JP6061381B2 - 一塩基多型の検出方法 - Google Patents
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Description
一塩基多型を解析する方法として、RFLP法(Restriction Fragmet Length Polymorphism)が知られている。RFLP法は、PCR(Polymerase Chain Reaction)増幅産物中の遺伝子変異部位を認識する制限酵素が存在する場合、共通配列部位にプライマーを設定し、その内側、すなわち、PCR増幅産物内に多型性をもたせて増幅し、得られたPCR産物を制限酵素で切断し、その断片の長さにより、多型の有無を判定する方法である。しかしながら、制限酵素を用いるため、分析コストが上がったり、解析全体の時間が長くなったりする等の課題がある。また、電気泳動により鎖長差を検出するため、作業が煩雑になったり、解析全体の時間が長くなったりする等の課題もある。
以下に本発明を詳述する。
イオン交換クロマトグラフィーに用いる溶離液は、下記式(1)で示されるグアニジンから誘導されるグアニジン塩を含有することが好ましい。
具体的には、グアニジン塩の濃度を0〜2000mmol/Lの範囲でグラジエント溶出させる方法を挙げることができる。従って、分析開始時のグアニジン塩の濃度は0mmol/Lである必要はなく、また、分析終了時のグアニジン塩の塩濃度も2000mmol/Lである必要はない。
グラジエント溶出の方法は、低圧グラジエント法であっても高圧グラジエント法であってもよいが、高圧グラジエント法による精密な濃度調整を行いながら溶出させる方法が好ましい。
また、強カチオン性基のカウンターイオンとしては、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲン化物イオンが挙げられる。
上記弱アニオン性基としては、例えば、カルボキシ基、リン酸基等が挙げられる。なかでも、カルボキシ基であることが好ましい。
オゾンは二重結合との反応性が高く、二重結合と反応したオゾンは、中間体であるオゾナイドを形成し、その後、カルボキシ基等が形成される。
オゾン水を用いることにより、オゾン水中に粒子を分散させるだけで粒子表面を簡便に酸化させることができる。その結果、基材粒子における疎水性の構造部分が酸化され、カルボキシ基、水酸基、アルデヒド基、ケト基等の親水性基が形成されると考えられる。
オゾンには強力な酸化作用があるが、オゾン水を用いて処理することにより、オゾンガスを用いて処理するよりも粒子表面を均一に酸化させることができ、より均一にカルボキシ基が形成されるので好ましい。
また、オゾン水によって処理することで、カルボキシ基の他、水酸基、アルデヒド基、ケト基等の親水性基が形成され、これらの親水性基の存在によって充填剤の表面と核酸との間に働く疎水性相互作用が弱まると考えられる。
従って、少なくとも表面に強カチオン性基と弱アニオン性基とを有する充填剤を用いた場合、主たる相互作用である充填剤表面と核酸との間に働くアニオン交換相互作用に加え、上述したように、弱いカチオン交換相互作用が働いたり、疎水性相互作用が弱まったりすることによって分離性能が向上するものと考えられる。
なお、本明細書において、「(メタ)アクリル」とは、「アクリル又はメタクリル」を意味し、「(メタ)アクリレート」とは、「アクリレート又はメタクリレート」を意味する。
なお、本明細書において平均粒子径は体積平均粒子径を示し、粒度分布測定装置(AccuSizer780/Particle Sizing Systems社製)を用いて測定することができる。
(アニオン交換カラム1)
攪拌機付き反応器中にて、3重量%ポリビニルアルコール(日本合成化学社製)水溶液2000mLに、テトラエチレングリコールジメタクリレート(新中村化学工業社製)300g、トリエチレングリコールジメタクリレート(新中村化学工業社製)100g、及び、過酸化ベンゾイル(キシダ化学社製)1.0gの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて80℃で1時間重合した。次に、強カチオン性のイオン交換基(4級アンモニウム基)を有する単量体として、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド(和光純薬工業社製)100gをイオン交換水に溶解し、得られた溶液を上記反応器中に更に添加した。次いで、攪拌しながら窒素雰囲気下にて80℃で2時間重合し、重合体組成物を得た。得られた重合体組成物を水及びアセトンで洗浄することにより、基材粒子の表面に4級アンモニウム基を有する親水性の被覆重合体粒子を得た。
得られた被覆重合体粒子10gを溶存オゾン濃度100ppmのオゾン水300mLに浸漬し、30分間攪拌した。攪拌終了後、遠心分離機(日立製作所社製、「Himac CR20G」)を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。この操作を2回繰り返し、被覆重合体粒子にオゾン水処理を施し、4級アンモニウム基とカルボキシ基が共存するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を得た。
なお、オゾン水は、内径15cm×長さ20cmの円柱形を有する外套内に、パーフルオロアルコキシ樹脂からなる内径0.5mm×厚さ0.04mm×長さ350cmの中空管状のオゾンガス透過膜400本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造システム(積水化学工業社製)を用いて調製した。
得られたイオン交換クロマトグラフィー用充填剤について、粒度分布計(Particle Sizing Systems社製、「Accusizer780」)を用いて測定したところ、平均粒子径は10μmであった。
得られたイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いて以下のカラム(アニオン交換カラム1)を準備した。
カラムサイズ:内径4.6mm×20mm
イオン交換基:4級アンモニウム基
市販されているカラムとして、以下のカラムを準備した。
品名:TSK−gel DNA−STAT(東ソー社製)
カラムサイズ:内径4.6mm×長さ100mm
イオン交換基:4級アンモニウム基
実施例1では、UGT1A1*6領域の野生型76bpと変異型79bpとの分離検出を行った。
以下に示すAS−PCR条件によって野生型と変異型の増幅産物を得た。
(1)試薬
AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitorgen社製、Lot.760816)
10×AccuPrime PCR Buffer I
AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity(5U/μL)
UGT1A1*6 primer(Operon Biotechnologies社製)
Forward(野生型)(10pmol/μL):5’−(cgcctcgttgtacatcagagcgg)−3’(配列番号1)
Forward(変異型)(10pmol/μL):5’−(ctgacgcctcgttgtacatcagagcga)−3”(配列番号2)
Reverse(10pmol/μL):5’−(cacatcctccctttggaatggca)−3”(配列番号3)
Nuclease−free Water(not DEPC−treated)(Ambion社製、Lot.0803015)
UGT1A1遺伝子 野生型配列挿入プラスミド(1×106コピー/μL)
UGT1A1遺伝子 変異型配列挿入プラスミド(1×106コピー/μL)
5μLの10×AccuPrime PCR Buffer I、1μLのForward primer、1μLのReverse priemrに総量が49μLとなるようNuclease−free Waterで調整した溶液に、1μLのUGT1A1遺伝子配列挿入プラスミドを添加し反応溶液とした。
C1000(バイオ・ラッド ラボラトリーズ社製)を用いて、PCR反応を行った。温度サイクルは以下に示す通りである。
94℃、30秒でテンプレートを熱変性させ、94℃を15秒、62℃を15秒、68℃を30秒の増幅サイクルを40サイクル行い、最後に68℃、5分で保温した。サンプルは使用するまで4℃で保存した。
準備したアニオン交換カラムを用いて、以下の条件でAS−PCR増幅産物を分離検出した。
システム:LC−20Aシリーズ(島津製作所社製)
溶離液:溶離液A 25mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH7.5)
溶離液B 25mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH7.5)+1mol/Lグアニジン塩酸塩
分析時間:アニオン交換カラム1を用いたときの分析時間は10分
アニオン交換カラム2を用いたときの分析時間は20分
溶出法:以下に示すグラジエント条件により、溶離液Bの混合比率を直線的に増加させた。
アニオン交換カラム1を用いたときの条件
0分(溶離液B40%)→10分(溶離液B50%)
アニオン交換カラム2を用いたときの条件
0分(溶離液B70%)→20分(溶離液B90%)
検体:UGT1A1*6領域の野生型76bp
UGT1A1*6領域の変異型79bp
流速:0.5mL/min(アニオン交換カラム1を用いたとき)
1.0mL/min(アニオン交換カラム2を用いたとき)
検出波長:260nm
試料注入量:10μL
参考例1では、UGT1A1*6領域の野生型271bpと変異型274bpとの分離検出を行った。
以下に示すAS−PCR条件によって野生型と変異型の増幅産物を得た。
AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitorgen社製、Lot.760816)
10×AccuPrime PCR Buffer I
AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity(5U/μL)
UGT1A1*6 primer(Operon Biotechnologies社製)
Forward(野生型)(10pmol/μL):5’−(cgcctcgttgtacatcagagcgg)−3’(配列番号1)
Forward(変異型)(10pmol/μL):5’−(ctgacgcctcgttgtacatcagagcga)−3”(配列番号2)
Reverse(10pmol/μL):5’−(gaaagggtccgtcagcatgac)−3”(配列番号4)
Nuclease−free Water(not DEPC−treated)(Ambion社製、Lot.0803015)
UGT1A1遺伝子 野生型配列挿入プラスミド(1×106コピー/μL)
UGT1A1遺伝子 変異型配列挿入プラスミド(1×106コピー/μL)
5μLの10×AccuPrime PCR Buffer I、1μLのForward primer、1μLのReverse priemrに総量が49μLとなるようNuclease−free Waterで調整した溶液に、1μLのUGT1A1遺伝子配列挿入プラスミドを添加し反応溶液とした。
C1000(バイオ・ラッド ラボラトリーズ社製)を用いて、PCR反応を行った。温度サイクルは以下に示す通りである。
94℃、30秒でテンプレートを熱変性させ、94℃を15秒、62℃を15秒、68℃を30秒の増幅サイクルを40サイクル行い、最後に68℃、5分で保温した。サンプルは使用するまで4℃で保存した。
準備したアニオン交換カラムを用いて、以下の条件でAS−PCR増幅産物を分離検出した。
システム:LC−20Aシリーズ(島津製作所社製)
溶離液:溶離液A 25mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH7.5)
溶離液B 25mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH7.5)+1mol/Lグアニジン塩酸塩
分析時間:アニオン交換カラム1を用いたときの分析時間は10分
アニオン交換カラム2を用いたときの分析時間は20分
溶出法:以下に示すグラジエント条件により、溶離液Bの混合比率を直線的に増加させた。
アニオン交換カラム1を用いたときの条件
0分(溶離液B60%)→10分(溶離液B80%)
アニオン交換カラム2を用いたときの条件
0分(溶離液B80%)→20分(溶離液B100%)
検体:UGT1A1*6領域の野生型271bp
UGT1A1*6領域の変異型274bp
流速:0.5mL/min(アニオン交換カラム1を用いたとき)
1.0mL/min(アニオン交換カラム2を用いたとき)
検出波長:260nm
試料注入量:10μL
比較例1では、UGT1A1*6領域の野生型76bpと変異型96bpとの分離検出を試みた。
AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitorgen社製、Lot.760816)
10× AccuPrime PCR Buffer I
AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity(5U/μL)
UGT1A1*6 primer(Operon Biotechnologies社製)
Forward(野生型)(10pmol/μL):5’−(cgcctcgttgtacatcagagcgg)−3’(配列番号1)
Forward(変異型)(10pmol/μL):5’−(atagttgtcctagcacctgacgcctcgttgtacatcagagcga)−3”(配列番号5)
Reverse(10pmol/μL):5’−(cacatcctccctttggaatggca)−3”(配列番号3)
Nuclease−free Water(not DEPC−treated)(Ambion社製、Lot.0803015)
UGT1A1遺伝子 野生型配列挿入プラスミド(1×106コピー/μL)
UGT1A1遺伝子 変異型配列挿入プラスミド(1×106コピー/μL)
5μLの10×AccuPrime PCR Buffer I、1μLのForward primer、1μLのReverse priemrに総量が49μLとなるようNuclease−free Waterで調整した溶液に、1μLのUGT1A1遺伝子配列挿入プラスミドを添加し反応溶液とした。
C1000(バイオ・ラッド ラボラトリーズ社製)を用いて、PCR反応を行った。温度サイクルは以下に示す通りである。
94℃、30秒でテンプレートを熱変性させ、94℃を15秒、62℃を15秒、68℃を30秒の増幅サイクルを40サイクル行い、最後に68℃、5分で保温した。サンプルは使用するまで4℃で保存した。
参考例2では、UGT1A1*6領域の野生型76bpと変異型79bpとの分離検出を行った。
Claims (4)
- AS−PCR法によって増幅された産物の大きさが200bp以下であり、かつ、野生型と変異型の鎖長差が10bp以下であることを特徴とする、請求項1記載の一塩基多型の検出方法。
- 強カチオン性基は、4級アンモニウム基であることを特徴とする請求項1又は2記載の一塩基多型の検出方法。
- グアニジン塩は、グアニジン塩酸塩又はグアニジン硫酸塩であることを特徴とする、請求項1、2又は3記載の一塩基多型の検出方法。
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