JP6090985B2

JP6090985B2 - 核酸鎖の分離方法

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Publication number: JP6090985B2
Application number: JP2012552751A
Authority: JP
Inventors: 卓也與谷; 牛澤　幸司; 幸司牛澤
Original assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 2011-01-12
Filing date: 2012-01-12
Publication date: 2017-03-08
Anticipated expiration: 2032-01-12
Also published as: CN103314290A; JPWO2012096327A1; US9481881B2; EP2672265A1; EP2672265A4; EP2672265B1; CN104946626A; WO2012096327A1; CN103314290B; US20130330735A1; KR20140041418A; KR101943119B1

Description

本発明は、核酸のＰＣＲ増幅産物、該ＰＣＲ増幅産物の制限酵素断片、又は核酸の制限酵素断片等の標的核酸の分離検出に用いるイオン交換クロマトグラフィー用溶離液に関する。また本発明は、該溶離液を用いたイオン交換クロマトグラフィーによる核酸鎖の分析方法に関する。

イオン交換クロマトグラフィーは、カラム充填剤のイオン交換基と測定対象物質中のイオンとの間に働く静電的相互作用を利用して測定対象物質を分離する方法である。
特に、核酸、タンパク質、多糖類といった生体高分子の分離に優れているため、生化学や医学等の分野で利用されている。
イオン交換クロマトグラフィーには、アニオン交換によるものとカチオン交換によるものとがある。アニオン交換は、カチオン性のカラム充填剤を用いて、アニオン性の物質を分離することができる。逆に、カチオン交換は、アニオン性のカラム充填剤を用いて、カチオン性の物質を分離することができる。

アニオン交換カラム充填剤のカチオン性の官能基としては、ジエチルアミノエチル基のような弱カチオン性基、４級アンモニウム基のような強カチオン性基があり、これらのカチオン性の官能基を有するアニオン交換カラム充填剤は既に市販され、各種研究分野で使用されている。

核酸とは、塩基、糖、リン酸からなるヌクレオチドがリン酸エステル結合で連なった生体高分子であり、糖構造の違いによってデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とリボ核酸（ＲＮＡ）とに分類される。
核酸のＰＣＲ増幅産物や、該ＰＣＲ増幅産物の制限酵素断片や、核酸の制限酵素断片等の標的核酸を、イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離する場合には、該標的核酸分子中に含まれるリン酸のマイナス電荷を利用したアニオン交換液体クロマトグラフィーが用いられ、該ＰＣＲ増幅産物や核酸断片等の標的核酸を鎖長別に分離検出することができる。

核酸鎖を鎖長別に分離する方法としては、ゲル電気泳動法が汎用されているが、作業が煩雑であったり、測定に時間がかかったりするなど、改善の余地が多くみられる。非特許文献１には、核酸関連化合物を高速液体クロマトグラフィーで分離する方法が開示されており、この方法を用いれば、煩雑な作業を必要とせずに短時間で核酸鎖を鎖長別に分離検出することができる。しかしながら、接近する鎖長差を充分に分離することが難しいという問題があるため、更なる分離性能の向上が要求されている。

「ライフサイエンスのための高速液体クロマトグラフィー基礎と実験」、廣川書店、ｐ．３２３

本発明は、核酸のＰＣＲ増幅産物や、該ＰＣＲ増幅産物の制限酵素断片や、核酸の制限酵素断片等の標的核酸の分離検出を、短時間かつ高い分離性能で行うことができるイオン交換クロマトグラフィー用溶離液を提供することを目的とする。また、本発明は、該溶離液を用いたイオン交換クロマトグラフィーによる核酸鎖の分析方法を提供することを目的とする。

本発明は、標的核酸に含まれる核酸鎖を鎖長別に分離する核酸鎖の分離方法であって、標的核酸をカチオン性充填剤が充填されたアニオン交換カラムに導入する工程と、グアニジン塩酸塩又はグアニジン硫酸塩を含有するイオン交換クロマトグラフィー用溶離液を用いて標的核酸をアニオン交換カラムから溶出することにより、核酸鎖を鎖長別に分離する工程とを有する核酸鎖の分離方法である。以下に本発明を詳述する。

本発明者らは、イオン交換クロマトグラフィーに用いる溶離液に、グアニジン塩を添加することにより、核酸鎖が異なる試料の分離性能を向上させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液は、上記式（１）で示されるグアニジンから誘導されるグアニジン塩を含有する。
上記グアニジン塩としては、例えば、グアニジン塩酸塩、グアニジン硫酸塩、グアニジン硝酸塩、グアニジン炭酸塩、グアニジンリン酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジンスルファミン酸塩、アミノグアニジン塩酸塩、アミノグアニジン重炭酸塩等が挙げられる。なかでも、グアニジン塩酸塩、グアニジン硫酸塩が好適に用いられる。

本発明のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液におけるグアニジン塩の分析時の濃度は、分析対象物に合わせて、適宜調整すればよいが、２０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが望ましい。
具体的には、グアニジン塩の濃度を０〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲でグラジエント溶出させる方法を挙げることができる。従って、分析開始時のグアニジン塩の濃度は０ｍｍｏｌ／Ｌである必要はなく、また、分析終了時のグアニジン塩の塩濃度も２０００ｍｍｏｌ／Ｌである必要はない。
上記グラジエント溶出の方法は、低圧グラジエント法であっても高圧グラジエント法であっても良いが、高圧グラジエント法による精密な濃度調整を行いながら溶出させる方法が好ましい。

上記グアニジン塩は、溶離液に単独で添加してもよいし、他の塩と組み合わせて添加してもよい。上記グアニジン塩に組み合わせて用いることができる塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム等のハロゲン化物とアルカリ金属とからなる塩や、塩化カルシウム、臭化カルシウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム等のハロゲン化物とアルカリ土類金属とからなる塩や、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の無機酸塩等が挙げられる。また、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム等の有機酸塩を用いてもよい。

本発明のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液に用いる緩衝液としては、公知の緩衝液類や有機溶媒類を用いることができ、具体的には例えば、トリス塩酸緩衝液、トリスとＥＤＴＡからなるＴＥ緩衝液、トリスと酢酸とＥＤＴＡからなるＴＡＥ緩衝液、トリスとホウ酸とＥＤＴＡからなるＴＢＡ緩衝液等が挙げられる。

上記溶離液のｐＨは特に制限されず、アニオン交換によって核酸鎖を分離できる範囲であればよい。

本発明のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液を用いる核酸鎖の分析方法もまた、本発明の一つである。

本発明の核酸鎖の分析方法に用いるカラムは、カチオン性充填剤が充填されたアニオン交換カラムであればよく、市販されているものや、基材微粒子の表面に強カチオン性基と弱アニオン性基とを有する充填剤を用いたアニオン交換カラム等を用いることができる。

本発明の核酸鎖の分析方法が適用可能な標的核酸（検出対象）としては、核酸のＰＣＲ増幅産物、該ＰＣＲ増幅産物の制限酵素断片、又は核酸の制限酵素断片が挙げられ、ウイルス由来又は遺伝子多型の疑われるヒト由来のもの、即ち、ウイルスの存在や型を判別するためのウイルス由来の核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）や遺伝子多型（一塩基多型）を判別するためのヒト由来のＤＮＡを例示することができる。

上記ＤＮＡ又は上記ＲＮＡは、公知の方法により抽出、精製した後、必要によりＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法等により増幅し、該増幅産物を本発明のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液を用いたイオン交換クロマトグラフィーに供する。

ウイルスがＲＮＡウイルスである等の場合は、抽出、精製したＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）反応を行い、ＰＣＲ増幅産物を得ることができる。

また、本発明の核酸鎖の分析方法を用いて遺伝子多型を判別する場合には、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：制限酵素断片長多型）法として公知の技術を応用することができる。ＲＦＬＰ法は、ＰＣＲ増幅産物中の遺伝子変異部を認識する制限酵素が存在する場合、共通配列部位にプライマーを設定し、その内側、即ち、ＰＣＲ増幅産物内に多型性をもたせて増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物を上記制限酵素で切断し、その断片の長さにより、多型の有無を判定する方法である。制限酵素による切断が起きた場合と起きなかった場合とでは、生じる断片の数もサイズも異なるので、それに基づいて切断が起きたか否か、ひいては目的の位置の塩基が何であったかを知ることができる。

プライマーによる増幅領域は、制限酵素による切断が起きた場合に生じる２個の断片が、それぞれ本発明のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液を用いたイオン交換クロマトグラフィーで明瞭に検出できるサイズ、好ましくは小さい方の断片が１ｂｐ以上、より好ましくは２０ｂｐ以上となるように設定する。また、生じる２個の断片のサイズの差が、本発明の核酸鎖の分析方法で明瞭に検出できるように、好ましくは１ｂｐ以上、より好ましくは２０ｂｐ以上になるように設定する。増幅領域のサイズの上限は特にないが、あまりに大きいとＰＣＲの時間もコストもかかり、また、それによる利点もないので、好ましくは１０００ｂｐ以下である。プライマーの塩基長は、それぞれの機能が発揮される長さであればよく、プライマーの塩基長の例としては１５〜３０ｂｐ、好ましくは２０〜２５ｂｐである。

上記ＰＣＲ法による増幅は、１段階で行ってもよいが、感度をより高めるために、第１段階のＰＣＲでより広い範囲の領域を増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物を鋳型として、その中に含まれる領域を第２段階のＰＣＲでさらに増幅してもよい（ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）。この場合、第２段階のＰＣＲに用いるプライマーは両方とも、第１段階のＰＣＲに用いるプライマーと異なるものであってもよいし、一方のみ異なるプライマーを用い、他方は第１段階のＰＣＲで用いたプライマーと同じものを用いてもよい（ｈｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）。

上記ＰＣＲ法自体は、公知であり、ＰＣＲ法による分離検出のためのキットも市販されているので、容易に実施することができる。ＰＣＲ法に用いるプライマーの設計やＤＮＡの増幅の条件は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（３ｒｄｅｄ．），Ｖｏｌｕｍｅ２，Ｃｈａｐｔｅｒ８，ｐｐ．８．１−８．１２６，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｉｎｇＨａｒｂｏｒ，２００１を参照できる。

本発明によれば、核酸のＰＣＲ増幅産物や、該ＰＣＲ増幅産物の制限酵素断片や、核酸の制限酵素断片等の標的核酸の分離検出を、短時間かつ高い分離性能で行うことができるイオン交換クロマトグラフィー用溶離液を提供することができる。また、本発明によれば、上記イオン交換クロマトグラフィー用溶離液を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、標的核酸を短時間で精度よく分析できる核酸鎖の分析方法を提供することができる。

実施例１のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液とカラム１とを用いて得られたクロマトグラムである。実施例１のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液とカラム２とを用いて得られたクロマトグラムである。実施例２のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液とカラム２とを用いて得られたクロマトグラムである。比較例１のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液とカラム１とを用いて得られたクロマトグラムである。比較例１のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液とカラム２とを用いて得られたクロマトグラムである。比較例２のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液とカラム１とを用いて得られたクロマトグラムである。比較例２のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液とカラム２とを用いて得られたクロマトグラムである。比較例３のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液とカラム２とを用いて得られたクロマトグラムである。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。

（実施例１、２及び比較例１〜３）
２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液に表１に示す塩を濃度が１０００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、実施例１、２及び比較例１〜３に係るイオン交換クロマトグラフィー用溶離液を調製した。得られた溶離液のｐＨは全て７．５であった。

＜評価＞
（分離性能の確認）
以下の方法を用いて、実施例及び比較例で調製したイオン交換クロマトグラフィー用溶離液を用いて標的核酸を分離検出した場合の分離性能を比較した。

（アニオン交換カラムの準備）
（アニオン交換カラム１）
市販されているカラムとして、以下のカラム（アニオン交換カラム１）を準備した。
品名：ＴＳＫ−ｇｅｌＤＮＡ−ＳＴＡＴ（東ソー株式会社製）
カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ１００ｍｍ
イオン交換基：４級アンモニウム基

（アニオン交換カラム２）
攪拌機付き反応器中にて、３重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に、テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）３００ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）１００ｇ及び過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて８０℃で１時間重合した。次に、強カチオン性のイオン交換基（４級アンモニウム基）を有する単量体として、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド（和光純薬工業社製）１００ｇをイオン交換水に溶解し、得られた溶液を上記反応器中にさらに添加した。次いで、攪拌しながら窒素雰囲気下にて８０℃で２時間重合した重合体組成物を得た。得られた重合体組成物を水及びアセトンで洗浄することにより、基材微粒子の表面にイオン交換基を有する親水性の被覆重合体粒子を得た。得られた被覆重合体粒子について、粒度分布計（ＰａｒｔｉｃｌｅＳｉｚｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ社製、「Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ７８０」）を用いて測定したところ、平均粒子径は１０μｍであった。
得られた被覆重合体粒子１０ｇを溶存オゾンガス濃度１００ｐｐｍのオゾン水３００ｍＬに浸漬し、３０分間攪拌した。攪拌終了後、遠心分離機（日立製作所社製、「ＨｉｍａｃＣＲ２０Ｇ」）を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。この操作を２回繰り返し、被覆重合体粒子にオゾン水処理を施し、４級アンモニウム基とカルボキシ基が共存するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を得た。
なお、オゾン水は、内径１５ｃｍ×長さ２０ｃｍの円柱形を有する外套内に、パーフルオロアルコキシ樹脂からなる内径０．５ｍｍ×厚さ０．０４ｍｍ×長さ３５０ｃｍの中空管状のオゾンガス透過膜４００本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造システム（積水化学工業社製）を用いて調製した。
得られたイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いて以下のカラム（アニオン交換カラム２）を準備した。
カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×２０ｍｍ
イオン交換基：４級アンモニウム基

準備したアニオン交換カラムを用いて、以下の条件で標的核酸を分離検出した。
システム：ＬＣ−２０Ａシリーズ（島津製作所社製）
溶離液：Ａ液２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、Ｂ液実施例及び比較例で調製した溶離液
溶出法：表１に示すグラジエント条件により、０分から２０分にかけて、Ｂ液の混合比率を直線的に増加させた。
検体：２０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒマーカー（タカラバイオ社製、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、３００、４００、５００ｂｐの断片が含まれる）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ（アニオン交換カラム１）、１．０ｍＬ／ｍｉｎ（アニオン交換カラム２）
検出波長：２６０ｎｍ
試料注入量：１０μＬ

実施例１のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液とカラム１とを用いて得られたクロマトグラムを図１、実施例１のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液とカラム２とを用いて得られたクロマトグラムを図２、実施例２のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液とカラム２とを用いて得られたクロマトグラムを図３、比較例１のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液とカラム１とを用いて得られたクロマトグラムを図４、比較例１のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液とカラム２とを用いて得られたクロマトグラムを図５、比較例２のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液とカラム１とを用いて得られたクロマトグラムを図６、比較例２のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液とカラム２とを用いて得られたクロマトグラムを図７、比較例３のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液とカラム２とを用いて得られたクロマトグラムを図８に示した。なお、図１〜８のグラフ中の数値は断片の塩基長（ｂｐ）の値である。
図１〜８より、実施例のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液を用いた場合は、検体に含まれるすべての断片を分離することができた。従って、カラムの種類に依らず、分離性能が効果的に向上することがわかった。一方で、比較例のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液を用いた場合は、カラムの種類や添加した塩の種類によって多少の違いが見られるものの、１４０ｂｐ以降の断片の分離が不充分であることがわかった。

本発明によれば、核酸のＰＣＲ増幅産物や、該ＰＣＲ増幅産物の制限酵素断片や、核酸の制限酵素断片等の標的核酸の分離検出を、短時間かつ高い分離性能で行うことができるイオン交換クロマトグラフィー用溶離液を提供することができる。また、本発明によれば、上記イオン交換クロマトグラフィー用溶離液を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、核酸鎖を短時間で精度よく分析できる分析方法を提供することができる。

Claims

標的核酸に含まれる核酸鎖を鎖長別に分離する核酸鎖の分離方法であって、
標的核酸をカチオン性充填剤が充填されたアニオン交換カラムに導入する工程と、
グアニジン塩酸塩又はグアニジン硫酸塩を含有するイオン交換クロマトグラフィー用溶離液を用いて標的核酸をアニオン交換カラムから溶出することにより、核酸鎖を鎖長別に分離する工程とを有する
ことを特徴とする核酸鎖の分離方法。
核酸鎖のサイズが１ｂｐ以上１０００ｂｐ以下であることを特徴とする請求項１記載の核酸鎖の分離方法。