KR20140041418A - 이온 교환 크로마토그래피용 용리액 및 핵산 사슬의 분석 방법 - Google Patents

이온 교환 크로마토그래피용 용리액 및 핵산 사슬의 분석 방법 Download PDF

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Abstract

핵산의 PCR 증폭 산물이나, 그 PCR 증폭 산물의 제한 효소 단편이나, 핵산의 제한 효소 단편 등의 표적 핵산의 분리 검출을, 단시간에 또한 높은 분리 성능으로 실시할 수 있는 이온 교환 크로마토그래피용 용리액을 제공한다. 또, 그 용리액을 사용한 이온 교환 크로마토그래피에 의한 핵산 사슬의 분석 방법을 제공한다. 하기 식 (1) 로 나타내는 구아니딘으로부터 유도되는 구아니딘염을 함유하는 이온 교환 크로마토그래피용 용리액.

Description

이온 교환 크로마토그래피용 용리액 및 핵산 사슬의 분석 방법{ELUENT FOR ION-EXCHANGE CHROMATOGRAPHY, AND METHOD OF ANALYZING NUCLEIC ACID CHAINS}
본 발명은 핵산의 PCR 증폭 산물, 그 PCR 증폭 산물의 제한 효소 단편, 또는 핵산의 제한 효소 단편 등의 표적 핵산의 분리 검출에 사용하는 이온 교환 크로마토그래피용 용리액에 관한 것이다. 또 본 발명은, 그 용리액을 사용한 이온 교환 크로마토그래피에 의한 핵산 사슬의 분석 방법에 관한 것이다.
이온 교환 크로마토그래피는, 칼럼 충전제의 이온 교환기와 측정 대상 물질 중의 이온 사이에 작용하는 정전적 상호 작용을 이용하여 측정 대상 물질을 분리하는 방법이다.
특히, 핵산, 단백질, 다당류와 같은 생체 고분자의 분리가 우수하기 때문에, 생화학이나 의학 등의 분야에서 이용되고 있다.
이온 교환 크로마토그래피에는 아니온 교환에 의한 것과 카티온 교환에 의한 것이 있다. 아니온 교환은, 카티온성의 칼럼 충전제를 이용하여 아니온성의 물질을 분리할 수 있다. 반대로 카티온 교환은, 아니온성의 칼럼 충전제를 이용하여 카티온성의 물질을 분리할 수 있다.
아니온 교환 칼럼 충전제의 카티온성 관능기로는, 디에틸아미노에틸기와 같은 약카티온성기, 4 급 암모늄기와 같은 강카티온성기가 있고, 이들의 카티온성의 관능기를 갖는 아니온 교환 칼럼 충전제는 이미 시판되어, 각종 연구 분야에서 사용되고 있다.
핵산이란, 염기, 당, 인산으로 이루어지는 뉴클레오티드가 인산에스테르 결합으로 연결된 생체 고분자로, 당 구조의 차이에 따라 디옥시리보핵산 (DNA) 과 리보핵산 (RNA) 으로 분류된다.
핵산의 PCR 증폭 산물이나, 그 PCR 증폭 산물의 제한 효소 단편이나, 핵산의 제한 효소 단편 등의 표적 핵산을 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분리하는 경우에는, 그 표적 핵산 분자 중에 함유되는 인산의 마이너스 전하를 이용한 아니온 교환 액체 크로마토그래피가 이용되며, 그 PCR 증폭 산물이나 핵산 단편 등의 표적 핵산을 사슬 길이별로 분리 검출할 수 있다.
핵산 사슬을 사슬 길이별로 분리하는 방법으로는 겔 전기 영동법이 범용되고 있는데, 작업이 번잡하거나 측정에 시간이 걸리거나 하는 등 개선의 여지가 많이 보여진다. 비특허문헌 1 에는, 핵산 관련 화합물을 고속 액체 크로마토그래피로 분리하는 방법이 개시되어 있고, 이 방법을 이용하면 번잡한 작업을 필요로 하지 않고 단시간에 핵산 사슬을 사슬 길이별로 분리 검출할 수 있다. 그러나, 접근하는 사슬 길이 차이를 충분히 분리하는 것이 어렵다는 문제가 있기 때문에, 추가적인 분리 성능의 향상이 요구되고 있다.
「라이프 사이언스를 위한 고속 액체 크로마토그래피 기초와 실험」, 히로카와 서점, p.323
본 발명은 핵산의 PCR 증폭 산물이나, 그 PCR 증폭 산물의 제한 효소 단편이나, 핵산의 제한 효소 단편 등의 표적 핵산의 분리 검출을, 단시간에 또한 높은 분리 성능으로 실시할 수 있는 이온 교환 크로마토그래피용 용리액을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또, 본 발명은 그 용리액을 사용한 이온 교환 크로마토그래피에 의한 핵산 사슬의 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 하기 식 (1) 로 나타내는 구아니딘으로부터 유도되는 구아니딘염을 함유하는 이온 교환 크로마토그래피용 용리액이다. 이하에 본 발명을 상세하게 서술한다.
[화학식 1]
Figure pct00001
본 발명자들은 이온 교환 크로마토그래피에 사용하는 용리액에 구아니딘염을 첨가함으로써, 핵산 사슬이 상이한 시료의 분리 성능을 향상시킬 수 있다는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
본 발명의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액은, 상기 식 (1) 로 나타내는 구아니딘으로부터 유도되는 구아니딘염을 함유한다.
상기 구아니딘염으로는, 예를 들어 구아니딘염산염, 구아니딘황산염, 구아니딘질산염, 구아니딘탄산염, 구아니딘인산염, 구아니딘티오시안산염, 구아니딘술파민산염, 아미노구아니딘염산염, 아미노구아니딘중탄산염 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 구아니딘염산염, 구아니딘황산염이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액에 있어서의 구아니딘염의 분석시의 농도는, 분석 대상물에 맞추어 적절히 조정하면 되는데, 2000 m㏖/ℓ 이하인 것이 바람직하다.
구체적으로는, 구아니딘염의 농도를 0 ∼ 2000 m㏖/ℓ 의 범위에서 그레이디언트 용출시키는 방법을 들 수 있다. 따라서, 분석 개시시의 구아니딘염의 농도는 0 m㏖/ℓ 일 필요는 없고, 또, 분석 종료시의 구아니딘염의 농도도 2000 m㏖/ℓ 일 필요는 없다.
상기 그레이디언트 용출 방법은, 저압 그레이디언트법이어도 고압 그레이디언트법이어도 되지만, 고압 그레이디언트법에 의한 정밀한 농도 조정을 실시하면서 용출시키는 방법이 바람직하다.
상기 구아니딘염은, 용리액에 단독으로 첨가해도 되고, 다른 염과 조합하여 첨가해도 된다. 상기 구아니딘염에 조합하여 사용할 수 있는 염으로는, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼륨, 브롬화나트륨, 브롬화칼륨 등의 할로겐화물과 알칼리 금속으로 이루어지는 염이나, 염화칼슘, 브롬화칼슘, 염화마그네슘, 브롬화마그네슘 등의 할로겐화물과 알칼리 토금속으로 이루어지는 염이나, 과염소산나트륨, 과염소산칼륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 황산암모늄, 질산나트륨, 질산칼륨 등의 무기산염 등을 들 수 있다. 또, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 숙신산나트륨, 숙신산칼륨 등의 유기산염을 사용해도 된다.
본 발명의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액에 사용하는 완충액으로는, 공지된 완충액류나 유기 용매류를 사용할 수 있고, 구체적으로는 예를 들어 트리스염산 완충액, 트리스와 EDTA 로 이루어지는 TE 완충액, 트리스와 아세트산과 EDTA 로 이루어지는 TAE 완충액, 트리스와 붕산과 EDTA 로 이루어지는 TBA 완충액 등을 들 수 있다.
상기 용리액의 pH 는 특별히 제한되지 않고, 아니온 교환에 의해 핵산 사슬을 분리할 수 있는 범위이면 된다.
본 발명의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액을 사용하는 핵산 사슬의 분석 방법도 또한 본 발명의 하나이다.
본 발명의 핵산 사슬의 분석 방법에 사용하는 칼럼은, 카티온성 충전제가 충전된 아니온 교환 칼럼이면 되고, 시판되고 있는 것이나, 기재 미립자의 표면에 강카티온성기와 약아니온성기를 갖는 충전제를 사용한 아니온 교환 칼럼 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 핵산 사슬의 분석 방법이 적용 가능한 표적 핵산 (검출 대상) 으로는, 핵산의 PCR 증폭 산물, 그 PCR 증폭 산물의 제한 효소 단편, 또는 핵산의 제한 효소 단편을 들 수 있고, 바이러스 유래 또는 유전자 다형이 의심되는 사람에서 유래된 것, 즉 바이러스의 존재나 형태를 판별하기 위한 바이러스에서 유래된 핵산 (DNA 나 RNA) 이나 유전자 다형 (1 염기 다형) 을 판별하기 위한 사람에서 유래된 DNA 를 예시할 수 있다.
상기 DNA 또는 상기 RNA 는, 공지된 방법에 의해 추출, 정제한 후, 필요에 따라 PCR (Polymerase Chain Reaction) 법 등에 의해 증폭시키고, 그 증폭 산물을 본 발명의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액을 사용한 이온 교환 크로마토그래피에 제공한다.
바이러스가 RNA 바이러스인 등의 경우에는, 추출, 정제한 RNA 에 대하여 RT - PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) 반응을 실시하여, PCR 증폭 산물을 얻을 수 있다.
또, 본 발명의 핵산 사슬의 분석 방법을 이용하여 유전자 다형을 판별하는 경우에는, PCR - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism：제한 효소 단편 길이 다형) 법으로 공지된 기술을 응용할 수 있다. RFLP 법은, PCR 증폭 산물 중의 유전자 변이부를 인식하는 제한 효소가 존재하는 경우, 공통 배열 부위에 프라이머를 설정하고, 그 내측, 즉 PCR 증폭 산물 내에 다형성을 갖게 하여 증폭시키고, 얻어진 PCR 증폭 산물을 상기 제한 효소로 절단하고, 그 단편의 길이에 따라 다형의 유무를 판정하는 방법이다. 제한 효소에 의한 절단이 일어난 경우와 일어나지 않은 경우에서는, 생성되는 단편의 수도 사이즈도 상이하기 때문에, 그에 기초하여 절단이 일어났는지의 여부, 나아가서는 목적한 위치의 염기가 무엇이었는지를 알 수 있다.
프라이머에 의한 증폭 영역은, 제한 효소에 의한 절단이 일어난 경우에 생성되는 2 개의 단편이, 각각 본 발명의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액을 사용한 이온 교환 크로마토그래피로 명료하게 검출할 수 있는 사이즈, 바람직하게는 작은 쪽의 단편이 1 bp 이상, 보다 바람직하게는 20 bp 이상이 되도록 설정한다. 또, 생성되는 2 개의 단편의 사이즈 차이가, 본 발명의 핵산 사슬의 분석 방법으로 명료하게 검출할 수 있도록, 바람직하게는 1 bp 이상, 보다 바람직하게는 20 bp 이상이 되도록 설정한다. 증폭 영역의 사이즈의 상한은 특별히 없지만, 지나치게 크면 PCR 의 시간도 비용도 들며, 또 그에 따른 이점도 없기 때문에, 바람직하게는 1000 bp 이하이다. 프라이머의 염기 길이는 각각의 기능이 발휘되는 길이이면 되고, 프라이머의 염기 길이의 예로는 15 ∼ 30 bp, 바람직하게는 20 ∼ 25 bp 이다.
상기 PCR 법에 의한 증폭은, 1 단계로 실시해도 되지만, 감도를 보다 높이기 위해서, 제 1 단계의 PCR 로 보다 넓은 범위의 영역을 증폭시키고, 얻어진 PCR 증폭 산물을 주형으로 하여, 그 중에 포함되는 영역을 제 2 단계의 PCR 로 추가로 증폭시켜도 된다 (nested PCR). 이 경우, 제 2 단계의 PCR 에 사용하는 프라이머는 양쪽 모두 제 1 단계의 PCR 에 사용하는 프라이머와 상이한 것이어도 되고, 한쪽만 상이한 프라이머를 사용하고, 다른 쪽은 제 1 단계의 PCR 에서 사용한 프라이머와 동일한 것을 사용해도 된다 (hemi-nested PCR).
상기 PCR 법 자체는 공지된 것이며, PCR 법에 의한 분리 검출을 위한 키트도 시판되어 있으므로, 용이하게 실시할 수 있다. PCR 법에 사용하는 프라이머의 설계나 DNA 의 증폭 조건은, Molecular Cloning：A Laboratory Manual (3rd ed.), Volume 2, Chapter 8, pp.8.1-8. 126, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sping Harbor, 2001 을 참조할 수 있다.
본 발명에 의하면, 핵산의 PCR 증폭 산물이나, 그 PCR 증폭 산물의 제한 효소 단편이나, 핵산의 제한 효소 단편 등의 표적 핵산의 분리 검출을, 단시간에 또한 높은 분리 성능으로 실시할 수 있는 이온 교환 크로마토그래피용 용리액을 제공할 수 있다. 또, 본 발명에 의하면, 상기 이온 교환 크로마토그래피용 용리액을 사용한 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 표적 핵산을 단시간에 양호한 정밀도로 분석할 수 있는 핵산 사슬의 분석 방법을 제공할 수 있다.
도 1 은 실시예 1 의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액과 칼럼 1 을 이용하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 2 는 실시예 1 의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액과 칼럼 2 를 이용하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 3 은 실시예 2 의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액과 칼럼 2 를 이용하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 4 는 비교예 1 의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액과 칼럼 1 을 이용하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 5 는 비교예 1 의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액과 칼럼 2 를 이용하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 6 은 비교예 2 의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액과 칼럼 1 을 이용하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 7 은 비교예 2 의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액과 칼럼 2 를 이용하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 8 은 비교예 3 의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액과 칼럼 2 를 이용하여 얻어진 크로마토그램이다.
이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에만 한정되지 않는다.
(실시예 1, 2 및 비교예 1 ∼ 3)
25 m㏖/ℓ 트리스염산 완충액에 표 1 에 나타내는 염을 농도가 1000 m㏖/ℓ 가 되도록 첨가하고, 실시예 1, 2 및 비교예 1 ∼ 3 에 관련된 이온 교환 크로마토그래피용 용리액을 조제하였다. 얻어진 용리액의 pH 는 모두 7.5 였다.
＜평가＞
(분리 성능의 확인)
이하의 방법을 이용하여, 실시예 및 비교예에서 조제한 이온 교환 크로마토그래피용 용리액을 이용하여 표적 핵산을 분리 검출한 경우의 분리 성능을 비교하였다.
(아니온 교환 칼럼의 준비)
(아니온 교환 칼럼 1)
시판되어 있는 칼럼으로서 이하의 칼럼 (아니온 교환 칼럼 1) 을 준비하였다.
품명：TSK-gel DNA-STAT (토소 주식회사 제조)
칼럼 사이즈：내경 4.6 ㎜ × 길이 100 ㎜
이온 교환기：4 급 암모늄기
(아니온 교환 칼럼 2)
교반기가 부착된 반응기 중에서, 3 중량％ 폴리비닐알코올 (닛폰 합성 화학 사 제조) 수용액에, 테트라에틸렌글리콜디메타크릴레이트 (신나카무라 화학 공업사 제조) 300 g, 트리에틸렌글리콜디메타크릴레이트 (신나카무라 화학 공업사 제조) 100 g 및 과산화 벤조일 (키시다 화학사 제조) 1.0 g 의 혼합물을 첨가하였다. 교반하면서 가열하고, 질소 분위기하에서 80 ℃ 에서 1 시간 중합하였다. 다음으로, 강카티온성의 이온 교환기 (4 급 암모늄기) 를 갖는 단량체로서 메타크릴산에틸트리메틸암모늄클로라이드 (와코 순약 공업사 제조) 100 g 을 이온 교환수에 용해시키고, 얻어진 용액을 상기 반응기 중에 추가로 첨가하였다. 이어서, 교반하면서 질소 분위기하에서 80 ℃ 에서 2 시간 중합한 중합체 조성물을 얻었다. 얻어진 중합체 조성물을 물 및 아세톤으로 세정함으로써, 기재 미립자의 표면에 이온 교환기를 갖는 친수성인 피복 중합체 입자를 얻었다. 얻어진 피복 중합체 입자에 대하여, 입도 분포계 (Particle Sizing Systems 사 제조, 「Accusizer 780」) 를 이용하여 측정한 결과, 평균 입자경은 10 ㎛ 였다. 얻어진 피복 중합체 입자 10 g 을 용존 오존 가스 농도 100 ppm 의 오존수 300 ㎖ 에 침지하여, 30 분간 교반하였다. 교반 종료 후, 원심 분리기 (히타치 제작소사 제조, 「Himac CR20G」) 를 이용하여 원심 분리하고, 상청액을 제거하였다. 이 조작을 2 회 반복하고, 피복 중합체 입자에 오존수 처리를 실시하여, 4 급 암모늄기와 카르복실기가 공존하는 이온 교환 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.
또한, 오존수는 내경 15 ㎝ × 길이 20 ㎝ 의 원주형을 갖는 외투 내에, 퍼플루오로알콕시 수지로 이루어지는 내경 0.5 ㎜ × 두께 0.04 ㎜ × 길이 350 ㎝ 의 중공관상의 오존 가스 투과막 400 개가 수용된 오존 용해 모듈을 포함하는 오존수 제조 시스템 (세키스이 화학 공업사 제조) 을 이용하여 조제하였다.
얻어진 이온 교환 크로마토그래피용 충전제를 이용하여 이하의 칼럼 (아니온 교환 칼럼 2) 을 준비하였다.
칼럼 사이즈：내경 4.6 ㎜ × 20 ㎜
이온 교환기：4 급 암모늄기
준비한 아니온 교환 칼럼을 이용하여, 이하의 조건으로 표적 핵산을 분리 검출하였다.
시스템：LC-20A 시리즈 (시마즈 제작소사 제조)
용리액：A 액 25 m㏖/ℓ 트리스염산 완충액 (pH 7.5), B 액 실시예 및 비교예에서 조제한 용리액
용출법：표 1 에 나타내는 그레이디언트 조건에 의해, 0 분에서 20 분에 걸쳐, B 액의 혼합 비율을 직선적으로 증가시켰다.
검체：20 bp DNALadder 마커 (다카라 바이오사 제조, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 300, 400, 500 bp 의 단편이 포함된다)
유속：0.5 ㎖/min (아니온 교환 칼럼 1), 1.0 ㎖/min (아니온 교환 칼럼 2)
검출 파장：260 ㎚
시료 주입량：10 ㎕
Figure pct00002
실시예 1 의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액과 칼럼 1 을 이용하여 얻어진 크로마토그램을 도 1, 실시예 1 의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액과 칼럼 2 를 이용하여 얻어진 크로마토그램을 도 2, 실시예 2 의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액과 칼럼 2 를 이용하여 얻어진 크로마토그램을 도 3, 비교예 1 의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액과 칼럼 1 을 이용하여 얻어진 크로마토그램을 도 4, 비교예 1 의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액과 칼럼 2 를 이용하여 얻어진 크로마토그램을 도 5, 비교예 2 의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액과 칼럼 1 을 이용하여 얻어진 크로마토그램을 도 6, 비교예 2 의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액과 칼럼 2 를 이용하여 얻어진 크로마토그램을 도 7, 비교예 3 의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액과 칼럼 2 를 이용하여 얻어진 크로마토그램을 도 8 에 나타내었다. 또한, 도 1 ∼ 8 의 그래프 중의 수치는 단편의 염기 길이 (bp) 의 값이다.
도 1 ∼ 8 로 부터, 실시예의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액을 사용한 경우에는, 검체에 포함되는 모든 단편을 분리할 수 있었다. 따라서, 칼럼의 종류에 관계없이 분리 성능이 효과적으로 향상되는 것을 알 수 있었다. 반면, 비교예의 이온 교환 크로마토그래피용 용리액을 사용한 경우에는, 칼럼의 종류나 첨가한 염의 종류에 따라 다소 차이는 보였지만, 140 bp 이후의 단편의 분리가 불충분하다는 것을 알 수 있었다.
산업상 이용가능성
본 발명에 의하면, 핵산의 PCR 증폭 산물이나, 그 PCR 증폭 산물의 제한 효소 단편이나, 핵산의 제한 효소 단편 등의 표적 핵산의 분리 검출을, 단시간에 또한 높은 분리 성능으로 실시할 수 있는 이온 교환 크로마토그래피용 용리액을 제공할 수 있다. 또, 본 발명에 의하면, 상기 이온 교환 크로마토그래피용 용리액을 사용한 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 핵산 사슬을 단시간에 양호한 정밀도로 분석할 수 있는 분석 방법을 제공할 수 있다.

Claims (3)

  1. 하기 식 (1) 로 나타내는 구아니딘으로부터 유도되는 구아니딘염을 함유하는 것을 특징으로 하는 이온 교환 크로마토그래피용 용리액.
    [화학식 1]
    Figure pct00003
  2. 제 1 항에 있어서,
    구아니딘염은 구아니딘염산염 또는 구아니딘황산염인 것을 특징으로 하는 이온 교환 크로마토그래피용 용리액.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 이온 교환 크로마토그래피용 용리액을 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 사슬의 분석 방법.
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