PT1874825E - Ligandos de afinidade - Google Patents

Description

ΡΕ1874825 1 DESCRIÇÃO "LIGANDOS DE AFINIDADE" A presente invenção refere-se a técnicas de purificação por afinidade e material, especialmente para cromatografia de afinidade, e ligandos específicos para utilização nessas técnicas. Mais especificamente, a invenção é dirigida a capturar e purificar Npr0, mutantes Npr0, proteínas de fusão Npr0 expressas como corpos de inclusão em condições de desnaturação ou proteínas com uma tendência de agregação elevada utilizando cromatografia de afinidade de péptidos. A cromatografia de afinidade é uma das técnicas mais eficientes para o isolamento específico de um composto a partir de uma mistura bruta, complexa. Foram aplicados com sucesso anticorpos como ligandos de afinidade devido à sua elevada selectividade e à sua elevada afinidade. Uma desvantagem dessas matrizes de afinidade é a sua instabilidade relativa que pode conduzir a lixiviação do anticorpo da matriz de suporte para o produto. Para além disso, a regeneração com tampões alcalinos, que é um processo comum na indústria biofarmacêutica, pode conduzir à desnaturação irreversível e perda de eficiência de ligação. Os péptidos curtos são capazes de substituir anticorpos como ligandos de afinidade. Estas moléculas pequenas oferecem estabi- 2 ΡΕ1874825 lidade química elevada, eficiência, selectividade, baixo preço e são normalmente não tóxicos. Estas características são consideradas como uma vantagem em relação a ligandos proteicos, especialmente quando aplicados num ambiente biofarmacêutico. Os péptidos dirigidos contra uma molécula alvo podem ser identificados a partir de bibliotecas de péptidos combinatórios ou bibliotecas biológicas. Bibliotecas combinatórias sintetizadas quimicamente incluem síntese de pin, saco de chá, SPOT. As bibliotecas biológicas incluem técnicas de apresentação em fagos, apresentação em bactérias, técnicas ribossomais.

Por outro lado, muitas proteínas apresentam uma tendência elevada para se agregarem em condições fisiológicas ou a sua actividade biológica inerente é a agregação, de modo a que, como postulado para as proteínas prião ou péptidos amilóides. De modo a estudar estas proteínas, elas têm que ser solubilizadas em condições cao-trópicas, por adição de detergentes, na presença de soluções aquosas com pH extremo (ácido ou básico) e adição de solventes orgânicos, tais como acetonitrilo, etanol, iso-propanol, propanol, piridina. Isto é frequentemente problemático, se não impossível, especialmente se as proteínas não deverem ser prejudicadas na sua actividade para realizar mais investigação após solubilização/ purificação.

Materiais comuns aplicados em cromatografia de afinidade são normalmente parceiros de ligação de potencial ligação em condições cosmotróficas ou fisiológicas, mas não 3 ΡΕ1874825 em condições caotrópicas. Consequentemente, as componentes purificadas por afinidade são frequentemente eluidas a partir do material de cromatoqrafia de afinidade aplicando condições caotrópicas. 0 pedido de patente internacional WO 01/11057 refere-se a um processo para a produção recombinante de uma proteína de fusão compreendendo uma autoprotease pestiviral Npr0. É por isso um objectivo da presente invenção proporcionar um método para a ligação de afinidade de um polipéptido heterólogo de interesse, em que o referido polipéptido é expresso como polipéptido de fusão da autoprotease pestiviral Npr0 ou de seus derivados, e em que o referido polipéptido de fusão é colocado em contacto em condições caotrópicas com uma matriz de afinidade compreendendo uma fase sólida e um ligando de afinidade compreendendo ligações peptídicas acopladas a esta fase sólida, em que o ligando de afinidade compreendendo a ligação peptídi-ca é seleccionado a partir do seguinte grupo de ligandos: a) péptidos que compreendem a fórmula X1X2X3X4, em que Xi até X4 são resíduos de aminoácidos e pelo menos dois de Xx até X4 é W, Y ou F; b) péptidos que compreendem a fórmula X5XsXiX8, em que X5 até Xe são resíduos de aminoácidos, pelo menos um de X5 até X8 é W, e pelo menos um de X5 até X8 é E ou D; e 4 ΡΕ1874825 c) poli-aminoácidos que consistem num monómero de aminoácidos do grupo que consiste em R, K, E e D e um monómero de aminoácido do grupo que consiste em Y, Fe W, preferencialmente poli-KY, poli-KF, poli-KW, poli-RY, poli-RF, poli-RW, poli-EY, poli-DY, poli-EF, poli-EW, poli-DF e poli-DW, com a condição de os péptidos de acordo com a) e b) possuírem um comprimento máximo de 35 resíduos de aminoácidos e que os poli-aminoácidos de acordo como c) possuem um comprimento mínimo de 20 resíduos de aminoácidos, e em que o referido polipéptido de fusão está ligado à referida matriz em condições caotrópicas.

Preferencialmente, os péptidos de acordo com a) e b) (de aqui em diante também referidos como "oligopé-ptidos") possuem um comprimento de 5 até 12, especialmente de 6 até 8, resíduos de aminoácidos. Preferencialmente, pelo menos um aminoácido carregado positivamente está presente nestes oligopéptidos. Os poli-aminoácidos de acordo com c) possuem um comprimento preferido de pelo menos 35 resíduos de aminoácidos, mais preferido pelo menos 50 resíduos de aminoácidos, especialmente pelo menos 100 resíduos de aminoácidos. Poli-aminoácidos especificamente preferidos são e.g., poli-aminoácidos comercialmente disponíveis para meios de cultura, tais como poli-KW, 4:1 (PM 20 000 - 50 000 Da; produto SIGMA N°. P9285), poli-KY, 4:1 (PM 20 000 - 50 000 Da; produto SIGMA N° . P4695) ou poli-KF, 1:1 (PM 20 000 - 50 000 Da; produto SIGMA N° . P3150) . 5 ΡΕ1874825 0 ligando de afinidade utilizado no método de acordo com a presente invenção pode ser modificado quimicamente, especialmente acetilado, esterifiçado, amidado, oxidado, reduzido ou proporcionado com uma molécula ligan-te. 0 ligando de afinidade é preferencialmente ligado a uma matriz sólida por ligações covalentes. Os ligandos de afinidade e as matrizes de acordo com a presente invenção possuem uma afinidade elevada para ligação a Npr0, seus derivados e suas proteinas de fusão, que podem ser expressas como corpos de inclusão. Especificamente, estes ligandos ou matrizes de afinidade ligam-se a Npr0, seus derivados e suas proteinas de fusão, em condições caotrópicas, pelo menos a parte Npr0 de e.g., uma proteina de fusão. Os ligandos de afinidade de acordo com a presente invenção exercem um grau elevado de especificidade para a sua capacidade de se ligar selectivamente a Npr0, derivados de Npr0 e seus polipéptidos de fusão, em condições desnaturantes. Dentro do âmbito da presente invenção, um tal ligando de afinidade é dirigido contra a parte do polipéptido de fusão de acordo com a invenção que exerce a função autoproteolítica. Como material da fase sólida, são apropriados todos os materiais já aplicados no presente campo. Preferencialmente, a fase sólida é seleccionada a partir do grupo que consiste em material de cromatografia, especialmente suportes baseados em celulose, agarose, acrilamida, poli (estireno-divinilbenzeno) ou copolimeros de 6 ΡΕ1874825 etilenoglicol-metacrilato, placas de microlitro, membrana de nitrocelulose, microchips, placas de vidro, ou suportes revestidos com metal.

De acordo com a presente invenção podem ser utilizados vários tipos de suportes de fase sólida, tais como os suportes baseados em celulose, agarose (géis de Sepharose ou Macro-Prep), dextrano (géis de Sephadex), acrilamida (géis de Sephacryl, Trisacryl), silica (géis TSK, SW), poli(estireno-divinilbenzeno) (géis Source ou Poros), copolimeros etilenoglicol-metacrilato (géis Toyopearl HW, TSK, PW, fractogel EMD) ou misturas, em particular de agarose e dextrano (gel de Superdex). Os suportes aprovados para utilização humana ou veterinária pelas autoridades competentes Norte-Americanas (FDA, Administração de alimentos e fármacos) ou as Agências da União Europeia serão mais particularmente seleccionadas. Adicionalmente, o suporte seleccionado deve ser ligado, preferencialmente por ligação covalente, ao ligando de afinidade de acordo com a presente invenção (o suporte diz-se ser funcionalizado). A matriz de fase sólida pode compreender, como a estrutura da matriz, qualquer material natural ou sintético e orgânico ou inorgânico conhecido per se como sendo aplicável na separação de proteínas em fase sólida e outras biomoléculas, e.g., polissacáridos naturais ou sintéticos, tais como agar-agar e agaroses; celuloses, éteres de celulose, tais como hidroxipropil celulose, carboximetil celulose; amidos; gomas tais como goma de guar, e goma arábica, goma ghatti, goma tragacanto, goma de 7 ΡΕ1874825 alfarroba, goma de xantano; pectinas; mucinas; dextranos; quitinas; quitosanos; alginatos; carragenanos; heparinas; gelatinas; polímeros sintéticos, tais como poliamidas, tais como poliacrilamidas e polimetacrilamidas; poliimidas; poliésteres; poliéteres; compostos poliméricos de vinilo, tais como álcoois polivinílicos e poliestirenos; polialquenos; materiais inorgânicos, tais como materiais de silício, tais como dióxido de silício incluindo sílica amorfa e quartzo; sílicas; silicatos de metal, vidros e cerâmicas porosos; óxidos de metal e sulfuretos, ou combinações destes materiais naturais ou sintéticos e orgânicos ou inorgânicos. A estrutura da matriz é preferencialmente selec-cionada a partir de agar-agar, agaroses, celuloses, éteres de celulose, tais como hidroxipropil celulose, carboximetil celulose, poliamidas, tais como poli(met)acrilamidas, álcoois polivinílicos, sílicas, e vidros de poro controlado.

Materiais de fase sólida especialmente interessantes, como estruturas de matriz são e.g., esferas de agar ou agarose, tais como esferas de Sepharose e Superose de Pharmacia Biotech, Suécia e Biogel A da Biorad, EUA; esferas à base de dextrano, tais como Sephadex, Pharmacia Biotech; esferas à base de celulose e membranas tais como celulose Perloza de Secheza, República Checa; esferas de compósito, tais como Sephacryl e Superdex, Pharmacia Biotech; esferas de polímeros orgânicos sintéticos, tais como Fractogel de Toso-Haas, EUA; meio POROS de Perceptive ΡΕ1874825

Biosystems, EUA, Bio-Rex, Bio-Gel P e Macro Prep da Biorad, HEMA e Separon de TESSEK e meios Hyper D e Trisacryl de BioSepra, EUA, Enzacryl e Azlactone, 3M, EUA; esferas de materiais silicioso, tais como vidro de poro controlado, PROSEP, de Bioprocesing, Inglaterra e Spherocil, BioSepra; e compósitos de revestimento de silica na forma de esferas ou membranas, tais como ACTI-DISK, ACTI-MOD e CycloSep de Arbor Technologies, EUA.

Tipicamente, a estrutura de matriz de fase sólida, assim como a matriz de fase sólida funcionalizada resultante, pode, e.g., estar na forma de partículas irregulares ou contas esféricas, membranas ou películas, superfícies moldadas, ou tiras. 0 material de fase sólida pode ser ainda totalmente ou parcialmente permeável ou completamente impermeável às proteínas. Numa forma de realização particularmente interessante da presente invenção, a matriz está na forma de contas irregulares ou esféricas com tamanhos no intervalo de 1-10000 pm, preferencialmente 10-1000 pm; tais como 10-60 pm para aplicações de desempenho elevado e tais como 50-500 pm, preferencialmente 50-300 pm, para objectivos preparativos.

Uma forma interessante particular da matriz é uma matriz de densidade controlada na forma de um conglomerado compreendendo partículas de controlo de densidade. Estes conglomerados são especialmente aplicáveis em operações de larga escala para cromatografia de leito fluidisado ou expandido, assim como técnicas de cromatografia de tipo 9 ΡΕ1874825 descontínuo diferentes em colunas não empacotadas, e.g., adsorção descontínua simples em tanques agitados.

Os ligandos de afinidade para utilização no método de acordo com a presente invenção podem ser ligados ao material de fase sólida através de qualquer tipo de ligação covalente per se a ser aplicável para este objectivo, quer por uma reacção química directa entre o ligando de afinidade de acordo com a presente invenção e o material de fase sólida ou através de uma activação anterior do material de fase sólida ou do ligando com um reagente adequado conhecido per se tornando possível ligar a estrutura de matriz e o ligando. Exemplos desses reagentes de activação adequados são epicloro-hidrina, epibromo-hidrina, alilglicidiléter; bis-epóxidos, tais como butanodioldiglicidiléter; compostos alifáticos substituídos por halogéneo, tais como di-cloropropanol, divinilsulfona; carbonildiimidazole; aldeídos tais como dialdeído glutá-rico; quinonas; brometo de cianogénio; periodatos tais como meta-periodato de sódio; carbodiimidas; clorotriazinas tais como cloreto cianúrico; cloretos de sulfonilo, tais como cloretos de tosilo e cloretos de tresilo; N-hidroxi succinimidas; 2-fluoro-l-metilpiridínio tolueno-4-sulfo- natos; oxazolonas; maleimidas; persulfuretos de piridilo; e hidrazidas. Entre estes, os reagentes de activação que deixam um grupo espaçador SP1 diferente de uma ligação simples, e.g., epicloro-hidrina, epibromo-hidrina, alilglicidiléter; bis-epóxidos; são preferidos compostos alifáticos substituídos por halogéneo; divinilsulfona; 10 ΡΕ1874825 aldeídos; quinonas; brometo de cianogénio; cloro-triazinas; oxazolonas; maleimidas; persulfuretos de piridilo; e hidrazidas.

Crê-se que reagentes de activação especialmente interessantes sejam compostos epoxi, tais como epicloro-hidrina, alilglicidiléter e butanodioldiglicidiléter.

Para cromatografia de afinidade de péptidos dentro do âmbito da presente invenção, pode ser utilizada qualquer matriz útil para a imobilização dos ligando peptídicos. Preferencialmente é utilizado Fractogel epoxy (M) , da Merck, Darmstadt, Alemanha) ou "meio de cromato-grafia monolítico" CIM-epoxi igualmente preferido. Os ligandos podem ser imobilizados quer directamente na estrutura quimicamente activada da matriz de cromatografia, ou através de um espaçador ou ligante. Neste último caso, é acoplado um espaçador à matriz cromatográfica, o referido espaçador é então activado quimicamente, de modo a permitir a ligação do ligando. Preferencialmente são utilizadas matrizes de Fractogel epoxi em combinação com espaçadores.

Numa forma de realização particularmente preferida da presente invenção, o espaçador é criado pela reacção da matriz cromatográfica com diaminodipropilamina (DADPA) e subsequente reacção com anidrido succínico (SA) . O grupo do terminal carboxilo resultante no espaçador é activado quimicamente e preferencialmente ligado a um aminogrupo terminal. O ligando é imobilizado na matriz ou 11 ΡΕ1874825 no espaçador através de um grupo reactivo que compreende. No caso de ligandos peptídicos, esses grupos reactivos podem ser o grupo amino, carboxilo ou o grupo sulfidrilo. Na presente invenção, a ancoragem do péptido na matriz ou o espaçador através de uma ligação amino é particularmente preferida.

Preferencialmente, a matriz de afinidade para utilização no método de acordo com a presente invenção, especialmente proporcionada como material de cromatografia de afinidade, apresenta ligandos oligopeptidicos como definido em a) e b) acima ou poli-aminoácidos, como definido em c) acima.

Como aqui utilizado, o termo "oligopéptidos" referem-se a compostos proteicos, contendo pelo menos três aminoácidos. Normalmente, esses oligopéptidos possuem um comprimento de até 35 aminoácidos, preferencialmente um comprimento de 4 até 20 residuos de aminoácidos.

Consequentemente, numa forma de realização preferida da presente invenção o sistema de cromatografia de afinidade utiliza um ligando oligopeptidico de cinco até doze aminoácidos de comprimento, mais preferido de seis até oito aminoácidos de comprimento, especialmente compreendendo um residuo de triptofano, cujo ligando se liga selec-tivamente à parte do polipéptido de fusão que exerce função autoproteolitica em condições caotrópicas e mantém a ligação durante a alteração assim como em condições cosmo-trópicas. 12 ΡΕ1874825

Esta forma de cromatografia de afinidade faz uso da ligação especifica de certos polipéptidos a outros polipéptidos, como por exemplo conhecidos de anticorpos. Os oligopéptidos são capazes de servir como ligandos de afinidade também. Estas moléculas oferecem estabilidade quimica elevada, eficiência, selectividade, baixo preço e normalmente não são tóxicos. Estas caracteristicas são consideradas como uma vantagem, especialmente quando aplicadas num processo biofarmacêutico. Os ligandos peptídicos dirigidos contra uma molécula alvo podem ser identificados a partir de bibliotecas de péptidos combinatórios ou bibliotecas biológicas de um modo conhecido de um especialista na matéria. No contexto da presente invenção, o rastreio para ligandos peptídicos foi realizado em condições caotrópicas.

Estes ligandos de afinidade para utilização no método de acordo com a presente invenção demonstraram ser caracterizados especificamente pela sua capacidade para se ligarem a Npr0 e proteínas de fusão Npr0 (e proteínas que são ou compreendem mutantes destes) em condições desnaturantes, e.g., ureia a 4 M. Métodos para a síntese de péptidos conhecidos na técnica, são adequados para a preparação dos ligandos oligopeptídicos que são sujeitos à presente invenção. Preferencialmente, todavia, os ligandos peptídicos são criados por síntese de SPOT, síntese de PIN, síntese de 13 ΡΕ1874825 sacos de chá, método de mistura e separação, descrito em Ruiwu Liu, et al. Experimental Hematology 31 (2003) 11-30 ou o método PELICAN, descrito em Joseph A. Buettner et al., Int. J. Peptide Protein Res. 47 (1996), 70-83. Podem ser aplicados vários produtos quimicos ligantes para ancorar o primeiro aminoácido. Numa forma de realização preferida da presente invenção, os ligandos são criados separadamente e posteriormente imobilizados na matriz cromatográfica. Noutra forma de realização preferida da presente invenção, os ligandos peptidicos são sintetizados directamente na matriz cromatográfica. O ligando oligopeptidico exerce um grau elevado de especificidade. Os oligopéptidos que são sintetizados no âmbito da presente invenção são caracterizados pela sua capacidade para ligar selectivamente Npr0, derivados de Npr0 e seus polipéptidos de fusão em condições desnaturantes. Dentro do âmbito da presente invenção, um tal ligando oligopeptidico é dirigido contra a parte do polipéptido de fusão de acordo com a invenção que exerce função autoproteolitica.

Noutra forma de realização preferida da presente invenção o ligando oligopeptidico possui uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em VSIFEW, AVSIEWY, AVSFIWY, VSFIWYK, ASRFWYA, AFYTWYA, AFYRWYK, AFYRWY, AFYRWYA, AVSIFEWY, AVSRNWY, ASRFWY, AFYRWYAA, AFYRWY, ASRFWYAA, AFYRWYAA e AFYSWYAA. 14 ΡΕ1874825

Dentro do âmbito da presente invenção, os ligandos oligopeptídicos podem ser utilizados com um terminal N livre ou com um terminal N bloqueado, sendo o bloqueamento alcançado e.g., através de ac(et)ilação. É muito preferida uma forma de realização da presente invenção, em que o derivado da Npr0 de CSFV que ocorre naturalmente, de acordo com SEQ ID N° 5 (uma vez que a sequência de aminoácidos deste mutante possui um motivo de sequência "EDDIE" do resíduo 53 até 57 (em vez de "RGDIR" no tipo selvagem), este mutante (e outros mutantes que compreendem este motivo) é aqui denominado mutante "EDDIE") é utilizado em combinação com um ligando oligope-ptídico seleccionado do grupo que consiste em ASRFWYA, AFYTWYA, AFYRWYK, AFYRWY e AFYRWYA.

Consequentemente, os ligandos de afinidade preferidos são seleccionados a partir do grupo que consiste em VSDDWY, VSEDWY, VSIDWY , VSYDWY, VSVDWY , VSWDWY, r VSYDWY VSFDWY, VSDEWY, VSEEWY, VSIEWY, VSYEWY, VSVEWY, VSWEWY VSYEWY, VSFEWY, DDDDWY, DDEDWY, DDIDWY, DDYDWY, DDVDWY DDWDWY, DDYDWY, DDFDWY, VSIFWE, FSIFEW, WSIFEW, VSLIWY VSLIDW, VSLIEW, VSLIWE, FSLEEW, VSDLDW, VSDLEW, VSYIDW VSYIWE (todos estes péptidos se ligam a . Npr0 a pH 5,5) VSIDWY, VSIEWY, VSIWWY, VSIIWY, VSYIWY, VSVIWY, VSFIWY VSFIWE, VSIFEW, VSIFWE, FSIFEW, WSIFEW, VSLIWY, VSLIDW VSLIEW, VSLIWE, FSLIEW, WSLIEW, FSYFEW, FSFYEW, WSFYEW FSYIEW, WSYIEW (todos estes péptidos se ligam a Npr0 a pl 7,3), AFYTWYA, AFYRWYK, AFYRWY, AFYRWYA, AFFRWYA, AFGRWYA, 15 ΡΕ1874825 AFHRWYA, AFIRWYA, AFLRWYA, AFMRWYA, AFNRWYA, AFPRWYA, AFQRWYA, AFRRWYA, AFSRWYA, AFTRWYA, AFVRWYA, AFYRWYA, AFYFWYA, AFYGWYA, AFYLWYA, AFYMWYA, AFYNWYA, AFYPWYA, AFYTWYA, AFYVWYA, AFYWWYA, AFYYWYA, AKWFRYA, VSRNWY, ASRNWYA, ASRFWYA, FSRNWYA, VFRNWYA, VWRNWYA, VYRNWYA, VSRAWYA, VSRFWYA, VSRWWYA, VSRYWYA, VSRNFYA, VSRNYYA, VSRNWFA, VSRNWWA (todos estes péptidos possuem uma afinidade especificamente elevada para mutantes de Npr0 com o motivo EDDIE nos residuos de aminoácidos 53 até 57) , Ac-

Ac-AFYRWYAK, Ac-Ac-AFIRWYAK, Ac-Ac-AFPRWYAK, Ac-Ac-AFTRWYAK, Ac- AFYTWYAK, Ac-AFYRWYKK, Ac-AFYRWYK, AFFRWYAK, Ac-AFGRWYAK, Ac-AFHRWYAK, AFLRWYAK, Ac-AFMRWYAK, Ac-AFNRWYAK, AFQRWYAK, Ac-AFRRWYAK, Ac-AFSRWYAK, AFVRWYAK, Ac- AFYRWYAK, Ac-AFYFWYAK, Ac-AFYGWYAK, Ac-

Ac-AFYPWYAK, Ac-AFYYWYAK, Ac-ASRFWYAK, Ac-VYRNWYAK,

Ac- Ac- Ac- Ac- AFYLWYAK, Ac-AFYMWYAK, Ac-AFYNWYAK, AFYTWYAK, Ac-AFYVWYAK, Ac-AFYWWYAK, AKWFRYAK, Ac-VSRNWYK, Ac-ASRNWYAK, FSRNWYAK, Ac-VFRNWYAK, Ac-VWRNWYAK, VSRAWYAK, Ac- VSRFWYAK, Ac-VSRWWYAK, Ac-VSRYWYAK, Ac-VSRNFYAK, Ac-VSRNYYAK, Ac-VSRNWFAK, Ac-VSRNWWAK, YWKA, Ac-YWKAK, YKYA, Ac-YKYAK, YWRA, Ac-YWRAK, ARWY, Ac-ARWYK, YWRA, Ac-YWRAK (todos estes péptidos possuem capacidades de imobilização melhoradas para o substrato devido a acetilação N-terminal e lisinação C-terminal). É uma caracteristica especifica da matriz de afinidade para utilização no método de acordo com a presente invenção que se liga especificamente à autoprotease Npr0 de pestivirus (Npr0) ou mutantes Npr0, e 16 ΡΕ1874825 proteínas de fusão Npr0. A ligação destas proteínas às presentes matrizes é tão eficiente que as proteínas são normalmente também ligadas em condições não caotrópicas. Por isso, as matrizes de acordo com a presente invenção são especificamente concebidas em relação à fase sólida e a afinidade alinhada para permitir uma ligação eficiente de autoprotease Npr0 de pestivírus (Npr0) ou mutantes Npr0, e proteínas de fusão Npr0 tanto em condições caotrópicas como não caotrópicas.

De acordo com outro aspecto, a presente revelação refere-se a um método para a ligação de afinidade de uma proteína de uma preparação de partida líquida, em que a referida proteína é colocada em contacto com uma matriz de afinidade de acordo com a presente invenção em condições caotrópicas através das quais a referida proteína se liga à referida matriz e separada da referida preparação de partida líquida.

Os termos "cosmotropo" (fazedor de ordem) e "cao-tropo" (fazedor de desordem) originalmente designam solutos que estabilizaram, ou desestabilizaram respectivamente, proteínas e membranas. Mais tarde, eles referiram-se à propriedade aparentemente correlacionada de aumento, ou diminuição respectivamente, a estruturação da água. Essas propriedades podem variar dependendo das circunstâncias, método de determinação ou a(s) capa(s) de solvatação investigada. Um termo alternativo utilizado para cosmotropo é "soluto compensatório" na medida em que se verificou que 17 ΡΕ1874825 eles compensam os efeitos nocivos dos conteúdos de sal elevado (que destroem a rede de ligação de hidrogénio natural da água) em células sob stresse osmótico. Tanto a extensão como a força de ligação de hidrogénio podem ser alteradas independentemente pelo soluto, mas qualquer um destes pode ser, e tem sido, utilizado como medidas de produção de ordem. É, contudo, os efeitos da extensão da qualidade de ligação de hidrogénio que é de primordial importância. Os efeitos de ordenamento de cosmotropos podem ser confundidos pela sua rotação difusional, que cria zonas de junção desorganizada mais extensivas de desordem superior com a água em grosso circundante do que os caotropos menos hidratados. A maioria dos cosmotropos não provoca uma rede de grande escala estruturante na água.

Os cosmotropos iónicos (ou: "anticaotropos" para os distinguir de cosmotropos não iónicos) devem ser tratados de forma diferente dos cosmotropos não iónicos, devido principalmente aos arranjos dirigidos e polarizados das moléculas de água circundantes. Geralmente, o comportamento iónico é equivalente ao da série Hofmeister. Iões grandes com carga única, iões com baixa densidade de carga (e.g., SCN", H2P04~, HS04", HC03", I", Cl", N03", NH4+, Cs+, K+, (NH2)3C+ (guanidinio) e (CH3)4N+ (tetrametilamónio) ; apresentando interacções mais fracas com água do que a água com ela própria e desse modo interferindo pouco na ligação de hidrogénio da água circundante), são caotropos enquanto que iões pequenos ou com carga múltipla, com densidade de carga elevada, são cosmotropos (e.g., S042- HP042”, Mg2+, Ca2+ 18 ΡΕ1874825

Li+, Na+, H+, OH" e HP042“, apresentando interacções mais fortes com moléculas de água do que a água com ela própria e por isso capaz de quebrar as ligações de hidrogénio água-água) . Os raios dos iões caotrópicos de carga única são superiores a 1,06 Â para catiões e superior a 1,78 Â para aniões. Assim, a ligação de hidrogénio entre as moléculas de água está mais quebrada na vizinhança imediata de cosmotropos iónicos do que caotropos iónicos. Reforçando esta conclusão, um estudo de espectroscopia de Raman da estrutura de ligações de hidrogénio da água no redor dos iões haleto F”, Cl", Br“ e I" indica que a extensão total da ligação de hidrogénio aquosa aumenta com o tamanho iónico crescente e um estudo de IV em HD0:D20 apresentou uma reorientação lenta da ligação de hidrogénio no redor destes iões haleto ficando mais lenta em relação ao tamanho crescente. Não é irracional que um soluto possa fortalecer algumas das ligações de hidrogénio que o circundam (produção de estrutura; e.g., os catiões cosmotrópicos irão fortalecer as ligações de hidrogénio doadas pelas molécula de água da capa interna) enquanto que ao mesmo tempo se quebram algumas outras ligações de hidrogénio (quebra de estrutura; e.g., os catiões cosmotrópicos irão enfraquecer as ligações de hidrogénio aceites pelas moléculas de água da capa interna) . Sendo os outros factores iguais, as moléculas de água são mantidas mais fortemente pelas moléculas com uma carga absoluta do que por moléculas sem carga absoluta; Como apresentado pela diferença entre aminoácidos zwitteriónicos e catiónicos. 19 ΡΕ1874825

Os iões fracamente hidratados (caotropos, K+, Rb+, Cs+, Br", I-, guanidínio+) podem ser "empurrados" para superfícies fracamente hidratadas através de interacções água-água fortes com a transição de hidratação iónica forte pata hidratação iónica fraca a ocorrer quando a força da hidratação ião-água iguala aproximadamente a força das interacções água-água na solução em grosso (sendo Na+ a fronteira no lado forte e sendo Cl” a fronteira no lado fraco). Estudos de difracção de neutrões em dois caotropos importantes (iões guanidínio e tiocianato) demonstram a sua hidratação muito pobre, apoiando a sugestão de eles interagirem preferencialmente com a proteína em vez de com a água. Em contraste como os cosmotropos, há pouca diferença significativa entre as propriedades dos caotropos iónicos e não iónicos devido à baixa densidade de carga do anterior. A estabilização óptima da macromolécula biológica por sal requer uma mistura de um anião cosmotrópico com um catião caotrópico.

Os caotropos quebram a rede de ligação de hidrogénio da água, permitindo desse modo que às macromoléculas mais liberdade estrutural e encorajando a extensão e desnaturação da proteína. Os cosmotropos são solutos de estabilização que aumentam a ordem da água (tais como álcoois poli-hídricos, trealose, N-óxido de trime-tilamina, betaína de glicina, ectoína, prolina e vários outros zwitteriões), enquanto que os caotropos criam 20 ΡΕ1874825 ligação de hidrogénio mais fraca, diminuindo a ordem da água, aumentando a sua tensão de superficie e desestabili-zando as estruturas macromoleculares (tais como cloreto de guanidinio e ureia a concentrações mais elevadas). Trabalho recente demonstrou que a ureia enfraquece tanto a ligação de hidrogénio como as interacções hidrofóbicas, mas a glucose actua como um cosmotropo, aumentando estas propriedades. Assim, quando as moléculas de ureia são menos do que optimamente hidratadas (cerca de 6 - 8 moles de água por mole de ureia) o hidrogénio da ureia liga-se a si próprio e à proteína (significativamente envolvendo as ligações peptídicas) na ausência de água suficiente, tornando-se assim mais hidrofóbica e desse modo mais capaz de interagir com outros sítios na proteína, conduzindo a desnaturação de leito de desidratação localizado. O guani-dínio é um ião planar que pode formar ligações de hidrogénio fraca em redor da sua margem, mas pode estabelecer pares de iões ligados a hidrogénio fortemente mantidos, a carboxilatos de proteína, semelhantes a ligações de "sal" de carboxilato de arginina estruturais quaternários que se encontram normalmente. Também, o guanidinio possui superfícies bastante hidrofóbicas que podem interagir com superfícies de proteína semelhantes para permitir a desnaturação de proteínas. Ambos os des-naturantes podem provocar o aumento de volume da proteína e desestruturação deslizando entre os sítios hidrofóbicos e consequentemente arrastando água ligada a hidrogénio para completar a desnaturação. 21 ΡΕ1874825

Geralmente a natureza cosmotrópica/caotrópica de um soluto é determinada a partir das propriedades físicas em grosso da água, frequentemente a concentração necessariamente elevada. A alteração no grau de estruturação pode ser encontrada, por exemplo, utilizando RMN ou espectroscopia vibracional. Os solutos de estabilização de proteína (cosmotropos) aumentam a extensão da ligação de hidrogénio (reduzindo o protão e tempos de relaxação de cortina de spin de 170) , enquanto que o desvio químico de RMN pode aumentar (apresentando ligação mais fraca, e.g. o cosmotropo zwitteriónico, N-óxido de trimetilamina) ou diminuir (apresentando ligação mais forte, e.g. o cosmotropo poli-hidroxilo, trealose). A trealose apresenta tanto uma redução no desvio químico e o tempo de relaxamento, como numa menor extensão o faz o estabilizador de proteína (NH4) 2S04, enquanto que o NaCl apenas apresenta uma redução no desvio químico e o estabilizador de proteína KSCN apresenta um aumento no tempo de relaxamento e uma redução no desvio químico. A espectroscopia vibracional pode utilizar o comprimento de onda próximo dos IV próximo de 5200 cm-1 (combinação v2 + v3) , que desvia em direcção a comprimentos de onda mais compridos (menor número de onda) quando as ligações de hidrogénio são mais fortes.

Um dos cosmotropos mais importantes é o açúcar de não redução α,α-trealose. Deve talvez ser referido que a trealose possui uma estrutura estática muito mais estática do que os açúcares de redução, devido à sua falta de mutarrotação, ou o outro dissacárido comum de não redução, sacarose, devido á sua falta de um anel de furano. 22 ΡΕ1874825

Consequentemente, o termo "condições caotrópicas" deve ser encarado individualmente na natureza da preparação de iniciação liquida (que pode e.g., ser uma solução, uma suspensão, uma emulsão, um sistema liquido de duas ou três fases, etc.), especialmente - em preparações que contêm mais do que uma fase - na fase aquosa da preparação. Condições caotrópicas preferidas de acordo com a presente invenção são aquelas que correspondem a uma concentração de ureia de 1 até 7 M, especialmente desde 2 até 6 M (preferencialmente numa solução salina tamponada, tais como 8,0 g NaCl, 0 2 g KC1, 1,44 g Na2HP04, 0,24 g KH2P04 a 1000 mL com A. dest., pH 7,4 com HC1). A correspondência de condições caotrópicas (assim como a redução de caotro-picidade (condições "inferiores" ou "menos caotrópicas")) pode ser facilmente determinada pelos métodos mencionados acima assim como as através da aplicação dos ensinamentos da série Hofmeister. A adição de várias substâncias no liquido inicial tem de ser verificada em casos individuais de modo a proporcionar condições óptimas de ligação/não agregação para ligação. Por exemplo, a utilização de agentes de redução deve ser optimizada para corresponder a uma quantidade de 0,05 até 50 mM de ditiotreitol (DTT) , especialmente 0,1 até 10 mM de DTT. Para além disso, também a adição de detergentes pode, como descrito acima, influenciar a caotropicidade da preparação de partida.

Preferencialmente, a proteína ligada à matriz é ainda processada enquanto está a ser ligada à referida 23 ΡΕ1874825 matriz. Esse outro processamento pode ser preferencialmente uma derivação quimica, complexação, degradação, etc., especialmente (no caso de uma proteina de fusão com uma unidade autocatalitica) autoproteólise. Este outro processamento pode também ser realizado preferencialmente em condições que são menos caotrópicos do que no material de partida. Normalmente, as condições óptimas para estes outros passos de processamento estão dependantes das condições óptimas para a própria reacção de processamento equilibrada com as necessidades de manter a afinidade da proteina ligada à matriz de afinidade do ligando de afinidade.

Para proporcionar a proteina ligada e opcionalmente processada na forma solúvel, a proteina tem que ser eluida novamente a partir do veiculo ou - se fornecido como uma proteina de fusão compreendendo uma parte autoproteo-lítica e uma parte de proteina alvo - pelo menos a parte da proteina alvo da proteina de fusão. Isto pode ser realizado de várias formas. No caso de uma proteina de fusão com uma parte autocatalitica, a eluição é realizada através da reacção autoproteolítica. Neste caso, a parte de autopro-tease fica na matriz de afinidade. Noutros casos, a proteina ligada à matriz ou à referida proteina processada é mantida na matriz, preferencialmente mesmo quando é aplicado um tampão de eluição com uma caotropicidade mais baixa que a preparação do liquido de partida. Preferencialmente, pelo menos a parte autoproteolitica da proteina de fusão é mantida ligada à matriz. 24 ΡΕ1874825

Noutros casos, a proteína pode ser mantida na matriz de afinidade e utilizada como um imobilizado, e.g. para proporcionar enzimas imobilizadas. Devido à ligação não covalente, mas todavia forte, da proteína à superfície sólida, a enzima imobilizada é utilizável em processos industriais, especialmente proporcionando (enzimaticamente, cataliticamente) superfícies activas, se a proteína imobilizada possui actividades enzimáticas.

De acordo com a presente invenção, a proteína é um polipéptido heterólogo recombinante gue compreende uma parte autoproteolítica e uma parte gue consiste numa proteína de interesse que é autoproteoliticamente clivável em condições não caotrópicas pela referida unidade autoproteolítica, em que a parte autoproteolítica é a autoprotease Npr0 de pestivírus (Npr0) ou mutantes Npr0, e proteínas de fusão Npr0 expressas como corpos de inclusão em condições desnaturantes.

De acordo com uma forma de realização preferida de um processo como descrito acima, o polipéptido de fusão compreende um derivado de uma autoprotease Npr0 de CSFV, em que adicionalmente à substituição de pelo menos um resíduo de cisteína, como descrito acima, pelo menos um resíduo de aminoácido básico é substituído por um resíduo de aminoácido acídico. É dada outra preferência a um derivado de uma 25 ΡΕ1874825 autoprotease Npr0 de CSFV, em que adicionalmente à substituição de pelo menos um resíduo de cisteína como descrito acima, para além disso, pelo menos um dos seguintes aminoácidos são trocados: H5, K16, N35, R53, G54, R57, L143, K145 e R150. Um exemplo preferido é um derivado em que os seguintes aminoácidos são trocados: arginina (R) 53 com ácido glutâmico (E), glicina (G) 54 com ácido aspártico (D) , arginina (R) 57 com ácido glutâmico (E), e leucina (L) 143 com glutamina (Q).

Assim, noutro aspecto a presente invenção refere-se com outra preferência a um processo como descrito acima, em que o polipéptido de fusão compreende um derivado de uma autoprotease Npr0 de CSFV, em que adicionalmente à substituição de pelo menos um resíduo de cisteína como descrito acima, os seguintes aminoácidos são trocados: arginina (R) 53 com ácido glutâmico (E), glicina (G) 54 com ácido aspártico (D) , arginina (R) 57 com ácido glutâmico (E) , e leucina (L) 143 com glutamina (Q).

Noutra forma de realização preferida da presente invenção um derivado da autoprotease Npr0 de CSFV compreende a seguinte sequência de aminoácidos: SEQ ID N°: 3 {1} 26 ΡΕ1874825

Assim, noutro aspecto a presente invenção também se refere a um processo como descrito acima, em que o polipéptido de fusão compreende um derivado de uma autoprotease Npr0 de CSFV possuindo uma sequência de acordo com SEQ ID N° 3.

Ainda noutro aspecto, a presente invenção refere-se a um derivado da Npr0 de um Pestivirus que ocorre naturalmente, que apresenta adicionalmente à agregação reduzida e pi mais neutro, mais solubilidade aumentada, em comparação com a Npr0 de um Pestivirus que ocorre naturalmente. A solubilidade é determinada como descrito acima.

Consequentemente, a presente invenção refere-se a um derivado de uma autoprotease Npr0 de CSFV, em que, adicionalmente à substituição de pelo menos um resíduo de cisteína como descrito acima, pelo menos um resíduo de aminoácido hidrofóbico é substituído por um resíduo hidrofílico.

Assim noutro aspecto a presente invenção também se refere a um processo como descrito acima, em que o polipéptido de fusão compreende um derivado de uma autoprotease Npr0 de CSFV, em que adicionalmente à substituição de pelo menos um resíduo de cisteína como descrito acima, pelo menos um resíduo de aminoácido hidrofóbico é substituído por um resíduo hidrofílico. 27 ΡΕ1874825 É preferido na presente invenção um derivado de uma autoprotease Npr0 de CSFV, em que adicionalmente à substituição de pelo menos um residuo de cisteina como descrito acima para além disso pelo menos um dos seguintes aminoácidos são substituídos: V 24, A27, L32, G54, L75, A109, V114, V121, L143, 1155 e F158. Um exemplo preferido é um derivado em que os seguintes aminoácidos são substituídos por treonina (T) : alanina (A) 109, valina (V) 114, isoleucina (I) 155 e fenilalanina (F)158.

Assim, noutro aspecto a presente invenção refere-se preferencialmente a um processo como descrito acima, em que o polipéptido de fusão compreende um derivado de uma autoprotease Npr0 de CSFV, em que adicionalmente à substituição de pelo menos um resíduo de cisteina como descrito acima, os seguintes aminoácidos são substituídos por treonina (T): alanina (A) 109, valina (V) 114, isoleucina (1)155 e fenilalanina (F)158. Outro, no âmbito da presente invenção, um derivado mais preferido de uma autoprotease Npr0 de CSFV, compreende a seguinte sequência de aminoácidos: SEQ ID N°: 4 {1} “MELNHFELLYKTSKQKPVGVSEPVYDTAGRPLFGNPSBVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTL RDLPRKGDCRSGimGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAFLEFFDETQFEETTKRIGRVTGS DGKLYHIYVEVDGEILLKLRKRGTPRTLKWTRNTTNCPWíVTSC- (168)

Assim, noutro aspecto a presente invenção refere-se mais preferencialmente a um processo como descrito 28 ΡΕ1874825 acima, em que o polipéptido de fusão compreende um derivado de uma autoprotease Npr0 de CSFV possuindo uma sequência de acordo com a SEQ ID N° 4.

Ainda mais preferido no âmbito da presente invenção é um derivado de uma autoprotease Npr0 de CSFV, em que adicionalmente à substituição de pelo menos um residuo de cisterna como descrito acima os sequintes aminoácidos foram substituidos: alanina (A) 109, valina (V) 114, isoleucina (I) 155 e fenilalanina (F) 158 por treonina (T), arginina (R) 53 com ácido glutâmico (E), glicina (G) 54 com ácido aspártico (D) , arginina (R) 57 com ácido glutâmico (E), e leucina (L) 143 com glutamina (Q).

Assim, noutro aspecto a presente invenção refere-se ainda mais preferencialmente a um processo como descrito acima, em que o polipéptido de fusão compreende um derivado de uma autoprotease Npr0 de CSFV, em que adicionalmente à substituição de pelo menos um residuo de cisteina como descrito acima os seguintes aminoácidos foram substituidos: alanina (A) 109, valina (V) 114, isoleucina (I) 155 e fenilalanina (F) 158 por treonina (T) ; arginina (R) 53 com ácido glutâmico (E) , glicina (G) 54 com ácido aspártico (D), arginina (R) 57 com ácido glutâmico (E), e leucina (L) 143 com glutamina (Q).

Muito preferencialmente o derivado de uma autoprotease Npr0 de CSFV de acordo com a presente invenção compreende a seguinte sequência de aminoácidos: ΡΕ1874825 29 SEQ ID N°: 5 {1} “MSELNHFELLyKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGKPSSVHPQSTX.KLPHDRGEDDIETTL RDLPRKGDCRSGNHIiGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRARLEFFDETQFEETTKRrGRVTGS DGKLYHIYVEVDGEILLKQftKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-{1685.

Assim, noutro aspecto muito preferido a presente invenção também se refere a um processo como descrito acima, em que o polipéptido de fusão compreende um derivado de uma autoprotease Npr0 de CSFV possuindo uma sequência de acordo com a SEQ ID N° 5.

Noutro aspecto igualmente preferido a presente invenção refere-se a um processo para a produção de proteínas heterólogas como descrito acima, em que o polipéptido de fusão compreende um derivado de uma autoprotease Npr0 de CSFV possuindo uma sequência de acordo com a SEQ. ID N°. 5, em que adicionalmente a asparagina (N) 35 é substituída com treonina (T) , e treonina (T) 158 é substituída com serina (S).

Noutro aspecto preferido a presente invenção refere-se a um processo para a produção de proteínas heterólogas como descrito acima, em que o polipéptido de fusão compreende um derivado de uma autoprotease Npr0 de CSFV possuindo uma sequência de acordo com a SEQ. ID N°. 32, em que adicionalmente a alanina (a) 28 é substituída com ácido glutâmico (E) , a serina (S) 71 é substituída com fenilalanina (F) e a arginina (R) 150 é substituída com histidina (H). 30 ΡΕ1874825

Preferencialmente, no processo de acordo com a presente invenção, o derivado de uma autoprotease Npr0 de CSFV é utilizado na fusão com uma proteína que contém pelo menos os três primeiros aminoácidos da pró-insulina, mais preferencialmente com pró-insulina, ainda mais preferencialmente com pró-insulina humana, muito preferencialmente com pró-insulina humana recombinante, para a produção de pró-insulina. É preferido, de acordo com a presente invenção se o derivado de uma autoprotease Npr0 de CSFV possuir adicionalmente à substituição de pelo menos um resíduo de cisteína como descrito acima, pelo menos um dos seguintes aminoácidos substituídos: arginina (R) 53, glicina (G) 54, arginina (R) 57, treonina (T) 109, 114, 155, 158 e leucina

(L) 143. Derivados preferidos da autoprotease Npr0 de CSFV de acordo com a presente invenção possuem adicionalmente à substituição de pelo menos um resíduo de cisteína como descrito acima, são substituídos os seguintes aminoácidos: arginina (R) 53 com ácido glutâmico (E), glicina (G) 54 com ácido aspártico (D) , arginina (R) 57 com ácido glutâmico (E) , treonina (T) 109, 114, 155, 158 com serina (S) e leucina (L) 143 com glutamina (Q) ou asparagina (N) ou ácido aspártico (D) ou serina (S) ou histidina. Noutras formas de realização, especialmente quando a proteína de fusão se deve ligar à matriz de afinidade de acordo com a presente invenção também em condições não caotópicas, a parte autoproteolítica da proteína de fusão deve ser inactiva ou proporcionada na forma não clivável. É então utilizada apenas para as suas propriedades de afinidade e 31 ΡΕ1874825 não devido às suas propriedades autoproteolíticas; todavia, também esses derivados de Npr0 de CSFV que não apresentam -seja devido a eles próprios ou devido à sua ligação à parte da molécula alvo da proteina de fusão - uma actividade autoproteolitica quando ligados à matriz de afinidade de acordo com a presente invenção - mesmo sem ser em condições não caotrópicas (fisiológicas, "normais")/ são também referidos como (partes) "autoproteoliticas".

Preferencialmente, a parte autoproteolitica é seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N° 1: (Npr0) {2) MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLR DLPRKGDCRSGNHIuGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAGFCEVTKRIGRVTGSD GKLYHIYVCVDGCILLKL&KRGT PRTLKWXRN FTNCPLWVTSC- (168) , SEQ ID N° 2: í 1) MELNHFELLYKXSKQKPVGVEEPWDTAGRPLFGNPSBVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFESVTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKLAKRGT PRTLKWIRNFTNCPLWVTSC- {168) , SEQ ID N° 3: GKLY Hl YVEVDGEILLKQAKRGT PRTLKWIRNFTNCP2WVTSC-(168), SEQ ID N° 4: (1} MELSHFELLYKXSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTkKLPHDRGRGDI RTTLR 01.ΡΒΚΘΟ€Η30ΗΗ6βΡν$βίΥΙΚΡεΡ¥ΥΥΟΟΥΤΰΡνΥΗΚΑΡΙίΕΡΡΟΕΤΟΡΕΒΤΤΚΚ2ΟΚνΤβ3Ο GKLYHIYVEVDGEIIíLKIARRGTPRTLKKTRHTTNCPLWVTSC- {168}, 32 ΡΕ1874825 SEQ ID N° 5: (mutante "EDDIE")

{1} HELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPgSTLKRPHDRGEDDXETTLR DLPRKGDCRSGMHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGFVYHRRPEEFFDETQFEETTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTIíKWTRNTTNCPIíWVTSC- (168) , SEQ ID N° 6: i1}MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGTPSEVH PQSTLKLPHDRGEDDtETTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEXQFEETTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGSILLKOAKRGTPRTLKWTRNSTECPLWVTSC-{168), SEQ ID N° 7: (1) MEI^HFELLYKTSKQKPYGVEEPVYDTEGRPLFGTPSEVHPQSTLKÍ.PHDRGEDDIETTER DLPRKGDCRFGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPHTLKWTRRSTNCPLWVTSC-{168}, SEQ ID N° 8: (1}MELNHFELLyKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLR DLPRKGDCRSGNELGPVSGXYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKSAKRGTPRTEKWSRMSTMCPLSsfVYSC- {168} e SEQ ID N° 9: {1} MELSHFEELYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPIFGTPSEVR PQSTLKLPBDRSRGDIRTTLR DEPRKGDCRSGNHLGPVSGIYlKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVfKRlGEVTGSD εΚΕΥΗΐΥΥΟΥΟΕαίΕΕΚΙ,ΑΚΚεΤΡΕΤΕΚϋίΙΚίίδΤΝΟΡΧ,ΐϊνΤΒΟ- {168) .

Um conjunto de proteínas apresenta uma tendência elevada para se agregarem em condições fisiológicas ou a sua actividade biológica inerente é a agregação, tal como postulado para as proteínas prião ou péptidos amilóides. De modo a estudar estas proteínas elas têm que ser solubi-lizadas em condições caotrópicas, através da adição de detergentes, na presença de soluções aquosas com pH extremo 33 ΡΕ1874825 (ácido ou básico) e adição de solventes orgânicos, tais como acetonitrilo, etanol, isopropanol, propanol, piridina etc. Os péptidos amilóides com tendência elevada para a agregação estão envolvidos num número elevado de doenças. Um resumo das principais amiloidoses e as proteinas ou péptidos envolvidos (Condições que afectam o sistema nervoso central estão escritos em itálico): Síndroma clínica Componente de fibrilha Doença de Alzheimer Péptidos Αβ (1-40, 1-41, 1-42, 1-43); Tau Encefalopatia espongiforme Proteína prião (comprimento total ou fragmentos) Doença de Parkinson α-sinucleico (selvagem ou mutante) Demência fronto-temporal Tau (selvagem ou mutante) Demência Dinamarquesa Familiar Péptido ADan Demência Britânica Familiar Péptidos Abri Hemorragia cerebral hereditária com. Cistatina C (menos um fragmento de 10 amiloidoses resíduos); Péptidos AP Esclerose lateral amilotrófica Superóxido dismutase (selvagem ou mutante) Atrofia dentatorubro-pallido-Luisiana Atrofina 1 (expansão poliQ) Doença de Huntington Huntingtina (expansão poliQ) Ataxia cerebral Ataxinas (expansão poliQ) Doença de Kennedy Receptor de andrógeno (expansão poliQ) Ataxia cerebelar spino 17 Proteína de ligação à caixa TATA (expansão poliQ) Amiloidose sistémica primária Cadeias leves de Ig (comprimento total ou fragmentos) Amiloidose sistémica secundária Amilóide A do soro (fragmentos) Febre do Mediterrâneo familiar Amilóide A do soro (fragmentos) Amiloidose sistémica senil Transtiretina (tipo selvagem ou seus fragmentos Polineuropatia amiloidótica I Familiar Transtiretina (mais de 45 variantes ou seus fragmentos) 34 ΡΕ1874825 (continuação) Síndroma clínica Componente de flbrilha Amiloidose relacionada com a β2-microglobulina hemodiálise Polineuropatia amiloidótica III Apolíproteína A-l (fragmentos) Familiar Amiloidose sistémica hereditária Gelsolina (fragmentos da proteína Finlandesa mutante) Diabetes de tipo II polipéptido amilóide pró-ilha (fragmentos) Carcinoma medular da tiróide Procalcitonina (comprimento total ou fragmento) Amiloidose atrial Factor natriurético atrial Amiloidose sistémica de lisozima Lisozima (comprimento total, mutante) Amilóide relacionado com a insulina Insulina (comprimento total) Amiloidose de cadeia α de fibrinogénio Fibrinogénio (variantes de cadeia α e fragmentos)

Outra classe de proteínas, as proteínas de membrana, estão associadas com a denominada bicamada de membrana. As membranas biológicas desempenham funções vitais como interfaces com o mundo exterior, como interfaces entre células, e fronteiras de compartimentos intracelulares. Assim, as membranas biológicas estão relacionadas com numerosas doenças tais como hiperinsulinemia, diabetes insipidus nefrogénicos, falência cardíaca congestiva, cirrose do fígado, fibrose quística, hiper e hipotensão, edema do pulmão, epilepsia, e cataratas. Cerca de 30% dos genes sequenciados codificam para proteínas de membrana. Todavia, apenas 30 estruturas únicas de proteínas de membrana foram resolvidas até resolução atómica, comparadas com 3000 estruturas cristalinas únicas de 35 ΡΕ1874825 proteínas solúveis, porque é difícil produzir cristais tridimensionais (3D) adequados para análise por raios X de proteínas de membrana solubilizadas com detergente. Entre as 67 estruturas de proteína de membrana depositadas na base de dados de proteínas, 52 são de origem bacteriana, sugerindo que as proteínas de membrana bacterianas são produzidas mais facilmente, purificadas e cristalizadas do que as de plantas ou animais. 0 desafio agora é resolver a estrutura das proteínas de membrana de organismos superiores e estudar a sua função, dinâmica e interacção com os ligandos. As proteínas de membrana constituem um alvo para fármacos importante para uma grande variedade de doenças. Preferencialmente, estas proteínas ("proteínas alvo") são ligadas como proteínas de fusão à matriz de afinidade. Se as proteínas alvo devem ser proporcionadas ou ainda utilizadas na forma imobilizada, a parte autopro-teolítica da molécula de fusão deve ser proporcionada numa forma inactiva ou não clivável. A parte autoproteolítica depois apenas serve como uma pega de afinidade ou marcador para imobilizar a proteína alvo na matriz de afinidade também em condições não caotrópicas.

Doenças de prião, tais como a variante da doença de Creutzfeldt-Jakob (vCJD) em pessoas e o "scrapie" em ovelhas, são caracterizadas pela deposição de PrPSc, uma proteína amilóide anormal, no cérebro. Alterando a conformação de PrPc, PrPSc propaga-se através dos cérebros de pessoas e animais infectados, provocando a neurodege-neração e morte. Ao longo dos anos, foram desenvolvidos 36 ΡΕ1874825 muitos anticorpos para utilização me investigação básica e diagnóstico que reconhecem PrP° isoladamente ou ambos PrP° e PrPSc. Todavia, os anticorpos específicos para PrPSc foram mais elusivos.

As proteínas de membrana (Proteínas de transmem-brana (proteínas integrais)): proteínas de membrana Beta-barril ocorrem nas membranas exteriores de bactérias Gram-negativas, mitocôndria e cloroplastos. As sequências que se estendem pela membrana de proteínas de membrana β-barril são menos hidrofóbicas do que as proteínas de membrana de α-hélice, que é provavelmente a razão principal pela qual as vias de dobragem e montagem de membrana que diferem completamente evoluíram a partir destas duas classes de proteínas de membrana. Algumas proteínas de membrana de β-barril podem ser redobradas espontaneamente num modelo de membranas de bicamada lipídica in vitro. Elas também podem possuir esta capacidade in vivo embora chaperones de lípido e proteína auxiliem provavelmente com a sua montagem em membranas alvo apropriadas. Outras proteínas de membrana importantes são superantigénios. 0 presente método é excelentemente adequado para proporcionar proteínas purificadas intactas (e opcionalmente imobilizadas) que normalmente possuem (em condições fisiológicas) uma tendência elevada para se agregarem e podem por isso não ser purificadas através de métodos convencionais, especialmente não por técnicas de purificação de afinidade. Uma vez que as matrizes de afinidade, 37 ΡΕ1874825 de acordo com a presente invenção possuem a capacidade para ligar proteínas em condições caotrópicas, o presente método pode ser utilizado para purificar por afinidade essas proteínas difíceis, especialmente aquelas proteínas que estão ligadas a doenças humanas. Consequentemente, numa forma de realização preferida da presente invenção, a proteína a ser ligada à presente matriz de afinidade é, ou compreende, uma proteína ou parte de proteína que possui uma tendência para se agregar em condições fisiológicas, especialmente uma proteína seleccionada a partir do grupo consistindo em péptidos Αβ, proteína do Prião Tau, oí-sinucleino, Tau, péptido ADan, péptido ABri, Cistatina C, péptidos Αβ, Superóxido dismutase, Atrofina 1, Huntingtina, Ataxinas, receptor de Androgénio, proteína de ligação a caixa TATA, cadeias leves Ig, amilóide A do soro, Trans-tiretina, Transtiretina, β2-microglobulina, Apolipoproteína A-l, Gelsolina, polipéptido amilóide Pró-ilha, Procal-citonina, Factor natriurético atrial, Lisozima, Insulina, Fibrinogénio, proteínas de comprimento total ou fragmentos específicos, mutantes, variantes ou suas expansões poliQ. ou seus

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o presente método é utilizado para a preparação de um polipéptido heterólogo, em que o referido polipéptido é expresso como polipéptido de fusão da autoprotease pestiviral Npr0 ou de seus derivados, e em que o referido polipéptido de fusão é ligado em condições caotrópicas com um péptido que exerce nessas condições a ligação específica à autoprotease pestiviral Npr0 38 ΡΕ1874825 derivados, e em que o referido péptido está ligado a uma fase sólida. Preferencialmente, tal processo compreende ainda a purificação do referido polipéptido.

Os ligandos de afinidade (as matrizes de afinidade) para utilização no método de acordo com a presente invenção possuem a propriedade de se ligar selectivamente em condições caotrópicas à autoprotease Npr0 de pestivirus (Npr0) ou mutantes Npr0, e polipéptidos de fusão Npr0 das duas últimas, e para manter esta ligação específica durante a alteração assim como em condições cosmotrópicas. A caracte-rística de caracterização dos ligandos de afinidade de acordo com a presente invenção é a sua especificidade de ligação a proteínas, especialmente mutantes Npr0, Npr0, polipéptidos de fusão e proteínas de elevada agregação, em condições caotrópicas. Esta característica torna-as úteis em qualquer tipo de condições experimentais que requeiram a ligação específica das proteínas em condições caotrópicas. Adicionalmente, a ligação específica pode ser mantida durante uma alteração e condições cosmotrópicas. Segue-se que os péptidos, como descrito acima, podem ser utilizados em condições experimentais que requerem ligação à molécula alvo desnaturada e manutenção da ligação durante a redobragem e renaturação da proteína. Consequentemente, os péptidos acima descritos podem ser utilizados por exemplo na captura e purificação de Npr0 em condições desnaturantes, utilizando cromatografia de afinidade do péptido, ou outras para outras formas de purificação de afinidade ou ensaios de afinidade que envolvem a interacção de um ligando e a proteína em condições caotrópicas. 39 ΡΕ1874825

Por exemplo, uma proteína com tendência elevada para agregação é fundida com Npr0 ou um mutante Npr0 e depois a proteína de fusão é purificado ou um extracto bruto é proporcionado a partir da expressão em condições caotró-picas e é incubado com uma superfície coberta (imobilizada) com um ligando de afinidade de acordo com a presente invenção. Depois as condições caotrópicas são subsequentemente substituídas por condições que são adequadas para o processo de reacção posterior ou análises, e.g.: A. As condições caotrópicas são substituídas por um tampão fisiológico e depois a reacção imunológica é realizada utilizando um anticorpo ou fragmento de anticorpo dirigido a um certo domínio da proteína. Esta estratégia permite a reacção imunológica de uma proteína que possui uma tendência elevada para agregar. B. As condições caotrópicas são substituídas e depois é realizada uma reacção química específica para modificar a estrutura da proteína. Exemplos são oxidação específica de uma cadeia lateral de aminoácidos, adição de fosfatos ou sulfatos, adição de um polímero natural ou sintético (e.g., PEGuilação), adição de uma cadeia peptídica de modo a n-ramificar a molécula de proteína, adição de corantes de proteínas que não são solúveis em soluções fisiológicas ou tampões. C. Reconstituição de moléculas simples de uma 40 ΡΕ1874825 proteína de membrana, por fusão da proteína com Npro ou um mutante Npr0. A pega molecular é imobilizada com um ligando de afinidade de acordo com a presente invenção contra a proteína de fusão e é ligada na presença de ureia a 4 Μ. A ureia é subsequentemente removida por detergente e bicamada lipídica.

Quando a ligação do polipéptido de fusão ao sistema de cromatografia foi realizada, os componentes de contaminação não ligados podem ser facilmente removidos da coluna por lavagem. Esses compostos de contaminação podem ser por exemplo polipéptidos de célula hospedeira e ácidos nucleicos, que foram ocluídos em, ou adsorvidos nos corpos de inclusão, e permanecem na solução de polipéptido após solubilização, assim como componentes residuais de um rebentamento enzimático celular. Após lavagem apenas do polipéptido de fusão permanece ligado à coluna de modo a que os passos seguintes são realizados num sistema purificado. A ligação do polipéptido de fusão é estabelecida em condições caotrópicas, inactivantes. De modo a induzir redobragem, as condições são alteradas para cosmotrópicas.

Numa forma de realização preferida, o passo de redobrar o polipéptido de fusão é realizado pela alteração das condições caotrópicas para cosmotrópicas através de troca de tampão. 41 ΡΕ1874825

Os tampões podem ser alternativamente gradualmente ou instantaneamente alterados para condições cosmo-trópicos. Numa forma de realização preferida da presente invenção, a troca do tampão caotrópico com tampão cosmo-trópico é realizado instantaneamente, por aplicação do tampão como uma rolha. Noutra forma de realização igualmente preferida da presente invenção, a troca dos tampões é realizada gradualmente. A ligação do polipéptido de fusão à coluna e/ou redobragem e clivagem do referido polipéptido de fusão pode ser facilitada se a troca do tampão é acompanhada por um ajuste de temperatura. Isto pode, por exemplo, ser introduzido por uma camisa de arrefecimento/aquecimento. Por isso, numa forma de realização preferida, uma camisa de arrefecimento/aquecimento é aplicada ao ajuste de temperatura; mais preferencialmente, o tampão é levado à temperatura desejada antes da sua aplicação. Deste modo, é alcançado esse ajuste de temperatura.

Após troca de condições no leito empacotado o polipéptido de fusão começa a remoldar e a parte que exerce a função autoproteolítica torna-se activa. Como resultado, o polipéptido de interesse fundido em C-terminal é removido por clivagem num sitio distinto definido pela especificidade da parte autoproteolítica, produzindo desse modo um terminal N homogéneo do polipéptido de interesse. Dependendo do tempo necessário para remoldar o polipéptido 42 ΡΕ1874825 de fusão, a velocidade da fase móvel com o tampão cosmo-trópico é reduzida ou parada quando todo o tampão caotró-pico é removido do leito empacotado. Após a remoldagem estar completa, o polipéptido de interesse libertado é removido por lavagem do leito empacotado através de posterior alimentação de tampão cosmotrópico. A parte auto-proteolítica N-terminal do polipéptido de fusão, assim como o polipéptido de fusão não clivado é eluida através de meios convencionais, e.g., concentração de sal elevada, uma alteração de pH ou NaOH, para regenerar o material de cromatografia. Para a regeneração o leito empacotado é lavado com um tampão que retira a autoprotease do adsor-vente. Esses tampões compreendem soluções acídicas ou alcalinas ou solventes orgânicos. Após reequilíbrio com tampão de partida/tampão caotrópico, o leito empacotado está pronto para o ciclo seguinte.

Por outro lado, podem ser proporcionadas proteínas de fusão que, após remoldagem correcta permanecem autocataliticamente inactivas, e.g., através de um ligante adequado entre a parte autoproteolítica e a parte da proteína alvo da proteína de fusão ou através de um mutante inactivado, e.g., um mutante de autoprotease com reduzida ou nenhuma actividade autoproteolítica. Por exemplo, pode ser proporcionado um ligante tripeptídico (aminoácidos 1, 2 e 3) entre as duas partes que possui na posição 1 e preferencialmente também nas posições 2 e 3 aminoácidos básicos (R, K, H) , acídicos (D, E) , hidrofóbicos grandes (V, L, I M) ou aromáticos (F, Y, W) para prevenir a 43 ΡΕ1874825 clivagem autoproteolítica. Exemplos de derivados de autoprotease inactivos são

Npr0 R53E, G54D, R57E, T59M, D92N, A109S, C112E, V114S,

V121K, C134E, C138E, L143N, I155S, F158S (1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDD-IETMLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQNYTGPVYHRAPLEFFDESQFEE-STKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKNAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC-(168),

Npr0 R53E, G54D, R57E, P87L, A109S, C112E, V114S, V121N,

T122A, C134E, C138E, L143E, I155S, F158S (1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDD-IETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGLVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEE-S TKRIGRNAGS DGKLYHIYVEVDGEILLKEAKRGTPRTLKWSRNS TNC PLWVTSC- (168) e

Npr0 R53E, G54D, R57E, A109S, C112E, V114S, V121N, C134E,

C138E, L143Q, I155S, F158S (1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDD-IETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEE-STKRIGRNTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC-(168) .

Com essas formas de realização, as proteínas alvo podem ser proporcionadas numa forma funcionalmente activa imobilizada com estrutura de "tipo nativo", mas com certeza sem o risco de agregação indesejada. Essas proteínas alvo imobilizadas ou capturadas podem ser utilizadas para estudos científicos, para ensaios imunológicos, intrínsecos, de fluorescência ou para ensaios de interacção com outras moléculas fisiológica ou farmaceuticamente interessantes . 44 ΡΕ1874825

Quando necessário, porque a taxa de clivagem pode não ser tão elevado como desejado, o polipéptido de fusão não clivado que é removido da coluna por lavagem durante o passo de regeneração pode ser realimentado noutro circulo do processo de cromatografia de acordo com a presente invenção. 0 polipéptido de interesse libertado pode ser obtido opcionalmente através da escolha dos respectivos tampões quer num estado de remoldagem parcial ou completamente remoldado. Dentro do âmbito da presente invenção, o polipéptido de interesse no efluente é parcialmente ou preferencialmente completamente remoldado. Numa forma de realização da presente invenção, a remoldagem da parte autoproteolitica activa do polipéptido de fusão pode ser completa, embora o polipéptido de interesse permaneça parcialmente não remoldada. Esta situação pode ocorrer por exemplo quando o polipéptido de interesse possui uma conformação muito complexa, por exemplo uma di- ou trime-rização, ou compreende um grupo prostético ou um cofactor. Esses polipéptidos de interesse podem requerer condições particulares de modo a completar a remoldagem. Consequentemente nesses casos, a moldagem pode ser completada num passo separado, em que podem ser criadas condições especiais, e.g., força protónica e pH ou a remoção completa de detergentes, que são normalmente adicionados durante a remoldagem. 45 ΡΕ1874825

Dentro do âmbito da presente invenção, as condições podem ser alteradas para qualquer estado em que o polipéptido de fusão se mantenha adsorvido à coluna. A presente invenção é ainda descrita com referência aos seguintes exemplos, que são apenas ilustrativos e não limitantes. Em particular, os exemplos referem-se a formas de realização preferidas da presente invenção. EXEMPLOS:

Exemplo 1 - Cromatografia de afinidade 1.1.1 Equipamento de cromatografia

As corridas de cromatografia no exemplo 1 são realizadas num sistema de cromatografia AKTA 100 Explorer (Amersham Biosciences). Os sorbentes de afinidade do péptido preparado são empacotados em colunas HR 5 (5 mm i.d., Amersham Biosciences). O volume do gel é aproxi-madamente de 1 mL. 1.1.2 Preparação de ligandos oligopeptídicos

Os ligandos oligopeptídicos utilizados no exemplo 1 são produzidos do seguinte modo: A Sintese do Péptido de Fase sólida é realizada num sintetizador de péptidos 433A (Applied ΡΕ1874825 46

Biosystems, Viena, Áustria) com activação por 1-hidroxi-lH-benzotriazol/N,Ν'-diciclo-hexilcarbo-diimida (HOBt/DCC) de aminoácidos protegidos com Fmoc (Bachem, Bubendorf, Suiça). Os péptidos são sintetizados numa resina 4-hidroximetil-fenoxi-metil-copoliestireno-1% de divinilbenzeno (resina HMP, resina Wang). Grupos de protecção para as cadeias laterais são terc-butilo (t-Bu) para tirosina, serina e treonina, OtBu para ácido glutâmico e ácido aspártico, terc-butoxicarbonil (Boc) para lisina e triptofano e tritilo (Trt) para cisteina, histidina, asparagina e glutamina. Para o acoplamento dos primeiros aminoácidos é utilizado 4-dimetilaminopiridina (DMAP) como um catalisador. Após acoplamento do primeiro amino-ácido, é realizado um passo de protecção utilizando anidrido benzóico. A desprotecção do grupo Fmoc é realizada com 20% de piperidina. A desprotecção da cadeia lateral e a clivagem da resina são realizadas por reacção com uma mistura de clivagem contendo 95% de ácido trifluo-roacético (TFA) , 2,5% de água e 2,5% triiso- propilsilano (TIS). Após lavagem com diclorome-tano (DCM) o péptido bruto é purificado por precipitação com éter repetida seguido por liofilização. Os péptidos são ainda purificados por RP-HPLC numa coluna Luna 15 μ C18 (2) 250 x 21,2 mm (Phenomenex, Torrence, CA, EUA) com bombas P 3500 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia), utilizando um gradiente linear de 5-50% ΡΕ1874825 47

de acetonitrilo vs. água (0,1% de TFA) a 30 mL/min. A pureza é confirmada por RP-HPLC analítico com uma cromatografia líquida HP 1090 (Hewlett Packard, EUS) utilizando uma coluna Luna 3 μ C18 (2) 100 x 4,6 mm (Phenomenex) com um gradiente linear de 1% de acetonitrilo por minuto. A homogeneidade e a identidade são verificados por ionização de dessorção de laser assistido por matriz - espectrometria de massa de tempo de voo (ThermoBioanalysis, Hempstead, UK). 1.1.3 Preparação da matriz de afinidade

As matrizes de afinidade utilizadas no exemplo 1 são preparadas da seguinte maneira: 10 g de Fractogel epoxi (M) (Merck, Darmstadt, Alemanha) é feito reagir com 50 mL de 1 M de Diamino-dipropilamina (DADPA) durante 48 horas à temperatura ambiente. Após a reacção o gel é lavado com 50 mL de 10 mM de HC1 e 3 vezes com 50 mL de água. O gel é ressuspenso em água, o pH é ajustado a 7,0 por adição de 0,1 M de NaOH e é adicionado 2 g de anidrido succínico. Após 30 minutos a agitação suave o pH é ajustado a 7,0 por adição de 10 M de NaOH e são adicionadas mais 2 g de anidrido succínico. Após mais 30 minutos de agitação, o gel é lavado com 50 mL de 0,1 M de NaOH, 50 mL de salino tamponado com fosfato (PBS), 3 vezes com 50 mL de água e 20% de etanol. Após secagem por sucção o gel é armazenado a 4°C. 48 ΡΕ1874825 1.1.4 Activação do grupo carboxilo e imobilização de péptidos:

As matrizes de afinidade de acordo com o exemplo 1 são activadas da seguinte maneira: 1 g de Fractogel molhada é modificada com um espaçador DADPA-SA como descrito no capítulo 1.1.3 e lavada 2 vezes com 5 mL de Acetonitrilo. A activação é efectuada com 3 mL de 0, 1 M de Succinimidilo-tricloroetilcarbonato e 0,1 M de trietilamina dissolvidos em acetonitrilo durante 3 horas. O gel é subsequentemente lavado com acetonitrilo e 1 mM de HC1. O péptido AFYRWYA é dissolvido em PBS a uma concentração de 3 mg/mL. 5 mL da solução de péptido é rapidamente adicionada ao gel e feita reagir durante 24 horas. O péptido VSFIWYK, é dissolvido em dimetilformamida (DMF) contendo 0,1 M de trietilamina. 5 mL da solução de péptido são rapidamente adicionados ao gel e feitos reagir 24 horas. O rendimento de acoplamento é determinado por RP-HPLC de amostras antes e depois do acoplamento.

Imobilização de péptidos em CIM-epoxy:

Os péptidos são dissolvidos num tampão de 100 mM de Na2C03 pH 10,0 contendo 0,15 M de NaCl. Os discos CIM são montados num cartucho fornecido pelo fabricante e a solução de péptido é lentamente bombeada através do disco utilizando uma bomba PI (Amersham Biosciences) num modo de circulação durante 48 hora à temperatura ambiente. O 49 ΡΕ1874825 rendimento de acoplamento é determinado por RPHPLC de amostras antes e depois do acoplamento. Após acoplamento os restantes grupos epoxilo são bloqueados com 0,5 M de etanolamina, pH 10,0 durante 48 horas. 1.1.5 Expressão do polipéptido de fusão A E. coli HMS 174 recombinante (DE3) que expressa um polipéptido de fusão compreendendo a autoprotease N-terminal Npro com uma marca 6xHis e uma GFPmut3.1 de fusão C-terminal são cultivadas num fermentador de 10 L. O polipéptido de fusão compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

1 MHHEHHHSLN HFELLYKTSK QKPVGVEEPV YDTAGRPtFG NPSEVHPQST LKLPHDRGRG 60 61 DIRTTLRDLP RKGDCRSGNH LGPVSGXYIK PGPVYYQBYY GPWHRAPLE FEDEAQFCBV 120 121 TKRXGRVT6S DGKLYBIYVC VOSCILjUKLA KRGTPRTLKW ISlsrraCPlW VT5CSGTMRK 180 181 GSELFTGWP ILVELDGDVN GHKFSVSGEG EGDATYGKLT LKFXCTTGKL FVPWPTLVTT 240 241 FGYGVQCFAR YPOHMKQHOF FKSAMFEGYV QERYIFFKDD GHYKTRAEVK FEGDTPVSRX 300 301 SLKGIDFKED GhlLGHKEEY NYNSHNVYIM ADKQKKGIKV NFKIRHNIED GSVQIADHYQ 360 361 CNTPIGOGPV LLPDHSYliST QSALSKDPNE KRDHMVLLEF VTÃRGXTSGM DELYK A célula hospedeira bacteriana, i.e. a estirpe de expressão, é cultivada de acordo com práticas micro-biológicas conhecidas per se. A estirpe é geralmente cultivada a partir de uma colónia única num meio nutriente, mas é também possível empregar suspensões de células criopreservadas (bancos de células). A estirpe é geralmente cultivada num processo multi-estádio de modo a obter biomassa suficiente para utilização posterior. 50 ΡΕ1874825

Numa pequena escala, isto pode ocorrer em frascos de agitação, sendo possível na maioria dos casos para empregar um meio complexo (por exemplo, meio LB) . Contudo, é também possível para utilizar meios definidos (por exemplo, meio citrato). Para a cultura, um pequeno volume de pré-cultura da estirpe hospedeira (inoculada com uma colónia única ou com a suspensão de células de uma crio-cultura) é cultivado, não sendo a temperatura para esta cultura geralmente crítica para resultar a expressão tardia, de modo que é possível rotineiramente operar a temperaturas relativamente elevadas (por exemplo, 30°C ou 37°C) . A cultura principal é estabelecida num volume maior (por exemplo 500 mL) , em que é, em particular, necessário assegurar um bom arejamento (volume grande de frasco em comparação com o volume de conteúdos, elevada velocidade de rotação). Uma vez que se pretende que a expressão ocorra na forma de corpos de inclusão insolúveis, a cultura principal será na maioria dos casos também efectuadas a uma temperatura relativamente elevada (por exemplo 30 ou 37°C). Os sistemas indutíveis são particularmente adequados para produzir corpos de inclusão (por exemplo com o promotor trp, lac, tac ou phoA). Após a fase logarítmica tardia ter sido atingida (normalmente a uma densidade óptica de 0,5 a 1,0 em frascos de agitação), nestes casos a substância indutora (por exemplo, é adicionado ácido indoleacrílico, isopropil β-D-tiogalactopiranósido = IPTG) e a incubação é continuada durante 1 a 5 horas. Durante este tempo, a maioria dos polipéptidos de fusão Npro são depositados como corpos de inclusão no citoplasma bacteriano. As células 51 ΡΕ1874825 resultantes podem ser recolhidas e posteriormente processadas .

Numa escala maior, o sistema multi-estágio consiste numa pluralidade de biorreactores (fermentadores), sendo preferido empregar meios nutrientes definidos neste caso de modo a ser capaz de melhorar o processo de manipular o controlo do processo. Adicionalmente, é possivel aumentar consideravelmente a biomassa e a formação do produto medindo nutrientes particulares (sistema descontinuo com alimentação). De outro modo, o processo é análogo ao frasco de agitação. Por exemplo, um fermentador de estádio preliminar e um fermentador de estádio principal são utilizados, sendo a temperatura de cultura seleccionada semelhante ao do frasco de agitação. 0 fermentador do estádio preliminar é inoculada com um denominado inoculo gue é geralmente cultivado a partir de uma colónia única ou uma criocultura num frasco de agitação. 0 bom arejamento e uma concentração de indutor suficiente devem também ser assegurados no fermentador - e especialmente no seu estádio principal. A fase de indução deve, contudo, em alguns casos, ser feita distintamente mais distantes em comparação com o frasco de agitação. As células resultantes são mais uma vez distribuídas para processamento posterior. 1.1.6 Isolamento de corpos de inclusão

Após colheita, as células (850 g de peso molhado) são ressuspensas em 2500 mL de 50 mM de Tris/HCl, 5 mM de 52 ΡΕ1874825 EDTA, 1% Triton X-100, pH 8,0. A suspensão gelada é passada através de um homogeneizador APV-2000 de pressão elevada (Invensys) três vezes a 800 bar para romper as célula. Entre as passagens a suspensão é arrefecida em gelo e homogeneizada utilizando um Ultraturrax. O homogenizado é centrifugado a baixa velocidade (JLA 10.500, 7500 rpm, 30 min) para obter os corpos de inclusão contendo o polipéptido recombinante de fusão. 1.1.7 Solubilização dos corpos de inclusão O pelete é ressuspenso em 50 mM de Tris/HCl, 5 mM de EDTA, 1% de Triton X-100, pH 8,0 e centrifugada. Este passo é repetido. Após um passo de lavagem com H20, o pelete é ressuspenso em H20. A suspensão obtida de corpos de inclusão é armazenada a -20°C para utilização posterior. A ressuspensão de corpos de inclusão é diluida 1 : 5 com 50 mM de Tris/HCl, 10 M de ureia, 50 mM de DTT, pH 7,3 à temperatura ambiente. Os componentes insolúveis são removidos por centrifugação. É obtida uma concentração de polipéptido de cerca de 15 mg/mL. A solução de polipéptido é diluida com 50 mM de Tris/HCl, 100 mM de NaCl, 4 M de ureia, pH 7,3 para atingir uma concentração de polipéptido de cerca de 2 mg/mL. 1.1.8 Ligação do polipéptido de fusão à coluna cromatográfica São aplicados 0,5 mL da solução de polipéptido a uma matriz Fractogel-DADPA-SA-VSFIWYK (0,5 x 5 cm), em que 53 ΡΕ1874825 a preparação e acoplamento do respectivo péptido é conduzido como acima descrito em 1.1.2 e 1.1.3. A coluna é equilibrada com 50 mM de Tris/HCl, 100 mM de NaCl, 4 M de ureia, pH 7,3 com um caudal linear de 50 cm/h. O caudal é aumentado para 150 cm/h após a injecção da amostra. 1.1.9 Lavagem de material contaminante não ligado

Os componentes não ligados são lavados com 5 volumes de coluna de tampão de equilíbrio. Uma troca para o tampão de reorganização, especificamente para 0,5 M de Tris/HCl, 2 mM de EDTA, 3% de glicerol, 5 mM de DTT, pH 7,3, é efectuada com 4,5 volumes de coluna. 1.1.10 Reorganização, clivagem e eluição

Após alteração das condições de caotrópico para cosmotrópico, o polipéptido de fusão é deixado a reorganizar durante 25 h na resina de cromatografia por interrupção de fluxo. A autoprotease activa cliva a GFPmut3.1 de fusão C-terminal. A subsequente eluição com tampão de reorganização a um caudal de 50 cm/h resulta em GFPmut3.1 nativa purificada, como é confirmado por medições de fluorescência e SDS-PAGE. 1.1.11 Regeneração A regeneração da resina de cromatografia é efectuada com 0,1 M de NaOH a um caudal de 50 cm/h. 54 ΡΕ1874825

Exemplo 2 - Preparação das matrizes de afinidade 2.1 Preparação de uma matriz de afinidade de péptido com acoplamento através da lisina C-terminal derivada com anidrido iodoacético numa matriz com grupos tiol (Fractogel-DADPA-IT). 300 mg do péptido N-acetilado Ac-AFYRWYAK foi dissolvido em 3 mL de dimetilformamida (DMF) contendo 65 pL de diisopropiletilamina. A solução foi então arrefecida em gelo. Depois 130 mg de anidrido iodoacético foram dissolvidas em 1,5 mL de DMF e adicionadas à solução de péptido. A reacção foi interrompida depois de um minuto por adição de 1 mL de ácido fórmico. A solução foi então diluida com água para uma concentração final de DMF de 30%. A solução foi então purificada por RP-HPLC preparativa como descrito anteriormente. As fracções foram liofilizadas e analisadas por espectrometria de massa. 10 g de Fractogel-DADPA foram preparadas como acima descrito. O gel foi subsequentemente lavado 3 vezes com tampão PBS. O gel foi então feito reagir com 10 mg/mL de iminotiolano (IT) dissolvido em tampão PBS durante 2 horas. 250 mg do péptido derivado de ácido iodoacético foi dissolvido em 15 mL de 20 mM de tampão MES, pH 6,0 contendo 30% de DMF. Esta solução foi então feita reagir com o gel durante 3 horas. O rendimento do acoplamento foi determinada por análise das amostras antes e depois do acoplamento com RP-HPLC. Os 55 ΡΕ1874825 restantes grupos tióis do gel foram bloqueados com uma solução de 1 mg/mL de iodoacetamida durante 2 horas. A matriz assim preparada é referida como Fractogel-DADPA-IT- AFYRWYAK. 2.2 Preparação de uma matriz de afinidade com ligandos Poli(lisina, triptofano) 10 g de Fractogel epoxi foram lavadas 3 vezes com tampão de acoplamento, um tampão de 20 mM de carbonato de sódio, contendo 150 mM de cloreto de sódio e 10 mM de trietilamina, pH 11,0. 100 mg de Poli (lisina, triptofano), 4:1 (PolyKW, Sigma) foram dissolvidos em 10 mL de tampão de acoplamento e feitos reagir com o gel durante 48 horas. A eficiência de acoplamento foi determinada medindo a absorvência a 280 nm da solução de Poli(lisina, triptofano) antes e depois do acoplamento. O gel foi então feito reagir com 0,5 M de etanolamina para bloquear os restantes grupos epoxi. A matriz assim preparada é referida como Fractogel-poliKW.

Alternativamente, o procedimento descrito é efectuado com Actigel B Ultraflow 4 epoxy. A matriz assim preparada é referida como Actigel-poliKW.

Além disso, o procedimento descrito é efectuado com Epoxy Sepharose 6B. A matriz assim preparada é referida como Sepharose-poliKW. 56 ΡΕ1874825

Exemplo 3: Cromatografia de Afinidade 3.1 Purificação de extractos de corpos de inclusão NproEDDIE-6His

NproEDDIE-6His: 1 MEL88FELLY KTSKQKPVGV EEPVYDTAGR PLFGRPSBVH PQSTLKLPHD RGEDDIETTL 60 61 RDLPRKGOCR SGNBLGPVSG YYIKPGPVYY QDYTSPVYHR APkEFFBETQ FEETTKRIGR 120 121 VTGSDGKLY HIYVEVDGEI LLKQAKRGTP RTLKKTRNTT «CPLWVTSCS VDKLAAALEH 160 181 HHHHH 185

Os extractos brutos de corpo de inclusão NproEDDIE-6His em 50 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 4 M ureia, 10 mM de α-monotioglicerol (MTG), pH 7,3 foram aplicados numa Fractogel-DADPA-IT-AFYRWYAK (0,5 x 5 cm) previamente equilibrada com 50 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 4 M de ureia, pH 7,3 a uma velocidade de fluxo linear de 25 e 150 cm/h respectivamente. Foi aplicada uma quantidade de amostra de 5 mL a uma concentração de proteina aproximada de 2 mg/mL. Após lavagem dos componentes não ligados com 5 volumes de coluna (CV) de tampão de equilíbrio a uma velocidade de fluxo linear de 150 cm/h, a eluição com 10 CV de 50 mM de Tris, 1 M de NaCl, 8 M de ureia, pH 7,3 foi efectuada sob as mesmas condições de fluxo. A regeneração de uma coluna foi efectuada com 10 CV de 0,2 M de NaOH. A diminuição dos compostos da célula hospedeira foi confirmada por SDS-PAGE. 57 ΡΕ1874825 3.2 Purificação de extractos de corpos de inclusão NproEDDIE-6His

Os extractos de corpos de inclusão NproEDDIE-6His em 50 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 4 M de ureia, 10 mM de MTG, pH 7,3 foram aplicados numa Fractogel-poli-KW (0,5 x 5 cm) previamente equilibrada com 50 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 4 M de ureia, pH 7,3 a uma velocidade de fluxo linear de 25 e 150 cm/h respectivamente. Foi aplicada uma quantidade de amostra de 5 mL a uma concentração de proteína aproximada de 2 mg/mL. Após lavagem dos componentes não ligados com 5 CV de tampão de equilíbrio a uma velocidade de fluxo linear de 150 cm/h, eluição com 10 CV de 50 mM de Tris, 1 M de NaCl, 8 M de ureia, pH 7,3 foi efectuada sob as mesmas condições de fluxo. A regeneração da coluna foi efectuada com 10 CV de 0,2 M de NaOH. A diminuição dos compostos da célula hospedeira foi confirmada por SDS-PAGE. 3.3 Purificação de extractos de corpos de inclusão NproEDDIE-6His A cromatografia de afinidade dos extractos brutos de corpos de inclusão de NproEDDIE-6His misturados com homogenizado de células E. coli HMS 174 (DE3) que produzem GFPmut3.1 foi efectuada numa Fractogel-DADPA-IT-AFYRWYAK como acima descrito. As amostras do fluxo e eluição foram recolhidas e analisadas para determinar o conteúdo de proteina e contaminantes por SDSPAGE. 58 ΡΕ1874825

Exemplo 4 - Sistema de detecção

Este sistema de detecção representa um sistema de detecção genérico para as proteinas de fusão Npro-EDDIE através de um péptido ligando, que se liga a Npr0-EDDIE, covalentemente imobilizado ou sintetizado numa membrana. A proteina de fusão está ligada à membrana compreendendo o péptido e o parceiro de fusão pode ser detectado pelas suas caracteristicas intrínsecas, e.g. autofluorescência de GFP, anticorpos contra o parceiro de fusão, as propriedades de ligação do parceiro de fusão. Esta membrana (como um exemplo preferido da matriz de afinidade de acordo com a presente invenção) é especificamente adequada para ligação de proteínas que não são ou são apenas levemente solúveis em solução aquosa e difíceis de detectar. Preferivelmente, a ureia é utilizada para solubilizar estas proteínas de acordo com a presente invenção.

No caso de ser utilizada a autoprotease de acordo com a presente invenção, a sua actividade pode ser inibida por e.g. ligantes, mutantes inactivos ou tampões inacti-vadores ou componentes de tampão (que podem ser adicionados no ponto de tempo desejado.

As membranas com péptidos imobilizados AFR*WYA, em que * representa cada um dos 20 aminoácidos proteino-génicos, foram incubadas com extractos brutos de corpos de inclusão de 6xHis-NproEDDIE-GFPmut3.1 a uma concentração de 59 ΡΕ1874825 1 mg/mL em 50 mM de Tris, 300 mM de NaCl, 4 M de ureia, 12,5 mM de ditiotreitol (DTT) , pH 7,3 durante 1 h. Após 5 min de lavagem com tampão de incubação, as condições foram alteradas para 1 M de Tris, 0,25 M de sacarose, 2 mM de EDTA, 10 mM de DTT, pH 7,3 para permitir a remontagem da GFPmut3.1 de fusão. A fluorescência de GFP nas manchas de péptido foi detectada com um analisador de imagem Typhoon (Amersham Biosciences) a um comprimento de onda de excitação de 488 nm e emissão a 520 nm a diferentes voltagens de fotomultiplicador de 315, 350 e 400 V.

Exemplo 5 - Sistema de detecção com Anti-péptido Npro biotinilado

Este sistema de detecção representa um sistema de detecção genérico para proteínas de fusão Npr0-EDDIE através da ligação de um péptido biotinilado a uma proteina de fusão NPr0-EDDIE ligada à membrana. A detecção é efectuada com um conjugado estreptavidina-peroxidase de rábano. A sobre-expressão de uma proteina de fusão compreendendo Npr0-EDDIE e um polipéptido fundido no terminal C em E. coli é detectada através de um péptido marcado dirigido contra Npr0-EDDIE: É preparado um homogenizado celular por tratamento de um caldo de fermentação de E. coli com uma solução contendo 10 M de ureia. O homogenizado é aplicado numa membrana de nitrocelulose. Depois a membrana é seca e bloqueada com 3% de lisozima em tampão fosfato durante 1 hora. A membrana é depois incubada 60 ΡΕ1874825 com uma solução contendo 10 yg/mL de um conjugado com AFYRWYAK-Biotina durante 1 hora. A estreptavidina-HPO dissolvida em PBS contendo 1 M de cloreto de sódio é adicionada durante 15 min seguida por 3 lavagens com tampão de incubação e subsequente detecção com o sistema de detecção de quimioluminescência Super Signal™ West Pico (Pierce, Rockford, IL, USA) e Lumi-Imager™ (Boehringer, Mannheim, Alemanha).

Exemplo 6 - Preparação de proteínas de fusão Npro mutantes 10 mL de solução de uma proteína de fusão 6HisNPro-SGT-GFPmut.3.1 extraída de IBs como acima descrito, solução de 6HisNPro extraída de IBs como acima descrito, e solução de 6HisNPro-EDDIE extraída de IBs como acima descrito, foram aplicadas em - uma coluna Fractogel-DADPA-SA-VSIFEW, - uma coluna Fractogel-DADPA-SA-AVSIEWY, - uma coluna Fractogel-DADPA-SA-AVSFIWY, e - uma coluna Fractogel-DADPA-SA-VSFIWYK,

Cada uma previamente equilibrada com 50 mM de Tris, 100 mM 61 ΡΕ1874825 de NaCl, 4 M de tampão ureia pH 7,3. Após aplicação, a coluna foi lavada com 15 volumes de coluna de tampão de equilíbrio. A eluição foi efectuada com um tampão de equilíbrio adicionado com 500 mM de NaCl. As fracções recolhidas durante a cromatografia foram analisadas por SDS-PAGE. São utilizadas BSA e lisozima como proteínas de controlo.

Preparação de corpos de inclusão: A E. coli HMS 174 recombinante (DE3) que expressa uma proteína de fusão compreendendo a autoprotease N-terminal Npro com uma marca 6His e GFPmut3.1 (ver 1.1.5 acima) foi cultivada num fermentador 10 L. Após colheita, as células (850 g peso molhado) foram ressuspensas em 2500 mL de 50 mM de Tris, 5 mM de EDTA, 1% de Triton X-100, pH 8,0. A suspensão arrefecida em gelo foi passada através de um homogeneizador APV-2000 de pressão elevada (Invensys) três vezes a 800 bar para romper as células. Entre as passagens a suspensão foi arrefecida em gelo e homogeneizada utilizando um Ultraturrax. O homogenizado foi centrifugado a baixa velocidade (JLA 10.500, 7 500 rpm, 30 min) para obter os corpos de inclusão contendo a proteína de fusão recombinante. 0 pelete foi ressuspenso em 50 mM de Tris, 5 mM de EDTA, 1% de Triton X-100, pH 8,0 e centrifugada. Este passo foi repetido. Após o passo de lavagem com H2O o pelete foi ressuspenso em H2O. Foram obtidos 580 mL de uma suspensão de corpos de inclusão com uma massa seca de 8,9 % e foram armazenados a -20°C para 62 ΡΕ1874825 utilização posterior. A suspensão de corpos de inclusão foi diluida 1 : 5 com 50 mM de Tris, 10 M de ureia, 50 mM de DTT, pH 7,3 a TA. Os componentes insolúveis foram removidos por centrifugação. Foi obtida uma concentração de proteina de cerca de 15 mg/mL. A solução de proteina foi diluida com 50 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 4 M de ureia, pH 7,3 para atingir uma concentração de proteina de cerca de 2 mg/mL.

Lisboa, 15 de Junho de 2010

Claims (12)

1. ΡΕ1874825 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para ligação por afinidade de um polipéptido heterólogo de interesse, em gue o referido polipéptido é expresso como um péptido de fusão da autoprotease pestiviral NPr0 ou de seus derivados, e em gue o referido polipéptido de fusão é colocado em contacto sob condições caotrópicas com uma matriz de afinidade compreendendo uma fase sólida e um ligando de afinidade compreendendo ligações peptidicas acopladas a esta fase sólida, em gue o ligando de afinidade compreendendo uma ligação peptídica é seleccionado a partir do seguinte grupo de ligandos: a) péptidos compreendendo a fórmula X1X2X3X4, em gue Xi a X4 são resíduos de aminoácidos e pelo menos dois de Xi a X4 são W,Y ou F; b) péptidos compreendendo a fórmula X5X6X7X8, em que X5 a X8 são resíduos de aminoácidos, pelo menos um de X5 a X8 é W, e pelo menos um de X5 aa X8 é E ou D; e c) poli-aminoácidos consistindo num monómero de aminoácido do grupo consistindo em R, K, E e D e um monómero de aminoácido do grupo consistindo em Y, F e W, preferivelmente poli-KY, poli-KF, poli-KW, poli-RY, poli-RF, poli-RW, poli-EY, poli-DY, poli-EF, poli-EW, poli-DF e poli-DW, 2 ΡΕ1874825 com a condição de que os péptidos de acordo com a) e b) possuem um comprimento máximo de 35 residuos de aminoácidos e que os poli-aminoácidos de acordo com c) possuem um comprimento minimo de 20 residuos de aminoácidos, e em que o referido polipéptido de fusão está liqado à referida matriz sob condições caotrópicas.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que os péptidos de acordo com a) e b) possuem um comprimento de 5 a 12, especialmente de 6 a 8, residuos de aminoácidos.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o ligando de afinidade é quimicamente modificado, especialmente acetilado, esterifiçado, amidado, oxidado, reduzido ou proporcionado com uma molécula ligante.
4. 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 to 3, em que a fase sólida é seleccionado a partir do grupo consistindo em material de cromatografia, especialmente suportes com base em celulose, agarose, acrilamida, poli(estireno-divinilbenzeno) ou copolimeros de etileno glicol-metacrilato, placas de microtitulação, membranas de nitrocelulose, microchips, placas de vidro ou suportes revestidos por metal.
5. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o ligando de afinidade é selec- 3 ΡΕ1874825 cionado a partir do grupo consistindo em VSDDWY, VSEDWY, VSIDWY, VSYDWY, VSVDWY, VSWDWY, VSYDWY, VSFDWY, VSDEWY, VSEEWY, VSIEWY, VSYEWY, VSVEWY, VSWEWY, VSYEWY, VSFEWY, DDDDWY, DDEDWY, DDIDWY, DDYDWY, DDVDWY, DDWDWY, DDYDWY, DDFDWY, VSIFWE, FSIFEW, WSIFEW, VSLIWY, VSLIDW, VSLIEW, VSLIWE, FSLEEW, VSDLDW, VSDLEW, VSYIDW, VSYIWE, VSIDWY, VSIEWY, VSIWWY, VSIIWY, VSYIWY, VSVIWY, VSFIWY, VSFIWE, VSIFEW, VSIFWE, FSIFEW, WSIFEW, VSLIWY, VSLIDW, VSLIEW, VSLIWE, FSLIEW, WSLIEW, FSYFEW, FSFYEW, WSFYEW, FSYIEW, WSYIEW, AFYTWYA, AFYRWYK, AFYRWY, AFYRWYA, AFFRWYA, AFGRWYA, AFHRWYA, AFIRWYA, AFLRWYA, AFMRWYA, AFNRWYA, AFPRWYA, AFQRWYA, AFRRWYA, AFSRWYA, AFTRWYA, AFVRWYA, AFYRWYA, AFYFWYA, AFYGWYA, AFYLWYA, AFYMWYA, AFYNWYA, AFYPWYA, AFYTWYA, AFYVWYA, AFYWWYA, AFYYWYA, AKWFRYA, VSRNWY, ASRNWYA, ASRFWYA, FSRNWYA, VFRNWYA, VWRNWYA, VYRNWYA, VSRAWYA, VSRFWYA, VSRWWYA, VSRYWYA, VSRNFYA, VSRNYYA, VSRNWFA, VSRNWWA, Ac-AFYTWYAK , Ac-AFYRWYKK, Ac- AFNRWYAK, AFSRWYAK, AFYFWYAK, AFYNWYAK, AFYWWYAK, ASRNWYAK, VWRNWYAK, VSRWWYAK, AFYRWYK, Ac-AFYRWYAK, Ac-AFFRWYAK, Ac-AFGRWYAK, AFHRWYAK, Ac-AFIRWYAK, Ac-AFLRWYAK, Ac-AFMRWYAK, - Ac-VSRNFYAK, VSRNWFAK, Ac-VS RNWWAK, YWKA, Ac-YWKAK, YKYA, Ac-YKYAK, YWRA, Ac-YWRAK, ARWY, Ac-ARWYK, YWRA e Ac-YWRAK. Ac-AFPRWYAK, Ac-AFTRWYAK, Ac-AFYGWYAK, Ac-AFYPWYAK, Ac-AFYYWYAK, Ac-ASRFWYAK, Ac-VYRNWYAK, Ac-VSRYWYAK, Ac-AFQRWYAK, Ac-AFVRWYAK, Ac-AFYLWYAK, Ac-AFYTWYAK, Ac-AKWFRYAK, Ac-FSRNWYAK, Ac-VSRAWYAK, Ac-AFRRWYAK, Ac-AFYRWYAK, Ac-AFYMWYAK, Ac-AFYVWYAK, Ac-VSRNWYK, Ac-VFRNWYAK, Ac-VSRFWYAK, Ac-VSRNYYAK, Ac- Ac- Ac- Ac- Ac- Ac- Ac- Ac- Ac- Ac- 4 ΡΕ1874825
6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o ligando de afinidade está covalentemente ligada à fase sólida.
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o referido polipéptido de fusão numa preparação inicial liquida é colocada em contacto com a referida matriz de afinidade sob condições caotrópicas em que o referido polipéptido de fusão está ligado à referida matriz de afinidade e é separada da referida preparação inicial liquida.
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o referido polipéptido de fusão ligado à matriz de afinidade é posteriormente processado enquanto ligado à referida matriz.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o referido polipéptido de fusão ligado à matriz de afinidade ou o referido polipéptido de fusão processado é eluido a partir da matriz de afinidade, preferivelmente por aplicação de um tampão de eluição com uma baixa caotropicidade como a preparação inicial liquida.
10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o referido polipéptido de fusão é expresso como corpos de inclusão condições de desnaturação. 5 ΡΕ1874825
11. 11. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, em que a referida autoprotease pes-tiviral NPr0 ou o seu referido derivado é seleccionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO 1; C1} MEI^HFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTÂGRPI.F6NPSEVHPQSTLiaPHDRGRG-DIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFF-DEAQFCEVTKRIGRVTGS DGKLYHIY VCVDGCI LI.KLRKRGTPRTLKWI RNFTNC PLWVTSC-(168), SEQ 10 NO 2; { X) MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEG-Dl RTTLR0LPRKG0CRSGMHLGPVSGX YIKPGPVYYQDYYGPVYHRAPLE PP-DEAQFEEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEI LLKLíVKRGTPRTLK^XRNFTKCPLVfVTSC-(168), SEQ XD NO 3: {1) MELNRFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVfíPQSTLKEPHDRGEDDX -ETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFEEVTKRl-GRVTGSDGKLYHXYVEVDGEXLLKQAKRGTPRTLKWXRNFTNCPÍ.WVTSC-' {168} , SEQ ID NO 4: (1) MEENHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRG-DIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPyYYQDYYGPVYHRAPtEFFDE-TQFEETYKRXGRVYGSDGKLYHIYVEVDGBILLKXAKRGtPRTLKWTRNYTNCPEWVTSC-(168), SEQ ID NO 5; < 1) HELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPX.FGN PSEVHPQSTLKLPHDRGEDDI-ETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIY X K PG PVYYQDYTGPVYHRAPLE FFDETQ FEETTKRI-GRVTGSDGKLYHIYVEVDGEIIiLKQAKRGtPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC- (168), 6 ΡΕ1874825 SEQ ID HO 6: GRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKQftKRGTPRTLKWTRKSTNCeiWrrSC”{168}, SEQ ID NO ?: {1}MELNHFBLLYKTSKQKPVGVEEPVYDTEGRPLFGTPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDI- GRVTGSDGKLYHIYVEVOGEILLKQAKRGYPHTLKWTKEfSTNCPLWVTSC- (168} , SEQ ID NO 8; {1) MELNHB’ELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQStLKLPHDRGEDDI-EXTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYXKPGPVYYQDYYGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRI-GRVTGSDGKLYHIYVEVDGEIELKSAKRGTPRTLKWSRNSTNCPEWVTSC-(168) and SEQ ID NO 9: {1} MELNHFELLYKTSKQKFVGVEEFVYDTAGRPLFGTPSEVEPQSTLKLPHDRGRG-DIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFF- deaqfcevtkrigrvtgsdgki.yhiyvcvdgcielklakrgtprtlkwirnstncplíívtsc- (168} .
12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o referido polipéptido de fusão compreende uma proteína ou unidade de proteína que possui uma tendência elevada para agregar sob condições fisiológicas, especialmente uma proteína seleccionada a partir do grupo consistindo em péptidos Αβ, proteína de Prião Tau, α-sinucleína, Tau, péptido ADan, péptido ABri, Cistatina C, péptidos Αβ, Superóxido dismutase, Atrofina 1, Huntingtina, Ataxinas, receptor de Androgénio, proteína de ligação a TATA box, cadeias leves Ig, Amilóide A do soro, Transtiretina, Transtiretina, β2-microglobulina, Apolipo- 7 ΡΕ1874825 proteína A-l, Gelsolina, polipéptido Pro-ilhéu amilóide, Procalcitonina, Factor natriurético atrial, Lisozima, Insulina, Fibrinogénio, suas proteínas de comprimento total ou fragmentos específicos, mutantes, variantes ou expansões poliQ. Lisboa, 15 de Junho de 2010 1 ΡΕ1874825 REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição • »»8111057# Literatura que não é de patentes citada na Descrição ♦ Ruiwu Li« «i ai ExpeimzfàaÍ tisímiskig?, 2033, * Jesepfe A. Bue&ner «t aí, M J. Pspihte Prc^fi v<SI, 31,11-3® í?es„ 189®,47,70-83