DE19819843A1

DE19819843A1 - Metallchelat bindende Peptide

Info

Publication number: DE19819843A1
Application number: DE1998119843
Authority: DE
Inventors: Joern Gloekler
Original assignee: Helmholtz Zentrum fuer Infektionsforschung HZI GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum fuer Infektionsforschung HZI GmbH
Priority date: 1998-05-05
Filing date: 1998-05-05
Publication date: 1999-11-11
Also published as: WO1999057262A3; WO1999057262A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein an Fe(III) bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz aus der folgenden Gruppe von Sequenzen: DOLLAR A (i) Arg Pro Thr Lys Lys Phe Thr Leu Thr His Lys His Ser Lys Arg, DOLLAR A wobei diese Sequenzen N-terminal um 1, 2 oder 3 Aminosäuren und/oder C-terminal um eine Aminosäure deletiert sein kann, DOLLAR A (ii) Gly Ile Pro Ala His Glu Gln His Thr Lys Lys Leu Trp Leu Leu, DOLLAR A wobei diese Sequenzen N-terminal um 1, 2, 3 oder 4 und/oder C-terminal um 1, 2, 3 oder 4 Aminosäuren deletiert sein kann, und DOLLAR A (iii) Ile Ser Leu Ser Asn His Arg Met Gln Trp His His Asn Tyr Ser, DOLLAR A wobei diese Sequenz N-terminal um 1, 2, 3, 4 oder 5 Aminosäuren und/oder C-terminal um 1, 2 oder 3 Aminosäuren deletiert sein kann.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptidsequenzen, die in Verbindung mit rekombinanten Proteinen eine spezifische Affi nitätsaufreinigung dieser mittels immobilisierter Metallionen ermöglichen.

Rekombinante Proteine werden heute vorzugsweise mit Hilfe von sogenannten Affinitäts-Tags exprimiert und aufgereinigt. Diese Tags bestehen zumeist aus Proteindomänen oder Peptiden, welche eine hohe spezifische Affinität zu einem Chromatographiemate rial besitzen, und sind entweder mit dem Amino- oder dem Car boxylterminus des rekombinanten Proteins fusioniert. Der Vor teil einer solchen Fusion ist die hohe selektive Affinität des Tags, wodurch eine Aufreinigung zur Homogenität von bis zu 95% des Proteins mit Hilfe eines einzigen Trennungsschritts ermöglicht wird. Die gebräuchlichsten sind das sogenannte His- Tag (eine Abfolge von 6 Histidinresten) GST (Glutathion-S- Transferase) Thioredoxin und MBP (Maltose bindendes Protein) Mit Hilfe von spezifischen Proteasen oder eines Inteins (selbst entfernende Proteindomäne; Protein Fusion & Purifica tion (pMAL™) System & IMPACT™ T7 System, vertrieben von New England Biolabs) ist es möglich, das Affinitäts-Tag nach oder während der Aufreinigung wieder zu entfernen. Dadurch kann das aufgereinigte Protein auch für klinische Zwecke eingesetzt werden.

Es ist bekannt, daß insbesondere Histidin enthaltende Proteine und Peptide von an Trägermaterialien immobilisierten Metallio nen wie Cu(II), Ni(II), Co(II) und Zn(II) gebunden werden. Auf diesem Prinzip beruht die Affinität des von Quiagen und auch anderen Firmen angebotenen His-Tags. Der große Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, His-Tag-Fusionsproteine auch unter denaturierten Bedingungen trennen und sogar renaturieren zu können. Der Nachteil des His-Tags ist unter Umständen eine schlechte Expression, beziehungsweise ein großer Hintergrund durch andere bindende Proteine. Des weiteren können auch die immobilisierten Schwermetalle während des Trennungsvorgangs ausgewaschen werden und damit das aufgereinigte Protein konta minieren. Somit eignet sich ein solches Verfahren nicht zur Aufreinigung von klinisch relevanten Proteinen.

Es ist bekannt, daß Phosphoaminosäuren, Histidin und auch Glutamat eine Bindung von Proteinen an immobilisierten Fe(III)-Ionen bei niedrigem pH ermöglichen. Da der Hintergrund hier sehr hoch ist, gibt es keine Ansätze für eine Entwicklung von Affinitätstags für Fe(III). Es gibt einen Hinweis auf ein Lysin-haltiges Protein, welches bei pH 8 zurückgehalten wird, jedoch bei 300 mM NaCl eluiert. Dieser Salzgehalt wird bei den meisten Aufreinigungen überschritten und führt sonst ebenfalls zu einem zu hohen Hintergrund.

Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft ein an Fe(III) bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz aus der folgenden Gruppe von Sequenzen:

(i) Arg Pro Thr Lys Lys Phe Thr Leu Thr His Lys His Ser Lys Arg
wobei diese Sequenz N-terminal um 1, 2 oder 3 Ami nosäuren und/oder C-terminal um eine Aminosäure de letiert sein kann,
(ii) Gly Ile Pro Ala His Glu Gln His Thr Lys Lys Leu Trp Leu Leu,
wobei diese Sequenz N-terminal um 1, 2, 3 oder 4 und/oder C-terminal um 1, 2, 3 oder 4 Aminosäuren deletiert sein kann, und
(iii) Ile Ser Leu Ser Asn His Arg Met Gln Trp His His Asn Tyr Ser
wobei diese Sequenz N-terminal um 1, 2, 3, 4 oder 5 Aminosäuren und/oder C-terminal um 1, 2 oder 3 Ami nosäuren deletiert sein kann.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein an Cu(II), Ni(II) und/oder Zn(II) und/oder insbesondere Co(II) bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz aus der folgenden Gruppe von Sequenzen:

(i) Ala His Gln Gln Thr His His Tyr Phe Thr His His Leu Asn Trp
wobei diese Sequenz N-terminal um eine Aminosäure und/oder C-terminal um 1, 2 oder 3 Aminosäuren dele tiert sein kann, und
(ii) Val Ala His His Trp Trp His Asp Gly Tyr Lys His Pro Leu Asn
wobei diese Sequenz N-terminal um 1 oder 2 Ami nosäure und/oder C-terminal um 1, 2 oder 3 Aminosäu ren deletiert sein kann.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein an Co(II), Ni(II) und/oder Zn(II) und/oder insbesondere Cu(II) bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz aus der folgenden Gruppe von Sequenzen:

(i) Ala His Pro His Arg His His Ser Asp Ser Met Leu Val Thr His
wobei diese Sequenz N-terminal um eine Aminosäure deletiert sein kann,
(ii) His Arg Ser Trp Thr Ser Pro His Asn His Pro His Thr His His,
(iii) Lys His His Leu His His Glu His Ala Tyr Pro Thr Leu Lys Asn
wobei diese Sequenz N-terminal um eine Aminosäure und/oder C-terminal um 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Ami nosäuren deletiert sein kann, und
(iv) His His His His Ser Tyr Met Ser Ser Ile Pro Ser Thr Ala Trp
wobei diese Sequenz C-terminal um 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Aminosäuren deletiert sein kann.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein an Co(II), Cu(II) und/oder Zn(II) und/oder insbesondere Ni(II) bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz aus der folgenden Gruppe von Sequenzen:

(i) Ala Tyr Pro His Phe His Ser Asn Ser His Leu Ile His Ser His
wobei diese Sequenz N-terminal um 1, 2 oder 3 Ami nosäuren deletiert sein kann,
(ii) Tyr His Thr Ser Ile His His His His Pro Val Asp His Leu Ala
wobei diese Sequenz N-terminal um eine Aminosäure und/oder C-terminal um eine oder zwei Aminosäuren deletiert sein kann,
(iii) Leu Asp His Thr Tyr Arg Ala His Ser Lys Val His His His His
wobei diese Sequenz N-terminal um eine oder zwei Aminosäuren deletiert sein kann,
(iv) Ala Pro Ser His His Thr His Ser His His Leu Thr Gln Met Arg
wobei diese Aminosäuresequenz N-terminal um 1, 2 oder 3 Aminosäuren und/oder C-terminal um 1, 2, 3, 4 oder 5 Aminosäuren deletiert sein kann, und
(v) His His His His Ser Tyr Met Ser Ser Ile Pro Ser Thr Ala Trp
wobei diese Aminosäuresequenz C-terminal um 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Aminosäuren deletiert sein kann.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein an Co(II), Cu(II) und/oder Ni(II) und/oder insbesondere Zn(II) bindendes Peptid mit der folgenden Aminosäurensequenz:
His His His His Ser Tyr Met Ser Ser Ile Pro Ser Thr Ala Trp, wobei diese Sequenz C-terminal um 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Ami nosäuren deletiert sein kann.

Mit den experimentell gefundenen Peptiden können die Nachteile der oben genannten bestehenden Methoden verbessert werden. Zum einen wird die Expression und Löslichkeit der Schwermetalle bindenden Peptide durch biologische Selektion verbessert. Zum anderen sind Fe(III) bindende Peptide gefunden worden, die bei bestimmten Bedingungen sehr spezifisch mit nur geringem Hin tergrund zur Trennung eines Fusionsproteins beitragen können.

Dabei enthalten die Peptide mit Affinität zu Co(II), Ni(II), Cu(II) und Zn(II) in erster Linie bis zu 6 Histidinreste, die aber nicht sämtlich kontinuierlich wie im bekannten His-Tag abfolgen. Die Liste dieser Peptide wird im Anhang angegeben.

Die Peptide, die Fe(III) spezifisch bei beispielsweise pH 7,4 binden, enthalten beispielsweise nur 2 Histidine und 4 Lysinreste.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Fusi onsprotein, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich um ein rekombinantes Protein handelt, dessen N-Terminus oder C-Termi nus zur Aufreinigung des Proteins und/oder zu seinem Nachweis durch ein Peptid bzw. eine Aminosäuresequenz (Affinitätstag) gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche gebildet wird.

Das erfindungsgemäße Fusionsprotein kann gekennzeichnet sein durch eine Verknüpfung von rekombinantem Protein und Affini tätstag, die nach Aufreinigung und/oder Nachweis des rekombi nanten Proteins lösbar ist.

Ferner kann das erfindungsgemäße Fusionsprotein dadurch ge kennzeichnet sein, daß es sich bei der Verknüpfung um eine Protease-Schnittstelle oder ein Intein handelt.

Die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Peptide können also zur Aufreinigung und/oder Nachweis an rekombinante Proteine fusioniert werden. Dies sollte auch in Kombination mit einem Intein oder einer Protease-Schnittstelle möglich sein, damit das Affinitäts-Tag nach der Trennung aus dem Kontext des nativen Proteins entfernt werden kann.

Zum Nachweis der rekombinanten Proteine können an Enzymen wie Alkalische Phosphatase immobilisierte Metallionen (INDIA-HRP von Pierce) sowie an Metallchelate geknüpfte fluoreszente Farbstoffe (P (1) 97 11 796.1 A1) dienen.

Die Fusionsproteine können auch unter denaturierenden Bedin gungen (beispielsweise 6 M Harnstoff) noch getrennt werden und sind somit den gegenwärtig angewendeten His-Tags ebenbürtig.

Ferner betrifft die Erfindung ein Oligonucleotid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein erfindungsgemäßes Fusionspro tein codiert.

Ferner betrifft die Erfindung einen Expressionsvektor mit ei nem erfindungsgemäßen Oligonucleotid zur Expression eines er findungsgemäßen Fusionsproteins.

Ferner betrifft die Erfindung einen bakteriellen Expressions stamm, insbesondere Escherichia coli-Stamm, mit einem erfin dungsgemäßen Expressionsvektor.

Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines an Co(II), Cu(II), Ni(II) und/oder Zn(II) bindenden Pep tids, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) ein Peptid

- mit 6 bis 15 Aminosäureresten und
- mit 4 bis 6 und gegebenenfalls mehr His-Resten als Aminosäu rereste,
- von denen bis zu 4 His-Reste unmittelbare aufeinanderfolgen können,

als Fusionsprotein mit einem Phagen-Hüllprotein in einem Pha gen-Display exprimiert,
(b) das exprimierte Fusionsprotein auf ein mit Co(II), Cu(II), Ni(II) und/oder Zn(II) beladenes Chromatographie-Material auf gibt und die Affinität des Peptids zu dem mit den Metallionen beladenen Chromatographie-Material testet,
(c) das Peptid, sofern es bindet, identifiziert, aus dem Fusi onsprotein löst oder synthetisch herstellt und isoliert.

Zum Stand der Technik sei verwiesen auf Patwardhan et al. in J. Chromatography, A 787 (1997) 91-100.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung ei nes an Fe(III) bindenden Peptids, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) ein Peptid

- mit 7 bis 15 Aminosäureresten, und
- mit 0 bis 2 und gegebenenfalls mehr Arg-Resten als Aminosäu rereste,
- mit 0 bis 4 und gegebenenfalls mehr Lys-Resten als Aminosäu rereste und
- mit 2 bis 3 und gegebenenfalls mehr His-Resten als Aminosäu rereste

als Fusionsprotein mit einem Phagen-Hüllprotein in einem Pha gen-Display exprimiert,
(b) das exprimierte Fusionsprotein auf ein mit Fe(III) belade nes Chromatographie-Material aufgibt und die Affinität des Peptids zu dem mit den Metallionen beladenen Chromatogra phie-Material testet,
(c) das Peptid, sofern es bindet, identifiziert, aus dem Fusi onsprotein löst oder synthetisch herstellt und isoliert.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann gekennzeichnet sein durch p(III) als Phagen-Hüllprotein.

Beispiel 1

Durch ein neuartiges Verfahren genannt Phage-Display konnten zunächst die Peptide, welche die Bindung zum Chromatographiematerial (Metallchelaten) ausmachen, identifiziert werden. Benutzt wurde die Phagen-Bank M13LP67 (Devlin, J. J. et al. (1990) Science 249, 404-406). Anschließend konnten die jeweiligen Eigenschaften am Modell des fusionierten und modellhaft auf zureinigenden Phagenhüllproteins pIII analysiert werden.

Als Beispiel ist ein Fusionsprotein mit dem Fe(III) bindenden Peptid Arg Pro Thr Lys Lys Phe Thr Leu Thr His Lys His Ser Lys Arg aufgereinigt werden (Fig. 1).

Es handelt sich hier um einen Western-Blot, bei dem das pIII- Fusionsprotein (oberste dicke Bande) und das Haupthüllprotein pVIII (großer Fleck links unten) mit Antikörpern nachgewiesen wurden.
Spalte 1 = Ausgangsmaterial der Aufreinigung
Spalte 2 = Molekulargewichtsstandard
Spalte 3 = 2 M Harnstoff behandelt, Elution 1 mit EDTA
Spalte 4 = 4 M Harnstoff behandelt, Elution 1 mit EDTA
Spalte 5 = 6 M Harnstoff behandelt, Elution 1 mit EDTA
Spalte 6 = 2 M Harnstoff behandelt, Elution 2 mit EDTA+SDS
Spalte 7 = 4 M Harnstoff behandelt, Elution 2 mit EDTA+SDS
Spalte 8 = 6 M Harnstoff behandelt, Elution 2 mit EDTA+SDS

Die das eisenbindende Peptid tragenden Phagen wurden bei 65°C für 20 min denaturiert und anschließend mit der jeweilig ange gebenen Menge Harnstoff behandelt. Als Affinitätsmaterial diente mit Fe(III) beladene NTA-Sepharose von Quiagen. Nach einem Waschschritt wurde mit EDTA eluiert, wobei die Fe(III)- Ionen samt Fusionsprotein von dem Material abgelöst werden (Elution 1). Da das pIII-Protein teilweise sehr hydrophob ist, konnte mit 1% SDS bei der Elution 2 das restliche Protein von dem Affinitätsmaterial gelöst werden. Wichtig ist, daß nach der Aufreinigung kein pVIII-Hüllprotein mehr nachweisbar ist. Auch andere Hintergrundproteine sind hier nicht zu sehen, auch nicht durch eine Silbernitratfärbung eines SDS- Polyacrylamidgels mit identischem Auftrag. Dafür bleibt ungefähr 1/5 des Fusionsproteins bei der Elution erhalten. Eine Trennung eines mit dem Affinitätspeptid fusionierten rekombinanten Proteins, auch unter denaturierenden Bedingungen, ist somit prinzipiell möglich. Ahnliche Ergebnisse lassen sich auch für die anderen Peptide zeigen.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. An Fe(III) bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz aus der folgenden Gruppe von Sequenzen:

2. An Cu(II), Ni(II) und/oder Zn(II) und/oder insbesondere Co(II) bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz aus der folgenden Gruppe von Sequenzen:

(i) Ala His Gln Gln Thr His His Tyr Phe Thr His His Leu Asn Trp
wobei diese Sequenz N-terminal um eine Aminosäure und/oder C-terminal um 1, 2 oder 3 Aminosäuren dele tiert sein kann, und
(ii) Val Ala His His Trp Trp His Asp Gly Tyr Lys His Pro Leu Asn
wobei diese Sequenz N-terminal um 1 oder 2 Aminosäu ren und/oder C-terminal um 1, 2 oder 3 Aminosäuren deletiert sein kann.

3. An Co(II), Ni(II) und/oder Zn(II) und/oder insbesondere Cu(II) bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz aus der folgenden Gruppe von Sequenzen:

4. An Co(II), Cu(II) und/oder Zn(II) und/oder insbesondere Ni(II) bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz aus der folgenden Gruppe von Sequenzen:

5. An Co(II), Cu(II) und/oder Ni(II) und/oder insbesondere Zn(II) bindendes Peptid mit der folgenden Aminosäurense quenz:
His His His His Ser Tyr Met Ser Ser Ile Pro Ser Thr Ala Trp,
wobei diese Sequenz C-terminal um 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Aminosäuren deletiert sein kann.

6. Fusionsprotein, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein rekombinantes Protein handelt, dessen N-Terminus oder C- Terminus zur Aufreinigung des Proteins und/oder zu seinem Nachweis durch ein Peptid bzw. eine Aminosäuresequenz (Af finitätstag) gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche ge bildet wird.

7. Fusionsprotein nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch eine Verknüpfung von rekombinantem Protein und Affinitätstag, die nach Aufreinigung und/oder Nachweis des rekombinanten Proteins lösbar ist.

8. Fusionsprotein nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Verknüpfung um eine Protease-Schnittstelle oder ein Intein handelt.

9. Oligonucleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Fusions protein gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 codiert.

10. Expressionsvektor mit einem Oligonucleotid gemäß Anspruch 9 zur Expression eines Fusionsproteins gemäß einem der An sprüche 6 bis 8.

11. Bakterieller Expressionsstamm, insbesondere Escherichia coli-Stamm, mit einem Expressionsvektor gemäß Anspruch 10.

12. Verfahren zur Gewinnung eines an Co(II), Cu(II), Ni(II) und/oder Zn(II) bindenden Peptids, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) ein Peptid
- - mit 6 bis 15 Aminosäureresten und
- - mit 4 bis 6 und gegebenenfalls mehr His-Resten als Ami nosäurereste,
- - von denen bis zu 4 His-Reste unmittelbare aufeinander folgen können,
als Fusionsprotein mit einem Phagen-Hüllprotein in einem Phagen-Display exprimiert,
(b) das exprimierte Fusionsprotein auf ein mit Co(II), Cu(II), Ni(II) und/oder Zn(II) beladenes Chromatogra phie-Material aufgibt und die Affinität des Peptids zu dem mit den Metallionen beladenen Chromatographie-Ma terial testet,
(c) das Peptid, sofern es bindet, identifiziert, aus dem Fusionsprotein löst oder synthetisch herstellt und isoliert.

13. Verfahren zur Gewinnung eines an Fe(III) bindenden Pep tids, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) ein Peptid
- - mit 7 bis 15 Aminosäureresten, und
- - mit 0 bis 2 und gegebenenfalls mehr Arg-Resten als Ami nosäurereste,
- - mit 0 bis 4 und gegebenenfalls mehr Lys-Resten als Ami nosäurereste und
- - mit 2 bis 3 und gegebenenfalls mehr His-Resten als Ami nosäurereste
als Fusionsprotein mit einem Phagen-Hüllprotein in einem Phagen-Display exprimiert,
(b) das exprimierte Fusionsprotein auf ein mit Fe(III) be ladenes Chromatographie-Material aufgibt und die Affi nität des Peptids zu dem mit den Metallionen beladen nen Chromatographie-Material testet,
(c) das Peptid, sofern es bindet, identifiziert, aus dem Fusionsprotein löst oder synthetisch herstellt und isoliert.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, gekennzeichnet durch p (III) als Phagen-Hüllprotein.