DE69931382T2

DE69931382T2 - Intein vermittelte peptidligation

Info

Publication number: DE69931382T2
Application number: DE69931382T
Authority: DE
Inventors: Ming-Qun Hamilton XU; C. Thomas Somerville EVANS
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1998-09-30
Filing date: 1999-09-30
Publication date: 2007-05-03
Anticipated expiration: 2019-10-01
Also published as: EP1117693A2; JP2002526387A; WO2000018881A3; WO2000018881A2; JP4749548B2; EP1117693A4; CA2344764A1; DE69931382D1; WO2000018881A9; WO2000018881A8; CA2344764C; EP1117693B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Gentechnik ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Manipulation von Proteinen. Jedoch sind genetische Methoden durch die Verwendung von nur natürlich codierten Aminosäuren beschränkt. Überdies sind cytotoxische Proteine durch Expression und Isolierung aus einer lebenden Quelle schwer zu gewinnen, weil die Expression des toxischen Proteins den Tod des Wirts zur Folge haben kann.
In gewissem Umfang wurden Vorschriften entwickelt, um diese Probleme zu umgehen, beispielsweise die chemische Gesamtsynthese (Kent, S.B. (1988) Ann. Rev. Biochem. 57: 957–989), die Verwendung von misacylierten tRNAs (Noren, et al., (1989) Science 244: 182–188) und halb-synthetische Techniken (Review von Offord, R. (1987) Protein Eng. 1: 151–157; Roy, et al. (1994) Methods in Enzymol. 231: 194–215; Wallace, C.J. (1993) FASEB 7: 505–515). Jedoch sind all diese Verfahren entweder durch die Größe des Fragmentes beschränkt, das erzeugt werden kann, oder durch die niedrige Reaktionsausbeute.
Es wäre deswegen wünschenswert, eine halb-synthetische Technik mit hoher Ausbeute zu entwickeln, um eine in vitro-Fusion eines synthetischen Proteins oder Peptid-Fragmentes an ein exprimiertes Protein ohne Einschränkung bezüglich der Größe der fusionierten Fragmente zu ermöglichen.
Desgleichen wäre es, um cytotoxische Proteine zu erzeugen, wünschenswert, ein Verfahren zum Fusionieren eines synthetischen Fragments in vivo an ein inaktives exprimiertes Protein zu entwickeln, um eine Proteinaktivität nach der Produktion durch den Wirt wiederherzustellen.
Das modifizierte Sce-VMA-Intein wurde dazu verwendet, Thioester-markierte Proteine zur Verwendung in der Ligation zu erzeugen (Beispiel 19, USSN 08/811, 492, eingereicht am 16. Juni 1996; Chong, (1996) J. Biol. Chem., 271 (36): 22159–22168; Chong, (1997) Gene, 192: 271–281; und Muir, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 6705–6710).
Einige Nachteile waren die niedrigen Ausbeuten, die aufgrund einer schlechten Spaltung des Sce-VMA-Inteins mit Thiol-Reagenzien, die für die Ligation optimal sind, dem Bedarf nach großen Peptid-Mengen aufgrund von An-Säulenreaktionen, der Verwendung von stark riechenden Reagenzien und/oder niederen Proteinausbeuten durch Verwendung eines großen, eukaryontischen Inteins, niedrig waren.
Zusammenfassung der Erfindung
Allgemein gesprochen, wurde nunmehr ein Verfahren zur Herstellung eines halb-synthetischen Fusionsproteins in vitro herausgefunden, das die Schritte der Erzeugung eines Ziel- bzw. Targetproteins, fusioniert an ein Proteinspleißelement (ein Intein) und ein selektives Spalten der Fusion und das Ligieren eines synthetischen Proteins oder Peptids am C-terminalen Thioester des Targetproteins umfasst, das viele der Nachteile der oben erwähnten Probleme überwindet. Ein solches Verfahren weist höhere Ausbeuten aufgrund einer besseren Thiol-induzierten Spaltung mit Thiol-Reagenzien auf, die für die Ligationsreaktion optimiert wurden. Eine von der Säule entfernte (off-column) Ligation ermöglicht die Probenkonzentration ebenso wie die Verwendung von weniger Peptid. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Thiol-Reagenz 2-Mercaptoethansulfonsäure (MESNA), das ein geruchloses Thiol-Reagenz ist, zur Spaltung und Ligation zusammen mit dem Mxe-Intein verwendet, das aus einer bakteriellen Quelle stammt und oftmals in bakteriellen Zellen besser exprimiert wird. Weiterhin ermöglicht der neue Ansatz, dass Peptide direkt an die Thioester-Bindung ligiert werden, die zwischen einem Intein und dem Targetprotein gebildet werden. Es wurde ebenfalls ein Verfahren zur Erzeugung eines cytotoxischen Proteins herausgefunden, das die Schritte der Erzeugung einer trunkierten, inaktiven Form des Proteins in vivo, die an ein Proteinspleißelement fusioniert ist, und das selektive Spalten der Fusion und ein Ligieren eines synthetischen Proteins oder Peptids an einen C-terminalen Thioester des Targetproteins zur Wiederherstellung der Aktivität des nativen cytotoxischen Proteins, umfasst. Rekombinante Vektoren zur Herstellung einer solchen spaltbaren Fusionsproteins sind ebenfalls offenbart.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Flussdiagramm, das die chemischen Reaktionen zeigt, die eine Intein-vermittelte Peptid-Ligation ermöglichen. Der am C-Terminus des Targetproteins während der IMPACT^TM-Aufreinigung erzeugte Thioester wurde in einer „nativen chemischen Ligations"-Reaktion verwendet. Dies ermöglichte die Ligation eines synthetischen Peptids an ein bakteriell exprimiertes Protein. Eine typische Ligationsreaktion schließt die Expression der Zielprotein-Intein-CBD-Fusion, gefolgt von einer Bindung an ein Chitin-Harz, ein. Ein Thiol-Reagenz induzierte die Spaltung des Inteins. Das Target wurde aus dem Chitin-Harz eluiert und ein synthetisches Peptid wurde zugesetzt. Die Ligationsreaktion schritt über Nacht voran.
2 ist ein Gel, das die Ergebnisse der Spaltung und Ligationsreaktionen unter Verwendung verschiedener Thiole zeigt. Die Spaltung und Ligationsreaktionen mit unterschiedlichen Thiolen wurden auf 10 bis 20 % Tricin-Gelen visualisiert. MYB (ein Fusionsprotein aus Maltose-bindendem Protein-Sce-VMA-Intein (N454A)-Chitin-Bindungsdomäne) und MXB (ein Fusionsprotein aus Maltose-bindendem Protein-Mxe-GyrA (N198A) Intein-Chitin-bindende Domäne) wurden über Nacht bei 4° C mit verschiedenen Thiolen (50 mM) in 150 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8, in Gegenwart eines 30-Aminosäurepeptids mit einem N-terminalen Cystein inkubiert. Das Peptid ligiert an den C-Terminus von MBP. Bahnen 1 bis 5: Ligation mit MYB. Bahn 1: kein Thiol. Bahn 2: Dithiothreitol. Bahn 3: 2-Mercaptoethansulfonsäure. Bahn 4: 3-Mercaptopropionsäure. Bahn 5: Thiophenol. Bahnen 6 bis 10: Ligation mit MXB. Bahn 6: kein Thiol. Bahn 7: Dithiothreitol. Bahn 8: 2-Mercaptoethansulfonsäure. Bahn 9: 3-Mercaptopropionsäure. Bahn 10: Thiophenol.
3 ist ein Gel, das die direkte Ligation eines Peptids an den Thioester zeigt, der zwischen dem Sce-VMA-Intein und dem Maltose-bindendem Protein gebildet wird. SDS-PAGE einer direkten Ligationsreaktion mit einem 10–20 % Tricin-Gel. Bahn 1: ein Vorläuferprotein (MYBleu), das aus Maltose-bindendem Protein-Sce-VMA1 Intein-Chitin-bindende Domäne besteht, wurde auf > 95° C für 5 Minuten in einem Puffer von 50 mM Trizma-Base, pH 8,5, erhitzt, die 100 mM NaCl, 1 % SDS und mM Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP), gefolgt von einer Über-Nacht-Inkubation bei Raumtemperatur, enthielt. Der Vorläufer (MYBleu) ist zusammen mit dem Sce-VMA1-Intein (Y) und dem Maltose-bindenden Protein (M) sichtbar, die Spaltprodukte sind. Bahn 2: Das Vorläuferprotein wurde denselben Bedingungen wie in Bahn 1 beschrieben unterworfen, außer dass das 30-Aminosäurepeptid (1 mM) zugesetzt wurde. Der Vorläufer (MYB) und die Spaltprodukte (Y und M) sind zusammen mit dem Ligationsprodukt (M + 30mer) sichtbar, das gebildet wird, wenn das 30-Aminosäurepeptid an das Maltose-bindende Protein fusioniert.
4 ist ein Diagramm, das den pTXB1-Expressionsvektor aus Beispiel I (SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:8) darstellt.
5 ist die DNA-Sequenz von pTXB1 (SEQ ID NO:5).
6 ist ein Gel, das die Ergebnisse der NpaI-Proteinligationsreaktion zeigt. Proteinligationsreaktionen wurden auf 10–20 % Tricin-Gelen überprüft. Bahn 1: geklärter Zellextrakt nach IPTG (0,5 mM) Induktion von ER2566-Zellen, die pTXB2-HpaI-Plasmid enthielten. Das Fusionsprotein von HpaI₂₂₃-MXEGyrA-Intein-CBD (52 kDa) ist sichtbar. Bahn 2: Zellextrakt wie in Bahn 1 nach Passage über eine Chitin-Säule, was die Bindung des Fusionsproteins zur Folge hat. Bahn 3: HpaI₂₂₃ (25,7 kDa) nach Spaltung aus dem Fusionsprotein durch Zusatz von MESNA. Bahn 4: Ligationsprodukt von HpaI₂₂₃ (0,2 mg/ml) mit 1 mM eines 31-Aminosäurepeptids (Ligationsprodukt 29,6 kDa), das die Reste repräsentiert, die zur Erzeugung von Volle-Länge-HpaI notwendig sind, nach Inkubation über Nacht bei 4° C. Bahn 5: Volle-Länge-HpaI aus einer rekombinanten Quelle (29,6 kDa), die BSA (66 kDa) und zwei Verunreinigungen enthält.
7 ist ein Western Blot verschiedener Proteine, die an ein biotinyliertes Peptid ligiert sind. Proteine, die mit dem Mxe-GyrA-IMPAC^TM-Derivat aufgereinigt wurden, wurden an ein synthetisches Peptid ligiert, das eine Antikörper-Erkennungssequenz enthielt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Targetproteins mit einem Carboxy-terminalen Thioester bereit, der für eine Peptid-Ligation geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren Folgendes umfasst:

(a) Exprimieren eines rekombinanten Vorläuferproteins in einer Wirtszelle, das das Targetprotein an seinem Carboxy-Terminus an ein Intein umfasst, wobei das Intein einen Amino-Terminus und einen Carboxy-Terminus aufweist, und wobei der Amino-Terminus des Inteins an ein Targetprotein fusioniert ist und wobei das Intein aus einem nativen Intein, einem Intein-Derivat oder einer Intein-Mutante ausgewählt ist; und
(b) In-Berührung-Bringen des exprimierten Vorläuferproteins mit 2-Mercaptoethansulfonsäure und Induzieren einer Spaltung des Inteins von dem Vorläuferprotein, um das Targetprotein mit dem Carboxy-terminalen Thioester zu bilden.

Vorzugsweise ist das Intein aus Saccharomyces cerevisiae Vma-Intein und Mycobacterium xenopi Gyr-A-Intein ausgewählt. Der Carboxy-Terminus des Inteins kann an eine Protein-bindende Domäne fusioniert sein, die eine Chitin-bindende Domäne ist. Das Targetprotein kann aus Bacillus stearothermophilus DNA Polymerase I, großes Fragment, Thioredoxin oder einem cytotoxischen Protein oder aus einem Maltose-bindenden Protein und Paramyosin ausgewählt sein.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Exprimieren eines rekombinanten Proteinvorläufers bereit, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren Folgendes umfasst:

(a) Einfügen einer Nucleinsäuresequenz, die ein Targetprotein codiert, in ein Plasmid an einer multiplen Klonierungsstelle, die sich stromaufwärts und in-Frame mit einem Fusionsgen befindet, das ein Intein und eine Chitin-bindende Domäne codiert, derart, dass (i) das Intein aus einem natürlich vorkommenden Intein, einem Intein-Derivat und einer Intein-Mutante ausgewählt wird; und (ii) die multiple Klonierungsstelle aus einem Linker aus SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:4 gebildet ist; und
(b) Einführen des Plasmids in eine Wirtszelle und Bereitstellen von Bedingungen, die zum Exprimieren des rekombinanten Vorläuferproteins durch die Wirtszelle geeignet sind.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Modifizieren eines Targetproteins durch Ligieren eines chemisch synthetisierten Peptids oder Proteins in vitro an das Targetprotein bereit, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren Folgendes umfasst:

(a) Exprimieren des Zielproteins in einer Wirtszelle, das an seinem Carboxy-Terminus an ein Intein fusioniert ist, ausgewählt aus einem Intein, einem Intein-Derivat und einem mutierten Intein, wobei das Intein zu einer Thiol-induzierten Spaltung in der Lage ist;
(b) Induzieren einer Spaltung des Inteins aus dem Zielprotein durch Zusetzen von 2-Mercaptoethansulfonsäure, um einen Carboxy-terminalen Thioester am Zielprotein zu bilden;
(c) Gewinnen des chemisch synthetisierten Peptids oder Proteins mit einem Amino-terminalen Cystein; und
(d) Ligieren des Zielproteins von (b) an das chemisch synthetisierte Peptid oder Protein aus (c) zur Bildung eines modifizierten Targetproteins.

Vorzugsweise wird das Intein an seinem Carboxy-Terminus an eine Chitin-bindende Domäne fusioniert. Das Protein kann vor der Modifikation ein cytotoxisches Protein sein.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Markierung eines Targetproteins bereit, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren Folgendes umfasst:

(a) Exprimieren eines rekombinanten Vorläuferproteins in einer Wirtszelle, das das Targetprotein an seinem Carboxy-Terminus an ein Intein fusioniert umfasst, wobei das Intein einen Amino- und einen Carboxy-Terminus derart aufweist, dass das Intein am Amino-Terminus an das Targetprotein fusioniert wird, wobei das Intein aus einem natürlich vorkommenden Intein, einem Intein-Derivat oder einer Intein-Mutante ausgewählt ist und wobei das Intein zu einer Thiol-induzierten Spaltung in der Lage ist;
(b) Spalten des Vorläuferproteins in Gegenwart von 2-Mercaptoethansulfonsäure, um das Zielprotein mit einem Carboxy-terminalen Thioester auszubilden;
(c) Gewinnen eines chemisch synthetisierten Peptids oder Proteins mit einem Marker und einem Amino-terminalen Cystein; und
(d) Ligieren des Targetproteins von (b) mit dem chemisch synthetisierten Peptid oder Protein von (c) zum Markieren des Targetproteins.

Vorzugsweise wird das Intein an seinem Carboxy-Terminus an eine Chitin-bindende Domäne fusioniert. Der Marker kann aus einem fluoreszierenden Marker, einer Spin-Markierung, einem Affinitätsmarker oder einem Radiomarker ausgewählt sein. Das chemisch synthetisierte Peptid oder Protein ist eine Antigen-Determinante.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Ligieren eines chemisch synthetisierten Proteins oder Peptids an eine inaktive Form eines Proteins bereit, um die Proteinaktivität wiederherzustellen, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren Folgendes umfasst:

(a) Exprimieren eines Fusionsproteins in einer Wirtszelle, das die inaktive Form des Proteins fusioniert an seinem Carboxy-Terminus an einen eines Inteins, eines Intein-Derivats oder einer Intein-Mutante umfasst, wobei das Fusionsprotein aus einem Plasmid exprimiert wird;
(b) Induzieren einer Intein-vermittelten Spaltung des Proteins aus (a) durch Zusetzen von 2-Mercaptoethansulfonsäure, um einen Carboxy-terminalen Thioester an dem inaktiven Protein zu formen;
(c) Gewinnen eines chemisch synthetisierten Proteins oder Peptids mit einem Aminoterminalen Cystein; und
(d) Ligieren des inaktiven Proteins aus (b) an das chemisch synthetisierte Peptid oder Protein aus (c), um die Proteinaktivität wiederherzustellen.

Das Protein kann ein cytotoxisches Protein sein, das eine Restriktionsendonuclease sein kann.
Nachdem der Umfang der vorliegenden Erfindung dargelegt wurde, wird diese nunmehr weiter beschrieben und allgemein veranschaulicht werden.
Die Ligationsverfahren der vorliegenden Erfindung basieren auf der Entdeckung, dass ein Cystein- oder Peptid-Fragment, das ein N-terminales Cystein enthält, in vitro an ein bakteriell exprimiertes Protein fusioniert werden kann, das durch eine Thiol-induzierte Spaltung eines Inteins erzeugt werden kann (US-Patent Nr. 5,496,714; Beispiel 19 von USSN 08/811,492, eingereicht am 16. Juni 1997; Chong, et al. (1996), siehe oben und Chong, et al., (1997), siehe oben.
Das Ligationsverfahren, das hierin offenbart ist, verwendet ein Proteinspleißelement, ein Intein (Perler, et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 1125–1127), um einen Thioester am C-terminalen α-Kohlenstoff eines exprimierten Proteins präzise zu erzeugen. Dieser reaktive Thioester könnte zwischen dem Targetprotein und dem Intein vorliegen oder durch Zusatz eines Thiol-Reagenzes erzeugt werden. Kürzlich wurde die Erzeugung eines solchen Thioesters unter Verwendung eines Inteins (CIVPS) beschrieben, der so modifiziert war, dass er in der Lage war, eine Thiol-induzierbare Spaltung an seiner N-terminalen Verbindungsstelle in Gegenwart des Thiol-Reagenz Dithiothreitol (DTT) eine Thiol-induzierbare Spaltung durchzumachen (Chong, et al. (1997), siehe oben; Comb, et al. US-Patent Nr. 5,496,714). Dieser C-terminale Thioester wurde früher in einer „nativen chemischen Ligations"-Reaktion verwendet (Dawson, et al., (1994) Science 266: 776–779), um ³⁵S-Cystein oder ein Peptid-Fragment, das ein N-terminales Cystein enthält, an ein bakteriell exprimiertes Protein zu fusionieren (Beispiel 19, Comb, et al. US-Patent Nr. 5,834,247, Chong (1996), siehe oben und Chong (1997), siehe oben).
Das Ligationsverfahren der vorliegenden Erfindung beginnt mit der Aufreinigung des Thioester-markierten Zielproteins unter Verwendung eines Inteins wie beschrieben (Chong, et al. (1997), siehe oben). Das direkte Ligationsverfahren der vorliegenden Erfindung beginnt mit der Isolierung eines Vorläufers, der aus dem Zielprotein-Intein-CBD zusammengesetzt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle bakteriell. In anderen Ausführungsformen ist die Wirtszelle Hefe, Insekt oder Säugetier. Ein Cystein-Thiol am N-Terminus eines synthetischen Peptids greift nukleophil einen Thioester an, der am frisch isolierten C-terminalen α-Kohlenstoff des Targetproteins vorliegt, oder greift direkt den Thioester an, der zwischen dem Targetprotein und dem Intein vorliegt. Dies erzeugt initial einen Thioester zwischen den beiden Reaktanten, und ordnet sich spontan zu einer nativen Peptid-Bindung um (1).
Um die Ligationseffizienz zu optimieren, so dass mehr als 90 % des bakteriell exprimierten Targetproteins an das synthetische Peptid oder Protein fusioniert werden können, werden spezifische Thiol-Reagenzien und Inteine gescreent. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Intein irgendein CIVPS sein, wie beispielsweise SceVMA, MxeGyrA oder Derivate oder Mutanten hiervon, und das Thiol-Reagenz ist 2-Mercaptoethansulfonsäure, Thiophenol, DTT oder 3-Mercaptopropionsäure (Comb, et al. US-Patent Nr. 5,496,714; US-Patent Nr. 5,834,247).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wurde ein Intein, dessen Proteinspleißaktivität durch Mutation blockiert wurde, verwendet. Die Mutante muss jedoch die Fähigkeit beibehalten, eine N-S-Verschiebung durchzumachen, was somit die Thioester-Bindung zwischen ihr selbst und einem N-terminalen Protein ermöglicht. Dieser Thioester kann dann nucleophil durch ein Thiol-Reagenz angegriffen werden oder durch das N-terminale Cystein einer Peptid-Sequenz. Beispielsweise erzeugte das Mutieren des C-terminalen Asparagins (asn 198) eines Inteins aus dem GyrA-Gen von Mycobacterium xenopi (Telenti, et al., (1997) J. Bacteriol. 179: 6378–6382) an ein Alanin ein Thiol-induzierbares Spaltelement. Dieses modifizierte Intein spaltete mit Thiol-Reagenzien, die für die Ligationsreaktion optimal waren, gut, wie beispielsweise MESNA und Thiophenol. Weiterhin können optimale Thiol-Reagenz- und Intein-Kombinationen durch Inkubieren eines Vorläuferproteins, das das Intein von Interesse enthält, mit einer breiten Vielzahl von Thiol-Reagenzien, gefolgt von der Bestimmung des Umfangs der Spaltung des Vorläuferproteins (2) bestimmt werden.
Die Verwendung eines derartigen Inteins und von spezifischen Thiol-Reagenzien führt zu optimalen Ausbeuten und hohen Ligationseffizienzen; typischerweise können mehr als 90 % des N-terminalen Ligationsfragments modifiziert werden.
Die Ligationsverfahren der vorliegenden Erfindung erweitern die Möglichkeit, nicht codierte Aminosäuren in größere Proteinsequenzen durch Erzeugen eines synthetischen Peptid-Fragmentes mit fluoreszierenden Sonden, Spin-Markierungen, Affinitätsmarkern, Radiomarkern oder Antigendeterminanten zu inkorporieren und diese an ein in vivo exprimiertes Protein zu ligieren, das unter Verwendung eines modifizierten Inteins isoliert wurde.
Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren die Isolierung cytotoxischer Proteine durch Aufreinigen eines inaktiven trunkierten Vorläufers aus einer Wirtsquelle, beispielsweise Bakterien, und die Erzeugung eines aktiven Proteins oder Enzyms nach der Ligation eines synthetischen Peptids. Beispielsweise können Restriktionsendonucleasen, die nicht erfolgreich durch traditionelle Verfahren kloniert wurden, gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt werden.
Ebenfalls ermöglicht das direkte Ligationsverfahren die Ligation eines Proteins oder einer Peptid-Sequenz an ein anderes Protein oder Peptid-Sequenz ohne Verwendung von exogenen Thiol-Reagenzien. Die direkte Ligation beruht auf dem nucleophilen Angriff der N-terminalen Aminosäure eines Peptids an dem Thioester, der zwischen einem Targetprotein und einem Intein gebildet wird (3).
In Zusammenfassung, kann ein Fusionsprotein unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, das einzigartige Eigenschaften besitzt, die gegenwärtig nicht genetisch bzw. gentechnisch erzeugt werden können.
Die unten dargestellten Beispiele sind lediglich als spezielle bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung vorgesehen und sollen den Umfang der Erfindung nicht einschränken. Die vorliegende Erfindung umfasst Modifikationen und Variationen der Verfahren, die hierin gelehrt werden, die für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet offensichtlich wären.
Die oben und unten erwähnten Bezugnahmen sind hiermit durch diese Bezugnahme mit aufgenommen.
Beispiel 1
Erzeugung der Vektoren pTXB1 und pTXB2 zur Ligation:
Asparagin 198 des MxeGyrA-Inteins (Telenti, et al., (1997) J. Bacteriol. 179: 6378–6382) wurden zu Alanin durch die Linker-Einfügung bzw. -Insertion in die XmnI- und PstI-Stellen bzw. -Orte von pmxeMIPTyrXmnSPdel zur Erzeugung von pMXP1 mutiert. Der XmnI-Ort war ursprünglich in die unmodifizierte MxeGyrA-Inteinsequenz durch stille Mutagenese eingebracht worden. Der PstI-Ort war eine einzigartige Stelle innerhalb des Plasmids. Der Linker war aus mxe#3 (5'-GGTTCGTCAGCCACGCTACTGGCCTCACCGGTTGATAGCTGCA-3') (SEQ ID NO:1) und mxe#4 (5'GCTATCAACCGGTGAGGCCAG TAGCGTGGCTGACGAACC-3') (SEQ ID NO:2) zusammengesetzt.
In pMXP1 wurde ein anderer Linker, zusammengesetzt aus mxe#1 (5'-TCGAATCTAGACATATGGCCATGGGTGGCGGCCGCCTCGAGGGCTCTTCCTGCATCACGGGAGATGCA-3') (SEQ ID NO:3) und mxe#2 (5'-CTAGTGCATCTCCCGTGATGCAGGAAGAGCCCTCGAGGCGHGCCGCCACCCA TGGCCATATGTCTAGAT-3') (SEA ID NO:4) in die XhoI- und SpeI-Stellen eingefügt, um eine multiple Klonierungsstelle (XbaI-NdeI-NcoI-NotI-XhoI-SapI) vor dem MxeGyrA-Intein (pMXP2) einzuführen.
Das 0,6 Kilobasen NotI an AgeI-Fragment von pMXP2 wurde in denselben Orten in pTYB1 (IMPACT-Kit, New England Biolabs, Beverly, MA) ligiert und das NcoI an AgeI-Fragment von pMXP2 wurde in pTYB3 (IMPACT-Kit, New England Biolabs, Beverly, MA) kloniert, um die Plasmide pTXB1 (siehe 4 und 5) (SEQ ID NO:5) bzw. pTXB2 zu erzeugen. Diese Vektoren weisen eine multiple Klonierungsstelle stromaufwärts der modifizierten MxeGyrA-Intein-Chitin-Bindungsdomänen-Fusion auf. Dies ermöglicht die Insertion eines Targetgens von Interesse in-Frame mit der Intein- und Chitin-bindenden Domäne (CBD).
Erzeugung von Vektoren pMYBleu zur Ligation:
pMYBleu war wie in Chong, et al., (1998), J. Biol. Chem. 273: 10567–10577 beschrieben. Dieser Vektor bestand aus Maltose-bindendem Protein stromaufwärts der SceVMA-Intein-Chitin-bindenden Domäne. Ein Leucin ist an der -1-Position anstelle des nativen Restes vorhanden (der ein Glycin ist).
Aufreinigung von Thioester-markierten Proteinen:
Die Proteinaufreinigung erfolgte wie beschrieben unter Verwendung des Sce-VMA-Inteins (Chong, et al., (1997) Gene 192: 271–281) mit geringen Modifikationen. ER2566-Zellen (IMPACT T7 Instruktionshandbuch von New England Biolabs, Beverly, MA), die den pTXB-Vektor mit dem geeigneten Insert enthielten, wurden bis zu einer OD₆₀₀ von 0,5 bis 0,6 bei 37° C gezüchtet und an diesem Punkt wurden diese mit 0,5 mM IPTG über Nacht bei 15° C induziert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und durch Beschallung lysiert (durchgeführt auf Eis). Das dreiteilige Fusionsprotein wurde an Chitin-Kügelchen (10 ml Bettvolumen, 6, Bahnen 1 und 2), äquilibriert in Puffer A (50 mM Tris, pH 7,4, und 500 mM NaCl) gebunden und mit 10 Säulenvolumina Puffer A zur Entfernung von ungebundenem Material gewaschen.
Die Spaltung wurde unter Verwendung eines Puffers aus 50 mM 2-Mercaptoethansulfonsäure (MESNA), 50 mM Tris, pH 8,0 und 100 mM NaCl gestartet. Andere Thiol-Reagenzien wurden ebenfalls zu anderen Zeitpunkten verwendet, wie beispielsweise Thiophenol, Dithiothreitol und/oder 3-Mercaptopropionsäure. Nach Über-Nacht-Inkubation bei von 4 bis 25° C wurde Protein aus der Säule eluiert (6, Bahn 3). Dieses Protein enthielt einen Thioester am C-Terminus.
Aufreinigung von MYB. MYBIeu und MXB:
Volle-Länge-Vorläuferproteine bestanden aus Maltose-bindendem Protein-SceVMA-Intein (N454A)-Chitin-bindender Domäne (MYB) und Maltose-bindendem Protein-MxeGyrA (N198A)Intein-Chitin-bindende Domäne (MXB) wurde nach Induktion und Beschallung wie oben beschrieben durch Aufbringen der beschallten Probe auf eine 10-ml-Säule aus Amyloseharz (New England Biolabs, Beverly, MA) aufgereinigt. Ungebundene Proteine wurden aus der Säule mit 10 Säulenvolumina Puffer A (siehe Aufreinigung von Thioester-markierten Proteinen) gewaschen. Gebundene Proteine wurden mit einem Puffer aus 50 mM Tris, pH 8, der 100 mM NaCl und 10 mM Maltose enthielt, eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt und die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des Bio-Rad-Proteinassays (Hercules, CA) bestimmt.
Peptidsynthese:
Peptide für anschließende Ligationsreaktionen wurden auf einem ABI-Modell 433A Peptidsynthesegerät unter Verwendung einer FastMoc^TM Chemie (Fields et al. (1991) Pept. Res. 4, 95–101) in einem 0,085 mmol Maßstab synthetisiert. Vorher beladene HMP (p-Hydroxymethylphenoxymethyl)polystyrolharze (Applied Biosystems, Foster City, CA), die bei 0,5 mmol/g funktionalisiert waren, wurden in Verbindung mit Fmoc/NMP Chemie verwendet, die eine HBTU Aminosäureaktivierung verwandte (Dourtoglou, et al., (1984) Synthesis 572–754; Knorr, et al., (1989) Tetrahedron Lett. 30, 1927–1930). Fmoc Aminosäuren wurden von Applied Biosystems bezogen (Foster City, CA).
Die Synthese schritt mit einer einzigen Kopplung während jedes Zyklus voran. Die Peptidspaltung aus dem Harz und eine gleichzeitige Entfernung von Seitenketten-Schutzgruppen wurde durch Zusatz eines Spaltgemisches erleichtert (Perkin Elmer, Norwalk, CT), das aus 0,75 g Phenol, 0,25 ml 1,2-Ethandithiol, 0,5 ml entionisiertem H₂O und 10 ml TFA bestand. Das Harz wurde mit Stickstoff gespült und sanft bei Raumtemperatur für 3 Stunden gerührt. Im Anschluss an die Filtration und die Ausfällung in kaltem (0° C) Methyl-t-butylether wurde das Präzipitat in der Etherfraktion durch Zentrifugation gesammelt. Das Peptidpräzipitat wurde Vakuum-getrocknet und durch Massenspektrometrie unter Verwendung eines Perceptive Biosystems (Framingham, MA) MALDI-TOF Massenspektrometers analysiert.
Die Endaufreinigung erfolgte durch HPLC unter Verwendung eines Waters HPLC-Systems mit einem Lambda-Max Model 481 Multiwellenlängendetektor (eingestellt auf 214 nm), 500 Serienpumpen und einem automatischen Gradientenkontrollgerät mit einer Vydac semipräparativen C18-Säule. Die Elution des Peptids erfolgte mit einem 60-minütigen linearen Gradienten von 6 bis 60 % Acetonitril (V/V) in einer wässrigen Lösung von 0,1 % TFA (V/V).
Proteinspaltung und Ligationsreaktionen:
Spaltung von MYB und MXB: Das Vorläuferprotein (1 mg/ml) wurde über Nacht bei 4° C mit oder ohne einem Thiol-Reagenz (50 mM) in 150 mM Tris, pH 8, das 100 mM NaCl enthielt, inkubiert.
Ligationsreaktionen mit MYB und MXB: Das Vorläuferprotein (1 mg/ml) wurde wie zur Spaltung beschrieben behandelt, außer dass ein 30-Aminosäurepeptid (1 mM Endkonzentration, NH₂-CAYKTTQANKHIIVACEGNPYVPVHFDASV-COOH (SEQ ID NO:6) in die Reaktion mit eingeschlossen wurde (2).
Die Ligationsreaktionen nach der Aufreinigung von Thioester-markierten Proteinen: Lyophilisierte Peptide (New England Biolabs, Beverly, MA) wurden (zu 1 mM Endkonzentration) direkt dem Thioester-markierten Protein hinzugefügt, das aus der Chitin-Säule isoliert wurde. Man ließ die Reaktion über Nacht bei von 4 bis 25° C fortschreiten. In beiden Ligationsverfahren ist die Kondensation der Reaktanten auf einem 10 bis 20 % Tricin-Gel sichtbar (6). Die Ligationsreaktion wurde in Bedingungen von 5 bis 150 mM Tris oder HEPES-Puffer, 50 bis 1000 mM NaCl, 10 mM Maltose und pH 6 bis 11 und 0 bis 6 M Urea getestet.
Direktligationsreaktionen:
MYBleu (1 mg/ml) wurde in 6 M Urea oder 1 % SDS, pH 7,5 bis 8,5, 50 bis 200 mM NaCl und 1 mM eines 30-Aminosäurepeptids (NH₂CAYKTTQANKHIVVACEGNPYVPVHFDASV-COOH (SEQ ID NO:6)) inkubiert. Das MYBleu wurde für 0 bis 180 Minuten bei entweder 4° C oder 100° C vor dem Zusatz des 30-Aminosäurepeptids inkubiert. Die Ligationsreaktionen schritten über Nacht bei entweder 4° C oder 25° C voran.
Beispiel II
Markierung eines Targetproteins: Maltose-bindendes Protein
Maltose-bindendes Protein (MBP, 42 kDa) wurde wie in Beispiel 1 oben beschrieben unter Verwendung des IMPACT-Verfahrens (IMPACT Handbuch von New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) in Gegenwart von MESNA isoliert.
Ein biotinyliertes Peptid, das ein N-terminales Cystein besitzt (CDPEK*DS-COOH (SEQ ID NO:9)), bei dem das Biotin an der ε-Aminogruppe des Lysinrestes befestigt war) wurde an das frisch aufgereinigte Targetprotein wie oben beschrieben ligiert. Kurz gesagt, wurden 4 μl biotinyliertes Peptid (10 mM) mit einer 36 μl-Teilmenge der frisch aufgereinigten MBP-Probe vermischt. Das Gemisch wurde über Nacht bei 4° C inkubiert.
Western Blots mit alkalischer Phosphatase verbundenem Anti-Biotin-Antikörper wies das Vorhandensein des ligierten Produktes, jedoch nicht des unligierten Targetproteins (7) nach. Die Effizienz der Ligation ist typischerweise größer als 90 %, wenn MESNA zur Spaltung verwendet wird.
Beispiel III
Markierung eines Zielproteins: Bst DNA Polymerase I, großes Fragment (Bst Pol 1)
Das große Bst DNA Polymerase I Fragment (67 kDa) wurde wie in Beispiel 1 oben unter Verwendung des IMPACT-Verfahrens (IMPACT Handbuch von New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) in Gegenwart von MESNA isoliert.
Ein biotinyliertes Peptid, das ein N-terminales Cystein besitzt (CDPEK*DS-COOH (SEQ ID NO:9)), bei dem das Biotin an der ε-Aminogruppe des Lysinrestes befestigt war) wurde an das frisch aufgereinigte Targetprotein wie beschrieben ligiert. Kurz gesagt, wurden 4 μl biotinyliertes Peptid (10 mM) mit einer 36-μl-Teilmenge der frisch aufgereinigten Bst-PolI-Probe vermischt. Das Gemisch wurde bei 4° C über Nacht inkubiert.
Western Blots mit alkalischer Phosphate gebundenem Anti-Biotin-Antikörper wiesen das Vorhandensein des ligierten Produktes, jedoch nicht das unligierte Targetprotein (7) nach. Die Effizienz der Ligation ist typischerweise größer als 90 %, wenn MESNA zur Spaltung verwendet wird.
Beispiel IV
Markierung eines Targetproteins: Paramyosin
Paramyosin (29 kDa) wurde wie in Beispiel 1 oben unter Verwendung des IMPACT-Verfahrens (IMPACT Handbuch von New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) in Gegenwart von MESNA isoliert.
Ein biotinyliertes Peptid, das ein N-terminales Cystein besitzt (CDPEK*DS-COOH (SEQ ID NO:9)), bei dem das Biotin an der ε-Aminogruppe des Lysinrestes befesigt war) wurde an das frisch aufgereinigte Targetprotein wie beschrieben ligiert. Kurz gesagt, wurden 4 μl biotinyliertes Peptid (10 mM) mit einer 36 μl-Teilmenge der frisch aufgereinigten Paramyosin-Probe vermischt. Das Gemisch wurde bei 4° C über Nacht inkubiert.
Western Blots mit alkalischer Phosphatase-gebundenen Anti-Biotin-Antikörpern wiesen das Vorhandensein des ligierten Produktes, jedoch nicht des unligierten Zielproteins (7) nach. Die Effizienz der Ligation ist typischerweise größer als 90 %, wenn MESNA zur Spaltung verwendet wird.
Beispiel V
Markierung eines Targetproteins: E. coli Thioredoxin
E. coli Thioredoxin (12 kDa) wurde wie in Beispiel 1 oben unter Verwendung des IMPACT-Verfahrens (IMPACT Handbuch von New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) in Gegenwart von MESNA isoliert.
Ein biotinyliertes Peptid, das ein N-terminales Cystein (CDPEK*DS-COOH (SEQ ID NO:9)) besaß, bei dem das Biotin an die ε-Aminogruppe des Lysinrestes gebunden war) wurde an das frisch aufgereinigte Targetprotein wie beschrieben ligiert. Kurz gesagt, wurden 4 μl biotinyliertes Peptid (10 mM) mit einer 36 μl-Teilmenge der frisch aufgereinigten Thioredoxin-Probe vermischt. Das Gemisch wurde bei 4° C über Nacht inkubiert.
Western Blots mit alkalischer Phosphatase gebundenem Anti-Biotin-Antikörper wiesen das Vorhandensein des ligierten Produktes, jedoch nicht des unligierten Targetproteins, nach (7). Die Effizienz der Ligation ist typischerweise größer als 90 %, wenn MESNA zur Spaltung verwendet wird.
Beispiel VI
Isolierung eines cytotoxischen Proteins
Das Ligationsverfahren von Beispiel 1 wurde auf die Isolierung eines potentiell cytotoxischen Proteins angewandt. Eine Endonuclease von Haemophilus parainfluenzae (HpaI; Ito, et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20: 705–709) wurde durch Ligieren einer inaktiven trunkierten Form des Enzyms erzeugt, die in E. coli (ER2566 Zellen, New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) mit den fehlenden Aminosäuren, die synthetisch chemisch synthetisiert wurden, exprimiert.
Die ersten 223 Aminosäuren von HpaI (Volle-Länge HpaI ist 254 Aminosäuren lang) wurden in-Frame mit dem modifizierten MxeGyrA-Intein und dem CBD fusioniert. Das 223-Aminosäure-HpaI-Fragment wurde wie zur Aufreinigung von Thioester-markierten Proteinen beschrieben isoliert. Das trunkierte HpaI zeigte keine nachweisbare enzymatische Aktivität.
Ein synthetisches Peptid, das die 31 Aminosäuren repräsentiert, die notwendig waren, um HpaI zu vervollständigen, wurden an die 223 Aminosäure trunkierte Form von HpaI durch das Verfahren von Beispiel I ligiert.
Enzymatischer Assay für HpaI:
Die Aktivität des fusionierten HpaI wurde durch seine Fähigkeit bestimmt, Lambda DNA (New England Biolabs, Beverly, MA) zu digerieren. Reihenverdünnungen von ligierten oder trunkierten HpaI mit dem geeigneten Peptid, hinzugefügt zu 1 mM, wurden mit 1 μg Lambda- DNA für 1 Stunde bei 37° C in einem Puffer von 20 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 10 mM Magnesiumacetat, 50 mM Kaliumacetat, 1 mM Dithiothreitol und 170 μg/ml BSA (Gesamtvolumen 30 μl) inkubiert. Digestionsreaktionen wurden auf 1 % Agarose-Gelen visualisiert, die mit Ethidiumbromid durchdrungen waren. Eine Einheit von HpaI wurde als Menge Enzym definiert, die notwendig war, um 1 μg Lambda DNA in einer Stunde bei 37° C zu digerieren.
Das neu ligierte HpaI wies eine spezifische Aktivität von 0,5 bis 1,5 × 10⁶ Einheiten/mg auf, die gut mit dem erwarteten Wert von 1 bis 2 × 10⁶ Einheiten/mg für das Volle-Länge-Enzym korrelierten.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Targetproteins mit einem carboxy-terminalen Thioester, der zur Peptidligierung geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren umfasst: a) Exprimieren, in einer Wirtszelle, eines rekombinanten Vorläuferproteins, umfassend das Targetprotein, das an seinem Carboxyterminus an ein Intein fusioniert ist, wobei das Intein einen Aminoterminus und einen Carboxyterminus besitzt, wobei der Aminoterminus des Inteins an das Targetprotein fusioniert ist, und das Intein aus einem nativen Intein, einem Inteinderivat oder einer Inteinmutante ausgewählt wird; und b) In Kontakt bringen des exprimierten Vorläuferproteins mit 2-Mercaptoethansulfonsäure und Induzieren der Abspaltung des Inteins vom Vorläuferprotein, um das Targetprotein mit dem carboxy-terminalen Thioester zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Intein aus Saccharomyces cerevisiae Vma-Intein und Mycobacterium xenopi Gyr A-Intein ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Carboxyterminus des Inteins an eine Protein-bindende Domäne fusioniert wird, die eine Chitin-bindende Domäne ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Targetprotein ausgewählt wird aus Bacillus stearothermophilus DNA Polymerase I großes Fragment, Thioredoxin oder einem cytotoxischen Protein.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Targetprotein ausgewählt wird aus einem Maltose-bindenden Protein und Paramyosin.
Verfahren zum Exprimieren eines rekombinanten Proteinvorläufers, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren umfasst: a) Insertieren einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Targetprotein kodiert, in ein Plasmid an einer multiplen Klonierungsstelle, die stromaufwärts von und im Leseraster mit einem Fusionsgen, welches für ein Intein und eine Chitin-bindende Domäne kodiert, lokalisiert ist, so dass i) das Intein ausgewählt wird aus einem natürlich vorkommenden Intein, einem Inteinderivat oder einer Inteinmutante; und ii) die multiple Klonierungsstelle durch einen Linker der SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:4 gebildet wird; und b) Einführen des Plasmids in eine Wirtszelle und Bereitstellen von Bedingungen, die zur Expression des rekombinanten Vorläuferproteins durch die Wirtszelle geeignet sind.
Verfahren zum Modifizieren eines Targetproteins durch Ligieren eines chemisch synthetisierten Peptids oder Proteins in vitro an das Targetprotein, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren umfasst: a) Exprimieren, in einer Wirtszelle, das an seinem Carboxyterminus an ein Intein fusionierte Targetprotein, wobei das Intein ausgewählt wird aus einem Intein, einem Inteinderivat oder einer Mutante des Inteins, wobei das Intein zu einer Thiol-induzierten Spaltung befähigt ist; b) Induzieren der Abspaltung des Inteins aus dem Targetprotein durch Zugabe von 2-Mercaptoethansulfonsäure, um einen carboxy-terminalen Thioester am Targetprotein zu bilden; c) Erhalten des chemisch synthetisierten Peptids oder Proteins mit einem Amino-terminalen Cystein; und d) Ligieren des Targetproteins aus b) an das chemisch synthetisierte Peptid oder Protein aus c), um ein modifiziertes Targetprotein zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Intein an seinem Carboxyterminus an eine Chitin-bindende Domäne fusioniert wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Protein, vor seiner Modifikation, ein cytotoxisches Protein ist.
Verfahren zum Markieren eines Targetproteins, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren umfasst: a) Exprimieren, in einer Wirtszelle, eines rekombinanten Vorläuferproteins, umfassend das Targetprotein, das an seinem Carboxyterminus an ein Intein fusioniert ist, wobei das Intein einen Amino- und einen Carboxyterminus aufweist, so dass das Intein an den Aminoterminus des Targetproteins fusioniert ist, wobei das Intein ausgewählt wird aus einem natürlich vorkommenden Intein, einem Inteinderivat oder einer Inteinmutante, und das Intein zu einer Thiol-induzierten Spaltung befähigt ist; b) Spalten des Vorläuferproteins durch Zugabe von 2-Mercaptoethansulfonsäure, um das Targetprotein mit einem carboxy-terminalen Thioester zu bilden; c) Erhalten des chemisch synthetisierten Peptids oder Proteins mit einem Marker und einem Amino-terminalen Cystein; und d) Ligieren des Targetproteins aus b) mit dem chemisch synthetisierten Peptid oder Protein aus c), um das Targetprotein zu markieren.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Intein an seinem Carboxyterminus an eine Chitin-bindende Domäne fusioniert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Marker ausgewählt wird aus einem fluoreszierenden Marker, einem Spin-Label, einem Affinitäts-Tag oder einer Radiomarkierung.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das chemisch synthetisierte Peptid oder Protein eine antigene Determinante ist.
Verfahren zum Ligieren eines chemisch synthetisierten Proteins oder Peptids an eine inaktive Form eines Proteins, um die Proteinaktivität wieder herzustellen, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren umfasst: a) Exprimieren, in einer Wirtszelle, eines Fusionsproteins, welches die inaktive Form des Proteins, fusioniert an seinem Carboxyterminus an ein Intein, ein Inteinderivat oder eine Inteinmutante, umfasst, wobei das Fusionsprotein von einem Plasmid exprimiert wird; b) Induzieren der durch das Intein vermittelten Spaltung des Proteins aus a) durch Zugabe von 2-Mercaptoethansulfonsäure, um einen carboxy-terminalen Thioester an dem inaktiven Protein zu bilden; c) Erhalten eines chemisch synthetisierten Proteins oder Peptids mit einem Amino-terminalen Cystein; und d) Ligieren des inaktiven Proteins von b) an das chemisch synthetisierte Peptid oder Protein von c), um die Proteinaktivität wieder herzustellen.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Protein ein cytotoxisches Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das cytotoxische Protein eine Restriktionsendonuklease ist.