KR20040019361A - 아실화된 폴리펩티드의 제조 방법 - Google Patents
아실화된 폴리펩티드의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 실험실 단계에서 후속하여 아실화되는 원하는 폴리펩티드의 전구체 물질을 발현시켜 형질전환된 숙주 세포에서 폴리펩티드를 생산하는 방법과 관련되어 있다. 본 발명은 또한 청구된 방법에서 사용하기 위한 DNA-서열, 벡터, 형질전환된 숙주 세포와 관련되어 있다. 본 발명은 특정 라이신 ε-아미노기에서 우선적으로 아실화되는 폴리펩티드를 만드는 방법을 제공한다.
Description
재조합 DNA 기술로 미생물과 다른 숙주 세포에서 외부(이종) 폴리펩티드의 발현이 가능하다. 상기 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 적절한 발현 벡터가 있는 효모 세포를 형질전환한 후에 이종 폴리펩티드의 효모 발현에서 인슐린과 인슐린 전구체, 글루카곤, 글루카곤 유사 펩티드와 유사물과 같은 폴리펩티드의 많은 종에서 성공해왔다.
재조합 숙주에서 제한된 크기의 단백질 또는 폴리펩티드의 발현에서 문제점은 숙주 유기체가 생산한 단백질 분해 효소에 의해 발현된 생성물의 단백질 분해이다.
따라서, 분리된 생성물은 아미노산 체인 길이가 다른 원하는 폴리펩티드 종의 이종 혼합물이다. 효모에서 이종 폴리펩티드를 생산하는데 있어서 다른 문제는 세포내 구획과 폴리펩티드의 내부 부위에서 기이한 방법에 의해 야기되는 원형질막에서 단백질 분해 방법 때문에 수익이 낮은 것이다. 효모는 두개의 염기 아미노산 서열의 C-말단 쪽에서 절단하는 Kex2p, Yps1p 와 같은 효모 단백질을 공정하는데 사용하기 위한 많은 프로테아제, X-Ala 또는 X-Pro에서 절단하는 Kex2p와 Ste13p 또는 Dap2p에 의한 내부단백질 분해후에 남아있는 염기 아미노산을 분해하는 카르복시펩티다아제 Kex1p을 함유한다.
약 10 내지 100 의 아미노산 체인을 가진 폴리펩티드와, 이황 결합이 없거나 소수인 또는 β-인트라핀, 글루카곤과 글루카곤 유사 펩티드와 같은 염기성 아미노산이 많은 어떤 폴리펩티드는 내부단백질적으로 분해되고 N-과 C-말단에서 단백질적으로 분해되는 비동질적 생성물을 생성하는 짧은-체인 개방 그리고 비이황 안정된 구조 때문에 형질전환된 숙주 세포에서 발현될 때, 세포내와 세포외 단백질 분해에 민감하다.
게다가, 발현된 생성물의 N-말단이 내부 효소에 대한 절단 부위를 구성하면 숙주 세포가 생산한 효소에 의한 발현된 폴리펩티드의 N-말단 절단으로 정확한 N-말단이 있는 원하는 생성물의 수준이 낮다. 예를 들어, 효모에서 효소 Ste13p가 X-Ala 또는 X-Pro에서 절단하고 여기서 X는 어떤 아미노산 잔기가 될 수 있다. 따라서, N-말단으로부터 두번째 잔기로 Ala 또는 Pro 잔기를 가진 폴리펩티드는 N-말단에서 절단되고 복구된 폴리펩티드는 복구 과정을 복잡하게 하고 전체 수익을 감소시키는 다른 분해산물의 혼합물이다.
게다가, 삼차구조가 없거나 적은 작은 폴리펩티드와 α-나선의 적은 양은 β-시트를 형성하고 대규모 생산에서 발효와 하류 분리와 정제 단계동안에 각각 위에 쌓이고 발효동안에 피브릴을 형성하는 경향이 높다. 피브릴이 형성되면 원하는 생성물이 손실되면서 원하지 않는 침천이 생긴다. 높은 pH에서 처리하여 피브릴화를 방지한다. 하지만, 그러한 염기성 처리는 생성물에 매우 가혹하고 원하지 않는 D-아미노산 잔기가 형성될 수 있다.
인간 GLP-1는 말단 회장, 이자, 뇌에서 L-세포에서 생산되는 프리 프로 글루카곤에서 유래하는 37 아미노산 잔기 펩티드이다. GLP-1(7-46)아미드, GLP-1(7-37), GLP-2을 생성하는 프리 프로 글루카곤의 공정은 L 세포에서 주로 발생한다. GLP-1와 GLP-2는 N-말단 으로부터 두번째 아미노산 잔기로서 Ala를 가지고 효모와 같은 숙주 유기체에서 발현되었을 때 N-말단 절단되기 쉽다.
제시된 바와 같이 자연적으로 발생하는 펩티드 또는 유사물에서 친유성 아실기를 도입하면 아실화된 펩티드 본래 펩티드 또는 변경되지 않은 유사물에 상대적으로 연장된 프로필이 있는 아실화된 펩티드를 형성한다. 이 현상은 GLP-1와 유사물의 아실화를 개시한 WO 98/08871와 GLP-2와 유사물의 아실화를 개시한 WO 98/08872에 개시되어 있고 증명되었다.
Lys 절단 부위의 아실화를 포함하는 아실화 전구체 분자는 아실화 후의 절단을 방지하도록 Lys 절단 부위는 회피되어야 한다. 본 발명에 따른 방법은 다음에서 명백한 것처럼 이 문제에 대한 해결책이다.
발명의 개요
더 넓은 양태에서, 본 발명은 원하는 폴리펩티드의 전구체 분자, 즉 발현된 전구체 분자가 우선적으로 아실화되는 것을 허용하고 숙주 세포 내 또는 배양 매체에서 단백질 분해에 대해 발현된 전구체 분자를 보호하는 N-말단 확장부를 포함하는 상기 전구체 분자를 발현하여 형질전환된 숙주에서 폴리펩티드를 생산하는 방법과 관련되어 있다. 추가적으로, 전구체 분자는 정제하기 쉽고 피브릴을 형성하는 경향이 적기 때문에 대규모 공정에서 하류 분리와 정제 단계를 선택할 때 틴력성이 강하다.
한 양태에서 본 발명은 ε-아미노기에서 아실화된 적어도 하나의 라이신 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법과 관련되어 있고, 상기 방법은 :
(ｉ)원하는 폴리펩티드와, 원하는 폴리펩티드에서 라이신 절단 부위에서 절단가능한 N-말단 확장부를 포함하는 전구체 분자를 발현하기에 적절한 조건에서, 상기 폴리펩티드의 전구체 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계;
(ⅱ) 발현된 전구체 분자를 배양액으로부터 분리하는 단계;
(ⅲ) N-말단 확장부에서 라이신 절단 부위의 ε-아미노기를 아실화하지 않고
원하는 폴리펩티드에서 적어도 하나의 라이신 잔기의 ε-아미노기를 우선적으로 아실화하는 단계;
(ⅳ)효소 절단에 의해 아실화된 전구체 분자로부터 N-말단 확장부를 제거하는 단계;
(v) 아실화된 폴리펩티드를 적절한 수단에 의해 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조 방법이다.
본 발명은 아실화되고 후속하여 시험관 내 단계에서 Lys 절단 부위에서 절단되고, 원하는 폴리펩티드의 전구체 분자를 발현하여 형질전환된 숙주 세포에서 폴리펩티드를 생산하는 방법과 관련된다. 본 발명은 또한 청구된 방법에서 DNA-서열, 벡터 그리고 형질전환된 숙주세포와 관련된다. 게다가, 본 발명은 원하는 폴리펩티드 그리고 특정 아실화 방법의 특정 전구체와 관련된다.
도 1은 TPI 프로모터 및 터미네이터 및 MF 알파 프레프로 서열의 조절성 제어하에서 Arg34GLP-1(7-37)을 암호화하는 DNA를 함유하는 플라스미드 pKV304를 나타낸다. 이 플라스미드는 본 발명에 따르는 전구체 분자용 발현 플라스미드를 제조하기 위한 출발 플라스미드이다.
N-말단 확장부는 전형적으로 길이가 15 아미노산까지이고 3-15; 3-12; 3-10; 3-9; 3-8; 3-7; 3-6; 3-5 아미노산이다. N-말단 확장부에서 아미노산은 : 1) N-말단 확장부의 C-말단에서 Lys 절단 부위의 아실화를 방지 또는 최소화; 2) 내부단백질 분해에 대해 발현된 전구체 분자를 보호; 3) 발효와 대규모 생산에서 분리와 정제와 같은 하류 공정단계 동안에 피브릴화에 의해 야기된 침전의 방지와 같은 다양한 목적중에서 선택한다. N-말단 확장부에서 양 말단에서 아미노산 잔기는 C-말단(절단 부위에서) 그리고 숙주 세포의 밖으로 그리고 배양 매체의 안으로 발현된 폴리펩티드의 수송을 보장하는 목적이 있는 프리-또는 프리-프로 펩티드와 같은 가능한 상류 서열로부터 N-말단의 효모 세포에서 원하는 폴리펩티드로부터 N-말단 확장부가 효과적으로 절단되는 것을 보장하도록 선택되어야 한다. 마지막으로, N-말단 확장부는 정제 목적용 태그로서 기능한다.
한 실시예에서 본 발명은 N-말단 확장부에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 폴리펩티드의 N-말단에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기와 함께 금속 이온 복합체 결합 부위를 설정할 수 있다.
금속 이온 결합 부위를 포함하는 N-말단 확장부는 알부민의 N-말단에서 유래한다. Cu+2결합 부위의 실시예는 배양 매체와 아실화 단계(iii)에 존재하는 Cu++와같은 중금속 이온과 함께 N-말단 확장부로 사용될 수 있는 소(Asp-Thr-His-Lys, SEQ ID NO : 34) 그리고 인간(Asp-Ala-His-Lys, SEQ ID NO : 35) 혈청 알부민 (Peters, T.; All about albumin academic Press, USA (1996) p 121-123)의 N-말단이다.
금속 이온 결합 부위를 포함하는 N-말단 확장부는 메탈로 엔도펩티다아제
EC 3.4. 24-의 일부에서 Zn-결합 부위에서 유래한다. 한 실시예에서, N-말단 확장부는 적어도 하나의 히스티딘 잔기를 포함한다. N-말단 확장부에서 히스티딘 잔기는 전형적으로 라이신 절단 부위로부터 1-4 잔기에 위치한다.
적어도 하나의 히스티딘잔기를 포함하는 N-말단 확장부의 실시예는 Glu-Glu-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 1); Glu-(Glu-Ala)2-His-Lys(SEQ ID NO : 2); Glu-(Glu-Ala)3-His-Lys(SEQ ID NO : 3); Glu-Glu-Gly-His-Lys (SEQ ID NO : 4); Glu-His-Pro-Lys (SEQ ID NO : 5); Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO : 6); Glu-Glu-His-Cys-Lys (SEQ ID NO : 7); Glu-Glu-His-His-Lys (SEQ ID NO : 8); Glu-His-His-His-Lys (SEQ ID NO : 9); Glu-His-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 10); Glu-Gly-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 11); Glu-His-Gly-His-Gly-Lys (SEQ ID NO : 12); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Leu-Lys (SEQ ID NO : 13); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Ile-Lys(SEQ ID NO : 14); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Val-Lys (SEQ ID NO : 15); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Met-Lys (SEQ ID NO : 16); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Phe-Lys (SEQ ID NO : 17); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Tyr-Lys (SEQ ID NO : 18) ; Glu-Glu-Ala-His-Glu-Trp-Lys (SEQID NO : 19); Gln-Asp-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 24); Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 30); Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO : 34); Glu-His-His-Gly-His-Gly-Lys (SEQ ID NO : 36); Asp-Ser-His-Lys (SEQ ID NO : 37); Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO : 38) ; Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO : 39); Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO : 40); Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO : 41); Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 42); Glu-Glu-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 43); Glu-Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 44); Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys(SEQ ID NO : 47); Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 48); Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 49)이다.
다른 실시예에서 본 발명은 전구체 분자의 N-말단 확장부가 라이신 절단 부위 N-말단과 폴리펩티드의 염 다리(이온 결합)를 설정할 수 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함하는 방법과 관련된다.
이 실시예에서, N-말단 확장부는 전형적으로 라이신 절단 부위로부터 1 내지 5 의 잔기에 위치한 적어도 하나의 Glu 또는 Asp를 포함한다.
그러한 실시예에서, N-말단 확장부는 Glu-Glu-서열을 포함한다. Glu 잔기를 포함하는 N말단 확장부의 실시예는 Glu-Glu-Ala-Glu-Lys (SEQ ID NO : 45); Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO : 46), Glu-Glu-Lys이다. 이 실시예에서, N-말단 확장부는 α-helix를 형성할 수 있다.
태그로서 기능하고 염다리를 형성할 수 있는 N-말단 확장부는 Ca+2에 결합하는 것으로 알려진 소 트립시노겐에서 엔터로키나아제 부위에서 유래하는 서열이다. 따라서 본 방법에서 사용하기에 적절한 N-말단 확장부는 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO : 26)이다.
α-helix을 형성할 수 있는 N-말단 확장부는 전형적으로 Zhu et al, Protein Science 2,384-394 (1993)에 기술된 바와 같은 교차하는 극성과 비극성 아미노산을 포함한다. 그러한 서열의 실시예는 Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 29), Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 30); Leu-Asp-Gly-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys (SEQ ID NO : 31); Glu-Glu-Leu-Asp-Gly-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys (SEQ ID NO : 32); Glu-Glu-Leu-Asp-Ala-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys (SEQ ID NO : 33); Glu-Glu-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 43); Glu-Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 44)이다.
이 실시예에서, N-말단 확장부는 진핵 N-글리코실레이션 부위 N-X-S 또는 N-X-T을 포함하고 X는 Pro을 제외한 아미노산 잔기가 될 수 있다. 글리코실레이션 부위를 포함하는 N-말단 확장부의 실시예는 Glu-Glu-Gly-Asn-Thr-Thr-Pro-Lys (SEQ ID NO : 20), Glu-Glu-Gly-Asn-Glu-Thr-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO : 21), Glu-Glu-Gly-Asn-Asp-Thr-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO : 22), Glu-Glu-Gly-Asn-Thr-Thr-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO: 23)이다.
다른 실시예에서 본 발명은 원하는 폴리펩티드는 N-말단에서 단백질 분해에민감하고 N-말단 확장부는 그러한 단백질 분해를 방지 또는 최소화하는 방법과 관련된다. 그러한 폴리펩티드는 N-말단으로부터 두번째 아미노산 잔기로서 Ala, Ser, Pro 또는 Gly 잔기를 가지는 특징이 있다.
다른 실시예에서 폴리펩티드는 N-말단 아미노산 잔기로서 His 또는 Tyr를 가진다.
더 구체적인 실시예에서, N-말단 확장부는 공식 Xn----X1-Lys을 가지고 여기서 Lys은 절단 부위이고 Xn--X1는 Lys 절단 부위에서 유리 ε-아미노기는 상기 기술된 단계 (iii)에서 아실화를 방지 또는 최소화하는 기능을 가진 길이가 2-14 아미노산 잔기인 펩티드 서열이다. Xn----X1는 내부단백질 분해 절단으로부터 발현된 원하는 폴리펩티드를 더 보호하고 발효와 하류 분리와 정제 단계 동안에 N-말단 확장된 분자의 피브릴화에 의해 야기된 침전을 방지할 것이다. Xn----X1에서 아미노산 잔기는 C-말단 (LysD)에서 N-말단 확장부가 최적 절단 되도록 선택한다. 게다가 확장부의 N말단에서 아미노산 잔기는 KEX 절단 부위에서 상부 신호-리더 서열 (Lys, Arg)으로부터 효모 세포에서 절단이 최적화되도록 선택한다.
적어도 하나의 X는 His 또는 Glu 또는 Asp 이고 확장부의 N-말단에서 유래한 두개의 아미노산 잔기는 바람직하게 Ala 또는 Pro가 아니라는 조건으로 펩티드 서열이 적어도 하나의 요구된 목적을 수행하는 한 Xn-----X1의 아미노산 잔기는 Lys을 제외한 아미노산 잔기가 될 수 있다.
한 실시예에서 Xn-----X1는 길이가 2-12 아미노산 잔기이다. 다른실시예에서 Xn-----X1는 길이가 2-10; 2-9; 2-8; 2-7; 2-6; 또는 2-5 아미노산 잔기이다.
다른실시예에서 Xn-----X1는 His; Glu ; Ala ; Asp; Gly ; Pro으로 구성된 군에서 선택된 2-8 아미노산 잔기를 포함한다.
다른실시예에서 Xn-----X1는 Glu ; Asp; Ala ; His; Trp; Tyr ; Ile ; Val ; Met; Phe로 구성된 군에서 선택된 4-10 아미노산 잔기를 포함한다.
다른 실시예에서 Xn-----X1는 Glu ; Asp; Gly ; Asn; Thr; Ser; Pro에서 선택된 5-8 아미노산 잔기를 포함한다.
모든 실시예에서 Glu 및/또는 Asp는 Kex2p 절단 부위를 수단으로 상부 프리-또는 프리-프로-서열로부터 이 말단에서 적절하게 절단되도록 보장하기 위해서 바람직하게 확장부의 N-말단에서 유래한 첫번째 그리고 두번째 아미노산 잔기로 선택한다. 게다가 N-말단 확장부의 N-말단에 있는 하나 또는 그 이상의 Glu 와 Asp 잔기는 발효동안에 생체 분해로부터 궁극적으로 원하는 폴리펩티드의 N-말단을 보호한다.
Xn----X1--Lys 서열의 실시예는 Glu-Glu-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 1) ; Glu (Glu-Ala)2-His-Lys (SEQ ID NO : 2); Glu-(Glu-Ala)3His-Lys (SEQ ID NO : 3); Glu-Glu-Gly-His-Lys (SEQ ID NO : 4); Glu-His-Pro-Lys (SEQ ID NO : 5); Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO : 6); Glu-Glu-His-Cys-Lys (SEQ ID NO : 7);Glu-Glu-His-His-Lys (SEQ ID NO : 8); Glu-His-His-His-Lys (SEQ ID NO : 9); Glu-His-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 10); Glu-Gly-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 11); Glu-His-Gly-His-Gly-Lys (SEQ ID NO : 12); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Leu-Lys (SEQ ID
NO : 13); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Ile-Lys (SEQ ID NO : 14); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Val-Lys (SEQ ID NO : 15); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Met-Lys (SEQ ID NO : 16); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Phe-Lys (SEQ ID NO : 17); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Tyr-Lys (SEQ ID NO : 18); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Trp-Lys (SEQ ID NO : 19); Glu-Glu-Gly-Asn-Thr-Thr-Pro-Lys (SEQ ID NO : 20); Glu-Glu-Gly-Asn-Glu-Thr-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO : 21), Glu-Glu-Gly-Asn-Asp-Thr-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO : 22); Glu-Glu-Gly-Asn-Thr-Thr-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO: 23); Gln-Asp-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 24); Glu-Glu-Lys ; Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO : 26); Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 29); Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 30); Leu-Asp-Gly-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys(SEQ ID NO : 31); Glu-Glu-Leu-Asp-Gly-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys(SEQ ID NO : 32); Glu-Glu-Leu-Asp-Ala-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys (SEQ ID NO : 33); Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO : 34); Asp-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 35); Glu-His-His-Gly-His-Gly-Lys (SEQ ID NO : 36); Asp-Ser-His-Lys (SEQ ID NO : 37); Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO : 38); Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys(SEQ ID NO : 39); Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO : 40); Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO : 41); Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 42); Glu-Glu-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO: 43); Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 44); Glu-Glu-Ala-Glu-Lys (SEQ ID NO : 45); Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO : 46); Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 47); Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 48); Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 49)이다.
다른 실시예에서, N-말단 확장부는 서열 Asp-X-His-Lys (SEQ ID NO : 50)을 가지고 X는 Ala, Thr 또는 Ser이다. 서열 Asp-X-His-Lys은 중금속 이온 알부민 결합 부위를 구성한다.
또 다른 실시예에서, N-말단 확장부는 서열 His-Z1-Z2-Lys (SEQ ID NO : 51)을 가지고 여기서 Z1은 Glu ; Asp; Asn; Gin ; Ser; Thr; Gly ; Leu; tie ; Val ; Met; Phe 또는 Tyr 그리고 Z2은 Leu; Ile ; Val ; Met; Phe; Tyr; Trp 또는 Cys이다. 한 실시예에서 Z1은 Glu 또는 Asp이다. 원하는 폴리펩티드에서 서열 His-Z1-Z2-Lys은 N-말단 His 잔기와 함께 Glu-Glu-Ala-His-Glu-Leu-Lys (SEQ ID NO : 13); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Ile-Lys(SEQ ID NO:14); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Val-Lys (SEQ ID NO : 15); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Met-Lys (SEQ ID NO : 16); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Phe-Lys (SEQ ID NO : 17); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Tyr-Lys (SEQ ID NO : 18); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Trp-Lys(SEQ ID NO : 19)와 같은 특정 메탈로 엔도펩티다아제에서 Zn-결합 부위에 동질적인 금속 결합 부위를 구성한다.
N-말단 확장부는 Ste13p 또는 Dap2p와 같은 효모 프로테아제의 단백질 분해활성에 대해서 전구체 분자의 N-말단을 보호하면서 발효동안에 발명의 전구체 분자에 안정적으로 부착되어 있음이 발견되었다.
N-말단 확장부는 단백질 분해효소를 수단으로 Lys에 특이적인 아실화된 복구된 전구체 분자로부터 제거한다. 그러한 단백질 분해 효소의 실시예는 트립신 또는Achromobacter lyticus프로테아제 1이다.
진보된 양태에 따르면 본 발명은 원하는 폴리펩티드에 대한 폴리펩티드 전구체, N-말단-확장부-Lys-Z3-Z4-*폴리펩티드* 공식을 가진 상기 폴리펩티드 전구체와 관련있고 여기서 Lys은 절단 부위, N-말단 확장부는 상기 기술된 바와 같이 2-14 아미노산 잔기를 가지고, Z3은 원하는 폴리펩티드에서 N-말단 아미노산 잔기이며 His 또는 Tyr이고 Z4는 원하는 폴리펩티드에서 N-말단으로부터 다음 아미노산 잔기이며 Ala, Ser 또는 Gly 그리고 *폴리펩티드* 는 원하는 폴리펩티드의 남아있는서열이다.
본 발명의 한 실시예에서 *폴리펩티드 * 는 GLP-1 또는 GLP-2의 적절한 일부이다.
자연적으로 발생하는 펩티드 또는 유사물에서 친유성 아실기를 도입하면 본래펩티드 또는 변경되지 않은 유사물에 상대적으로 연장된 프로필을 가진 아실화된 펩티드를 형성하게 된다. 이 현상은 GLP-1와 유사물의 아실화를 개시한 WO 98/08871 그리고 GLP-2 와 유사물의 아실화를 개시한 WO 98/08872에 개시되고 증명되었다.
친유성기는 WO 98/08871에 개시된 바와 같이 단일 또는 두개의 펩티드 스페이서를 수단으로 도입된다. 대안적으로, 친유성군은 WO 00/55119 에 개시된 바와 같이 α-아미노-α,ω-디카르복시산기를 수단으로 도입된다. 본 폴리펩티드 전구체 분자는 유리 ε-아미노기가 있는 적어도 2개의 라이신 군을 포함한다. 즉 라이신은 원하는 폴리펩티드에서 잔기와 적어도 하나의 라이신 잔기를 절단한다. 라이신 절단 잔기를 포함한 모든 라이신 군이 아실화된다면, 원하는 폴리펩티드 서열 로부터 N-말단 확장부의 후속 절단은 가능하지 않다. 따라서 N-말단 확장부를 가진 원하는 폴리펩티드를 발현하는 목적 중의 하나는 라이신 절단 부위에서 유리 ε-아미노기의 아실화를 방지 또는 최소화하는 것이다. GLP-1가 부위 26에서 라이신인 경우에 전구체 분자는 원하는 라이신 잔기에서 우선적으로 아실화될 수 있다. 아실화후에 아실화된 전구체 분자는 상기 기술된 적절한 효소 수단으로 절단될 수 있고 원하는 아실화된 폴리펩티드는 분리될 수 있다.
아실화 단계 (iii)는 pH 7 내지 12 에서 수행될 수 있다. 특정 실시예에서, pH는 8 내지 11.5 또는 9.0 내지 10.5 그리고 pH 값 9.5 내지 10.5 가 효과적인 것으로 증명되었다. 온도는 - 5 내지 35 ℃ 이고 전형적으로 0 내지 20℃ 또는 15 내지 30 ℃ 사이이다.
본 발명의 한 실시예에서 아실화는 Cu2+, Fe2+, Ni2+, Co2+, Zn2+, Mg2+, Mn2+, Ca2+와 같은 2가 금속이온이 존재할 때 수행한다. 하지만, Co3+와 같은 삼가 금속 이온도 또한 본 발명의 목적에 효과적이다.
진보된 양태에 따르면 본 발명은 청구된 폴리펩티드 전구체, 벡터, 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환된 숙주 세포를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 관련된다.
정의
용어 "우선적 아실화"는 분자의 하나 또는 그 이상의 원하는 부위에서 같은 분자에서 다른 부위보다 상당히 높은 정도로 아실화가 일어나는 아실화 방법을 포함한다. 따라서, 원하는 부위에서 아실화는 전체 아실화의 적어도 50%, 바람직하게 적어도 80%, 가장 바람직하게 90-100% 이다. 이 부위에서 아실화는 원하는 최종생성물로부터 N-말단 확장부의 후속하는 절단을 방해하여 수익이 손실되기 때문에 본 방법에서 N-말단 확장부에서 라이신 절단 부위의 ε-아미노기의 아실화는 가능하면 회피 또는 최소화되어야 한다.
"N-말단 확장부"는 원하는 폴리펩티드에서 N-말단 아미노산 잔기에 제거 가능하게 부착된 폴리펩티드 서열을 의미한다. N-말단 확장부는 길이가 2-15 아미노산 잔기이고 원하는 폴리펩티드로부터 절단을 위한 C-말단 아미노산 잔기에서 Lys 잔기를 포함한다. N-말단 확장부는 상기 기술된 바와 같이 숙주 세포내에서 단백질 분해에 대해 발현된 융합 폴리펩티드를 보호한다. 추가로, 아실화 공정동안 상기 Lys 잔기를 마스크하여 N-말단 확장부에서 라이신 절단 부위의 ε-아미노기의 아실화를 방지 또는 최소화하는 것으로 믿어진다.
"원하는 폴리펩티드"는 전구체 분자로부터 N-말단 확장부를 절단한 후 획득한 궁극적 폴리펩티드를 말한다. 이 발현은 상기 폴리펩티드의 아실화된 그리고아실화되지 않은 버전에 해당한다. "N-말단 확장부"는 원하는 폴리펩티드의 N-말단에서 유래한 N-말단 확장부의 절단에 대해 절단 부위를 구성하는 라이신 잔기를 포함한다. Lys기가 N-말단 확장부의 C-말단 아미노산 또는 N-말단 확장부에 포함된 서열로서 제시되면, 상기 Lys-잔기는 원하는 폴리펩티드의 N말단 아미노산 잔기에 직접적으로 결합되어 있고 절단 부위를 구성한다. Lys-잔기에서 절단 (단계 iv)은 바람직하게 Lys에 특이적인 단백질 분해효소를 수단으로 수행한다. 그러한 단백질 분해 효소의 실시예는 트립신 또는 Achromobacter lyticus protease (ALP)이다.
원하는 폴리펩티드의 실시예는 GLP-1이다. GLP-1의 아미노산 서열은 즉 Schmidt et al. (Diabetologia 28704-707 (1985)에 제시된다. GLP-1 (7-37)와 유사물의 흥미로운 약제적 성질은 최근에 많은 관심을 끌었지만 이러한 분자의 구조에 대해서는 매우 조금만 알려져 있다. 미셀에서 GLP-1의 두번째 구조는 Thortonet al. (Biochemlstry3335323539 (1994))에 기술되었지만 정상적 용액에서 GLP-1은 매우 유동적인 분자로 간주된다.
단편과 이 펩티드의 유사물을 묘사하기 위해서 단순한 체계가 사용된다. 따라서, 예를 들어, Nos. 1 내지 6 아미노산 잔기를 삭제하고 부위8에서 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기를 Gly로 치환하여 Gly8GLP-1(7-37)은 GLP-1(1-37)에서 유래한 GLP-1의 단편을 지정한다. 유사하게, Lys26(N8-tetradecanoyl)-GLP-1(1-37)은GLP-1(1-37)을 지정하고 부위26에서 Lys 잔기의 ε-아미노기는 테트라데카노일화된다.
원하는 폴리펩티드의 다른 실시예는 N-말단 부위에 His 또는 Tyr를 가지고 인접한 부위에 Ser, Ala 또는 Gly을 가지는 펩티드의 GRF (성장 호르몬 방출 요소) 집단에 속하는 GLP-2와 글루카곤이다, vide Adelhorst K. et al., The Journal of Biological Chemlstry (1994) p 6275-6278).
"POT'는Schizosaccharomyces pombe트리오스 포스페이트 이소머라아제 유전자이고 "TPI1"는 S. cerevisiae는 트리오스 포스페이트 이소머라아제 유전자이다.
"피브릴화"는 "피브릴"이 형성되는 방법을 의미한다. "피브릴"은 잘 인식되고 기술된 현상이며 비평행적 β-시트로 구성되어 있다. pH 12에서 염기성 처리와 같은 조잡한 화학 조건에서 수행하지 않으면 구조가 거의 없는 GLP와 같은 분자와 매우 유동적이고 삼차구조가 거의 없는 것은 침전을 생성하고 수율이 손실되는 응고되기 쉽다.
"리더"는 프리-펩티드 (신호 펩티드)와 프로-펩티드로 구성된 아미노산 서열을 의미한다.
용어"신호 펩티드"는 단백질의 전구체 형태에 N-말단 서열으로 존재하는 프리-펩티드을 의미하는 것으로 이해된다. 신호 펩티드의 기능은 이종 단백질을 내부형질 세망으로 수송을 촉진하는 것이다. 신호 펩티드는 이 과정에서 보통 절단된다. 신호 펩티드는 단백질을 생산하는 효모유기체에 이종 또는 동종이다. 많은신호 펩티드는 YPS1신호 펩티드 (공식적으로 YAP3 신호 펩티드로 불리는) 또는 기능적 유사물을 포함한 발명의 DNA 구조물과 함께 사용된다. (Egel-Mitani et al. (1990) YEAST 6: 127-137 and US 5,726,038) and the α-factor signal of theMFOR 1gene (Thorner (1981) inThe Molecular Biology of the yest Saccharomvces cerevisiae,Strathern et al., eds., pp 143-180, Cold Spring Harbor Laboratory, NY and US 4,870, 00.)
용어"프로-펩티드"는 기능이 발현된 폴리펩티드가 내부 형질 세망에서 골지체로 그리고 더 배양 매체로 분비하기 위한 분비소낭으로 이동하도록 하는 폴리펩티드 서열을 의미한다.(즉 폴리펩티드를 세포벽을 가로질러 적어도 세포막을 통과하여 효모 세포의 주변세포질 공간으로 수송). 프로-펩티드는 효모 α-factor 프로-펩티드, vide US 4,546,082 와 4,870,008이다. 대안적으로, 프로-펩티드는 자연에서 발견되지 않는 프로-펩티드인 합성된 프로-펩티드이다. 적절한 합성 프로-펩티드는 US 5,395,922; 5,795,746; 5,162,498 와 WO 98/32867에 기술되어 있다. 프로-펩티드는 바람직하게 C-말단에서 Lys-Arg 서열 또는 기능적 유사물과 같은 엔도펩티다아제 공정 부위를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 Beaucage et al.(1981) Tetrahedron Letters 22: 1859-1869, 또는 the method described by Matthes et al. (1984) EMBO Journal 3: 801-805과 같은 설정된 방법으로 제제한다. 포스포아미다이트 방법에 따라서, 예를 들어,자동화 DNA 합성기에서 올리고뉴클레오티드가 합성되고 정제, 연결되어 합성된 DNA 구조물을 형성한다. DNA 구조물을 제제하는 현재 원하는방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR)이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 혼합된 게놈, cDNA, 합성 출처가 될 수 있다. 예를 들어, 리더 펩티드를 암호화하는 게놈 또는 cDNA 서열은 본 발명의 전구체 분자를 암호화하는 게놈 또는 cDNA 서열에 연결되고 그 후 잘 알려진 방법에 따라 동종 재조합체에 대한 원하는 아미노산 서열을 암호화하는 합성 올리고뉴클레오티드를 삽입하여 또는 바람직하게 적절한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR로 원하는 서열을 생성하여 DNA 서열을 부위에서 변경한다.
본 발명은 선택된 미생물 또는 숙주 세포에서 복제할 수 있고 본 발명의 전구체 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 이동시키는 벡터를 포함한다. 재조합 벡터는 자발적으로 복제하는 벡터, 즉 외부 염색체로 존재하는 벡터, 복제는 염색체 복제와 독립적이고 즉 , 플라스미드, 잉여 염색체 요소 , 최소 염색체, 또는 인공 염색체이다. 벡터는 자가 복제를 보장하는 수단을 포함한다. 대안적으로, 숙주 세포에 도입되었을 때 벡터는 게놈으로 통합되고 통합된 염색체와 함께 복제되는 것이다. 게다가 단일 벡터 또는 플라스미드 또는 두 개 또는 그 이상의 벡터 또는 함께, 숙주 cell의 게놈으로 도입되는 전체 DNA를 포함하는 플라스미드 또는 트랜스포존이 사용된다. 벡터는 선형 또는 원형 플라스미드이고 바람직하게 게놈에 독립적인 세포에서 숙주 세포의 게놈으로 벡터의 통합 또는 벡터의 자기복제를 허용하는 요소를 포함한다.
원하는구체예에서, 재조합 발현 벡터는 효모에서 복제할 수 있다. 벡터가 효모에서 복제할 수 있도록 하는 서열의 예들은 효모 플라스미드 2㎛ 복제 유전자REP 1-3 및 복제의 기원이다.
본 발명의 벡터는 바람직하게 형질전환된 세포의 용이한 선택을 허락하는 하나 이상의 선택성 마커를 함유한다. 선택성 마커는 그의 생성물이 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속 내성, 영양요구체에 대한 원영양성 등을 제공하는 유전자이다. 박테리아 선택성 마커의 예들은Bacillus subtilis또는Bacillus licheniformls로부터의dal유전자, 또는 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라시클린 내성과 같은 항생물질 내성을 부여하는 마커이다. 사상진균 숙주 세포에서 사용되는 선택성 마커는amdS(아세트아미다제),argB(오르니틴 카르바모일-트랜스페라제),pyrG(오로티딘-5'-포스페이트 디카르복실라제) 및trpC(안트라닐레이트 신타제)를 포함한다. 효모 숙주 세포에 적합한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3이다. 효모를 위해 원하는 선택성 마커는Schizosaccharomyces pompeTPI 유전자이다(Russell (1985) Gene 40:125-130).
벡터에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 돌연변이, 절단, 및 혼성체 프로모터를 포함하여 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 어떤 핵산 서열일 수 있으며, 숙주 세포에 대해 동종성 또는 이종성인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로부터 얻어질 수 있다.
박테리아 숙주 세포에서 전사를 디렉팅하는데 적합한 프로모터의 예들은E. coli lac오페론,Streptomyces coelicolor아가라제 유전자(dagA),Bacillus subtilis레반수크라제 유전자(sacB),Bacillus licheniformls알파-아밀라제 유전자(amyL),Bacillus stearothermophilus말토겐 아밀라제 유전자(amyM),Bacillus amyloliquefaciens알파-아밀라제 유전자(amyQ), 및Bacillus licheniformls페니실리나제 유전자(penP)로부터 얻어진 프로모터이다. 사상진균 숙주 세포에서 전사를 디렉팅하는데 적합한 프로모터의 예들은Aspergillus oryzaeTAKA 아밀라제,Rhizomucor mlehei아스파르트 프로테이나제,Aspergillus niger중성 알파-아밀라제, 및Aspergillus niger산 안정성 알파-아밀라제의 유전자들로부터 얻어진 프로모터이다. 효모 숙주에서 유용한 프로모터는Saccharomyces cerevisiaeMFα1, TPI, ADHm Gal 또는 PGK 프로모터이다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구성물은 전형적으로 적합한 터미네이터에 작동가능하게 연결된다. 효모에서 적합한 터미네이터는 TPI 터미네이터(Alber 등 (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434) 또는 CYC1 터미네이터이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열, 프로모터 및 터미네이터를 각각 리게이트하고, 그들을 선택된 숙주에서의 복제에 필요한 정보를 함유하는 적합한 벡터에 삽입하는데 사용된 과정들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 먼저 본 발명의 전구체 분자를 암호화하는 전체 DNA 서열을 함유하는 DNA 구성물을 제조하고, 이어서 이 단편을 적합한 발현 벡터에 삽입함에 의해서나, 또는 개별 요소들에 대한 유전 정보를 함유하는 DNA 단편들을 연속적으로 삽입한 후 리게이션함에 의해 벡터가 구성될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 전구체 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 그러한 폴리뉴클레오티드 서열을포함하는 벡터는 숙주 세포에 도입되며, 이로써 벡터는 염색체 통합체로서 또는 더 먼저 설명된 자기-복제 염색체-외 벡터로서 유지된다. 용어 "숙주 세포"는 복제 동안 발생한 돌연변이로 인해 모세포와 동일하지 않게 된 모세포의 어떤 자손을 포함한다. 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 유용한 원핵생물은 박테리아 세포들, 예를 들어Bacillus및Streptomyces세포를 포함하는 그램 양성 박테리아, 또는E. coli및Pseudomonassp. 세포와 같은 그램 음성 박테리아이다. 진핵생물 세포는 포유류, 곤충, 식물, 또는 진균 세포일 수 있다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 효모 세포이다. 본 발명의 방법에서 사용된 효모 유기체는 배양시 다량의 전구체 분자를 생산하는 어떤 적합한 효모 유기체일 수 있다. 적합한 효모 유기체의 예들은 효모 종들Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Sacchoromyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Candidasp.,Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichumsp., 및Geotrichum fermentans로부터 선택된 균주이다.
효모 세포의 형질전환은, 예를 들어 원형질체를 형성한 후 원래 알려진 방식으로 형질전환하여 달성될 수 있다. 세포를 배양하는데 사용된 배지는 효모 유기체를 성장시키는데 적합한 어떤 종래의 배지일 수 있다. 다음에, 본 발명의 분비된 전구체는, 원심분리, 여과, 또는 이온교환 매트릭스 또는 역상 흡착 매트릭스에 의한 전구체 포착에 의해 효모 세포와 배지를 분리하고, 황산암모늄과 같은 염에 의해 상청액 또는 여과물의 단백질성 성분을 침전시키고, 이어서 다양한 크로마토그래피 과정, 예를 들어 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등에 의해 정제하는 것을 포함하는 종래의 과정에 의해 배지로부터 회수될 수 있다.
본 텍스트에서, 용어 "유사체"는, 모 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되거나, 및/또는 모 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되거나, 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 모 펩티드에 부가된 펩티드를 지정하기 위해 사용된다. 그러한 부가는 모 펩티드의 N-말단 단부나 C-말단 단부 또는 양쪽 모두에서 일어날 수 있다.
용어 "유도체"는 모 펩티드의 아미노산 잔기 중 하나 이상이, 예를 들어 알킬화, 아실화, 에스테르 변형 또는 아미드 변형에 의해 화학적으로 변형된 펩티드를 지정하기 위해 본 텍스트에서 사용된다.
아미노산 잔기는 1문자 또는 3문자 코드에 의해 표시한다.
실시예 1
N-말단 연장된 Arg
34
GLP-1
(7-37)
의 발현
숙주 균주 ME1719는 배수염색체 균주이며, 두 아스파르틸 프로테아제 활성, 즉 일- 또는 이염기성 아미노산 잔기의 C-말단 측면을 절단하는 YPS1(앞서 YAP3으로 칭했음)(Egel-mltani 등, YEAST 6:127:137, 1990) 및 프로테아제 B, 카르복시펩티다제 Y, 아미노펩티다제 I, RNase, 알칼리성 포스파타제, 산 트레할라제 및 엑소폴리포스파타제와 같은 다른 프로테아제의 활성화를 초래하는 PEP4 액포 프로테아제 A를 결여한 표현형을 가진다. 더욱이, 삼탄당 포스페이트 이소머라제 유전자(TPI)는 분열되는데, 이것은 표현형이 글루코스 함유 배지에서 성장한 형질전환체에 있는 글루코스를 이용하는 것을 가능하게 만든다. ME1719의 유전적 바탕은 MAT a /α Δyps1::ura3/Δyps1::URA3 pep4-3/pep4-3 Δtpi::LEU2/Δtpi::LEU2 leu2/leu2 Δura3/Δura3이다.
N-말단 연장된 Arg34GLP-1(7-37)을 함유하는 발현 플라스미드를 다음과 같이 제조했다: N-말단 연장되지 않은 Arg34GLP-1(7-37)을 암호화하는 DNA를 함유하는 플라스미드 pKV304를 Eagl+Ncol 또는 Eagl+Asp718로 절단했다. 아가라제 전기영동 및 GeneCleanTMIII 정제 후 1.4kb 및 10kb 단편을 각각 분리했다. Ncol 및 Asp718 절단 부위를 함유하는 Arg34GLP-1(7-37)의 다양한 N-말단 연장에 상응하는 올리고뉴클레오티드 연결자를 상기 설명된 것과 마찬가지로 정제했다. Arg34GLP-1(7. 37)(Ncol+Asp718)의 N-말단 확장부용으로 디자인된 1.4 kb 단편 (Eagl+Ncol), 10 kb 단편 (Eagl+Asp718), 연결자 단편을 연결하고E. coli균주 MT172에서 형질전환하였으며 N-말단적으로 확장된 정확한 Arg34GLP-1(7. 37)을 확인하기 위해서 플라스미드 DNA를 서열화하였다.
플라스미드 DNA를 효모 균주 ME1719으로 형질전환하고 효모 형질전환체는 MUPD 선택적 플레이트에서 두 번 분리하였다. 효모 세포를 30℃에서 3일동안 5 ㎖ MUPD 배지에서 배양하고 배양 상청액은 HPLC와 MALDI-MS(Matrix Assisted Laser Desorption/Inonisation Mass Spectrometry)로 분석하였다. MUPD 배지는 25 g 효모 추출 (Bacto), 5 g KH2PO4, 1,5 g MgS04. 7H20, 1 리터로 이온 교환된 물로 구성되고 121℃에서 20분 동안 자동멸균 전에 5 N H2SO4로pH는 6으로 조절되었다. 30 g 글루코스는 50% w/v 농도에서 분리적으로 자동멸균되었고 무균적으로 첨가하였다.
표1는 다른 GLP-1 전구체와 N-말단 확장부가 없는 대조군과 비교한 수율을 제시한다.
실시예 2
2가 또는 3가 금속 이온이 존재할 때와 존재하지 않을 때 EEAHK (SEQ ID NO :1)- Arg
34
GLP-1
(7. 37)
의 아실화
GLP-1 유사물은 실시예 1에 기술된 대로 생산되었다. 발효액을 원심분리로 정제하고 상청액의 2620 ㎖은 7900 ㎖로 희석하였고 pH는 3.1로 조절되었다. 최종 수행도는 4.9 mS/cm이었다. 100 ㎖ Pharmacia Strealine® SP Code no. 17-0993-05로 채워진 2.6 X 100 cm 칼럼은, pH 3.1에서 0.025M 구연산염 버퍼를 사용한 후에 0.5 ㎖/분의 유속에서 0.5M 트리스 염기로 희석한 공급자 (Pharmacia booklet 18-1124-26, Expanded Gel Adsorption, Principles and Methods)가 추천한 대로 평형이 유지되었고 유동화되었다. GLP1 유사물을 포함한 부분은 희석된 H2SO4가 있는 0.010M Tris, 0.015M Na2SO4pH 7.4 에서 CH3CN 구배를 사용하는 분석 RP-HPLC로 확인한다. 혼주된 샘플의 부피는 GLP-1 유사물의 361 mg 을 포함한 100 ㎖였고 순도는 72.4% 였다. 샘플은 제제된 RP-HPLC로 더 정제하였다. 버퍼 체계는 A-버퍼 0.010M Tris, 0.015M Na2SO4와 희석된 H2SO4가 있는 20% 에탄올v/v pH 7.5 ,70% 에탄올로 올성된 B-버퍼로 구성된다. 90 mg GLP1 유사물에 대응하는 일정량을, 7 um, Macherey-Nagel,D 에서 획득한 C4 ,10% B로 평형화된 Nucleosil 300A로 충진된 HPLC 칼럼 (250 X 20) mm에 적용하였다. 샘플은 6 ㎖ 분의 유속 비율에서 전체 720 ㎖에서 10% B 내지 90% B 의 직선 구배로 희석되었다. 용출액은 214 nm내지 276 nm에서 제어되었다. GLP1 유사물을 포함한 샘플은 혼주되었고 ,물의 일정량으로 희석되었으며, pH 5.0 로 조절되고 4℃로 냉각되었다. 침전물은 원심분리로 분리하고 동결건조되었다. 286 mg 을 얻고 최종 순도는 98.0% 였다.
GLP-1 유사물의 아실화는 정제된 유사물의 10 mg 샘플을 사용하여 수행한다. 샘플을 0.5 ml 0. 05M Na2CO3에서 용해하고 15℃에서 배양한다. Glu(ONSU) N-헥사데카노일 메틸에스테르를 0.5㎖ CH3CN에서 용해하고 유사물 용액에 첨가한다. 시약을 첨가하기 전과 15 내지 30 분 후에 냉각 버퍼로 반응을 종결한 후 샘플을 취한다. 냉각버퍼에 샘플을 첨가하고 20% vol/vol 에탄올로 희석한 후 분석용 RP-HPLC 로 분석한다. 2가 금속 이온이 있을 때 아미노산 아실화 시약을 첨가하기 전에 금속 이온의 0. 1M 용액의 적절한 부피를 첨가하여 아실화를 수행한다. Na2CO3버퍼의 부피는 그에 따라 조절된다. 금속 이온으로서 Zn2+로 한 실험에서 Zn2+아세테이트를 사용하였다.
Zn
2+
가 존재할 때 EEAHK (SEQ ID NO :1)- Arg
34
GLP-1
(7-37)
-Lys
26
γ-Glu- 헥사데카노일의 아실화의 최적화
Zn2+의 2 이상의 등가물을 첨가하는 것은 샘플의 침전과 관련되어 있다. 하지만, Zn2+의 2 이상의 등가물이 잉여의 아실화제와 함께 아실화하기 위해 사용되었을 때 수율은 향상되었다. 따라서, 42.4% 수율과 Zn2+이 없을 때 획득한 5.1% 탈아미화한 생성물에 우월한, 탈아미화한 아실화생성물의 7% 로 52% 수율을 획득하였다.
결과는 하기 표2 와 표3 에 제시되었다.
Zn
2+
이 존재할 때 Arg
34
GLP-1
(7-37)
-Lys26 γ-Glu-헥사데카노일의 합성
상기 기술된 바와 같이 15분동안 2 등가물 Zn2+이 존재할 때 아실화제의 2 등가물을 첨가하여 EEAHK (SEQ ID NO :1)-Arg34GLP-1(7-37)이 아실화한다. TFA/CH3CN/H20 버퍼 체계를 사용하여 전체 15㎕을 분석용 RP-HPLC 칼럼에 적용한다. 57 ㎍ 에 대응하는 정제된생성물은 합성 수율 46%을 나타낸다. 생성물을 건조시키고 후속하여 0 ℃에서 0.025ml 0.1 m NaOH 에서 용해시킨 후 20분동안 배양하였다. 메틸에스테르를 가수분해한 후, 샘플을 15 ㎕ 0.1m HCl와 5 ㎕ 0.1m Tris. HCl에 첨가하였다. pH 지시제 종이로 약 pH 8-9로 측정하였다. 샘플은 10㎕ CH3CN와 1㎕ 1mg/㎖Achromobacter lyticus protease1 (EC 3.4. 21.50)에 첨가하고 실온에서 30분동안 배양하였다. 전체 10 ㎕을 상기 기술된 RP-HPLC 체계에 적용하고 66.2% 에 해당하는 가장 선명한 3 피크의 특성을 규명하였으며 원하는 생성물에 일치하는 것으로 발견되었다. 결과는 하기 표4에 제시되었다.
실시예 3
EEAEK (SEQ ID NO: 45)-Arg
34
GLP-1
(7-37)
의 아실화와 ALP-공정
GLP-1 전구체 EEAEK (SEQ ID NO : 43)-Arg34GLP-1(7-37)는 상기 기술된 바와 같이 효모에서 발현되었고 발효 상청액에서 이온 강도를 7로 조절하고 양이온 칼럼 SP Sepharose Fast Flow XL (Amersham Pharmacia)에 결합시켜 회복되었다. 전구체는 50 mM 포름산에서 50 mM 포름산 + 1 M NaCl의 구배 0-100%로 희석하였다. 10 칼럼의 부피가 증가한 후 칼럼을 50 mM 포름산의 2 부피로 세척한 후 3.5 칼럼 부피동안에 0.5 M 글리신 pH 9로 용출하였다. 부분을 MALDI-MS로 분석하고 전구체 혼주를 확인하였다. 이러한 혼주를 Reverse Phase HPLC a ZORBAX 300SB-CN 칼럼 (9.4 X 250 mm)에 적용시켰다. 버퍼 A (0,1 % TFA)에서 버퍼 B (0,1 % TFA/80% 에탄올)의 30-70 % 구배로 용출하였다. 부분은 UV-pattern과 MALDI-MS로 확인하였다. 혼주를 수집하고, 에탄올은 진공에서 증발시켰으며 생성물을 동결건조하였다.
동결건조된 전구체 EEAEK (SEQ ID NO : 45)-Arg34GLP-1(7-37)5 mg을 350 g 물에 용해하고 실온에서 700 ㎕ NMP (N-메틸-피리돈-2)와 N-헥사테카노일-/-글루탐산
-a-4차-부틸에스테르-y-숙시닐이미딜 에스테르의 4등가물을 시간 0 에서 첨가하였다. EDIPA (에틸 디-이소프로필 아민)으로 pH는 9.5로 조절되었으며 EDIPA을 첨가하여 9.5으로 일정하게 유지되었다. 60 분 후에 물에서 1% 글리신 용액 208 ㎕을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 반응 혼합물을 분석하면 24% 가 반응하지 않는 생성물이며. 61%은 부위 Lys26에서 단일 아실화되고 8% 는 Lys26와 N-말단 아미노기에서 두번 아실화됨이 제시된다. 7% 는 Lys6 와 Lys26에서 두 번 아실화되었다. 단일 그리고 두번 아실화된 분자는 잘 설정된 방법에 따라 라이신 절단 부위에서 ALP와 함께 공정하여 단일 아실화된 Arg34GLP-1(7-37)(69%)로 전환되었다. 결과는 HPLC 와 MALDI-MS로 증명하였다.
실시예 4
EELDARLEALK (SEQ ID NO : 33)-Arg
34
GLP-1
(7-37)
, EEA-HEYK (SEQ ID NO : 18)-Arg
34
GLP-1
(7-37)
와 DDDDK (SEQ ID NO: 26)-Arg
34
GLP-1
(7-37)
의 아실화와 절단
GLP-1 전구체 EELDARLEALK (SEQ ID NO : 33)-Arg34GLP-1(7-37), EEAHEYK(SEQ ID NO : 18)-Arg34GLP-1(7-37)와 DDDDK (SEQ ID NO: 26)-Arg34GLP-1(7-37)는 효모에서 모두 발현되었으며 실시예 3에 기술된 대로 정제되었다.
실시예 3에 기술된 대로 아실화를 수행하였다. 헥사데카노일-/-글루탐산-a-4차-부틸 에스테르-y-숙시닐이미딜 에스테르의 1.3 등가물이 사용되었다. HPLC와 MALDI-MS 분석으로 모든 경우에서 아실화 혼합물에서 ALP와 직접 가수분해한 후 15-30% 반응하지 않은 기질과 약 20 % 두번 아실화된 생성물(Lys6, Lys26)을 밝혀냈다. 결과는 표5에 제시되었다.
Claims (63)
- ε-아미노기에서 아실화된 적어도 하나의 라이신 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법에 있어서,(ｉ)원하는 폴리펩티드를 포함하고 원하는 폴리펩티드로부터 라이신 절단 부위에서 절단가능한 N-말단 확장부를 포함하는 상기 폴리펩티드의 전구체 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주세포를 전구체 분자를 발현하기에 적절한 조건에서, 상기 전구체 분자를 배양하는 단계;(ⅱ) 발현된 전구체 분자를 배양액으로부터 분리하는 단계;(ⅲ) N-말단 확장부에서 라이신 절단 부위의 ε-아미노기를 아실화하지 않고원하는 폴리펩티드에서 적어도 하나의 라이신 잔기의 ε-아미노기를 우선적으로 아실화하는 단계;(ⅳ)효소 절단에 의해 아실화된 전구체 분자로부터 N-말단 확장부를 제거하는 단계;(v) 아실화된 폴리펩티드를 적절한 수단에 의해 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, N-말단 확장부는 길이가 15 아미노산까지인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, N-말단 확장부는 길이가 3-15; 3-12; 3-10; 3-9; 3-7; 3-6 또는 3-5 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드는 단일아실화된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, N-말단 확장부에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 폴리펩티드의 N-말단에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기와 함께 금속 이온 복합체 결합 부위를 설정할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, N-말단 확장부는 돼지 혹은 사람 혈청 알부민의 N-말단에서 유래하는 금속 이온 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, N-말단 확장부는 메탈로엔도펩티다아제에서 Zn 결합 부위에서 유래한 금속 이온 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 전구체 물질의 N-말단 확장부는 N-말단의 라이신 절단 부위와 폴리펩티드의 염다리를 설정할 수 있는, 적어도 하나의 음으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8항에 있어서, N-말단 확장부는 α-나선을 형성할 수 있는 것을 특징으로하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, N-말단 확장부는 트립시노겐으로부터 Ca+2결합 엔터로키나아제 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항에 있어서, N-말단 확장부는 진핵 N-글리코실레이션 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 원하는 폴리펩티드는 N-말단에서 단백질 분해에 의한 분해에 민감하고, N-말단 확장부는 그러한 단백질 분해에 의한 분해를 방지 또는 최소화하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 원하는 폴리펩티드는 N-말단으로부터 두번째 아미노산 잔기로서 Ala 또는 Pro를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 13 항에 있어서, 원하는 폴리펩티드는 N-말단 아미노산 잔기로서 His를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, N-말단 확장부는 적어도 하나의 히스티딘 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, N-말단 확장부에서 하나 혹은 그 이상의 히스티딘 잔기는 라이신 절단 부위로부터 1-4잔기에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, N-말단 확장부는 Glu-Glu-Ala-His-Lys(SEQ ID NO:1);Glu-(Glu-Ala)2-His-Lys(SEQ ID NO:2); Glu-(Glu-Ala)3-His-Lys(SEQ ID NO:3); Glu-Glu-Gly-His-Lys(SEQ ID NO:4); Glu-His-Pro-Lys(SEQ ID NO:5); Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys(SEQ ID NO:6); Glu-Glu-His-Cys-Lys(SEQ ID NO:7); Glu-Glu-His-His-Lys(SEQ ID NO:8); Glu-His-His-His-Lys(SEQ ID NO:9); Glu-His-Ala-His-Lys(SEQ ID NO:10); Glu-Gly-Ala-His-Lys(SEQ ID NO:11); Glu-His-Gly-His-Gly-Lys(SEQ ID NO:12); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Leu-Lys(SEQ ID NO:13); Glu-Glu-Ala-His-Glu-lle-Lys(SEQ ID NO:14); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Val-Lys(SEQ ID NO:15); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Met-Lys(SEQ ID NO:16); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Phe-Lys(SEQ ID NO:17); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Tyr-Lys(SEQ ID NO:18); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Trp-Lys(SEQ ID NO:19); Gln-Asp-Ala-His-Lys(SEQ ID NO:24); Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-His-Trp-leu-Lys(SEQ ID NO:30); Asp-Ser-His-Lys(SEQ ID NO:34); Glu-His-His-Gly-His-Gly-lys(SEQ ID NO:36); Asp-Ser-His-Lys(SEQ ID NO:37); Gln-Asp-Thr-His-Lys(SEQ ID NO:38); Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys(SEQ IDNO:39); Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys(SEQ ID NO:40); Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys(SEQ ID NO:41); Trp-His-Trp-leu-Lys(SEQ ID NO:42); Glu-Glu-Trp-His-Trp-leu-Lys(SEQ ID NO:43); Glu-Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-His-Trp-leu-Lys(SEQ ID NO:44); Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys(SEQ ID NO:47); Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys(SEQ ID NO:48); Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys(SEQ ID NO:49)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항에 있어서, N-말단 확장부는 적어도 하나의 Glu 또는 Asp를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 18 항에 있어서, Glu 또는 Asp 잔기는 라이신 절단 부위로부터 1 과 5 사이의 잔기에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 18 항에 있어서, N-말단 확장부는 Glu-Glu-서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 18 항에 있어서, N-말단 확장부는 Glu-Glu-Ala-Glu-Lys (SEQ ID NO:45); Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO:46); Glu-Glu-Lys인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9 항에 있어서, N-말단 확장부는 Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys(SEQ ID NO : 29), Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 30); Leu-Asp-Gly-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys(SEQ ID NO:31); Glu-Glu-Leu-Asp-Gly-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys(SEQ ID NO :32); Glu-Glu-Leu-Asp-Ala-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys (SEQ ID NO : 33); Glu-Glu-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 43); Glu-Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 44)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, N-말단 확장부는 Glu-Glu-Gly-Asn-Thr-Thr-Pro-Lys (SEQ ID NO : 20), Glu-Glu-Gly-Asn-Glu-Thr-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO : 21), Glu-Glu-Gly-Asn-Asp-Thr-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO : 22), Glu-Glu-Gly-Asn-Thr-Thr-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO: 23)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10 항에 있어서, N-말단 확장부는 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO:26)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, N-말단 확장부는 다음 식을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.Xn-----X1-Lys상기식에서 Lys은 절단 부위이고 Xn-----X1은, 제1항의 단계(ⅲ)에서 Lys 절단 부위에서 유리 ε-아미노기의 아실화를 방지 혹은 최소화하는 기능을 가지고 내부 단백질 분해에 의한 절단으로부터 발현된 전구체 폴리펩티드를 보호하는 기능을 더 가지는 길이가 2-14 아미노산 잔기의 펩티드 서열이고, 단 X는 Lys이 아니고 적어도 하나의 X는 His 또는 Glu 또는 Asp인 방법이다.
- 제 25 항에 있어서, Xn--X1는 길이가 2-12 개의 아미노산 잔기이고 다른 실시예에서, Xn--X1는 길이가 2-10; 2-9; 2-8; 2-7; 2-6; 또는 2-5 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 25 항에 있어서,Xn--X1는 His; Glu ; Ala ; Asp; Gly ; Pro로 구성된 군에서 선택된 2-8개의 아미노산 잔기를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 25 항에 있어서, Xn--X1는 Glu ; Asp; Ala ; His; Trp; Tyr ; lie ; Val ;Met; Phe로 구성된 군에서 선택된 4-10개의 아미노산 잔기를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 25 항에 있어서,Xn--X1는 Glu ; Asp; Gly ; Asn; Thr; Ser; Pro로 구성된 군에서 선택된 5-8개의 아미노산 잔기를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 25 항에 있어서, N-말단 확장부의 N-말단으로부터 첫번째 및 두번째 X는 Glu 와 Asp 로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 25 항에 있어서, Xn--X1-Lys잔기는 Glu-Glu-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 1) ; Glu-(Glu-Ala)2-His-Lys (SEQ ID NO : 2); Glu-(Glu-Ala)3-His-Lys (SEQ ID NO : 3); Glu-Glu-Gly-His-Lys (SEQ ID NO : 4); Glu-His-Pro-Lys (SEQ ID NO : 5); Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO : 6); Glu-Glu-His-Cys-Lys (SEQ ID NO : 7);Glu-Glu-His-His-Lys (SEQ ID NO : 8); Glu-His-His-His-Lys (SEQ ID NO : 9); Glu-HisAla-His-Lys (SEQ ID NO : 10); Glu-Gly-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 11); Glu-His-Gly-His-Gly-Lys (SEQ ID NO : 12); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Leu-Lys (SEQ ID NO : 13); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Ile-Lys (SEQ ID NO : 14); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Val-Lys (SEQ ID NO : 15); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Met-Lys (SEQ ID NO : 16); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Phe-Lys (SEQ ID NO : 17); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Tyr-Lys (SEQ ID NO : 18); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Trp-Lys(SEQ ID NO : 19); Glu-Glu-Gly-Asn-Thr-Thr-Pro-Lys (SEQ ID NO : 20); Glu-Glu-Gly-Asn-Glu-Thr-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO : 21),Glu-Glu-Gly-Asn-Asp-Thr-Glu-Pro-Lys(SEQ ID NO : 22); Glu-Glu-Gly-Asn-Thr-Thr-Glu-Pro-Lys (SEQ ID NO: 23); Gln-Asp-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 24);Glu-Glu-Lys ; Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO : 26); Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 29); Glu-GluGlu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 30); Leu-Asp-Gly-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys (SEQ ID NO : 31); Glu-Glu-Leu-Asp-Gly-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys (SEQ ID NO : 32); Glu-Glu-LeuAsp-Ala-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys (SEQ ID NO : 33); Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO : 34); AspAla-His-Lys (SEQ ID NO : 35); Glu-His-His-Gly-His-Gly-Lys(SEQ ID NO : 36); Asp-Ser-His-Lys (SEQ ID NO : 37); Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO : 38); Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO : 39); Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO : 40); GluAla-Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO : 41); Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 42); Glu-Glu-Trp-His-Trp-Leu-Lys (SEQ ID NO : 43); Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys(SEQ ID NO : 44);Glu-Glu-Ala-Glu-Lys(SEQ ID NO : 45); Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys(SEQ ID NO : 46); Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 47); Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys(SEQ ID NO : 48);Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys(SEQ ID NO : 49)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, N-말단 확장부는 서열 His-Z1-Z2-Lys (SEQ ID NO : 51)을 포함하고 Z1은 Glu ; Asp; Asn; Gln ; Ser; Thr; Gly ;Leu; Ile ; Val ; Met; Phe 또는 Tyr 이고 Z2는 Leu; Ile ; Val ; Met; Phe; Tyr; Trp 또는 Cys 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 32 항에 있어서, Z1은 Glu 또는 Asp 이고 Z2는 Leu; Ile ; Val ;Met; Phe, Tyr, Trp 또는 Cys 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, N-말단 확장부는 서열 Asp-X-His-Lys (SEQ ID NO : 50)을 포함하고 X는 Ala, Thr 또는 Ser인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 34 항에 있어서, N-말단 확장부는 서열 Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO:34) 또는 Asp-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 35)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 35 항에 있어서, N-말단 확장부는 Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO : 38); Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO : 41); Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO : 40); Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys (SEQ ID NO : 39); Gln-Asp-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 24); Glu-AlaGln-Asp-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 47); Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 48); Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys (SEQ ID NO : 49)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 원하는 폴리펩티드는 N-말단 부위에 His 또는 Tyr을 가지고 다음 위치에 Ser, Ala 또는 Gly을 가지는 펩티드의 GRF(성장 호르몬 방출 요소) 군에 속하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 37 항에 있어서, 원하는 폴리펩티드는 GLP-1 또는 GLP-2 또는 GLP-1 또는 GLP2 유사물 또는 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 37 항에 있어서, 폴리펩티드는 Lys26과 Lys34부위에서 GLP-1(7-37)아실화되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 37 항에 있어서, GLP-1 유사물은 Lys26부위에서 Arg34GLP1(7-37)아실화되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 단계(iv)의 효소적 절단은Achromobacter lyticus프로테아제1과 같은 라이신 엔도펩티다아제를 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 숙주 세포는 효모 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 42 항에 있어서, 효모 세포는Saccharomyces cerevisiae세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 43 항에 있어서, 효모 세포는 △YPS1 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 아실화 단계 (iii)는 유기 용매에서 또는 금속 이온의 존재하에 물과 유기 용매의 혼합물에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 45 항에 있어서, 금속 이온은 Zn, Cu, Co, Ni, Fe, Mg, Mn 또는 Ca 인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 45 항에 있어서, 유기 용매는 CH3CN 또는 NMP (N-메틸-피롤리돈)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 45 항에 있어서, 아실화 단계는 pH 7과 12사이에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, pH는 8 과 11.5 사이 또는 9.0 과 10.5 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 45 항에 있어서, 아실화 단계는 -5 과 35 ℃ 사이의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 50 항에 있어서, 온도는 15 와 25 ℃ 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음 식을 갖는 원하는 폴리펩티드의 폴리펩티드 전구체.N-말단-확장부-Lys-Z3-Z4-*폴리펩티드*상기식에서 Lys은 절단 부위, N말단 확장부는 2-14 아미노산 잔기를 가지고 Lys 절단 부위의 아실화를 방지 또는 최소화할 수 있고 발효하는 동안 단백질 분해에 의한 분해에 대해서 폴리펩티드 전구체를 보호할 수 있으며 Z3은 His 또는 Tyr 이고 원하는 폴리펩티드에서의 N말단 아미노산 잔기이며, Z4은 원하는 폴리펩티드에서의 N말단으로부터의 다음 아미노산 잔기이며 Ala, Ser 또는 Gly이고 *폴리펩티드* 는 원하는 폴리펩티드의 나머지 서열이다.
- 제 52 항에 있어서, N-말단 서열은 폴리펩티드의 N-말단에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기와 함께 금속 이온 복합체 결합 부위를 설정할 수 있는 것을 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 전구체.
- 제 52 항에 있어서, N-말단 확장부는 알부민의 N-말단 확장부로부터 금속 이온 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 전구체.
- 제 52 항에 있어서, N-말단 확장부는 메탈로엔토펩티다아제에서의 Zn 결합 부위에서 유래한 금속 이온 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 전구체.
- 제 52 항에 있어서, N-말단 확장부는 라이신 절단 부위와 염다리를 설정할 수 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 전구체.
- 제 56 항에 있어서, N-말단 확장부는 α-나선을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 전구체.
- 제 56 항에 있어서, N-말단 확장부는 진핵 글리코실레이션 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 전구체.
- 제 52 항에 있어서, N-말단 확장부는 적어도 하나의 히스티딘 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 전구체.
- 제 52 항에 있어서, N-말단 확장부는 적어도 하나의 Glu 또는 Asp을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 전구체.
- 제 60 항에 있어서, 원하는 폴리펩티드는 GLP-1 또는 GLP-2 또는 GLP-1 또는 GLP2 유사물 또는 유도체인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 전구체.
- 제 61 항에 있어서, 폴리펩티드는 Lys26와 Lys34위치에서 GLP-1(7-37)아실화되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 전구체.
- 제 61 항에 있어서, GLP-1 유사물은 Lys26위치에서 Arg34GLP1(7-37)아실화되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 전구체.
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