JP2000500019A

JP2000500019A - ストレプトアビジン融合タンパク質経由でのペプチドの生産方法

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Publication number: JP2000500019A
Application number: JP9518551A
Authority: JP
Inventors: コペトツキ，エルハルト
Original assignee: ロシュダイアグノスティクスゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1995-11-16
Filing date: 1996-11-06
Publication date: 2000-01-11
Also published as: CA2237296C; US6136564A; CA2237296A1; EP0861325A1; AU7566396A; WO1997018314A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、微生物中でのＤＮＡの発現によるペプチドの組換え生産方法であって、前記ＤＮＡがストレプトアビジンと１つの前記ペプチドから成る融合タンパク質をコードするペプチドの組換え生産方法に関する。ストレプトアビジンと該ペプチドはエンドプロテイナーゼにより開裂させることができるペプチド配列により連結されている。この方法は、不溶性の不活性タンパク質の単離、変性剤を使った不活性タンパク質の可溶化、エンドプロテイナーゼによる融合タンパク質の開裂が行える程度までの8.5〜11のpH値での変性剤の希釈、融合タンパク質の開裂、ストレプトアビジンと未開裂の融合タンパク質が沈澱するまでのpH値の低下、および上清からの所望のペプチドの精製も含んで成る。前記方法は副甲状腺ホルモンおよびウロジラチン並びにそれらの断片を生産するのに特に適当である。

Description

【発明の詳細な説明】ストレプトアビジン融合タンパク質経由でのペプチドの生産方法本発明は、ストレプトアビジン融合タンパク質の発現およびその後の融合タンパク質の酵素的開裂によるペプチドの組換え生産方法に関する。ペプチドは普通約100アミノ酸までから成る物質であると理解される。そのようなペプチドは化学的に〔Kent，S.B.H.他(1988)(1)、Hodson，J.H．(1993)(2) 〕または組換えにより〔Kopetzki，E.他(1994)(3)、Winnacker，E.L．(1987)(4) 、Harris，T.J.R．(1983)(5)〕のいずれかで調製することができる。ペプチド化学合成の欠点は、特に経済的な合成が約30〜40アミノ酸までしか可能でないことと、合成中に望ましくない修飾（誤った配列、開裂されない保護基）がしばしば起こることである。更なる問題は、断片のカップリング中のラセミ化、保護基の開裂の難しさ、および最終的に複雑な精製である。ペプチドの組換え生産には様々な方法が利用できる。例えば、直接発現を微生物または細胞系の細胞質中で行うことができる。しかしながら、これには約80〜 100アミノ酸の最低ペプチド鎖長が要求される。それより小さいペプチドは安定でなく、タンパク質分解により分解される。更にそれらのタンパク質は通常は付加的なＮ末端メチオニンを含み、収率が非常に低い。そのようなペプチドの生産は、選択的開裂配列を有する可溶性融合タンパク質の発現とその後の化学的または酵素的開裂による所望のペプチドの遊離により改善することができる〔Itakura，K．他(1977)(20)；EP-B 0 001 930(21)；Gram， H.他(1994)(19)；Sharma, A.他（1992）(22)〕。しかしながら、可溶性融合タンパク質の特定の欠点は、それらが細胞中でまたは分泌の最中にタンパク質分解と主に非構造ペプチド領域中のプロセシングにより既に分解されてしまう可能性があることである。ストレプトアビジン融合タンパク質の生産はEP-B 0 198 015、Sano，T．(1991 )(9)およびSano，T．(1992)(10)において記載されている。Sanoの場合のそのようなキメラタンパク質は、ストレプトアビジン成分としてストレプトアビジンのアミノ酸16〜133、ポリリンカーおよび標的タンパク質の配列を含んで成る。San oにより記載された標的タンパク質はマウスメタロチオネインＩタンパク質とT7 遺伝子10タンパク質である。しかしながら、それらのキメラタンパク質は、標的タンパク質をストレプトアビジン成分から再開裂せしめることができる開裂部位を１つも含まない。ストレプトマイセス中でのストレプトアビジン融合タンパク質の生産はEP-B 0 198 015に記載されている。しかしながら、該融合タンパク質からのペプチド成分の単離は非常に複雑である。例えば、開裂前と開裂後の両方でリガンドとしてイミノビオチンを使ったアフィニティークロマトグラフィーを実施しなければならない。本発明の目的は、できるだけ完全であるストレプトアビジン成分からの分離によりストレプトアビジン融合タンパク質経由でペブチドを高収率で且つ高純度で生産することができる方法を提供することであった。この目的は、本発明によれば、ペプチドの組換え生産方法であって、ストレプトアビジンと前記ペプチドを含んで成り前記ストレプトアビジンと前記ペプチドがエンドプロテイナーゼにより開裂され得るペプチド配列を介して連結されている融合タンパク質をコードするＤＮＡを、微生物、好ましくは原核生物中で発現せしめ、次いで発現された不溶性の不活性融合タンパク質を単離し、変性剤を使って前記不活性融合タンパク質を可溶化し、エンドプロテイナーゼにより前記融合タンパク質を開裂させることができるまで前記変性剤を8.5〜11のpH値で希釈し、前記融合タンパク質を開裂せしめ、開裂されたストレプトアビジンと開裂されない融合タンパク質が沈澱するまでpH値を下げ、そして上清から所望のペプチドを精製することを含んで成る方法により達成される。本発明の方法は、ストレプトアビジン融合タンパク質を原核生物中で非常に良好に発現させることができ且つ不溶性不活性タンパク質（封入体）の形で単離することができるという利点を利用する。変性剤中で可溶化されたストレプトアビジン融合タンパク質は、8.5より上のpH値で、沈澱させることなくそれらをエンドプロテイナーゼで消化することができる程度にまで希釈することができる。本発明の方法の更に重要な利点は、活性タンパク質を形成させるための融合タンパク質の復元が不要であることである。最終的に遊離されたストレプトアビジンと場合により開裂されなかったストレプトアビジン融合タンパク質は、６以下のpH値での沈澱により所望のペプチドから分離することができる。本発明の方法は多数の短鎖ペプチドの生産に適する。該方法は特に、ナトリウム利尿プチドや副甲状腺ホルモンペプチドの生産に特に適当である。ナトリウム利尿ペプチド（ＮＰペプチド）は、心室、副腎および脳において前駆体ポリペプチド（プロホルモン）から生成されるナトリウム利尿活性を有するペプチドであり、そして２個のシステイン残基間でのジスルフィド結合により形成される構造要素として17アミノ酸の環を有する。前駆体ポリペプチドは、例えば「心房性」ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ 1〜126）またはカルジオジラチン（ＣＣＤ 1〜126）並びにＢ型およびＣ型の「脳」ナトリウム利尿ペプチドである。好ましいＮＰペプチドはヒトα心房性ナトリウム利尿ペプチド（ｈαＡＮＰ）から誘導される。この場合、アミノ酸95〜126、99〜126および 102〜126のＣ末端ｈαＡＮＰ断片が特に好ましい。ウロジラチン（ＣＤＤ 95〜126）はヒト尿から単離することができるナトリウム利尿ペプチドである〔Forssmann，K．他(1988)(23)〕。このペプチドは32アミノ酸の鎖長であり、２個のシステイン残基間でのジスルフィド結合の形成により 17アミノ酸の環を形成し、そしてカルジオジラチン／「心房性」ナトリウム利尿ペプチド（ＣＤＤ／ＡＮＰ）ファミリーの一員である。αＡＮＰ(99〜126)と同様に、それはＡＮＰプロペプチド（ＡＮＰ 1〜126）から形成される。ウロジラチン（ＣＣＤ 95〜126）はおそらくアミノ酸94と95の間でのこのペプチドの開裂により生体内で形成されるのだろう。約3.5 kDaのウロジラチンペプチドは、Ｎ末端の４アミノ酸延長によりαＡＮＰ（99〜126）ペプチドと異なっている。ウロジラチンのアミノ酸配列と構造は例えばDrummer，C．他（1993）(24)中に記載されている。ウロジラチンは膜上のＡＮＰレセプターＡおよびＢに結合し、該レセプターに関連した細胞内グアニル酸シクラーゼを活性化する。これは第二のメッセンジャーであるｃＧＭＰの形成を引き起こし、ｃＧＭＰが腎臓の利尿作用およびナトリウム排出作用並びに血管平滑筋に対する弛緩作用を媒介する〔Heim， J.M.（1989）(25)〕。従ってウロジラチンは、例えば心臓または肝臓移植後の患者において、急性腎不全の予防および治療用の好ましい薬剤である〔Bub，A．他（1992）(26)；Drummer，C.他（1991）(27)および(1992)（28）；Emmeluth，C. 他（1992）(29)；Goetz，K.L.他（1990）(30)〕。本発明の方法は副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）並びにその断片を生産するのにも有利に用いることができる。ＰＴＨのＤＮＡ配列とアミノ酸配列は例えばRokkones，E.他（1994）(16)に記載されている。ヒト副甲状腺ホルモン遺伝子は115アミノ酸のプレープロ−ＰＴＨタンパク質をコードする。シグナル配列とプロセグメントの開裂後、成熟ＰＴＨホルモンは84アミノ酸（ＰＴＨ１〜84 ）を有する。Ｅ．コリ中およびＳ．セレビシェ中で組換え生産されたＰＴＨは不安定であり、迅速に分解されることが示された。ＰＴＨ融合タンパク質の生産は Forsberg，G.他(1991)(17)により記載されている。このために、成熟ＰＴＨ（１〜84）と15 kD IgG結合タンパク質とから成る融合タンパク質をコードする核酸が調製される。両タンパク質成分の間にトロンビンまたはサブチリシンのための開裂部位が挿入される。この融合タンパク質もまた不安定であり、Ｅ．コリ中での発現の最中にかなりの程度が既に分解されてしまう。プロテインＡシグナル配列を使ったＥ．コリの周縁質中への成熟ＰＴＨ（１〜84）ホルモンの分泌によりＰＴＨ（１〜84）の分解を防止することもできなかった。Ｅ．コリ中でのＰＴＨ（１〜84）の半減期はわずか数分である。第Ｘａ因子を使って開裂せしめることができる融合タンパク質を使ったＥ．コリ中でのＰＴＨ（１〜84）の生産はGardella，T.J.他(1990)(18)により記載されている。しかしながら、第Ｘａ因子による開裂はごく不完全であり（２時間後に約50％開裂）、または第Ｘａ因子との長期インキュベーション後にはＰＴＨ（１〜84）の分解も引き起こす。融合タンパク質を使ったＥ．コリ中でのＰＴＨ断片（ＰＴＨ１〜38）の生産も Gram，H.他(1994)(19)により記載されている。Ｃ末端側に融合されたＰＴＨ（１〜38）ペプチドの開裂にAsp-Pro-Proリンカーが使われる。これは２段階法によって開裂／除去することができる。第一段階の反応において、酸に不安定なAsp-Proペプチド結合が化学的に加水分解される（60 mM HCl中で50℃にて24時間の融合タンパク質のインキュベーション）。その後、残ったＮ末端のPro-Proジペプチドが第二段階の反応においてＬ．ラクチス（L ．lactis）からのジペプチジルペプチダーゼIVを使って酵素的に除去される。しかしながら、この方法は非常に時間がかかり、酸加水分解により多量の副生成物が形成される。融合タンパク質は特異的に開裂させるプロテイナーゼ（制限プロテイナーゼ）を使って酵素的に開裂させることができる。プロテイナーゼは、生産しようとするペプチドのアミノ酸配列を考慮に入れて選択される。できるなら、制限プロテイナーゼの認識／開裂配列が融合タンパク質の所望のペプチド中と好ましくは担体成分（ストレプトアビジン成分）中にも存在しないように注意しなければならない。すなわちそれは開裂領域（リンカー領域）中に１度だけ存在すべきである。適当な特異的に開裂させるエンドプロテイナーゼは例えばエンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トロンビン、サブチリシンＢＰＮ変異体／ユビキチンタンパク質ペプチダーゼ、レニン、コラーゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼLys-C、カリクレイン〔Carter，P.(12)〕、ＴＥＶプロテイナーゼ〔Parks，T.D．他、Anal．Biochem．216（1994）413-417〕(36)、IgＡプロテイナーゼ,〔Pohlner，J.他、Nature 325（1987）458-462〕(37)、Kex2pプロテイナーゼ（EP-A 0 467 839）(38)またはＳ．アウレウスＶ８プロテイナーゼである。好ましくは、リジンのＣ末端側でタンパク質およびペプチドを特異的に開裂せしめるエンドプロテイナーゼLysCが使われる。そのような酵素は例えば真菌または細菌由来のものが知られている（DE 30 34 045 C2）。エンドブロテイナーゼL ysCはウロジラチンのようなリジン残基を含まないペプチドを生産するのに特に適当である。エンドプロテイナーゼにより開裂せしめることができるペプチド配列は、本発明の意味の中では好ましくは５〜15アミノ酸から成り且つ所望のエンドプロテイナーゼのためのＣ末端開裂部位を含有する、短鎖ペプチド配列として理解される。このリンカーは、好ましくは所望のエンドプロテイナーゼ認識配列のＮ末端側にGly，Thr，Ser，Ala，Pro，Asp，Glu，ArgおよびLysのアミノ酸から選ばれた数個のアミノ酸の組合せを更に含んで成る。それらの追加のアミノ酸の２〜８が負に帯電したアミノ酸Aspおよび／またはGluであるリンカーの使用が特に好ましい。融合タンパク質をコードするＤＮＡは、Sambrook，J.他（1989）(6)に記載された既知の方法により製造することができる。ストレプトアビジン成分として例えばEP-B 0 198 015(7)およびEP-A 0 612 32 5(8)に記載されたストレプトアビジンを用いることができる。更に例えばSano， T.他(9)により記載されたようなストレプトアビジン誘導体またはストレプトアビジン断片も適当である。好ましくはＮ末端および／またはＣ末端において先端が切り取られた（短縮された）ストレプトアビジンが用いられる。これは凝集とタンパク質分解を防止する（Sano，T.他(9)）。好ましくはアミノ酸10〜20で始まりそしてアミノ酸130〜140で終わるストレプトアビジンが使われる（Argarana ，C.E.他（1986）(33)と同様な番号付け）。アミノ酸16〜133または13〜139から成るストレプトアビジンの使用が特に好ましい。融合タンパク質は、微生物中、好ましくは原核生物中での融合タンパク質をコードするＤＮＡ（核酸配列）の発現により生産される。使われる発現ベクターは、タンパク質が変性された不溶性形（封入体）で生産されるように培地中へのタンパク質の分泌を媒介するであろういずれの要素も含むべきではない。発現に適当であるＤＮＡは、好ましくは合成により製造することができる。そのような方法は当業者に周知であり、例えばBeattie，K.L．およびFowler，R.F.(1991)(34)；EP-B 0 424 990(35)；Itak ura，K.他（1997）(20)中に記載されている。本発明のタンパク質の核酸配列を変更することも有利なことがある。そのような変更は例えば次のものである： − 連結、クローニングおよび突然変異誘発を促進する様々な制限酵素認識配列を導入するための核酸配列の変更。 − 宿主細胞にとって好ましいコドンを含めるための核酸配列の変更。 − 宿主細胞中での発現を最適にするための追加の調節および転写要素による核酸配列の延長。該方法の中の適当な発現ベクターの作製および発現のための全ての追加の段階は、技術の現状であり、当業者に周知である。そのような方法は例えばSambrook ，J.他（1989）(6)に記載されている。融合タンパク質は原核生物中だけでなく他の細胞、例えば真核宿主細胞、例えば酵母（例えばサッカロミセス、ピヒア、ハンゼヌラおよびクルイベロミセス）並びに真菌、例えばアスペルギルスおよびトリコデルマ中に不溶性タンパク質凝集物の形、いわゆる封入体（ＩＢ）の形で蓄積することができる。封入体は、細胞中でのタンパク質の合成速度が、生来の活性タンパク質に折り畳まれる速度よりも大きい時に形成される。この場合、タンパク質は細胞内で好ましくは細胞質中で凝集する。よって、タンパク質は変性され圧縮された不溶性の形態で細胞中に貯蔵される。これは細胞機能の妨害を最小にする。例えばエシェリキア、ストレブトマイセスまたはバシラスが原核宿主生物として適当である。本発明の融合タンパク質の生産には、微生物、好ましくは原核生物が融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを使って常法により形質転換され、次いで常法により醗酵される。細胞の溶解後、不溶性不活性タンパク質（ＩＢ）が常法により例えば遠心分離（ペレット分画）により単離される。必要なら、例えば界面活性剤を含む緩衝液でペレットを洗浄することにより、所望の不溶性タンパク質凝集物を更に富化せしめることができる。ＩＢは当業者に周知の方法により変性剤、例えば塩酸グアニジン、尿素または尿素誘導体（米国特許第5,453,363 号を参照のこと）を使って可溶化され、そして希釈または透析により適当な非変性緩衝液（pH＞8.5）に移される。この方法では、希釈は残存する変性剤が融合タンパク質の酵素的加水分解に対して有意な影響を与えないような方式で行われる。希釈は好ましくは、例えばＩＢ可溶化物を変性剤を含まない緩衝液（pH＞8.5 ）に滴下添加することによりパルス様方式で行われる。そのようなパルス様希釈は、変性剤の効果の除去と可溶化すべき分子の分離をほぼ同時に可能にする。これは可溶化すべき分子の望ましくない分子間相互作用（凝集）を大部分回避する。驚くべきことに、本発明の方法により生産された融合タンパク質は宿主細胞中で分解されず且つペプチド成分自体（例えばＰＴＨまたはウロジラチン）の有意な開裂を伴わずに完全に酵素的に開裂され得ることがわかった。本発明の方法はウロジラチン、副甲状腺ホルモンまたはその断片の生産に特に適当である。アミノ酸95〜126、99〜126または102〜126のウロジラチン断片並びにアミノ酸１〜37の副甲状腺ホルモン断片が特に好ましく生産される。下記の実施例、刊行物、配列表および図面は本発明を更に説明するが、本発明の保護範囲は特許請求の範囲から発する。記載の方法は、変更後であっても本発明の内容を説明する例として理解すべきである。図１は、実施例１に従って得られるＤＮＡセグメントＡおよびＢを示す。図２は、実施例２に従って得られるＤＮＡセグメントＣおよびＤを示す。図３は、実施例４に従って得られるＤＮＡセグメントＥおよび実施例４に従って得られるＤＮＡセグメントＦを示す。実施例１エンドプロテイナーゼリンカーを含有するコアＳＡ−ＵＲＯ（95−126）の作製（ブラスミド：pSA-EK-URO）コアＳＡ：アミノ酸Met-(13-139)の短縮形ストレプトアビジンＵＲＯ（95-126）：アミノ酸95〜126のウロジラチンまたはカルジオジラチン断片〔Drummer，C．他（1993） (24)により記載された配列〕。エンドプロテイナーゼLysC開裂部位を含有するコアＳＡ−ＵＲＯ（95-126）融合タンパク質用の発現ベクターは、コアストレプトアビジン用の発現ベクターpS AM-COREを基にしている。プラスミドpSAM-COREの作製と説明はWO 93/09144(11) 中に記載されている。コアＳＡ融合タンパク質を調製するために、コアＳＡ遺伝子の終止コドンの前の３′末端に置いたユニークNheI制限開裂部位を使用する。リンカー［VDDDDK］（配列番号１）およびウロジラチン（95〜126）ポリペブチド［TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY］（配列番号２）をコードする長さ約 140 bpのＤＮＡ断片は、２本の長さ約70 bpの化学合成ＤＮＡ断片から成った。Ｅ．コリにおいて好ましく使われるコドン（Ｅ．コリのコドン使用頻度）を遺伝子デザインの際に考慮に入れ、そして各ＤＮＡセグメントの末端に適当なユニーク制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を提供した。２つの反応混合物中、相補的オリゴヌクレオチド１（配列番号３）と２（配列番号４）をＤＮＡセグメントＡ（図１）にアニールさせ、そしてオリゴヌクレオチド３（配列番号５）と４（配列番号６）をＤＮＡセグメントＢ（図１）にアニールさせ（反応緩衝液：12.5ミリモル／ｌ Tris-HCl，pH 7.0および12.5ミリモル／l MgCl₂；オリゴヌクレオチド濃度：各場合１ピコモル／60μｌ）、次いでハイブリダイゼーション生成物ＡおよびＢを各々Ｅ．コリpUCBM21ベクター（Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，Germany ）のポリリンカー領域中にサブクローニングした(ＤＮＡセグメントＡ，開裂部位：EcoRIおよびNotI；ＤＮＡセグメントＢ，開裂部位：NotIおよびHindIII)。２つのサブクローン化ＤＮＡセグメントのＤＮＡ配列をＤＮＡ塩基配列決定によって確認した。その後、コアＳＡ−ＵＲＯ（95-1 26）融合遺伝子用の発現プラスミドpSA-EK-UROを、NheI／NotI ＤＮＡセグメントＡ、NotI／HindIII ＤＮＡセグメントＢおよび約2.9 kbpのNheI／HindIII−pS AM-COREベクター断片から３断片連結において組み立てた。この方法では、ＤＮＡセグメントＡおよびＢは、対応するpUCBM21プラスミド誘導体から適当なエンドヌクレアーゼでの二重消化により単離した。制限マッピングにより所望のプラスミドpSA-EK-UROを同定し、そしてリンカー−ウロジラチン領域のＤＮＡ配列をＤＮＡ塩基配列決定により再確認した。実施例２エンテロキナーゼリンカーを含有するコアＳＡ−ＰＴＨ（1-37）融合遺伝子の作製（プラスミド：pSA-EK-PTH）ＰＴＨ（1-37）：Handy，G.N．他（1981）Proc．Natl．Acad．Sci． USA 78: 7365-7369(39)により記載されたアミノ酸配列のアミノ酸１〜37の副甲状腺ホルモン断片。エンテロキナーゼ開裂部位を含有するコアＳＡ−ＰＴＨ（1-37）融合遺伝子の発現用のベクターpSA-EK-PTHは、エンテロキナーゼ開裂部位を含有するコアＳＡ −ＵＲＯ（95-126）融合遺伝子について実施例１に記載した方策に従って調製した。２つの反応混合物において、相補的オリゴヌクレオチド５（配列番号７）と６（配列番号８）をＤＮＡセグメントＣ（図２）にアニールさせ、そしてオリゴヌクレオチド７（配列番号９）と８（配列番号10）をＤＮＡセグメントＤ（図２）にアニールさせ（反応緩衝液：12.5ミリモル／ｌ Tris-HCl，pH 7.0および12.5ミリモル／ｌ MgCl₂；オリゴヌクレオチド濃度：各場合１ナノモル／60μｌ）、次いでハイブリダイゼーション生成物ＣおよびＤを各々Ｅ．コリpUCBM21ベクターのポリリンカー領域中にサブクローニングした（ＤＮＡセグメントＣ，開裂部位：EcoRIおよびNcoI；ＤＮＡセグメントＤ，開裂部位：NcoIおよびHindIII）。２つのサブクローン化ＤＮＡセグメントのＤＮＡ配列をＤＮＡ塩基配列決定により確認した。その後、コアＳＡ−ＥＫ−ＰＴＨ（1-37）融合遺伝子用の発現プラスミドpSA-EK-PTHを、NheI／NcoI ＤＮＡセグメントＣ、NcoI／HindIII ＤＮＡセグメントＤおよび約2.9 kbpのNheI／HindIII −pSAM-COREベクター断片から３断片連結において組み立てた。この方法では、ＤＮＡセグメントＣおよびＤは、対応するpUCBM21プラスミド誘導体から適当なエンドヌクレアーゼでの二重消化により単離した。制限マッピングにより所望のプラスミドpSA-EK-PTHを同定し、そしてエンテロキナーゼリンカー−ＰＴＨ領域のＤＮＡ配列をＤＮＡ塩基配列決定により再確認した。実施例３トロンビンリンカーを含有するコアＳＡ−ＰＴＨ（1-37）融合遺伝子の作製（プラスミド：pSA-THRO-PTH）プラスミドpSA-THRO-PTHは、エンテロキナーゼリンカーコード領域をトロンビンリンカーに置き換えることにより、コアＳＡ−ＥＫ−ＰＴＨ用発現プラスミド pSA-EK-PTH（実施例２参照）から誘導される。使用するトロンビンリンカーのアミノ酸配列［GDFLAEGLVPR］（配列番号15）は、フィブリノーゲン中の天然のトロンビン開裂部位（アミノ酸位置：６〜16）およびトロンビンに対する最小認識配列（Carter，P.，Ladisch，M.R.；Willson ，R.C.；Painton，C.C.；Builder，S.E．編（1990）(12)）に基づいている。このために、プラスミドpSA-EK-PTHをNheIとPvuIIで消化し、長さ約2.9 kbpの NheI／PvuII-pSA-EK-PTHベクター断片を単離し、そして２つの相補的オリゴヌクレオチド９（配列番号11）と10（配列番号12）のハイブリダイゼーションにより調製したＤＮＡセグメントＥ（図３）に連結せしめた。所望のプラスミド構成物pSA-THRO-PTHを制限マッピングにより同定し、そして置換されたリンカー領域をＤＮＡ塩基配列決定により確認した。実施例４ＴＥＶリンカーを含有するコアＳＡ−ＰＴＨ（1-37）融合遺伝子の作製（プラスミド： pSA-TEV-PTH）プラスミドpSA-TEV-PTHは、エンテロキナーゼリンカーのコード領域をＴＥＶリンカーに置き換えることにより、コアＳＡ−ＥＫ−ＰＴＨ発現プラスミドpSA- EK-PTH（実施例２参照）から誘導される。植物ウイルスTEV NIaプロテイナーゼ（「タバコ腐食ウイルス」）はアミノ酸配列ENLYFQ ↓G/Sを認識し、GlnとGlyまたはSerとの間を開裂する（Dougherty， W.G．他（1988）(13)）。組換え生産された酵素はGIBCO BRL(Life Technologies ，Inc．Gaithersburg，MD，USA)から入手した。このために、プラスミドpSA-EK-PTHをNheIとPvuIIで消化し、長さ約2.9 kbpの NheI／PvuII−pSA-EK-PTHベクター断片を単離し、そして２つの相補的オリゴヌクレオチド11（配列番号13）と12（配列番号14）のハイブリダイゼーションにより調製したＤＮＡセグメントＦ（図３）に連結せしめた。所望のプラスミド構成物pSA-TEV-PTHを制限マッピングにより同定し、そして置換されたリンカー領域をＤＮＡ塩基配列決定により確認した。実施例５Ｅ．コリ中でのコアＳＡ融合タンパク質の発現コアＳＡ融合タンパク質の発現のために、実施例１〜４に記載の発現プラスミドpSA-EK-URO，pSA-EK-PTH，pSA-THRO-PTHおよびpSA-TEV-PTH（アンピシリン耐性）のうちの１つとlacI^qリプレッサープラスミドpUBS500（カナマイシン耐性；調製および説明はEPA 0368342を参照のこと）を用いて、Ｅ．コリK12株RM82（ED 8654のメチオニン復帰変異体、Murray，N.E.他（1977）(14)）を形質転換せしめた。 RM82/pUBS500/pSA-EK-URO，RM82/pUBS500/pSA-EK-PTH，RM82/pUBS500/pSA-THR O-PTHおよびRM82/pUBS500/pSA-TEV-PTH細胞を、50mg／mlアンピシリンと50mg／m lカナマイシンを含むＤＹＴ培地〔１％(w/v)酵母エキス、１％(w/v)バクト−トリプトン（Difco，Detroit，USA）および0.5 ％NaCl〕中で0.6〜0.9の550 nmでの光学濃度（ＯＤ_550nm）まで培養し、続いてIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）（最終濃度１〜５ミリモル／ｌ）と共にインキュベートした。４〜８時間の誘導期の後、遠心分離により細胞を回収し、細胞ペレットを25ミリモル／ｌのリン酸カリウム緩衝液pH 7.5で洗浄した。発現分析各場合に１mlの遠心済培地からの細胞ペレット（RM82/pUBS500/pSA-EK-URO，R M82/pUBS500/pSA-EK-PTH，RM82/pUBS500/pSA-THRO-PTHおよびRM82/pUBS500/pSA- TEV-PTH細胞）を0.25mlの10ミリモル／ｌリン酸塩緩衝剤，pH 6.8および１ミリモル／ｌ EDTA中に再懸濁し、そして超音波処理によって細胞を溶解させた。遠心分離後、1/5容の５×SDS試料緩衝液（１×SDS試料緩衝液：50ミリモル／ｌ Tr is-HCl，pH 6.8，1％ SDS，１％メルカプトエタノール，10％グリセロール，0.001 ％ブロモフェノールブルー）を上清に加えた。不溶性細胞破片画分を6〜8 M尿素を含有する１×SDS試料緩衝液0.3 ml中に再懸濁し、該試料を95℃で５分間インキュベートしそして遠心分離した。その後、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）〔Laemmli，U.K．(1970)(15)〕によりタンパク質を分離し、クーマシーブリリアントブルーＲ色素で染色した。Ｅ．コリ中で合成されたコアＳＡ融合タンパク質は均質であり、不溶性細胞破片画分（ＩＢ）中にもっぱら観察された。このコア−ＳＡ融合タンパク質の発現収率はＥ．コリの全タンパク質に関して30〜50％であった。実施例６細胞溶解および封入体（ＩＢ）の調製 200 g（湿重量）のＥ．コリRM82/pUBS500/pSA-EK-URO，RM82/pUBS500/pSA-EK- PTH，RM82/pUBS500/pSA-THRO-PTHおよびRM82/pUBS500/pSA-TEV-PTH細胞を１ｌの 0.1モル／l Tris-HCl，pH 7.0中に０℃で懸濁し、300 mgのリゾチームを添加し、そして０℃で20分間インキュベートした。その後、高圧分散によって機械的に細胞を完全溶解させ、２mlの１モル／ｌ MgCl₂と10mgのＤＮアーゼ（Boehringer Mannheim # 154709）を添加することによって25℃で30分以内でＤＮＡを消化した。続いて500 mlの60ミリモル／ｌ細胞溶解液に添加し、０℃で更に30分間インキュベートした。その後、不溶性成分（細胞破片とＩＢ）を遠心分離により沈澱させた。ペレットを１ｌの0.1モル／ｌ Tris-HCl，20ミリモル／ｌ EDTA pH 6.5中に懸濁し、25℃で30分間インキュベートし、そして遠心分離によりＩＢ調製物を単離した。ＩＢの可溶化 25 gのＩＢペレット（湿重量）を200 mlの10ミリモル／ｌ Tris-HCl緩衝剤、８モル／ｌ尿素、10ミリモル／ｌ EDTA pH 7.0中で25℃にて２時間攪拌することにより懸濁した。遠心分離により不溶性成分を分離し、透明な上清を更に処理した。実施例７可溶化物の希釈ポンプ（押出量：15〜40ml／時）を使って3.8 ｌの50ミリモル／ｌ Tris-HCl pH 9.0に200 mlのコアＳＡ融合タンパク質可溶化物を連続添加することにより、 BioFlo II醗酵槽（New Brunswick Scientific Co.，Inc．Edison，NJ，USA）中で希釈を行った。実施例８コアＳＡ融合タンパク質の酵素的開裂エンテロキナーゼ開裂（開裂配列ValAsp4Lys）エンテロキナーゼ開裂部位を有するコアＳＡ融合タンパク質を、0.3〜3 mg／m lの濃度および１：20〜１：250の基質／プロテイナーゼ比（エンテロキナーゼ；子ウシ腸からの制限プロテイナーゼ、Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany ）において30℃にて50ミリモル／ｌ Tris-HCl，pH 8.0中で消化し、そして酵素的開裂の時間推移（速度論）を分析用逆相HPLCにより分析した（実施例9.1参照）。このために、反応混合物から６〜24時間に渡り１〜３時間間隔で試料（10〜 100 μｌ）を取った。LysC エンドプロテイナーゼ開裂（開裂部位 Lys）コアＳＡ−ＥＫ−ＵＲＯ融合タンパク質を0.3〜3 mg／mlの濃度および１：100 0〜１：25,000の基質／プロテイナーゼ比〔リゾバクター・エンザイモゲネス（L ysobactor enzymogenes ）からのLysC−エンドプロテイナーゼ、配列分析用；Boe hringer Mannheim，Mannheim，Germany〕において30〜35℃にて50ミリモル／ｌ Tris- HCl，pH 8.0中で消化し、そして酵素的開裂の時間推移（速度論）を分析用逆相H PLCにより分析した（実施例9.1参照）。このために、反応混合物から６〜24時間に渡り１〜３時間間隔で試料（10〜100μｌ）を取った。トロンビン開裂（開裂配列 GDFLAEGLVPR）コアＳＡ−ＴＨＲＯ−ＰＴＨ融合タンパク質を0.3〜3 mg／mlの濃度および１：50〜１：500の基質／プロテイナーゼ比（ヒト血漿からのトロンビン；Boehrin ger Mannheim，Mannheim，Germany）において25〜30℃にて50ミリモル／ｌ Tris -HCl，pH 8.8中で消化し、そして酵素的開裂の時間推移（速度論）を分析用逆相 HPLCにより分析した（実施例9.1参照）。このために、反応混合物から６〜24時間に渡り１〜３時間間隔で試料（10〜100 μｌ）を取った。TEV NIa プロテイナーゼ開裂（開裂配列GluAsnLeuTyrPheGln↓Gly/Ser）コアＳＡ−ＴＥＶ−ＰＴＨ融合タンパク質を0.3〜3 mg／mlの濃度および１：5 0〜１：500の基質／プロテイナーゼ比（組換えTEV NIa 制限プロテイナーゼ，GI BCO BRL Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD，USA）において30℃にて 50ミリモル／ｌ Tris-HCl，pH 8.0，0.5ミリモル／ｌ EDTAおよび１ミリモル／ｌ DTT中で消化し、そして酵素的開裂の時間推移（速度論）を分析用逆相HPLCにより分析した（実施例9.1参照）。このために、反応混合物から６〜24時間に渡り１〜３時間間隔で試料（10〜100 μｌ）を取った。実施例９沈澱によるコアＳＡと未開裂のコアＳＡ融合タンパク質との分離遊離されたコアＳＡ担体タンパク質と未開裂のコアＳＡ融合タンパク質を、pH を下げることにより（pH＜６）開裂調製物から沈澱させた。開裂混合物を25ミリモル／ｌの最終濃度になるように１モル／ｌのクエン酸と混合し、pH 3.0に調整し、そして沈澱を遠心分離または濾過により分離した。実施例10 ペプチドＵＲＯ（95-126）およびＰＴＨ（1-37）の精製酵素的に開裂されたペプチドを当業者に周知のクロマトグラフィー法により更に精製することができる。10.1 Fractogel EMD-SO₃ 650(M)上でのカチオン交換クロマトグラフィーによるペプチドの精製 25ミリモル／ｌクエン酸，pH 3.0（1 CV/h）で平衡化したMerck Company(Darm stadt，Germany)製のFractogel EMD-SO₃-650(M)カラム（３×40cm，V=283ml）上に開裂混合物を負荷した。そして溶出液の280 nm吸光度が緩衝液のブランク値に達するまで平衡緩衝液で洗浄した。結合した物質を平衡緩衝液中の０〜１ミリモル／ｌ NaClの勾配（10〜20 CV，1 CV/h）により溶出させた。10.2 逆相HPLCによるペプチドの精製カチオン交換クロマトグラフィーによるペプチドの予備精製（実施例10.1参照）の後、１〜２mlのアリコート（約100〜300 μg）を半調製用RP-HPLCにより分画精製した。クロマトグラフィー条件：カラム：Eurospher 100-C₈，５ μｍ（４×250 mm、V= 3.17 ml）（Knauer，Berlin，Germany）試料容量：１〜２ml（100 〜300 μｇタンパク質）検出器：ＵＶ，220 nm 流速：0.5 ml／分移動相溶媒：Ａ：0.13％ TFA／H₂O Ｂ：0.1 ％ TFA，80％アセトニトリル，20％H₂O (v/v)実施例11 分析用逆相HPLC 分析用逆相HPLCはEuropherカラム（Europher 100-C₈，５μｍ，４×250 mm，V = 3.17 ml，Knauer，Berlin，Germany）を使って行った。試料容量は１〜100 μ ｇタンパク質に相当する10〜100 μｌであった。検出は220 nmでＵＶ検出器を使って行った。0.5 ml／分の流速でクロマトグラフィーを行った。移動相溶媒：Ａ：0.13％トリフルオロ酢酸／水（50分間で100→０％勾配）Ｂ：0.1 ％トリフルオロ酢酸、80％アセトニトリル、20％水（v/v）（50分間で０→100 ％勾配）。実施例12 精製したペプチドの特徴づけ精製したペプチドの素性および純度を化学合成した標準物に比較して質量分析法（PD-MSおよびレーザー脱着分光法）、分析用逆相HPLC、等電点電気泳動〔Bar k，J.E.他，J．Forensic Sci．Soc．16（1976）115-120(42)〕、SDS-PAGE〔Laem mli，U.K.，Nature 227（1970）680-685(43)〕および毛管電気泳動により調べた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年２月１７日（１９９８．２．１７）【補正内容】請求の範囲１．ペプチドの組換え生産方法であって、ストレプトアビジンと前記ペプチドを含んで成り前記ストレプトアビジンと前記ペプチドが第Ｘ因子またはトロンビンにより開裂させることができるペプチド配列を介して連結されている融合タンパク質をコードするＤＮＡを微生物中で発現させ、不溶性の不活性融合タンパク質を単離し、前記不活性融合タンパク質を変性剤を使って可溶化し、第Ｘ因子またはトロンビンにより前記融合タンパク質を開裂せしめることができるまで8.5 〜11のpH値にて前記変性剤を希釈し、前記融合タンパク質を開裂させ、開裂されたストレプトアビジンと開裂されない融合タンパク質が沈澱するまでpH値を下げ、そして上清から所望のペプチドを精製することを含んで成る方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ペプチドの組換え生産方法であって、ストレプトアビジンと前記ペプチドを含んで成り前記ストレプトアビジンと前記ペプチドがエンドプロテイナーゼにより開裂せしめることができるペプチド配列を介して連結されている融合タンパク質をコードするＤＮＡを微生物中で発現させ、不溶性の不活性融合タンパク質を単離し、前記不活性融合タンパク質を変性剤を使って可溶化し、エンドプロテイナーゼにより前記融合タンパク質を開裂せしめることができるまで8.5〜11のp H値にて変性剤を希釈し、前記融合タンパク質を開裂せしめ、開裂されたストレプトアビジンと開裂されない融合タンパク質が沈澱するまでpH値を下げ、そして上清から所望のペプチドを精製することを含んで成る方法。２．可溶化された不活性タンパク質が水性緩衝液中で希釈される、請求項１に記載の方法。３．前記ペプチドとしてウロジラチン、副甲状腺ホルモンまたはそれから誘導された断片が使われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。４．前記ペプチドとしてアミノ酸99〜126もしくは102〜126のウロジラチン（9 5〜126）の断片またはアミノ酸１〜37の副甲状腺ホルモンの断片が使われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。