JP3925982B2 - プロセッシング酵素を用いたキメラタンパク質の切断方法 - Google Patents
プロセッシング酵素を用いたキメラタンパク質の切断方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3925982B2 JP3925982B2 JP06398997A JP6398997A JP3925982B2 JP 3925982 B2 JP3925982 B2 JP 3925982B2 JP 06398997 A JP06398997 A JP 06398997A JP 6398997 A JP6398997 A JP 6398997A JP 3925982 B2 JP3925982 B2 JP 3925982B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chimeric protein
- amino acid
- arg
- peptide
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 113
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 113
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 41
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title abstract description 30
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title abstract description 30
- 238000012545 processing Methods 0.000 title abstract description 18
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 title description 21
- 230000007017 scission Effects 0.000 title description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 100
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 36
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 44
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 41
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 35
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 34
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 12
- 101001007681 Candida albicans (strain WO-1) Kexin Proteins 0.000 claims description 11
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 7
- 101001135770 Homo sapiens Parathyroid hormone Proteins 0.000 claims description 6
- 101001135995 Homo sapiens Probable peptidyl-tRNA hydrolase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000058004 human PTH Human genes 0.000 claims description 6
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 4
- 102400000322 Glucagon-like peptide 1 Human genes 0.000 claims description 3
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 claims description 3
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 claims description 3
- HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N Pro-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 3
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 claims description 3
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 claims description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims 7
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 claims 2
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical class IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims 1
- 108010091718 peptide L Proteins 0.000 claims 1
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 claims 1
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 36
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 4
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 55
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- 108010049264 Teriparatide Proteins 0.000 description 43
- OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N teriparatide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N 0.000 description 43
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 35
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 29
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 24
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 17
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 16
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 15
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 11
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 7
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 7
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 7
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 7
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 6
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 6
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 6
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 6
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 6
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 5
- RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N L-prolylglycine Chemical group [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 4
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 4
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Chemical group OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- -1 hPTH (1-37) Proteins 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910021592 Copper(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 2
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 2
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 2
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 108010073230 parathyroid hormone (1-38) Proteins 0.000 description 2
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 2
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 2
- UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N (2-chloroethyl)phosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CCCl UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-5-amino-2-[[2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N 0.000 description 1
- NGJOFQZEYQGZMB-KTKZVXAJSA-N (4S)-5-[[2-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[2-[[(1S)-4-carbamimidamido-1-carboxybutyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-4-carboxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-4-carboxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-carboxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 NGJOFQZEYQGZMB-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- QFVODVAZJVCZIQ-INNSVFCQSA-N 51257-86-4 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)OC(=O)CC[C@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)OC(=O)CC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)OC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC1N=CN=C1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 QFVODVAZJVCZIQ-INNSVFCQSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100098479 Caenorhabditis elegans glp-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 101900264058 Escherichia coli Beta-galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 101800004295 Glucagon-like peptide 1(7-36) Proteins 0.000 description 1
- 101800004266 Glucagon-like peptide 1(7-37) Proteins 0.000 description 1
- 102400000326 Glucagon-like peptide 2 Human genes 0.000 description 1
- 101800000221 Glucagon-like peptide 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000741445 Homo sapiens Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101500016415 Lophius americanus Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- PYOHODCEOHCZBM-RYUDHWBXSA-N Phe-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 PYOHODCEOHCZBM-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108700034501 Staphylococcus aureus auR Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000004690 coupled electron pair approximation Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- UKVFVQPAANCXIL-FJVFSOETSA-N glp-1 (1-37) amide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 UKVFVQPAANCXIL-FJVFSOETSA-N 0.000 description 1
- TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N glucagon-like peptide 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940045644 human calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000006713 insertion reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 108010040335 parathyroid hormone (3-34) Proteins 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000011085 pressure filtration Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000001814 protein method Methods 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M sodium;3-[[4-[(e)-[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfonatophenyl)methyl]azaniumylidene]-2-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]methyl]-n-ethyl-3-methylanilino]methyl]benzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=C1 RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/585—Calcitonins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
- C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、生理活性ペプチドまたはその前駆体を生産する際に基質となるキメラタンパク質及びその生産方法に関する。本発明はさらには、該キメラタンパク質から該生理活性ペプチドを遊離させ、精製する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
キメラタンパク質発現法による多くのペプチド生産方法が試みられている。目的ペプチドの遊離方法として、化学的あるいは酵素による切断が用いられている。酵素としては、リジン残基のC末端側のペプチド結合を特異的に切断するリシルエンドペプチダーゼ(アクロモバクタープロテアーゼ−I)、グルタミン酸残基のC末端側を特異的に切断するスタフィロコッカルプロテアーゼV8などがある。化学的方法としては、亜硝酸によるアスパラギン残基の開裂、CNBrによるメチオニン残基の開裂などがある。
【0003】
化学的方法は、目的ペプチドの修飾が避けられず、切断後の目的ペプチドの精製において種々の類似体からの精製が必要になる。一方、酵素切断方法は、特異性の高く、切断も比較的穏やかな条件で行われるため、目的ペプチドの精製が容易であるが、これらの酵素が利用可能か否かは目的ペプチドのアミノ酸配列に依存するため、既存のプロテアーゼが選択できない場合があり、汎用性の高い切断酵素が求められている。
【0004】
ペプチドホルモン及びその前駆体が生体内で生成される際、該ペプチドのプレカーサーポリペプチドが酵素(プロセッシング酵素)により特異的に切断される。該酵素には、前駆体変換酵素1/3(PC1/3)、前駆体変換酵素2(PC2)、フリン(furin)等が知られており、サッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)のα−因子(α−mating factor)の生成時に機能するKex2プロテアーゼもその一種である。これらのプロセッシング酵素をキメラタンパク質からの目的ペプチドの切り出しに直接使用すれば、ペプチドホルモンを損なわなず、かつ、多種多様のペプチドに適用できると期待できるため、このような生産方法が望まれていた。
【0005】
本発明者らは、大腸菌β−ガラクトシダーゼ由来ポリペプチドを保護ペプチドとし、適切なリンカーペプチドを選び、目的ペプチドとのキメラタンパク質を大腸菌体内で、効率的に不溶性の封入体として生産する方法を報告した(特開平5−328992)。該キメラタンパク質は、尿素等の変性剤で可溶化され、プロセッシング酵素の基質とされる。
【0006】
【関連技術】
一方、本発明者等は膜結合型酵素のサッカロマイセス・セレビジアエ由来のKex2プロテアーゼを、その遺伝子を改変することにより、可溶性酵素(分泌型Kex2誘導体)として生産する方法を報告した(「分泌型Kex2誘導体の製造方法」と題する平成8年3月4日出願の明細書)。しかし、本酵素をプロセッシング酵素として使用するにあたり、その基質となるキメラタンパク質の設計についての言及はなされていなかった。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、大量培養下、大腸菌体内で効率良く封入体として生産され、プロセッシング酵素が有効に作用する条件下で容易に可溶化されるキメラタンパク質を設計し、生産する方法、さらにはプロセッシング酵素により目的ペプチドがキメラタンパク質から効率よく切断される様に切断部位近傍のアミノ酸配列を設計し、生産する方法の開発が望まれていた。また、このようにして生産された生理活性ペプチドを99%以上の純度にまで高回収率で精製する、汎用性の高い精製方法の開発も同時に望まれていた。
従って、本発明は分泌Kex2誘導体のごときプロセッシング酵素を使用して生理活性ペプチドを生産する際に基質となるキメラタンパク質の設計、生産方法及び該ペプチドの精製方法を提供しようとするものである。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、前記の課題の解決方法を検討した結果、1)キメラタンパク質に、Hisに富む配列、例えば{(His)4 −Pro−Gly}n (n=1〜6)を含むリンカーペプチドを挿入することが生産量の増加と分泌型Kex2誘導体のごときプロセッシング酵素反応条件下での溶解性の上昇につながるという事実、2)リンカー内のプロセッシング酵素作用部位のアミノ酸配列をX1−X2−(Lys/Arg/Pro)−Argとし、望ましくは、X1としてLys、Arg又はHisを選択し、X2としてHis又はPheを選択することが、反応性の高い基質の条件であるという事実、さらに、
【0009】
3)反応後、反応液のpHを弱酸性にシフトし、さらに希釈して変性剤の濃度を低下させて目的ペプチド以外の成分のほとんどを沈殿させ、遠心分離あるいは圧搾濾過により目的ペプチドを95%以上上清に回収でき、そして例えば陽イオン交換クロマトグラフィー、低圧逆相クロマトグラフィー、逆相HPLC等を単独で又は好ましくは組合わせて使用することにより高純度かつ高回収率で目的ペプチドを精製できる、という事実を初めて明らかにし、本発明を完成した。
【0010】
従って本発明は、次の式:
A−L−B
〔式中、Aは、保護ペプチドであり;
Bは、目的ペプチドであり;そして
Lは、リンカーペプチドであって、そのC−末端部分に配列:X1 −X2 −(Pro,Lys又はArg)−Arg(式中、X1 及びX2 は任意のアミノ酸である)を有し、そしてN−末端にHisに富む部分を有する〕
【0011】
により表わされるキメラタンパク質を提供する。前記N−末端のHisに富む部分としては配列:〔(His)4 −Pro−Gly〕n (式中、nは1〜6である)が好ましく、またX1はArg,Lys又はHisであり、そしてX2はHis又はPheであることが好ましい。さらに、前記N−末端部分のアミノ酸配列と前記C−末端部分のアミノ酸配列との間に1〜5個の任意のアミノ酸が存在していてもよい。
本発明はまた、上記のキメラタンパク質の製造方法において、該キメラタンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、該培養物から前記キメラタンパク質を採取することを特徴とする方法を提供する。
【0012】
本発明はさらに、前記の目的ペプチド(B)の製造方法において、前記のキメラタンパク質にプロセッシング酵素を作用させてリンカーペプチド(L)のC−末端と目的ペプチド(B)のN−末端との間のペプチド結合を切断し、目的ペプチド(B)を得ることを特徴とする方法を提供する。
【0013】
上記の方法は、好ましい態様においては、キメラタンパク質をコードする遺伝子を発現できるベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、該形質転換体を破砕して封入体の不溶性画分を得、不溶性画分を可溶化剤で処理することで封入体中のキメラタンパク質を可溶化し、該可溶化されたキメラタンパク質の前記リンカーアミノ酸残基のC末端と前記目的ペプチドのN末端の間のペプチド結合を分泌型Kex2誘導体のごときプロセッシング酵素により切断して該目的ペプチドを切り離し、沈殿処理、陽イオン交換クロマトグラフィー、低圧逆相クロマトグラフィー及び逆相HPLCにより該目的ペプチドを精製する。
【0014】
【発明の実施の形態】
本発明の方法により、上記保護ペプチド、リンカー及び生理活性ペプチド(目的ペプチド)からなるキメラタンパク質をプロセッシング酵素により切断して、生理活性ペプチドを製造することができる。このようなペプチドとして、ヒト副甲状腺ホルモン(hPTH(1−84))及びその誘導体(hPTH(1−34)、hPTH(1−37)、hPTH(1−38))、ヒト副甲状腺ホルモンの他の誘導体(hPTH(1−31)Gly、hPTH(1−34)Gly、hPTH(1−37)Gly、hPTH(1−38)Gly、hPTH(3−84)、hPTH(3−34)、hPTH(3−37)、hPTH(3−38))、細胞増殖因子、カルシトニンおよびその前駆体、グルカゴン様タンパク質1(Glucagon-like peptide 1:GLP−1)及びその誘導体(GLP−1(1−37)GLP−1(7−37)、GLP−1(7−36)NH2 等) 等をあげることができるが、これらに限定されるものではない。
【0015】
また、プロセッシング酵素としては、Kex2プロテアーゼ、フリン(Furin)、前駆体変換酵素1(PC1)もしくは前駆体変換酵素2(PC2)又はこれらの誘導体等を使用することができるが、これらに限定されない。本発明においては特にKex2酵素のC−末端を除去することにより得られる分泌型Kex2誘導体が好ましい。
【0016】
本発明における保護ペプチドは、その大きさが220アミノ酸以下のペプチドであることが好ましい。例えば、大腸菌βガラクトシダーゼのN末端の1位から90〜210個のアミノ酸からなるものが好ましい。さらに好ましくは、大腸菌βガラクトシダーゼのN末端の1位から97位、117位又は139位からなるペプチドである。またさらに好ましくは、これらのペプチドのシステイン残基がセリン残基に置換されたものであり、最も好ましいのは、さらに14位のアルギニン残基がリジン残基に置換されたものである。また、保護ペプチド中にはプロセッシング酵素により認識される配列、例えばPro−Arg、Arg−Arg、Lys−Arg等、を含まないものが好ましく、保護ペプチド中に該認識配列がある場合には、そのような認識配列の少なくとも1つのアミノ酸を他のアミノ酸で置換し、プロセッシング酵素により認識されない配列にすることにより、プロセッシング酵素による切断を防止することができる。
【0017】
キメラタンパク質の溶解性を改善するためのリンカーアミノ酸としては、親水性のものが好ましい。目的ペプチドの種類によってキメラタンパク質の電荷が変化し、封入体生産性の低下をもたらす場合があるため、親水性アミノ酸として、封入体生産の場である菌体内の生理的pH(中性)近傍で緩衝能を持つヒスチジン残基を用いることが望ましい。さらに変性・可溶化後、リンカー部分の二次構造を緩やかなものにする目的でPro−Gly配列を挿入することが望ましい。多種の生理活性ペプチドに対応できるように、(His)4 −Pro−Glyをコードする合成DNAフラグメントを用意し、保護ペプチドをコードするDNAフラグメント中に適宜重複挿入させて、{(His)4 −Pro−Gly}n (n=1〜6)となるようにリンカーを設計することが最も好ましい。なお、以下このリンカーのN末端部分の配列をLNと記す。
【0018】
さらに、本発明者等は、大量生産可能となったサッカロマイセス・セレビジアエ由来のKex2プロテアーゼ誘導体(分泌型Kex2誘導体)が、キメラタンパク質を基質とした場合、Kex2プロテアーゼ認識部位(Lys/Arg/Pro)−Arg近傍のアミノ酸もその活性に大きく影響することを初めて明らかにした。すなわち、リンカーのC末端に位置するアミノ酸配列を、X1−X2−(Lys/Arg/Pro)−Arg(式中X1、X2は任意のアミノ酸)とし、X1にはArg、Lys又はHisを、X2にはHis又はPheを用いた場合に分泌型Kex2誘導体活性が最大となることを明らかにした。なお、以下このリンカーのC末端部分の配列をLCと記す。
【0019】
キメラタンパク質法で生産され切り出された目的ペプチドは、種々の手法で精製されるが、該キメラタンパク質を用いた場合、未反応キメラタンパク質、保護ペプチド類、大腸菌由来不純物を簡便な沈殿操作により、効率的に除去できることを明らかにした。すなわち、分泌型Kex2誘導体反応後、pHを弱酸性側にシフトし、さらに反応液を希釈して変性剤濃度を低下させることで、大腸菌由来不純物のほとんどと、未反応キメラタンパク質、保護ペプチド類を95%以上沈殿に移行させ、目的ペプチドを95%以上上清に保持でき、遠心分離あるいは圧搾濾過により目的ペプチドを含む清澄液を簡便に得られることを明らかにした。
【0020】
本上清をpH調製等の後に直接陽イオン交換クロマトに通して目的ペプチドを吸着させ、塩濃度の変化あるいはpHの変化を利用して溶出させ、さらに溶出画分を低圧の逆相クロマトに通して目的ペプチドを吸着させ、有機溶媒濃度の変化を利用して溶出かつ濃縮させた。有機溶媒濃度を低下させた後、逆相HPLCに供し、有機溶媒濃度の変化を利用して分離分画し、高純度の目的ペプチドを得た。
次に、本発明を目的ペプチドがヒト副甲状腺ホルモン誘導体hPTH(1−34)である場合を例にとって説明する。
【0021】
βGal−210SPPH84発現用プラスミドpG210ShProPTHは、まずhPTH(1−84)遺伝子を合成DNAオリゴマーの連結により作製し、次に作製した遺伝子をプラスミドpG210ShCT[G]のhCT[G]遺伝子をコードする領域と置換して作製した(図3)。hPTH(1−84)遺伝子のN末端から35番目のアミノ酸(Val)をコードするコドンを翻訳停止コドンに、βGal−210S(大腸菌β−ガラクトシダーゼのN末端1位から210位までのペプチドにおいて、システイン残基がセリン残基に置換されているペプチド)をコードする遺伝子をβGal−117S(大腸菌β−ガラクトシダーゼのN末端1位から117位までのペプチドにおいて、システイン残基がセリン残基に置換されているペプチド)をコードする遺伝子に変えたpG117SHPPH34を作製した(図6〜7)。
【0022】
同様に、βGal−210Sをコードする遺伝子に変えて、βGal−139Sをコードする遺伝子あるいはβGal−97Sをコードする遺伝子を挿入することにより、pG139SHPPH34あるいはpG97SHPPH34を作製することができる。
これらのプラスミドは、それぞれβGal−97S、βGal−117S及びβGal−139Sをコードする構造遺伝子と誘導体hPTH(1−34)の構造遺伝子とがリンカーペプチドPhe−Met−Lys−Ser−Val−Lys−Lys−Argを介して連結されており、このキメラタンパク質をコードする構造遺伝子はlacプロモーターの制御下にある。またこのプラスミドはテトラサイクリン耐性遺伝子マーカーを含有する。
【0023】
βGal−97SPPH34は分泌型Kex2誘導体反応条件下での溶解度が高かったが生産量が少なく、βGal−117SPPH34とβGal−139SPPH34は、生産量は多かったが該条件下での溶解性が低下し、キメラタンパク質から誘導体hPTH(1−34)を切り出すためには、より多くの分泌型Kex2誘導体が必要であった。そこで、生産量が多く尿素溶液の溶解度が高いキメラタンパク質を得るため、前記保護ペプチドとリンカーMet−Ser−Val−Lys−Lys−Argの間に、親水性かつ中性付近で緩衝能を持ち、キメラタンパク質の二次構造形成を阻害するアミノ酸からなるリンカーLNを挿入した。
【0024】
LNとしては、{(His)4 −Pro−Gly}n (n=1〜6)からなるペプチドを用いた。{(His)4 −Pro−Gly}n (n=1〜6)の導入は、(His)4 −Pro−Glyまたは{(His)4 −Pro−Gly}2 をコードするDNAフラグメントを合成し、保護ペプチドをコードするDNAフラグメントの3’末端部分に適当なモル比で挿入反応させることで行い、前記アミノ酸配列を一つまたは複数個含有したリンカーペプチドを含むキメラタンパク質をコードする遺伝子を作製することができる。
【0025】
なお、DNAフラグメントが反転して挿入されたものもは、DNA塩基配列分析で確認し、除外した。これらのキメラタンパク質をコードするプラスミドで大腸菌M25株を形質転換し、キメラタンパク質の生産性を見た(図8)。その結果、保護ペプチドβGal−97SおよびβGal−139Sの場合はn=3で、βGal−117Sの場合はn=1〜6で、キメラタンパク質の生産量が高いことがわかった。また、これらキメラタンパク質の封入体を菌体破砕、遠心分離により洗浄単離し、尿素で可溶化・希釈して、Kex2−660反応に供した(図9)。
【0026】
その結果、{(His)4 −Pro−Gly}n (n=1〜6)の導入により、すべてのキメラタンパク質がKex2−660に対して感受性が高くなっていることがわかった。そこで、キメラタンパク質生産量、Kex2−660に対する反応性、および保護ペプチドの大きさを考慮し、hPTH(1−34)生産用のキメラタンパク質には、保護ペプチドとしてβGal−117S、リンカーペプチドLNとして(His)4 −Pro−GlyからなるβGal−117S4HPPH34を採用した。
【0027】
以上の結果より、分泌型Kex2誘導体により生理活性ペプチドを切り出すためのキメラタンパク質の設計として、大腸菌体内での生産性のみならず分泌型Kex2誘導体反応条件下での溶解性を改善するために、{(His)4 −Pro−Gly}n (n=1〜6)なるペプチドを挿入することが適していることを明らかにした。
本過程では、分泌型Kex2誘導体がモル比でキメラタンパク質の1/1000程度必要であり、製造原材料費の大半を占めていた。そこで、さらに、分泌型Kex2誘導体により切断されやすいキメラタンパク質を設計する必要があった。βGal−117S4HPPH34の分泌型Kex2誘導体認識部位は、ヒト副甲状腺ホルモン前駆体のプロ配列Lys−Ser−Val−Lys−Lys−Argを使用した。
【0028】
しかし、この配列が分泌型Kex2誘導体による切断に最適か否かは不明であり、多くの他のプロテアーゼに見られるように最適化によりさらに切断効率が増加する可能性が考えられる。認識部位のC末端側にはhPTH(1−34)が続いているのでアミノ酸の置換はできないが、N末端側の配列は新たに認識部位を創生しなければ任意に選択できる。そこで基質であるキメラタンパク質のP3部位(X2)を任意のアミノ酸に変換することを試みた。図10に示す18種類のアミノ酸配列について検討した結果、X2にHisまたはPheを導入すると、キメラタンパク質からのhPTH(1−34)の切り出し効率が良くなることが判明した。
【0029】
次に、副反応が少なかったHisをX2に固定して、P4部位(X1)を図11に示す20種類のアミノ酸配列について検討した結果、X1にArg、LysまたはHisを導入すると、キメラタンパク質からのhPTH(1−34)の切り出し効率が良くなることが判明した。このうち最も切り出し効率が良かった、Arg−His−Lys−ArgをLCに選んだ。
さらに本研究の過程で、βGal−117Sの13、14位に存在するArg−Arg配列のC末端側のペプチド結合が分泌型Kex2誘導体により切断され、この結果生じるβGal(1−14)が、後の酸性沈殿による精製工程において、hPTH(1−34)と同じ上清画分に回収されることが判明したので、14位のArgをLysに置換して切断を抑制し、βGal(1−14)の生成を抑えた。
【0030】
以上の結果より、hPTH(1−34)生産用キメラタンパク質には、保護ペプチドとして14位のArgをLysに置換したβGal−117S(βGal−117KS)を、リンカーペプチドとしてPro−His−His−His−His−Pro−Gly−Gly−Arg−Pro−Ser−Arg−His−Lys−Argなるアミノ酸配列を有するペプチドを採用した。
【0031】
次に本発明者等は、このようにして設計したキメラタンパク質βGal−117KS4HRHPH34を大腸菌で発現させ、封入体として洗浄回収後可溶化し、分泌型Kex2誘導体反応に供したのち精製方法を検討した。大腸菌由来不純物、未反応キメラタンパク質や保護ペプチドを含むペプチドは、中性から弱酸性で溶解性が極端に低下することを利用して、pHを分泌型Kex2誘導体反応至適pHの7.8〜8.2から6.2〜6.5へシフトすることで沈殿させることができた。
【0032】
さらに、変性剤(尿素)濃度を希釈により低下させることでほとんどの不純物を沈殿させ得た。遠心分離または圧搾濾過により沈殿を除去し、hPTH(1−34)を効率よく上清に回収した。上清をpH5.0に調整後陽イオン交換クロマト(例えば、PorosHS 、SPトヨパール)にhPTH(1−34)を吸着させ、0.3M〜0.4MのNaClで溶出させた。溶出液に酢酸を添加し、低圧逆相クロマト(例えば、PorosR2 、SokenODS - W)にhPTH(1−34)を吸着させ、30%程度のアセトニトリルで溶出させ、濃縮及び逆相HPLCに悪影響を与える不純物の除去を行った。
【0033】
溶出液中のアセトニトリルを減圧蒸留で除き、0.22μmのフィルターで濾過し、逆相HPLC(例えば、InertsilPrepODS 、TSK-ODS-120T)にhPTH(1−34)を吸着させ、アセトニトリルのグラジエント溶出にて分画し、高純度の画分を集め、純度99.5%のhPTH(1−34)を回収率40%〜70%で分取した。以上の結果から、この回収率は今まで報告されている中で最も高く、本発明の有用性が実証された。
【0034】
【実施例】
実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下本発明のための材料として用いたプラスミド、大腸菌、各実施例に共通な基本的な実験操作ついて述べる。
【0035】
プラスミド
プラスミドpG210ShCT[G]は、β−ガラクトシダーゼのN末端1位から210位までのアミノ酸からなるペプチドのうち、76位、122位及び154位のシステイン残基がセリン残基に置換されているもの(βGal−210S)にグルタミン酸残基を介して、hCT[G](ヒトカルシトニンの32位のアミノ酸のC末端にグリシン残基が付加したペプチド)が結合したキメラタンパク質を大腸菌ラクトースオペロンのプロモーター(lacプロモーター)により発現できるプラスミドである。
【0036】
pGHα210(Ser)rop- を制限酵素PvuIIとEcoRIで消化して得られるβGal−210Sの一部をコードする遺伝子を含むDNAフラグメントとpG97S4DhCT[G]を制限酵素PvuIIとEcoRIで消化して得られるベクター部分を含むDNAフラグメントと連結して作製した(図13)。なお、pGHα210(Ser)rop- の作製方法については特公平6−87788に開示され、プラスミドpG97S4DhCT[G]を含有する大腸菌W3110株は、Escherichia coli SBM323と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号:微工研条寄第3503号(FERM BP−3503)として1991年8月8日に寄託されている。
【0037】
プラスミドpG210ShCT[G]に目的とするペプチドをコードするDNA領域を読み枠を合わせてEco RI−Sal I DNAフラグメントとして導入すれば、βGal−210Sとのキメラタンパク質を発現することができる。合成ヒト副甲状腺ホルモン前駆体(hProPTH(1−84))遺伝子のクローニングおよびプラスミドpGP#19の作製の材料として用いた(図3)。
【0038】
大腸菌
大腸菌JM109株はコンピテントセルの状態で東洋紡(株)から購入し、プラスミドの調製に利用した。大腸菌M25株(W3110/ompT:Sugimura et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 153 、753-759 、1988)は、キメラタンパク質の発現に利用した。
【0039】
培地
大腸菌の培養には以下の培地を用いた。
SB培地:0.5%(w/v)グリセロール、2.4%(w/v)酵母エキス、1.2%(w/v)トリプトン、0.1Mリン酸水素カリウム緩衝液(pH7.5)
NU1合成培地:0.4%(w/v)酵母エキス、0.4%(w/v)K2 HPO4 、0.4%(w/v)KH2 PO4 、0.27%(w/v)Na2 HPO4 、1.2%(w/v)(NH4 )2 SO4 、0.02%(w/v)NH4 Cl、0.3%(w/v)L−メチオニン、0.2%(w/v)MgSO4 ・7H2 O、40mg/L FeSO4 ・7H2 O、40mg/L CaCl2 ・2H2 O、10mg/L AlCl3 ・6H2 O、10mg/L CoCl2 ・6H2 O、2mg/L ZnSO4 ・7H2 O、2mg/L Na2 Mo4 ・2H2 O、1mg/L CuCl2 ・2H2 O、0.5mg/L H3 BO3 および10mg/L MnSO4 ・nH2 O。
【0040】
基本的な実験操作
具体的に実施例に示さない場合は、実験操作は以下の方法に従った。
DNAプライマーは、フォスホアミダイド法による全自動合成機(アプライドバイオシステムズモデル320A)で合成した。DNA塩基配列はジデオキシ法で決定した。
DNA切断は購入先の指定する3〜10倍量の制限酵素を用いて1時間反応させた。プラスミド構造の解析は0.5〜1μgのDNAを用いて20μl反応液中で行い、DNAの調製には3〜10μgのDNAを用いて50〜100μl反応液中で行った。反応温度、反応バッファー等の条件は購入先の指定に従った。
【0041】
アガロースゲル電気泳動サンプルは、反応液に1/5容量の色素液(0.25%(w/v)ブロムフェノールブルーを含む15%(w/v)Ficoll水溶液)を加え調製した。アガロースゲル電気泳動用バッファーにはTAEバッファー(40mMTris/酢酸、2mM EDTA)を用いた。プラスミドの構造解析にはMupid−2(コスモバイオ(株))を用いて100ボルト1時間の泳動を行ない、DNAの調製のためには水平ゲル(20 cm x 15 cm x 0.7 cm)を用いて150ボルト4時間または35ボルト13時間の泳動を行なった。ゲルはエチジウムブロミド水溶液(0.5μg/ml)で20分染色した後、紫外線照射してDNAバンドを検出した。アガロースゲル濃度は、分画するDNAフラグメントの大きさに合わせて、1.0、2.0%(w/v)を用いた。
【0042】
アガロースゲル中のDNAは、0.1×TAEバッファーを満たした透析チューブ内にゲルを入れ電圧をかけて溶出させ、ゲルから抽出した。DNA溶液をフェノール処理、クロロホルム処理後、エタノール沈殿を行い、DNAを精製した。
ライゲーション反応は、0.05〜1μgのDNAフラグメントを含む反応液(67mMTris/HCl(pH7.5)、5mM MgCl2 、5mM DTT、1mM ATP)30μlに10単位のT4DNAライゲースを加え、16℃で12〜18時間反応を行うか、TAKARA ligation Kit (宝酒造(株))を用いて行なった。
【0043】
大腸菌JM109株の形質転換法は購入先の指示に従い、大腸菌M25株の形質転換法は塩化カルシウム法に準じて行い、形質転換株は薬剤耐性(テトラサイクリン)で選択した。
SDS−ポリアクリルアミド電気泳動(SDS−PAGE)サンプルは、同量のSDSサンプルバッファー(63mMTris/HCl(pH6.8)、10%(w/v)グリセロール、10%(w/v)SDS、10μg/mlブロムフェノールブルー)を加え、3分間煮沸し調製した。電気泳動は、16%(w/v)SDSPAGEmini(TEFCO )ゲルを用いて1枚あたり20mAで70分間行い、ゲルはクマジーブリリアントブルーGで染色した。
【0044】
hPTH(1−34)の定量は、まず、hPTH(1−34)を含む溶液をサンプルバッファー(1M酢酸/2M尿素)で10倍から20倍に希釈後、遠心上清を得、次に、これをYMC−ODS−A302(d4.6mmX150mm)カラム((株)山村化学研究所)を接続したHPLC島津製作所(株)LC10A )に供し、A液(0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸(TFA)/10%(v/v)アセトニトリル)、B液(0.094%(v/v)TFA/50%(v/v)アセトニトリル)、B40%→80%/20min勾配の系にて展開し、214nmの吸光度測定にて検出されたhPTH(1−34)のピーク面積を既知濃度の標準hPTH(1−34)のピーク面積と比較し行った。
その他、別途表示する以外は基本的な遺伝子操作はMolecular Cloning (Maniatisら編、Cold Spring Harbor laboratory 、New York(1982))に記載の方法に従って行なった。
【0045】
実施例1.hProPTH(1−84)遺伝子の作製
hProPTH(1−84)遺伝子は、図1に示すようにU1〜U7(配列番号1〜7)およびL1〜L7(配列番号8〜14)の14本のフラグメントに分け、合成した。
hProPTH(1−84)遺伝子は、各フラグメントを以下のように連結し、作製した(図2)。
【0046】
まず、DNAフラグメントU1(配列番号1)とL7(配列番号14)(各々約1μg)を16単位のT4ポリヌクレオチドカイネースと0.5nM(1MBq以上)の[γ−32P]dATPを含むリン酸化反応液15μl中(50mM Tris/HCl(pH7.6)、10mM MgCl2 、5mM DTT)で37℃、15分間反応させた。これに5mM ATPを含むリン酸化反応液5μlを加え、さらに37℃で45分間反応させた。U2(配列番号2)とL6(配列番号13)、U3(配列番号3)とL5(配列番号12)、U4(配列番号4)とL4(配列番号11)、U5(配列番号5)とL3(配列番号10)、U6(配列番号6)とL2(配列番号9)、およびU7(配列番号7)とL1(配列番号8)についても同様に行った。
【0047】
上述の7個の反応液をひとつにまとめ、エタノール沈殿を行いDNAを回収した。これを80μlの100mM Tris/HCl(pH7.6)、6.5mM MgCl2 、300mM NaClに溶解した。このうち40μlを95℃に5分間放置した後、30分かけて43℃まで温度を下げた。氷冷後40μlのライゲーションB液(宝酒造(株))を加え、26℃に15分放置した。
このサンプルを5%ポリアクリルアミド電気泳動に供した。泳動後、オートラジオグラフィーで、連結したDNAフラグメントを検出した。約280bpに対応するDNAフラグメントをゲルから抽出後、定法に従い精製した。
【0048】
実施例2.βGal−139S(FM)PPH84発現プラスミドpGP#19の作製
合成hProPTH(1−84)遺伝子を含む約280bpのDNAフラグメントには、5’末端には制限酵素Eco RI 部位が3’末端には制限酵素Sal I 部位が存在する。hProPTH(1−84)遺伝子のクローニングはこのEco RI/Sal I DNAフラグメントをpG210ShCT[G]のEco RI/Sal I 部位に挿入し、行った。
【0049】
pG210ShCT[G]を制限酵素Eco RIとSal I で切断後、ベクター部分を含む約3.5kbDNAフラグメントを調製した。これと実施例1で得られた約280bpからなるhProPTH(1−84)遺伝子のDNAフラグメントを連結し、プラスミドpG210ShProPTHを得た(図3)。pG210ShProPTHを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、JM109[pG210ShProPTH]を得た。
さらに、pG210ShProPTHの制限酵素XhoI /EcoRI 部位にリンカーKM091(配列番号15)及びKM092(配列番号16)を導入し、プラスミドpG210S(S/X)を作製した(図3)。なお、このリンカーは、両端に制限酵素XhoIとEcoRI 部位を、その間にSac I 部位を持つ。
【0050】
pG210S(S/X)は、制限酵素Sac I およびXho I で消化後、Kilo-Sequence 用 Deletion Kit (宝酒造(株))を用いて、βGal−210SをコードするDNA領域を経時的かつ特異的に欠失させた。Klenowフラグメントで末端修復をおこなったのち、セルフライゲーションを行ない、βGal−139SとhProPTH(1−84)がPhe−Metを介して連結されたキメラタンパク質βGal−139S(FM)PPH84をコードするプラスミドpGP#19を得た(図4)。pGP#19を導入した大腸菌JM109株をJM109[pGP#19]と呼ぶ。
【0051】
実施例3.βGal−117SmHPPH34発現プラスミドpG117SmHPPH34の作製
本実施例においては、βGal−117SmHPPH34発現プラスミドpG117SmHPPH34の作製を例に挙げるが、βGal−117Sに変えてβGal−97SあるいはβGal−139Sを用いることにより、βGal−97SmHPPH34発現プラスミドpG97SmHPPH34あるいはβGal−139SmHPPH34発現プラスミドpG139SmHPPH34を作製することができる。
【0052】
1)pGP#19PPH34の作製
pGP#19PPH34は、pGP#19を鋳型にS01(配列番号17)およびS02(配列番号18)をプライマーとして、PCR法により、hPTH(1−84)の35位のバリン残基のコドンGTTを翻訳停止コドンTAAに変換したDNAフラグメントを増幅後、常法により制限酵素 Aat II −Sal I DNAフラグメントを単離精製し、pGP#19の対応する部分と交換して作製した(図5)。
【0053】
2)pG117SPPH34の作製
pG210(S/X)を鋳型にS03(配列番号19)とS05(配列番号20)をプライマーとしてPCR法により増幅後、制限酵素 Pvu IとSma I で消化したDNAフラグメント、pGP#19PPH34を鋳型にS07(配列番号21)およびS02をプライマーとしてPCR法により増幅後、制限酵素Sal I とSma I で消化したDNAフラグメント、並びにpGP#19PPH34の複製開始起点を含む制限酵素 Pvu I-Sal I DNAフラグメントをT4ライゲースで連結し、pG117SPPH34を作製した(図6〜7)。
【0054】
3)pG117SmHPPH34(m=4又は8)の作製
pG117SmHPPH34(m=4又は8)は、pG117SPPH34の制限酵素Sma I 部位に(His)4 −Pro−GlyをコードするリンカーS08(配列番号22)とS09(配列番号23)、および{(His)4 −Pro−Gly}2 をコードするリンカーS10(配列番号24)とS11(配列番号25)を挿入し作製した。なお、リンカーの長さを変えることにより、m=12、16又は24であるプラスミドを作ることができる(図6〜7)。
【0055】
さらに、pG117SPPH34の制限酵素Sma I 部位に(Lys)4 −Pro−GlyをコードするのリンカーS12(配列番号26)とS13(配列番号27)を挿入し、pG117S4KPPH34を作製した。同様にして、pG97S4KPPH34、pG139S4KPPH34を作製することができる。
また、挿入されたリンカーの数および方向は、プラスミドを調製後、DNA塩基配列を決定し、確認し、本実施例において作製したキメラタンパク質を表1に示した。
【0056】
【表1】
【0057】
実施例4.hPTH(1−34)キメラタンパク質の生産
表1に示したキメラタンパク質の生産性をSDS−PAGEを用いて調べた。表1に示したキメラタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミド16個をそれぞれ大腸菌JM109株に導入し、2mlのSB培地で37℃16時間試験管で振盪培養後、生理食塩水にて希釈し、培養液濁度(OD660)を10とした。この懸濁液100μlに同量のSDSサンプルバッファーを加え、3分間煮沸し、その上清10μlを用いてSDS−PAGEを行い、各菌体あたりのキメラタンパク質生産量を比較した。
【0058】
結果を図8に示す。その結果、β−ガラクトシダーゼ誘導体とヒスチジン残基の数の組み合わせにより発現量が変化し、βGal−97Sでは、{(His)4 −Pro−Gly}n においてn=2、3、βGal−117Sでは、n=1、2、3、4、6、βGal−139Sでは、n=2、3で高生産性を獲得したことがわかった。特にβGal−117Sの誘導体においては{(His)4 −Pro−Gly}n (n=1〜6)の導入により発現量が顕著に増加し、これらの生産量はリジン残基によって単に電荷を変えたものより多かった。
【0059】
実施例5.キメラタンパク質からのhPTH(1−34)切り出し
高生産量のキメラタンパク質(βGal−97SmHPPH34(m=12)、βGal−117SmHPPH34(m=0、4、8、12、16、24)、βGal−139SmHPPH34(m=0、12);m=0はコントロール)について、Kex2−660の基質としての適性を調べるため、キメラタンパク質封入体を回収し、8M尿素で溶解後反応液組成(20mMTris/HCl(pH8.2)、100mM NaCl、3.0M尿素、2.0mM CaCl2 、8mg/mlキメラタンパク質)になるように希釈し、Kex2−660を終濃度20kU/mlとなるように添加して、hPTH(1−34)の切り出しを行った。本条件下、1時間でコントロールのβGal−117SPPH34は90%以上切断された。
【0060】
各誘導体のKex2−660反応性は、pG117SPPH34のkcatとの比をもって図9に示した。hPTH(1−34)の定量は[基本的な実験操作]に示した方法で行った。この結果、実施したすべての例で{(His)4 −Pro−Gly}n (n=1〜6)の導入によりKex2−660反応性も改善されることがわかった。
特に、βGal−117S4HPPH34は、1個の(His)4 −Pro−Glyリンカーの挿入で、キメラタンパク質の生産量とKex2−660反応性が改善され、さらにKex2反応条件下での溶解度も15g/L以上でβGal−139SPPH34の8g/Lに比べて改善されていることがわかった。
【0061】
実施例6.hPTH(1−34)の大量生産
高発現かつKex2−660の基質としても適していたキメラタンパク質βGal−117S4HPPH34を大量に得るため、本キメラタンパク質をコードする遺伝子を有するプラスミドpG117S4HPPH34で大腸菌M25株(W3110/ompT)を形質転換し、M25[pG117S4HPPH34]株を得た。M25[pG117S4HPPH34]株は、2%(w/v)酵母エキス、1%(w/v)トリプトン、1.2%(w/v)K2 HPO4 、0.3%(w/v)KH2 PO4 、0.5%(w/v)グリセロールからなる培地を用い、20L培養槽にて37℃で培養した。
【0062】
菌体濃度がOD660=1.0のときにIPTG(イソプロピルベータチオガラクトシド)を最終濃度1mMとなるように添加し、菌体濃度がOD660=12まで培養を継続した。集菌後、TE(10mMTris/HCl、1mM EDTA(pH8.0))に懸濁し、高圧ホモジナイザー(Manton-Gaullin)による菌体破砕、遠心分離、TEおよび脱イオン水での懸濁洗浄を行って、封入体約100gを得た。封入体懸濁液(160g/L)250mlに、1M Tris/HCl(pH8.2)100ml、5M NaCl 50ml、脱イオン水500ml、尿素900gを加えて30℃の恒温槽中30分撹拌溶解し、暖めた脱イオン水で希釈し、30℃で5Lとした。
【0063】
これに250mM CaCl2 溶液50mlを撹拌しながら穏やかに添加し、さらにKex2−660を20kU/mlとなるように加えた。2時間後、(切断率は90%以上)酢酸にてpHを6.4に合わせ、さらに脱イオン水で2倍に希釈し、未反応キメラタンパク質および保護ペプチドを凝集沈殿させた。遠心分離によりhPTH(1−34)を含む上清を得、酢酸にてpHを5.0とし、10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)で平衡化した陽イオン交換樹脂(SPトヨパール)カラムを通してhPTH(1−34)を吸着させ、0.4M NaClで、hPTH(1−34)を溶出させた。
【0064】
これに酢酸を最終3%(v/v)となるように添加し、3%(v/v)酢酸で平衡化した低圧逆相カラム(SokenODS-W)を通してhPTH(1−34)を吸着させ、3%(v/v)酢酸を含む30%(v/v)アセトニトリル溶液でhPTH(1−34)を溶出させた。減圧下でアセトニトリルを除き、0.22μmのメンブレンフィルターでろ過して、逆相HPLC分取カラム(TSKgelODS120T Φ55X600)にて精製した。溶出は、アセトニトリルの直線濃度勾配(A:5%(v/v)酢酸/10%(v/v)アセトニトリル;B:5%(v/v)酢酸/40%(v/v)アセトニトリル;%B=20%→80%/60分、流速40ml/分)で溶出した。各工程でのhPTH(1−34)回収率を表2に示した。
【0065】
【表2】
【0066】
実施例7.キメラタンパク質のKex2−660認識部位P3のアミノ酸置換
P3部位のアミノ酸(Lys)を他のアミノ酸に変換するため、P3部位に対応するコドンを変換したオリゴヌクレオチドS14〜S18(配列番号28〜32)を合成し、これらとS02(配列番号18)をプライマーに、pG117S4HPPH34を鋳型として、PCR法にてDNAフラグメントを合成した。該DNAフラグメントを、エタノール沈殿法にて精製し、Stu I およびSal I で切断後、2.0%(w/v)アガロース電気泳動を行い、目的とする0.4kbpのStu I-Sal I フラグメントを精製した。
【0067】
次に該DNAフラグメントと、Stu I およびSal I で消化し同様に精製したpG117S4HPPH34のβガラクトシダーゼ部分をコードするDNAフラグメントとをライゲーション反応に供した。反応後、大腸菌JM109株を形質転換し、テトラサイクリン耐性株を取得した。各組み合わせ毎に形質転換体を10個選択し、培養後、プラスミドを調製し、変異導入部分のDNA塩基配列を決定、P3部位アミノ酸が以下のアミノ酸に置換した遺伝子を含むプラスミドを持つクローンを選択した。
【0068】
すなわち、pG117S4HPPH34のコードするキメラタンパク質のKex2−660認識部位Ser−Val−Lys−Lys−ArgがSer−Val−X−Lys−Arg(X=Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg、Phe、Tyr、Trp、His、Pro)に置換されたアミノ酸配列を持つキメラタンパク質βGal−117S4HVXPH34の発現ベクターpG117S4HVXPH34を得た。
【0069】
各キメラタンパク質とKex2−660反応性を調べるため、各クローンを50mlのSB培地で培養し、菌体濃度がOD660=1.0の時にIPTGにて発現を誘導後、さらに4時間培養を続け、集菌、TE緩衝液洗浄、懸濁、破砕、遠心分離を行い、封入体を得た。さらに各封入体を1%(w/v)TritonX100、10mM EDTAおよびTEで洗浄し、精製した封入体を得た。
該封入体に含まれるペプチド成分の90%以上が目的とするキメラタンパク質であった。各キメラタンパク質の封入体懸濁液に、1M Tris/HCl(pH8.2)20μl、5M NaCl 20μl、10M尿素300μlを加えて溶解し、脱イオン水650μlで希釈後、30℃の恒温槽中で10分保温し、これに250mM CaCl2 溶液10μlを添加し、さらにKex2−660を20kU/mlとなるように加えた。
【0070】
本条件下、1時間でコントロールのβGal−117SPPH34は90%以上切断された。hPTH(1−34)の生成は、前述のODSカラムを用いたHPLCで定量した。各誘導体のKex2−660反応性は、pG117S4HPPH34のkcatとの比をもって示した(図10)。X=Phe、Hisのときには、Kex2−660によるhPTH(1−34)の切り出し効率が良くなり、X=ProではKex2−660によりhPTH(1−34)がほとんど切り出されないことが明らかになった。
【0071】
実施例8.キメラタンパク質のKex2−660認識部位P4のアミノ酸置換
実施例7の結果および、切断時の副生成物の少ないことから、P3部位にヒスチジン残基を持つキメラタンパク質βGal−117S4HVHPH34をhPTH(1−34)生産のためのキメラタンパク質として選び、P4部位のアミノ酸置換によるKex2−660反応性のさらなる向上を試みた。オリゴヌクレオチドS19〜S24(配列番号33〜38)を合成し、これらとS02をプライマーとし、pG117S4HVHPPH34を鋳型として、PCR法にて変異が導入されたDNAフラグメントを合成した。
【0072】
実施例7に示した方法で、キメラタンパク質のKex2−660認識部位Ser−Val−His−Lys−ArgがSer−X−His−Lys−Arg(X=Gly、Ala、Leu、Ile、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg、Cys、Met、Phe、Tyr、Trp、His、Pro、Val)に置換された構造を持つキメラタンパク質βGal−117S4HXHPH34の発現ベクターpG117S4HXHPH34が得られた。
【0073】
該キメラタンパク質を基質として実施例6と同じ条件でKex2−660に対する感受性を判断した。X=Lys、Argのときには、Kex2−660によるhPTH(1−34)の切り出し効率が良くなり、X が酸性アミノ酸(Asp、Glu)の時にはKex2−660によりhPTH(1−34)がほとんど切り出されないことが明らかになった(図11)。これにより、Kex2−660プロテアーゼは、P1部位にアルギニン残基、P2部位に強塩基性アミノ酸又はプロリン残基を要求するだけでなく、P3部位にヒスチジン残基又はフェニルアラニン残基、P4部位に強塩基性アミノ酸を好むことおよび、P3部位にプロリン残基が、またはP4部位に酸性アミノ酸があると該キメラタンパク質切断活性が極端に低下することが初めて明らかになった。
【0074】
実施例9.保護ペプチドのKex2−660切断部位の除去
実施例7及び8におけるKex2−660切断反応を経時的にHPLCにて追跡した結果、保護ペプチドβGal−117Sの13、14位のArg−Arg配列のC末端側のペプチド結合が切断されることが判明した。これにより、生じるβGal(1−14)は、hPTH(1−34)を酸性沈殿により精製する時に混入することが予想された。そこで、14位のArgをLysに置換し、Kex2−660による切断を抑制し、βGal(1−14)の生成を抑えることを試みた。
【0075】
14位のArgをLysに置換したキメラタンパク質(βGal−117KS4HRHPH34)をコードするプラスミドpGKSPH34(図12)を以下のように作製した。まず、オリゴヌクレオチドS25(配列番号39)とS26(配列番号40)をプライマーとし、pG117S4HRHPH34を鋳型として、PCR法にて変異が導入されたDNAフラグメント、Ase I-RKを合成した。同様にオリゴヌクレオチドS27(配列番号41)とS28(配列番号42)をプライマーとし、DNAフラグメント、RK-Bgl II を合成した。
【0076】
各DNAフラグメントを精製し、各々約1ngずつを混合し、プライマー非存在下でPCRを4回行い、変異が導入された、Ase I-Bgl IIフラグメントを合成した。これに再度オリゴヌクレオチドS25とS28を添加してPCRを継続し、同フラグメントを増幅した。本フラグメントをエタノール沈殿法にて精製し、Ase I およびBgl IIで切断後、2.0%(w/v)アガロース電気泳動を行い、目的とする0.35kbpのフラグメントを調製した。pG117S4HRHPH34のAse I / Sph I (1.8kbp)フラグメントおよびSph I / Bgl II(1.4kbp)フラグメントを、1.0%(w/v)アガロース電気泳動を行い、精製した。
【0077】
上記3フラグメントをライゲーション反応後、大腸菌JM109を形質転換し、テトラサイクリン耐性株を取得し、プラスミドをアルカリ法にて調製後、変異導入部分のDNA塩基配列を解析し、保護ペプチド14位のArgをコードするDNA配列CGGをAAGに置換した遺伝子を含むプラスミドpGKSPH34を持つ目的クローンを選択した。実施例5に示した方法で、キメラタンパク質の封入体を取得し、Kex2−660反応に供した結果、この置換によりほぼ完全に保護ペプチドの切断が抑制され、精製工程の負担を軽減できることが判明した。
【0078】
実施例10.キメラタンパク質βGal−117KS4HRHPH34の大量調製とhPTH(1−34)の生産
試験管レベルでKex2−660の基質として最適と考えられたキメラタンパク質βGal−117KS4HRHPH34の大量培養条件下における生産性とKex2−660プロテアーゼによる切り出し、およびhPTH(1−34)の精製を行った。
pGKSPH34にて、大腸菌M25株を形質転換し、テトラサイクリン耐性株を取得し、生産株M25[pGKSPH34]を作製した。M25[ pGKSPH34]株を2%(w/v)グルコースを含むNU1合成培地にて大量培養を行った。
【0079】
グルコース消費後は、炭素源としてグリセロールをフィードし、pHを7.0にコントロールしながら、24時間培養を行った。最終到達菌体濃度は、150−200ODであった。該キメラタンパク質は、大量培養条件下でも安定した生産性を示し、大量発現にも関わらず、顕著な宿主大腸菌の生育阻害は見られなかった。封入体生産量は約5g/L培地であった。菌体破砕後の不溶性画分をTEおよび脱イオン水で洗浄して精製封入体を得た。
【0080】
尿素で可溶化した後希釈して、反応液組成を20mM Tris/HCl(pH8.2)、50mM NaCl、2.5mM CaCl2 、2.7M尿素、8.0mg/mlキメラタンパク質とし、反応温度30℃でKex2−660を5kU/mlになるように添加し、キメラタンパク質からhPTH(1−34)の切り出しを行い、hPTH(1−34)の生成を定量した。30分で切断率90%以上となり、βGal−117S4HPH34と比較して、Kex2−660量が1/4に減少した。反応終了後、実施例5と同様にhPTH(1−34)精製した。精製工程の回収率は実施例5の場合とほぼ同様であった。
実施例11.βGal−117S4HGP生産プラスミド、pG117S4HGPの作製
グルカゴン様ペプチドI(hGLP−1(7−37))を含むキメラタンパク質(βGal−117S4HGP)を生産するプラスミド、pG117S4HGPは以下の手順で作製した。まず、図14(a)に示す4つのDNA(GLP−1(配列番号:43),GLP−2(配列番号:44),GLP−3(配列番号:45),GLP−4(配列番号:46)を合成し、それらの5′末端をT4ポリヌクレオチドカイネースを用いてリン酸化後、これらを混合し、アニーリングさせて、hGLP−1(7−37)遺伝子(DNA(I))を調製した。一方、図14(b)に示す2つの合成DNA(117S4H Sph Iプライマー(配列番号:47)、117S4H Bgl IIプライマー(配列番号:48)はPCRプライマーとして使用し、pGKSPH34を鋳型としてPCRを行った。得られたPCR産物は、Bgl IIおよびSph Iで消化し、Bgl IIおよびSph Iの粘着末端を持つDNA断片(DNA(II))を調製した。
【0081】
次に、pGKSPH34をBgl IIおよびSal Iで消化後、1%アガロース電気泳動を行い、大きい方のDNA断片(DNA(III))をゲルより回収した。このようにして得られたDNA(I),DNA(II) およびDNA(III)をT4DNAリガーゼを用いて連結し、pG117S4HGPを作製した(図15)。
【0082】
実施例12.キメラタンパク質βGal−117S4HGPの生産
作製したpG117S4HGPを有する大腸菌W3110M25株を、1.5%グルコース、4g/L K2 HPO4 、4g/L KH2 PO4 、2.7g/L Na2 HPO4 、0.2g/L NH4 Cl、1.2g/L (NH4 )2 SO4 、4g/L 酵母エキス、2g/L L−メチオニン、2g/L MgSO4 ・7H2 O、40mg/L CaCl2 ・2H2 O、40mg/L FeSO4 ・7H2 O、10mg/L MnSO4 ・nH2 O、10mg/L AlCl3 ・H2 O、4mg/L CoCl2 ・6H2 O、2mg/L ZnSO4 ・7H2 O、2mg/L Na2 MoO4 ・2H2 O、1mg/L CuCl2 ・2H2 O、0.5mg/L H3 BO4 、10mg/L テトラサイクリンを含む培地で、32℃,pH7.0で培養し、グルコースの枯渇後は、グリセリンを炭素源として、37℃でさらに8時間培養し、菌体内にβGa1−117S4HGPの封入体を生産させた。
【0083】
培養終了後、培養液をマントンゴリーンホモジナイザー(マントンゴーリン社製、モデル15M−8TA)により600KG/cm2 の条件でホモジナイズ処理し、遠心分離(CEPA遠心分離機)により沈殿画分を回収した。得られた沈殿を培養液と等量の緩衝液(10mM Tris−HCl(pH8.0),1mM EDTA)に懸濁後、再度、遠心分離で沈殿を回収し、培養液と等量の脱イオン水に懸濁した。その後、再び遠心分離を行い沈殿を回収した後、沈殿と等容量の脱イオン水に懸濁し、後の操作に使用した。
【0084】
実施例13.キメラタンパク質からのhGLP−1(7−37)の切り出し
実施例12で得られたキメラタンパク質封入体を回収し、8M尿素で溶解後反応液組成(20mM Tris−HCl(pH8.2),100mM NaCl,3.0M尿素、2.0mM CaCl2 ,8mg/ml キメラタンパク質)になるように希釈し、Kex2−660を10,000U/mlとなるように添加して、hGLP−1(7−37)の切り出しを行った。本条件下、一時間でコントロールのβGal−117S4HGPは90%以上切断された。
【0085】
実施例14.hGLP−1(7−37)の分取(図16、表3)
高発現かつKex2−660の基質としても適していたキメラタンパク質βGal−117S4HGPを大量に得るため、本キメラタンパク質をコードするプラスミドpG117S4HGPにて大腸菌M25(W3110/ompT)を形質転換し、20L培養槽にて培養した。培地は酵母エキス20g/L、バクトトリプトン10g/L、K2 HPO4 12g/L、KH2 PO4 3g/L、グリセリン5g/Lからなり、菌体濃度がOD660=1.0で、IPTG(イソプロピルベータチオガラクトシド)を最終濃度1mMとなるように添加した。消泡剤(ディスフォームCC−222、(株)日本油脂)を用いた。
【0086】
37℃で菌体濃度がOD660=12まで培養を継続した。集菌後、TE(10mM Tris/HCl,1mM EDTA pH8.0)に懸濁し、高圧ホモジナイザー(Manton−Gaulline)による菌体破砕、遠心分離、TE及び脱イオン水での懸濁洗浄を行って、封入体約100gを得た。封入体懸濁液(160g/L)250mlに、1M Tris/HCl(pH8.2)100ml,5モル NaCl溶液50ml、脱イオン水500ml、尿素900gを加えて30℃の恒温槽中30分攪拌溶解し、暖めた脱イオン水で希釈し、30℃で5Lとした。これに250mM CaCl2 溶液50mlを攪拌しながら穏やかに添加し、更にKex2−660を20,000unit/ml(約4,0mg/L)となるように加えた。
【0087】
2時間後、(切断率は90%以上)酢酸にてpHを6.4に合わせ、更に脱イオン水で2倍に希釈し、未反応キメラタンパク質及び、保護ペプチドを凝集沈殿させた。遠心分離によりhGLP−1(7−37)を含む上清を得、酢酸にてpHを5.0とし、2M尿素・10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)で平衡化した陽イオン交換樹脂(SPトヨパール)カラムを通してhGLP−1(7−37)を吸着させ、2M尿素・10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.2)で洗浄後、0Mから300mMまでの塩化ナトリウム濃度勾配にて、hGLP−1(7−37)を溶出させた。あらかじめフラクションチューブには、最終3%となるように酢酸を入れておき、hGLP−1(7−37)の凝集を抑制した。
【0088】
hGLP−1(7−37)を含む画分を集め、5%酢酸で平衡化した低圧逆相カラム(SokenODS−W)を通してhGLP−1(7−37)を吸着させ、5%酢酸を含む50%アセトニトリル溶液で、hGLP−1(7−37)を溶出させた。減圧下でアセトニトリルを除き、0.22μmのメンブレンフィルター濾過後、凍結乾燥した。
【0089】
hGLP−1(7−37)の定量を以下詳述する。hGLP−1(7−37)を含む溶液をサンプルバッファー(1M酢酸/2M尿素)で10倍から20倍に希釈し、遠心上清を得る。HPLC(島津LC10A)にYMC−C8−A302(4.6mm I.D.×150mm)カラムを接続し、A液(0.1% TFA/10%アセトニトリル)、B液(0.094% TFA/60%アセトニトリル)、B40%→80%/20min勾配の系にて該上清の10μlないしは20μを展開し、220nmの吸光度測定にて検出されたhGLP−1(7−37)と既知濃度の標準hGLP−1(7−37)のピーク面積比から定量する。回収率表を表3に示す。
【0090】
【表3】
【0091】
【配列表】
【0092】
【0093】
【0094】
【0095】
【0096】
【0097】
【0098】
【0099】
【0100】
【0101】
【0102】
【0103】
【0104】
【0105】
【0106】
【0107】
【0108】
【0109】
【0110】
【0111】
【0112】
【0113】
【0114】
【0115】
【0116】
【0117】
【0118】
【0119】
【0120】
【0121】
【0122】
【0123】
【0124】
【0125】
【0126】
【0127】
【0128】
【0129】
【0130】
【0131】
【0132】
【0133】
【0134】
【0135】
【0136】
【0137】
【0138】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、合成hProPTH(1−84)遺伝子作製に用いた合成オリゴマーの配列を示す。
【図2】図2は、合成hProPTH(1−84)遺伝子の作製方法を示す。
【図3】図3は、プラスミドpG210S(S/X)の作製方法を示す図である。Placは大腸菌のラクトースオペロンのプロモーターを、Ttrpは大腸菌のTrpEのアテニュエーターターミネーターを示す。
【図4】図4は、キメラタンパク質βGal−139S(FM)PPH84を発現するプラスミドpGP#19の作製方法を示す。
【図5】図5は、キメラタンパク質βGal−139S(FM)PPH34を発現するプラスミドpGP#19PPH34の作製方法を示す図である。
【図6】図6は、キメラタンパク質βGal−117SPPH34およびβGal−117SnHPPH34を発現するプラスミドpG117SPPH34とpG117SnHPPH34の作製方法の前半部分を示す図である(n=1〜6)。pG97SPPH34とpG97SnHPPH34はプライマーS05をS04に変え、pG139SPPH34とpG139SnHPPH34はプライマーS05をS06に変え、作製した。
【図7】図7は、キメラタンパク質βGal−117SPPH34およびβGal−117SnHPPH34を発現するプラスミドpG117SPPH34とpG117SnHPPH34の作製方法の後半部分を示す図である(n=1〜6)。pG97SPPH34とpG97SnHPPH34はプライマーS05をS04に変え、pG139SPPH34とpG139SnHPPH34はプライマーS05をS06に変え、作製した。
【図8】図8は、ポリヒスチジンリンカー{(His)4 −Pro−Gly}n (n=1〜6)がキメラタンパク質の生産量に与える影響を調べたSDS−PAGEの結果を示した図である。図中4Hはヒスチジン残基が4個すなわち、n=1であることを示す。
【図9】図9は、Kex2−660によるhPTH(1−34)の切り出し効率に与えるポリヒスチジンリンカー{(His)4−Pro−Gly}n(n=1〜6)の影響を示した図である。横軸はβGal−117SPPH34のkcat値を1としたときの相対値を示した。
【図10】図10は、Kex2−660によるhPTH(1−34)の切り出し効率に与えるKex2プロテアーゼの認識部位P3のアミノ酸の影響を示した図である。P4のアミノ酸はバリン残基に固定し、P3部位のアミノ酸を置換した。横軸はβGal−117S4HVKPH34のkcat値を1としたときの相対値を示した。
【図11】図11は、Kex2−660によるhPTH(1−34)の切り出し効率に与えるKex2プロテアーゼの認識部位P4のアミノ酸の影響を示した図である。P3のアミノ酸はヒスチジン残基に固定し、P4部位のアミノ酸を置換した。横軸はβGal−117S4HVKPH34のkcat値を1としたときの相対値を示した。
【図12】図12は、βGal−117KS4HRHPH34遺伝子の発現ベクターpGKSPH34の構造を模式的に示した図である。なお、βGal−117KSはβGal−117Sの14位のアルギニン残基がリジン残基に置換されているペプチドである。
【図13】図13は、プラスミドpG210ShCT(G)の作製方法を示す図である。
【図14】図14は、hGLP−1(7−37)遺伝子(DNA(1))作製用合成オリゴヌクレオチドの塩基配列、及びpGKSPH34を鋳型とするPCR用プライマーの塩基配列を示す図である。
【図15】図15は、プラスミドpG117S4HGPの作製過程を示す図である。
【図16】図16は、hGLP−1の精製のプロフィルを示す図であり、AはKex2反応後、Bは酸性沈殿上清、Cは陽イオン交換カラム後、Dは低圧逆相カラム後の結果を示す。ピーク1はhGLP−1(7−37)、ピーク2はhGLP−1、ピーク3は保護ペプチド、ピーク4はキメラタンパク質を示す。
Claims (15)
- 次の式:
A−L−B
〔式中、Aは、保護ペプチドであり;
Bは、目的ペプチドであり;そして
Lは、リンカーペプチドであって、そのC−末端部分に配列:X1−X2−(Pro,Lys又はArg)−Arg(式中、X1は Asp 及び Glu 以外の任意のアミノ酸であり、そしてX2は Pro 以外の任意のアミノ酸である)を有し、そしてN−末端に〔(His)4−Pro−Gly〕n(式中、nは1〜6である)の配列を有する、
により表わされるキメラタンパク質。 - 前記N−末端部分のアミノ酸配列と前記C−末端部分のアミノ酸配列との間に1〜5個の任意のアミノ酸が存在する、請求項1に記載のキメラタンパク質。
- X1がArg、Lys又はHisであり、そしてX2がHis又はPheである請求項1又は2に記載のキメラタンパク質。
- Aがアミノ酸配列;Pro−Arg、Arg−Arg及びLys−Argを含有しないポリペプチドである、請求項1〜3のいずれか1項記載のキメラタンパク質。
- Aがアミノ酸配列;Pro−Arg、Arg−Arg又はLys−Argを含有するポリペプチドである場合、A中に該アミノ酸配列を含有しないように該アミノ酸配列中の少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている、請求項1〜3のいずれか1項記載のキメラタンパク質。
- Aが220アミノ酸残基以下のポリペプチドである、請求項1〜5のいずれか1項記載のキメラタンパク質。
- Aが大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼのN−末端側の1位のアミノ酸から97位、117位又は139位のアミノ酸までのペプチドである、請求項6記載のキメラタンパク質。
- A中のシステイン残基が他のアミノ酸に置換されている、請求項1〜7のいずれか1項記載のキメラタンパク質。
- 前記他のアミノ酸がセリン残基である、請求項8記載のキメラタンパク質。
- Bがヒト副甲状腺ホルモン又はその誘導体であって、前記誘導体が、ヒト甲状腺ホルモンのN−末端の1位又は3位のアミノ酸残基から、 31 位、 34 位、 37 位、 38 位もしくは 84 位のアミノ酸残基までの配列を有する断片、又はこれらのC−末端に Gly を付加した断片である、請求項1〜9のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
- BがGLP-1又はその誘導体であって、前記誘導体が、 GLP-1 のN−末端の7位のアミノ酸残基から 37 位のアミノ酸残基までの配列を有する断片である、請求項1〜9のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
- 前記リンカーペプチドLがKex2プロテアーゼ又はその誘導体により切断され、前記誘導体が Kex 2プロテアーゼのC−末端を除去し、N−末端から 660 位のアミノ酸残基までの配列を有する断片である、請求項1〜11のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のキメラタンパク質の製造方法において、該キメラタンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、該培養物から前記キメラタンパク質を採取することを特徴とする方法。
- 目的ペプチド(B)の製造方法において、請求項1〜13のいずれか1項に記載のキメラタンパク質に、Kex2プロテアーゼ又はその誘導体を作用させてリンカーペプチド(L)のC−末端と目的ペプチド(B)のN−末端との間のペプチド結合を切断する工程を含み、前記誘導体が Kex 2プロテアーゼのC−末端を除去し、N−末端から 660 位のアミノ酸残基までの配列を有する断片である、目的ペプチド(B)を得ることを特徴とする方法。
- 目的ペプチド(B)を得る際に等電点沈澱処理を用いることを特徴とする、請求項13又は14に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP06398997A JP3925982B2 (ja) | 1996-03-04 | 1997-03-04 | プロセッシング酵素を用いたキメラタンパク質の切断方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7090696 | 1996-03-04 | ||
JP8-70906 | 1996-03-04 | ||
JP06398997A JP3925982B2 (ja) | 1996-03-04 | 1997-03-04 | プロセッシング酵素を用いたキメラタンパク質の切断方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09296000A JPH09296000A (ja) | 1997-11-18 |
JP3925982B2 true JP3925982B2 (ja) | 2007-06-06 |
Family
ID=13445041
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP06398997A Expired - Lifetime JP3925982B2 (ja) | 1996-03-04 | 1997-03-04 | プロセッシング酵素を用いたキメラタンパク質の切断方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5891671A (ja) |
EP (1) | EP0794255B1 (ja) |
JP (1) | JP3925982B2 (ja) |
KR (1) | KR100468268B1 (ja) |
CN (1) | CN1216901C (ja) |
AT (1) | ATE290088T1 (ja) |
AU (1) | AU734397B2 (ja) |
CA (1) | CA2198966C (ja) |
DE (1) | DE69732583T2 (ja) |
DK (1) | DK0794255T3 (ja) |
TW (1) | TW480270B (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2284847A1 (en) * | 1998-01-30 | 1999-08-05 | Suntory Limited | Process for producing peptides using a helper peptide |
JP4741076B2 (ja) * | 1998-07-10 | 2011-08-03 | サイオス インコーポレイテッド | 8より上または5未満のpIを有するペプチドを産生するための方法 |
DK1795598T3 (da) | 1999-07-23 | 2010-02-01 | Kenji Kangawa | Hidtil ukendte peptider |
JP2003514532A (ja) * | 1999-11-19 | 2003-04-22 | トランスカーヨティック セラピーズ インコーポレイテッド | 生成物の産生量を最適化するための核酸構築体 |
US6730306B1 (en) * | 2000-03-08 | 2004-05-04 | Large Scale Biology Corporation | Parvovirus vaccine as viral coat protein fusions |
EP1493747B1 (en) | 2002-04-11 | 2012-12-19 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Process for producing modified peptide |
GB0308732D0 (en) * | 2003-04-15 | 2003-05-21 | Axcess Ltd | Absorption enhancers |
GB0308734D0 (en) * | 2003-04-15 | 2003-05-21 | Axcess Ltd | Uptake of macromolecules |
BR112017011662A2 (pt) | 2014-12-01 | 2018-02-27 | Pfenex Inc | parceiros de fusão para a produção de peptídeo |
CN110305223B (zh) * | 2019-06-26 | 2022-05-13 | 重庆派金生物科技有限公司 | 重组串联融合蛋白制备目标多肽的方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60217894A (ja) * | 1984-04-14 | 1985-10-31 | Suntory Ltd | 新規プロテア−ゼ及びその製造方法 |
RU2091490C1 (ru) * | 1985-10-25 | 1997-09-27 | Зимодженетикс, Инк. | Способ получения гетерологичного полипептида в эукариотических микроорганизмов |
DE3805150A1 (de) * | 1987-04-11 | 1988-10-20 | Hoechst Ag | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von polypeptiden |
DE3725320A1 (de) * | 1987-07-30 | 1989-02-09 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Expressionsvektoren und verfahren unter deren verwendung zur gewinnung von cro/ss-galaktosidase/pth-fusionsproteinen und von pth |
JPH07108232B2 (ja) * | 1990-10-09 | 1995-11-22 | エム・ディ・リサーチ株式会社 | ペプチド又は蛋白質の製造方法 |
JPH05328492A (ja) * | 1992-05-21 | 1993-12-10 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | スピーカ用ダンパー |
CA2198968C (en) * | 1996-03-04 | 2010-02-09 | Toyofumi Masuda | Process for production of secretory kex2 derivatives |
-
1997
- 1997-03-03 CA CA2198966A patent/CA2198966C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-04 DE DE69732583T patent/DE69732583T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-04 TW TW086102706A patent/TW480270B/zh not_active IP Right Cessation
- 1997-03-04 US US08/811,028 patent/US5891671A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-04 AT AT97301407T patent/ATE290088T1/de active
- 1997-03-04 KR KR1019970007016A patent/KR100468268B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-03-04 EP EP97301407A patent/EP0794255B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-04 JP JP06398997A patent/JP3925982B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-04 CN CN971096937A patent/CN1216901C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-04 DK DK97301407T patent/DK0794255T3/da active
- 1997-03-04 AU AU15036/97A patent/AU734397B2/en not_active Ceased
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2198966A1 (en) | 1997-09-04 |
KR100468268B1 (ko) | 2005-06-27 |
AU1503697A (en) | 1997-09-11 |
ATE290088T1 (de) | 2005-03-15 |
JPH09296000A (ja) | 1997-11-18 |
US5891671A (en) | 1999-04-06 |
EP0794255A2 (en) | 1997-09-10 |
EP0794255A3 (en) | 1999-01-27 |
AU734397B2 (en) | 2001-06-14 |
EP0794255B1 (en) | 2005-03-02 |
DK0794255T3 (da) | 2005-06-27 |
KR970065554A (ko) | 1997-10-13 |
CN1216901C (zh) | 2005-08-31 |
TW480270B (en) | 2002-03-21 |
DE69732583T2 (de) | 2006-01-19 |
DE69732583D1 (de) | 2005-04-07 |
CN1167155A (zh) | 1997-12-10 |
CA2198966C (en) | 2011-06-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR970005928B1 (ko) | 프라세싱 부위에 인접한 음전하를 띤 아미노산을 함유하는 이스트 프라세싱 시스템 | |
EP0978565B1 (en) | Process for producing peptide with the use of accessory peptide | |
JP2000500019A (ja) | ストレプトアビジン融合タンパク質経由でのペプチドの生産方法 | |
JP5291137B2 (ja) | 8より上または5未満のpIを有するペプチドを産生するための方法 | |
JPH02500876A (ja) | 組換えポリペプチドの製品およびその製造、単離および精製方法 | |
HUT73394A (en) | Process for production of protein | |
JPH01199578A (ja) | Kex2エンドプロテアーゼ及びその製造方法 | |
JP4624495B2 (ja) | ヒト・インスリンの生成 | |
AU607973B2 (en) | Process for production of physiologically active peptide containing cysteine residue | |
JP3925982B2 (ja) | プロセッシング酵素を用いたキメラタンパク質の切断方法 | |
HU216335B (hu) | Eljárás peptidek előállítására | |
JP3406244B2 (ja) | 新規な融合蛋白質からの組み換えインスリンの製造方法 | |
EP1417237B1 (en) | Process for preparation of polypeptides of interest from fusion peolypeptides | |
JPH0816120B2 (ja) | 成長ホルモン放出因子を含むハイブリドポリペプチド | |
JP3995279B2 (ja) | 蛋白の製造方法 | |
JP4332599B2 (ja) | アドレノメデュリン前駆体の製造方法 | |
JP4663524B2 (ja) | OmpTプロテアーゼ変異体を用いたポリペプチドの切断方法 | |
JP3982866B2 (ja) | 分泌型Kex2誘導体の製造方法 | |
KR100473443B1 (ko) | 단백질의 생산방법 | |
KR19990016368A (ko) | 융합단백질을 이용한 인성장호르몬의 제조방법 | |
KR20040007892A (ko) | 재조합 인간 훼리틴 단백질 및 그 제조방법 | |
KR20030010536A (ko) | 융합단백질로부터 목적 단백질을 분리하는 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040225 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20050111 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060704 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060901 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061031 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061220 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070130 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070227 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110309 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110309 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120309 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120309 Year of fee payment: 5 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120309 Year of fee payment: 5 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130309 Year of fee payment: 6 |