KR20030010536A

KR20030010536A - 융합단백질로부터 목적 단백질을 분리하는 방법

Info

Publication number: KR20030010536A
Application number: KR1020020043968A
Authority: KR
Inventors: 이우종; 박흥복; 조태훈; 김정민; 박연성
Original assignee: 주식회사 삼양제넥스
Priority date: 2001-07-26
Filing date: 2002-07-25
Publication date: 2003-02-05
Also published as: DE60239684D1; KR100535265B1; ATE504603T1

Abstract

본 발명은 융합파트너와 목적단백질을 융합된 형태로 발현시킨 후 매트릭스에 선택적으로 흡착시키고 융합파트너와 목적단백질에 대해 효과적인 절단반응을 실시함으로써 목적단백질을 분리하는 정제공정에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 목적단백질과 융합 파트너를 포함하는 융합단백질에 있어서, 상기 융합 파트너는 유비퀴틴 분해효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 C-말단에 포함하며 상기 목적단백질의 전하와 융합파트너의 등전점 차이가 1 이상이 되도록 융합 파트너의 전하가 변화된 것인 융합 단백질을 발현시키고, 상기 융합단백질을 매트릭스에 로딩시키고, 매트릭스에 흡착된 상태에서 또는 매트릭스로부터 분리시킨 후 융합단백질을 유비퀴틴 분해 효소로 처리하고, 목적단백질을 회수함으로써, 목적단백질을 간단히 높은 순도와 수율로 정제할 수 있다. 본 발명에 의하면, 재조합 단백질의 생산시 요구되는 복잡한 정제공정을 해결할 수 있어 획기적으로 경제성을 향상시킬 수 있다.

Description

융합단백질로부터 목적 단백질을 분리하는 방법{Process for preparation of polypeptides of interest from fusion polypeptides}

본 발명은 목적단백질과 융합파트너가 결합된 융합단백질로부터 목적단백질을 정제하는 방법, 및 이에 유용한 융합단백질에 관한 것이다.

유전자 재조합 기술이 발전하면서 자연계에서는 얻기 어려운 단백질을 재조합 균주의 발효공정을 통해 대량 생산함으로써 인류의 복지 증진에 크게 기여하고 있다. 숙주세포로는 대장균을 비롯하여 효모, 동물세포 등이 사용되고 있다. 특히 대장균을 이용한 단백질 생산의 경우 유전적 조작이 용이하고, 생산성이 높으며,저렴한 배지를 이용해 배양할 수 있는 장점이 있다.

재조합 대장균을 이용한 단백질 생산에 있어서, 목적단백질은 그 특성에 따라 수용성 단백질 형태로 발현되거나 또는 불용성의 내포체 형태로 발현이 된다. 수용성 형태로 발현된 단백질은 단백질 접힘이 효율적으로 이루어져 목적단백질 본래의 활성을 보인다. 3차원적 구조를 갖추기 전에 서로 응집하여 불용화된 단백질은 고유의 활성을 나타내지 않으므로 다양한 방법으로 내포체를 가용화시킨 후 재접힘(refolding) 공정을 수행해야 한다. 이 경우 재접힘 공정의 수율과 생산성이 낮고, 목적단백질 내 다이설파이드 결합(disulfide bond) 개수가 많은 경우 정확한 재접힘이 불가능하므로 목적단백질은 가능하면 수용성 형태로 발현되는 것이 유리하다. 또한 목적단백질이 수용성 형태로 발현될 경우, 익스팬디드 베드 흡착 (expanded bed absorption, 이하 EBA) 방식을 이용해 원심분리, 여과 등의 초기정제공정을 획기적으로 줄일 수 있어 수율 및 생산성을 크게 향상시킬 수 있다. 목적단백질을 수용성 형태로 발현시키기 위하여 수용성으로 잘 발현되는 융합파트너와 융합시켜 생산하기도 하는데, 이때 사용하는 융합파트너로는 GST, 말토오스 결합 단백질, 티오레독신, 유비퀴틴 등이 있다. 유비퀴틴은 76개의 아미노산으로 구성되어 있는 작은 펩타이드로 목적단백질을 유비퀴틴과 융합시켜 발현시킬 경우 발현율이 증대되며 특히 수용성 형태의 발현을 촉진시킴으로써 활성형의 목적단백질 생산이 용이하다.

반면, 목적단백질을 수용성 형태로 발현시킬 경우 재조합 단백질을 순수하게 회수하기가 어려운 단점이 있다. 불용성의 내포체 형태로 발현된 경우에는 초기 정제공정에서 대장균 유래의 수용성 물질들로부터 분리가 용이하지만 수용성 형태로 발현된 단백질은 숙주세포의 단백질, DNA, 다당체 등 수많은 수용성 이물질과 혼합된 상태로 존재하므로 정제가 매우 어려워진다. 내포체로 발현된 경우에도 EBA 공정을 적용하기 위해 우레아 등의 변성제를 첨가하고 세포파쇄를 실시하여 가용화시키기도 하는데 이 경우 앞에서 언급한 내포체 형성에 따른 일차 정제 효과를 포기해야 한다. 결론적으로 목적단백질의 효율적인 접힘을 위해 수용성 단백질 형태로 발현시키는 경우 또는 EBA 공정을 이용하고자 하는 경우 모두 목적단백질이 수많은 대장균 유래의 수용성 단백질, DNA, 다당체들과 혼합된 상태에서 이후 정제단계로 들어가게 되어 목적단백질의 분리가 매우 어려워지므로 효율적인 분리정제공정이 절실히 요구되어진다.

목적단백질을 세포내 다른 단백질로부터 회수하는 정제 공정은 일반적으로 전하, 용해도, 크기와 소수성 등의 차이를 이용한다. 이와 같은 정제방법은 비교적 저렴한 재료를 이용하지만 선택성이 떨어져서 여러 가지 방법을 조합한 다단계 정제과정을 거쳐야만 원하는 순도를 얻을 수 있으며 정제 수율은 여러 단계의 공정을 거치며 현격히 떨어지게 된다. 또한 각각의 단백질 특성에 맞춰 새로운 공정을 매번 구성하고 최적화시켜야 하는 문제점이 있다. 목적단백질에 대한 선택성을 높이기 위해 목적단백질의 고유한 분자 구조를 인식하는 항체를 수지에 결합시켜 분자구조에 따른 친화도를 이용하거나, 특정 담체에 친화성이 있는 꼬리표(tag)를 융합파트너로 활용하는 정제방법도 흔히 사용되어지고 있다. 이와 같은 목적으로 개발된 융합파트너로는 GST, 폴리히스티딘 등이 있다(미국특허 5,108,919, 한국특허 제177304호). 항체나 융합파트너를 이용하는 경우에는 항체생산의 어려움과 고가, 융합파트너에 선택적으로 친화적인 수지의 가격이 높아 산업적 응용이 제한적이다.

또한, 이와 같이 융합단백질 형태로 발현시킬 경우 이후 단계에서 융합파트너를 절단 등의 방법을 통해 융합단백질에서 제거해야 한다. 특히 목적단백질이 의료용 단백질인 경우 절단반응 후 정확하게 목적 단백질의 N-말단 또는 C-말단이 노출되도록 목적단백질과 보조 단백질의 연결부위에 적합한 절단 부위를 삽입하는 동시에 목적단백질 내에 동일한 절단 부위가 존재하지 않도록 융합단백질을 설계해야 한다. 산처리, CNBr 처리 등의 화학적 방법이나 팩터 Xa, 엔테로키나아제 등의 단백질 분해효소를 이용해 절단반응을 실시하는데, 이 효소들도 선택성이 좋지 않아 목적 절단부위 이외의 위치에서 절단반응이 일어날 수 있고, 반응이 효율적이지 못하며 효소가격이 매우 비싸다.

목적단백질과 등전점의 차이를 보이는 단백질 또는 펩타이드를 융합파트너로 하여 융합단백질을 구성하고 이온교환수지로 분리하는 공정개발이 시도되었다. 미국특허 4,532,207에서는 EGF를 생산함에 있어 음이온성인 EGF의 C-말단에 양이온성 아미노산인 아르지닌으로 구성된 꼬리표를 붙인 후 양이온 교환수지를 이용해서 정제를 하였으나 C-말단에 수개의 이온성 아미노산 서열을 첨가하는 경우에 목적단백질의 단백질 입체구조적 특성으로 인해 융합단백질이 이온교환수지에 효과적으로 흡착하기 어려워 수율이 저하될 수 있다. 미국특허 5,179,196와 미국특허 5,322,930에서는 목적단백질과 전기적 성질이 다른 융합파트너로 융합단백질을 구성하였으며 각각 CNBr 절단부위와 Staph V8 단백질분해효소 절단부위를 두 단백질사이에 삽입하였다. 그러나, 상기 특허에서는 융합단백질 이외에 비슷한 등전점을 보이는 수많은 대장균 유래의 단백질이 이온교환수지에 흡착하게 되고 상기에서 기술된 절단방법은 선택성이 떨어져 융합단백질 이외의 이온교환수지에 흡착된 대장균 유래 단백질도 함께 분해되어 용출됨으로써 기술의 목적을 달성하기가 어렵다.

본 발명은 고순도의 목적단백질을 간편하고 효율적으로 분리할 수 있는 DNA 구조물을 제공한다.

본 발명은 고순도의 목적단백질을 간편하고 효율적으로 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 단백질의 등전점 변화 성질을 이용하여 단백질을 정제하는 방법을 제공한다.

도 1은 유비퀴틴의 개략적인 3차원 구조도이다.

도 2는 실시예 3에 따라 재조합 대장균에서 발현된 융합단백질의 양이온교환수지를 통한 정제시 다양한 염농도에서 용출되는 분획의 SDS-PAGE 분석 사진이다.

도 3은 실시예 5에 따라 융합단백질이 포함된 세포파쇄액을 양이온교환수지에 흡착시킨 후 400mM의 염농도에서 용출시켜 얻은 분획을 같은 방법으로 얻은 유비퀴틴 분해 효소와 반응시킨 후 양이온교환수지에 로딩하여 얻은 SDS-PAGE 분석 사진이다.

도 4는 실시예 6에 따라 융합단백질이 포함된 세포파쇄액을 양이온교환수지에 흡착시킨 후 400mM의 염농도에서 용출시켜 얻은 분획을 같은 방법으로 얻은 유비퀴틴 분해 효소와 반응시킨 후 음이온교환수지에 로딩하여 얻은 SDS-PAGE 분석 사진이다.

도 5는 실시예 7에 따라 도 3의 래인3번에 해당하는 분획을 역상 고속액체크로마토그라피로 분석하여 얻은 크로마토그램이다.

도 6은 융합단백질이 포함된 세포파쇄액을 양이온교환수지에 흡착시키고 낮은 염농도에서 세척한 후 유비퀴틴 분해 효소를 양이온교환수지에 흡착시켜 반응시킴으로써 목적단백질을 고순도로 얻을 수 있음을 보여주는 SDS-PAGE 분석 사진이다.

도 7은 세포추출액을 익스펜디드 베드흡착 방식을 이용하여 양이온교환수지에 흡착시킨 다음 침강시키고 유비퀴틴 분해 효소를 이용하여 양이온교환수지탑 내에서 반응시킨 후 각 분획들을 SDS-PAGE로 분석한 사진이다.

도 8은 실시예 11에 따라 멤브레인에 로딩한 시료, NaCl 용출액, 탈염후 UBP절단반응액, 및 절단반응액을 멤브레인에 통과시킨 분획을 SDS-PAGE로 분석한 사진이다.

도 9는 실시예 13에 따라 멤브레인에 로딩한 시료, NaCl 용출액, 탈염후 UBP절단반응액, 및 절단반응액을 멤브레인에 통과시킨 분획을 SDS-PAGE로 분석한 사진이다.

본 발명은 목적단백질과 융합파트너가 결합된 융합단백질로부터 목적단백질을 정제하는 방법 및 이에 유용한 융합단백질에 관한 것이다.

본 발명은 구체적으로, 목적단백질과 융합 파트너를 포함하는 융합단백질에 있어서, 상기 융합 파트너는 유비퀴틴 분해효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 C-말단에 포함하며 상기 목적단백질의 전하와 융합파트너의 등전점 차이가 1 이상이 되도록 융합 파트너의 전하가 변화된 것인 융합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명에서 특별한 설명이 없는 한 단백질과 펩타이드는 혼용해서 사용된다.

본 발명에서 "유비퀴틴 분해효소"는 진핵세포 내에 존재하며 단백질의 C-말단 아미노산 서열 RGG 다음을 잘라내는 효소를 의미하며, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)유래의 UBP1, UBP2 그리고 근육세포내의 UBP41 등이다. 유비퀴틴 분해효소는 유비퀴틴의 76번째 아미노산인 글라이신 다음의 펩타이드 결합을 정확히 절단하기 때문에 목적단백질의 N-말단에 특정 아미노산이 나타나도록 정확히 조절할 수 있다(미국특허 5,847,097).

본 발명에서는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)유래의 UBP1를 사용하여 N-말단에 6 ~ 10개의 라이신으로 구성된 꼬리표가 붙도록 변형시켜 사용할 수 있다.

본 발명에서 "목적단백질"은 생산하고자 하는 단백질을 의미하며, 예를 들어 성장 호르몬, 인터페론, 인터루킨, 과립콜로니자극인자, 에리트로포에틴 및 인슐린과 같은 생리학적 활성이 있는 단백질일 수 있다.

본 발명에서 "융합파트너"는 C 말단에 유비퀴틴 절단 효소에 의해 절단되는 아미노산 서열, 예를 들어 RGG를 포함하며, 목적단백질과 융합파트너간 등전점 차이가 1이상, 바람직하게는 1.5이상, 더욱 바람직하게는 2이상 되도록 전하가 변화된 펩타이드를 의미한다. 여기서, 융합 파트너의 전하는 융합 파트너에서 1이상의 아미노산이 치환, 삽입, 또는 결실에 의해 변화될 수 있다. 본 발명에서 융합파트너로는 융합단백질을 수용성 형태로 발현될 수 있게 하는 펩타이드가 바람직하다. 따라서 유비퀴틴, 유비퀴틴의 일부 또는 합성 펩타이드 뿐 아니라, 예를 들어, GST(Glutathione S transferase), 말토오스 결합단백질, 유비퀴틴, 티오레독신 등과 같이 융합단백질을 수용성 형태로 발현시킬 수 있다고 보고된 펩타이드 또는 이들의 변형체로 C-말단에 유비퀴틴 분해효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 융합파트너로 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 융합 파트너는 상기 목적 단백질의 전하와 다른 전하를 띠는 아미노산 서열이 융합 파트너의 N-말단 또는 내부에 포함되어 전하가 변화된 것일 수 있으며, 상기 목적단백질의 전하와 다른 전하를 띠는 아미노산 서열이 히스티딘, 라이신 및 아르기닌으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열일 수 있으며, 2-30개 아미노산으로 이루어진 서열이 바람직하다. 예컨대, 폴리히스티딘, 폴리라이신, 또는 폴리아르기닌 등을 포함하다.

또는, 상기 목적단백질의 전하와 다른 전하를 띠는 아미노산 서열이 글루탐산 및 아스파르트산으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열일 수 있으며, 2-30개 아미노산으로 이루어진 서열이 바람직하다. 예를 들면, 폴리글루타메이트, 및 폴리아스파테이트등을 포함할 수 있다. 예를 들어 유비퀴틴 또는 유비퀴틴 절단 효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 포함하는 유비퀴틴의 일부 또는 유비퀴틴의 유도체 또는 합성 펩타이드로서, 제조하고자 하는 목적단백질의 전하와 다른 전하를 띠는 아미노산 서열을 N-말단 또는 내부에 포함하는 펩타이드일 수 있다.

본 발명에서 "목적단백질의 전하와 다른 전하를 띠는 아미노산 서열"은 융합단백질 또는 목적단백질 분리 공정에서의 pH하에서 목적단백질의 전하와 다른 전하를 띠는 아미노산 서열로, 목적 단백질과 융합파트너의 매트릭스에 대한 흡착력 차이를 가져오는 아미노산 서열을 의미한다. 목적 단백질의 pI 값은 알 수 있으므로, 분리 정제 공정에서 사용되는 용매의 pH에서 목적 단백질의 전하와 다른 전하를 갖도록 하는 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 예를 들어 목적단백질의 pI가 7보다 낮은 경우 라이신 또는 아르기닌과 같이 양전하를 띠는 아미노산을 2개 이상 연속적으로 포함하는 서열을 사용할 수 있다. 예를 들어 목적단백질의 pI가 7보다 높은 경우 글루타민산 또는 아스파라긴과 같이 음전하를 띠는 아미노산을 2개 이상 연속적으로 포함하는 서열을 사용할 수 있다.

이러한 "목적단백질의 전하와 다른 전하를 띠는 아미노산 서열"은 융합파트너의 N-말단 또는 융합파트너의 내부에 존재할 수 있다. 이와 같은 아미노산 서열이 존재하는 경우, 융합파트너의 일부분의 전하를 쉽게 변화시킬 수 있어 융합파트너와 목적단백질의 매트릭스, 예컨대 이온교환수지 또는 멤브레인에 대한 흡착 정도를 쉽게 변화시킬 수 있다.

대다수 의료용 단백질의 등전점이 7.0 이하인데 대장균 세포내 대부분의 단백질은 등전점이 7.0 이하이고 세포추출물에 들어 있는 핵산류와 엔도톡신도 모두 낮은 등전점 분포를 보이므로 높은 pI 값의 융합파트너와 목적단백질을 결합시킬 경우 세포 유래 불순물로부터 융합단백질을 분리할 수 있다.

한 예로, 유비퀴틴의 예상 pI는 6.56 정도로 거의 중성이어서 pI가 약산성인 목적단백질과 등전점의 차이를 두어 이온교환수지 또는 멤브레인으로 정제하기가 어렵다. 이러한 경우 유비퀴틴의 N-말단 또는 내부에 수개의 양이온성 또는 음이온성 펩타이드 꼬리표를 붙여 융합단백질을 생산할 경우 융합단백질의 등전점을 높게또는 낮게 하여 숙주세포내 단백질로 부터 쉽게 정제할 수 있다.

본 발명은 또한, 목적단백질과 유비퀴틴 분해효소에 의해 절단되는 융합단백질의 등전점의 차이를 유도하기 위하여 유비퀴틴의 N 말단에 이온성 아미노산이 여러개 연결된 꼬리표를 붙여 발현시킬 수 있지만 유비퀴틴 내의 아미노산을 치환하거나 또는 이온성 아미노산을 유비퀴틴 내에 삽입함으로써 동일한 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 융합 파트너는 또한, 유비퀴틴의 3차원 구조상 표면에 존재하는 아미노산이 치환되어 융합 파트너의 전하가 변화된 것일 수 있으며, 예를 들면, 상기 유비퀴틴의 3차원 구조상 표면에 존재하는 1이상의 아미노산이 히스티딘, 라이신, 및 아르기닌로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산으로 치환된 것이거나, 상기 유비퀴틴의 3차원 구조상 표면에 존재하는 1이상의 아미노산이 글루타메이트 및 아스파테이트로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 아마노산으로 치환된 것일 수 있다.

상기 융합 파트너에서 치환 가능한 아미노산 위치는 도 1에 나타난 유비퀴틴 3차원 구조를 참고하여(Vijay-Kumar 등, J Mol Biol 194:pp. 531 (1987)), 유비퀴틴 융합단백질을 유비퀴틴 분해효소가 인식할 수 있도록 유비퀴틴의 3차원적 구조를 유지하면서 유비퀴틴 표면 전하를 바꿔주기 위하여 알파헬릭스와 베타시트의 2차원적 구조내에 존재하지 않는 루프상의 아미노산 중 표면에 노출되어있는 아미노산중에서 선택될 수 있다.

상기 융합 파트너는 유비퀴틴의 아미노산 Glu16, Glu18, 및 Glu 64 위치의아미노산으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 자리에 위치하는 아미노산이 치환된 것일 수 있으며, 바람직하게는 유비퀴틴의 아미노산 Glu16이 아르기닌으로, Glu18이 라이신으로, 및 Glu 64이 아르기닌으로 치환된 것일 수 있다.

본 발명에서 "세포 추출물"은 세포 파쇄물 또는 목적단백질을 포함하는 융합단백질을 함유하는 배지 용액을 모두 의미한다.

본 발명은 상기 융합단백질을 이용하여 융합단백질로부터 목적단백질을 분리하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 a) 본 발명에 따른 목적 단백질과 융합파트너로 이루어진 융합단백질을 숙주세포에서 발현시키고,

b) 상기 융합파트너가 흡착하는 매트릭스에 융합단백질을 로딩하고,

c) 상기 매트릭스에 유비퀴틴 분해효소를 처리하고,

d) 상기 매트릭스로부터 목적단백질을 용출시키는 것을 포함하는, 융합단백질로부터 목적단백질을 분리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, a) 본 발명에 따른 목적 단백질과 융합파트너로 이루어진 융합단백질을 숙주세포에서 발현시키고,

c) 상기 매트릭스로부터 융합단백질을 회수하고,

d) 회수한 융합단백질을 유비퀴틴 분해효소로 처리하고,

e) 매트릭스에 대한 흡착력 차이에 의하여 상기 융합파트너로부터 목적단백질을 분리하는 것을 포함하는, 융합단백질로부터 목적단백질을 분리하는 방법에 관한 것이다.

상기 목적 단백질을 분리하는 방법중 단계 b)의 융합파트너를 매트릭스에 로딩하는 단계는 i) 상기 융합단백질을 포함하는 세포추출물을 융합단백질이 흡착하는 매트릭스에 로딩하거나, ii) 상기 융합단백질을 포함하는 세포추출물을 목적 단백질이 흡착하는 매트릭스에 로딩하고, 상기 매트릭스로부터 융합단백질을 회수하고, 상기 회수한 융합단백질을 융합파트너가 흡착하는 매트릭스에 로딩하는 단계로 수행할 수도 있다.

상기 매트릭스는 이온교환수지 또는 전하를 띤 멤브레인일 수 있다. 또한, 본 발명에서 적용가능한 목적 단백질과 융합파트너는 등전점 차이가 1이상, 바람직하게는 1.5이상, 더욱 바람직하게는 2이상인 것이다. 예컨대, 상기 목적 단백질의 pI가 7.0 이하의 단백질이거나 pI가 7.0 이상의 단백질일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일례에서, a)숙주 세포에서 목적단백질과 상기 목적단백질의 전하와 다른 전하를 띠는 아미노산 서열을 N-말단 또는 내부에 포함하며 유비퀴틴 분해효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 C-말단에 포함하는 융합파트너로 이루어지는 융합단백질을 발현시키고, b)융합단백질을 포함하는 세포추출물을 융합파트너가 흡착하는 매트릭스에 로딩하고, c)상기 매트릭스에 유비퀴틴 분해효소를 처리하고, d)매트릭스로부터 목적단백질을 용출시키는 것으로 이루어지는, 목적단백질을 효율적으로 분리 정제할 수 있는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 a)숙주 세포에서 목적단백질과 상기 목적단백질의 전하와 다른 전하를 띠는 아미노산 서열을 N-말단 또는 내부에 포함하며 유비퀴틴 분해효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 C-말단에 포함하는 융합파트너로 이루어지는 융합단백질을 발현시키고, b)상기 융합단백질을 포함하는 세포추출물을 융합파트너가 흡착하는 매트릭스에 로딩하고, c)상기 융합단백질을 매트릭스로부터 회수하고, d)회수한 융합단백질을 유비퀴틴 분해효소로 처리하고, e) 매트릭스에 대한 흡착력 차이에 의하여 상기 융합파트너로부터 목적단백질을 분리하는 것으로 이루어지는, 목적단백질을 효율적으로 분리 정제할 수 있는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 구체적인 일례에서, pI가 7.0 이하인 목적단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로, 목적단백질을 포함하는 융합단백질을 매트릭스에 흡착시킨 후 융합단백질을 용출시키는 과정없이 양이온 교환수지 또는 멤브레인에 흡착된 상태에서 유비퀴틴 분해효소를 처리하고 용출액으로 절단된 목적단백질을 용출함으로써 고순도의 목적단백질 분획을 얻을 수 있다. 이와 같은 본 발명의 방법은 숙주세포에서 C-말단에 유비퀴틴 분해효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 포함하며, N-말단 또는 내부에 양전하를 띠는 2개 이상의 아미노산을 포함하는 융합파트너와 pI가 7보다 낮은 목적단백질로 이루어지는 융합단백질을 발현시키고, 상기 융합단백질을 포함하는 세포추출물을 융합파트너가 흡착하는 양이온교환수지 또는 멤브레인에 로딩하고, 상기 이온교환수지에 유비퀴틴 분해효소를 처리하고 상기 양이온교환수지 또는 멤브레인으로부터 목적단백질을 용출시키는 것으로 이루어질 수 있다.

유비퀴틴 분해효소를 처리하기 전에, 융합단백질이 해리되지 않을 정도로 저농도의 염용액을 수지탑에 흘려주어 약하게 흡착된 숙주세포 유래의 단백질 또는 엔도톡신 등을 해리시킴으로써 최종 목적단백질의 순도를 더 높일 수 있다. 융합단백질의 분해반응 후 목적단백질 이외의 단백질이 용출되지 않을 정도의 낮은 염용액으로 용출시키면 목적단백질이 선택적으로 용출되어 고순도로 얻을 수 있다.

본 발명의 방법의 또다른 예는 pI가 7.0 이하인 목적단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로, 숙주세포에서 C-말단에 유비퀴틴 분해효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 포함하며, N-말단 또는 내부에 양전하를 띠는 2개 이상의 아미노산을 포함하는 융합파트너와 pI가 7보다 낮은 목적단백질로 이루어지는 융합단백질을 발현시키고, 상기 융합단백질을 포함하는 세포추출물을 융합파트너가 흡착하는 양이온교환수지에 로딩하고, 상기 융합단백질을 양이온교환수지 또는 멤브레인으로부터 회수하고, 회수한 융합단백질을 유비퀴틴 분해효소로 처리하고, 이온교환수지에 대한 흡착력 차이에 의하여 상기 융합파트너로부터 목적단백질을 분리하는 것으로 이루어진다. 매트릭스에 대한 흡착력 차이에 의하여 융합파트너로부터 목적단백질을 분리하는 것은, 예를 들어 유비퀴틴 분해효소로 처리된 융합단백질을 음이온교환수지에 로딩하여 먼저 융합파트너는 용출시키고 목적단백질을 흡착시킨 후 목적단백질을 다시 용출시키거나, 유비퀴틴 분해효소로 처리된 융합단백질을 양이온교환수지에 로딩하여 융합파트너는 흡착시키고 목적단백질을 용출시키는 것에 의해 달성할 수 있다.

또는 pI가 7.0 이상인 목적단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로, 숙주세포에서 C-말단에 유비퀴틴 분해효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 포함하며, N-말단 또는 내부에 음전하를 띠는 2개 이상의 아미노산을 포함하는 융합파트너와 pI가 7보다 높은 목적단백질로 이루어지는 융합단백질을 발현시키고, 상기 융합단백질을 포함하는 세포추출물을 목적단백질이 흡착하는 양이온교환수지에 로딩하고, 상기 융합단백질을 양이온교환수지로부터 회수하고, 상기 융합단백질을 다시 융합파트너가 흡착하는 음이온교환수지에 로딩하고, 상기 융합단백질을 음이온교환수지로부터 회수하고, 회수한 융합단백질을 유비퀴틴 분해효소로 처리하고, 이온교환수지에 대한 흡착력 차이에 의하여 상기 융합파트너로부터 목적단백질을 분리하는 것으로 이루어진다. 이온교환수지에 대한 흡착력 차이에 의하여 융합파트너로부터 목적단백질을 분리하는 것은, 예를 들어 유비퀴틴 분해효소로 처리된 융합단백질을 양이온교환수지에 로딩하여 먼저 융합파트너는 용출시키고 목적단백질을 흡착시킨 후 목적단백질을 다시 용출시키거나, 유비퀴틴 분해효소로 처리된 융합단백질을 음이온교환수지에 로딩하여 융합파트너는 흡착시키고 목적단백질을 용출시키는 것에 의해 달성할 수 있다.

특히 대장균 세포내 단백질의 대부분은 약산성 pH에 등전점이 존재하여 pH 7.0에서 90 % 이상의 세포내 단백질들은 음으로 하전되고 세포추출물에 들어 있는 핵산류와 엔도톡신도 모두 음으로 하전되어 있다. 따라서 본 발명에서 제시하는 바와 같이 융합파트너에 양전하를 띠는 아미노산 서열을 존재하도록 함으로써, 융합단백질을 포함하는 세포추출물을 양이온교환수지를 통과시킴에 의해 대부분의 세포내 단백질, 핵산류 및/또는 엔도톡신 등을 쉽게 제거할 수 있다.

본 발명의 양이온 교환수지는 CM 세파로스, SP 세파로스 등을 사용할 수 있고 음이온 교환수지를 사용하는 경우에는 Q 세파로스, DEAE 세파로스 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서는 융합단백질을 숙주세포에서 생산한 후 얻은 세포추출물을 바로 익스펜디드 베드 흡착방법에 도입하여 원심분리, 여과 등의 초기정제단계를 줄이고 융합단백질의 흡착, 절단을 한번에 실시할 수 있다. 익스펜디드 베드 흡착 크로마토그래피는 세포추출물로부터 고체 불순물을 제거하는 동시에 원하는 단백질을 얻는 단일 단계공정으로 전통적인 원심분리, 여과 등의 초기정제공정을 대체할 수 있다.

목적단백질의 순도는 역상 고속액체크로마토그래피를 이용하여 측정할 수 있으며 본 발명의 방법에 의해 DNA와 엔도톡신의 농도도 낮출 수 있다.

본 발명에서 다양한 목적단백질이 융합파트너에 융합되어 원핵 또는 진핵세포에서 적절한 발현시스템을 통해 발현될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: K6Ub-hGH 발현 벡터의 제조

인간성장호르몬 유전자는 (Genbank 번호 K02382, Human growth hormone synthetic gene, complete cds)를 pGNX2(한국 등록특허공보 제0319520호)에 클로닝하여 pGNX2hGH를 제조하였다. 이것을 주형으로 하여 hGHN 및 hGHCB 프라이머 (표 1)를 이용하여 400bp의 중합효소연쇄반응 산물을 얻어 BamH1으로 절단하였다.

유비퀴틴 유전자는 Genbank 번호 M17524 (Synthetic human ubiquitin gene,complete cds)의 유전자를 주형으로, 정방향 프라이머 5'-GCAGCATATGCAGATTTTCGTC-3'(UBF) 및 역방향 프라이머인 5'-CGACGGCGCCACCTCTTAGCC-3'의(UBR) 양쪽 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 한 후 그 230bp 산물을 NdeI을 절단하였다. 이를 HindIII로 절단한 pUC18과 결합하여 pUC18Ubq를 합성하였다. 이것을 hGH 유전자와 연결하기 위해 Sfo1과 BamH1으로 자른후 400bp 중합효소연쇄반응 산물과 연결하여 pUC18ubhGH를 얻었다. 이것을 발현 벡터로 옮기기 위하여 pGNX4(한국등록특허공보 제0319520호)과 pUC18ubhGH를 Nde1 및 BamH1의 같은 효소로 잘라 pGNX4ubhGH를 제조하였다. pGNX4ubhGH로E.coliXL1-Blue MR을 형질전환시키고 가나마이신이 포함된 선택배지에서 선별을 하여 LB 액체배지에서 배양하였다. OD₆₀₀=0.6에서 0.5 mM IPTG로 발현을 유도하고 SDS-PAGE 분석을 통해 발현여부를 확인하였다.

양이온성 아미노산인 라이신 6개로 구성된 펩타이드를 융합단백질의 N-말단에 결합시키기 위하여, 한가닥의 라이신 꼬리표 올리고뉴클레오타이드 KTT(표 1)을 합성하여 주형으로 사용하고 5' 프라이머(KTN)와 3' 프라이머(KTC) 을 이용해 중합효소연쇄반응을 실시하여 45bp크기의 밴드를 얻었다. 제한효소 Nde1(NEB, England)과 Ase1(NEB, England)으로 자른 후 Nde1으로 절단한 pGNX4UbhGH와 연결하여 pGNX4K6UbhGH를 얻었다. pGNX4K6UbhGH로E.coliXL1blue MR을 형질전환시키고 가나마이신 선택배지에서 형질전환체를 선별하였다. LB 액체배지에서 진탕배양하였으며 1mM IPTG로 발현을 유도한 후 발현여부를 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다. 발현된 균주의 플라스미드 DNA를 서열분석한 결과 N-말단의 6개의 라이신이 AAG AAA AAAAAG AAA AAG의 코돈으로 구성되어있음을 확인하였다.

실시예 2: K10-UBP 발현 벡터의 제조

UBP1 유전자를 클로닝하기 위해 S.cerevisiae ATCC 번호 208275의 게놈을 주형으로 프라이머 UBPN와 UBPC(표 1)를 이용하여 중합연쇄반응을 2400bp의 UBP1 유전자를 얻은 후 pRSETc 벡터의 NdeI과 BamH1 자리에 클로닝하였다. 클로닝된 것을 Nde1과 BamH1으로 잘라서 같은 효소로 잘린 pGNX4 벡터와 연결하여 pGNX4UBP1을 제조하였다. 이것을E.coliXL1-Blue MR에 형질전환시켰다. 이를 통하여 얻은 클론을 가나마이신이 포함된 배지에서 선별하여 항생제를 포함한 LB 액체배지에서 배양하여 OD₆₀₀=0.6에서 0.5 mM IPTG로 발현유도하였고, 발현된 UBP1를 이용하여 실시예1의 융합단백질을 기질로 한 절단 반응을 통해 역가를 확인하였다.

UBP1의 활성을 가지면서 용이한 정제를 위해 라이신 10개를 N-말단에 붙였다. 먼저 10개의 AAG 코돈을 가지는 올리고뉴클레오타이드 10K (표 1)를 합성하고 앞뒤쪽의 Nde1과 Ase1 효소자리를 제한효소로 자른 후 Nde1과 CIP로 처리된 pGNX4UBP1을 연결하여 pGNX410KUBP1을 합성하였다. 이것은 pGNX4UBP1과 동일한 방법으로 활성을 확인하였다. 본 실시예 1 및 2에서 사용한 프라이머 서열을 하기 표 1에 나타냈다.

프라이머	염기서열(5' -> 3')	SEQ ID NO.
hGHN	5'-TTTCCAACCATTCCACTG-3'	1
hGHCB	5'-GACTGGATCCTTAAAAACCACAAGAACC-3'	2
KTN	5'-GGGGAATTCCATATG-3'	3
KTT	5'-GGGGAATTCCATATGAARAARAARAARAARAATAATGGATCCCCC-3'	4
KTC	5'-GGGGGATCCATTAAT-3'	5
UBPN	5'-CTACCGCGGTTCATATGGCTTTTGTTTATTGAAAGAAG-3'	6
UBPC	5'-ATTGGATCCTTAGTTTACATCTTTACC-3'	7
10K	5'-GGCCATATG(AAG)10ATTAATGGCC-3'	8
UBF	5'-GCAGCATATGCAGATTTTCGTC-3'	20
UBR	5'-CGACGGCGCCACCTCTTAGCC-3'	21

(R은 아데닌 또는 구아닌)

실시예 3: 융합단백질의 생산 및 정제

실시예 1에서 제조된 발현벡터 pGNX4K6UbhGH로E. coliTG1을 형질전환시킨 후 콜로니를 얻어 LB 배지(가나마이신 50 mg/L 포함) 5 mL에 접종하였다. 37℃에서 배양한 다음 그 중 1 mL을 5 g/L의 포도당이 포함된 100 mL의 R 배지(배지 조성: 표 2)에 다시 접종하여 30℃에서 배양하였다. 이를 15g/L의 포도당이 포함된 R 배지 1.4L에 다시 접종하고 포도당이 소모되는 시점에서 500g/L의 포도당 용액을 주입하는 유가식배양을 실시하였다. 배양액의 흡광도가 70에 도달하면 IPTG 1 mM을 첨가하여 단백질의 발현을 유도하였다. 원심분리하여 수확한 세포를 20 mM 인산염 완충액 (pH7.5)에 현탁시키고 마이크로플루이다이저를 사용하여 파쇄하였다. 15,000rpm의 회전속도로 60분간 원심분리하여 가용성 세포추출액인 상층액을 회수한 다음 이온교환수지를 이용하여 정제를 시도하였다.

성분	첨가량
KH₂PO₄	3 g/L
K₂HPO₄	3 g/L
(NH4)₂SO₄	4 g/L
트리소디움 시트레이트	2.3 g/L
카사미노산	2 g/L
글루코오스	5 g/L
MgSO₄7H₂O	0.22 ml/L
미량 금속 용액	1 ml/L
가나마이신	100 mg/L
티아민	5 mg/L

이코노팩 컬럼 (Econo-Pack, Bio-Rad, USA)에 SP-세파로오스 패스트 플로우 (SP-Sepharose Fast Flow, Pharmacia, Sweden) 양이온 교환수지 2mL을 충전한 다음 유속 1 mL/min으로 운전하였다. 이동상은 인산염 완충액 (pH 7.5)를 이용하였으며 시료를 주입하기 전에 수지 부피의 15배에 해당하는 완충액으로 수지를 평형화시켰다. 상기의 상층액을 주입한 다음 수지 부피의 3배에 해당하는 완충액으로 씻어내고 동일한 이동상에 다양한 농도로 NaCl이 첨가된 용액을 사용하여 단계별 용출을 실시하였다. 200, 400, 600, 800, 1000 mM의 농도로 NaCl이 첨가된 완충액 각각 6 ml을 이용하여 용출시켰으며 수지부피의 6배에 해당하는 1 M NaCl 용액으로 세척하였다. 다양한 염농도에서 용출된 분획을 SDS-PAGE로 분석하였으며 도 2에 나타내었다 (SM : 분자량 마커, 1 : 세포파쇄액 주입후 용출액, 2: 세척액, 3: 200mM NaCl + 완충액으로 세척한 후 용출액, 4: 400mM NaCl + 완충액으로 세척한 후 용출액, 5: 600mM NaCl + 완충액으로 세척한 후 용출액, 6: 800mM NaCl + 완충액으로 세척한 후 용출액, 7: 1M NaCl + 완충액으로 세척한 후 용출액).

도 2에 나타낸 바와 같이, 융합단백질인 K6Ub-hGH는 400mM의 높은 염농도에서 용출되어 대다수 대장균 유래 단백질을 제거할 수 있었으나 많은 종류의 양이온성 단백질이 함께 흡착하였다.

실시예 4: 유비퀴틴 분해효소 생산

실시예 2에서 제조한 발현벡터 pGNX4K10UBP1으로E. coliTG1을 형질전환시켜 얻은 재조합 대장균을 실시예 3의 방법으로 배양하여 라이신 10개의 꼬리표가 융합된 유비퀴틴 분해효소(K10-UBP)를 생산하였다. 실시예 3의 방법으로 처리하여 얻은 재조합 대장균 세포추출액을 확보하고 양이온 교환수지를 이용해 효소를 분리하였다. 실시예 1에서 K6Ub-hGH는 400mM에서 용출하였는데 K10-UBP도 400mM 분획에서 역가를 보여 두 가지 융합단백질을 포함한 용액의 이온 강도를 동일하게 맞출 수 있었다.

실시예 5: 유비귀틴 절단반응과 양이온교환수지를 이용한 정제공정

실시예 3에서 부분정제된 K6Ub-hGH 400mM 분획과 실시예 4에서 부분정제된 K10-UBP 400mM 분획을 50대 1의 비율로 혼합하고 30℃에서 1시간 절단반응을 실시하고 SDS-PAGE로 분석하였다 (도 3의 래인 2).

20mM 인산염 완충액(pH7.5)과 반응액을 1대 1로 혼합하여 이온강도를 낮추고 SP-세파로오스 패스트 플로우 양이온 교환수지 컬럼에 주입한 결과 인성장호르몬만이 수지에 흡착되지 않고 바로 용출되었다. 다른 단백질들은 양이온교환수지에 흡착되어 높은 순도와 수율로 인성장호르몬을 분리할 수 있었다 (도 3. 래인, 1: K6Ub-hGH 400mM 분획, 2: K6Ub-hGH 400mM 분획을 UBP로 처리한 액, 3: K6Ub-hGH400mM 분획을 UBP로 처리한 액을 컬럼에 주입한 후의 용출액, 4: 완충액으로 세척한 액, 5: 200mM NaCl + 완충액으로 세척한 액, 6: 1M NaCl + 완충액으로 세척한 액)

실시예 6: 유비귀틴 절단반응과 음이온교환수지를 이용한 정제공정

실시예 3에서 부분정제된 K6Ub-hGH 400mM 분획과 실시예 4에서 부분정제된 K10-UBP 400mM 분획을 50대 1의 비율로 혼합하고 30℃에서 1시간 절단반응을 실시하고 반응액 내에 인성장호르몬이 음이온교환수지에 잘 흡착되도록 PD-10 컬럼(Pharmacia)를 이용해 탈염시켰다. 탈염된 절단 반응액을 Q-세파로스 패스트 플로우 음이온교환수지 컬럼에 주입하고 20mM 인산염 완충액을 세척하여 흡착되지 않는 단백질을 용출하였다. 200 mM 염용액을 흘려 인성장호르몬을 용출하였다 (도 4, 래인 1: K6Ub-hGH 400mM 분획을 UBP 처리한 액, 2: K6Ub-hGH 400mM 분획을 UBP 처리한 액을 컬럼에 주입한 후의 용출액, 3: 완충액으로 세척한 액, 4: 50mM NaCl + 완충액으로 세척한 액, 5: 200mM NaCl + 완충액으로 세척한 액, 6: 1M NaCl + 완충액으로 세척한 액).

실시예 7: 역상 고속크로마토그라피를 이용한 분석

실시예 5의 방법으로 분리한 인간성장호르몬의 순도를 확인하기 위하여 역상 고속액상크로마토그래피를 실시하였다. 도 3의 래인 3번에 해당하는 분획을 시료로 사용하였고 칼럼은 Vydac?C4 (300A, 5um, 4.6mm id x 250mm, USA)를 사용하여 분석하였다. 분석조건은 유럽약전에 나와있는 인성장호르몬 분석조건을 참조하여 설정하였다(유럽약전 1999:0951). 컬럼온도는 45℃로 유지하였고 이동상으로 29% 이소프로파놀과 71% 50mM 트리스 완충액 (pH 7.5)를 사용하였으며 유속은 250 ㎕/min 로 고정하였다. 도 5에 크로마토그램을 나타내었는데 2단계 이온교환수지 정제공정을 통해서 99% 이상의 순도로 인성장호르몬을 생산할 수 있었다.

실시예 8. 수지탑내 절단반응

SP-세파로오스 패스트 플로우 양이온교환수지 컬럼을 실시예 3과 같이 구성하고 pH 7.5의 인산염 완충액으로 평형화시킨 다음, 실시예 3의 방법으로 부분정제한 K6UbhGH를 포함하는 400mM 분획 3mL을 동일 부피의 완충액으로 희석하여 이온강도를 낮춘 후 수지탑내로 주입하였다. 흡착되지 않은 단백질들을 제거하기 위해 6mL의 완충액으로 세척을 하였다. 실시예 4의 방법으로 얻은 K10-UBP이 포함된 400mM 분획 1mL을 동일 부피의 완충액으로 희석한 후 수지탑으로 주입한 후 상온에서 1시간 반응하였다. 반응 후 200mM의 NaCl이 포함된 완충액 6mL을 흘려 절단된 인성장호르몬을 용출시키고 1M의 NaCl이 포함된 완충액 6mL로 나머지 흡착단백질을 용출시켰다. 각 단계에서 나온 분획을 SDS-PAGE 분석결과를 도 6에 나타내었다 (SM : 분자량 마커, 1: K6UbhGH를 포함하는 400mM 분획, 2: 완충액으로 세척한 액, 3: K10-UBP가 포함된 400mM 분획 주입후 용출액, 4: 200mM NaCl이 함유된 완충액으로 세척한 액, 5: 1M NaCl이 함유된 완충액으로 세척한 액). K6Ub-hGH를 포함하는 400mM의 염농도에서 용출된 분획내의 단백질들은 양이온 교환수지에 잘 흡착하여완충액을 이용한 전세척 과정에서 단백질이 용출되지 않았다(래인 2). 마찬가지로 400mM의 염농도에서 용출된 K10-UBP을 포함하는 분획내의 단백질들도 잘 흡착하였다(래인 3). 유비퀴틴 분해효소를 이용한 절단반응 후 인성장호르몬은 융합단백질에서 유리되는데, 절단반응 후 200mM의 NaCl이 포함된 완충액을 흘려주면 용출된 분획에서 절단된 인성장호르몬이 매우 높은 순도로 존재함을 확인할 수 있었다 (래인 4 ).

실시예 9: EBA 방식의 정제공정 적용

100ml의 STREAMLINE^?SP 수지가 채워진 STREAMLINE^?25 컬럼에 pH 7.5의 인산염 완충액으로 평형화 시킨 후 실시예 3의 K6Ub-hGH 융합단백질이 포함된 세포파쇄액(400ml)을 컬럼 베드의 팽창비율이 2가 되도록 아래에서 위 방향으로 주입하였다. 시료 주입 후 수지 부피의 2배에 해당하는 인산염 완충액으로 세척하여 세포찌꺼기 등의 고형물질들과 대장균 세포단백질, DNA 등을 제거하기 위하였다. 수지에 흡착된 융합단백질에서 인성장호르몬을 절단하기 위하여 수지를 침강시키고 위의 실시예 4에 의해 얻어진 K10-UBP 용액 50ml을 완충액으로 희석한 후 컬럼내부로 주입하여 반응을 시작하였다. 연동펌프를 이용해 컬럼 내부액을 순환시키며 반응시켰고 흡광분광계를 통과시켜 흡광도를 측정함으로써 반응의 진행정도를 측정하였다. 반응이 진행됨에 따라 흡착된 융합단백질에서 절단되어 완충액으로 유리된 인성장호르몬이 증가하게 되어 흡광도가 증가하였으며 3시간 경과 후에 더 이상의 흡광도증가가 없어 반응이 완료되었음을 확인하였다. 반응 후 100mM NaCl이 포함된 완충액을 주입하면서 유리된 인성장호르몬을 용출시켰고 각각 600mM, 1M NaCl이 포함된 완충액 100ml로 세척하였다 (도 7, 1: 분자량 마커, 2: 세포파쇄액, 3: 세포파쇄액 주입 후 세척한 액, 4: UBP 처리 후 용출액, 5: 100mM NaCl이 함유된 완충액으로 세척한 액, 6: 600mM NaCl이 함유된 완충액으로 세척한 액, 7: 1M NaCl이 함유된 완충액으로 세척한 액).

실시예 10: pGNX4K6UbIFNalpha-2b 발현벡터의 제조

유비퀴틴 단백질과 인간인터페론 단백질의 융합을 위해서 2단계의 연쇄중합반응을 이용하였다.

첫번째 단계로 유비퀴틴 유전자 (Genbank 번호 M17524, Synthetic human ubiquitin gene, complete cds)를 가진 벡터를 주형으로하여 프라이머 F6KUb (표 3, 제한효소NdeI 자리, 6개의 라이신과 유비퀴틴 유전자의 5'말단 포함) 와 프라이머 ORIFN(표 3, ubiquitin 유전자의 3'말단과 인간인터페론 유전자의 5'말단을 포함)을 이용하여 유비퀴틴 유전자를 증폭하였고, 인간 인터페론 유전자(genebank 번호. V00538, Messenger RNA for human leukocyte (alpha) interferon)를 포함한 벡터를 주형으로 하여 프라이머 OFIFN (표 3, ubiquitin 유전자의 3'말단과 인간인터페론 유전자의 5'말단을 포함)과 프라이머 RIFN (표 3, 인간인터페론 유전자의 3'말단과 제한효소BamHI 자리 포함)을 이용하여 인간 인터페론유전자를 증폭하여 각각 250염기와 500염기에 해당하는 크기의 중합연쇄반응의 반응산물을 얻었다.

2번째 단계로는 두 반응 산물을 연결하기 위해 첫번째 단계에서 얻은 각각의 산물을 함께 주형으로 하고 프라이머 F6KUb (NdeI 자리와 6개의 Lysine과 유비퀴틴 유전자의 5' 말단 포함)와 프라이머 RIFN(인간인터페론 유전자의 3'말단과 제한효소BamHI 자리 포함)을 이용하여 다시 한번의 중합연쇄반응으로 두 유전자가 연결된 750염기정도의 반응산물을 얻어낼 수 있었다. 이 반응산물과 발현벡터인 pGNX4를 제한효소NdeI과BamHI으로 각각 잘라 연결하여 pGNX4K6UbIFNalpha-2b라는 벡터를 제조하였다. 벡터의 DNA 염기서열 분석 결과 6개의 라이신, 유비퀴틴과 인간인터페론이 하나의 단백질로 발현될 수 있음을 확인할 수 있었다.

이렇게 확인된 벡터 pGNX4K6UbIFNalpha-2b를 TG1이라는 대장균에 형질전환시켰으며, 0.5 mM IPTG로 발현을 유도하고 SDS-PAGE 분석을 통해 발현여부를 확인하였다. 본 실시예에서 사용한 프라이머 서열을 하기 표 3에 나타냈다.

프라이머	프라이머 염기서열(5'-> 3')	비고	서열번호
F6KUb	GGGTTAACATATGGAGGATGAGGATGAAGACAAGATTTTCGT CAAGAC	제한효소 Nde I자리,ATG와 6개의 라이신 포함	9
ORIFN	AGGGAGATCACAGCCACCTCTTAGCCTTAGCACA	-	10
OFIFN	TAAGAGGTGGCTGTGATCTCCCTGAGACCCACA	-	11
RIFN	GCGCGGATCCTTATTCCTTCCTCCTTAATCTT	TAG와 제한효소 Bam HI 자리 포함	12

실시예 11: 양이온교환 멤브레인을 이용한 인터페론의 정제

라이신 6개가 N 말단에 추가된 유비퀴틴과 인터페론이 융합되어있는 DNA를 포함하는 pGNX4K6UbIFNalpha-2b 플라스미드로 TG1 숙주세포를 형질전환시키고 융합단백질이 발현되는 클론을 선발하였다. 5ml LB 배지에서 전배양하고 100ml LB 배지에 3% 접종을 실시하였다. 흡광도 1.5~2가 되었을 때 IPTG를 이용하여 인터페론을 발현시켰으며 IPTG 첨가 후 4시간 경과 후 세포를 수확하였다. 13000rpm의 회전속도로 3분간 원심분리를 실시하여 균체를 회수하고 4ml의 20mM 인산염 버퍼에 현탁시킨 후 초음파 파쇄기로 세포를 파쇄하였다. 파쇄액을 13000rpm의 회전속도로 30분간 원심분리한 후 상등액을 회수하여 정제에 사용하였다. 인터페론의 정제에는 이온성 기능단을 갖는 Vivapure S mini H (Vivascience, Germany) 양이온교환 멤브레인을 이용하였으며 20mM 인산염 버퍼로 평형화 시킨 후 사용하였다. 앞서 얻은 인터페론이 포함된 상등액 0.4ml을 멤브레인에 로딩하고 1200g로 원심분리하여 흡착시켰다. 인산염버퍼 0.4ml로 2회 멤브레인을 세척하고 1M NaCl이 포함된 인산염 버퍼로 용출시켰다. 용출되어 나온 분획 중 0.1ml을 molecular cut-off 3500 규격의 투석장치(Slide-A-Lyzer mini, Pierce, USA)를 이용해 1시간 동안 탈염시키고 UBP1을 이용해 절단반응을 실시하였다. 2시간 반응 후 반응액을 20mM 인산염버퍼로 평형화시킨 멤브레인에 다시 로딩한 후1200g 회전속도로 5분 원심분리하였다. 이때 흡착하지 않고 멤브레인을 통과한 분획에 매우 높은 순도로 인터페론이 존재함을 확인 할 수 있었다 (도 8: 레인, 1 : Loading sample 1/10 희석, 2 : 1M NaCl 용출액, 3 : 탈염 후 UBP 절단반응, 4 : 절단반응액 멤브레인 통과한 분획).

실시예 12: 유비퀴틴의 변형

유비퀴틴의 3차원 구조도를 참고하여 유비퀴틴 융합단백질을 유비퀴틴 분해효소가 인식할 수 있도록 유비퀴틴의 3차원적 구조를 유지하면서 유비퀴틴 표면 전하를 바꿔주기 위하여, 유비퀴틴 내의 16, 18, 64번 위치에 존재하는 음이온성 글루타메이트로 이를 아르기닌 또는 라이신으로 치환하여 등전점의 변화를 유도하였다. 유비퀴틴의 변형을 위하여 두 번의 중합효소연쇄반응을 이용하였다.

첫 번째의 중합효소연쇄반응에서는 목적위치에 다른 DNA 염기서열을 가지는 프라이머를 이용하였다. 유비퀴틴단백질 16, 18번째 글루타메이트의 변형을 위한 프라이머 FMUB1과 64번째의 글루타메이트의 변형을 위한 프라이머 RMUB1을 이용하였다. 이 반응에서 얻은 반응산물을 유비퀴틴의 정방향 프라이머 FMUB2(ATG와NdeI포함)와 역방향 프라이머 RMUB2(SfoI site 포함)를 이용한 중합효소연쇄반응으로 변형유비퀴틴을 얻을 수 있었다. 이를 pGEM-T easy vector에 넣어 pGEM-Mub라는 벡터를 만들었으며 DNA염기서열 분석을 통하여 목적한 변형유비퀴틴 유전자 서열을 확인하였다.

변형 유비퀴틴 단백질과 인간성장호르몬 단백질의 융합을 위해서 2단계의 연쇄중합반응을 이용하였다. 첫 번째 단계로 변형 유비퀴틴 유전자를 가진 벡터 (pGEM-Mub) 를 주형으로 하여 프라이머 FMUB2(제한효소NdeI 자리, ATG와 변형유비퀴틴 유전자의 5'말단 포함) 와 프라이머 ORhGH(변형유비퀴틴 유전자의 3'말단과 인간성장호르몬 유전자의 5'말단을 포함)을 이용하여 변형유비퀴틴 유전자를 증폭하였고, 인간성장호르몬 유전자(Genbank 번호 K02382, Human growth hormone synthetic gene, complete cds)를 포함한 벡터를 주형으로 하여 프라이머 OFhGH (변형유비퀴틴 유전자의 3'말단과 인간성장호르몬 유전자의 5'말단을 포함)와 프라이머 RhGH (인간성장호르몬 유전자의 3'말단과 제한효소BamHI 자리 포함)을 이용하여 인간 성장호르몬유전자를 증폭하여 각각 250염기와 6000염기에 해당하는 크기의 중합연쇄반응의 반응산물을 얻었다. 2번째 단계로는 두 반응 산물을 연결하기 위해 첫 번째 단계에서 얻은 각각의 산물을 함께 주형으로 하고 프라이머 FMUB2 (NdeI 자리와 변형 유비퀴틴 유전자의 5' 말단 포함)와 프라이머 RhGH(인간성장호르몬 유전자의 3'말단과 제한효소BamHI 자리 포함)을 이용하여 다시한번의 중합연쇄반응으로 두 유전자가 연결된 900염기정도의 반응산물을 얻어낼 수 있었다. 이 반응산물과 발현벡터인 pGNX4 (한국출원 1999-17920) 를 제한효소NdeI과BamHI으로 각각 잘라 연결하여 pGNX4MUbhGH라는 벡터를 제조하였다. 벡터의 DNA 염기서열 분석 결과 변형 유비퀴틴과 인간성장호르몬의 유전자가 융합되어 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 13: 변형유비퀴틴을 이용한 인성장호르몬의 정제

단백질 서열을 변화시킨 변형유비퀴틴과 인성장호르몬이 융합되어있는 DNA를 포함하는 pGNX4MUbhGH 플라스미드로 대장균 숙주세포를 형질전환 시키고 융합단백질이 발현되는 클론을 선발하였다. 5ml LB 배지에서 전배양하고 100ml LB 배지에 3% 접종을 실시하였다. 흡광도 1.5~2가 되었을 때 IPTG를 이용하여 융합단백질을 발현시켰으며 IPTG 첨가 후 4시간 경과 후 세포를 수확하였다. 13000rpm의 회전속도로 3분간 원심분리를 실시하여 균체를 회수하고 흡광도 50 정도로 20mM MES 버퍼에 현탁시킨 후 초음파 파쇄기로 세포를 파쇄하였다. 파쇄액을 13000rpm의 회전속도로 30분간 원심분리한 후 상등액을 회수하여 정제에 사용하였다.

융합단백질의 정제에는 이온성 기능단을 갖는 Vivapure S mini H (Vivascience, Germany) 양이온교환 멤브레인을 이용하였으며 20mM MES 버퍼로 평형화시킨 후 사용하였다. 앞서 얻은 융합단백질이 포함된 상등액 0.4ml을 멤브레인에 로딩하고 900g로 원심분리하여 흡착시켰다. MES 버퍼 0.4ml로 2회 멤브레인을 세척하고 1M NaCl이 포함된 MES 버퍼로 용출시켰다. 용출되어 나온 분획 중 0.1ml을 molecular cut-off 3500 규격의 투석장치(Slide-A-Lyzer mini, Pierce, USA)를 이용해 1시간 동안 탈염시키고 UBP1을 이용해 절단반응을 실시하였다. 반응 후 반응액을 20mM MES 버퍼로 평형화 시킨 멤브레인에 다시 로딩한 후 900g 회전속도로 5분 원심분리하여 정제된 인성장호르몬을 얻을 수 있었다.

유비퀴틴 N 말단에 이온성 꼬리표를 붙인 것과 마찬가지로 유비퀴틴 내부의 아미노산을 치환함으로써 등전점을 올려 양이온교환수지에 흡착시킬 수 있었으며 유비퀴틴 분해효소에 의해 절단됨을 확인할 수 있었다. (도 9. 레인, 1 : Loading sample 1/10 희석, 2 : 1M NaCl 용출액, 3 : 탈염 후 UBP 절단반응, 4 : 절단반응액 멤브레인 통과한 분획). 본 실시예에서 사용한 프라이머 서열을 하기 표 4에 나타냈으며, 하기 표에 나타낸 염기서열중 밑줄을 그어 진하게 표시한 문자는 변형된 부분을 나타낸다.

프라이머	염기서열	비고	서열번호
FMUB1	5'-CTT TGA CCG GTA AAA CCA TAA CAT TG C GC G TT A AAT CTT CCC ATA CC-3'	아미노산 변형(Glu16??Arg16, Glu18??Lys18)	13
FMUB2	5'-GGC CGC ATA TGC AGA TTT TCG TCA AGA CTT TGA CCG GTA AAA CC-3'	제한효소NdeI자리,ATG포함	14
RMUB1	5'-CTC TTA GCC TTA GCA CAA GAT GTA AGG TGG A GC G CT TCT GAA TGT TG-3'	아미노산 서열의 변형(Glu64??Arg64)	15
RMUB2	5'-CGC GGA TCC AGT GGA ATG GTT GGG GCG CCA CCT CTT AGC CTT AGC AC-3'	SfoI 자리 포함	16
ORhGH	5'-CAG TGG AAT GGT TGG AAA GCC ACC TCT TAG CCT TAG-3'		17
OFhGH	5'-CTA AGG CTA AGA GGT GGC TTT CCA ACC ATT CCA CTG-3'		18
RhGH	5'-GCC GGA TCC TTA AAA ACC ACA AGA ACC-3'	BamHI 자리 포함	19

본 발명에 의해 목적단백질을 간단하고 경제적인 방법에 의해 효과적으로 정제할 수 있다.

Claims

목적단백질과 융합 파트너를 포함하는 융합단백질에 있어서, 상기 융합 파트너는 유비퀴틴 분해효소에 의해 절단되는 아미노산 서열을 C-말단에 포함하며 상기 목적단백질의 전하와 융합파트너의 등전점 차이가 1 이상이 되도록 융합 파트너의 전하가 변화된 것인, 융합 단백질.
제 1 항에 있어서, 상기 융합파트너가 유비퀴틴에서 유래된 것인 융합단백질.
제 1 항에 있어서, 상기 융합 파트너는 융합 파트너에서 1이상의 아미노산이 치환, 삽입, 또는 결실에 의해 전하가 변화된 것인 융합 단백질.
제 3 항에 있어서, 상기 융합 파트너는 상기 목적 단백질의 전하와 다른 전하를 띠는 아미노산 서열이 융합 파트너의 N-말단 또는 내부에 포함되어 전하가 변화된 것인 융합단백질.
제 4 항에 있어서, 상기 목적단백질의 전하와 다른 전하를 띠는 아미노산 서열이 히스티딘, 라이신, 및 아르기닌으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산으로 이루어진 2-30개 아미노산 서열인 융합단백질.
제 4 항에 있어서, 상기 목적단백질의 전하와 다른 전하를 띠는 아미노산 서열이 글루탐산, 및 아스파르트산으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산으로 이루어진 2-30개 아미노산 서열인 융합단백질.
제 3 항에 있어서, 상기 융합 파트너는 유비퀴틴의 3차원 구조상 표면에 존재하는 아미노산이 치환되어 융합 파트너의 전하가 변화된 것인 융합단백질.
제 7 항에 있어서, 상기 유비퀴틴의 3차원 구조상 표면에 존재하는 1이상의 아미노산이 히스티딘, 라이신, 및 아르기닌로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산으로 치환된 것인 융합 단백질.
제 7 항에 있어서, 상기 융합 파트너는 유비퀴틴의 아미노산 Glu16, Glu18, 및 Glu 64 위치의 아미노산으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 자리에 위치하는 아미노산이 치환된 것인 융합 단백질.
제 9 항에 있어서, 상기 융합 파트너는 유비퀴틴의 아미노산 Glu16이 아르기닌으로, Glu18이 라이신으로, 및 Glu 64이 아르기닌으로 치환된 것인 융합 단백질.
제 7 항에 있어서, 상기 유비퀴틴의 3차원 구조상 표면에 존재하는 1이상의아미노산이 글루탐산 및 아스파르트산으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 아마노산으로 치환된 것인 융합 단백질.
제 1 항에 있어서, 상기 목적 단백질이 인성장호르몬, 인터페론, 인터루킨, 과립콜로니자극인자, 에리트로포에틴 및 인슐린으로 구성되는 군에서 선택되는 것인 융합단백질.
a) 제 1 항에 따른 목적 단백질과 융합파트너로 이루어진 융합단백질을 숙주세포에서 발현시키고,

b) 상기 융합파트너가 흡착하는 매트릭스에 융합단백질을 로딩하고,

c) 상기 매트릭스에 유비퀴틴 분해효소를 처리하고,

d) 상기 매트릭스로부터 목적단백질을 용출시키는 것을 포함하는, 융합단백질로부터 목적단백질을 분리하는 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 제 2항 내지 제12항중 어느 한항에 따른 융합단백질인 목적단백질을 분리하는 방법.
a) 제 1항에 따른 목적 단백질과 융합파트너로 이루어진 융합단백질을 숙주세포에서 발현시키고,

b) 상기 융합파트너가 흡착하는 매트릭스에 융합단백질을 로딩하고,

c) 상기 매트릭스로부터 융합단백질을 회수하고,

d) 회수한 융합단백질을 유비퀴틴 분해효소로 처리하고,

e) 매트릭스에 대한 흡착력 차이에 의하여 상기 융합파트너로부터 목적단백질을 분리하는 것을 포함하는, 융합단백질로부터 목적단백질을 분리하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 제 2항 내지 제12항중 어느 한항에 따른 융합단백질인 목적단백질을 분리하는 방법.
제 13항 또는 15항에 있어서, 상기 단계 b)의 융합단백질을 매트릭스에 로딩하는 단계는 i) 상기 융합단백질을 포함하는 세포추출물을 융합파트너가 흡착하는 매트릭스에 직접 로딩하거나, ii) 상기 융합단백질을 포함하는 세포추출물을 목적 단백질이 흡착하는 매트릭스에 로딩하고, 상기 매트릭스로부터 융합단백질을 회수하고, 상기 회수한 융합단백질을 융합파트너가 흡착하는 매트릭스에 로딩하는 단계로 수행하는, 목적단백질을 분리하는 방법.
제 13항 또는 15항에 있어서, 상기 매트릭스는 이온교환수지 또는 전하를 띤 멤브레인인, 목적단백질을 분리하는 방법.
제 13항 또는 15항에 있어서, 상기 목적 단백질이 pI가 7.0 이하의 단백질인 방법.
제 13항 또는 15항에 있어서, 상기 목적 단백질이 pI가 7.0 이상의 단백질인 방법.