JPH06166698A - ハイブリッドポリペプチド - Google Patents
ハイブリッドポリペプチドInfo
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- JPH06166698A JPH06166698A JP4098307A JP9830792A JPH06166698A JP H06166698 A JPH06166698 A JP H06166698A JP 4098307 A JP4098307 A JP 4098307A JP 9830792 A JP9830792 A JP 9830792A JP H06166698 A JPH06166698 A JP H06166698A
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- JP
- Japan
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- polypeptide
- dna
- binding
- interest
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
- C07K14/675—Beta-endorphins
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1018—Carboxy- and carbamoyl transferases (2.1.3)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
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- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】アビジン結合性ポリペプチドのＣ−末端でアビ
ジン結合性ポリペプチドに融合している、ビオチン結合
のための領域を含む組換えハイブリッドポリペプチド、
そのＤＮＡ発現ベクター、ポリペプチドの製造方法の提
供。 【構成】１またはそれ以上の目的のポリペプチドをコー
ドするアビジンに融合した、結合のためのポリペプチド
をコードするＤＮＡ断片よりなるＤＮＡ発現ベクターを
用い組換えＤＮＡ法によりハイブリッドポリペプチドを
産生。蛋白分解性または化学試薬を用いて結合のための
ポリペプチドから目的のポリペプチドを切断するための
結合性アミノ酸配列を含む。ハイブリッドポリペプチド
はコードするＤＮＡ発現ベクターで形質転換した適当な
宿主細胞中で発現され、アビジンアフィニティクロマト
グラフィーで粗細胞抽出物から回収・精製後、結合のた
めのポリペプチドを切断、目的のポリペプチドを産生す
る。
ジン結合性ポリペプチドに融合している、ビオチン結合
のための領域を含む組換えハイブリッドポリペプチド、
そのＤＮＡ発現ベクター、ポリペプチドの製造方法の提
供。 【構成】１またはそれ以上の目的のポリペプチドをコー
ドするアビジンに融合した、結合のためのポリペプチド
をコードするＤＮＡ断片よりなるＤＮＡ発現ベクターを
用い組換えＤＮＡ法によりハイブリッドポリペプチドを
産生。蛋白分解性または化学試薬を用いて結合のための
ポリペプチドから目的のポリペプチドを切断するための
結合性アミノ酸配列を含む。ハイブリッドポリペプチド
はコードするＤＮＡ発現ベクターで形質転換した適当な
宿主細胞中で発現され、アビジンアフィニティクロマト
グラフィーで粗細胞抽出物から回収・精製後、結合のた
めのポリペプチドを切断、目的のポリペプチドを産生す
る。
Description
【０００１】
【発明の技術分野】本発明はハイブリッドポリペプチド
（hybrid polypeptide）の産生のためのＤＮＡ発現ベク
ターに関する。本発明はまたアビジン結合性ポリペプチ
ドに結合した目的のポリペプチドよりなる組換えハイブ
リッドポリペプチド（ここでアビジン結合性ポリペプチ
ドはビオチン結合領域を含む）に関し、１つまたはそれ
以上の目的のポリペプチドを産生し回収する方法に関す
る。
（hybrid polypeptide）の産生のためのＤＮＡ発現ベク
ターに関する。本発明はまたアビジン結合性ポリペプチ
ドに結合した目的のポリペプチドよりなる組換えハイブ
リッドポリペプチド（ここでアビジン結合性ポリペプチ
ドはビオチン結合領域を含む）に関し、１つまたはそれ
以上の目的のポリペプチドを産生し回収する方法に関す
る。
【０００２】本発明は、ハイブリッドポリペプチドの産
生のためのＤＮＡ発現ベクターに関し、特に補欠分子族
基ビオチンの結合のための領域または認識配列を含むポ
リペプチドに結合した目的のポリペプチドよりなる、組
換えハイブリッドポリペプチドに関する。さらに詳しく
は本発明は、ビオチン化ハイブリッドポリペプチドがア
ビジンに結合している、ハイブリッドポリペプチドに関
する。本発明はまた、原核または真核蛋白発現系におい
てこのハイブリッドポリペプチドを産生する方法に関す
る。このようなハイブリッドポリペプチドは、アビジン
モノマーアフィニティクロマトグラフィーを用いること
により高純度および高収率で得られる（１９８９年９月
２９日出願の米国特許出願第４１４，７８５号、高速液
体クロマトグラフィーアビジンモノマーアフィニティ樹
脂（HPLC MONOMER AFFINITY RESIN)）。米国特許出願第
４１４，７８５号は、モノマー性アビジンポリペプチド
リガンドと、固体不活性支持体に固定したアビジンを含
有する新規のアフィニティ媒体上に目的の分子を吸着さ
せることによる、合成または天然の分子および／または
そのビオチン化誘導体を単離する、新規の特に効率的な
方法を開示している。米国特許出願第４１４，７８５号
の開示内容は参考のため本明細書中に引用されている。
生のためのＤＮＡ発現ベクターに関し、特に補欠分子族
基ビオチンの結合のための領域または認識配列を含むポ
リペプチドに結合した目的のポリペプチドよりなる、組
換えハイブリッドポリペプチドに関する。さらに詳しく
は本発明は、ビオチン化ハイブリッドポリペプチドがア
ビジンに結合している、ハイブリッドポリペプチドに関
する。本発明はまた、原核または真核蛋白発現系におい
てこのハイブリッドポリペプチドを産生する方法に関す
る。このようなハイブリッドポリペプチドは、アビジン
モノマーアフィニティクロマトグラフィーを用いること
により高純度および高収率で得られる（１９８９年９月
２９日出願の米国特許出願第４１４，７８５号、高速液
体クロマトグラフィーアビジンモノマーアフィニティ樹
脂（HPLC MONOMER AFFINITY RESIN)）。米国特許出願第
４１４，７８５号は、モノマー性アビジンポリペプチド
リガンドと、固体不活性支持体に固定したアビジンを含
有する新規のアフィニティ媒体上に目的の分子を吸着さ
せることによる、合成または天然の分子および／または
そのビオチン化誘導体を単離する、新規の特に効率的な
方法を開示している。米国特許出願第４１４，７８５号
の開示内容は参考のため本明細書中に引用されている。
【０００３】市販されている重要なペプチドやポリペプ
チドの合成は高い産生コストや精製コストのため、およ
び産生回収率が悪いため限定されてきた。最近まで、動
物、微生物、植物、死体、血清および尿は、生物活性の
あるポリペプチドの精製のための唯一の資源であった。
チドの合成は高い産生コストや精製コストのため、およ
び産生回収率が悪いため限定されてきた。最近まで、動
物、微生物、植物、死体、血清および尿は、生物活性の
あるポリペプチドの精製のための唯一の資源であった。
【０００４】組換えＤＮＡ技術の進歩により貴重なポリ
ペプチドの生物合成法が、商業的規模で可能になった。
市販の有用なポリペプチドの合成を可能にした組換えＤ
ＮＡ技術は、原核または真核発現系に導入することがで
きる。例えば組換えＤＮＡ技術は、組換え細菌によるヒ
ト成長ホルモンの産生を可能にし、発酵が従来の産生方
法に取って代わっている。今日まで生物合成法が、２０
個以上のアミノ酸残基を有するペプチドの商業的規模の
合成法の唯一の実際的方法であった。
ペプチドの生物合成法が、商業的規模で可能になった。
市販の有用なポリペプチドの合成を可能にした組換えＤ
ＮＡ技術は、原核または真核発現系に導入することがで
きる。例えば組換えＤＮＡ技術は、組換え細菌によるヒ
ト成長ホルモンの産生を可能にし、発酵が従来の産生方
法に取って代わっている。今日まで生物合成法が、２０
個以上のアミノ酸残基を有するペプチドの商業的規模の
合成法の唯一の実際的方法であった。
【０００５】目的のポリペプチドはいったん合成される
と、複雑の細胞成分の混合物から精製しなければならな
い。精製の程度はポリペプチドの応用目的に依存する。
複数の精製過程の間に活性成分がかなり失われるため、
精製のコストは産生コストの７０％までを占める。
と、複雑の細胞成分の混合物から精製しなければならな
い。精製の程度はポリペプチドの応用目的に依存する。
複数の精製過程の間に活性成分がかなり失われるため、
精製のコストは産生コストの７０％までを占める。
【０００６】ポリペプチドの精製は、普通目的のポリペ
プチドの物理学的性質に基づく１つまたはそれ以上の過
程により達成される。例えば蛋白は、溶解度、サイズ、
イオン的性質または特定のリガンドに対するアフィニテ
ィ（親和性）により分離される。許容できる精製を達成
するには普通これらの方法のうちいくつかを用いる必要
がある。
プチドの物理学的性質に基づく１つまたはそれ以上の過
程により達成される。例えば蛋白は、溶解度、サイズ、
イオン的性質または特定のリガンドに対するアフィニテ
ィ（親和性）により分離される。許容できる精製を達成
するには普通これらの方法のうちいくつかを用いる必要
がある。
【０００７】アフィニティ樹脂クロマトグラフィーは、
目的の精製レベルを達成するのに必要な精製ステップの
数を大幅に減少させることができる。アフィニティ精製
は精製すべきポリペプチドと、通常固体支持体に結合し
たリガンドとの特異的相互作用に基づく。本明細書中で
は、ポリペプチドは、ポリペプチドの上に存在する結合
領域に結合する補欠分子族により、リガンドに結合す
る。合成ペプチドの細胞抽出または粗混合物のような複
雑な混合物がアフィニティ樹脂に通されると、精製すべ
きポリペプチドは樹脂に選択的に保持され、補欠分子族
を欠く他のすべての分子は樹脂から洗い流される。従っ
て、目的のポリペプチドは単一のステップにより高純度
に回収される。
目的の精製レベルを達成するのに必要な精製ステップの
数を大幅に減少させることができる。アフィニティ精製
は精製すべきポリペプチドと、通常固体支持体に結合し
たリガンドとの特異的相互作用に基づく。本明細書中で
は、ポリペプチドは、ポリペプチドの上に存在する結合
領域に結合する補欠分子族により、リガンドに結合す
る。合成ペプチドの細胞抽出または粗混合物のような複
雑な混合物がアフィニティ樹脂に通されると、精製すべ
きポリペプチドは樹脂に選択的に保持され、補欠分子族
を欠く他のすべての分子は樹脂から洗い流される。従っ
て、目的のポリペプチドは単一のステップにより高純度
に回収される。
【０００８】ポリペプチドの精製にアフィニティクロマ
トグラフィーを有効に使用するために、組換えＤＮＡ技
術を用いて組換えハイブリッドポリペプチドのキメラ遺
伝子融合体が作成される。このキメラ遺伝子融合体は細
菌宿主細胞中で以下の成分を取り込む：５’プロモータ
ー；目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ；リガンド
結合領域を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
そして随時大腸菌発現ベクターｐｋｋ２２３−３中に見
いだされるｒｒｎＢターミネーターのようなリボゾーム
ターミネーター（ブロシウスとホーリイ（Brosius, J.
and Holy A.)、プロシーディングズオブナショナルアカ
デミーオブサイエンシーズオブユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA）第８１巻、６９２９−６９３３頁
（１９８４年）；ブロシウス（Brosius, J.)ら、プラス
ミッド（Plasmid)第６巻、１１２−１１８頁（１９８４
年））。適切なプロモーターは宿主細胞中で目的の遺伝
子を最大に発現するものであり、プロモーター作成に際
し考慮すべき因子はオールドとプリムローズ（Old and
Primrose）が遺伝子操作の原理（Principles of Gene M
anipulation)第３版の第７章（ブラックウェルサイエン
ティフィック出版（Blackwell Scientific Publicatio
n）、カリホルニア州パロアルト（Palo Alto)、１９８
５年）で議論している。クローン化遺伝子の発現に適し
た細菌性プロモーターの例としては、ＰＬ、ｔａｃ、ｌ
ａｃ、およびｔｒｐプロモーター（前述）がある。キメ
ラ遺伝子融合体を作成するのに用いるＤＮＡは、生物体
から得ることもできるし、新規の合成ＤＮＡでもよい
し、または両者の組合せでもよい。ＤＮＡ配列はキメラ
遺伝子中に取り込まれ、適当な宿主生物中で目的のポリ
ペプチドとアフィニティ樹脂への結合のためのポリペプ
チドが単一のポリペプチド鎖として産生されるように、
これがＤＮＡ発現ベクター中に挿入される。
トグラフィーを有効に使用するために、組換えＤＮＡ技
術を用いて組換えハイブリッドポリペプチドのキメラ遺
伝子融合体が作成される。このキメラ遺伝子融合体は細
菌宿主細胞中で以下の成分を取り込む：５’プロモータ
ー；目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ；リガンド
結合領域を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
そして随時大腸菌発現ベクターｐｋｋ２２３−３中に見
いだされるｒｒｎＢターミネーターのようなリボゾーム
ターミネーター（ブロシウスとホーリイ（Brosius, J.
and Holy A.)、プロシーディングズオブナショナルアカ
デミーオブサイエンシーズオブユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA）第８１巻、６９２９−６９３３頁
（１９８４年）；ブロシウス（Brosius, J.)ら、プラス
ミッド（Plasmid)第６巻、１１２−１１８頁（１９８４
年））。適切なプロモーターは宿主細胞中で目的の遺伝
子を最大に発現するものであり、プロモーター作成に際
し考慮すべき因子はオールドとプリムローズ（Old and
Primrose）が遺伝子操作の原理（Principles of Gene M
anipulation)第３版の第７章（ブラックウェルサイエン
ティフィック出版（Blackwell Scientific Publicatio
n）、カリホルニア州パロアルト（Palo Alto)、１９８
５年）で議論している。クローン化遺伝子の発現に適し
た細菌性プロモーターの例としては、ＰＬ、ｔａｃ、ｌ
ａｃ、およびｔｒｐプロモーター（前述）がある。キメ
ラ遺伝子融合体を作成するのに用いるＤＮＡは、生物体
から得ることもできるし、新規の合成ＤＮＡでもよい
し、または両者の組合せでもよい。ＤＮＡ配列はキメラ
遺伝子中に取り込まれ、適当な宿主生物中で目的のポリ
ペプチドとアフィニティ樹脂への結合のためのポリペプ
チドが単一のポリペプチド鎖として産生されるように、
これがＤＮＡ発現ベクター中に挿入される。
【０００９】本発明において結合領域または認識配列が
補欠分子族（例えばビオチン）のハイブリッドポリペプ
チドへの結合を指令する。ビオチン化ハイブリッドポリ
ペプチドは、アフィニティリガンド組成物（例えばアビ
ジンモノマー樹脂）（米国特許出願第４１４，７８５
号）により特異的に選択される。従って単一の精製ステ
ップにより複雑な混合物（例えば粗細菌溶解物）から目
的の蛋白を分離でき、単一のクロマトグラフィーステッ
プにより高レベルで回収でき、多ステップ精製過程に伴
う回収の問題を緩和することができる。ハイブリッドポ
リペプチドとアビジンモノマーアフィニティ樹脂のこの
ような組合せは、商業的に有用なポリペプチドの精製に
おいて、既存方法に対して大きな利点がある。
補欠分子族（例えばビオチン）のハイブリッドポリペプ
チドへの結合を指令する。ビオチン化ハイブリッドポリ
ペプチドは、アフィニティリガンド組成物（例えばアビ
ジンモノマー樹脂）（米国特許出願第４１４，７８５
号）により特異的に選択される。従って単一の精製ステ
ップにより複雑な混合物（例えば粗細菌溶解物）から目
的の蛋白を分離でき、単一のクロマトグラフィーステッ
プにより高レベルで回収でき、多ステップ精製過程に伴
う回収の問題を緩和することができる。ハイブリッドポ
リペプチドとアビジンモノマーアフィニティ樹脂のこの
ような組合せは、商業的に有用なポリペプチドの精製に
おいて、既存方法に対して大きな利点がある。
【００１０】ハイブリッド組換えポリペプチドの他のア
フィニティ精製法が記載されているが、多くの技術的困
難さがその商業規模のポリペプチド精製への利用を限定
している。例えばポリアルギニンＣ−末端テイル（tai
l）（サセンフェルドとブルーワー（Sassenfeld and Br
ewer)、バイオテクノロジー（Biotechnology)第２巻、
７６−８１頁（１９８４年））、またはポリヒスチジン
領域（スミス（Smith ）ら、ジャーナルオブバイオロジ
カルケミストリー（J. Biol. Chem.）第２６３巻、７２
１１頁（１９８８年））を含有するポリペプチドをコー
ドするキメラ遺伝子は、イオン交換または金属キレート
イオンクロマトグラフィーによる分離を促進する。アフ
ィニティ相互作用は融合ポリペプチドの物理学的性質
（キレート金属に対する荷電性）に依存し、これらの物
理学的性質を充分変化させてアフィニティ結合を達成す
ることは必ずしも可能ではないため、このような系は広
く応用することはできない。
フィニティ精製法が記載されているが、多くの技術的困
難さがその商業規模のポリペプチド精製への利用を限定
している。例えばポリアルギニンＣ−末端テイル（tai
l）（サセンフェルドとブルーワー（Sassenfeld and Br
ewer)、バイオテクノロジー（Biotechnology)第２巻、
７６−８１頁（１９８４年））、またはポリヒスチジン
領域（スミス（Smith ）ら、ジャーナルオブバイオロジ
カルケミストリー（J. Biol. Chem.）第２６３巻、７２
１１頁（１９８８年））を含有するポリペプチドをコー
ドするキメラ遺伝子は、イオン交換または金属キレート
イオンクロマトグラフィーによる分離を促進する。アフ
ィニティ相互作用は融合ポリペプチドの物理学的性質
（キレート金属に対する荷電性）に依存し、これらの物
理学的性質を充分変化させてアフィニティ結合を達成す
ることは必ずしも可能ではないため、このような系は広
く応用することはできない。
【００１１】もう１つのタイプのアフィニティクロマト
グラフィーは免疫アフィニティクロマトグラフィーであ
り、ここでは精製のために目的のポリペプチドは大腸菌
のベータガラクトシダーゼ（ルーテルとムラーヒル（Ru
ther and Muller-Hill）、イー・エム・ビー・オー・ジ
ェイ（EMBO J.)第２巻、１７９１−１７９４頁（１９８
３年））、または小さい親水性ペプチド（ホップ（Hop
p）ら、ユーエス（US）４，７０３，００４（１９８８
年））のような免疫原性蛋白に融合される。ブドウ球菌
プロテインＡ（protein A)に結合したプロテインＡはＩ
ｇＧセファロースを用いて精製できる（ニルソン（Nils
son)ら、イー・エム・ビー・オー・ジェイ（EMBO J.)第
４巻、１０７５−１０８０頁（１９８５年）、ローウェ
ナドラー（Lowenadler）ら、イー・エム・ビー・オー・
ジェイ（EMBO J.)第５巻、２３９３−２３９８頁（１９
８６年））。プロテインＧに結合したポリペプチドは固
定化リガンドとしてアルブミンを用いることにより単離
できる（ニグレン（Nygren）ら、ジェイ・モル・リコグ
ニション（J. Mol. Recognition)第１巻、６９頁（１９
８８年））。これらの方法の有用性を限定している決定
的な欠点は、アフィニティ樹脂からの融合蛋白の分離
に、変性剤の使用を含む極端な条件が必要なことであ
り、これは天然の折り畳み（natural folding)が達成さ
れなければ生物活性を損なう可能性がある。生成物の回
収率が低いこともこれらの系の有用性を限定している。
グラフィーは免疫アフィニティクロマトグラフィーであ
り、ここでは精製のために目的のポリペプチドは大腸菌
のベータガラクトシダーゼ（ルーテルとムラーヒル（Ru
ther and Muller-Hill）、イー・エム・ビー・オー・ジ
ェイ（EMBO J.)第２巻、１７９１−１７９４頁（１９８
３年））、または小さい親水性ペプチド（ホップ（Hop
p）ら、ユーエス（US）４，７０３，００４（１９８８
年））のような免疫原性蛋白に融合される。ブドウ球菌
プロテインＡ（protein A)に結合したプロテインＡはＩ
ｇＧセファロースを用いて精製できる（ニルソン（Nils
son)ら、イー・エム・ビー・オー・ジェイ（EMBO J.)第
４巻、１０７５−１０８０頁（１９８５年）、ローウェ
ナドラー（Lowenadler）ら、イー・エム・ビー・オー・
ジェイ（EMBO J.)第５巻、２３９３−２３９８頁（１９
８６年））。プロテインＧに結合したポリペプチドは固
定化リガンドとしてアルブミンを用いることにより単離
できる（ニグレン（Nygren）ら、ジェイ・モル・リコグ
ニション（J. Mol. Recognition)第１巻、６９頁（１９
８８年））。これらの方法の有用性を限定している決定
的な欠点は、アフィニティ樹脂からの融合蛋白の分離
に、変性剤の使用を含む極端な条件が必要なことであ
り、これは天然の折り畳み（natural folding)が達成さ
れなければ生物活性を損なう可能性がある。生成物の回
収率が低いこともこれらの系の有用性を限定している。
【００１２】大きな蛋白による低分子の結合に基づくア
フィニティは、基質アフィニティクロマトグラフィーと
して知られている。低分子であるリガンドは特異的なリ
ゲート（ligate）と複合体を形成する。リガンド：リゲ
ートの組合せの例としては、アビジン：ビオチン（グリ
ーン（Green)）、蛋白化学の進歩（Advances in Proein
Chemistry）第２９巻、８５−１３３頁、アンソン（An
son)ら編、（１９８５年））、ストレプトアビジン：ビ
オチン（ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１９０１、ミードとガル
ビン（Meade and Garvin）（１９８５年））、リポ酸：
アビジン（グリーン（Green)、前述）、クロランフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ：アセチルＣｏＡ
（ＥＰＯ ０１３１３６３、ベネット（Bennet）ら（１
９８４年））、ベータガラクトシダーゼ：パラ−アミノ
−フェニル−ベータ−Ｄ−チオ−ガラクトシド（オフェ
ンバーガー（Offenberger)ら、プロシーディングズオブ
ナショナルアカデミーオブサイエンシーズオブユーエス
エー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）第８２巻、７５４
０−７５４４頁（１９８５年））、マルトース結合蛋
白：デンプン（ＥＰＯ２８６２３９、グアン（Guan）
ら、１９８８年）、およびグルタチオン−Ｓ−トランス
フェラーゼ：グルタチオン（スミスとジョンソン（Smit
h and Johnson)、ジーン（Gene）第６７巻、２１−３０
頁（１９８８年））がある。
フィニティは、基質アフィニティクロマトグラフィーと
して知られている。低分子であるリガンドは特異的なリ
ゲート（ligate）と複合体を形成する。リガンド：リゲ
ートの組合せの例としては、アビジン：ビオチン（グリ
ーン（Green)）、蛋白化学の進歩（Advances in Proein
Chemistry）第２９巻、８５−１３３頁、アンソン（An
son)ら編、（１９８５年））、ストレプトアビジン：ビ
オチン（ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１９０１、ミードとガル
ビン（Meade and Garvin）（１９８５年））、リポ酸：
アビジン（グリーン（Green)、前述）、クロランフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ：アセチルＣｏＡ
（ＥＰＯ ０１３１３６３、ベネット（Bennet）ら（１
９８４年））、ベータガラクトシダーゼ：パラ−アミノ
−フェニル−ベータ−Ｄ−チオ−ガラクトシド（オフェ
ンバーガー（Offenberger)ら、プロシーディングズオブ
ナショナルアカデミーオブサイエンシーズオブユーエス
エー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）第８２巻、７５４
０−７５４４頁（１９８５年））、マルトース結合蛋
白：デンプン（ＥＰＯ２８６２３９、グアン（Guan）
ら、１９８８年）、およびグルタチオン−Ｓ−トランス
フェラーゼ：グルタチオン（スミスとジョンソン（Smit
h and Johnson)、ジーン（Gene）第６７巻、２１−３０
頁（１９８８年））がある。
【００１３】近年補欠分子族ビオチンと、蛋白アビジン
とストレプトアビジン（グリーン、前述）に対する極め
て高いアフィニティ（１０１５Ｍ−１）を利用して、微
生物学、生化学および医学分野の強力で広く応用できる
手段が工夫されている（ウィルチェックとバイアー（Wl
chek and Bayer）、アナリティカルケミストリー（Anal
yt Biochem）第１７１巻、１−３２頁（１９８８年）、
バイアーとウィルチェック（Bayer and Wilchek ）、メ
ソッズ・イン・ビオケム・アナル（Methods inBiochem
Anal ）第２６巻、１−４５頁（１９８０年））。
とストレプトアビジン（グリーン、前述）に対する極め
て高いアフィニティ（１０１５Ｍ−１）を利用して、微
生物学、生化学および医学分野の強力で広く応用できる
手段が工夫されている（ウィルチェックとバイアー（Wl
chek and Bayer）、アナリティカルケミストリー（Anal
yt Biochem）第１７１巻、１−３２頁（１９８８年）、
バイアーとウィルチェック（Bayer and Wilchek ）、メ
ソッズ・イン・ビオケム・アナル（Methods inBiochem
Anal ）第２６巻、１−４５頁（１９８０年））。
【００１４】ビオチン（アン・エヌ・ワイ・アカド・サ
イ（Ann N. Y. Acad. Sci ）第４４７巻、１−４４１
頁、ダクシナムルチとバガバン（Dakshinamurti and Bh
agavan）（１９８５年））はほんのわずかの蛋白種で見
いだされる補欠分子族である。インビボでの結合にはビ
オチンホロエンザイムシンセターゼ（biotin holoenzym
e synthetases)が介在し、これは高度に保存された領域
を認識し、この領域へのビオチンの共有結合を触媒する
（ウッド（Wood）ら、ジャーナルオブバイオロジカルケ
ミストリー（J. Biol. Chem.）第２５５巻、７３９７−
７４０９頁（１９８０年）；シェノイとウッド（shenoy
and Wood)、エフエーエスシービー・エス（FASCB S)第
２巻、２３９６−２４０１頁（１９８８年））。組換え
ＤＮＡ技術を用いる実験により、ビオチンホロエンザイ
ムシンセターゼはこの保存結合領域を含む異種蛋白をビ
オチン化することが証明されている。例えばこの保存配
列を含む、プロピオニバクテリウム（Propionibacteriu
m)からの酵素トランスカルボキシラーゼの１．３Ｓサブ
ユニットは、大腸菌中でクローン化し発現された時、大
腸菌シンセターゼによりビオチン化される（マーチフ
（Murtif）ら、プロシーディングズオブナショナルアカ
デミーオブサイエンシーズオブユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA）第８２巻、５６１７−５６２１頁
（１９８５年））。
イ（Ann N. Y. Acad. Sci ）第４４７巻、１−４４１
頁、ダクシナムルチとバガバン（Dakshinamurti and Bh
agavan）（１９８５年））はほんのわずかの蛋白種で見
いだされる補欠分子族である。インビボでの結合にはビ
オチンホロエンザイムシンセターゼ（biotin holoenzym
e synthetases)が介在し、これは高度に保存された領域
を認識し、この領域へのビオチンの共有結合を触媒する
（ウッド（Wood）ら、ジャーナルオブバイオロジカルケ
ミストリー（J. Biol. Chem.）第２５５巻、７３９７−
７４０９頁（１９８０年）；シェノイとウッド（shenoy
and Wood)、エフエーエスシービー・エス（FASCB S)第
２巻、２３９６−２４０１頁（１９８８年））。組換え
ＤＮＡ技術を用いる実験により、ビオチンホロエンザイ
ムシンセターゼはこの保存結合領域を含む異種蛋白をビ
オチン化することが証明されている。例えばこの保存配
列を含む、プロピオニバクテリウム（Propionibacteriu
m)からの酵素トランスカルボキシラーゼの１．３Ｓサブ
ユニットは、大腸菌中でクローン化し発現された時、大
腸菌シンセターゼによりビオチン化される（マーチフ
（Murtif）ら、プロシーディングズオブナショナルアカ
デミーオブサイエンシーズオブユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA）第８２巻、５６１７−５６２１頁
（１９８５年））。
【００１５】保存されたビオチン結合領域を含むポリペ
プチドまたはポリペプチドの一部（例えばプロピオニバ
クテリウムからの１．３Ｓ全１．３Ｓ（ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１）蛋白、または１．３Ｓ蛋白内で同定されたビオ
チン結合認識配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２））は、ハイブ
リッド組換えポリペプチド中に導入される。１つまたは
それ以上の目的のポリペプチドに結合したビオチン結合
領域を含むこのようなハイブリッドポリペプチドを用い
て、リガンドアビジンのリゲートビオチンに対するアフ
ィニティに基づいて、実質的に任意の組換え蛋白が分離
される。
プチドまたはポリペプチドの一部（例えばプロピオニバ
クテリウムからの１．３Ｓ全１．３Ｓ（ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１）蛋白、または１．３Ｓ蛋白内で同定されたビオ
チン結合認識配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２））は、ハイブ
リッド組換えポリペプチド中に導入される。１つまたは
それ以上の目的のポリペプチドに結合したビオチン結合
領域を含むこのようなハイブリッドポリペプチドを用い
て、リガンドアビジンのリゲートビオチンに対するアフ
ィニティに基づいて、実質的に任意の組換え蛋白が分離
される。
【００１６】アビジン：ビオチンクロマトグラフィー
は、商業規模のポリペプチド精製のための基質アフィニ
ティクロマトグラフィー系に一般的に応用できるという
利点を有する。基質アフィニティ樹脂は一般的に廉価で
ある。融合蛋白は穏和な条件を用いて遊離のリガンドに
よる溶出で回収される。ビオチン補欠分子族の翻訳後の
添加は、蛋白の最終の折り畳み状態には依存せず（ウッ
ド（Wood）ら、ジャーナルオブバイオロジカルケミスト
リー（J. Biol. Chem.）第２５５巻、７３９７−７４０
９頁（１９８０年）、これは組換えポリペプチドに対し
て宿主細胞が翻訳後の修飾を加えないとき有利な点であ
る。ビオチン結合を指令するようなリガンド領域は、ア
フィニティクロマトグラフィー前の、封入体中に見いだ
される融合蛋白の回収、または抽出中に溶解用の変性剤
や両性イオン活性剤を必要とする不溶性蛋白の回収に特
に有効である。
は、商業規模のポリペプチド精製のための基質アフィニ
ティクロマトグラフィー系に一般的に応用できるという
利点を有する。基質アフィニティ樹脂は一般的に廉価で
ある。融合蛋白は穏和な条件を用いて遊離のリガンドに
よる溶出で回収される。ビオチン補欠分子族の翻訳後の
添加は、蛋白の最終の折り畳み状態には依存せず（ウッ
ド（Wood）ら、ジャーナルオブバイオロジカルケミスト
リー（J. Biol. Chem.）第２５５巻、７３９７−７４０
９頁（１９８０年）、これは組換えポリペプチドに対し
て宿主細胞が翻訳後の修飾を加えないとき有利な点であ
る。ビオチン結合を指令するようなリガンド領域は、ア
フィニティクロマトグラフィー前の、封入体中に見いだ
される融合蛋白の回収、または抽出中に溶解用の変性剤
や両性イオン活性剤を必要とする不溶性蛋白の回収に特
に有効である。
【００１７】クローナン（Cronann)（ジャーナルオブバ
イオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）第２６５
巻、１０３２７−１０３３３頁（１９９０年））は、
１．３Ｓ遺伝子を含む融合遺伝子（ビオチン結合領域を
含む）を作成するのに、大腸菌からの組換えＤＮＡプラ
スミッド（マーチフ（Murtif）ら、プロシーディングズ
オブナショナルアカデミーオブサイエンシーズオブユー
エスエー（Proc. Natl.Acad. Sci. USA）第８２巻、５
６１７−５６２１頁（１９８５年））を使用した。クロ
ーナン（Cronann)（前述）は、１．３Ｓ配列はインビボ
で蛋白を特異的に標識するのに、およびアビジンアフィ
ニティクロマトグラフィーにより粗細胞溶解物から蛋白
を精製するのに使用できることを証明した。
イオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）第２６５
巻、１０３２７−１０３３３頁（１９９０年））は、
１．３Ｓ遺伝子を含む融合遺伝子（ビオチン結合領域を
含む）を作成するのに、大腸菌からの組換えＤＮＡプラ
スミッド（マーチフ（Murtif）ら、プロシーディングズ
オブナショナルアカデミーオブサイエンシーズオブユー
エスエー（Proc. Natl.Acad. Sci. USA）第８２巻、５
６１７−５６２１頁（１９８５年））を使用した。クロ
ーナン（Cronann)（前述）は、１．３Ｓ配列はインビボ
で蛋白を特異的に標識するのに、およびアビジンアフィ
ニティクロマトグラフィーにより粗細胞溶解物から蛋白
を精製するのに使用できることを証明した。
【００１８】クローナン（Cronann)（前述）のキメラ遺
伝子は、１．３Ｓ遺伝子５’末端に目的の遺伝子の３’
末端を結合させて作成され、１．３ＳポリペプチドのＮ
−末端に結合した目的のポリペプチドを有するハイブリ
ッド組換えポリペプチドが得られた。このような融合は
マーチフとサモルズ（Murtif and Samols)（ジャーナル
オブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）第
２６２巻、１１８１３−１１８１６頁（１９８７年））
の理論に一致しており、彼らはビオチンのその結合領域
への結合を妨害を避けるために、１．３Ｓ遺伝子の５’
末端（１．３ＳポリペプチドのＮ−末端）への目的の遺
伝子の３’末端の融合を記載している。マーチフとサモ
ルズ（Murtif and Samols)（前述）は、１．３Ｓポリペ
プチドのＣＯＯＨ末端の構造と、この領域とインビボで
ビオチンが結合するＣＯＯＨ末端からのちょうど３５残
基目に位置するリジン残基との空間的関係が、酵素によ
る正しい認識と１．３Ｓポリペプチドのビオチン化に必
須であると記載している。さらにマーチフとサモルズ
（Murtif and Samols)（前述）は、１．３Ｓポリペプチ
ドのカルボキシル末端領域の構造はビオチン化に必須で
あり、１．３Ｓポリペプチドのカルボキシル末端領域の
疎水性を変更すると「ビオチン化が排除される」と記載
している。マーチフとサモルズ（Murtif and Samols)は
１．３Ｓカルボキシル末端で２個のアミノ酸でそれぞれ
延長された１．３Ｓポリペプチドのビオチン化を確かに
観察した。しかしＣ−末端にこのような２個のアミノ酸
を追加することは、その疎水性を実質的に変化させず、
このような小さな追加はＣ−末端の構造を変化させない
であろうと考えられる。従ってマーチフとサモルズ（Mu
rtif and Samols)（前述）とクローナン（Cronann)（前
述）はビオチン結合領域の正しい構造が保持されるよう
に、１．３Ｓポリペプチドまたは１．３Ｓポリペプチド
の断片のＣＯＯＨ末端への目的のポリペプチドの融合か
ら離れて記載している。
伝子は、１．３Ｓ遺伝子５’末端に目的の遺伝子の３’
末端を結合させて作成され、１．３ＳポリペプチドのＮ
−末端に結合した目的のポリペプチドを有するハイブリ
ッド組換えポリペプチドが得られた。このような融合は
マーチフとサモルズ（Murtif and Samols)（ジャーナル
オブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）第
２６２巻、１１８１３−１１８１６頁（１９８７年））
の理論に一致しており、彼らはビオチンのその結合領域
への結合を妨害を避けるために、１．３Ｓ遺伝子の５’
末端（１．３ＳポリペプチドのＮ−末端）への目的の遺
伝子の３’末端の融合を記載している。マーチフとサモ
ルズ（Murtif and Samols)（前述）は、１．３Ｓポリペ
プチドのＣＯＯＨ末端の構造と、この領域とインビボで
ビオチンが結合するＣＯＯＨ末端からのちょうど３５残
基目に位置するリジン残基との空間的関係が、酵素によ
る正しい認識と１．３Ｓポリペプチドのビオチン化に必
須であると記載している。さらにマーチフとサモルズ
（Murtif and Samols)（前述）は、１．３Ｓポリペプチ
ドのカルボキシル末端領域の構造はビオチン化に必須で
あり、１．３Ｓポリペプチドのカルボキシル末端領域の
疎水性を変更すると「ビオチン化が排除される」と記載
している。マーチフとサモルズ（Murtif and Samols)は
１．３Ｓカルボキシル末端で２個のアミノ酸でそれぞれ
延長された１．３Ｓポリペプチドのビオチン化を確かに
観察した。しかしＣ−末端にこのような２個のアミノ酸
を追加することは、その疎水性を実質的に変化させず、
このような小さな追加はＣ−末端の構造を変化させない
であろうと考えられる。従ってマーチフとサモルズ（Mu
rtif and Samols)（前述）とクローナン（Cronann)（前
述）はビオチン結合領域の正しい構造が保持されるよう
に、１．３Ｓポリペプチドまたは１．３Ｓポリペプチド
の断片のＣＯＯＨ末端への目的のポリペプチドの融合か
ら離れて記載している。
【００１９】従って２つのアミノ酸残基より実質的に長
いポリペプチドのの追加はマーチフとサモルズ（Murtif
and Samols)の理論から、１．３ＳポリペプチドのＣ−
末端の構造を変化させビオチン化を妨害すると予想され
るため、マーチフとサモルズ（Murtif and Samols)（前
述）とクローナン（Cronann)（前述）の理論に反して、
１．３ＳポリペプチドのＣ−末端に目的のポリペプチド
を融合し、ハイブリッド内の１．３Ｓポリペプチドの適
当なリジン残基が、確かにビオチン化されたことを発見
するのは驚くべきことであった。さらに１．３Ｓポリペ
プチドが目的のポリペプチドのＣ−末端に融合している
ハイブリッドポリペプチドが、アビジンモノマーアフィ
ニティクロマトグラフィー（米国特許出願第４１４，７
８５号）を用いて１ステップのクロマトグラフィーで高
純度および高収率で回収された。
いポリペプチドのの追加はマーチフとサモルズ（Murtif
and Samols)の理論から、１．３ＳポリペプチドのＣ−
末端の構造を変化させビオチン化を妨害すると予想され
るため、マーチフとサモルズ（Murtif and Samols)（前
述）とクローナン（Cronann)（前述）の理論に反して、
１．３ＳポリペプチドのＣ−末端に目的のポリペプチド
を融合し、ハイブリッド内の１．３Ｓポリペプチドの適
当なリジン残基が、確かにビオチン化されたことを発見
するのは驚くべきことであった。さらに１．３Ｓポリペ
プチドが目的のポリペプチドのＣ−末端に融合している
ハイブリッドポリペプチドが、アビジンモノマーアフィ
ニティクロマトグラフィー（米国特許出願第４１４，７
８５号）を用いて１ステップのクロマトグラフィーで高
純度および高収率で回収された。
【００２０】さらに目的のポリペプチドを１．３Ｓポリ
ペプチドのＮ−末端ではなくＣ−末端に融合させること
による利点がある。宿主細胞中の蛋白発現レベルは、プ
ロモーターの強度や最適な蛋白翻訳の開始（前述）など
の種々の因子により決定される。プロモーターの強度は
メッセンジャーＲＮＡの転写の効率に寄与する。翻訳開
始に関与する過程の最適化は、宿主細胞中の蛋白発現の
高レベルを達成するのに重要である。目的のポリペプチ
ドが１．３Ｓ遺伝子の３’末端で導入される時プロモー
ターや５’制御配列に直接隣接する１．３Ｓ遺伝子の
５’末端の最適位置には変化は生じない。プロモーター
と１．３Ｓ遺伝子の５’末端の間に目的のポリペプチド
を挿入するには、宿主細胞中で最大の発現レベルを達成
するために追加の実験が必要かも知れない。
ペプチドのＮ−末端ではなくＣ−末端に融合させること
による利点がある。宿主細胞中の蛋白発現レベルは、プ
ロモーターの強度や最適な蛋白翻訳の開始（前述）など
の種々の因子により決定される。プロモーターの強度は
メッセンジャーＲＮＡの転写の効率に寄与する。翻訳開
始に関与する過程の最適化は、宿主細胞中の蛋白発現の
高レベルを達成するのに重要である。目的のポリペプチ
ドが１．３Ｓ遺伝子の３’末端で導入される時プロモー
ターや５’制御配列に直接隣接する１．３Ｓ遺伝子の
５’末端の最適位置には変化は生じない。プロモーター
と１．３Ｓ遺伝子の５’末端の間に目的のポリペプチド
を挿入するには、宿主細胞中で最大の発現レベルを達成
するために追加の実験が必要かも知れない。
【００２１】本発明の目的は、目的のポリペプチドはア
ビジン結合性ポリペプチドのＣ−末端でアビジン結合性
ポリペプチドに融合している、ビオチン結合のための領
域を含むアビジン結合性ポリペプチドに融合している目
的のポリペプチドよりなる、組換えハイブリッドポリペ
プチドを与えることである。
ビジン結合性ポリペプチドのＣ−末端でアビジン結合性
ポリペプチドに融合している、ビオチン結合のための領
域を含むアビジン結合性ポリペプチドに融合している目
的のポリペプチドよりなる、組換えハイブリッドポリペ
プチドを与えることである。
【００２２】本発明の別の目的は、目的のポリペプチド
のＤＮＡは、アビジン結合性ポリペプチドをコードする
ＤＮＡの３’末端でアビジン結合性ポリペプチドに融合
している、ビオチン結合のための領域を含むポリペプチ
ドをコードするＤＮＡに融合している、目的のポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子をコー
ドするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ発現ベクターを与えるこ
とである。
のＤＮＡは、アビジン結合性ポリペプチドをコードする
ＤＮＡの３’末端でアビジン結合性ポリペプチドに融合
している、ビオチン結合のための領域を含むポリペプチ
ドをコードするＤＮＡに融合している、目的のポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子をコー
ドするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ発現ベクターを与えるこ
とである。
【００２３】本発明のさらに別の目的は、、ハイブリッ
ドポリペプチドのプラスミッドを作成し、このプラスミ
ッドを原核および真核宿主細胞発現系に形質転換（tran
sformation）して、この発現系から得られるハイブリッ
ドポリペプチドをアビジンと接触させて、得られる目的
のアビジンが結合した目的のハイブリッドポリペプチド
を採取することにより、目的のハイブリッドポリペプチ
ドを産生する方法を与えることである。
ドポリペプチドのプラスミッドを作成し、このプラスミ
ッドを原核および真核宿主細胞発現系に形質転換（tran
sformation）して、この発現系から得られるハイブリッ
ドポリペプチドをアビジンと接触させて、得られる目的
のアビジンが結合した目的のハイブリッドポリペプチド
を採取することにより、目的のハイブリッドポリペプチ
ドを産生する方法を与えることである。
【００２４】他の目的と利点は以下のさらに完全な記載
と請求の範囲により明らかになるであろう。
と請求の範囲により明らかになるであろう。
【００２５】図面の説明 図１．プラスミッドｐｔａｃｌ．３ｄｐの部分制限地
図。 図２．目的のポリペプチドが結合のためのポリペプチド
のＣ−末端に融合するように作成した、ハイブリッドポ
リペプチドのキメラ遺伝子作成体。 図３．結合のための１つのポリペプチドに融合した、２
つ以上の目的のポリペプチドを含むハイブリッドポリペ
プチドのキメラ遺伝子。 図４．それぞれ非隣接性（noncontiguous)の結合のため
のポリペプチドのＣ−末端に融合している、２つの非隣
接性の目的のポリペプチドを含むハイブリッドポリペプ
チドのキメラ遺伝子作成体。
図。 図２．目的のポリペプチドが結合のためのポリペプチド
のＣ−末端に融合するように作成した、ハイブリッドポ
リペプチドのキメラ遺伝子作成体。 図３．結合のための１つのポリペプチドに融合した、２
つ以上の目的のポリペプチドを含むハイブリッドポリペ
プチドのキメラ遺伝子。 図４．それぞれ非隣接性（noncontiguous)の結合のため
のポリペプチドのＣ−末端に融合している、２つの非隣
接性の目的のポリペプチドを含むハイブリッドポリペプ
チドのキメラ遺伝子作成体。
【００２６】大まかに言えば本発明は、（１）ハイブリ
ッドポリペプチドはビオチン化アビジン結合性ポリペプ
チドよりなる、目的のポリペプチドがアビジンに結合す
るためのビオチン基の結合のためのハイブリッドポリペ
プチドと、（２）アビジン結合性ポリペプチドに融合し
た少なくとも１つの目的のポリペプチドであって、この
アビジン結合性ポリペプチドのＣ−末端でビオチン化ア
ビジン結合性ポリペプチドに融合した、少なくとも１つ
の目的のポリペプチド、よりなる組成物に関する。
ッドポリペプチドはビオチン化アビジン結合性ポリペプ
チドよりなる、目的のポリペプチドがアビジンに結合す
るためのビオチン基の結合のためのハイブリッドポリペ
プチドと、（２）アビジン結合性ポリペプチドに融合し
た少なくとも１つの目的のポリペプチドであって、この
アビジン結合性ポリペプチドのＣ−末端でビオチン化ア
ビジン結合性ポリペプチドに融合した、少なくとも１つ
の目的のポリペプチド、よりなる組成物に関する。
【００２７】本発明はまた、コード鎖（coding strand)
上で５’から３’方向へ、５’プロモーター領域よりな
る遺伝子、アビジンへの結合のためのビオチンの結合の
ためのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および目
的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、ＤＮ
Ａ発現ベクターに関する。
上で５’から３’方向へ、５’プロモーター領域よりな
る遺伝子、アビジンへの結合のためのビオチンの結合の
ためのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および目
的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、ＤＮ
Ａ発現ベクターに関する。
【００２８】本発明はさらに、コード鎖上で５’から
３’方向へ、５’プロモーター領域よりなる遺伝子、ア
ビジンへの結合のためのビオチンの結合をコードするＤ
ＮＡ配列、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
を含むプラスミッドを形成し、このプラスミッドを原核
および真核宿主細胞発現系に形質転換させ、この宿主細
胞発現系から得られるハイブリッドポリペプチドをアビ
ジンと接触させ、こうして得られるアビジンが結合した
目的のハイブリッドポリペプチドを採取することよりな
る、目的のポリペプチドの産生方法に関する。
３’方向へ、５’プロモーター領域よりなる遺伝子、ア
ビジンへの結合のためのビオチンの結合をコードするＤ
ＮＡ配列、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
を含むプラスミッドを形成し、このプラスミッドを原核
および真核宿主細胞発現系に形質転換させ、この宿主細
胞発現系から得られるハイブリッドポリペプチドをアビ
ジンと接触させ、こうして得られるアビジンが結合した
目的のハイブリッドポリペプチドを採取することよりな
る、目的のポリペプチドの産生方法に関する。
【００２９】クローナン（Ｃｒｏｎａｎｎ）（前述）と
マーチフとサモルズ（Ｍｕｒｔｉｆａｎｄ Ｓａｍｏｌ
ｓ）（前述）の理論に反して、１．３Ｓポリペプチドの
Ｃ−末端で１．３Ｓポリペプチドに目的のポリペプチド
を融合させる時、このハイブリッド組換えポリペプチド
内で１．３Ｓポリペプチドのビオチン結合のための領域
にビオチンが結合することを見いだしたことは、驚きで
ある。クローナン（Ｃｒｏｎａｎｎ）（前述）とマーチ
フとサモルズ（Ｍｕｒｔｉｆ ａｎｄ Ｓａｍｏｌｓ）
（前述）は、１．３ＳのＣ−末端での融合は本来の疎水
性を破壊し、１．３Ｓポリペプチドの本来の構造を破壊
し、従ってビオチン化を阻害して、その結果ハイブリッ
ドポリペプチドのアビジンへの結合を阻害する可能性が
あると記載している。さらに驚くべきことに、Ｃ−末端
で別のポリペプチドに融合している１．３Ｓペプチドに
結合したビオチン補欠分子族は前述したアビジンモノマ
ーアフィニティ樹脂（米国特許出願第４１４，７８５
号）へのハイブリッドポリペプチドの結合にビオチン分
子が利用できるように位置していることを見いだした。
ハイブリッドポリペプチドはアビジン樹脂に選択的に保
持され、高純度および高収率で回収される。
マーチフとサモルズ（Ｍｕｒｔｉｆａｎｄ Ｓａｍｏｌ
ｓ）（前述）の理論に反して、１．３Ｓポリペプチドの
Ｃ−末端で１．３Ｓポリペプチドに目的のポリペプチド
を融合させる時、このハイブリッド組換えポリペプチド
内で１．３Ｓポリペプチドのビオチン結合のための領域
にビオチンが結合することを見いだしたことは、驚きで
ある。クローナン（Ｃｒｏｎａｎｎ）（前述）とマーチ
フとサモルズ（Ｍｕｒｔｉｆ ａｎｄ Ｓａｍｏｌｓ）
（前述）は、１．３ＳのＣ−末端での融合は本来の疎水
性を破壊し、１．３Ｓポリペプチドの本来の構造を破壊
し、従ってビオチン化を阻害して、その結果ハイブリッ
ドポリペプチドのアビジンへの結合を阻害する可能性が
あると記載している。さらに驚くべきことに、Ｃ−末端
で別のポリペプチドに融合している１．３Ｓペプチドに
結合したビオチン補欠分子族は前述したアビジンモノマ
ーアフィニティ樹脂（米国特許出願第４１４，７８５
号）へのハイブリッドポリペプチドの結合にビオチン分
子が利用できるように位置していることを見いだした。
ハイブリッドポリペプチドはアビジン樹脂に選択的に保
持され、高純度および高収率で回収される。
【００３０】本発明によれば、１つまたはそれ以上の目
的のポリペプチドと、結合のための少なくとも１つのポ
リペプチドよりなるハイブリッドポリペプチドは組換え
ＤＮＡ法により産生される。１つまたは複数の切断性ア
ミノ酸が存在してもよい。このような結合性、または切
断性アミノ酸は、ポリペプチドを適当な化学試薬または
酵素で処理した時、ポリペプチドの特異的部位でポリペ
プチドの分離を可能にする。必要な場合は、目的のポリ
ペプチドが結合のためのポリペプチドから切断されるよ
うに、切断部位は目的のポリペプチドの隣に存在させ
る。クローニングベクターは複製され、ベクターにより
形質転換された原核または真核細胞中でハイブリッドポ
リペプチドが産生される。アビジンアフィニティクロマ
トグラフィーにより、複雑な細胞抽出混合物からハイブ
リッドポリペプチドが精製される。特に好適な型のアビ
ジンはアビジンモノマーである。細胞培養液または発酵
液（fermentation broth）から形質転換された細胞の抽
出物が作られ、ハイブリッドポリペプチドは可溶性状態
にされ、抽出物はアビジンモノマーカラムにかけられ
る。カラムを充分量の洗浄用緩衝液で洗浄して、非結合
物質をカラムから洗い流す。ハイブリッドポリペプチド
をカラムから溶出させる。カラムからハイブリッドポリ
ペプチドを溶出させた後、結合のためのポリペプチドを
随時適当な切断試薬または酵素で目的のポリペプチドか
ら切断する。アビジンモノマーカラムに切断された混合
物を通すことにより、高純度の目的のポリペプチドが得
られ、結合のためのポリペプチドはカラムに保持され
る。
的のポリペプチドと、結合のための少なくとも１つのポ
リペプチドよりなるハイブリッドポリペプチドは組換え
ＤＮＡ法により産生される。１つまたは複数の切断性ア
ミノ酸が存在してもよい。このような結合性、または切
断性アミノ酸は、ポリペプチドを適当な化学試薬または
酵素で処理した時、ポリペプチドの特異的部位でポリペ
プチドの分離を可能にする。必要な場合は、目的のポリ
ペプチドが結合のためのポリペプチドから切断されるよ
うに、切断部位は目的のポリペプチドの隣に存在させ
る。クローニングベクターは複製され、ベクターにより
形質転換された原核または真核細胞中でハイブリッドポ
リペプチドが産生される。アビジンアフィニティクロマ
トグラフィーにより、複雑な細胞抽出混合物からハイブ
リッドポリペプチドが精製される。特に好適な型のアビ
ジンはアビジンモノマーである。細胞培養液または発酵
液（fermentation broth）から形質転換された細胞の抽
出物が作られ、ハイブリッドポリペプチドは可溶性状態
にされ、抽出物はアビジンモノマーカラムにかけられ
る。カラムを充分量の洗浄用緩衝液で洗浄して、非結合
物質をカラムから洗い流す。ハイブリッドポリペプチド
をカラムから溶出させる。カラムからハイブリッドポリ
ペプチドを溶出させた後、結合のためのポリペプチドを
随時適当な切断試薬または酵素で目的のポリペプチドか
ら切断する。アビジンモノマーカラムに切断された混合
物を通すことにより、高純度の目的のポリペプチドが得
られ、結合のためのポリペプチドはカラムに保持され
る。
【００３１】図１にプラスミッドｐｔａｃ１．３ｄｐの
部分制限地図を示す。プラスミッドｐｔａｃ１．３ｄｐ
はディー・サモルス（D. samols)（ケースウェスタンリ
ザーブ大学（Case Western Reserve University)）から
得られたプラスミッドｐｔａｃ１．３ｔとｐｔａｃ１．
３（１−１２５）を修飾して作成された。
部分制限地図を示す。プラスミッドｐｔａｃ１．３ｄｐ
はディー・サモルス（D. samols)（ケースウェスタンリ
ザーブ大学（Case Western Reserve University)）から
得られたプラスミッドｐｔａｃ１．３ｔとｐｔａｃ１．
３（１−１２５）を修飾して作成された。
【００３２】プラスミッドｐｔａｃ１．３ｄｐを含む大
腸菌ＣＳＨ２６株は、アメリカンタイプカルチャーコレ
クション（American Type Culture Collection）（米国
メアリーランド州、ロックビル（Rockville)）に、ＡＴ
ＣＣＮｏ．６８９３７として寄託された。この寄託は
「特許手続きのための微生物の寄託の国際認識に関する
ブダペスト条約」（the Budapest Treaty on the Inter
national Recognition Of The Deposit Of Microorgani
sms For The Purpose Of Patent Procedure)に従って行
った。
腸菌ＣＳＨ２６株は、アメリカンタイプカルチャーコレ
クション（American Type Culture Collection）（米国
メアリーランド州、ロックビル（Rockville)）に、ＡＴ
ＣＣＮｏ．６８９３７として寄託された。この寄託は
「特許手続きのための微生物の寄託の国際認識に関する
ブダペスト条約」（the Budapest Treaty on the Inter
national Recognition Of The Deposit Of Microorgani
sms For The Purpose Of Patent Procedure)に従って行
った。
【００３３】図２に、ハイブリッドポリペプチドのキメ
ラ遺伝子作成体を示す。キメラ遺伝子は、目的のポリペ
プチドが結合のためのポリペプチドのＣ−末端で融合す
るように作成された。これらの例では目的のポリペプチ
ドは合成ｂ−エンドルフィンであり、結合のためのポリ
ペプチドはプロピオニバクテリウムシェルマニイ（Prop
ionibacterium shermanii)のトランスカルボキシラーゼ
からの１．３Ｓポリペプチドである。図２Ａでは、１．
３ＳポリペプチドのＣ−末端とｂ−エンドルフィンポリ
ペプチドのＮ−末端の間に存在するａｓｐ−ｐｒｏ切断
部位が示されている。図２Ｂでは、１．３Ｓポリペプチ
ドのＣ−末端と新規の逆エンドルフィン（reverse-endo
rphin)ポリペプチドのＮ−末端の間に存在するａｓｐ−
ｐｒｏ切断部位が示されている。図２Ｃでは、１．３Ｓ
ポリペプチドのＣ−末端とｂ−エンドルフィンポリペプ
チドのＮ−末端の間に存在するメチオニン切断部位が示
されている。図２Ｄでは、１．３ＳポリペプチドのＣ−
末端とｂ−エンドルフィンポリペプチドのＮ−末端の間
には切断部位は存在しない。
ラ遺伝子作成体を示す。キメラ遺伝子は、目的のポリペ
プチドが結合のためのポリペプチドのＣ−末端で融合す
るように作成された。これらの例では目的のポリペプチ
ドは合成ｂ−エンドルフィンであり、結合のためのポリ
ペプチドはプロピオニバクテリウムシェルマニイ（Prop
ionibacterium shermanii)のトランスカルボキシラーゼ
からの１．３Ｓポリペプチドである。図２Ａでは、１．
３ＳポリペプチドのＣ−末端とｂ−エンドルフィンポリ
ペプチドのＮ−末端の間に存在するａｓｐ−ｐｒｏ切断
部位が示されている。図２Ｂでは、１．３Ｓポリペプチ
ドのＣ−末端と新規の逆エンドルフィン（reverse-endo
rphin)ポリペプチドのＮ−末端の間に存在するａｓｐ−
ｐｒｏ切断部位が示されている。図２Ｃでは、１．３Ｓ
ポリペプチドのＣ−末端とｂ−エンドルフィンポリペプ
チドのＮ−末端の間に存在するメチオニン切断部位が示
されている。図２Ｄでは、１．３ＳポリペプチドのＣ−
末端とｂ−エンドルフィンポリペプチドのＮ−末端の間
には切断部位は存在しない。
【００３４】図３では、結合のための１つのポリペプチ
ドに融合した２つ以上の目的のポリペプチドを含む、ハ
イブリッドポリペプチドのキメラ遺伝子が示されてい
る。図３Ａでは、プロピオニバクテリウムシェルマニイ
（Propionibacterium shermanii)のトランスカルボキシ
ラーゼからの１．３ＳポリペプチドのＣ−末端への、２
つの隣接するｂ−エンドルフィンポリペプチドの融合が
示されている。図３Ｂでは、１．３Ｓポリペプチドへの
２つの異なる非隣接性の目的のポリペプチドの融合が示
されている。マルトース結合蛋白は１．３Ｓポリペプチ
ドのＮ−末端に融合しており、合成ｂ−エンドルフィン
は同じ１．３ＳポリペプチドのＣ−末端に融合してい
る。図３Ｃは、１．３ＳポリペプチドのＮ−末端への２
つの異なる隣接する目的のポリペプチドの融合を示す。
マルトース結合蛋白と合成ｂ−エンドルフィンポリペプ
チドは、１．３ＳポリペプチドのＮ−末端に直列に（in
tandem)融合している。
ドに融合した２つ以上の目的のポリペプチドを含む、ハ
イブリッドポリペプチドのキメラ遺伝子が示されてい
る。図３Ａでは、プロピオニバクテリウムシェルマニイ
（Propionibacterium shermanii)のトランスカルボキシ
ラーゼからの１．３ＳポリペプチドのＣ−末端への、２
つの隣接するｂ−エンドルフィンポリペプチドの融合が
示されている。図３Ｂでは、１．３Ｓポリペプチドへの
２つの異なる非隣接性の目的のポリペプチドの融合が示
されている。マルトース結合蛋白は１．３Ｓポリペプチ
ドのＮ−末端に融合しており、合成ｂ−エンドルフィン
は同じ１．３ＳポリペプチドのＣ−末端に融合してい
る。図３Ｃは、１．３ＳポリペプチドのＮ−末端への２
つの異なる隣接する目的のポリペプチドの融合を示す。
マルトース結合蛋白と合成ｂ−エンドルフィンポリペプ
チドは、１．３ＳポリペプチドのＮ−末端に直列に（in
tandem)融合している。
【００３５】図４では、２つの非隣接性の目的のポリペ
プチドを含むハイブリッドポリペプチドのキメラ遺伝子
作成体が示されている。各コード配列は、非隣接性の結
合のためのポリペプチドのＣ−末端に融合している。具
体的な例では、２つの合成ｂ−エンドルフィンポリペプ
チドがそれぞれ異なる１．３ＳポリペプチドのＣ−末端
に融合している。
プチドを含むハイブリッドポリペプチドのキメラ遺伝子
作成体が示されている。各コード配列は、非隣接性の結
合のためのポリペプチドのＣ−末端に融合している。具
体的な例では、２つの合成ｂ−エンドルフィンポリペプ
チドがそれぞれ異なる１．３ＳポリペプチドのＣ−末端
に融合している。
【００３６】
【目的のポリペプチド】目的のポリペプチドは、宿主細
胞中でベクターにより発現される実質的に任意の原核お
よび真核ポリペプチドよりなる。このような手段で産生
される目的のポリペプチドの中には、酵素（例えばプロ
テアーゼ、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リ
アーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなど）がある。
胞中でベクターにより発現される実質的に任意の原核お
よび真核ポリペプチドよりなる。このような手段で産生
される目的のポリペプチドの中には、酵素（例えばプロ
テアーゼ、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リ
アーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなど）がある。
【００３７】本発明はまた、保存ポリペプチド（例えば
フェリチンまたはアバルブミン）、または輸送ポリペプ
チド（例えばヘモグロビン、血清アルブミン、エルロプ
ラスミン（eruloplasmin）など）にも関する。さらに収
縮系および運動系の中で機能する型のポリペプチド（例
えばアクチンやミオシンなど）がある。
フェリチンまたはアバルブミン）、または輸送ポリペプ
チド（例えばヘモグロビン、血清アルブミン、エルロプ
ラスミン（eruloplasmin）など）にも関する。さらに収
縮系および運動系の中で機能する型のポリペプチド（例
えばアクチンやミオシンなど）がある。
【００３８】本発明はまた、保護性または防御性の機能
を有するポリペプチド（例えば血液ポリペプチドのトロ
ンビンやフィブリノーゲン）の産生にも関する。他の保
護性ポリペプチドとしては、結合性ポリペプチド（例え
ば抗原に結合して抗原を中和する抗体や免疫グロブリ
ン）も含まれる。さらに本発明はプロテインＡなども含
む。
を有するポリペプチド（例えば血液ポリペプチドのトロ
ンビンやフィブリノーゲン）の産生にも関する。他の保
護性ポリペプチドとしては、結合性ポリペプチド（例え
ば抗原に結合して抗原を中和する抗体や免疫グロブリ
ン）も含まれる。さらに本発明はプロテインＡなども含
む。
【００３９】本発明により産生されるポリペプチドはま
た、種々のホルモン（例えばエンドルフィン、ヒト成長
ホルモン、ソマトスタチン、プロラクチン、エストロゲ
ン、プロゲステロン、サイロトロピン、カルシトニン、
ゴナドトロピン、インシュリンなど）も含む。他のホル
モンとしては、免疫系に関与するとして同定されている
もの（例えばインターロイキン１、インターロイキン
２、コロニー刺激因子、マクロファージ活性化因子、イ
ンターフェロンなど）がある。
た、種々のホルモン（例えばエンドルフィン、ヒト成長
ホルモン、ソマトスタチン、プロラクチン、エストロゲ
ン、プロゲステロン、サイロトロピン、カルシトニン、
ゴナドトロピン、インシュリンなど）も含む。他のホル
モンとしては、免疫系に関与するとして同定されている
もの（例えばインターロイキン１、インターロイキン
２、コロニー刺激因子、マクロファージ活性化因子、イ
ンターフェロンなど）がある。
【００４０】本発明は、毒性ポリペプチド（例えばヒマ
（castor bean ）からのリシン（ricina）または綿実か
らのゴシピン（gossypin）など）の産生にも使用され
る。
（castor bean ）からのリシン（ricina）または綿実か
らのゴシピン（gossypin）など）の産生にも使用され
る。
【００４１】構成要素として作用するポリペプチドも本
発明に含まれる（例えば繊維性ポリペプチドのコラーゲ
ン、エラスチンおよびアルファ−ケラチン）。他の構成
ポリペプチドとしては、糖蛋白、ウイルス蛋白、ムコ蛋
白などがある。
発明に含まれる（例えば繊維性ポリペプチドのコラーゲ
ン、エラスチンおよびアルファ−ケラチン）。他の構成
ポリペプチドとしては、糖蛋白、ウイルス蛋白、ムコ蛋
白などがある。
【００４２】診断薬として使用されるポリペプチド（例
えばある手術の疾患の存在のマーカー）も本発明に含ま
れる。
えばある手術の疾患の存在のマーカー）も本発明に含ま
れる。
【００４３】さらにハイブリッドポリペプチドとして産
生される目的のポリペプチドとしては、治療に使用され
るポリペプチド（例えば抗腫瘍活性を有するポリペプチ
ド、ワクチン産生に有用なポリペプチド、抗原の認識用
のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または診断薬と
して機能するポリペプチドなど）がある。
生される目的のポリペプチドとしては、治療に使用され
るポリペプチド（例えば抗腫瘍活性を有するポリペプチ
ド、ワクチン産生に有用なポリペプチド、抗原の認識用
のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または診断薬と
して機能するポリペプチドなど）がある。
【００４４】本発明は、上記の天然のポリペプチドに加
えて、合成のポリペプチド（一般に天然に存在しないア
ミノ酸の配列と定義される）にも使用される。
えて、合成のポリペプチド（一般に天然に存在しないア
ミノ酸の配列と定義される）にも使用される。
【００４５】
【結合のためのポリペプチド】結合用のアビジン結合性
ポリペプチド一般に、ハイブリッド融合ポリペプチドの
アビジンへの結合を可能にするポリペプチドである。こ
のような結合のためのポリペプチドとして使用されるも
のには、補欠分子族ビオチンの結合のための認識配列を
含むもの（例えばプロピオニバクテリウム（Propioniba
cterium)からのトランスカルボキシラーゼの１．３Ｓポ
リペプチドサブユニット）がある。
ポリペプチド一般に、ハイブリッド融合ポリペプチドの
アビジンへの結合を可能にするポリペプチドである。こ
のような結合のためのポリペプチドとして使用されるも
のには、補欠分子族ビオチンの結合のための認識配列を
含むもの（例えばプロピオニバクテリウム（Propioniba
cterium)からのトランスカルボキシラーゼの１．３Ｓポ
リペプチドサブユニット）がある。
【００４６】１．３Ｓポリペプチドの全配列を結合のた
めのポリペプチドとして使用する以外に、１．３Ｓポリ
ペプチドの他の小さい部分（特にアミノ酸残基５８から
１００（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のすべてまたは一
部）も、ビオチンの結合を指令るものとして使用され
る。当業者に公知の方法により、１つまたはそれ以上の
欠失、置換、挿入または突然変異なども可能であり、そ
の結果ビオチン化１．３Ｓポリペプチドまたはビオチン
化断片が作成される。１．３Ｓポリペプチドまたは断片
をコードするヌクレオチド配列は、当業者に公知の方法
により、市販のＤＮＡシンセサイザーを用いて合成する
ことができる。
めのポリペプチドとして使用する以外に、１．３Ｓポリ
ペプチドの他の小さい部分（特にアミノ酸残基５８から
１００（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のすべてまたは一
部）も、ビオチンの結合を指令るものとして使用され
る。当業者に公知の方法により、１つまたはそれ以上の
欠失、置換、挿入または突然変異なども可能であり、そ
の結果ビオチン化１．３Ｓポリペプチドまたはビオチン
化断片が作成される。１．３Ｓポリペプチドまたは断片
をコードするヌクレオチド配列は、当業者に公知の方法
により、市販のＤＮＡシンセサイザーを用いて合成する
ことができる。
【００４７】さらに、本発明の精神と範囲を逸脱するこ
となく、酵素的にビオチン化される他のポリペプチドま
たはその一部も使用される。
となく、酵素的にビオチン化される他のポリペプチドま
たはその一部も使用される。
【００４８】
【ハイブリッドポリペプチドの配置】ハイブリッドポリ
ペプチドは少なくとも１つの目的のポリペプチドに融合
した少なくとも１つの結合のためのポリペプチドよりな
る。少なくとも１つの目的のポリペプチドは結合のため
のポリペプチドのＣ−末端に融合していることが好まし
い。随時複数の目的のポリペプチドが、結合のためのポ
リペプチドのＣ−末端で連続的に融合される。または複
数の隣接する目的のポリペプチドが、結合のためのポリ
ペプチドのＮ−末端で連続的に融合される。さらに非隣
接性の配置で、２つ以上の目的のポリペプチドが存在す
ることができる（例えば１つの目的のポリペプチドが結
合のためのポリペプチドのＮ−末端に融合して、１つの
ポリペプチドが同じ結合のためのポリペプチドのＣ−末
端に融合してもよい）。２つの目的のポリペプチドが、
結合のための２るのポリペプチドのＣ−末端に融合して
もよい（その配置は、結合のためのポリペプチド１：目
的のポリペプチド１：結合のためのポリペプチド２：目
的のポリペプチド２）。ここに開示した任意の配置で、
目的のポリペプチドは同じでも異なっていてもよく、結
合のためのポリペプチドも同じでも異なっていてもよ
い。
ペプチドは少なくとも１つの目的のポリペプチドに融合
した少なくとも１つの結合のためのポリペプチドよりな
る。少なくとも１つの目的のポリペプチドは結合のため
のポリペプチドのＣ−末端に融合していることが好まし
い。随時複数の目的のポリペプチドが、結合のためのポ
リペプチドのＣ−末端で連続的に融合される。または複
数の隣接する目的のポリペプチドが、結合のためのポリ
ペプチドのＮ−末端で連続的に融合される。さらに非隣
接性の配置で、２つ以上の目的のポリペプチドが存在す
ることができる（例えば１つの目的のポリペプチドが結
合のためのポリペプチドのＮ−末端に融合して、１つの
ポリペプチドが同じ結合のためのポリペプチドのＣ−末
端に融合してもよい）。２つの目的のポリペプチドが、
結合のための２るのポリペプチドのＣ−末端に融合して
もよい（その配置は、結合のためのポリペプチド１：目
的のポリペプチド１：結合のためのポリペプチド２：目
的のポリペプチド２）。ここに開示した任意の配置で、
目的のポリペプチドは同じでも異なっていてもよく、結
合のためのポリペプチドも同じでも異なっていてもよ
い。
【００４９】少なくとも１つの結合のためのポリペプチ
ドに複数の目的のポリペプチドを融合させる利点は、１
つのハイブリッドポリペプチド内に２つのコピーのポリ
ペプチドを含有することにより、存在する１つの目的の
ポリペプチドの収率を増加させることができること、ま
た目的のポリペプチドが異なる場合１回のアビジンアフ
ィニティクロマトグラフィーステップにより同時に精製
されるポリペプチド種の数を増やすことができることで
ある。
ドに複数の目的のポリペプチドを融合させる利点は、１
つのハイブリッドポリペプチド内に２つのコピーのポリ
ペプチドを含有することにより、存在する１つの目的の
ポリペプチドの収率を増加させることができること、ま
た目的のポリペプチドが異なる場合１回のアビジンアフ
ィニティクロマトグラフィーステップにより同時に精製
されるポリペプチド種の数を増やすことができることで
ある。
【００５０】ハイブリッドポリペプチドは、１つまたは
複数の結合のためのポリペプチドから１つまたは複数の
目的のポリペプチドを切断するための１つまたは複数の
結合性アミノ酸を含有してもよい。１つまたは複数の結
合性アミノ酸は１つまたは複数の結合のためのポリペプ
チドと１つまたは複数の目的のポリペプチドの間に、１
つまたはそれ以上の切断反応が応用目的に必要な程度に
各ポリペプチド種を分離するように、取り込まれる。す
べての場合に、特定のハイブリッドポリペプチド内のポ
リペプチド種のすべて、いくつかまたは１つを切断する
必要は必ずしもない。
複数の結合のためのポリペプチドから１つまたは複数の
目的のポリペプチドを切断するための１つまたは複数の
結合性アミノ酸を含有してもよい。１つまたは複数の結
合性アミノ酸は１つまたは複数の結合のためのポリペプ
チドと１つまたは複数の目的のポリペプチドの間に、１
つまたはそれ以上の切断反応が応用目的に必要な程度に
各ポリペプチド種を分離するように、取り込まれる。す
べての場合に、特定のハイブリッドポリペプチド内のポ
リペプチド種のすべて、いくつかまたは１つを切断する
必要は必ずしもない。
【００５１】結合のためのポリペプチドに目的のポリペ
プチドを結合させるのに使用されるアミノ酸には、アス
パラギン酸−プロリン、アスパラギン−グリシン、メチ
オニン、システイン、リジン−プロリン、アルギニン−
プロリン、イソロイシン−グルタミン酸−グリシン−ア
ルギニンなどがある。適当な化学試薬または切断酵素に
接触させることにより、少なくとも１つの結合のための
ポリペプチドは少なくとも１つの目的のポリペプチドか
ら切断される。
プチドを結合させるのに使用されるアミノ酸には、アス
パラギン酸−プロリン、アスパラギン−グリシン、メチ
オニン、システイン、リジン−プロリン、アルギニン−
プロリン、イソロイシン−グルタミン酸−グリシン−ア
ルギニンなどがある。適当な化学試薬または切断酵素に
接触させることにより、少なくとも１つの結合のための
ポリペプチドは少なくとも１つの目的のポリペプチドか
ら切断される。
【００５２】作成されるすべてのハイブリッド融合ポリ
ペプチド（切断部位は導入されているかまたは欠失して
いる）について、１つまたは複数の結合のためのポリペ
プチドから１つまたは複数の目的のポリペプチドを切断
することは、必ずしも必要ではないことは認識すべきで
ある。
ペプチド（切断部位は導入されているかまたは欠失して
いる）について、１つまたは複数の結合のためのポリペ
プチドから１つまたは複数の目的のポリペプチドを切断
することは、必ずしも必要ではないことは認識すべきで
ある。
【００５３】ハイブリッドポリペプチドに結合したビオ
チンを結合するのに使用されるアビジンは、モノマー
（一量体）性またはテトラマー（四量体）性のアビジン
またはストレプトアビジンでもよい。アビジンモノマー
はアビジンアフィニティ媒体の好適な型である。粗細胞
混合物から目的のポリペプチドを分離するのにアビジン
モノマーを使用することの利点は、アビジンへの結合の
ためのポリペプチドの結合が可逆性であること、アフィ
ニティクロマトグラフィー後の目的のポリペプチドの収
率と純度が高いことである。
チンを結合するのに使用されるアビジンは、モノマー
（一量体）性またはテトラマー（四量体）性のアビジン
またはストレプトアビジンでもよい。アビジンモノマー
はアビジンアフィニティ媒体の好適な型である。粗細胞
混合物から目的のポリペプチドを分離するのにアビジン
モノマーを使用することの利点は、アビジンへの結合の
ためのポリペプチドの結合が可逆性であること、アフィ
ニティクロマトグラフィー後の目的のポリペプチドの収
率と純度が高いことである。
【００５４】
【ハイブリッドポリペプチド遺伝子の組立（asssembly)
と発現】ハイブリッドポリペプチドをコードする遺伝子
は組換えＤＮＡ法を用いて、ＤＮＡ発現ベクター内で、
５’プロモーター領域よりなるキメラ遺伝子、アビジン
への結合のための補欠分子族の少なくとも１つの結合の
ためのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、そして少
なくとも１つの目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列、を組合せることにより産生される。随時キメラ遺
伝子は１つまたは複数の結合性アミノ酸（すなわち結合
のためのポリペプチドから目的のポリペプチドを切断す
るための１つまたはそれ以上のアミノ酸）をコードする
少なくとも１つのＤＮＡ配列を含有してもよい。
と発現】ハイブリッドポリペプチドをコードする遺伝子
は組換えＤＮＡ法を用いて、ＤＮＡ発現ベクター内で、
５’プロモーター領域よりなるキメラ遺伝子、アビジン
への結合のための補欠分子族の少なくとも１つの結合の
ためのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、そして少
なくとも１つの目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列、を組合せることにより産生される。随時キメラ遺
伝子は１つまたは複数の結合性アミノ酸（すなわち結合
のためのポリペプチドから目的のポリペプチドを切断す
るための１つまたはそれ以上のアミノ酸）をコードする
少なくとも１つのＤＮＡ配列を含有してもよい。
【００５５】種々の目的のポリペプチド（例えば前述し
たもの）をコードする遺伝子は、種々の原核および真核
細胞源（例えば植物細胞または動物細胞または細菌細
胞）から得られる。遺伝子は標準的な公知の方法を使用
することにより、原核および真核宿主細胞の染色体物質
から、または原核および真核宿主細胞のプラスミッドま
たはウイルスから単離される。さらにＤＮＡの自動合成
により、天然に存在するポリペプチドまたは合成ポリペ
プチドをコードするＤＮＡを得ることもできる。宿主細
胞中でキメラ遺伝子の発現を可能にするために、現在多
くの異なるポリペプチド分子をコードする遺伝子を有す
る種々の天然に存在するかまたは合成ＤＮＡ発現ベクタ
ーが、いろいろな所から市販されている。酵素リバース
トランスクリプターゼ（reverse transcriptase)を使用
して、ｍＲＮＡから目的のＤＮＡを産生することもでき
る。この酵素はＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成する。
たもの）をコードする遺伝子は、種々の原核および真核
細胞源（例えば植物細胞または動物細胞または細菌細
胞）から得られる。遺伝子は標準的な公知の方法を使用
することにより、原核および真核宿主細胞の染色体物質
から、または原核および真核宿主細胞のプラスミッドま
たはウイルスから単離される。さらにＤＮＡの自動合成
により、天然に存在するポリペプチドまたは合成ポリペ
プチドをコードするＤＮＡを得ることもできる。宿主細
胞中でキメラ遺伝子の発現を可能にするために、現在多
くの異なるポリペプチド分子をコードする遺伝子を有す
る種々の天然に存在するかまたは合成ＤＮＡ発現ベクタ
ーが、いろいろな所から市販されている。酵素リバース
トランスクリプターゼ（reverse transcriptase)を使用
して、ｍＲＮＡから目的のＤＮＡを産生することもでき
る。この酵素はＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成する。
【００５６】本発明において、１つまたはそれ以上の目
的のポリペプチドをコードする遺伝子が単離、合成また
は他の手段で得られると、１つまたは複数の遺伝子は、
補欠分子族ビオチンの結合のための認識配列を含むポリ
ペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子にこの遺
伝子が結合され、アビジンへのハイブリッドポリペプチ
ドの結合を可能にする。
的のポリペプチドをコードする遺伝子が単離、合成また
は他の手段で得られると、１つまたは複数の遺伝子は、
補欠分子族ビオチンの結合のための認識配列を含むポリ
ペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子にこの遺
伝子が結合され、アビジンへのハイブリッドポリペプチ
ドの結合を可能にする。
【００５７】結合のためのポリペプチドの合成を指令す
る遺伝子は一般に、アビジンへのハイブリッド融合ポリ
ペプチドの結合を可能にするポリペプチドをコードする
ものである。使用可能な結合のためのポリペプチドをコ
ードするこのような遺伝子としては、補欠分子族ビオチ
ンの結合を指令するアミノ酸配列をコードする遺伝子
（例えばプロピオニバクテリウム（Propionibacterium
u）のトランスカルボキシラーゼの１．３Ｓポリペプチ
ドのサブユニットの遺伝子）である。
る遺伝子は一般に、アビジンへのハイブリッド融合ポリ
ペプチドの結合を可能にするポリペプチドをコードする
ものである。使用可能な結合のためのポリペプチドをコ
ードするこのような遺伝子としては、補欠分子族ビオチ
ンの結合を指令するアミノ酸配列をコードする遺伝子
（例えばプロピオニバクテリウム（Propionibacterium
u）のトランスカルボキシラーゼの１．３Ｓポリペプチ
ドのサブユニットの遺伝子）である。
【００５８】結合のためのポリペプチドをコードする遺
伝子は、補欠分子族ビオチンの結合を指令するものでも
よい。特に好適なビオチン化された結合のためのポリペ
プチドは、プロピオニバクテリウムシェルマニイ（Prop
ionibacterium shermanii)からのトランスカルボキシラ
ーゼの１．３Ｓサブユニット（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１）である。プロピオニバクテリウムシェルマニイ（Pr
opionibacterium shermanii)の全１．３Ｓポリペプチド
をコードする遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）が好適
であるが、随時ビオチンの結合を司令するポリペプチド
をコードする遺伝子または遺伝子断片も適している。遺
伝子断片の調製は当業者には公知である。
伝子は、補欠分子族ビオチンの結合を指令するものでも
よい。特に好適なビオチン化された結合のためのポリペ
プチドは、プロピオニバクテリウムシェルマニイ（Prop
ionibacterium shermanii)からのトランスカルボキシラ
ーゼの１．３Ｓサブユニット（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１）である。プロピオニバクテリウムシェルマニイ（Pr
opionibacterium shermanii)の全１．３Ｓポリペプチド
をコードする遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）が好適
であるが、随時ビオチンの結合を司令するポリペプチド
をコードする遺伝子または遺伝子断片も適している。遺
伝子断片の調製は当業者には公知である。
【００５９】少なくとも１つの目的のポリペプチドをコ
ードする１つまたは複数の遺伝子、および１つまたは複
数の結合のためのポリペプチドをコードする１つまたは
複数の遺伝子は、好ましくは適当な制限酵素で処理され
るか、または他の方法でキメラ遺伝子またはＤＮＡ発現
ベクターの他の要素との結合を促進するように粘着末端
を持つように処理される。
ードする１つまたは複数の遺伝子、および１つまたは複
数の結合のためのポリペプチドをコードする１つまたは
複数の遺伝子は、好ましくは適当な制限酵素で処理され
るか、または他の方法でキメラ遺伝子またはＤＮＡ発現
ベクターの他の要素との結合を促進するように粘着末端
を持つように処理される。
【００６０】キメラハイブリッドポリペプチド遺伝子を
有する得られるＤＮＡ発現ベクターを用いて、適当な原
核および真核宿主細胞を形質転換する。目的の宿主細胞
に適したＤＮＡ発現ベクターの選択は、当業者には公知
である。形質転換操作の後、形質転換された細胞を単離
し、ハイブリッドポリペプチドの発現について解析す
る。ハイブリッドポリペプチドを有すると同定された形
質転換体は、さらに制限酵素消化、ＤＮＡ配列決定、お
よび当業者には公知の方法により目的の遺伝子の正しさ
を確認する方法により、解析される。
有する得られるＤＮＡ発現ベクターを用いて、適当な原
核および真核宿主細胞を形質転換する。目的の宿主細胞
に適したＤＮＡ発現ベクターの選択は、当業者には公知
である。形質転換操作の後、形質転換された細胞を単離
し、ハイブリッドポリペプチドの発現について解析す
る。ハイブリッドポリペプチドを有すると同定された形
質転換体は、さらに制限酵素消化、ＤＮＡ配列決定、お
よび当業者には公知の方法により目的の遺伝子の正しさ
を確認する方法により、解析される。
【００６１】目的のハイブリッドポリペプチドを有する
宿主細胞として同定された形質転換体は、次に培養して
増殖させ、ベクターを複製して目的のポリペプチドを含
有するハイブリッドポリペプチドの高レベルの発現をさ
せる。ハイブリッドポリペプチドの大規模な産生のため
に融和性のある宿主の他の株の形質転換に、さらにクロ
ーニングベクターを使用してもよい。
宿主細胞として同定された形質転換体は、次に培養して
増殖させ、ベクターを複製して目的のポリペプチドを含
有するハイブリッドポリペプチドの高レベルの発現をさ
せる。ハイブリッドポリペプチドの大規模な産生のため
に融和性のある宿主の他の株の形質転換に、さらにクロ
ーニングベクターを使用してもよい。
【００６２】遺伝子または遺伝子断片の入手、ＤＮＡ発
現ベクターの調製、宿主細胞の形質転換、宿主細胞中で
のハイブリッドポリペプチドの発現、およびそれらのポ
リペプチドの同定などの種々の方法は、サムブルーク、
フリッツおよびマニアチス（J. Sambrook, E.F. Fritsc
h, and T. Maniatis）、モレキュラークローニング（Mo
lecular Cloning)、第２版、コールドスプリングハーバ
ープレス（Cold Spring Harbor Press）１９８９年、お
よびアウスベル、ブレント、キングストン、ムーア、セ
イドマン、スミス、ストルール（F.M. Ausubel, R. Bre
nt, R.E.Kingston, D.M. Moore, J.G. Seidman, J.A. S
mith, K. Struhl.）編、カレントプロトコールズインモ
レキュラーバイオロジー（Current Protocls in Molecu
lar Biology)、第１巻、ジョンウィリーアンドサンズ
（John Weley and Sons)、ニューヨーク、１９８９年に
記載されており、その内容は参考のため本明細書中に引
用されている。
現ベクターの調製、宿主細胞の形質転換、宿主細胞中で
のハイブリッドポリペプチドの発現、およびそれらのポ
リペプチドの同定などの種々の方法は、サムブルーク、
フリッツおよびマニアチス（J. Sambrook, E.F. Fritsc
h, and T. Maniatis）、モレキュラークローニング（Mo
lecular Cloning)、第２版、コールドスプリングハーバ
ープレス（Cold Spring Harbor Press）１９８９年、お
よびアウスベル、ブレント、キングストン、ムーア、セ
イドマン、スミス、ストルール（F.M. Ausubel, R. Bre
nt, R.E.Kingston, D.M. Moore, J.G. Seidman, J.A. S
mith, K. Struhl.）編、カレントプロトコールズインモ
レキュラーバイオロジー（Current Protocls in Molecu
lar Biology)、第１巻、ジョンウィリーアンドサンズ
（John Weley and Sons)、ニューヨーク、１９８９年に
記載されており、その内容は参考のため本明細書中に引
用されている。
【００６３】
【ＤＮＡ発現ベクターの調製】ＤＮＡ発現ベクターの調
製に種々のクローニングベクターが使用できる。プラス
ミッドが好適であるが、コスミッドまたはバクテリオフ
ァージも使用できる。宿主細胞として昆虫細胞、植物細
胞または動物細胞が使用される場合は、ウイルスをベク
ターとして使用することもできる。ＤＮＡ発現ベクター
は天然起源から得ることもできるし、合成ＤＮＡでもよ
い。特定の発現系に選ばれるプラスミッドは、複製とポ
リペプチド発現ができるために宿主と融和性（compatib
le）がなければならない。ハイブリッドポリペプチドを
コードする遺伝子の導入に選ばれたプラスミッドは、宿
主細胞に認識される複製開始点を有していなければなら
ない。
製に種々のクローニングベクターが使用できる。プラス
ミッドが好適であるが、コスミッドまたはバクテリオフ
ァージも使用できる。宿主細胞として昆虫細胞、植物細
胞または動物細胞が使用される場合は、ウイルスをベク
ターとして使用することもできる。ＤＮＡ発現ベクター
は天然起源から得ることもできるし、合成ＤＮＡでもよ
い。特定の発現系に選ばれるプラスミッドは、複製とポ
リペプチド発現ができるために宿主と融和性（compatib
le）がなければならない。ハイブリッドポリペプチドを
コードする遺伝子の導入に選ばれたプラスミッドは、宿
主細胞に認識される複製開始点を有していなければなら
ない。
【００６４】ＤＮＡ発現ベクターは、形質転換の後（例
えば抗生物質耐性遺伝子内の）複製開始点またはプラス
ミッドに必要な機能を不活性化することなく、ハイブリ
ッドポリペプチドの遺伝子に結合させるためのベクター
を切断する制限エンドヌクレアーゼ酵素により認識され
るＤＮＡ配列を含有していなければならない。ベクター
は、挿入すべき外来遺伝子が結合するための適当な末端
を提供する制限酵素切断部位を有していなければならな
い。ＤＮＡベクターは、ハイブリッドポリペプチド遺伝
子の取り込み用の１つまたは２つのユニークな部位（こ
の部位はハイブリッドポリペプチド遺伝子内には存在し
ない）を有していることが好ましい。異なる粘性（cohe
sive）末端またはブラント末端（blunt)中で停止する２
つ以上の異なる外来遺伝子を取り込むことができるよう
に、ベクターは多くのユニークな制限酵素切断部位を有
していることが有用である。
えば抗生物質耐性遺伝子内の）複製開始点またはプラス
ミッドに必要な機能を不活性化することなく、ハイブリ
ッドポリペプチドの遺伝子に結合させるためのベクター
を切断する制限エンドヌクレアーゼ酵素により認識され
るＤＮＡ配列を含有していなければならない。ベクター
は、挿入すべき外来遺伝子が結合するための適当な末端
を提供する制限酵素切断部位を有していなければならな
い。ＤＮＡベクターは、ハイブリッドポリペプチド遺伝
子の取り込み用の１つまたは２つのユニークな部位（こ
の部位はハイブリッドポリペプチド遺伝子内には存在し
ない）を有していることが好ましい。異なる粘性（cohe
sive）末端またはブラント末端（blunt)中で停止する２
つ以上の異なる外来遺伝子を取り込むことができるよう
に、ベクターは多くのユニークな制限酵素切断部位を有
していることが有用である。
【００６５】ＤＮＡ発現ベクターは、形質転換された細
胞が直ちに同定され、形質転換を受けない細胞から分離
されることを可能にするための表現型（phenotype)を発
現させなければならない。このような表現型の選択遺伝
子は、特定の抗生物質に対する耐性（非形質転換細胞の
増殖は阻害されるが、形質転換細胞の増殖は阻害されな
い）を与える遺伝子を含んでいなければならない。この
ような遺伝子は現在広く入手可能であり、抗生物質（例
えばアンピシリン、テトラサイクリン、ストレプトマイ
シン、カナマイシンなど）に対する耐性を与える。ベー
タガラクトシダーゼ遺伝子を破壊する挿入された遺伝子
（例えばハイブリッドポリペプチド遺伝子）を含むプラ
スミッドは、形質転換後の宿主細胞が培地中の試薬５−
ブロモ−４−クロロ−３インドール−ｂ−Ｇ−ガラクト
ピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を還元して細菌のコロニーが
青色を発色する能力の欠如により、同定することができ
る。このようなプラスミッド、試薬、および培地は当業
者には公知である。
胞が直ちに同定され、形質転換を受けない細胞から分離
されることを可能にするための表現型（phenotype)を発
現させなければならない。このような表現型の選択遺伝
子は、特定の抗生物質に対する耐性（非形質転換細胞の
増殖は阻害されるが、形質転換細胞の増殖は阻害されな
い）を与える遺伝子を含んでいなければならない。この
ような遺伝子は現在広く入手可能であり、抗生物質（例
えばアンピシリン、テトラサイクリン、ストレプトマイ
シン、カナマイシンなど）に対する耐性を与える。ベー
タガラクトシダーゼ遺伝子を破壊する挿入された遺伝子
（例えばハイブリッドポリペプチド遺伝子）を含むプラ
スミッドは、形質転換後の宿主細胞が培地中の試薬５−
ブロモ−４−クロロ−３インドール−ｂ−Ｇ−ガラクト
ピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を還元して細菌のコロニーが
青色を発色する能力の欠如により、同定することができ
る。このようなプラスミッド、試薬、および培地は当業
者には公知である。
【００６６】好ましくは宿主細胞として大腸菌が使用さ
れ、大腸菌宿主のクローニングと形質転換にはプラスミ
ッドが好ましい。好適なプラスミッドはｐＫＫ２２３−
３（ファルマシア（Pharmacia)、ウプサラ（Uppsala)、
スエーデン）。このプラスミッドは大腸菌の複製開始点
の遺伝子と、抗生物質アンピシリンに対する耐性遺伝子
を有している。このプラスミッドはまた、クローニング
を促進するユニークな制限エンドヌクレアーゼ切断部位
よりなる合成リンカー領域を有している。このプラスミ
ッドは強いｔａｃプロモーター（大腸菌内での高レベル
の転写を指令する）を有している。
れ、大腸菌宿主のクローニングと形質転換にはプラスミ
ッドが好ましい。好適なプラスミッドはｐＫＫ２２３−
３（ファルマシア（Pharmacia)、ウプサラ（Uppsala)、
スエーデン）。このプラスミッドは大腸菌の複製開始点
の遺伝子と、抗生物質アンピシリンに対する耐性遺伝子
を有している。このプラスミッドはまた、クローニング
を促進するユニークな制限エンドヌクレアーゼ切断部位
よりなる合成リンカー領域を有している。このプラスミ
ッドは強いｔａｃプロモーター（大腸菌内での高レベル
の転写を指令する）を有している。
【００６７】ハイブリッドポリペプチドの産生に昆虫細
胞の培養物が使用される場合は、好適なプラスミッドは
ｐＶＬ１３９２である（サマーズ（M. Summers）、テキ
サス大学、インビトロゲン社（Invitrogen, Inc.）、カ
リホルニア州サンジエゴ市、より市販されている、）。
昆虫細胞培養物の利点は、グリコシレーション（glycos
ylation)や他のタイプの翻訳後の修飾（例えば適当なジ
スルフィド結合形成による折り畳み）が必要なポリペプ
チドは、この発現系で修飾されるが、このタイプの翻訳
後の修飾は原核細胞宿主では出来ないことである。
胞の培養物が使用される場合は、好適なプラスミッドは
ｐＶＬ１３９２である（サマーズ（M. Summers）、テキ
サス大学、インビトロゲン社（Invitrogen, Inc.）、カ
リホルニア州サンジエゴ市、より市販されている、）。
昆虫細胞培養物の利点は、グリコシレーション（glycos
ylation)や他のタイプの翻訳後の修飾（例えば適当なジ
スルフィド結合形成による折り畳み）が必要なポリペプ
チドは、この発現系で修飾されるが、このタイプの翻訳
後の修飾は原核細胞宿主では出来ないことである。
【００６８】ハイブリッドポリペプチド遺伝子よりなる
キメラ遺伝子の挿入のために選ばれたプラスミッドを調
製するには、プラスミッドを制限エンドヌクレアーゼ
（例えばＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩ、またはユニーク
な部位でプラスミッドを切断して結合すべきキメラ遺伝
子の末端に相補的な粘性３’および５’末端を産生する
任意の制限酵素または酵素の組合せ）で消化する。必要
な場合は、プラスミッドを２つの異なる酵素で処理し
て、２つの異なる粘性末端を産生させて１つまたは複数
のキメラハイブリッドポリペプチド遺伝子がプラスミッ
ド内で正しい配向になるように結合することを促進させ
る。ブラント末端を産生するある種の酵素を使用するこ
ともでき、またはリンカー分子をベクターまたは外来遺
伝子に加えて目的の粘性末端を調製してもよい。このよ
うな戦略や方法は当業者には公知である。
キメラ遺伝子の挿入のために選ばれたプラスミッドを調
製するには、プラスミッドを制限エンドヌクレアーゼ
（例えばＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩ、またはユニーク
な部位でプラスミッドを切断して結合すべきキメラ遺伝
子の末端に相補的な粘性３’および５’末端を産生する
任意の制限酵素または酵素の組合せ）で消化する。必要
な場合は、プラスミッドを２つの異なる酵素で処理し
て、２つの異なる粘性末端を産生させて１つまたは複数
のキメラハイブリッドポリペプチド遺伝子がプラスミッ
ド内で正しい配向になるように結合することを促進させ
る。ブラント末端を産生するある種の酵素を使用するこ
ともでき、またはリンカー分子をベクターまたは外来遺
伝子に加えて目的の粘性末端を調製してもよい。このよ
うな戦略や方法は当業者には公知である。
【００６９】プラスミッドが消化される時、２つまたは
それ以上のＤＮＡ断片が生成する。複製開始点を有する
目的のプラスミッド断片と、プラスミッドの複製と同定
に必須の他の遺伝子は、ゲル電気泳動や当業者には公知
の他の方法により同定され、回収される。
それ以上のＤＮＡ断片が生成する。複製開始点を有する
目的のプラスミッド断片と、プラスミッドの複製と同定
に必須の他の遺伝子は、ゲル電気泳動や当業者には公知
の他の方法により同定され、回収される。
【００７０】
【結合のためのポリペプチドの遺伝子の調製】ハイブリ
ッドポリペプチドの構成物の特に好適な配置は、結合の
ためのポリペプチド（最も好ましくは１．３Ｓポリペプ
チド）の位置が、プラスミッドｐｋｋ２２３−３の合成
リンカー内のＰｓｔＩ部位のプロモーターに対して直接
３’であることである。ＰｓｔＩ部位は、プロモーター
とリボゾーム結合部位に対して３’である。
ッドポリペプチドの構成物の特に好適な配置は、結合の
ためのポリペプチド（最も好ましくは１．３Ｓポリペプ
チド）の位置が、プラスミッドｐｋｋ２２３−３の合成
リンカー内のＰｓｔＩ部位のプロモーターに対して直接
３’であることである。ＰｓｔＩ部位は、プロモーター
とリボゾーム結合部位に対して３’である。
【００７１】欠失、挿入、置換、または突然変異の起き
た、ビオチンの結合を指令する１．３Ｓ遺伝子は、本発
明の精神と範囲に包含されることは理解すべきである。
さらにそのポリペプチドがビオチンまたはリポ酸の結合
を指令する天然または合成の１つまたはそれ以上の遺伝
子も、本発明の範囲と精神の中に包含される。
た、ビオチンの結合を指令する１．３Ｓ遺伝子は、本発
明の精神と範囲に包含されることは理解すべきである。
さらにそのポリペプチドがビオチンまたはリポ酸の結合
を指令する天然または合成の１つまたはそれ以上の遺伝
子も、本発明の範囲と精神の中に包含される。
【００７２】１．３Ｓ遺伝子は好ましくはその５’末端
でＰｓｔＩの切断部位を有し、３’末端でＢａｍＨＩの
切断部位を有するように作成され、そして結合する場合
１．３Ｓ遺伝子はｔａｃプロモーターと正しいリーディ
ングフレーム（読み取り枠）で連結し、リボゾーム結合
部位は変化を受けず、１．３Ｓ遺伝子または断片は好ま
しくはヌクレオチド配列ＧＡＴ ＣＣＡ ＴＡＡ ＣＧ
Ｃ ＣＴＡ ＡＧＣＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、
または同時にＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部
位を与え、アミノ酸ａｓｐ−ｐｒｏをコードする任意の
配列中で停止するようにする。ａｓｐ−ｐｒｏは、適当
な目的のポリペプチドから１．３Ｓ結合のためのポリペ
プチドの切断のための、結合性アミノ酸として使用され
る好適な配列である。しかし目的のポリペプチドがその
配列中にａｓｐ−ｐｒｏ配列を含む場合は、目的のポリ
ペプチド中に存在しない他の任意の１つまたはそれ以上
のアミノ酸がａｓｐ−ｐｒｏの代わりに使用される。そ
のような場合、１．３Ｓ遺伝子を目的のポリペプチドの
遺伝子に結合させることができる適当な粘性末端を作成
するように遺伝子を構成することが必要である。
でＰｓｔＩの切断部位を有し、３’末端でＢａｍＨＩの
切断部位を有するように作成され、そして結合する場合
１．３Ｓ遺伝子はｔａｃプロモーターと正しいリーディ
ングフレーム（読み取り枠）で連結し、リボゾーム結合
部位は変化を受けず、１．３Ｓ遺伝子または断片は好ま
しくはヌクレオチド配列ＧＡＴ ＣＣＡ ＴＡＡ ＣＧ
Ｃ ＣＴＡ ＡＧＣＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、
または同時にＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部
位を与え、アミノ酸ａｓｐ−ｐｒｏをコードする任意の
配列中で停止するようにする。ａｓｐ−ｐｒｏは、適当
な目的のポリペプチドから１．３Ｓ結合のためのポリペ
プチドの切断のための、結合性アミノ酸として使用され
る好適な配列である。しかし目的のポリペプチドがその
配列中にａｓｐ−ｐｒｏ配列を含む場合は、目的のポリ
ペプチド中に存在しない他の任意の１つまたはそれ以上
のアミノ酸がａｓｐ−ｐｒｏの代わりに使用される。そ
のような場合、１．３Ｓ遺伝子を目的のポリペプチドの
遺伝子に結合させることができる適当な粘性末端を作成
するように遺伝子を構成することが必要である。
【００７３】結合のためのポリペプチドの遺伝子の適当
な末端への結合を促進するように、少なくとも１つの目
的のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子
は、単離、合成または他の方法で得られ、５’末端で修
飾される。結合のための１．３Ｓポリペプチドの３’末
端は、正しいリーディングフレーム中で目的のポリペプ
チドをコードする遺伝子が結合するための好適な末端で
ある。さらにキメラ遺伝子中の配列の中の最後の目的の
ポリペプチドの３’末端は、発現ベクターへの結合を促
進するようにこの末端がプラスミッドベクターの５’末
端に相補的であるように調製することが好ましい。
な末端への結合を促進するように、少なくとも１つの目
的のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子
は、単離、合成または他の方法で得られ、５’末端で修
飾される。結合のための１．３Ｓポリペプチドの３’末
端は、正しいリーディングフレーム中で目的のポリペプ
チドをコードする遺伝子が結合するための好適な末端で
ある。さらにキメラ遺伝子中の配列の中の最後の目的の
ポリペプチドの３’末端は、発現ベクターへの結合を促
進するようにこの末端がプラスミッドベクターの５’末
端に相補的であるように調製することが好ましい。
【００７４】異なるキメラ遺伝子において、発現ベクタ
ー内で１つまたはそれ以上の目的のポリペプチドが互い
に正しい配向であり、１つまたは複数の結合のためのポ
リペプチドに対しても正しい配向を得るには、前述した
基本的なステップが使用されることを理解すべきであ
る。好ましくは各目的のポリペプチドの遺伝子は正しい
リーディングフレーム中で隣接する遺伝子に結合してお
り、すべての隣接する末端は、それらが結合を促進する
ように相補的になるように調製される。さらに他の目的
のポリペプチドまたは１つまたはそれ以上の結合のため
のポリペプチドからの切断を必要とする任意の目的のポ
リペプチドの遺伝子は、その挿入により遺伝子が正しく
ないリーディングフレーム内に来ないように、すべての
切断部位が正しく配置されるように作成しなければなら
ない。
ー内で１つまたはそれ以上の目的のポリペプチドが互い
に正しい配向であり、１つまたは複数の結合のためのポ
リペプチドに対しても正しい配向を得るには、前述した
基本的なステップが使用されることを理解すべきであ
る。好ましくは各目的のポリペプチドの遺伝子は正しい
リーディングフレーム中で隣接する遺伝子に結合してお
り、すべての隣接する末端は、それらが結合を促進する
ように相補的になるように調製される。さらに他の目的
のポリペプチドまたは１つまたはそれ以上の結合のため
のポリペプチドからの切断を必要とする任意の目的のポ
リペプチドの遺伝子は、その挿入により遺伝子が正しく
ないリーディングフレーム内に来ないように、すべての
切断部位が正しく配置されるように作成しなければなら
ない。
【００７５】ＤＮＡの断片を共有結合させる結合反応
は、サムブルーク、フリッツおよびマニアチス（J. Sam
brook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis）（前述）、お
よびアウスベル（Ausubel)ら（前述）により記載されて
おり、当業者には公知である。
は、サムブルーク、フリッツおよびマニアチス（J. Sam
brook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis）（前述）、お
よびアウスベル（Ausubel)ら（前述）により記載されて
おり、当業者には公知である。
【００７６】結合されたプラスミッドは宿主細胞の形質
転換ができる。好適な宿主は大腸菌であるが、他の細
菌、昆虫細胞、酵母、または哺乳動物または植物細胞も
特定の宿主細胞に適するＤＮＡ発現ベクターとともに使
用される。
転換ができる。好適な宿主は大腸菌であるが、他の細
菌、昆虫細胞、酵母、または哺乳動物または植物細胞も
特定の宿主細胞に適するＤＮＡ発現ベクターとともに使
用される。
【００７７】大腸菌の形質転換は当業者には公知の標準
的方法であり、適当な宿主株（例えば大腸菌ＨＢ１０
１）が、ハイブリッドポリペプチドの遺伝子を有するプ
ラスミッドを受容し、育成し、複製して発現する。大腸
菌の形質転換はサムブルーク（Sambrook）らにより記載
されている。宿主が昆虫細胞の場合、サマーズとスミス
（M. Summers and G. Smith)の記載した方法（「バキュ
ロウイルスベクターと昆虫細胞培養法のマニュアル」
（A Manual of Methods for Baculovirus Vectorsand I
nsect Cell Culture Procedures）、テキサスアグリカ
ルチュラルエクスペリメントステーションブルチン（Te
xas Agricultural Experiment Station Bulletin）Ｎ
ｏ．１５、１９８８年）に従ってトランスフェクション
が行われる。
的方法であり、適当な宿主株（例えば大腸菌ＨＢ１０
１）が、ハイブリッドポリペプチドの遺伝子を有するプ
ラスミッドを受容し、育成し、複製して発現する。大腸
菌の形質転換はサムブルーク（Sambrook）らにより記載
されている。宿主が昆虫細胞の場合、サマーズとスミス
（M. Summers and G. Smith)の記載した方法（「バキュ
ロウイルスベクターと昆虫細胞培養法のマニュアル」
（A Manual of Methods for Baculovirus Vectorsand I
nsect Cell Culture Procedures）、テキサスアグリカ
ルチュラルエクスペリメントステーションブルチン（Te
xas Agricultural Experiment Station Bulletin）Ｎ
ｏ．１５、１９８８年）に従ってトランスフェクション
が行われる。
【００７８】形質転換される宿主細胞を同定するため
に、培養物を適当な抗生物質を含む選択培地中に入れ
る。プラスミッド由来の耐性を有する細胞のみが生存で
きる。生存している細胞コロニーを溶解した後プラスミ
ッドを回収し、制限酵素消化、マッピング、ＤＮＡシー
ケンシング、または当業者には公知の他の方法により性
状解析する。さらにハイブリッドポリペプチドを発現す
るコロニーは、免疫学的測定法（例えば酵素結合免疫吸
着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはウェスタンブロッッティ
ング）により同定することができる。ある態様において
は、１つまたはそれ以上の目的のポリペプチドの生物活
性を直接測定することが可能である。
に、培養物を適当な抗生物質を含む選択培地中に入れ
る。プラスミッド由来の耐性を有する細胞のみが生存で
きる。生存している細胞コロニーを溶解した後プラスミ
ッドを回収し、制限酵素消化、マッピング、ＤＮＡシー
ケンシング、または当業者には公知の他の方法により性
状解析する。さらにハイブリッドポリペプチドを発現す
るコロニーは、免疫学的測定法（例えば酵素結合免疫吸
着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはウェスタンブロッッティ
ング）により同定することができる。ある態様において
は、１つまたはそれ以上の目的のポリペプチドの生物活
性を直接測定することが可能である。
【００７９】ハイブリッドポリペプチドを有する形質転
換細胞が同定されると、それらは確立された技術（例え
ば発酵）により増殖させられる。さらにハイブリッドポ
リペプチドの大量生産と精製用に他の細菌株または適当
な宿主細胞を形質転換するために、回収されたプラスミ
ッドを用いる。
換細胞が同定されると、それらは確立された技術（例え
ば発酵）により増殖させられる。さらにハイブリッドポ
リペプチドの大量生産と精製用に他の細菌株または適当
な宿主細胞を形質転換するために、回収されたプラスミ
ッドを用いる。
【００８０】形質転換された宿主細胞により発現され
る、結合のためのポリペプチド、アビジンへの結合のた
めのビオチン基、目的のポリペプチドそして随時切断部
位を含有するハイブリッドポリペプチドは、アフィニテ
ィクロマトグラフィーにより培地と他の破片から分離さ
れる。好適なアフィニティ媒体はアビジンモノマー樹脂
である（米国特許出願第４１４，７８５号）。この目的
のために宿主細胞は媒体から分離され、例えば超音波処
理により破壊される。随時ハイブリッドポリペプチドの
適当な末端に細胞外分泌用のシグナルペプチドが含まれ
る場合は、ハイブリッドポリペプチドは培地中に排出さ
れることもできる。このような分泌ポリペプチドが好ま
しい場合は、ハイブリッドポリペプチドをコードするキ
メラ遺伝子の中に細胞外分泌を指令するポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列を含めることが必要である。
る、結合のためのポリペプチド、アビジンへの結合のた
めのビオチン基、目的のポリペプチドそして随時切断部
位を含有するハイブリッドポリペプチドは、アフィニテ
ィクロマトグラフィーにより培地と他の破片から分離さ
れる。好適なアフィニティ媒体はアビジンモノマー樹脂
である（米国特許出願第４１４，７８５号）。この目的
のために宿主細胞は媒体から分離され、例えば超音波処
理により破壊される。随時ハイブリッドポリペプチドの
適当な末端に細胞外分泌用のシグナルペプチドが含まれ
る場合は、ハイブリッドポリペプチドは培地中に排出さ
れることもできる。このような分泌ポリペプチドが好ま
しい場合は、ハイブリッドポリペプチドをコードするキ
メラ遺伝子の中に細胞外分泌を指令するポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列を含めることが必要である。
【００８１】いったん放出されたハイブリッドポリペプ
チドは適当な緩衝液（好ましくはその中でハイブリッド
ポリペプチドが溶解性であるもの）中で維持される。緩
衝液溶液は、宿主細胞からのハイブリッドポリペプチド
の回収が最大になるように調製される。回収を促進する
ように最適化されるべき緩衝液の性質には、ｐＨ、イオ
ン組成、イオン強度、または種々の界面活性剤組成物の
存在または欠如などがある。
チドは適当な緩衝液（好ましくはその中でハイブリッド
ポリペプチドが溶解性であるもの）中で維持される。緩
衝液溶液は、宿主細胞からのハイブリッドポリペプチド
の回収が最大になるように調製される。回収を促進する
ように最適化されるべき緩衝液の性質には、ｐＨ、イオ
ン組成、イオン強度、または種々の界面活性剤組成物の
存在または欠如などがある。
【００８２】随時アフィニティクロマトグラフィーの前
にハイブリッドポリペプチドを濃縮または部分的に精製
するために、宿主細胞のある程度の分画が行われる。１
つの好適な方法は、硫酸アンモニウム沈澱法である。蛋
白精製において一般に使用されている他の方法も使用で
きる。細胞抽出物はアフィニティクロマトグラフィーの
好適なカラム（アビジンモノマーカラム）にかけられ、
次に大量の緩衝液で洗浄してすべての非結合物質を除去
する。酢酸またはビオチンによりカラムからハイブリッ
ドポリペプチドが特異的に溶出される。その結果、目的
のポリペプチドを含む高収率の高純度のハイブリッドポ
リペプチドが得られる。
にハイブリッドポリペプチドを濃縮または部分的に精製
するために、宿主細胞のある程度の分画が行われる。１
つの好適な方法は、硫酸アンモニウム沈澱法である。蛋
白精製において一般に使用されている他の方法も使用で
きる。細胞抽出物はアフィニティクロマトグラフィーの
好適なカラム（アビジンモノマーカラム）にかけられ、
次に大量の緩衝液で洗浄してすべての非結合物質を除去
する。酢酸またはビオチンによりカラムからハイブリッ
ドポリペプチドが特異的に溶出される。その結果、目的
のポリペプチドを含む高収率の高純度のハイブリッドポ
リペプチドが得られる。
【００８３】
【目的のポリペプチドからの結合のためのポリペプチド
の分離】目的のポリペプチドの生物活性を回復するため
に、１つまたはそれ以上の結合のためのポリペプチドか
ら１つまたはそれ以上の目的のポリペプチドを切断する
ことが好ましいかまたは必要である。ハイブリッドポリ
ペプチドをまず緩衝液中に懸濁して、結合のためのポリ
ペプチドからの分離を行う。次に１つまたは複数の結合
性アミノ酸に特異的な化学的または蛋白分解性切断剤を
添加する。例えば目的のポリペプチドが、ａｓｐ−ｐｒ
ｏケトン結合により結合のためのポリペプチドに結合し
ている場合、揮発性の酸（例えば蟻酸）を懸濁液に添加
して切断する。メチオニンが結合性アミノ酸の場合は、
試薬臭化シアンを使用してメチオニンと目的のポリペプ
チドの最初のアミノ酸とを切断する。
の分離】目的のポリペプチドの生物活性を回復するため
に、１つまたはそれ以上の結合のためのポリペプチドか
ら１つまたはそれ以上の目的のポリペプチドを切断する
ことが好ましいかまたは必要である。ハイブリッドポリ
ペプチドをまず緩衝液中に懸濁して、結合のためのポリ
ペプチドからの分離を行う。次に１つまたは複数の結合
性アミノ酸に特異的な化学的または蛋白分解性切断剤を
添加する。例えば目的のポリペプチドが、ａｓｐ−ｐｒ
ｏケトン結合により結合のためのポリペプチドに結合し
ている場合、揮発性の酸（例えば蟻酸）を懸濁液に添加
して切断する。メチオニンが結合性アミノ酸の場合は、
試薬臭化シアンを使用してメチオニンと目的のポリペプ
チドの最初のアミノ酸とを切断する。
【００８４】揮発性の切断剤（得例えば蟻酸または臭化
シアン）は、ポリペプチド混合物から蒸発除去される。
酵素により切断する場合、混合物から酵素を除去するに
は混合物を酵素基質カラムに通す。結合のためのポリペ
プチドから目的のポリペプチドを純粋に得る必要がある
場合、混合物をアビジンアフィニティカラムに通して除
去する。いずれにしても結合のためのポリペプチドはア
ビジンへの結合により保持され、従ってアビジンに結合
しない目的のポリペプチドの高純度の溶液が分離され
る。
シアン）は、ポリペプチド混合物から蒸発除去される。
酵素により切断する場合、混合物から酵素を除去するに
は混合物を酵素基質カラムに通す。結合のためのポリペ
プチドから目的のポリペプチドを純粋に得る必要がある
場合、混合物をアビジンアフィニティカラムに通して除
去する。いずれにしても結合のためのポリペプチドはア
ビジンへの結合により保持され、従ってアビジンに結合
しない目的のポリペプチドの高純度の溶液が分離され
る。
【００８５】ある目的のポリペプチドは結合のためのポ
リペプチドに結合した状態の時、その生物活性を有する
ことに注目すべきである。その結果、目的のポリペプチ
ドから結合のためのポリペプチドを切断する必要はな
く、目的のポリペプチドと結合のためのポリペプチドを
分離するステップは必要ではない。さらに結合のための
ポリペプチドが目的のポリペプチドに結合したままの場
合、１つまたは複数の結合性アミノ酸は存在してもよい
し欠如していてもよい。この場合、前記で詳述したＤＮ
Ａ発現ベクターの作成体と調製法は改変される。
リペプチドに結合した状態の時、その生物活性を有する
ことに注目すべきである。その結果、目的のポリペプチ
ドから結合のためのポリペプチドを切断する必要はな
く、目的のポリペプチドと結合のためのポリペプチドを
分離するステップは必要ではない。さらに結合のための
ポリペプチドが目的のポリペプチドに結合したままの場
合、１つまたは複数の結合性アミノ酸は存在してもよい
し欠如していてもよい。この場合、前記で詳述したＤＮ
Ａ発現ベクターの作成体と調製法は改変される。
【００８６】
【一般的方法】以下の例は、以下に記載された１つまた
はそれ以上の一般的方法を用いて行われる。以下のすべ
ての例において、具体的な実験ステップで使用される制
限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、ポリメラーゼ、およ
び他のＤＮＡ修飾酵素は、使用される酵素または試薬の
製造業者の指示に従って使用した。以下に引用された２
つの実験マニュアル、カレントプロトコールズインモレ
キュラーバイオロジー（Current Protocls in Molecula
r Biology)（アウスベル（Ausubel)ら、１９８９年）と
モレキュラークローニングオブラボラトリーマニュアル
（Molecular Cloning of Laboratory Manual）、第２
版、（サムブルーク（Sambrook）ら、コールプリングハ
ーバープレス（Cold Spring Harbor Press）、コールド
スプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨ
ーク、１９８９年）は、下記の例を実施するのに当業者
にも有用な補足情報を含む。
はそれ以上の一般的方法を用いて行われる。以下のすべ
ての例において、具体的な実験ステップで使用される制
限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、ポリメラーゼ、およ
び他のＤＮＡ修飾酵素は、使用される酵素または試薬の
製造業者の指示に従って使用した。以下に引用された２
つの実験マニュアル、カレントプロトコールズインモレ
キュラーバイオロジー（Current Protocls in Molecula
r Biology)（アウスベル（Ausubel)ら、１９８９年）と
モレキュラークローニングオブラボラトリーマニュアル
（Molecular Cloning of Laboratory Manual）、第２
版、（サムブルーク（Sambrook）ら、コールプリングハ
ーバープレス（Cold Spring Harbor Press）、コールド
スプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨ
ーク、１９８９年）は、下記の例を実施するのに当業者
にも有用な補足情報を含む。
【００８７】方法１．ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ
消化 ＤＮＡを消化するための１つまたはそれ以上の制限酵素
を使用する制限エンドヌクレアーゼ消化は、アウスベル
（Ausubel)ら、カレントプロトコールズインモレキュラ
ーバイオロジー（Current Protocls in Molecular Biol
ogy)第１巻、第３章、単元３．１に記載された方法を用
いて行った。プラスミッドの制限酵素地図作成（restri
ction mapping)はアウスベル（Ausubel)ら（前述）、単
元３．２に記載された方法を使用して行う。制限酵素は
プロメガ（Promega)（マジソン（Madison)、ウィスコン
シン州）またはニューイングランドバイオラボズ（New
England Biolabs)、ビバリー（Beverly)、マサチューセ
ッツ州）より入手し、特異酵素によるＤＮＡの完全また
は部分分解は一般に製造業者の指示に従い行う。
消化 ＤＮＡを消化するための１つまたはそれ以上の制限酵素
を使用する制限エンドヌクレアーゼ消化は、アウスベル
（Ausubel)ら、カレントプロトコールズインモレキュラ
ーバイオロジー（Current Protocls in Molecular Biol
ogy)第１巻、第３章、単元３．１に記載された方法を用
いて行った。プラスミッドの制限酵素地図作成（restri
ction mapping)はアウスベル（Ausubel)ら（前述）、単
元３．２に記載された方法を使用して行う。制限酵素は
プロメガ（Promega)（マジソン（Madison)、ウィスコン
シン州）またはニューイングランドバイオラボズ（New
England Biolabs)、ビバリー（Beverly)、マサチューセ
ッツ州）より入手し、特異酵素によるＤＮＡの完全また
は部分分解は一般に製造業者の指示に従い行う。
【００８８】方法２．アガロースゲル電気泳動を用いる
ＤＮＡの精製 アガロースゲル電気泳動は、アウスベル（Ausubel)ら
（前述）、第１巻、第２章、単元２．５Ａに記載された
方法に従い行う。切り出したゲル断片からの大きな（＞
１ｋｂ）ＤＮＡ断片の分離と単離はアウスベル（Ausube
l)ら（前述）、第２章、単元２．６に記載された方法に
従い、小さな（＜１ｋｂ）ＤＮＡ断片の分離と単離は、
アウスベル（Ausubel)ら（前述）、第２章、単元２．７
に記載された方法に従って行う。大きなＤＮＡ断片から
の塩とゲル断片の除去は、ゲネクリーンキット（GeneCl
ean kit)（バイオ１０１社（Bio101, Inc.）、カリホル
ニア州、サンジエゴ市）を用いて、製造業者の供給する
方法に従って行い、小さいＤＮＡ断片からの塩とゲル断
片の除去は、マーマエイドキット（MerMaid kit)（バイ
オ１０１社（Bio101, Inc.）、カリホルニア州、サンジ
エゴ市）を用いて、製造業者の勧める方法に従って行
う。
ＤＮＡの精製 アガロースゲル電気泳動は、アウスベル（Ausubel)ら
（前述）、第１巻、第２章、単元２．５Ａに記載された
方法に従い行う。切り出したゲル断片からの大きな（＞
１ｋｂ）ＤＮＡ断片の分離と単離はアウスベル（Ausube
l)ら（前述）、第２章、単元２．６に記載された方法に
従い、小さな（＜１ｋｂ）ＤＮＡ断片の分離と単離は、
アウスベル（Ausubel)ら（前述）、第２章、単元２．７
に記載された方法に従って行う。大きなＤＮＡ断片から
の塩とゲル断片の除去は、ゲネクリーンキット（GeneCl
ean kit)（バイオ１０１社（Bio101, Inc.）、カリホル
ニア州、サンジエゴ市）を用いて、製造業者の供給する
方法に従って行い、小さいＤＮＡ断片からの塩とゲル断
片の除去は、マーマエイドキット（MerMaid kit)（バイ
オ１０１社（Bio101, Inc.）、カリホルニア州、サンジ
エゴ市）を用いて、製造業者の勧める方法に従って行
う。
【００８９】方法３．ＤＮＡ断片の結合 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ
ズ（New England Biolabs)、ビバリー（Beverly ）、マ
サチューセッツ州）を用いるＤＮＡ断片の結合はアウス
ベル（Ausubel)ら（前述）、単元３．１４の方法で、製
造業者の勧める方法に従い行う。
ズ（New England Biolabs)、ビバリー（Beverly ）、マ
サチューセッツ州）を用いるＤＮＡ断片の結合はアウス
ベル（Ausubel)ら（前述）、単元３．１４の方法で、製
造業者の勧める方法に従い行う。
【００９０】方法４．コンピタントな（competent ）大
腸菌細胞の調製と大腸菌の形質転換 塩化カルシウムを用いるコンピタントな大腸菌ＣＳＨ２
６細胞の調製とＤＮＡ発現ベクターによる形質転換は、
サムブルーク（Sambrook）ら、モレキュラークローニン
グアラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning A La
boratory Manual)、第２版、１９８９年、第１章に記載
された方法を用いて行う。ＤＮＡ挿入体を含むプラスミ
ッドを有するクローンは、１００mg／Ｌアンピシリンを
補強したＬ−寒天上で細胞を増殖させて同定する。
腸菌細胞の調製と大腸菌の形質転換 塩化カルシウムを用いるコンピタントな大腸菌ＣＳＨ２
６細胞の調製とＤＮＡ発現ベクターによる形質転換は、
サムブルーク（Sambrook）ら、モレキュラークローニン
グアラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning A La
boratory Manual)、第２版、１９８９年、第１章に記載
された方法を用いて行う。ＤＮＡ挿入体を含むプラスミ
ッドを有するクローンは、１００mg／Ｌアンピシリンを
補強したＬ−寒天上で細胞を増殖させて同定する。
【００９１】方法５．プラスミッドＤＮＡの単離 プラスミッドＤＮＡの単離は、アウスベル（Ausubel)ら
（前述）第１章、単元１．７に記載された方法に従い行
う。
（前述）第１章、単元１．７に記載された方法に従い行
う。
【００９２】方法６．合成一本鎖オリゴヌクレオチドか
らの二本鎖ＤＮＡの調製 オリゴヌクレオチドは標準的なホスポラミダイト（phos
poramidite）化学を使用して合成する（０．２マイクロ
モル合成）。断片はアウスベル（Ausubel)ら（前述）第
１章、単元２．１２に記載された変性条件下で２０％ポ
リアクリルアミゴゲル上で分離、溶出、および脱塩す
る。二本鎖ＤＮＡは、３’末端の完全な相補性を有する
１５ヌクレオチドの重複領域を有する合成オリゴヌクレ
オチドの上方鎖（upper strand）と下方鎖（lower stra
nd）対から、各鎖（strand）の１μg の混合物を９０℃
で５分間加熱してから、１時間から２時間かけてゆっく
り室温まで冷却することにより構成する。この短い重複
領域（duplex region)はセクアナーゼ（Sequenase)、Ｔ
７ ＤＮＡポリメラーゼ（ユーエスバイオケミカル（US
Biochemical）より入手し、製造業者の勧める方法に従
い行う）を用いる完全な二本鎖ＤＮＡの相互にプライム
された合成（mutually primed synthesis ）の鋳型およ
びプライマーとなる。重複型（duplex）の延長の後、二
本鎖ＤＮＡを方法２に記載したアガロースゲル電気泳動
により精製する。
らの二本鎖ＤＮＡの調製 オリゴヌクレオチドは標準的なホスポラミダイト（phos
poramidite）化学を使用して合成する（０．２マイクロ
モル合成）。断片はアウスベル（Ausubel)ら（前述）第
１章、単元２．１２に記載された変性条件下で２０％ポ
リアクリルアミゴゲル上で分離、溶出、および脱塩す
る。二本鎖ＤＮＡは、３’末端の完全な相補性を有する
１５ヌクレオチドの重複領域を有する合成オリゴヌクレ
オチドの上方鎖（upper strand）と下方鎖（lower stra
nd）対から、各鎖（strand）の１μg の混合物を９０℃
で５分間加熱してから、１時間から２時間かけてゆっく
り室温まで冷却することにより構成する。この短い重複
領域（duplex region)はセクアナーゼ（Sequenase)、Ｔ
７ ＤＮＡポリメラーゼ（ユーエスバイオケミカル（US
Biochemical）より入手し、製造業者の勧める方法に従
い行う）を用いる完全な二本鎖ＤＮＡの相互にプライム
された合成（mutually primed synthesis ）の鋳型およ
びプライマーとなる。重複型（duplex）の延長の後、二
本鎖ＤＮＡを方法２に記載したアガロースゲル電気泳動
により精製する。
【００９３】方法７．粗大腸菌細胞抽出物の調製 ハイブリッドポリペプチドの遺伝子を有するプラスミッ
ドを含む大腸菌宿主細胞を、１００mg／Ｌアンピシリン
を含むＬ−ブロス中で、ニューブランズウィックインキ
ュベーターシェーカー（New Brunswick incubator-shak
er）中で４２℃で２５０ＲＰＭで一晩インキュベートし
て静止期まで増殖させる。ＧＳＡローターを用いてソー
バル（Sorvall)ＲＣ−５Ｂ遠心分離機で５０００×Ｇで
４℃で３０分間遠心分離して、細胞をペレットにして集
める。上澄液を流し出し、細胞ペレットの重さを測る。
細胞を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．８−
７．２（またはｐＨ４．０から１１．０までの適当な緩
衝液）中で４℃で、１：２（細胞湿重量：緩衝液容量）
で懸濁する。次にフィッシャーソニックヂスメンブラネ
ーター（Fisher sonic dismembranator)モデル３００で
大きいプローブを用いる超音波処理で、９５％相対出力
で１分間サイクルを３回行い、細胞を溶解する。得られ
た溶解物を４℃で３０分間１７，５００ＲＰＭで遠心分
離する。得られた上澄液に２％（Ｗ：Ｖ）のストレプト
マイシンサルフェートを加える。４℃で１５から３０分
間インキュベートした後、溶解物を前述したように１
７，５００ＲＰＭで遠心分離する。得られた上澄液を硫
酸アンモニウムで３０％飽和にして、４℃で３０分間イ
ンキュベートして、前述したように１７，５００ＲＰＭ
で遠心分離する。得られた上澄液を硫酸アンモニウムで
６０％飽和にして、４℃で３０分間インキュベートし
て、前述したように１７，５００ＲＰＭで遠心分離す
る。６０％硫酸アンモニウムの添加で生成したペレット
を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に再
懸濁して、約８０から１００mg/ml の総蛋白を得、これ
を前述したように１７，５００ＲＰＭで遠心分離する。
上澄液を粗抽出物と命名する。
ドを含む大腸菌宿主細胞を、１００mg／Ｌアンピシリン
を含むＬ−ブロス中で、ニューブランズウィックインキ
ュベーターシェーカー（New Brunswick incubator-shak
er）中で４２℃で２５０ＲＰＭで一晩インキュベートし
て静止期まで増殖させる。ＧＳＡローターを用いてソー
バル（Sorvall)ＲＣ−５Ｂ遠心分離機で５０００×Ｇで
４℃で３０分間遠心分離して、細胞をペレットにして集
める。上澄液を流し出し、細胞ペレットの重さを測る。
細胞を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．８−
７．２（またはｐＨ４．０から１１．０までの適当な緩
衝液）中で４℃で、１：２（細胞湿重量：緩衝液容量）
で懸濁する。次にフィッシャーソニックヂスメンブラネ
ーター（Fisher sonic dismembranator)モデル３００で
大きいプローブを用いる超音波処理で、９５％相対出力
で１分間サイクルを３回行い、細胞を溶解する。得られ
た溶解物を４℃で３０分間１７，５００ＲＰＭで遠心分
離する。得られた上澄液に２％（Ｗ：Ｖ）のストレプト
マイシンサルフェートを加える。４℃で１５から３０分
間インキュベートした後、溶解物を前述したように１
７，５００ＲＰＭで遠心分離する。得られた上澄液を硫
酸アンモニウムで３０％飽和にして、４℃で３０分間イ
ンキュベートして、前述したように１７，５００ＲＰＭ
で遠心分離する。得られた上澄液を硫酸アンモニウムで
６０％飽和にして、４℃で３０分間インキュベートし
て、前述したように１７，５００ＲＰＭで遠心分離す
る。６０％硫酸アンモニウムの添加で生成したペレット
を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に再
懸濁して、約８０から１００mg/ml の総蛋白を得、これ
を前述したように１７，５００ＲＰＭで遠心分離する。
上澄液を粗抽出物と命名する。
【００９４】方法８．アビジンモノマーアフィニティク
ロマトグラフィー 粗抽出物を、ＬＫＢ ＨＰＬＣ 装置（２つのモデル２
１５０ポンプ、モデル２１５２コントローラー、および
モデル２１４０スペクトラル検出器が付いている）のア
ビジンモノマーアフィニティ樹脂（米国特許出願第４１
４，７８５号）を充填した４mm×５cmのカラムに載せ
る。試料の吸光度を２８０ｎｍで追跡する。粗抽出物を
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．８−７．２
（またはｐＨ４．０から１１．０までの適当な緩衝液）
中で流速０．１ml／分で、同じ緩衝液で平衡化させたカ
ラムに載せる。試料を載せた後、カラムを吸光度がベー
スライン吸光度にもどるまで流速０．１ml／分でリン酸
緩衝液で洗浄する。次にカラムを水で平衡化させ、５ml
の２Ｍ ＮａＣｌを添加する。カラムを水で再度平衡化
させる。この同じＮａＣｌ−水洗浄工程を４から５回繰
り返す。方法９で記載するように酢酸またはビオチンで
試料を溶出する。
ロマトグラフィー 粗抽出物を、ＬＫＢ ＨＰＬＣ 装置（２つのモデル２
１５０ポンプ、モデル２１５２コントローラー、および
モデル２１４０スペクトラル検出器が付いている）のア
ビジンモノマーアフィニティ樹脂（米国特許出願第４１
４，７８５号）を充填した４mm×５cmのカラムに載せ
る。試料の吸光度を２８０ｎｍで追跡する。粗抽出物を
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．８−７．２
（またはｐＨ４．０から１１．０までの適当な緩衝液）
中で流速０．１ml／分で、同じ緩衝液で平衡化させたカ
ラムに載せる。試料を載せた後、カラムを吸光度がベー
スライン吸光度にもどるまで流速０．１ml／分でリン酸
緩衝液で洗浄する。次にカラムを水で平衡化させ、５ml
の２Ｍ ＮａＣｌを添加する。カラムを水で再度平衡化
させる。この同じＮａＣｌ−水洗浄工程を４から５回繰
り返す。方法９で記載するように酢酸またはビオチンで
試料を溶出する。
【００９５】方法９．アビジンモノマーアフィニティク
ロマトグラフィー樹脂からのハイブリッドポリペプチド
の溶出
ロマトグラフィー樹脂からのハイブリッドポリペプチド
の溶出
【００９６】Ａ．酢酸を用いる溶出 ５mlの１０％氷酢酸をカラムに添加する。溶出したハイ
ブリッドポリペプチドを２８０ｎｍの吸光度がベースラ
イン吸光度にもどるまで集める。
ブリッドポリペプチドを２８０ｎｍの吸光度がベースラ
イン吸光度にもどるまで集める。
【００９７】Ｂ．ビオチンを用いる溶出 １００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．５中の１０
ｍＭのビオチン５mlをカラムに添加する。溶出したハイ
ブリッドポリペプチドを２８０ｎｍの吸光度がベースラ
イン吸光度にもどるまで集める。
ｍＭのビオチン５mlをカラムに添加する。溶出したハイ
ブリッドポリペプチドを２８０ｎｍの吸光度がベースラ
イン吸光度にもどるまで集める。
【００９８】方法１０．結合のためのポリペプチドから
の目的のポリペプチドの切断 Ａ．酸切断 文献：ロンドン（London, M.）、メソッズインエンザイ
モロジー（Mehods in Enzymology）第４７巻、１４５−
１５９頁（１９７７年）。 ハイブリッドポリペプチド懸濁液を７０％蟻酸（Ｖ／
Ｖ）に調整し、４０℃で２４から４８時間インキュベー
トする。次に混合物を凍結乾燥する。方法８により高純
度の目的のポリペプチドが得られる。
の目的のポリペプチドの切断 Ａ．酸切断 文献：ロンドン（London, M.）、メソッズインエンザイ
モロジー（Mehods in Enzymology）第４７巻、１４５−
１５９頁（１９７７年）。 ハイブリッドポリペプチド懸濁液を７０％蟻酸（Ｖ／
Ｖ）に調整し、４０℃で２４から４８時間インキュベー
トする。次に混合物を凍結乾燥する。方法８により高純
度の目的のポリペプチドが得られる。
【００９９】Ｂ．メチオニン残基の臭化シアン切断 文献：グロスとウィトコップ（Gross, E. and B. Witko
p)、ジャーナルオブアメリカンケミカルササエティー
（Journal of American Chemical Society）第８３巻、
１５１０−１５１１頁（１９６１年）。 ハイブリッドポリペプチドを２３℃で７０％蟻酸水溶液
に溶解させる。少量の７０％蟻酸中の５０モル過剰の臭
化シアンを撹拌しながら添加する。混合物を暗所で０−
２５℃で１６から２４時間インキュベートする。次に混
合物を１０倍量の水で希釈し、凍結乾燥する。方法８に
より高純度の目的のポリペプチドが得られる。
p)、ジャーナルオブアメリカンケミカルササエティー
（Journal of American Chemical Society）第８３巻、
１５１０−１５１１頁（１９６１年）。 ハイブリッドポリペプチドを２３℃で７０％蟻酸水溶液
に溶解させる。少量の７０％蟻酸中の５０モル過剰の臭
化シアンを撹拌しながら添加する。混合物を暗所で０−
２５℃で１６から２４時間インキュベートする。次に混
合物を１０倍量の水で希釈し、凍結乾燥する。方法８に
より高純度の目的のポリペプチドが得られる。
【０１００】方法１１．結合のためのポリペプチドから
の目的のポリペプチドの分離 乾燥したポリペプチド混合物をアビジンモノマーカラム
ローディング（loading)緩衝液、１００ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液、ｐＨ６．８−７．２、またはＰＨが４．０
から１１．０の他の適当な緩衝液に再懸濁する。切断し
たポリペプチド混合物を前述した方法を用いてアビジン
樹脂に通すことにより、高純度の目的のポリペプチドが
得られる。結合のためのポリペプチドはアビジンモノマ
ーに保持され、目的のポリペプチドは保持されない。目
的のポリペプチドは流出液中に集められる。
の目的のポリペプチドの分離 乾燥したポリペプチド混合物をアビジンモノマーカラム
ローディング（loading)緩衝液、１００ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液、ｐＨ６．８−７．２、またはＰＨが４．０
から１１．０の他の適当な緩衝液に再懸濁する。切断し
たポリペプチド混合物を前述した方法を用いてアビジン
樹脂に通すことにより、高純度の目的のポリペプチドが
得られる。結合のためのポリペプチドはアビジンモノマ
ーに保持され、目的のポリペプチドは保持されない。目
的のポリペプチドは流出液中に集められる。
【０１０１】方法１２．プラスミッド発現ベクター ２つのプラスミッドがディー・サモルス（D. samols)
（ケースウェスタンリザーブ大学（Case Western Reser
ve University ））から得られた。 Ａ．プラスミッドｐｔａｃ１．３ｔ。このプラスミッド
はプロピオニバクテリウムシェルマニイ（Propionibact
erium shermanii)からのトランスカルボキシラーゼの
１．３Ｓポリペプチドの１２３個のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ配列を含む（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。
１．３ＳポリペプチドをコードするＤＮＡは発現ベクタ
ーｐＫＫ２２３−３のポリリンカー中に４３１塩基対の
断片としてクローン化される（マーチフ（Murtif）ら、
プロシーディングズオブナショナルアカデミーオブサイ
エンシーズオブユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA）第８２巻、５６１７−５６２１頁（１９８５
年））。
（ケースウェスタンリザーブ大学（Case Western Reser
ve University ））から得られた。 Ａ．プラスミッドｐｔａｃ１．３ｔ。このプラスミッド
はプロピオニバクテリウムシェルマニイ（Propionibact
erium shermanii)からのトランスカルボキシラーゼの
１．３Ｓポリペプチドの１２３個のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ配列を含む（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。
１．３ＳポリペプチドをコードするＤＮＡは発現ベクタ
ーｐＫＫ２２３−３のポリリンカー中に４３１塩基対の
断片としてクローン化される（マーチフ（Murtif）ら、
プロシーディングズオブナショナルアカデミーオブサイ
エンシーズオブユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA）第８２巻、５６１７−５６２１頁（１９８５
年））。
【０１０２】プラスミッドｐｔａｃ１．３（１−１２
５）。プラスミッドｐｔａｃ１．３（１−１２５）はマ
ーチフとサモルズ（Murtif and Samols)（ジャーナルオ
ブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）第２
６２巻、１１８１３−１１８１５頁（１９８７年）に記
載されている。プラスミッドｐｔａｃ１．３ｔと同様に
ｐｔａｃ１．３（１−１２５）は１．３Ｓポリペプチド
を含有するが、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位
をコードする１．３Ｓ遺伝子の３’末端に、配列ＧＡＴ
ＣＣＡ ＴＡＡ ＣＧＣ ＣＴＡ ＡＧＣ ＴＴ（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）をさらに有する。この追加ＤＮ
Ａ配列は、１．３Ｓポリペプチドのカルボキシル末端の
結合性アミノ酸配列ａｓｐ−ｐｒｏをコードする。
５）。プラスミッドｐｔａｃ１．３（１−１２５）はマ
ーチフとサモルズ（Murtif and Samols)（ジャーナルオ
ブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）第２
６２巻、１１８１３−１１８１５頁（１９８７年）に記
載されている。プラスミッドｐｔａｃ１．３ｔと同様に
ｐｔａｃ１．３（１−１２５）は１．３Ｓポリペプチド
を含有するが、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位
をコードする１．３Ｓ遺伝子の３’末端に、配列ＧＡＴ
ＣＣＡ ＴＡＡ ＣＧＣ ＣＴＡ ＡＧＣ ＴＴ（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）をさらに有する。この追加ＤＮ
Ａ配列は、１．３Ｓポリペプチドのカルボキシル末端の
結合性アミノ酸配列ａｓｐ−ｐｒｏをコードする。
【０１０３】本発明の本質と実施方法をさらに詳しく説
明するために、以下に実施例を示す。実施例４、５、７
および８は実際には行わなかったが、実施すれば以下の
ようになるであろう。
明するために、以下に実施例を示す。実施例４、５、７
および８は実際には行わなかったが、実施すれば以下の
ようになるであろう。
【０１０４】実施例１．大腸菌でのハイブリッドポリペ
プチドの発現レベルを増加させるためのｐｔａｃ１．３
（１−１２５）の修飾 ｐｔａｃ１．３（１−１２５）中に挿入されたキメラ遺
伝子から産生される、ハイブリッドポリペプチドの発現
レベルを、全可溶性細胞蛋白の約０．１％から全可溶性
細胞蛋白の約５．０％に増加させるために、ｐｔａｃ
１．３（１−１２５）を以下のように修飾した。ｐｔａ
ｃ１．３（１−１２５）を制限酵素ＸｈｏＩとＨｉｎｄ
IIIで消化した。アガロースゲル電気泳動により目的の
１３１塩基対（ｂｐ）断片を得た。ベクターｐｔａｃ
１．３ｄｐも前述した条件下でＸｈｏＩとＨｉｎｄ III
で消化し、アガロースゲル精製により４．８６キロ塩基
（ｋｂ）断片を得た。プラスミッドｐｔａｃ１．３（１
−１２５）からの１３１ｂｐ断片をｐｔａｃ１．３ｄｐ
の４．８６ｋｂ断片に結合させてプラスミッドｐｔａｃ
１．３ｄｐ（図１）を得た。結合したプラスミッド混合
物を用いてコンピタントな大腸菌ＨＢ１０１を形質転換
させた。ｐｔａｃ１．３ｄｐを有する大腸菌クローン
を、選択されたアンピシリン耐性大腸菌細胞から単離さ
れたプラスミッドの制限酵素消化により同定した。
プチドの発現レベルを増加させるためのｐｔａｃ１．３
（１−１２５）の修飾 ｐｔａｃ１．３（１−１２５）中に挿入されたキメラ遺
伝子から産生される、ハイブリッドポリペプチドの発現
レベルを、全可溶性細胞蛋白の約０．１％から全可溶性
細胞蛋白の約５．０％に増加させるために、ｐｔａｃ
１．３（１−１２５）を以下のように修飾した。ｐｔａ
ｃ１．３（１−１２５）を制限酵素ＸｈｏＩとＨｉｎｄ
IIIで消化した。アガロースゲル電気泳動により目的の
１３１塩基対（ｂｐ）断片を得た。ベクターｐｔａｃ
１．３ｄｐも前述した条件下でＸｈｏＩとＨｉｎｄ III
で消化し、アガロースゲル精製により４．８６キロ塩基
（ｋｂ）断片を得た。プラスミッドｐｔａｃ１．３（１
−１２５）からの１３１ｂｐ断片をｐｔａｃ１．３ｄｐ
の４．８６ｋｂ断片に結合させてプラスミッドｐｔａｃ
１．３ｄｐ（図１）を得た。結合したプラスミッド混合
物を用いてコンピタントな大腸菌ＨＢ１０１を形質転換
させた。ｐｔａｃ１．３ｄｐを有する大腸菌クローン
を、選択されたアンピシリン耐性大腸菌細胞から単離さ
れたプラスミッドの制限酵素消化により同定した。
【０１０５】実施例２．ポリペプチド間に酸切断部位を
有する、目的のポリペプチドの結合のためのポリペプチ
ドのＣ−末端への融合 この例では合成ｂ−エンドルフィンポリペプチドが１．
３ＳポリペプチドのＣ−末端に融合されているハイブリ
ッドポリペプチドについて記載する。切断のための２つ
のポリペプチドの間にａｓｐ−ｐｒｏ切断部位を導入
し、アビジンモノマー樹脂を用いてアフィニティ精製し
た後１．３Ｓポリペプチドからｂ−エンドルフィンを精
製する。
有する、目的のポリペプチドの結合のためのポリペプチ
ドのＣ−末端への融合 この例では合成ｂ−エンドルフィンポリペプチドが１．
３ＳポリペプチドのＣ−末端に融合されているハイブリ
ッドポリペプチドについて記載する。切断のための２つ
のポリペプチドの間にａｓｐ−ｐｒｏ切断部位を導入
し、アビジンモノマー樹脂を用いてアフィニティ精製し
た後１．３Ｓポリペプチドからｂ−エンドルフィンを精
製する。
【０１０６】ｂ−エンドルフィン遺伝子の合成 修飾されたｂ−エンドルフィンポリペプチドのアミノ酸
配列をＳＥＱ ＩＤＮＯ：６に示す：そしてこのアミノ
酸配列をコードする対応するヌクレオチド配列をＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：７に示す。この合成遺伝子を組み立てた
銅製オリゴヌクレオチドをＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（Ｒ
Ｈｃｂｅ１）とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＲＨｃｂｅ
２）に示す。修飾されたｂ−エンドルフィンポリペプチ
ド中には内部にメチオニン残基は存在しない。ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：６の５’末端での１２位から１７位までの
ヌクレオチドでのＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ切断認
識配列ＧＡＴＣＣは、この配列がｐｔａｃ１．３ｄｐ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）のＢａｍＨＩ部位に挿入さ
れる時、ｂ−エンドルフィン遺伝子の５’末端でのＡＴ
Ｇコドンの導入を可能にし、ポリペプチドのＮ−末端に
メチオニンを加える。大腸菌での発現を最大にするため
に、高度に発現された大腸菌遺伝子の好適なコドンを用
いてＤＮＡ配列中に本物のｂ−エンドルフィンのアミノ
酸配列を逆翻訳した（デボアー（Deboer, H.）、第８
章、「遺伝子発現の最大化」（MaximizingGene Express
ion）、レズニコフとゴールド（W. Reznikoff and L. G
old）編）。ＲＨｃｂｅ１とＲＨｃｂｅ２を合成し、ア
ニーリングし、方法３に記載した方法でＴ７ＤＮＡポリ
メラーゼでつないだ。得られた二本鎖ＤＮＡ配列（ＳＥ
ＱＩＤ ＮＯ：５）をＢａｍＨＩで消化し、合成ｂ−エ
ンドルフィンをコードする１０５ｂｐの断片を得、これ
をアガロースゲル電気泳動で精製した。プラスミッドベ
クターｐＵＣ１９（サムブルーク（Sambrook）ら、モレ
キュラークローニングアラボラトリーマニュアル（Mole
cular Cloning A Laboratory Manual)、第２版、第１
巻、１．１３頁）をＢａｍＨＩで線状化（linearize)し
た。ベクターの自己結合を最小にするためにサムブルー
ク（Sambrook）ら（前述、第１巻、３．３８−３．３９
頁）の記載した方法を用いて、結合の前に消化混合物を
牛の小腸ホスファターゼとインキュベートして脱リン酸
化した。アガロースゲル電気泳動で純粋なプラスミッド
を回収し１１０ｂｐ合成ｂ−エンドルフィン断片をｐＵ
Ｃ１９プラスミッドに結合させ、この結合したプラスミ
ッドを用いてコンピタントな大腸菌ＨＢ１０１を形質転
換させた。アンピシリン耐性クローンからプラスミッド
を単離した後、正しいプラスミッドを有する組換え大腸
菌細胞を制限酵素消化で同定した。合成ｂ−エンドルフ
ィンの遺伝子を有する組換えプラスミッドをｐＵＣ１９
ｅｎｄｏｒＢ３と命名した。
配列をＳＥＱ ＩＤＮＯ：６に示す：そしてこのアミノ
酸配列をコードする対応するヌクレオチド配列をＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：７に示す。この合成遺伝子を組み立てた
銅製オリゴヌクレオチドをＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（Ｒ
Ｈｃｂｅ１）とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＲＨｃｂｅ
２）に示す。修飾されたｂ−エンドルフィンポリペプチ
ド中には内部にメチオニン残基は存在しない。ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：６の５’末端での１２位から１７位までの
ヌクレオチドでのＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ切断認
識配列ＧＡＴＣＣは、この配列がｐｔａｃ１．３ｄｐ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）のＢａｍＨＩ部位に挿入さ
れる時、ｂ−エンドルフィン遺伝子の５’末端でのＡＴ
Ｇコドンの導入を可能にし、ポリペプチドのＮ−末端に
メチオニンを加える。大腸菌での発現を最大にするため
に、高度に発現された大腸菌遺伝子の好適なコドンを用
いてＤＮＡ配列中に本物のｂ−エンドルフィンのアミノ
酸配列を逆翻訳した（デボアー（Deboer, H.）、第８
章、「遺伝子発現の最大化」（MaximizingGene Express
ion）、レズニコフとゴールド（W. Reznikoff and L. G
old）編）。ＲＨｃｂｅ１とＲＨｃｂｅ２を合成し、ア
ニーリングし、方法３に記載した方法でＴ７ＤＮＡポリ
メラーゼでつないだ。得られた二本鎖ＤＮＡ配列（ＳＥ
ＱＩＤ ＮＯ：５）をＢａｍＨＩで消化し、合成ｂ−エ
ンドルフィンをコードする１０５ｂｐの断片を得、これ
をアガロースゲル電気泳動で精製した。プラスミッドベ
クターｐＵＣ１９（サムブルーク（Sambrook）ら、モレ
キュラークローニングアラボラトリーマニュアル（Mole
cular Cloning A Laboratory Manual)、第２版、第１
巻、１．１３頁）をＢａｍＨＩで線状化（linearize)し
た。ベクターの自己結合を最小にするためにサムブルー
ク（Sambrook）ら（前述、第１巻、３．３８−３．３９
頁）の記載した方法を用いて、結合の前に消化混合物を
牛の小腸ホスファターゼとインキュベートして脱リン酸
化した。アガロースゲル電気泳動で純粋なプラスミッド
を回収し１１０ｂｐ合成ｂ−エンドルフィン断片をｐＵ
Ｃ１９プラスミッドに結合させ、この結合したプラスミ
ッドを用いてコンピタントな大腸菌ＨＢ１０１を形質転
換させた。アンピシリン耐性クローンからプラスミッド
を単離した後、正しいプラスミッドを有する組換え大腸
菌細胞を制限酵素消化で同定した。合成ｂ−エンドルフ
ィンの遺伝子を有する組換えプラスミッドをｐＵＣ１９
ｅｎｄｏｒＢ３と命名した。
【０１０７】合成ｂ−エンドルフィンのｐｔａｃ１．３
ｄｐへのクローニング ｐＵＣ１９ｅｎｄｏｒＢ３中のｂ−エンドルフィン遺伝
子をｐｔａｃ１．３ｄｐ中の１．３Ｓ遺伝子の３’末端
に以下のようにして融合させた：ｐＵＣ１９ｅｎｄｏｒ
Ｂ３をＢａｍＨＩで消化して１０５ｂｐのｂ−エンドル
フィン遺伝子断片を作成し、アガロースゲル電気泳動で
精製した。２つのＢａｍＨＩ部位を含むベクターｐｔａ
ｃ１．３ｄｐをＢａｍＨＩで部分消化した。１つののＢ
ａｍＨＩ部位のみで切断したプラスミッドＤＮＡをアガ
ロースゲル電気泳動で精製した。１１０ｂｐのｂ−エン
ドルフィン遺伝子を、線状化したｐｔａｃ１．３ｄｐプ
ラスミッドのＢａｍＨＩ部位に結合し、結合混合物を用
いてコンピタントな大腸菌ＨＢ１０１を形質転換させ
た。ｂ−エンドルフィン遺伝子を正しい配向で含む結合
したプラスミッドを、アンピシリン耐性形質転換大腸菌
から単離したプラスミッドの制限酵素解析により同定
し、ｐｔａｃ１．３ｄｐ：ｅｎｄｏｒＢ３と命名した
（図２）。このプラスミッドは、第１位でメチオニン残
基を含む合成ｂ−エンドルフィンポリペプチドに融合し
たａｓｐ−ｐｒｏ切断配列に、そのＣ−末端で融合した
１．３Ｓポリペプチドよりなる、ハイブリッド融合ポリ
ペプチドをコードする。アンピシリン１００mg／ｌを含
むＬ−ブロスにｐｔａｃ１．３ｄｐ：ｅｎｄｏｒＢ３を
有する大腸菌宿主を接種して、合成ｂ−エンドルフィン
の高純度調製物を得た。方法７により１．３Ｓ：ｂ−エ
ンドルフィンがハイブリッドポリペプチドを含む粗蛋白
を得た。方法８に記載されたアビジンモノマー樹脂クロ
マトグラフィーにより酢酸を用いて樹脂から精製ハイブ
リッドポリペプチドを溶出して（方法９Ａ）、高純度の
１．３Ｓ：ｂ−エンドルフィンポリペプチドを得た。方
法１０のパートＡに従い蟻酸中でインキュベートして
１．３Ｓポリペプチドからｂ−エンドルフィンを切断
し、方法１１を繰り返して、切断混合物をアビジンモノ
マー樹脂クロマトグラフィーにより、高純度のｂ−エン
ドルフィンを得た。ａｓｐ−ｐｒｏ結合配列の酸切断に
より、プロリン残基は切断されたｂ−エンドルフィンポ
リペプチドのＮ−末端に保持されている。
ｄｐへのクローニング ｐＵＣ１９ｅｎｄｏｒＢ３中のｂ−エンドルフィン遺伝
子をｐｔａｃ１．３ｄｐ中の１．３Ｓ遺伝子の３’末端
に以下のようにして融合させた：ｐＵＣ１９ｅｎｄｏｒ
Ｂ３をＢａｍＨＩで消化して１０５ｂｐのｂ−エンドル
フィン遺伝子断片を作成し、アガロースゲル電気泳動で
精製した。２つのＢａｍＨＩ部位を含むベクターｐｔａ
ｃ１．３ｄｐをＢａｍＨＩで部分消化した。１つののＢ
ａｍＨＩ部位のみで切断したプラスミッドＤＮＡをアガ
ロースゲル電気泳動で精製した。１１０ｂｐのｂ−エン
ドルフィン遺伝子を、線状化したｐｔａｃ１．３ｄｐプ
ラスミッドのＢａｍＨＩ部位に結合し、結合混合物を用
いてコンピタントな大腸菌ＨＢ１０１を形質転換させ
た。ｂ−エンドルフィン遺伝子を正しい配向で含む結合
したプラスミッドを、アンピシリン耐性形質転換大腸菌
から単離したプラスミッドの制限酵素解析により同定
し、ｐｔａｃ１．３ｄｐ：ｅｎｄｏｒＢ３と命名した
（図２）。このプラスミッドは、第１位でメチオニン残
基を含む合成ｂ−エンドルフィンポリペプチドに融合し
たａｓｐ−ｐｒｏ切断配列に、そのＣ−末端で融合した
１．３Ｓポリペプチドよりなる、ハイブリッド融合ポリ
ペプチドをコードする。アンピシリン１００mg／ｌを含
むＬ−ブロスにｐｔａｃ１．３ｄｐ：ｅｎｄｏｒＢ３を
有する大腸菌宿主を接種して、合成ｂ−エンドルフィン
の高純度調製物を得た。方法７により１．３Ｓ：ｂ−エ
ンドルフィンがハイブリッドポリペプチドを含む粗蛋白
を得た。方法８に記載されたアビジンモノマー樹脂クロ
マトグラフィーにより酢酸を用いて樹脂から精製ハイブ
リッドポリペプチドを溶出して（方法９Ａ）、高純度の
１．３Ｓ：ｂ−エンドルフィンポリペプチドを得た。方
法１０のパートＡに従い蟻酸中でインキュベートして
１．３Ｓポリペプチドからｂ−エンドルフィンを切断
し、方法１１を繰り返して、切断混合物をアビジンモノ
マー樹脂クロマトグラフィーにより、高純度のｂ−エン
ドルフィンを得た。ａｓｐ−ｐｒｏ結合配列の酸切断に
より、プロリン残基は切断されたｂ−エンドルフィンポ
リペプチドのＮ−末端に保持されている。
【０１０８】ｐｔａｃ１．３ｄｐ：ｅｎｄｏｒＢ３と反
対の配向でｂ−エンドルフィン遺伝子断片を含むクロー
ンは、結合性アミノ酸配列ａｓｐ−ｐｒｏにより結合さ
れた新規の２１個のアミノ酸残基の逆エンドルフィンペ
プチドに融合した１．３Ｓポリペプチドを産生した。新
規ペプチドをコードするｐｔａｃ１．３ｄｐ：ｒｅｖｅ
ｎｄｏｒＢ３と命名されたこの遺伝子を図２Ｂに示す。
このポリペプチドはアビジンモノマークロマトグラフィ
ー（方法８）により精製され、酢酸を用いてカラムから
高収率および高純度で溶出される（方法９Ａ）。
対の配向でｂ−エンドルフィン遺伝子断片を含むクロー
ンは、結合性アミノ酸配列ａｓｐ−ｐｒｏにより結合さ
れた新規の２１個のアミノ酸残基の逆エンドルフィンペ
プチドに融合した１．３Ｓポリペプチドを産生した。新
規ペプチドをコードするｐｔａｃ１．３ｄｐ：ｒｅｖｅ
ｎｄｏｒＢ３と命名されたこの遺伝子を図２Ｂに示す。
このポリペプチドはアビジンモノマークロマトグラフィ
ー（方法８）により精製され、酢酸を用いてカラムから
高収率および高純度で溶出される（方法９Ａ）。
【０１０９】この例はさらに、目的のポリペプチドを高
収率および高純度で得るための効率的な方法としての、
アビジンに結合するためのポリペプチドを含むハイブリ
ッドポリペプチドの産生を示す。
収率および高純度で得るための効率的な方法としての、
アビジンに結合するためのポリペプチドを含むハイブリ
ッドポリペプチドの産生を示す。
【０１１０】実施例３．２つのポリペプチドの間のメチ
オニン切断部位を用いる、目的のポリペプチドの結合の
ためのポリペプチドへの融合 この例では、合成ｂ−エンドルフィンポリペプチドはそ
のＮ−末端でメチオニン残基に融合し、このメチオニン
残基は１．３ＳポリペプチドのＣ−末端に位置してお
り、従ってアビジンモノマークロマトグラフィーにより
１．３Ｓポリペプチドからｂ−エンドルフィンを分離す
るための、単一のアミノ酸切断部位を与える。臭化シア
ンで切断することにより、ｂ−エンドルフィンのＮ−末
端からメチオニンが切断されるため、ｂ−エンドルフィ
ン上の修飾されないＮ−末端が得られる。
オニン切断部位を用いる、目的のポリペプチドの結合の
ためのポリペプチドへの融合 この例では、合成ｂ−エンドルフィンポリペプチドはそ
のＮ−末端でメチオニン残基に融合し、このメチオニン
残基は１．３ＳポリペプチドのＣ−末端に位置してお
り、従ってアビジンモノマークロマトグラフィーにより
１．３Ｓポリペプチドからｂ−エンドルフィンを分離す
るための、単一のアミノ酸切断部位を与える。臭化シア
ンで切断することにより、ｂ−エンドルフィンのＮ−末
端からメチオニンが切断されるため、ｂ−エンドルフィ
ン上の修飾されないＮ−末端が得られる。
【０１１１】ベクターｐｔａｃ１．３ｄｐはＸｈｏＩと
Ｈｉｎｄ IIIにより完全に消化され、１３１ｂｐ断片は
アガロースゲル電気泳動で精製される。この１３１ｂｐ
断片はＳａｕ３Ａで部分消化され、アガロースゲル電気
泳動で単離、精製される。このＸｈｏＩ−Ｓａｕ３Ａ断
片は、ｂ−エンドルフィンをコードする二本鎖合成ＤＮ
Ａ断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）に結合される。こ
のｂ−エンドルフィンはＮ−末端にメチオニン残基を有
する。このＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２中の断片は方法６
に記載されたように、合成オリゴヌクレオチドＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１０とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１から構成
され、１１０ｂｐのＸｈｏＩ−Ｓａｕ３Ａ断片に結合す
る前にＳａｕ３Ａで完全に消化される。この結合の２２
０ｂｐ生成物はアガロース電気泳動で精製される。この
ベクターｐｔａｃ１．３ｄｐはＸｈｏＩとＢａｍＨＩで
部分消化され、４８８６ｂｐの線状ベクターはアガロー
スゲル電気泳動で精製される。結合したプラスミッドを
用いて、方法４を使用して調製したコンピタントな大腸
菌ＣＳＨ２６を形質転換する。形質転換したアンピシリ
ン耐性大腸菌のクローンからプラスミッドを単離し、正
しい配向で目的の遺伝子を含むプラスミッドを制限酵素
解析で同定し、ｐｔａｃ１．３ｄｐ：ｍｅｔ：ｅｎｄｏ
ｒと命名した（図２Ｃ）。１００mg／ｌアンピシリンを
含むＬ−ブロスにｐｔａｃ１．３ｄｐ：ｍｅｔ：ｅｎｄ
ｏｒを有する大腸菌を接種することにより、合成ｂ−エ
ンドルフィンの高純度調製物が得られる。方法７に従っ
て１．３Ｓ：ｂ−エンドルフィンハイブリッドポリペプ
チドを含む粗蛋白抽出物が得られる。方法８に記載され
たアビジンモノマーアフィニティクロマトグラフィーに
より酢酸を用いて樹脂から精製されたハイブリッドポリ
ペプチドを溶出することにより、高純度の１．３Ｓ：ｂ
−エンドルフィンポリペプチドが得られる（方法８
Ａ）。１．３Ｓポリペプチドからのｂ−エンドルフィン
の切断は、方法１０のパートＢに従い臭化シアン中でイ
ンキュベートすることにより達成され、方法１１を繰り
返し切断混合物のアビジンモノマーアフィニティクロマ
トグラフィーにより、高純度のｂ−エンドルフィンが得
られる。
Ｈｉｎｄ IIIにより完全に消化され、１３１ｂｐ断片は
アガロースゲル電気泳動で精製される。この１３１ｂｐ
断片はＳａｕ３Ａで部分消化され、アガロースゲル電気
泳動で単離、精製される。このＸｈｏＩ−Ｓａｕ３Ａ断
片は、ｂ−エンドルフィンをコードする二本鎖合成ＤＮ
Ａ断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）に結合される。こ
のｂ−エンドルフィンはＮ−末端にメチオニン残基を有
する。このＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２中の断片は方法６
に記載されたように、合成オリゴヌクレオチドＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１０とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１から構成
され、１１０ｂｐのＸｈｏＩ−Ｓａｕ３Ａ断片に結合す
る前にＳａｕ３Ａで完全に消化される。この結合の２２
０ｂｐ生成物はアガロース電気泳動で精製される。この
ベクターｐｔａｃ１．３ｄｐはＸｈｏＩとＢａｍＨＩで
部分消化され、４８８６ｂｐの線状ベクターはアガロー
スゲル電気泳動で精製される。結合したプラスミッドを
用いて、方法４を使用して調製したコンピタントな大腸
菌ＣＳＨ２６を形質転換する。形質転換したアンピシリ
ン耐性大腸菌のクローンからプラスミッドを単離し、正
しい配向で目的の遺伝子を含むプラスミッドを制限酵素
解析で同定し、ｐｔａｃ１．３ｄｐ：ｍｅｔ：ｅｎｄｏ
ｒと命名した（図２Ｃ）。１００mg／ｌアンピシリンを
含むＬ−ブロスにｐｔａｃ１．３ｄｐ：ｍｅｔ：ｅｎｄ
ｏｒを有する大腸菌を接種することにより、合成ｂ−エ
ンドルフィンの高純度調製物が得られる。方法７に従っ
て１．３Ｓ：ｂ−エンドルフィンハイブリッドポリペプ
チドを含む粗蛋白抽出物が得られる。方法８に記載され
たアビジンモノマーアフィニティクロマトグラフィーに
より酢酸を用いて樹脂から精製されたハイブリッドポリ
ペプチドを溶出することにより、高純度の１．３Ｓ：ｂ
−エンドルフィンポリペプチドが得られる（方法８
Ａ）。１．３Ｓポリペプチドからのｂ−エンドルフィン
の切断は、方法１０のパートＢに従い臭化シアン中でイ
ンキュベートすることにより達成され、方法１１を繰り
返し切断混合物のアビジンモノマーアフィニティクロマ
トグラフィーにより、高純度のｂ−エンドルフィンが得
られる。
【０１１２】実施例４．ハイブリッドポリペプチド中に
結合性アミノ酸が存在しない、結合のためのポリペプチ
ドのカルボキシル末端への目的のポリペプチドの直接の
融合 この例では、合成ｂ−エンドルフィンポリペプチドを、
１．３ＳポリペプチドのＣ−末端に直接融合する。アビ
ジンモノマークロマトグラフィーを用いて、ハイブリッ
ド融合ポリペプチドの形で高純度のｂ−エンドルフィン
を得る。
結合性アミノ酸が存在しない、結合のためのポリペプチ
ドのカルボキシル末端への目的のポリペプチドの直接の
融合 この例では、合成ｂ−エンドルフィンポリペプチドを、
１．３ＳポリペプチドのＣ−末端に直接融合する。アビ
ジンモノマークロマトグラフィーを用いて、ハイブリッ
ド融合ポリペプチドの形で高純度のｂ−エンドルフィン
を得る。
【０１１３】作成体ｐｔａｃ１．３ｔ（方法１２）を、
ＸｈｏＩとＨｉｎｄ IIIで完全に消化し、小さい方の１
３１ｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動で精製する。こ
の１３１ｂｐ断片をＳａｕ３Ａ Ｉで部分消化し、１１
０ｂｐ断片をアガロースゲルで精製する。１１０ｂｐ断
片を二本鎖ＤＮＡ断片ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に結合
させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５は合成ｂ−エンドル
フィン遺伝子をコードし、その３’末端に結合性アミノ
酸すなわちアミノ酸配列を含まない。ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１５は方法６を用いて、合成オリゴヌクレオチドＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４か
ら構成される。１１０ｂｐ断片への結合の前に、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１５はＳａｕ３Ａ Ｉで完全に消化す
る。２１７ｂｐ結合産物をアガロースゲル電気泳動で精
製する。ベクターｐｔａｃ１．３ｄｐをＸｈｏＩとＢａ
ｍＨＩで部分消化し、４８８６ｂｐ断片もアガロースゲ
ル電気泳動で精製する。結合したプラスミッドを用いて
コンピタントな大腸菌ＣＳＨ２６を形質転換する。組換
えプラスミッドをアンピシリン耐性形質転換体から単離
し、正しい配向で目的の遺伝子を含むクローンを制限酵
素解析で同定し、ｐｔａｃ１．３：ｅｎｄｏｒと命名す
る（図２Ｄ）。１００mg／ｌアンピシリンを含むＬ−ブ
ロスにｐｔａｃ１．３：ｅｎｄｏｒを有する大腸菌を接
種することにより、合成ｂ−エンドルフィンの高純度調
製物が得られる。方法７に従って１．３Ｓ：ｂ−エンド
ルフィンハイブリッドポリペプチドを含む粗蛋白抽出物
が得られる。方法８に記載されたアビジンモノマーアフ
ィニティクロマトグラフィーにより酢酸を用いて樹脂か
ら精製されたハイブリッドポリペプチドを溶出すること
により、高純度の１．３Ｓ：ｂ−エンドルフィンポリペ
プチドが得られる（方法８Ａ）。
ＸｈｏＩとＨｉｎｄ IIIで完全に消化し、小さい方の１
３１ｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動で精製する。こ
の１３１ｂｐ断片をＳａｕ３Ａ Ｉで部分消化し、１１
０ｂｐ断片をアガロースゲルで精製する。１１０ｂｐ断
片を二本鎖ＤＮＡ断片ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に結合
させる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５は合成ｂ−エンドル
フィン遺伝子をコードし、その３’末端に結合性アミノ
酸すなわちアミノ酸配列を含まない。ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１５は方法６を用いて、合成オリゴヌクレオチドＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４か
ら構成される。１１０ｂｐ断片への結合の前に、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１５はＳａｕ３Ａ Ｉで完全に消化す
る。２１７ｂｐ結合産物をアガロースゲル電気泳動で精
製する。ベクターｐｔａｃ１．３ｄｐをＸｈｏＩとＢａ
ｍＨＩで部分消化し、４８８６ｂｐ断片もアガロースゲ
ル電気泳動で精製する。結合したプラスミッドを用いて
コンピタントな大腸菌ＣＳＨ２６を形質転換する。組換
えプラスミッドをアンピシリン耐性形質転換体から単離
し、正しい配向で目的の遺伝子を含むクローンを制限酵
素解析で同定し、ｐｔａｃ１．３：ｅｎｄｏｒと命名す
る（図２Ｄ）。１００mg／ｌアンピシリンを含むＬ−ブ
ロスにｐｔａｃ１．３：ｅｎｄｏｒを有する大腸菌を接
種することにより、合成ｂ−エンドルフィンの高純度調
製物が得られる。方法７に従って１．３Ｓ：ｂ−エンド
ルフィンハイブリッドポリペプチドを含む粗蛋白抽出物
が得られる。方法８に記載されたアビジンモノマーアフ
ィニティクロマトグラフィーにより酢酸を用いて樹脂か
ら精製されたハイブリッドポリペプチドを溶出すること
により、高純度の１．３Ｓ：ｂ−エンドルフィンポリペ
プチドが得られる（方法８Ａ）。
【０１１４】実施例５．結合のためのポリペプチド：目
的のポリペプチド：目的のポリペプチドの順序での１つ
の結合のためのポリペプチドのＣ−末端への２つの目的
のポリペプチドの融合 この例では、２つの直列に並んだ合成ｂ−エンドルフィ
ンポリペプチドを１．３ＳポリペプチドのＣ−末端に融
合する。この場合結合性アミノ酸ａｓｐ−ｐｒｏ−ｍｅ
ｔは１．３ＳポリペプチドのＣ−末端から最初のｂ−エ
ンドルフィンポリペプチドを分離し、もう１つのａｓｐ
−ｐｒｏ−ｍｅｔは第２のｂ−エンドルフィンポリペプ
チドから最初のｂ−エンドルフィンを分離する。このよ
うな融合は目的のポリペプチドの収率を倍にし、同時に
アビジンアフィニティクロマトグラフィーによるこのポ
リペプチドの精製の手段を与える。
的のポリペプチド：目的のポリペプチドの順序での１つ
の結合のためのポリペプチドのＣ−末端への２つの目的
のポリペプチドの融合 この例では、２つの直列に並んだ合成ｂ−エンドルフィ
ンポリペプチドを１．３ＳポリペプチドのＣ−末端に融
合する。この場合結合性アミノ酸ａｓｐ−ｐｒｏ−ｍｅ
ｔは１．３ＳポリペプチドのＣ−末端から最初のｂ−エ
ンドルフィンポリペプチドを分離し、もう１つのａｓｐ
−ｐｒｏ−ｍｅｔは第２のｂ−エンドルフィンポリペプ
チドから最初のｂ−エンドルフィンを分離する。このよ
うな融合は目的のポリペプチドの収率を倍にし、同時に
アビジンアフィニティクロマトグラフィーによるこのポ
リペプチドの精製の手段を与える。
【０１１５】プラスミッドｐｔａｃ１．３ｄｐ（図１）
をＸｈｏＩとＨｉｎｄ IIIで完全に消化する。こうして
得られるアミノ酸８で始まりａｓｐ−ｐｒｏ部位に到る
配列をコードする１１８ｂｐ断片は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：５に見られる１．３Ｓポリペプチドの３′末端のＢ
ａｍＨＩ部位によって作成される。この断片はアガロー
スゲル電気泳動で精製される。オリゴヌクレオチドＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７から
構成される二本鎖ＤＮＡ断片ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
８、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９とＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２０から構成されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を
作成することにより、２つの直列のｂ−エンドルフィン
ポリペプチドが産生される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８
とＳＥＱＩＤ ＮＯ：２１は、方法６に記載した合成と
鎖構成戦略を用いて、それぞれのオリゴヌクレオチドか
ら構成された。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８とＳＥＱ Ｉ
ＤＮＯ：２１ははＢａｍＨＩで消化され結合される。こ
の断片は、ａｓｐ−ｐｒｏ切断配列で分離された２つの
直列のｂ−エンドルフィンポリペプチドをコードする。
この二量体生成物はアガロースゲル電気泳動で精製さ
れ、この断片はｐｔａｃ１．３ｄｐから得られる１１８
ｂｐのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ １．３Ｓ部分コード配列
に結合される。この結合生成物はアガロースゲル電気泳
動で精製され、ＸｈｏＩとＢａｍＨＩによる部分消化に
より線状化されたｐｔａｃ１．３ｄｐの部分消化により
産生された４８８６ｂｐ断片に結合される。プラスミッ
ドＤＮＡは形質転換大腸菌ＨＢ１０１から単離される。
正しいキメラ遺伝子配向を含むプラスミッドを制限エン
ドヌクレアーゼマッピングにより確認し、ｐｔａｃ１．
３：ｅｎｄｏｒ：ｅｎｄｏｒと命名した（図３Ａ）。１
００mg／ｌアンピシリンを含むＬ−ブロスにｐｔａｃ
１．３：ｅｎｄｏｒ：ｅｎｄｏｒを有する大腸菌を接種
することにより、合成ｂ−エンドルフィンの高純度調製
物が得られる。方法７に従って１．３Ｓ：ｂ−エンドル
フィン：ｂ−エンドルフィンハイブリッドポリペプチド
を含む粗蛋白抽出物が得られる。方法８に記載されたア
ビジンモノマーアフィニティクロマトグラフィーによ
り、酢酸を用いて樹脂から精製されたハイブリッドポリ
ペプチドを溶出することにより、高純度の１．３Ｓ：ｂ
−エンドルフィン：ｂ−エンドルフィンポリペプチドが
得られる（方法８Ａ）。方法１０のパートＡに従い蟻酸
中でインキュベートすることにより、１ステップで１．
３Ｓポリペプチドから両方のｂ−エンドルフィンポリペ
プチドが切断され、切断混合物のアビジンモノマーアフ
ィニティクロマトグラフィーにより方法１１を繰り返す
ことにより、高純度のｂ−エンドルフィンが得られる。
をＸｈｏＩとＨｉｎｄ IIIで完全に消化する。こうして
得られるアミノ酸８で始まりａｓｐ−ｐｒｏ部位に到る
配列をコードする１１８ｂｐ断片は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：５に見られる１．３Ｓポリペプチドの３′末端のＢ
ａｍＨＩ部位によって作成される。この断片はアガロー
スゲル電気泳動で精製される。オリゴヌクレオチドＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７から
構成される二本鎖ＤＮＡ断片ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
８、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９とＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２０から構成されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を
作成することにより、２つの直列のｂ−エンドルフィン
ポリペプチドが産生される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８
とＳＥＱＩＤ ＮＯ：２１は、方法６に記載した合成と
鎖構成戦略を用いて、それぞれのオリゴヌクレオチドか
ら構成された。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８とＳＥＱ Ｉ
ＤＮＯ：２１ははＢａｍＨＩで消化され結合される。こ
の断片は、ａｓｐ−ｐｒｏ切断配列で分離された２つの
直列のｂ−エンドルフィンポリペプチドをコードする。
この二量体生成物はアガロースゲル電気泳動で精製さ
れ、この断片はｐｔａｃ１．３ｄｐから得られる１１８
ｂｐのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ １．３Ｓ部分コード配列
に結合される。この結合生成物はアガロースゲル電気泳
動で精製され、ＸｈｏＩとＢａｍＨＩによる部分消化に
より線状化されたｐｔａｃ１．３ｄｐの部分消化により
産生された４８８６ｂｐ断片に結合される。プラスミッ
ドＤＮＡは形質転換大腸菌ＨＢ１０１から単離される。
正しいキメラ遺伝子配向を含むプラスミッドを制限エン
ドヌクレアーゼマッピングにより確認し、ｐｔａｃ１．
３：ｅｎｄｏｒ：ｅｎｄｏｒと命名した（図３Ａ）。１
００mg／ｌアンピシリンを含むＬ−ブロスにｐｔａｃ
１．３：ｅｎｄｏｒ：ｅｎｄｏｒを有する大腸菌を接種
することにより、合成ｂ−エンドルフィンの高純度調製
物が得られる。方法７に従って１．３Ｓ：ｂ−エンドル
フィン：ｂ−エンドルフィンハイブリッドポリペプチド
を含む粗蛋白抽出物が得られる。方法８に記載されたア
ビジンモノマーアフィニティクロマトグラフィーによ
り、酢酸を用いて樹脂から精製されたハイブリッドポリ
ペプチドを溶出することにより、高純度の１．３Ｓ：ｂ
−エンドルフィン：ｂ−エンドルフィンポリペプチドが
得られる（方法８Ａ）。方法１０のパートＡに従い蟻酸
中でインキュベートすることにより、１ステップで１．
３Ｓポリペプチドから両方のｂ−エンドルフィンポリペ
プチドが切断され、切断混合物のアビジンモノマーアフ
ィニティクロマトグラフィーにより方法１１を繰り返す
ことにより、高純度のｂ−エンドルフィンが得られる。
【０１１６】実施例６．結合のためのポリペプチドのＮ
−末端への１つの目的のポリペプチドの融合と、同じ結
合のためのポリペプチドのＣ−末端への第２の目的のポ
リペプチドの融合 この例では、１．３ＳポリペプチドのＮ−末端にマルト
ース結合蛋白（グアン（Guan）ら、ジーン（Gene）６７
−２１−３０（１９８７年）およびマイナ（Maina)ら、
ジーン（Gene）第７４巻、３６５−３７３頁（１９８８
年））が融合され、合成ｂ−エンドルフィンは同じ１．
３ＳポリペプチドのＣ−末端に融合され、２つの異なる
非隣接性の目的のポリペプチドよりなるハイブリッドポ
リペプチドを作成した。
−末端への１つの目的のポリペプチドの融合と、同じ結
合のためのポリペプチドのＣ−末端への第２の目的のポ
リペプチドの融合 この例では、１．３ＳポリペプチドのＮ−末端にマルト
ース結合蛋白（グアン（Guan）ら、ジーン（Gene）６７
−２１−３０（１９８７年）およびマイナ（Maina)ら、
ジーン（Gene）第７４巻、３６５−３７３頁（１９８８
年））が融合され、合成ｂ−エンドルフィンは同じ１．
３ＳポリペプチドのＣ−末端に融合され、２つの異なる
非隣接性の目的のポリペプチドよりなるハイブリッドポ
リペプチドを作成した。
【０１１７】作成したｐｔａｃ１．３ｄｐ：ｅｎｄｏｒ
ｂ３（図２Ａ）をＳａｌＩとＨｉｎｄ IIIで消化した。
作成された４３８ｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動で
精製した。この断片は１．３Ｓポリペプチドのアミノ酸
１９から１２３、ａｓｐ−ｐｒｏ−ｍｅｔ結合性アミノ
酸、および３１アミノ酸のｂ−エンドルフィンポリペプ
チドをコードする。このベクターｐＭＡＬ−ｃ（ニュー
イングランゴバイオラボズ（New England Biolabs)から
得られる）はＳａｌＩとＨｉｎｄ IIIを用いる消化によ
り線状化した。このベクターはｔａｃプロモーターの制
御下のマルトース結合蛋白を含む（グアン（Guan）ら、
ジーン（Gene）６７−２１−３０（１９８７年）および
マイナ（Maina)ら、ジーン（Gene）第７４巻、３６５−
３７３頁（１９８８年））。線状化されたベクターと４
３８ｂｐの１．３Ｓ−ｂ−エンドルフィン断片を結合
し、結合混合物を用いてコンピタントな大腸菌ＣＨＳ２
６を形質転換させた。プラスミッドＤＮＡを単離し、正
しいキメラ遺伝子配向を含むプラスミッドを制限エンド
ヌクレアーゼマッピングにより確認した。得られるクロ
ーンをｐｔａｃ：ｍａｌＢ：１．３：ｅｎｄｏｒＢ３と
命名した（図３Ｂ）。１００mg／ｌアンピシリンを含む
Ｌ−ブロスにｐｔａｃ：ｍａｌＢ：１．３：ｅｎｄｏｒ
Ｂ３を有する大腸菌宿主を接種することにより、ハイブ
リッドマルトース結合蛋白−合成ｂ−エンドルフィンポ
リペプチドの高純度調製物が得られる。方法７に従って
このハイブリッドポリペプチドを含む粗蛋白抽出物が得
られる。方法８に記載されたアビジンモノマーアフィニ
ティクロマトグラフィーによりビオチンを用いて、樹脂
から精製されたハイブリッドポリペプチドを溶出するこ
とにより、高純度のマルトース結合蛋白：１．３Ｓ：ｂ
−エンドルフィン：ハイブリッドポリペプチドが得られ
る（方法８Ｂ）。ポリペプチド懸濁液を１００ｍＭ炭酸
アンモニウム緩衝液、ｐＨ７．２、を３回交換する透析
後、試料を凍結乾燥することによりビオチンが除去され
る。方法１０のパートＢに従い臭化シアン中でインキュ
ベートすることにより、１．３Ｓポリペプチドからｂ−
エンドルフィンが切断され、切断混合物のアビジンモノ
マーアフィニティクロマトグラフィーにより方法１１を
繰り返すことにより高純度のｂ−エンドルフィンが得ら
れる。方法８Ｂに記載したビオチン溶出法を繰り返すこ
とにより、このマルトース結合蛋白−１．３Ｓハイブリ
ッドポリペプチドを高純度で回収する。
ｂ３（図２Ａ）をＳａｌＩとＨｉｎｄ IIIで消化した。
作成された４３８ｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動で
精製した。この断片は１．３Ｓポリペプチドのアミノ酸
１９から１２３、ａｓｐ−ｐｒｏ−ｍｅｔ結合性アミノ
酸、および３１アミノ酸のｂ−エンドルフィンポリペプ
チドをコードする。このベクターｐＭＡＬ−ｃ（ニュー
イングランゴバイオラボズ（New England Biolabs)から
得られる）はＳａｌＩとＨｉｎｄ IIIを用いる消化によ
り線状化した。このベクターはｔａｃプロモーターの制
御下のマルトース結合蛋白を含む（グアン（Guan）ら、
ジーン（Gene）６７−２１−３０（１９８７年）および
マイナ（Maina)ら、ジーン（Gene）第７４巻、３６５−
３７３頁（１９８８年））。線状化されたベクターと４
３８ｂｐの１．３Ｓ−ｂ−エンドルフィン断片を結合
し、結合混合物を用いてコンピタントな大腸菌ＣＨＳ２
６を形質転換させた。プラスミッドＤＮＡを単離し、正
しいキメラ遺伝子配向を含むプラスミッドを制限エンド
ヌクレアーゼマッピングにより確認した。得られるクロ
ーンをｐｔａｃ：ｍａｌＢ：１．３：ｅｎｄｏｒＢ３と
命名した（図３Ｂ）。１００mg／ｌアンピシリンを含む
Ｌ−ブロスにｐｔａｃ：ｍａｌＢ：１．３：ｅｎｄｏｒ
Ｂ３を有する大腸菌宿主を接種することにより、ハイブ
リッドマルトース結合蛋白−合成ｂ−エンドルフィンポ
リペプチドの高純度調製物が得られる。方法７に従って
このハイブリッドポリペプチドを含む粗蛋白抽出物が得
られる。方法８に記載されたアビジンモノマーアフィニ
ティクロマトグラフィーによりビオチンを用いて、樹脂
から精製されたハイブリッドポリペプチドを溶出するこ
とにより、高純度のマルトース結合蛋白：１．３Ｓ：ｂ
−エンドルフィン：ハイブリッドポリペプチドが得られ
る（方法８Ｂ）。ポリペプチド懸濁液を１００ｍＭ炭酸
アンモニウム緩衝液、ｐＨ７．２、を３回交換する透析
後、試料を凍結乾燥することによりビオチンが除去され
る。方法１０のパートＢに従い臭化シアン中でインキュ
ベートすることにより、１．３Ｓポリペプチドからｂ−
エンドルフィンが切断され、切断混合物のアビジンモノ
マーアフィニティクロマトグラフィーにより方法１１を
繰り返すことにより高純度のｂ−エンドルフィンが得ら
れる。方法８Ｂに記載したビオチン溶出法を繰り返すこ
とにより、このマルトース結合蛋白−１．３Ｓハイブリ
ッドポリペプチドを高純度で回収する。
【０１１８】実施例７．結合のためのポリペプチドのＮ
−末端への２つの目的のポリペプチドへの直列の融合
（１つのアミノ酸切断配列は結合のためのポリペプチド
から最初の目的のポリペプチドを分離し、第２のアミノ
酸切断配列は第２の目的のポリペプチドから最初の目的
のポリペプチドを分離する） マルトース結合蛋白とｂ−エンドルフィンを１．３Ｓポ
リペプチドに直列に融合させる。１つのアミノ酸切断配
列はマルトース結合蛋白とｂ−エンドルフィンを分離
し、もう１つのアミノ酸切断配列は１．３Ｓポリペプチ
ドとｂ−エンドルフィンを分離する。
−末端への２つの目的のポリペプチドへの直列の融合
（１つのアミノ酸切断配列は結合のためのポリペプチド
から最初の目的のポリペプチドを分離し、第２のアミノ
酸切断配列は第２の目的のポリペプチドから最初の目的
のポリペプチドを分離する） マルトース結合蛋白とｂ−エンドルフィンを１．３Ｓポ
リペプチドに直列に融合させる。１つのアミノ酸切断配
列はマルトース結合蛋白とｂ−エンドルフィンを分離
し、もう１つのアミノ酸切断配列は１．３Ｓポリペプチ
ドとｂ−エンドルフィンを分離する。
【０１１９】ｐｔａｃ１．３ｄｐをＨｉｎｃIIとＨｉｎ
ｄ IIIで消化する。３２２ｂｐ断片をアガロースゲル電
気泳動で精製する。ＢａｍＨＩ認識配列（ＣＧＧＡＴＣ
ＣＧ）をコードするリンカーをこの断片に結合させ、こ
の断片をＢａｍＨＩで消化してこの断片の５’末端にＢ
ａｍＨＩ部位を作成する。こうして作成された３３８９
ｂｐＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ III断片はアガロースゲル電
気泳動で精製される。ＤＮＡ断片ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１５をＢａｍＨＩで消化し、ｐｔａｃ１．３ｄｐから修
飾された３３８ｂｐのＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ III断片に
結合させる。この目的の４４４ｂｐ断片をアガロースゲ
ル電気泳動で精製する。ベクターｐＭＡＬ−ｃ（ニュー
イングランドバイオラボズ（New England Biolabs)、ビ
バリー（Beverly)、マサチューセッツ州）をＨｉｎｄ I
IIとＢａｍＨＩで消化し、大きい方の断片をアガロース
ゲル電気泳動で精製する。この４４４ｂｐ断片と６．１
ｋｂ断片を結合し、結合混合物を用いてコンピタントな
大腸菌ＣＳＨ２６を形質転換させる。プラスミッドＤＮ
Ａを単離し、正しい配向でキメラ遺伝子を含有するプラ
スミッドを制限エンドヌクレアーゼマッピングで確認
し、ｐｔａｃ：ｍａｌＣ：ｅｎｄｏｒＢ３：１．３ｄｐ
（図３Ｃ）と命名した。正しい組換えプラスミッドはａ
ｓｐ−ｐｒｏカルボキシル末端を有する１．３Ｓポリペ
プチドのアミノ酸１９ー１２３にａｓｐ−ｐｒｏリンカ
ーで結合したｂ−エンドルフィンに、ａｓｐ−ｐｒｏ−
ｍｅｔで融合して４２，０００ＭＷマルトース結合蛋白
よりなる融合蛋白をコードする。方法８に記載されたア
ビジンモノマーアフィニティクロマトグラフィーによ
り、ビオチンを用いて樹脂から精製されたハイブリッド
ポリペプチドを溶出することにより、高純度のマルトー
ス結合蛋白：ｂ−エンドルフィン：１．３Ｓハイブリッ
ドポリペプチドが得られる（方法８Ｂ）。ポリペプチド
懸濁液を１００ｍＭ炭酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７．
２、を３回交換する透析後、試料を凍結乾燥することに
よりビオチンが除去される。方法１０のパートＡに従い
蟻酸中でインキュベートすることにより、１．３Ｓポリ
ペプチドからｂ−エンドルフィンが切断され、切断混合
物のアビジンモノマーアフィニティクロマトグラフィー
により方法１１を繰り返すことにより、高純度のｂ−エ
ンドルフィンが得られる。方法９Ｂの方法を用いて、ビ
オチンでアンモニウムからマルトース結合蛋白：１．３
Ｓハイブリッドポリペプチドを溶出することにより、マ
ルトース結合蛋白が高純度で回収される。１００ｍＭ炭
酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７．２、を３回交換する透
析後、試料を凍結乾燥することによりビオチンからハイ
ブリッドポリペプチドが精製される。この試料を凍結乾
燥し、方法１０のパートＢに従い臭化シアン中で復元す
る。方法１１に詳述したアビジンモノマークロマトグラ
フィーを繰り返すことにより、マルトース結合蛋白が高
純度で回収される。
ｄ IIIで消化する。３２２ｂｐ断片をアガロースゲル電
気泳動で精製する。ＢａｍＨＩ認識配列（ＣＧＧＡＴＣ
ＣＧ）をコードするリンカーをこの断片に結合させ、こ
の断片をＢａｍＨＩで消化してこの断片の５’末端にＢ
ａｍＨＩ部位を作成する。こうして作成された３３８９
ｂｐＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ III断片はアガロースゲル電
気泳動で精製される。ＤＮＡ断片ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１５をＢａｍＨＩで消化し、ｐｔａｃ１．３ｄｐから修
飾された３３８ｂｐのＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ III断片に
結合させる。この目的の４４４ｂｐ断片をアガロースゲ
ル電気泳動で精製する。ベクターｐＭＡＬ−ｃ（ニュー
イングランドバイオラボズ（New England Biolabs)、ビ
バリー（Beverly)、マサチューセッツ州）をＨｉｎｄ I
IIとＢａｍＨＩで消化し、大きい方の断片をアガロース
ゲル電気泳動で精製する。この４４４ｂｐ断片と６．１
ｋｂ断片を結合し、結合混合物を用いてコンピタントな
大腸菌ＣＳＨ２６を形質転換させる。プラスミッドＤＮ
Ａを単離し、正しい配向でキメラ遺伝子を含有するプラ
スミッドを制限エンドヌクレアーゼマッピングで確認
し、ｐｔａｃ：ｍａｌＣ：ｅｎｄｏｒＢ３：１．３ｄｐ
（図３Ｃ）と命名した。正しい組換えプラスミッドはａ
ｓｐ−ｐｒｏカルボキシル末端を有する１．３Ｓポリペ
プチドのアミノ酸１９ー１２３にａｓｐ−ｐｒｏリンカ
ーで結合したｂ−エンドルフィンに、ａｓｐ−ｐｒｏ−
ｍｅｔで融合して４２，０００ＭＷマルトース結合蛋白
よりなる融合蛋白をコードする。方法８に記載されたア
ビジンモノマーアフィニティクロマトグラフィーによ
り、ビオチンを用いて樹脂から精製されたハイブリッド
ポリペプチドを溶出することにより、高純度のマルトー
ス結合蛋白：ｂ−エンドルフィン：１．３Ｓハイブリッ
ドポリペプチドが得られる（方法８Ｂ）。ポリペプチド
懸濁液を１００ｍＭ炭酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７．
２、を３回交換する透析後、試料を凍結乾燥することに
よりビオチンが除去される。方法１０のパートＡに従い
蟻酸中でインキュベートすることにより、１．３Ｓポリ
ペプチドからｂ−エンドルフィンが切断され、切断混合
物のアビジンモノマーアフィニティクロマトグラフィー
により方法１１を繰り返すことにより、高純度のｂ−エ
ンドルフィンが得られる。方法９Ｂの方法を用いて、ビ
オチンでアンモニウムからマルトース結合蛋白：１．３
Ｓハイブリッドポリペプチドを溶出することにより、マ
ルトース結合蛋白が高純度で回収される。１００ｍＭ炭
酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７．２、を３回交換する透
析後、試料を凍結乾燥することによりビオチンからハイ
ブリッドポリペプチドが精製される。この試料を凍結乾
燥し、方法１０のパートＢに従い臭化シアン中で復元す
る。方法１１に詳述したアビジンモノマークロマトグラ
フィーを繰り返すことにより、マルトース結合蛋白が高
純度で回収される。
【０１２０】実施例８．同じハイブリッドポリペプチド
中で２つの結合のためのポリペプチドのＣ−末端への２
つの目的のポリペプチドの融合 この例では、２つのハイブリッドポリペプチド中で２つ
の非隣接性のｂ−エンドルフィンポリペプチドが２つの
非隣接性の１．３Ｓポリペプチドに融合され、各１．３
Ｓポリペプチドと直接結合されるｂ−エンドルフィンと
の間に切断アミノ酸配列が存在し、融合ハイブリッドポ
リペプチド、１．３Ｓ：ａｓｐ−ｐｒｏ−ｍｅｔ：ｂ−
エンドルフィン：ａｓｐ−ｐｒｏ：１．３Ｓａｓｐ−ｐ
ｒｏ−ｍｅｔ：ｂ−エンドルフィンが産生される。
中で２つの結合のためのポリペプチドのＣ−末端への２
つの目的のポリペプチドの融合 この例では、２つのハイブリッドポリペプチド中で２つ
の非隣接性のｂ−エンドルフィンポリペプチドが２つの
非隣接性の１．３Ｓポリペプチドに融合され、各１．３
Ｓポリペプチドと直接結合されるｂ−エンドルフィンと
の間に切断アミノ酸配列が存在し、融合ハイブリッドポ
リペプチド、１．３Ｓ：ａｓｐ−ｐｒｏ−ｍｅｔ：ｂ−
エンドルフィン：ａｓｐ−ｐｒｏ：１．３Ｓａｓｐ−ｐ
ｒｏ−ｍｅｔ：ｂ−エンドルフィンが産生される。
【０１２１】ベクター１．３ｄｐ：ｅｎｄｏｒＢ３（図
２Ａ）をＨｉｎｃIIとＨｉｎｄ IIIで消化し、４３７ｂ
ｐ断片をアガロースゲル電気泳動で精製する。ＢａｍＨ
Ｉ認識配列（ＣＧＧＡＴＣＣＧ）をコードする合成リン
カー（ニューイングランドバイオラボズ（New England
Biolabs)、ビバリー（Beverly)、マサチューセッツ州）
をこの４３７ｂｐ断片に結合させる。結合後このＤＮＡ
をＢａｍＨＩで消化してＢａｍＨＩ粘性末端を作成し、
４４３ｂｐＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ III断片をアガロース
ゲル電気泳動で精製する。ｐｔａｃ１．３；ｅｎｄｏ
ｒ：ｅｎｄｏｒ（図３Ａ）をＢａｍＨＩとＨｉｎｄ III
で消化し、１つのＢａｍＨＩ部位と１つのＨｉｎｄ III
部位で消化された５．１ｋｂの線状ＤＮＡが得られる。
この５．１ｋｂ断片をアガロースゲル電気泳動で精製し
た後、４４３ｂｐ断片に結合させる。この結合混合物を
用いてコンピタントな大腸菌ＨＢ１０１を形質転換させ
る。アンピシリン耐性形質転換大腸菌からプラスミッド
ＤＮＡを単離し、正しい配向でキメラ遺伝子を含有する
プラスミッドを制限エンドヌクレアーゼマッピングで確
認する。この方法で得られた組換えプラスミッドはｐｔ
ａｃ１．３：ｅｎｄｏｒ：１．３：ｅｎｄｏｒ（図４）
と命名され、精製される各ハイブリッドポリペプチドに
つき２分子のｂ−エンドルフィンの単離を可能にし、１
回の発酵からのポリペプチドの収率を倍にするハイブリ
ッドポリペプチドをコードする。１００mg／ｌのアンピ
シリンを含有するＬ−ブロスにｐｔａｃ１．３：ｅｎｄ
ｏｒ：１．３：ｅｎｄｏｒを接種することにより、高純
度の合成ｂ−エンドルフィンが得られる。方法７に従い
１．３Ｓ：ｂ−エンドルフィン：１．３Ｓ：ｂ−エンド
ルフィンハイブリッドポリペプチドを含む粗蛋白抽出物
が得られる。方法８に記載されたアビジンモノマーアフ
ィニティクロマトグラフィーにより酢酸を用いて樹脂か
ら精製されたハイブリッドポリペプチドを溶出すること
により、高純度の１．３Ｓ：ｂ−エンドルフィン：１．
３Ｓ：ｂ−エンドルフィンポリペプチドが得られる（方
法８Ａ）。方法１０のパートＡに従い蟻酸中でインキュ
ベートすることにより、１ステップで両方の１．３Ｓポ
リペプチドからの両方のｂ−エンドルフィンポリペプチ
ドが切断され、方法１１を繰り返すことにより切断混合
物のアビジンモノマーアフィニティクロマトグラフィー
により高純度のｂ−エンドルフィンが得られる。
２Ａ）をＨｉｎｃIIとＨｉｎｄ IIIで消化し、４３７ｂ
ｐ断片をアガロースゲル電気泳動で精製する。ＢａｍＨ
Ｉ認識配列（ＣＧＧＡＴＣＣＧ）をコードする合成リン
カー（ニューイングランドバイオラボズ（New England
Biolabs)、ビバリー（Beverly)、マサチューセッツ州）
をこの４３７ｂｐ断片に結合させる。結合後このＤＮＡ
をＢａｍＨＩで消化してＢａｍＨＩ粘性末端を作成し、
４４３ｂｐＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ III断片をアガロース
ゲル電気泳動で精製する。ｐｔａｃ１．３；ｅｎｄｏ
ｒ：ｅｎｄｏｒ（図３Ａ）をＢａｍＨＩとＨｉｎｄ III
で消化し、１つのＢａｍＨＩ部位と１つのＨｉｎｄ III
部位で消化された５．１ｋｂの線状ＤＮＡが得られる。
この５．１ｋｂ断片をアガロースゲル電気泳動で精製し
た後、４４３ｂｐ断片に結合させる。この結合混合物を
用いてコンピタントな大腸菌ＨＢ１０１を形質転換させ
る。アンピシリン耐性形質転換大腸菌からプラスミッド
ＤＮＡを単離し、正しい配向でキメラ遺伝子を含有する
プラスミッドを制限エンドヌクレアーゼマッピングで確
認する。この方法で得られた組換えプラスミッドはｐｔ
ａｃ１．３：ｅｎｄｏｒ：１．３：ｅｎｄｏｒ（図４）
と命名され、精製される各ハイブリッドポリペプチドに
つき２分子のｂ−エンドルフィンの単離を可能にし、１
回の発酵からのポリペプチドの収率を倍にするハイブリ
ッドポリペプチドをコードする。１００mg／ｌのアンピ
シリンを含有するＬ−ブロスにｐｔａｃ１．３：ｅｎｄ
ｏｒ：１．３：ｅｎｄｏｒを接種することにより、高純
度の合成ｂ−エンドルフィンが得られる。方法７に従い
１．３Ｓ：ｂ−エンドルフィン：１．３Ｓ：ｂ−エンド
ルフィンハイブリッドポリペプチドを含む粗蛋白抽出物
が得られる。方法８に記載されたアビジンモノマーアフ
ィニティクロマトグラフィーにより酢酸を用いて樹脂か
ら精製されたハイブリッドポリペプチドを溶出すること
により、高純度の１．３Ｓ：ｂ−エンドルフィン：１．
３Ｓ：ｂ−エンドルフィンポリペプチドが得られる（方
法８Ａ）。方法１０のパートＡに従い蟻酸中でインキュ
ベートすることにより、１ステップで両方の１．３Ｓポ
リペプチドからの両方のｂ−エンドルフィンポリペプチ
ドが切断され、方法１１を繰り返すことにより切断混合
物のアビジンモノマーアフィニティクロマトグラフィー
により高純度のｂ−エンドルフィンが得られる。
【０１２２】本発明の請求の範囲中において「アビジ
ン」という用語はストレプトアビジンを含む。
ン」という用語はストレプトアビジンを含む。
【０１２３】本発明をいくつかの好適な態様と具体的な
例により説明したが、本発明はこれらに限定されるもの
ではなく、請求の範囲により限定されるものである。
例により説明したが、本発明はこれらに限定されるもの
ではなく、請求の範囲により限定されるものである。
【０１２４】
【配列表】 配列番号：１ Met Lys Leu Lys Val Thr Val Asn Gly Thr Ala Tyr Asp Val Asp Val Asp 1 5 10 15 Val Asp Lys Ser His Glu Asn Pro Met Gly Thr Ile Leu Phe Gly Gly Gly 20 25 30 Thr Gly Gly Ala Pro Ala Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Lys 35 40 45 50 Ala Gly Glu Gly Glu Ile pro Ala Pro Leu Ala Gly Thr Val Ser Lys Ile 55 60 65 Leu Val Lys Glu Gly Asp Thr Val Lys Ala Gly Gln Thr Val Leu Val Leu 70 75 80 85 Glu Ala Met Lys Met Glu Thr Glu Ile Asn Ala Pro Thr Asp Gly Lys Val 90 95 100 Gly Lys Val Leu Val Lys Glu Arg Asp Ala Val Gln Gly Gly Gly Gly Leu 105 110 115 Ile Lys Ile Gly 20
【０１２５】 配列番号：２ Pro Ala Pro Leu Ala Gly Thr Val Ser Lys Ile Leu Val Lys Glu Gly Asp Thr 1 5 10 15 Val Lys Ala Gly Gln Thr Val Leu Val Leu Glu Ala Met Lys Met Gln Thr Glu Ile 20 25 30 35 Asn Ala Pro Thr Asp Gly 40
【０１２６】配列番号：３
【０１２７】配列番号：４
【０１２８】配列番号：５
【０１２９】 配列番号：６ Tyr Gly Gly Phe Leu Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Ler Val Thr Leu 1 5 10 15 Phe Lys Asn Ala Ile Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu 20 25 30
【０１３０】配列番号：７
【０１３１】配列番号：８
【０１３２】配列番号：９
【０１３３】配列番号：１０
【０１３４】配列番号：１１
【０１３５】配列番号：１２
【０１３６】配列番号：１３
【０１３７】配列番号：１４
【０１３８】配列番号：１５
【０１３９】配列番号：１６
【０１４０】配列番号：１７
【０１４１】配列番号：１８
【０１４２】配列番号：１９
【０１４３】配列番号：２０
【０１４４】配列番号：２１
【図１】図１はプラスミッドｐｔａｃ１．３ｄｐの部分
制限地図。
制限地図。
【図２】図２は目的のポリペプチドが結合のためのポリ
ペプチドのＣ−末端に融合するように作成した、ハイブ
リッドポリペプチドのキメラ遺伝子作成体。
ペプチドのＣ−末端に融合するように作成した、ハイブ
リッドポリペプチドのキメラ遺伝子作成体。
【図３】図３は単一の結合のためのポリペプチドに融合
した２つ以上の目的のポリペプチドを含むハイブリッド
ポリペプチドのキメラ遺伝子。
した２つ以上の目的のポリペプチドを含むハイブリッド
ポリペプチドのキメラ遺伝子。
【図４】図４はそれぞれ非隣接性（nonconteguous)の結
合のためのポリペプチドのＣ−末端に融合している、２
つの非隣接性の目的のポリペプチドを含むハイブリッド
ポリペプチドのキメラ遺伝子作成体。
合のためのポリペプチドのＣ−末端に融合している、２
つの非隣接性の目的のポリペプチドを含むハイブリッド
ポリペプチドのキメラ遺伝子作成体。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 9284−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 7/04 8318−4Ｈ 7/44 8318−4Ｈ 15/12 8517−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/62 15/70 15/85 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡ Ｃ 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/574 Ａ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ０７Ｋ 99:00 99:62 99:64
Claims (73)
- 【請求項１】 （１）ハイブリッドポリペプチドはビオ
チン化アビジン結合性ポリペプチドよりなる、目的のポ
リペプチドがアビジンに結合するためのビオチン基の結
合のためのハイブリッドポリペプチドと、（２）アビジ
ン結合性ポリペプチドに融合した少なくとも１つの目的
のポリペプチドであって、このアビジン結合性ポリペプ
チドのＣ−末端でビオチン化アビジン結合性ポリペプチ
ドに融合した少なくとも１つの目的のポリペプチド、よ
りなる組成物 - 【請求項２】 アビジンへの結合のためのビオチン基の
結合のためおポリペプチドから、目的のポリペプチドを
切断するための配列中に１つまたはそれ以上の結合性ア
ミノ酸が存在する、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項３】 １つまたはそれ以上の結合性アミノ酸は
目的のポリペプチドと結合のためのビオチン化アビジン
結合性ポリペプチドに、ビオチン化アビジン結合性ポリ
ペプチドのＣ−末端と、目的のポリペプチドのＮ−末端
で、結合している請求項２に記載の組成物。 - 【請求項４】 １つまたはそれ以上の結合性アミノ酸
は、アスパラギン酸−プロリン；アスパラギン−グリシ
ン；メチオニン；システイン；リジン−プロリン；アル
ギニン−プロリン；リジン−アルギニン；およびイソロ
イシン−グルタミン酸−グリシン−アルギニンよりなる
群から選択される、請求項２に記載の組成物。 - 【請求項５】 結合のためのアビジン結合性ポリペプチ
ドはプロピオニバクテリウム（Propionibacterium)から
の１．３Ｓポリペプチドである、請求項１に記載の組成
物。 - 【請求項６】 アビジン結合性ポリペプチドはその中に
ビオチン結合のための認識配列を有する１．３Ｓであ
る、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項７】 結合のためのポリペプチドは、Pro Ala
Pro Leu Ala Gly Thr Val Ser Lys Ile Leu Val Lys Gl
u Gly Asp Thr Val Lys Ala Gly Gln Thr Val Leu Val
Leu Glu Ala Met Lys Met Glu Thr Glu Ile Asn Ala Pr
o Thr Asp Gly の複数よりなる群から選択される有効な
配列の組合せを含むビオチン結合のための認識配列を含
む、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項８】 アビジンはモノマー（一量体）性アビジ
ンである、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項９】 アビジンはストレプトアビジンである、
請求項１に記載の組成物。 - 【請求項１０】 アビジンはテトラマー（四量体）性ア
ビジンである、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項１１】 目的のポリペプチドは酵素である、請
求項１に記載の組成物。 - 【請求項１２】 目的のポリペプチドは抗腫瘍活性を有
する、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項１３】 目的のポリペプチドはワクチン産生に
有用な抗原である、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項１４】 目的のポリペプチドは抗原の認識のた
めのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項１５】 目的のポリペプチドは診断用試薬とし
て機能する、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項１６】 非隣接性（non-contiguous）の複数の
結合のためのポリペプチドが存在する、請求項１に記載
の組成物。 - 【請求項１７】 非隣接性の複数の目的のポリペプチド
が存在する、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項１８】 隣接性（contiguous）の複数の目的の
ポリペプチドが存在する、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項１９】 隣接性の目的のポリペプチドの間の配
列中に位置する１つまたはそれ以上の結合性アミノ酸が
存在する、請求項１８に記載の組成物。 - 【請求項２０】 少なくとも２つの結合のための異なる
ポリペプチドが存在する、請求項１６に記載の組成物。 - 【請求項２１】 複数の目的のポリペプチドは同じであ
る、請求項１７に記載の組成物。 - 【請求項２２】 複数の結合のためのポリペプチドの少
なくとも１つは、そのＣ−末端で目的のポリペプチドの
Ｎ−末端に結合しており、別の結合のためのポリペプチ
ドはそのＮ−末端で同じ目的のポリペプチドのＣ−末端
に結合している、請求項１６に記載の組成物。 - 【請求項２３】 請求項１から７と請求項１１から２２
までのいずれか１項に記載の組成物をコードする、１つ
または複数のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ発現ベクタ
ー。 - 【請求項２４】 ５’プロモーター領域、および結合の
ためのポリペプチドをコードする図１のＤＮＡ配列より
なる遺伝子を含有するＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項２５】 ５’プロモーター領域、ビオチンの結
合のためのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、およ
び目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列よりなる
遺伝子を含有するＤＮＡ発現ベクターであって、目的の
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ビオチンの結
合のためのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対し
て３’である、上記発現ベクター。 - 【請求項２６】 目的のポリペプチドを結合のためのポ
リペプチドから切断するために、配列中に１つまたはそ
れ以上の結合性アミノ酸をコードするＤＮＡ配列が存在
する、請求項２５に記載のＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項２７】 結合性アミノ酸または結合性アミノ酸
配列をコードするＤＮＡ配列は、結合のためのポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列に対して３’であり、目的
のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して５’で
ある、請求項２６に記載のＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項２８】 ＤＮＡ配列は、アスパラギン酸−プロ
リン；アスパラギン−グリシン；メチオニン；システイ
ン；リジン−プロリン；およびリジン−アルギニンより
なる群から選択される、１つまたは複数のアミノ酸をコ
ードする、請求項２６に記載のＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項２９】 ＤＮＡ配列はプロピオニバクテリウム
（Propionibacterium)からの１．３Ｓポリペプチドをコ
ードする、請求項２４に記載のＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項３０】 その中にビオチン結合のための認識配
列を有する１．３ＳポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列が存在する、請求項２５に記載のＤＮＡ発現ベクタ
ー。 - 【請求項３１】 ＤＮＡは、Pro Ala Pro Leu Ala Gly
Thr Val Ser Lys Ile Leu Val Lys Glu Gly Asp Thr Va
l Lys Ala Gly Gln Thr Val Leu Val Leu Glu Ala Met
Lys Met Glu Thr Glu Ile Asn Ala Pro Thr Asp Gly の
複数よりなる群から選択される有効な配列の組合せを含
む、ビオチンの結合のための認識配列を含む結合のため
のポリペプチドをコードする、請求項２５に記載のＤＮ
Ａ発現ベクター。 - 【請求項３２】 ビオチンの結合のためのポリペプチド
はアビジンまたはストレプトアビジンへの結合のためで
ある、請求項２５に記載のＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項３３】 ビオチンの結合のためのポリペプチド
はモノマー性アビジンへの結合のためである、請求項２
５に記載のＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項３４】 ビオチンの結合のためのポリペプチド
はテトラマー性アビジンへの結合のためである、請求項
２５に記載の組成物。 - 【請求項３５】 目的のポリペプチドのＤＮＡは酵素を
コードする、請求項２５に記載のＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項３６】 目的のポリペプチドのＤＮＡは抗腫瘍
活性を有するポリペプチドをコードする、請求項２５に
記載のＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項３７】 目的のポリペプチドのＤＮＡはワクチ
ン産生に有用な抗原である目的のポリペプチドをコード
する、請求項２５に記載のＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項３８】 目的のポリペプチドのＤＮＡは抗原の
認識のためのアミノ酸配列を有する目的のポリペプチド
をコードする、請求項２５に記載のＤＮＡ発現ベクタ
ー。 - 【請求項３９】 目的のポリペプチドのＤＮＡは診断用
試薬として機能する目的のポリペプチドをコードする、
請求項２５に記載のＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項４０】 ＤＮＡは、非隣接性の複数の結合のた
めのポリペプチドをコードする、請求項２５に記載のＤ
ＮＡ発現ベクター。 - 【請求項４１】 ＤＮＡは、非隣接性の複数の目的のポ
リペプチドをコードする、請求項２５に記載のＤＮＡ発
現ベクター。 - 【請求項４２】 ＤＮＡは、少なくとも２つの結合のた
めのポリペプチドをコードする、請求項４１に記載のＤ
ＮＡ発現ベクター。 - 【請求項４３】 ＤＮＡは、隣接性の複数の目的のポリ
ペプチドをコードする、請求項２５に記載のＤＮＡ発現
ベクター。 - 【請求項４４】 結合のためのポリペプチドから目的の
ポリペプチドを切断するための１つまたはそれ以上の結
合性アミノ酸をコードするＤＮＡ配列が配列中に存在す
る、請求項４１または４２に記載のＤＮＡ発現ベクタ
ー。 - 【請求項４５】 ＤＮＡは、同じである複数の目的のポ
リペプチドをコードする、請求項４１または４２に記載
のＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項４６】 複数の結合のためのポリペプチドの少
なくとも１つをコードするＤＮＡはその５’末端で、目
的のポリペプチドをコードするＤＮＡの３’末端に融合
（fused)しており、別の結合のためのポリペプチドをコ
ードするＤＮＡはその５’末端で、同じ目的のポリペプ
チドの３’末端に融合している、請求項４０または４１
に記載のＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項４７】 原核（procaryotic)発現系または真核
（eucaryotic）発現系で維持される請求項２４−４６の
いずれか１項に記載の任意のＤＮＡを含むＤＮＡ発現ベ
クター。 - 【請求項４８】 目的のポリペプチドの産生方法におい
て、５’プロモーター領域、アビジンへの結合のための
ビオチンの結合をコードするＤＮＡ配列、目的のポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列（ここで目的のポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列は、ビオチンの結合のため
のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して３’で
ある）、よりなる遺伝子を含有するＤＮＡ発現ベクター
を作成し、このＤＮＡ発現ベクターを原核発現系または
真核発現系に形質転換させ、この発現系から得られるハ
イブリッドポリペプチドをアビジンと接触させ、アビジ
ンの結合した目的のポリペプチドを採取することよりな
る、上記産生方法。 - 【請求項４９】 発現系は原核系である、請求項４８に
記載の方法。 - 【請求項５０】 発現系は真核系である、請求項４８に
記載の方法。 - 【請求項５１】 発現系は大腸菌（E. coli)である、請
求項４８に記載の方法。 - 【請求項５２】 発現系は昆虫細胞である、請求項４８
に記載の方法。 - 【請求項５３】 結合のためのポリペプチドから目的の
ポリペプチドを切断するステップを含む、請求項４８に
記載の方法。 - 【請求項５４】 結合のためのポリペプチドから目的の
ポリペプチドを切断するための１つまたはそれ以上の結
合性アミノ酸をコードするＤＮＡ配列が配列中に存在す
る、請求項４８に記載の方法。 - 【請求項５５】 ＤＮＡ配列は、アスパラギン酸−プロ
リン；アスパラギン−グリシン；メチオニン；システイ
ン；リジン−プロリン；アルギニン−プロリン；リジン
−アルギニン；およびイソロイシン−グルタミン酸−グ
リシン−アルギニンよりなる群から選択される、少なく
とも１つまたはそれ以上の結合性アミノ酸をコードす
る、請求項５４に記載の方法。 - 【請求項５６】 アビジンの結合した目的のポリペプチ
ドはアビジンから分離され、目的のポリペプチドが回収
される、請求項４８に記載の方法。 - 【請求項５７】 ＤＮＡは、Pro Ala Pro Leu Ala Gly
Thr Val Ser Lys Ile Leu Val Lys Glu Gly Asp Thr Va
l Lys Ala Gly Gln Thr Val Leu Val Leu Glu Ala Met
Lys Met Glu Thr Glu Ile Asn Ala Pro Thr Asp Gly の
複数よりなる群から選択される有効な配列の組合せを含
む、ビオチン結合のための認識配列の結合のためのポリ
ペプチドをコードする、請求項４８に記載の方法。 - 【請求項５８】 アビジンはモノマー性アビジンであ
る、請求項４８に記載の方法。 - 【請求項５９】 アビジンはテトラマー性アビジンであ
る、請求項４８に記載の方法。 - 【請求項６０】 アビジンはストレプトアビジンであ
る、請求項４８に記載の方法。 - 【請求項６１】 目的のポリペプチドのＤＮＡは、酵素
をコードする、請求項４８に記載の方法。 - 【請求項６２】 目的のポリペプチドのＤＮＡは、抗腫
瘍活性を有する目的のポリペプチドをコードする、請求
項４８に記載の方法。 - 【請求項６３】 目的のポリペプチドのＤＮＡは、ワク
チン産生に有用な抗原である目的のポリペプチドをコー
ドする、請求項４８に記載の方法。 - 【請求項６４】 目的のポリペプチドのＤＮＡは、抗原
の認識のためのアミノ酸配列を有する目的のポリペプチ
ドをコードする、請求項４８に記載の方法。 - 【請求項６５】 目的のポリペプチドのＤＮＡは、診断
用試薬として機能する目的のポリペプチドをコードす
る、請求項４８に記載の方法。 - 【請求項６６】 ＤＮＡは、非隣接性の複数の結合のた
めのポリペプチドをコードする、請求項４８に記載の方
法。 - 【請求項６７】 ＤＮＡは、非隣接性の複数の目的のポ
リペプチドをコードする、請求項４８に記載の方法。 - 【請求項６８】 ＤＮＡは、隣接性の複数の目的のポリ
ペプチドをコードする、請求項４８に記載の方法。 - 【請求項６９】 結合のためのポリペプチドから目的の
ポリペプチドを切断するための、１つまたはそれ以上の
結合性アミノ酸をコードするＤＮＡ配列が存在する、請
求項６７または６８に記載の方法。 - 【請求項７０】 ＤＮＡは、少なくとも２つの結合のた
めの異なるポリペプチドをコードする、請求項４８に記
載の方法。 - 【請求項７１】 ＤＮＡは、同じである複数の目的のポ
リペプチドをコードする、請求項４８に記載の方法。 - 【請求項７２】 請求項４８に記載の方法において、結
合のためのポリペプチドをコードするＤＮＡはその５’
末端で、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡの３’
末端に融合しており、第１の結合のためのポリペプチド
と同じであるかまたは異なる別の結合のためのポリペプ
チドをコードする第２のＤＮＡ配列が存在し、その５’
末端で同じ目的のポリペプチドの３’末端に融合してい
る、上記方法。 - 【請求項７３】 発現系の形質転換されたプラスミッド
は、化学的に安定な非加水分解性結合基を介して、化学
的に不活性の固体の、水不溶性および溶媒不溶性基質に
共有結合したアビジンと接触される、請求項４８に記載
の方法。
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