PT1454138E

PT1454138E - Imunocitoquinas com seletividade modulada

Info

Publication number: PT1454138E
Application number: PT02792325T
Authority: PT
Inventors: Stephen D Gillies
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2001-12-04
Filing date: 2002-12-04
Publication date: 2012-03-28
Also published as: MXPA04005266A; US7462350B2; ZA200405247B; AU2002357784B2; AU2002357784A1; US20070036752A1; JP4795640B2; PL369741A1; EP2354791A1; BR0214650A; PL206975B1; CA2469151C; CA2469151A1; EP1454138A2; EP1454138A4; US20030166163A1; WO2003048334A3; WO2003048334A2; ATE542137T1; KR100988180B1

Description

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DESCRIÇÃO "IMUNOCITOQUINAS COM SELETIVIDADE MODULADA"

Dominio da Invenção A presente invenção refere-se genericamente a proteínas de fusão contendo uma citoquina e a métodos para aumentar a eficácia terapêutica dessas proteínas de fusão. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a proteínas de fusão de citoquinas que exibem uma semivida em circulação mais prolongada no corpo de um paciente do que a correspondente citoquina de ocorrência natural e que têm propriedades terapêuticas melhoradas. Em particular, a invenção refere-se a proteínas de fusão de IL2 com características terapêuticas melhoradas.

Antecedentes A interleuqina-2 (IL-2) é uma citoquina potente cuja ação no sistema imunológico consiste em gerar principalmente uma resposta imunológica mediada por células. Nas condições apropriadas, a IL-2 é produzida localmente em concentrações elevadas perto do sítio de um antigénio de modo a fornecer os sinais coestimuladores necessários para a geração de uma resposta imunológica ao antigénio. Dado o seu papel no crescimento e diferenciação de células T, a IL-2 tem sido um candidato em abordagens imunoterapêuticas ao tratamento de tumores. Para além de estimular células T, foi mostrado que a IL-2 também estimula células B, células NK, células assassinas ativadas por linfoquinas (LAK), monócitos, macrófagos e células dendríticas. A IL-2 é um agente terapêutico aprovado para o tratamento de carcinoma renal metastático e melanoma metastático, mas 2 a sua utilização está restringida devido a efeitos secundários tóxicos graves, que incluem febre, náuseas, extravasamento vascular e hipotensão. Entre os vários efeitos tóxicos observados com a administração de IL-2, o efeito tóxico que é menos desejável e que se crê interferir substancialmente na terapia de IL-2 é a síndroma do extravasamento vascular (VLS) e as complicações a ela associadas.

Em consequência, continua a ser necessário na área aumentar adicionalmente a utilidade terapêutica de proteínas IL-2.

Resumo da Invenção A presente invenção baseia-se, em parte, na identificação de mutações na fração IL-2 de uma proteína de fusão de IL-2 para aumentar a dose máxima tolerada da proteína relativamente à dose de eficácia máxima para essa proteína quando administrada a um paciente. Proteínas de fusão preferidas são capazes de se ligar, por interações distintas, a mais do que uma espécie de recetores expressos na mesma célula no corpo de um paciente. Proteínas de fusão de citoquinas preferidas incluem uma citoquina que é capaz de se ligar a mais do que um tipo de complexos de recetores de citoquinas e a mais do que um tipo de células. A invenção também proporciona métodos para identificar variantes particulares de proteínas de fusão de citoquinas com propriedades úteis. A presente invenção proporciona proteínas de fusão compreendendo uma fração de domínio de anticorpo fundida a uma fração de IL-2 mutante, em que a proteína de fusão exibe maior seletividade do que uma proteína de referência incluindo a fração não de IL-2 fundida a uma fração de 3 domínio de anticorpo, e em que a seletividade é medida na forma de uma razão de ativação de células que expressam o recetor IL-2Roí3y relativamente à ativação de células que expressam o recetor IL-2R^y. A fração IL-2 mutante das proteínas de fusão inclui uma mutação na proteína IL-2 humana madura. Numa forma de realização, proteínas de fusão de acordo com a invenção incluem uma substituição de aminoácidos numa ou mais posições de aminoácidos na fração IL-2. Ainda noutra forma de realização, proteínas de fusão da invenção incluem modificações de um ou mais aminoácidos na fração IL-2 das proteínas de fusão.

Mutações realizadas nas proteínas de fusão da invenção alteram a seletividade das proteínas de fusão relativamente a uma proteína de fusão de referência, em que a seletividade é medida na forma de uma razão de ativação de células que expressam o recetor IL-2Ro^y relativamente à ativação de células que expressam o recetor ΙΝ-2Κβγ. Mutações realizadas nas proteínas de fusão também podem originar um efeito diferencial na afinidade da proteína de fusão para o recetor IL-2RPy relativamente à afinidade da proteína de fusão para o recetor IL-2Ro^y. Mutações ou alterações preferidas reduzem a ativação, por uma proteína de fusão, de células que expressam o recetor ΙΝ-2Νβγ relativamente à ativação, pela proteína de fusão, de células que expressam o recetor IL-2Ro^y.

Proteínas de fusão preferidas da invenção exibem geralmente um efeito diferencial que é maior do que cerca de 2 vezes. Num aspeto, o efeito diferencial é medido pela resposta proliferativa de células ou linhas de células cujo 4 crescimento depende da IL-2. Esta resposta à proteína de fusão é expressa na forma de um valor ED50, que é obtido representando graficamente uma curva de resposta à dose e determinando a concentração de proteína que origina uma resposta semimáxima. A razão entre os valores ED50 obtidos para células que expressam o recetor IL-2R^y e células que expressam o recetor IL-2RapY para uma proteína de fusão da invenção, relativamente à razão de valores ED50 para uma proteína de fusão de referência, dá uma medida do efeito diferencial para a proteína de fusão. A seletividade de proteínas de fusão da invenção pode ser medida contra uma proteína de fusão de referência compreendendo a mesma fração de domínio de anticorpo da proteína de fusão fundida a uma fração de IL-2 não mutante. Numa forma de realização preferida, um efeito diferencial medido para as proteínas de fusão da invenção, como descrito acima, situa-se entre cerca de 5 vezes e cerca de 10 vezes. Preferivelmente, o efeito diferencial exibido pelas proteínas de fusão da invenção situa-se entre cerca de 10 vezes e cerca de 1000 vezes.

Numa forma de realização preferida alternativa, a seletividade da proteína de fusão é comparada com a seletividade de uma proteína de fusão de referência que compreende a mesma fração não IL-2 tal como na proteína de fusão fundida a uma fração IL-2 incluindo IL-2 humana madura com uma substituição de aminoácidos na posição 88 que altera uma asparagina numa arginina (N88R). Proteínas de fusão da invenção que têm um índice terapêutico melhorado incluem proteínas de fusão com uma seletividade próxima da de N88R mas situada entre cerca de 0,1% e cerca de 100% da seletividade de uma proteína de fusão de 5 referência com a substituição de aminoácidos N88R. Noutra forma de realização, proteínas de fusão da invenção têm uma seletividade situada entre cerca de 0,1% e cerca de 30% da seletividade de uma proteína de fusão de referência com a substituição de aminoácidos N88R na fração IL-2. Proteínas de fusão da invenção também incluem proteínas de fusão que têm uma seletividade situada entre cerca de 1% e cerca de 20% da seletividade da proteína de fusão de referência com a substituição de aminoácidos N88R na fração IL-2. A seletividade de proteínas de fusão da invenção também pode situar-se entre cerca de 2% e cerca de 10% da seletividade da proteína de fusão de referência incluindo a substituição de aminoácidos N88R na fração IL-2 humana madura.

Proteínas de fusão da invenção têm uma semivida no soro que é mais prolongada do que a semivida no soro da proteína IL-2 humana madura. A semivida prolongada no soro de proteínas de fusão da invenção pode ser atribuída à fração de domínio de anticorpo da proteína de fusão. Numa forma de realização, a fração de domínio de anticorpo de uma proteína de fusão da invenção inclui, por exemplo, variantes do domínio de anticorpo KS-1/4, variantes do domínio de anticorpo NHS76 e variantes do domínio de anticorpo 14.18. O domínio de anticorpo também pode ser selecionado de uma variedade de outros anticorpos, por exemplo, anticorpos contra vários antigénios tumorais e virais.

Numa forma de realização preferida, um efeito diferencial medido para as proteínas de fusão da invenção, como descrito acima, situa-se entre cerca de 5 vezes e cerca de 10 vezes. Preferivelmente, o efeito diferencial exibido 6 pelas proteínas de fusão da invenção situa-se entre cerca de 10 vezes e cerca de 1000 vezes. É útil efetuar mutações de aminoácidos na fração IL-2 de proteínas de fusão da invenção que originem um efeito diferencial que é 2 vezes ou maior. Diferentes mutações de aminoácidos na fração IL-2 originam um efeito diferencial maior do que cerca de 2 vezes, entre cerca de 5 vezes e cerca de 10 vezes, ou preferivelmente entre cerca de 10 vezes e cerca de 1000 vezes.

Na forma de realização preferida da invenção, a mutação de aminoácidos é uma substituição do ácido aspártico correspondente à posição 20 da fração IL-2 humana madura por uma treonina (D20T). Noutra forma de realização, é útil efetuar a mutação de mais do que uma posição de aminoácidos na fração IL-2. Outras mutações adequadas de acordo com a invenção estão relacionadas com os aminoácidos nas posições K8, Q13, E15, Hl 6, L19, Q22, M23, N26, H79, L80, R81, D84, N88, 192 e E95 da proteína IL-2 humana madura. Posições de aminoácidos úteis adicionais que podem ser mutadas são L25, N31, L40, M46, K48, K49, D109, E110, A112, T113, V115, E116, N119, R120, 1122, T123, Q126, S127, S130 e T131 da proteína IL-2 humana madura. Posições de aminoácidos preferidas que são mutadas em proteínas de fusão da invenção incluem D20, N88 e Q126. Se N88 e Q126 forem adicionalmente mutados, o aminoácido asparagina na posição 88 é substituído por uma arginina (N88R), e a glutamina na posição 126 é substituída por um ácido aspártico (Q126D).

As várias substituições de aminoácidos resultam numa seletividade da atividade das proteínas de fusão da invenção para células contendo o recetor IL-2Roí3y relativamente a células contendo o recetor ΙΗ-2Ρβγ, o que 7 pode ser refletido na afinidade da proteína de fusão para um recetor IL-2R^y relativamente à afinidade da proteína de fusão para um recetor IL-2RapY.

Proteínas de fusão com mutações numa ou mais posições de aminoácidos descritas acima têm um efeito diferencial que é maior do que cerca de 2 vezes. Preferivelmente, o efeito diferencial situa-se entre cerca de 5 vezes e cerca de 10 vezes e, mais preferivelmente, entre cerca de 10 vezes e cerca de 1000 vezes.

Para além da mutação de aminoácidos na fração IL-2, aminoácidos na fração não IL-2 também podem ser mutados. Numa forma de realização preferida, a fração não IL-2 é um domínio de anticorpo. O domínio de anticorpo pode ser selecionado de uma variedade de diferentes anticorpos de imunoglobulinas (Ig), preferivelmente anticorpos IgG, incluindo, por exemplo, domínios de anticorpos IgG gama 1, IgG gama 2 e IgG gama 4, ou qualquer combinação destes domínios de anticorpos. Como usados aqui, é entendido que os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" significam (i) um anticorpo intacto (por exemplo, um anticorpo monoclonal ou anticorpo policlonal), (ii) respetivas porções de ligação de antigénios, incluindo, por exemplo, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento (Fab')2/ um fragmento Fv, um sítio de ligação de anticorpo de cadeia simples, um sFv, (iii) anticorpos biespecíficos e respetivas porções de ligação de antigénios, e (iv) anticorpos multiespecíficos e respetivas porções de ligação de antigénios. Em proteínas da invenção, uma região Fc de imunoglobulina pode incluir pelo menos uma região pesada constante de imunoglobulina, por exemplo, um domínio pesado constante 2 (CH2) de imunoglobulina, um domínio pesado constante 3 (CH3) de imunoglobulina e, dependendo do tipo de imunoglobulina usado para gerar a região Fc, opcionalmente um domínio pesado constante 4 (CH4) de imunoglobulina, ou uma combinação dos acima. Em formas de realização particulares, a região Fc de imunoglobulina pode estar desprovida de um domínio pesado constante 1 (CHI) de imunoglobulina. Apesar de as regiões Fc de imunoglobulina poderem basear-se em qualquer classe de imunoglobulinas, por exemplo, IgA, IgD, IgG e IgM, são preferidas regiões Fc de imunoglobulina baseadas em IgG. Uma fração de anticorpo incluída numa proteína de fusão da invenção é preferivelmente humana, mas pode ser derivada de um anticorpo murino, ou qualquer outra imunoglobulina de mamífero ou não de mamífero. É contemplado que uma região Fc utilizada numa proteína de fusão da invenção pode ser adaptada à aplicação específica da molécula. Numa forma de realização, a região Fc é derivada de um isotipo de imunoglobulina γΐ, ou uma sua variante. Noutra forma de realização, a região Fc é derivada de um isotipo de imunoglobulina γ2, ou uma sua variante. Noutras formas de realização, a região Fc pode ser derivada de um isotipo de imunoglobulina γ3, ou uma sua variante. A região Fc pode compreender uma região conetora que é derivada de um isotipo de imunoglobulina diferente da própria região Fc. Por exemplo, a região Fc pode ser derivada de um isotipo de imunoglobulina γ2 e incluir uma região conetora derivada de isotipo de imunoglobulina γΐ, ou uma sua variante. Ainda noutra forma de realização preferida da invenção, a região Fc é derivada de um isotipo de imunoglobulina γ4. São particularmente preferidos isotipos de imunoglobulina γ4 que foram modificados de modo a conterem uma região conetora derivada de um isotipo de imunoglobulina γΐ, ou uma sua variante. 9

Numa forma de realização, proteínas de fusão da invenção compreendem mutações na fração Ig. Uma mutação útil é uma mutação na sequência de IgG gama 1 QTOSTYR (SEQ ID NO: 1), alterando um N num Q; uma mutação particularmente útil é uma mutação na sequência gama 2 ou 4 QFNST (SEQ ID NO: 2), alterando o motivo dipeptídico FN em AQ. A invenção também apresenta construções de DNA que codificam várias proteínas de fusão da invenção. As proteínas de fusão da invenção são particularmente úteis para o tratamento de cancro, infeções virais e perturbações imunológicas.

Estes e outros objetivos, juntamente com vantagens e características da invenção aqui divulgada, tornar-se-ão mais claros a partir da descrição, figuras e reivindicações que se seguem.

Descrição Breve das Figuras A Figura 1 ilustra a fusão de uma citoquina a uma segunda fração proteica que altera as características de ligação naturais da citoquina. A Figura IA ilustra o parceiro de fusão de IL-2 na forma de uma molécula dimérica, como um anticorpo ou a porção Fc de uma proteína de fusão contendo Fc, e consequentemente duas moléculas de IL-2 são conduzidas para a superfície celular quando a fração IL-2 da proteína de fusão interage com o seu recetor. A Figura 1B ilustra um segundo mecanismo que produz o mesmo efeito. A Figura 2 mostra perfis farmacocinéticos típicos da proteína de fusão imunocitoquina huKS-IL2 (representada por triângulos) e duas variantes, huKS-ala-IL2 (representada por círculos) e huKS-ala-IL2(N88R) (representada por estrelas) . 10

Descrição Pormenorizada da Invenção A invenção proporciona métodos e composições que aumentam o índice terapêutico de proteínas de fusão de IL-2 e imunocitoquinas de IL-2 em particular. De acordo com a invenção, o índice terapêutico de uma molécula terapêutica é uma medida da razão da dose máxima tolerada de uma molécula dividida pela dose de eficácia máxima para essa molécula. A invenção inclui variantes melhoradas de imunocitoquinas IL-2 que exibem uma semivida em circulação significativamente mais longa em comparação com a IL-2 livre. A invenção também proporciona proteínas de fusão de IL-2, e em particular imunocitoquinas IL-2, que exibem uma resposta de IL-2 seletiva, refletida por ativação reduzida de células, com várias funções efetoras, pelas proteínas de fusão da invenção, que é uma causa principal dos efeitos tóxicos da IL-2. Adicionalmente, a invenção proporciona proteínas de fusão de IL-2 com atividade melhorada. Uma proteína de fusão de IL-2 da invenção inclui alterações numa ou mais posições de aminoácidos que alteram a afinidade relativa da proteína de fusão de IL-2 para diferentes recetores da IL-2, conduzindo a propriedades biológicas alteradas da proteína de fusão de IL-2. A invenção é útil para reduzir ou minimizar qualquer toxicidade associada a terapia com IL-2. Independentemente do mecanismo subjacente de qualquer toxicidade de IL-2 determinada, como VLS, a toxicidade resulta, em parte, do facto de a IL-2 ser administrada de modo intravenoso e, assim, atuar de modo sistémico no corpo, mesmo que o efeito da IL-2 seja desejado num sítio específico. Este problema é exacerbado pelo facto de uma administração sistémica de IL-2 requerer uma dose muito mais elevada do que a requerida por uma administração localizada, o que, por sua vez, pode 11 promover toxicidades que não seriam observadas a doses mais baixas. A invenção proporciona proteínas de fusão de IL-2 com toxicidade reduzida. A invenção também proporciona métodos de preparação de proteínas de fusão de IL-2 com toxicidade reduzida.

Em geral, a invenção é útil para proteínas de fusão incluindo uma fração IL-2 fundida a uma fração de domínio de anticorpo. De acordo com a invenção, uma fração de domínio de anticorpo pode ser uma proteína sintética ou natural ou uma respetiva porção ou variante (incluindo variantes de espécies, alélicas e mutantes). Frações preferidas de domínio de anticorpo incluem Fc. De acordo com a invenção, uma fração IL-2 pode ser uma molécula de IL-2 natural, ou uma respetiva porção ou variante (incluindo variantes de espécies, alélicas e mutantes), que retém pelo menos uma atividade ou função da IL-2 (uma fração de IL-2 pode ser uma IL-2 que é modificada de modo a ter uma afinidade de ligação diferente para recetores da IL-2 de acordo com a invenção).

De acordo com a invenção, células respondem à IL-2 através de recetores específicos da superfície celular (IL-2R), que existem em duas formas. 0 recetor de afinidade elevada é heterotrimérico, consistindo em subunidades α, β e γ; o recetor de afinidade intermédia é heterodimérico, consistindo em subunidades β e γ. As constantes de ligação da IL-2 para estas duas formas de IL-2R diferem em duas ordens de grandeza. A transdução do sinal é mediada, no lado citoplasmático do recetor, por interações no complexo βγ. Diferentes tipos de células expressam as subunidades a, β e γ em quantidades variáveis. Por exemplo, células T ativadas expressam todas as subunidades, formando o IL- 12 2Καβγ de elevada afinidade, ao passo que células T em repouso maduras e células NK expressam as subunidades β e Y, dando origem ao IL-2R^y de afinidade intermédia. Assim, para estimulação, células requerem diferentes níveis de exposição à IL-2 e, inversamente, por regulação da atividade da IL-2 num contexto celular específico, a natureza de uma resposta imunológica pode ser controlada. Métodos e composições da invenção são particularmente úteis no contexto de proteínas de fusão de IL-2, como imunocitoquinas contendo IL-2. De acordo com a invenção, imunocitoquinas contendo IL-2 são moléculas sintéticas para as quais foi mostrado que aumentam significativamente a eficácia da terapia com IL-2 por direcionamento direto da IL-2 para um microambiente tumoral. Imunocitoquinas são proteínas de fusão que consistem numa fração de anticorpo e uma fração de citoquina, como uma fração de IL-2. De acordo com a invenção, uma fração de anticorpo pode ser um anticorpo ou imunoglobulina completo ou uma respetiva porção ou variante (incluindo variantes de espécies, alélicas e mutantes) que tem uma função biológica tal como uma afinidade de ligação específica para antigénios. De modo semelhante, uma fração de citoquina da invenção pode ser uma citoquina natural ou uma respetiva porção ou variante (incluindo variantes de espécies, alélicas e mutantes) que retém pelo menos alguma atividade de citoquina. Os benefícios de uma terapia com imunocitoquinas são claros. Por exemplo, uma fração de anticorpo de uma imunocitoquina reconhece um epítopo específico de tumor e leva ao direcionamento da molécula de imunocitoquina para o sítio tumoral. Em consequência, concentrações elevadas de IL-2 podem ser distribuídas no microambiente tumoral, desse modo originando ativação e proliferação de uma variedade de 13 células efetoras imunológicas mencionadas acima, utilizando uma dose muito menor da imunocitoquina do que seria requerido para a IL-2 livre. Adicionalmente, a semivida em circulação aumentada de uma imunocitoquina, em comparação com a IL-2 livre, contribui para a eficácia da imunocitoquina. E finalmente, as funções efetoras naturais de um anticorpo também podem ser exploradas, por exemplo, por ativação da citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) em células NK contendo FcyRIII.

Uma imunocitoquina de IL-2 tem uma eficácia maior relativamente à IL-2 livre. No entanto, algumas caracteristicas de imunocitoquinas de IL-2 podem agravar efeitos secundários potenciais da molécula de IL-2. Devido à semivida em circulação significativamente mais prolongada de imunocitoquinas de IL-2 na corrente sanguínea relativamente à IL-2 livre, a probabilidade de a IL-2, ou de outras porções da molécula da proteína de fusão, ativar componentes geralmente presentes na rede vascular é aumentada. A mesma preocupação aplica-se a outras proteínas de fusão que contêm IL-2 fundida a outra fração, como Fc ou albumina, originando uma semivida estendida da IL-2 em circulação. A invenção proporciona proteínas de fusão de IL-2 alteradas, como IL-2 fundida a um anticorpo intacto ou a uma porção de um anticorpo, ou a albumina, com toxicidade reduzida em comparação com formas inalteradas dessas proteínas de fusão. A invenção também proporciona proteínas de fusão com uma ou mais alterações nas frações IL-2 e/ou não IL-2 que alteram a atividade relativa da proteína de fusão em células que expressam as subunidades α, β e γ de recetores da IL-2 em comparação com células que expressam 14 as subunidades β e γ de recetores da IL-2. A invenção também proporciona proteínas de fusão alteradas contendo IL-2 que exibem uma afinidade alterada para a subunidade a, β ou γ do recetor da IL-2 em comparação com formas inalteradas dessas proteínas de fusão.

Algumas proteínas de fusão de anticorpo contendo IL-2 exibem atividade de IL-2 que está quantitativamente alterada relativamente à IL -2 livre, mas que não é qualitativamente ótima para aplicações terapêuticas. A invenção proporciona formas modificadas de proteínas de fusão anticorpo-IL2 nas quais a IL-1 ou o anticorpo, ou ambas as frações, são alteradas para melhorar qualitativamente a atividade da IL-2 para uma dada aplicação. A invenção também proporciona estratégias para determinar os tipos de modificações que são particularmente úteis na conceção de proteínas de fusão modificadas para o tratamento de doenças. A Figura 1 ilustra possíveis mecanismos pelos quais uma proteína de fusão pode ligar-se a uma superfície celular, de modo que são alteradas as propriedades de ligação a recetores de uma fração da proteína de fusão. Por exemplo, a Figura IA ilustra o parceiro de fusão da IL-2 na forma de uma molécula dimérica. Isto aumenta a probabilidade de a segunda molécula de IL-2 interagir com o seu recetor, por exemplo, diminuindo a velocidade de dissociação, que conduz a um aumento global da ligação. A Figura 1B ilustra um segundo mecanismo que produz o mesmo efeito. Em células que contêm um recetor para a IL-2 e um recetor para o parceiro de fusão de IL-2 da proteína de fusão (por exemplo, um 15 recetor Fc para a parte Fc de uma fração Ig) , o recetor para o parceiro de fusão (por exemplo, o recetor Fc) pode engrenar a proteína de fusão e fixá-la na superfície celular, onde agora tem probabilidade aumentada de se ligar a um recetor da IL-2.

Foi recentemente completado um ensaio de Fase I/II de uma proteína de fusão anticorpo-citoquina, denominada huKS-IL2. A huKS-IL2 é uma proteína de fusão que consiste no anticorpo KS-1/4 fundido à citoquina, interleuquina-2. 0 KS-1/4 reconhece o antigénio de superfície de células tumorais EpCAM (molécula de adesão de células epiteliais) e tem o efeito de concentrar IL-2 no sítio tumoral. No decurso deste ensaio mediram-se respostas de pacientes ao tratamento. Um paciente que exibiu resposta significativa à terapia sentiu uma resposta clínica parcial, seguida de estabilização da doença e redução da utilização de medicação para a dor. 0 paciente já tinha recebido tratamentos prévios comuns que tinham falhado. A vida do paciente foi significativamente estendida para além do esperado na ausência desse tratamento.

Surpreendentemente, em resultado de quimioterapia prévia, a população de células T deste paciente havia sido essencialmente suprimida. Este paciente tinha contagens de células T muito mais baixas do que todos os outros pacientes do ensaio. Uma vez que é conhecido que a IL-2 ativa células T e que é conhecido, por exemplo, que aumenta a citotoxicidade de células T CD8(+) para células tumorais, a resposta forte deste paciente aparentemente sem células T foi particularmente inesperada. Esta observação desencadeou estudos adicionais de novas proteínas de fusão anticorpo-IL-2 nas quais a fração de IL-2 poderá exibir 16 especificidade alterada para células, conduzindo a uma melhoria do índice terapêutico de proteínas de fusão de IL-2. A partir da estrutura cristalina da IL-2, comparações de sequências com citoquinas relacionadas e estudos de mutagénese dirigida a sítios, têm-se feito muitos progressos na elucidação dos aminoácidos da IL-2 que entram em contacto com diferentes subunidades de recetores da IL-2 e suas consequências na atividade biológica. Por exemplo, o resíduo D20, conservado na IL-2 ao longo de espécies de mamíferos, é um resíduo crítico para a ligação da subunidade β do recetor da IL-2, e várias substituições nesta posição têm efeitos distintos. Por exemplo, a variante IL-2(D20K) não consegue ligar-se a nenhum complexo de IL-2R e é geralmente inativa, ao passo que as variantes IL-2(D20E) ou IL-2(D20T) retêm a sua atividade biológica. As posições de aminoácidos R38 e F42 são críticas para a ligação da subunidade α e, enquanto mutações nestes sítios diminuem a interação da IL-2 com o recetor de elevada afinidade IL-2Ro^y, ainda se liga ao recetor de afinidade intermédia IL-2Rβγ e, deste modo, alguma bioatividade é retida. N88 é outro resíduo que está envolvido na mediação de interações com a subunidade β e, enquanto a variante IL-2(N88R) tem afinidade grandemente reduzida para o recetor de afinidade intermédia, a sua afinidade para o recetor de elevada afinidade permanece essencialmente inalterada. Em consequência, o mutante N88R da IL-2 ainda consegue ativar células T. A afinidade de ligação de proteínas de fusão da invenção para diferentes recetores pode ser determinada por alguns 17 métodos conhecidos na área, incluindo, por exemplo, um radioimunoensaio.

Assim, é possível perturbar a estrutura da IL-2, de modo a que exiba maior afinidade para um complexo de recetor de IL-2 em comparação com outro complexo recetor de IL-2, por mutação de um aminoácido específico que contacta uma das subunidades dos recetores, ou por alteração de uma combinação de resíduos de aminoácidos. Em consequência, a molécula exibe maior atividade num tipo de células versus outro. De acordo com a invenção, é possível manipular a estrutura da IL-2 no contexto de uma proteína de fusão Ig-IL2 para se obter o efeito desejado. Além disso, nalguns casos, a proteína de fusão variante Ig-IL2 possui características biológicas diferentes em comparação com a correspondente proteína mutante IL-2 livre.

Também é possível, de acordo com a invenção, manipular a fração de IL-2 numa proteína de fusão de modo que exiba uma afinidade alterada para uma ou mais das subunidades de recetores da IL-2 (α, β ou γ) e origine uma diminuição global da bioatividade da proteína de fusão. Essas variantes conseguem ativar células que respondem à IL-2, mas requerem uma concentração mais elevada do que a IL-2 livre. Em conformidade, quando proteínas de fusão de IL-2 são concentradas num sítio alvo desejado, por exemplo, por uma fração de direcionamento, estas variantes têm um índice terapêutico melhorado. A subunidade α do recetor IL-2R aparenta desempenhar uma função de fixação: este recetor de baixa afinidade liga-se à IL-2 e mantém a IL-2 próximo da superfície celular, de modo que a concentração efetiva na vizinhança de subunidades dos recetores IL-2R^ e IL-2Ry da superfície 18 celular é aumentada. Em conjunto, a subunidade α e as subunidades βγ do recetor da IL-2 criam o complexo IL-2R de elevada afinidade. A invenção baseia-se, em parte, no reconhecimento de que proteínas de fusão de IL-2 podem participar em múltiplas e distintas interações com recetores na superfície celular. Por exemplo, no caso de proteínas de fusão contendo uma fração de anticorpo, a própria fração de anticorpo pode promover a ligação da proteína de fusão à superfície celular e, além disso, a IL-2 pode estar presente em múltiplas cópias na proteína de fusão. Em resultado, a IL-2 pode ser fixada a uma célula que expressa apenas as subunidades β e γ de IL-2R, e pode ter uma capacidade aumentada para ativar essa célula.

Por exemplo, uma imunoglobulina (Ig) dimérica fundida a IL-2 possui duas cópias da IL-2, de modo que a ligação de uma fração IL-2 ao seu recetor aumenta a probabilidade de uma interação da segunda fração IL-2 com uma molécula recetora na mesma superfície celular. 0 diagrama da Figura IA representa uma configuração possível de uma proteína de fusão Ig-IL2 numa superfície celular. A invenção proporciona proteínas de fusão Ig-IL2 nas quais a fração IL-2 é alterada para reduzir a ligação a um recetor IL-2RpY.

Um segundo mecanismo pelo qual proteínas de fusão Ig-IL2 podem ter ligação alterada à superfície de certas células imunológicas consiste no facto de o recetor Fc numa superfície celular poder ligar-se à parte Fc de uma fração Ig e, desse modo, fixar a IL-2 na superfície de células que possuem um recetor Fc e um recetor de IL-2 (Figura 1B) . Essas células incluem células NK, células B e macrófagos. A invenção proporciona proteínas de fusão Ig-IL2 nas quais a 19 fração Ig é alterada para reduzir a ligação a um recetor Fc. A invenção também proporciona proteínas de fusão Ig-IL2 nas quais a fração Ig e a fração IL-2 incorporam alterações da natureza descrita acima.

Outra característica da invenção consiste em variantes de proteínas de fusão de IL-2, como fusões Ig-IL2 ou fusões de IL-2 contendo Fc, com perfis de toxicidade superiores. Por exemplo, uma proteína de fusão Ig-IL2 contendo a mutação D20T exibe toxicidade reduzida em animais, como ratinhos, em comparação com as correspondentes proteínas de fusão Ig-IL2 com D na posição 20. Noutro exemplo, uma proteína de fusão Ig-IL2 contendo a mutação N88R ou a combinação de mutações L85T, I86T, N88R na fração IL-2 exibe toxicidade reduzida em animais, como ratinhos, em comparação com as correspondentes proteínas de fusão Ig-IL2 com N na posição 88. Adicionalmente, uma proteína de fusão anticorpo-IL2 contendo a mutação D20T ou a mutação N88R na fração IL-2 exibe potência comparável à correspondente proteína de fusão anticorpo-IL2 paterna quando utilizada para tratar um tumor que expressa um antigénio alvo do anticorpo.

As propriedades da variante D20T de proteínas de fusão Ig-IL2 são particularmente surpreendentes à luz das propriedades relatadas da mutação D20T na proteína IL-2 livre. Especificamente, a mutação D20T na proteína IL-2 livre não exibe uma diferença, relativamente à proteína IL-2 de tipo selvagem, da sua atividade para células contendo IL-2Rc^y ou células contendo ^-2Αβγ (Shanafelt et al., PCT WO99/60128). No entanto, uma proteína de fusão Ig-IL2 contendo a mutação D20T tem uma potência drasticamente reduzida de ativação de células contendo IL-2R3y, mas tem 20 uma potência essencialmente normal de ativação de células contendo IL-2R<^y.

Em conformidade, a mutação de vários aminoácidos na fração IL-2 de uma proteína de fusão Ig-IL2 conduz a toxicidade reduzida, mas tem um efeito relativamente pequeno na potência da proteína de fusão no tratamento de várias doenças. Por exemplo, a extensão da possibilidade de alteração da afinidade de uma variante de proteína de fusão de IL-2 para os seus recetores é uma função de quão bem a proteína de fusão particular fica concentrada no seu sítio alvo pretendido. É particularmente útil efetuar a mutação de um ou mais dos seguintes aminoácidos na fração IL-2: Lys8, Glnl3, Glul5, Hisl6, Leul9, Asp20, Gln22, Met23, Asn26, Arg38, Phe42, Lys43, Thr51, His79, Leu80, Arg81, Asp84, Asn 88, Vai 91, Ile92 e Glu95. Também é útil efetuar a mutação de um ou mais dos seguintes aminoácidos na fração IL-2: Leu25, Asn31, Leu40, Met46, Lys48, Lys49, Aspl09, GlullO, Alall2, Thrll3, Valll5, Glull6, Asnll9, Argl20, Ilel22, Thrl23, Gin 126, Serl27, Serl30 e Thrl31.

Esta invenção divulga formas de uma fração Ig fundida a IL-2, por exemplo, fusões anticorpo-IL2, como huKS-IL2 ou dl-NHS76-IL2, nas quais alterações na fração Ig fundida a IL-2 afetam as propriedades de ligação da proteína de fusão ao complexo IL-2R. Estas alterações podem consistir em substituições de aminoácidos na sequência de aminoácidos da cadeia pesada, ou modificações químicas. Substituições de aminoácidos úteis incluem aquelas que afetam a glicosilação da proteína de fusão ou que afetam diretamente a interação com um recetor Fc. Uma substituição particularmente útil pode ser tal que inibe a glicosilação normalmente presente na posição N297 (nomenclatura da UE) da cadeia pesada de 21

IgG. Modificações químicas e bioquímicas incluem PEGuilação da molécula ou tratamento com N-glicanase para remover cadeias glicosilo N-ligadas. Sem pretender ficar restringido pela teoria, é possível considerar que alterações específicas na porção de anticorpo da molécula podem afetar a conformação da IL-2, por exemplo, alterando a rigidez da molécula de anticorpo. No caso de huKS-IL2, estas alterações podem conduzir a uma molécula KS-IL2 que agora exibe uma seletividade aumentada para células T num bioensaio à base de células.

Para proteínas de fusão anticorpo-IL2 é muitas vezes útil selecionar uma fração Ig que confere à molécula outras propriedades desejadas. Por exemplo, uma fração IgG da subclasse gama 1 pode ser preferida para manter funções efetoras imunológicas, como ADCC. Alternativamente, uma fração IgG das subclasses gama 2 ou gama 4 pode ser preferida, por exemplo, para reduzir interações com recetores FcR. Quando se utilizarem frações IgG das subclasses gama 2 ou gama 4, é particularmente preferida a inclusão de uma região conetora derivada de gama 1. É muitas vezes útil utilizar as mutações e modificações químicas ou bioquímicas de proteínas de fusão Ig-IL2 em combinação com outras mutações possuindo propriedades úteis distintas, como a mutação da lisina no terminal C de certas regiões Fc numa alanina ou outro resíduo hidrófobo. Por exemplo, é particularmente útil aplicar as modificações da invenção à proteína de fusão de anticorpo huKS-ala-IL2 ou dl-NHS(76)-ala-IL2. Também é preferido introduzir na molécula outras mutações que eliminem epítopos de células T potenciais. É particularmente preferido que estas mutações 22 não alterem substancialmente as propriedades desejadas da molécula.

Esta invenção também divulga formas de uma fração Ig fundida a IL-2, por exemplo, uma fusão anticorpo-IL2, como huKS-IL2, nas quais uma alteração especifica na sequência de aminoácidos da IL-2, por exemplo, IL2(D20T) ou IL2(N88R), altera as propriedades de ligação da proteína de fusão ao complexo IL-2R. A sequência de aminoácidos da proteína IL-2 humana madura está representada na SEQ ID NO: 3. As alterações das propriedades de ligação refletem-se numa seletividade aumentada para células T num bioensaio à base de células. A mutação particular influencia o grau de seletividade para células T. Adicionalmente, estas alterações dão origem a uma molécula de fusão, por exemplo, huKS-ala-IL2(D20T) ou huKS-ala-IL2(N88R), com menos efeitos secundários tóxicos quando administrada a ratinhos de modo sistémico do que, por exemplo, huKS-ala-IL2. Estas alterações também dão origem a uma proteína de fusão, por exemplo, huKS-ala-IL2(N88R) , que é pelo menos tão eficaz como a huKS-IL2 normal ou huKS-ala-IL2 em terapia tumoral nalguns modelos tumorais de ratinho.

Uma vez que as respostas imunológicas requeridas para eliminar um tumor são múltiplas e também variam de tipo de tumor para tipo de tumor, pode não ser desejável eliminar completamente uma funcionalidade da molécula quando é utilizada uma molécula com toxicidade reduzida. Por exemplo, num modelo de ratinho onde foi induzida metástase pulmonar de carcinoma do cólon, verificou-se que a huKS-IL2 tratou eficazmente o cancro por um mecanismo mediado por células T, que não requereu células NK, ao passo que, num modelo de ratinho de neuroblastoma, se verificou que a 23 eliminação do tumor por huKS-IL2 requer células NK mas não células T. Em consequência, há casos em que o perfil de seletividade pode ser mais apropriadamente modulado de modo a ainda permitir uma resposta mediada por NK. Numa forma de realização da invenção, uma abordagem mais desejável consiste em alterar subtilmente o perfil de seletividade da molécula de modo a ainda ser obtida uma resposta envolvendo múltiplos tipos de recetores, muito preferivelmente nos sítios onde a molécula fica concentrada. Por exemplo, a invenção proporciona alterações de uma proteína de fusão Ig-IL2 em que a seletividade para IL-2R(^y, relativamente a Ι1,-2Κβγ, é aumentada 2 até 10 vezes, 10 até 100 vezes, 100 até 1000 vezes ou mais de 1000 vezes, relativamente a uma proteína de fusão Ig-IL2 não modificada correspondente.

Moléculas da presente invenção são úteis para o tratamento de malignidades e tumores, particularmente tratamento de tumores sólidos. Exemplos de tumores que podem ser tratados de acordo com a invenção são tumores de origem epitelial, como os presentes nos seguintes, mas não limitados a estes, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro do estômago, cancro hepático, cancro da bexiga, cabeça e pescoço. De igual modo, de acordo com a invenção, malignidades e tumores de origem neuroectodérmica são candidatos adequados para tratamento, tais como mas não se limitando a melanoma, carcinoma do pulmão de células pequenas, sarcomas de tecido mole e neuroblastomas.

De acordo com a invenção, é útil que o agente terapêutico seja dirigido para o sítio tumoral ou sítio da malignidade ou metástase. São particularmente úteis proteínas de fusão de Ig contendo anticorpos dirigidos para antigénios preferencialmente apresentados por tumores ou células 24 malignas. Por exemplo, são particularmente úteis proteínas de fusão contendo uma fração de anticorpo com especificidade para EpCAM (por exemplo, KS1/4), ou Fibronectina embrionária (por exemplo, BC1), ou CEA, ou complexos de cromatina (por exemplo, NHS76), ou GD2 (por exemplo, 14.18), ou CD 19, ou CD20, ou CD52, ou HER2/neu/c-erbB-2, ou MUC-1, ou PSMA. Adicionalmente, são particularmente úteis anticorpos dirigidos para vários antigénios virais.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Construção de genes de fusão Ig-IL2 com substituições de codões na sequência codificadora da IL-2 ou na sequência codificadora do anticorpo.

Um vetor de expressão para imunocitoquinas foi descrito em Gillies et ai., (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203. Várias modificações na sequência de nucleótidos permitiram a adição de sequências codificadoras à extremidade 3' do gene γ-l humano. No gene γ-l humano que codifica a cadeia pesada, o sitio de restrição Xmal localizado 280 bp a montante do codão de terminação da tradução foi destruído por introdução de uma mutação silenciosa (TCC em TCA) . Introduziu-se outra mutação silenciosa (TCT to TCC) no codão Ser três resíduos a montante da lisina C-terminal da cadeia pesada, para criar a sequência TCCCOGOGT AAA (SEQ ID NO. 4), que contém um novo sítio Xmal [Lo et ai., (1998) Protein Engineering 1_1: 495-500] . O cDNA da IL-2 foi construído por síntese química e contém um novo e único sítio de restrição PvuII [Gillies et ai., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. 89: 1428-1432]. Os sítios Xmal e PvuII são únicos no vetor de expressão, e 25 facilitaram a construção de variantes anticorpo-IL2, incluindo as seguintes. 1) huKS-ala-IL2. A construção de huKS-ala-IL2 foi previamente descrita (por exemplo, WO01/58957). A proteína resultante contém uma substituição de aminoácidos na junção entre a região constante da cadeia pesada de Ig e a huIL-2 madura. A junção tem normalmente a sequência SPGK-AFT (SEQ ID NO: 5), na qual -SPGK- é o terminal C da cadeia pesada e -APT- é o terminal N da proteína IL-2 madura. Em huKS-ala-IL2 introduziu-se uma substituição K em A (referida como posição K [-1 ] ) e a junção tem agora a sequência Si*GA-API (SEQ ID NO: 6) . Em consequência, a semivida no soro desta proteína é melhorada (ver Exemplo 5). 2) dI-KS-ala-IL2. Esta proteína de fusão KS-IL2 contém substituições em KS-ala-IL2 para gerar uma versão da proteína de fusão na qual foram eliminados epítopos de células T potenciais (descrito nos requerimentos de patente copendentes U.S.S.N. 10/112,582 e 10/138,727, cuja totalidade das revelações é aqui incorporada por referência). A região constante da porção Ig das proteínas de fusão da invenção pode ser selecionada da região constante normalmente associada à região variável, ou uma região constante diferente que origina uma proteína de fusão com a porção Ig incluindo regiões variáveis e constantes de diferentes subclasses de moléculas IgG ou diferentes espécies. Por exemplo, pode ser utilizada a região constante de IgG gama4 (SEQ ID NO: 7) em vez da região constante de gamai (SEQ ID NO: 8) . A alteração tem a vantagem de a cadeia gama4 poder originar uma semivida no 26 soro mais prolongada. Em conformidade, a região constante de IgG gama2 (SEQ ID NO: 9) também pode ser utilizada em vez da região constante de IgG gamai (SEQ ID NO: 8) . Adicionalmente, a região conetora derivada de IgG gamai (SEQ ID NO: 10) pode substituir a região conetora que normalmente ocorre em IgG gama2 (SEQ ID NO: 11) ou região constante de IgG gama4 (SEQ ID NO: 12) . O componente Ig da proteína de fusão também pode incluir mutações na região constante de modo que a IgG tenha afinidade de ligação reduzida para pelo menos um de FcyRI, FcyRII ou FcyRIII. As proteínas de fusão da invenção podem incluir mutações nas regiões constantes de IgG para remover potenciais sítios de glicosilação e epítopos de células T. Por exemplo, as várias regiões constantes podem incluir alterações na parte C-terminal das regiões constantes para remover potenciais epítopos de células T. Por exemplo, potenciais epítopos de células T na parte C-terminal de várias regiões constantes de moléculas IgG são removidos alterando a sequência de aminoácidos K&LSLSPGK (SEQ ID NO: 13) nas regiões constantes de IgG gamai e IgG gama 2, e a sequência de aminoácidos KSLSLSLGK (SEQ ID NO: 14) na região constante de IgG gama4, na sequência de aminoácidos KSAT.ATPGA (SEQ ID NO: 15). 3) huKS-ala-IL2(N88R). Esta variante de huKS-IL2 contém a mesma substituição de aminoácidos na junção entre a região constante da cadeia pesada de Ig e huIL-2 madura como descrita acima (K[—1]A, criada pela alteração do codão AAA em GCC) e, adicionalmente, contém uma substituição na posição N88 na sequência da huIL-2 madura em favor de R (criada pela alteração do codão aAT em aGG) . Introduziu-se outra alteração na sequência de nucleótidos da huIL-2 para eliminar um sítio de restrição existente para Bam Hl por 27 introdução de uma mutação silenciosa (posição de aminoácido G98, o codão foi mudado de ggA tcc para ggC tcc).

Utilizou-se uma estratégia de mutagénese à base de PCR na construção de huKS-ala-IL2(N88R). Geraram-se dois fragmentos de PCR sobrepostos que abrangem a sequência codificadora da huIL2 madura utilizando como modelo huIL2 num vetor Bluescript (Stratagene). 0 fragmento de PCR a montante continha as alterações de nucleótidos que codificam K[-1]A e N88R por incorporação destas mutações nos "primers" sentido e antissentido, respetivamente. Estas alterações estão indicadas pelos nucleótidos a cheio nas sequências dos "primers". A sequência do "primer" sentido foi a seguinte: 5XXCC(K3mm'C«CCCCÁACTTÇAAOrITCTACA3, (SEQ ID NO: 16); a sequência do "primer" antissentido foi: 5' /^CCCTTl\AGTTCCAGAACTATrAC0TlGAT€CTGCTGATTAAGTCCCTAGGT3' ( SEq ID NO: 17). 0 nucleótido sublinhado representa uma alteração que destrói o sitio Bam Hl. 0 segundo fragmento de PCR a jusante continha uma região de sobreposição de 20 nucleótidos com o fragmento de PCR a montante e a restante sequência da IL2. O "primer" sentido utilizado nesta reação foi 5’AmCtGGAACTAAAGGGSTCCOAAACAACATTCATGTOT (SEQ ID NO: 18). Mais uma vez, o nucleótido sublinhado designa a mutação silenciosa que destrói o sitio Bam Hl. O "primer" antissentido utilizado foi o "primer" reverso M13 comum que hibridiza com uma sequência no vetor pBluescript. Estes fragmentos de PCR sobrepostos foram utilizados numa reação com o "primer" na SEQ ID NO: 16 e um "primer" reverso M13 para gerar o produto de PCR final, que foi subsequentemente inserido num vetor TA (Invitrogen). A sequência do fragmento inserido foi verificada, e utilizou-se um fragmento Xma I/Xho I de 442 bp contendo a 28 sequência IL2 modificada (do plasmídeo TA-IL2(N88R)) para substituir a sequência huIL-2 de tipo selvagem no plasmídeo de expressão de imunocitoquinas paterno (que codifica huKS-IL2) . 0 plasmídeo de expressão de imunocitoquinas resultante que codifica huKS-ala-IL2(N88R) foi verificado por mapeamento de restrição e sequenciação. 4) huKS M1-IL2(TTSR (SEQ ID NO: 19)). A variante de imunocitoquina huKS M1-IL2 foi construída por técnicas comuns de DNA recombinante (e descritas, por exemplo, no requerimento de patente copendente U.S.S.N. 10/112,582, cuja totalidade da revelação é aqui incorporada por referência). Contém múltiplas substituições de aminoácidos na região de junção anticorpo - IL-2 da proteína de fusão que eliminam potenciais epítopos de células T e dão origem a uma proteína menos imunogénica. A sequência foi alterada de KSLSLSPGA-AFT (SEQ ID NO: 20) para K.SA1A1.PGA-APT (SEQ ID NO: 21) (o traço designa o sítio da junção Ig/IL-2 e os aminoácidos substituídos estão sublinhados) e é designada "Ml". Nesta variante também está incorporada a alteração K em A no último aminoácido antes da junção, que foi mostrado aumentar a semivida no soro da imunocitoquina. huKS M1-IL2(TTSR) contém outras substituições de aminoácidos localizadas na porção IL-2 da imunocitoquina. Para eliminar potenciais epítopos de células T criados pela substituição de N88R descrita acima, a sequência é alterada de “©IJSML·· (SEQ ID NO: 22) da huIL-2 natural para (SEQ ID NO: 23).

Utilizou-se uma abordagem de mutagénese à base de PCR para introduzir as alterações na sequência de nucleótidos do gene huIL-2, incorporando as mutações no "primer" sentido. 29

Criou-se a sequência TTxR por alterações dos codões ACC, ACC e AGG, respetivamente. Gerou-se um fragmento de PCR de 197 bp mutagenizado abrangendo a extremidade 3' da sequência hu IL-2 a partir do plasmideo de expressão de imunocitoquinas modelo que codifica huKS-ala-IL2(N88R) utilizando um "primer" sentido com a sequência 5>ACTTAAíM€CTAGGGACACCACCÂG€ÀGQÀTCAACGTAAl’AGT3I (SEQ ID NO: 24) e um "primer" antissentido com a sequência S'ATCATGTCTGGATCCCTC3* (SEQ ID NO: 25) . 0 fragmento de PCR foi clonado num vetor TA e a sequência foi verificada. Para regenerar a sequência IL-2 completa, este fragmento foi ligado, na forma de um digesto de restrição Afl II/Xho I, a um fragmento Hind III/Afl II de 2 kb obtido a partir do plasmideo de expressão de imunocitoquinas que codifica huKS-ala-IL2(N88R), e foi inserido num vetor pBluescript restringido com Hind III/Xho I. 0 gene IL-2 mutagenizado foi então trocado, em vez da sequência huIL-2 natural, num plasmideo de expressão de imunocitoquinas que codifica KS M1-IL2 numa ligação de três vias. 5) huKS(N em Q)-IL2. Construiu-se um plasmideo de expressão de imunocitoquinas que codifica huKS(N em Q)-IL2 utilizando técnicas comuns de DNA recombinante. huKS(N em Q)-IL2 contém uma substituição de aminoácidos no domínio CH2 da região constante de Fc gama 1 do anticorpo que elimina glicosilação N-ligada. A sequência de aminoácidos é alterada de 0YNSTY8 (SEQ ID NO: 1) para QYQBTYR (SEQ ID NO: 26), com o aminoácido substituído indicado a cheio. De modo semelhante construíram-se proteínas de fusão incluindo regiões constantes de gama 2 e gama 4 que contêm mutações que alteram a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) em QÂQST (SEQ ID NO: 27), desse modo eliminando adicionalmente um potencial epítopo de células T. 30

Exemplo 2: Modificações quimicas ou enzimáticas de uma proteina de fusão Ig-IL2 conducentes a especificidade modificada para recetores

Este exemplo descreve manipulações bioquímicas da imunocitoquina utilizadas para gerar uma huKS-IL2 PEGuilada ou uma huKS-IL2 desglicosilada, e respetivas variantes. Os mesmos métodos podem ser aplicados a outras proteínas de fusão de IL-2, como a imunocitoquina 14.18-IL2 ou fusões albumina-citoquina. Estas variantes foram utilizadas num exemplo subsequente para investigar o seu efeito na resposta proliferativa de várias linhas de células num bioensaio à base de células (Tabela 1) ou nas propriedades farmacocinéticas da molécula. PEGuilação de huKS-IL2. PEG (20 000) foi ligado de modo covalente à proteína via grupos amina presentes na proteína. Para esta finalidade empregou- se um derivado reativo de PEG contendo um agente de ligação succinimida (Propionato de mPEG-Succinimidilo, denominado "SPA-PEG" em baixo). A huKS-IL2 foi extensamente dialisada num tampão sem amina composto por 50 mM Fosfato de Sódio (pH 7,5), 0,05% Tween 80, e foi concentrada. 0 SPA-PEG em excesso foi combinado com huKS-IL2 numa razão molar de 5:1 ou 10:1. Imediatamente antes da utilização preparou-se uma solução mãe de SPA-PEG 5 mM em água desionizada. Um volume apropriado da solução de SPA-PEG foi combinado com huKS-IL2 e a reação foi incubada numa plataforma oscilante durante 30 até 40 minutos à temperatura ambiente. Adicionou-se um excesso 5 até 10 molar de glicina para arrefecer

rapidamente a reação, e os produtos reacionais foram purificados por cromatografia de exclusão por tamanhos. Uma coluna Superdex 200, equilibrada em 50 mM HEPES e 150 mM 31

NaCl, foi carregada com a amostra reacional, e frações em eluição contendo a proteína PEGuilada foram reunidas e concentradas.

Tratamento de huKS-IL2 com N-Glicanase. A huKS-IL2 (1,5 mg) foi incubada com 30 mU de PNGaseF (New England Biolabs) durante a noite a 37°C. 0 produto reacional foi purificado por passagem numa coluna de Proteína A-Sefarose e eluição da huKS-IL2 ligada a pH 3. O eluato foi neutralizado e concentrado numa coluna de rotação num tampão de PBS e 0,05% Tween80. A desglicosilação da huKS-IL2 foi verificada por cromatograf ia de exclusão por tamanhos e num gel de ureia.

Exemplo 3: Expressão e purificação de Ig-IL2 e variantes de Ig-IL2

0 procedimento geral descrito aqui para huKS-ala-IL2(N88R) pode ser utilizado para uma grande variedade de proteínas de fusão Ig-citoquina, incluindo fusões de Ig a citoquinas mutantes. Para se obterem clones transfetados de modo estável que expressam huKS-ala-IL2(N88R), DNA do plasmídeo de expressão de imunocitoquinas que codifica huKS-ala-IL2(N88R) foi introduzido nas células NS/0 de mieloma de ratinho por eletroporação. As células NS/0 cresceram em meio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado com 10% soro fetal de bovino inativado pelo calor, 2 mM glutamina e penicilina/estreptomicina. Cerca de 5 x 106 células foram lavadas uma vez com PBS e ressuspensas em 0,5 mL de PBS. Em seguida, 10 pg de DNA plasmídico linearizado foram incubados com as células numa Cuvete Gene Pulser (0,4 cm de separação das pontas dos elétrodos, BioRad) em gelo durante 10 minutos. A eletroporação foi realizada utilizando um Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) com parâmetros a 0,25 V 32 e 500 pF. Permitiu-se a recuperação das células durante 10 minutos em gelo, após o que foram ressuspensas em meio de crescimento e plaqueadas em placas de 96 cavidades. Os clones transfetados de modo estável foram selecionados por crescimento na presença de 100 nM metotrexato (MTX) , que foi adicionado ao meio de crescimento dois dias pós- transfeção. As células foram nutridas de 3 em 3 dias durante mais duas ou três vezes, e clones resistentes a MTX apareceram num período de 2 até 3 semanas. Os sobrenadantes dos clones foram avaliados por ELISA anti-Fc para identificar grandes produtores. Os clones grandes produtores foram isolados e propagados em meio de crescimento contendo 100 nM MTX. A imunocitoquina foi purificada do sobrenadante da cultura de tecido por cromatografia em coluna de Afinidade com Proteína A. Para huKS-ala-IL2(N88R), uma coluna de Proteína A recombinante (rPA) Agarose foi pre-equilibrada com dez volumes de tampão de processamento, como 100 mM Arginina, 5 mM Citrato, 0,01% Tween 80 pH 5,6, e a coluna foi carregada com sobrenadante filtrado da cultura de células contendo huKS-ala-IL2(N88R) a 16 mL/minuto para uma ligação de aproximadamente 40 mg/mL de resina rPA. A coluna foi extensamente lavada com o mesmo tampão e, por fim, a imunocitoquina eluiu em 50 mM glicina a pH 3. Recolheram-se frações de pico e ajustou-se o pH para neutro com 1 N NaOH.

Exemplo 4: Atividade de variantes Ig-IL2 em bioensaios.

Para bioensaios à base de células utilizaram-se linhas de células cujo crescimento depende da IL-2, e avaliou-se a atividade de proteínas de fusão de Ig, por exemplo, huKS-IL2 e variantes de huKS-IL2, por proliferação destas células. Por exemplo, empregaram-se CTLL-2 (ATCC# TIB-214; 33

Matesanz e Alcina, 1996) e TF-Ιβ (Farner et al., [1995] Blood 8_6: 4568-4578) para seguir uma resposta de células T e uma resposta do tipo células NK, respetivamente. CTLL-2 é uma linha de linfoblastos T murinos que expressa o IL-2Rc^y de elevada afinidade, e TF-Ιβ é uma linha de células humanas derivada de células eritroides precursoras imaturas que expressam o IL-2R^y de afinidade intermédia. Outra linha de células útil para estes ensaios é, por exemplo, a linha de células derivada de linfoma de células T adulto humano Kit-225 (K6) (Uchida et al., [1987] Blood 7_0g 1069-1072). Quando emparelhadas com a linha de células TF-Ιβ, a atividade das proteínas de fusão é avaliada num par de linhas de células que albergam recetores da mesma espécie de mamífero. Estes ensaios também podem ser realizados com populações de células derivadas de PBMCs (Células Mononucleares do Sangue Periférico) humanas, para isolar células NK, que contêm IL-2R3y, ou para produzir células T ativadas, que expressam Ιύ-2Κοίβγ. Técnicas para isolar estas populações de células de PBMCs humanas são conhecidas dos profissionais. Por exemplo, obtêm-se células T, ou blastos PHA, por incubação de PBMCs durante três dias em 10 microgramas/mL de fito-hemaglutinina (PHA-P; L9017, Sigma, St. Louis). Células NK em repouso são habitualmente obtidas por um protocolo de seleção negativa, por exemplo, utilizando um estojo de isolamento de células NK (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) para células humanas. Para correlacionar a atividade destas proteínas de fusão com resultados obtidos de modelos tumorais de ratinho também é útil realizar estes ensaios em populações de células obtidas do ratinho que expressam um ou o outro complexo recetor da IL-2. Por exemplo, uma população de células NK pode ser obtida de baços de ratinhos Balb/C deficientes para recombinação (SCID) utilizando um estojo de 34 enriquecimento de células NK murinas SPINSEP™ (Stemcell Technologies Inc, Vancouver, BC, Canadá). A pureza de qualquer uma destas populações enriquecidas pode ser avaliada por análise FACS.

Em resumo, células lavadas foram plaqueadas a uma densidade de 10 000 células/cavidade numa placa de microtitulo de 96 cavidades e foram incubadas em meio celular suplementado, por exemplo, com huKS-IL2 ou variantes de huKS-IL2 purificadas. Adicionalmente, a proteína huIL-2 de tipo selvagem, obtida da R&D Systems (Minneapolis, MN) foi avaliada como padrão. A proteína adicionada foi preparada na forma de uma série de diluições numa gama de concentrações de aproximadamente 1000 vezes, entre 0,45 ng/mL e 420 ng/mL (normalizadas relativamente a equivalentes molares de IL2). Passadas 32 horas adicionaram-se a cada cavidade 0,3 pCi de [metil-3H]timidina (Dupont-NEN-027) e as células foram incubadas durante 16 horas adicionais. Em seguida, as células foram recolhidas e submetidas a lise em filtros de vidro. Mediu-se a 3H-timidina incorporada em DNA num contador de cintilações.

Obteve-se um valor ED50 para cada variante da proteína huKS-IL2 relativo à proliferação celular a partir da representação gráfica de uma curva de resposta à dose e identificação da concentração de proteína que originou uma resposta semimáxima. A seletividade da resposta foi expressa na forma de uma razão de valores ED50, por exemplo, ED50 [ΤΕ1-β]/ΕΌ50 [CTLL-2]. Assim, uma razão de ED50 elevada indicou ser requerida uma dose relativamente maior da proteína para induzir uma resposta de células TF-1β em comparação com uma resposta de células CTLL-2. A 35 razão dos valores ED50 das variantes huKS-IL2 foi comparada com a huIL-2 livre e as proteínas huKS-IL2 paternas. Este valor normalizado é uma medida do efeito diferencial. Um valor maior do que o obtido para a proteína de referência indicou um desvio da seletividade para células CTLL-2. Nalguns casos pode ser preferível obter razões de ED50 com linhas de células originárias da mesma espécie, de modo que as atividades da IL-2 não sejam adicionalmente influenciadas por diferenças de espécies cruzadas na sua interação com os recetores. 0 exemplo seguinte emprega células CTLL-2 murinas e TF-Ιβ humanas para calcular razões ED50 com proteínas de fusão Ig-IL2 e IL-2 livre, e resultados representativos dessa experiência estão apresentados na Tabela 1.

Tabela 1

Proteína Razão ED50 IL-2 0, 81 HuKS-IL2 0, 11 HuKS-ala-IL2 0,17 KS(N em Q)-IL2 0,72 HuKS-ala-IL2(N88R) 2300 KS-IL2(TTSR) > 6 HuKS-IL2 PEGuilada 1, 99 HuKS-IL2 + Glicanase 0,45 14.18-IL2 0, 07 14.18-IL2 PEGuilada 1,34 14.18-IL2 + Glicanase 0,21

Neste exemplo, em comparação com a razão ED50 obtida com a IL-2 livre (0,81), obteve-se uma razão ED50 aproximadamente 5 vezes menor com huKS-IL2 (0,17). Isto indicou que o perfil de seletividade da proteína de fusão foi desviado, exibindo uma maior seletividade para células TF-Ιβ. Uma combinação diferente anticorpo / IL-2, 14.18-IL2, também foi mais seletiva para TFl-β do que a IL-2 isolada (razão ED50 de 0,07), indicando que este efeito não se limitou a um anticorpo específico contido na proteína de fusão 36 anticorpo-IL2, e a atividade reduzida de proteínas de fusão Ig-IL2 humanas para células contendo recetores murinos de elevada afinidade, relativamente a huIL-2, pode refletir uma característica geral das proteínas de fusão Ig-IL2.

Outras variantes exibiram uma razão ED50 alterada com favorecimento de uma resposta de células CTLL-2. Observou-se um efeito dramático com a huKS-ala-IL2(N88R), para a qual a razão ED50 foi maior do que 2000, refletindo o facto de a proliferação de células TF-Ιβ, mediada nestas células pelo recetor de afinidade intermédia, mal ter sido detetável. Assim, enquanto a huKS-ala-IL2(N88R) ativou a sinalização de células com IL-2Ro^y, não ativou significativamente células com IL-2R3y. Também foi possível avaliar a atividade da huKS-ala-IL2(N88R) em células NK murinas purificadas que expressam o complexo IL-2Rβγ murino; em contraste com o que foi relatado para a proteína IL2(N88R) humana livre - que indicou que a seletividade se perdeu virtualmente quando se examinaram células T e NK de ratinho (ver Wetzel et al., Resumo do Encontro ASCO 2001) -o valor ED50 para huKS-ala-IL2(N88R) nas células NK de ratinho foi semelhante ao observado com células TF-Ιβ.

Observaram-se desvios subtis da seletividade da resposta para células CTLL-2 em variantes Ig-IL2 com alterações que afetam a glicosilação da porção de anticorpo da proteína de fusão. Especificamente, KS (N em Q)-IL2, que não tem um sítio de glicosilação na porção Fc do anticorpo, exibiu um aumento de 3 vezes da Razão ED50 (0,72) relativamente a huKS-IL2, ao passo que a huKS-IL2 tratada com N-Glicanase exibiu um aumento de 2 vezes (razão ED50 de 0,45) relativamente à huKS-IL2. Da mesma forma, o tratamento com N-Glicanase de IL-2 fundida a uma molécula de anticorpo 37 diferente conduziu a um resultado semelhante; por exemplo, 14.18-IL2 tratada com N-Glicanase originou um aumento de 3 vezes da razão ED50 em comparação com 14.18-IL2 não tratada. Estes resultados indicaram que certas alterações na porção de anticorpo da própria molécula afetam as propriedades de ligação e ativação de uma molécula IL-2 fundidas àquela. A PEGuilação da proteína de fusão também alterou o seu perfil de seletividade. Mais uma vez observou-se um desvio para atividade estimuladora de CTLL-2. Para a huKS-IL2, uma variante PEGuilada originou um aumento de 9 vezes da seletividade em favor de células CTLL-2 (razão ED50 de 1,99) e, para 14.18-IL2, um aumento de 20 vezes foi induzido por PEGuilação (razão ED50 de 1,34).

Nalguns casos, estes desvios da seletividade para uma dada proteína também podem refletir a combinação particular de tipos de células empregues nos ensaios, como ilustrado em resultados representativos mostrados na Tabela 2. Por exemplo, quando se compararam KS-IL2, KS-ala-IL2 e IL2 utilizando a linha de células contendo IL-2Ro^y humanas Kit 225 em vez de CTLL-2 murinas, os padrões de desvio da seletividade não se mantiveram. Particularmente no que se refere a células Kit 225, estas três proteínas exibiram atividade essencialmente idêntica. Todavia e mais importante ainda, verificou-se que as tendências da resposta de seletividade de variantes Ig-IL2 entre células TF-Ιβ e células Kit-225 foram semelhantes às estabelecidas com células TF-Ιβ e células CTLL-2, incluindo o efeito de desglicosilação da fração Fc de uma proteína de fusão Ig-IL2 (ver resultados representativos na Tabela 2 em baixo e Exemplo 10). 38

Tabela 2

Proteína Razão ED50 TF-ip/Kit-225 IL-2 2,8 HuKS-IL2 4 HuKS-ala-IL2 10,4 KS-ala-IL2(N88R) 52 000

Adicionalmente, verificou-se que células Kit-225 foram mais sensíveis à IL-2 e proteínas de fusão de IL-2, e respetivas variantes, do que células CTLL-2. Por exemplo, o valor ED50 para huKS-ala-IL2 foi 0,08 em células Kit-225 e 5,0 em células CTLL-2, e para KS-ala-IL2(N88R) foi 0,13 em células Kit 225 e 3 em células CTLL-2, indicando um aumento de aproximadamente 10 - 50 vezes da sensibilidade de células Kit 225 nestes ensaios. Assim, o valor da razão ED50 para uma dada proteína depende da combinação particular de tipos de células empregues.

Exemplo 5: Farmacocinética de proteínas de fusão de IL-2 com características modificadas de ligação a recetores

Comparou-se o perfil farmacocinético (PK) de huKS-ala-IL2(N88R) com o perfil de huKS-ala-IL2 e huKS-IL2. Para cada proteína utilizaram-se três ratinhos com 6-8 semanas de idade. Vinte e cinco qg das proteínas de fusão, diluídos para 125 qg/mL em PBS, foram injetados na veia da cauda dos ratinhos e obtiveram-se amostras de sangue de 50 qL por sangramento retro-orbital imediatamente após a injeção (0 horas) e às 0,5, 1, 2, 4, 8 e 24 horas pós-injeção. As

amostras de sangue foram recolhidas em tubos revestidos com heparina, para evitar a coagulação do sangue, e mediram-se os níveis de imunocitoquinas no sobrenadante do plasma pós-celular num ensaio ELISA. O procedimento do ensaio ELISA 39 utilizado para estudos farmacocinéticos foi previamente descrito (WOOl/58957) . Este ensaio mediu a presença de uma imunocitoquina intacta. A captura da imunocitoquina do plasma foi efetuada em placas revestidas com EpCAM e a deteção foi realizada com um anticorpo conjuqado a HRP dirigido contra a IL-2. Tinha sido previamente mostrado que a variante huKS-IL2 com uma substituição K em A na junção, huKS-ala-IL2, exibiu uma semivida em circulação dramaticamente melhorada em comparação com a huKS-IL2 (WOOl/58957). De facto, verificou-se que a semivida em circulação da huKS-ala-IL2 (N88R) foi melhorada de modo semelhante, indicando que a alteração N88R na porção IL-2 da molécula não teve nenhum efeito substancial na farmacocinética. Apresentam-se na Figura 2 resultados de uma experiência representativa. A Figura 2 ilustra uma variação temporal da concentração da imunocitoquina presente no soro (expressa em percentagem da concentração de proteína remanescente no soro relativamente à concentração de partida imediatamente após administração intravenosa) ao longo de 24 horas. As concentrações proteicas são determinadas num ensaio ELISA no qual a imunocitoquina é capturada pela sua fração de anticorpo e é detetada pela sua fração de citoquina. Eixo X = tempo em horas; Eixo Y = log(% da concentração de proteína remanescente).

Exemplo 6: Toxicidade de proteínas de fusão Ig-IL2 com características modificadas de ligação a recetores num mamífero

Examinou-se a toxicidade relativa das variantes de KS-IL2 huKS-IL2, huKS-ala-IL2 e huKS-ala-IL2(N88R) em ratinhos. Como mostrado no Exemplo 5, a huKS-ala-IL2 e huKS-ala-IL2(N88R) têm PK substancialmente aumentada quando 40 comparadas com a huKS-IL2. Ainda assim, para fins comparativos, empregou-se um esquema de dosagem idêntico para as diferentes moléculas, apesar da diferença da PK. Não obstante ser provável que uma semivida no soro mais prolongada aumente a eficácia de um agente terapêutico, também pode conduzir a toxicidade aumentada. Mas este exemplo mostra que, enquanto a huKS-ala-IL2 exibiu toxicidade aumentada em comparação com a huKS-IL2 (devido a uma semivida em circulação mais prolongada), a huKS-ala-IL2(N88R) exibiu toxicidade decrescida em comparação com a huKS-IL2 apesar de uma semivida em circulação mais prolongada.

Ratinhos Balb/C (3 animais por condição experimental) receberam diariamente injeções intravenosas de uma das três proteínas durante cinco dias consecutivos. As proteínas de fusão foram diluídas em 200 pL de PBS e foram administradas na dosagem seguinte: huKS-IL2 e huKS-ala-IL2 a 25, 50 ou 75 pg por ratinho, e huKS-ala-IL2(N88R) a 50, 75 ou 100 pg por ratinho. Um grupo de controlo recebeu injeções intravenosas de PBS. Monitorizou-se diariamente a sobrevivência dos ratinhos e examinou-se o efeito na sobrevivência dos ratinhos. Os ratinhos sobreviveram à administração de todas as doses de huKS-IL2. No entanto, a huKS-ala-IL2 foi mais tóxica. Enquanto os ratinhos toleraram uma dose de 25 pg de huKS-ala-IL2, os 3 ratinhos morreram no dia 6 a uma dose de 50 pg e, a uma dose de 75 pg, dois ratinhos tinham morrido no dia 4,5 e o terceiro ratinho no dia 5. Por outro lado, a huKS-ala-IL2(N88R) foi bem tolerada a todas as doses, incluindo 100 pg. De facto, a huKS-ala-IL2(N88R) também foi administrada a uma dose de 200 pg por ratinho, e os ratinhos sobreviveram. Assim, a huKS-ala-IL2(N88R) foi significativamente menos tóxica do que a huKS-ala-IL2. 41

Os ratinhos que morreram durante o tratamento com huKS-ala-IL2 foram dissecados e os seus órgãos foram avaliados. Todos os órgãos, incluindo pulmão, baço, fígado, estômago e rim, estavam grandemente distendidos, indicando extravasamento vascular extenso. Também se avaliaram órgãos de animais tratados com a variante huKS-ala-IL2(N88R). Os ratinhos foram tratados como descrito acima, e verificou-se que os pesos dos órgãos de animais tratados com huKS-ala-IL2(N88R) foram geralmente semelhantes aos de animais de controlo, particularmente para os pulmões e fígado. Sem pretender ficar restringido pela teoria, pensa-se que o aumento do peso do baço se deve mais a um aumento da celularidade causada por uma resposta imunológica de anticorpo contra esta proteína humana do que a um extravasamento vascular. Infere-se que a huKS-ala-IL2(N88R) produz extravasamentos vasculares menos graves do que a huKS-ala-IL2. A Tabela 3 apresenta um exemplo de valores aproximados para o aumento de x vezes do peso de órgãos relativamente a órgãos de um ratinho de controlo.

Tabela 3 ÓRGÃO AUMENTO DE PESO (x vezes) HuKS-ala-IL2 (20 pg/ratinho) huKS-ala-IL2(N88R) (100 μς/ΜίίηΙιο) Pulmão 4 1,7 Baço 3 3 Fígado 1,5 1 Rim 1 1

Avaliou-se o efeito de vários contextos de estirpes de ratinhos, com alterações conhecidas na constituição do seu sistema imunológico, relativamente à toxicidade destas proteínas de fusão Ig-IL2. Utilizaram-se as estirpes de ratinhos DBA/2, Balb/C, B6 . CB17-Prkdcscld/Sz J (SCID) , beige e SCID/beige. As proteínas de fusão foram administradas 42 como acima a uma dose de 25 pg e 50 pg por ratinho para huKS-ala-IL2 e a uma dose de 200 pg por ratinho para huKS-ala-IL2(N88R), e avaliaram-se a sobrevivência e peso dos ratinhos durante um período de duas semanas.

No caso da huKS-ala-IL2, a maior parte das estirpes de ratinhos exibiu resultados semelhantes aos observados com ratinhos Balb/C relatados acima: a dose de 50 pg conduziu a morte dos animais no dia 5, ao passo que, à dose mais baixa, os animais sobreviveram e os seus pesos recuperaram para cerca do seu peso inicial, mas não atingiram os ganhos de peso dos animais de controlo pseudotratados. É interessante notar que os ratinhos beije, deficientes em células NK funcionais, conseguiram tolerar melhor a dose elevada de 50 pg; dois animais tinham morrido pelo dia 9, mas um, tendo inicialmente exibido perda de peso significativa (cerca de 25% pelo dia 7), recuperou, e pelo dia 15 tinha atingido o peso corporal de animais pseudotratados e dos tratados com a dose mais baixa. Os ratinhos DBA/2 foram mais sensíveis à huKS-ala-IL2; mesmo à dose mais baixa, os animais DBA/2 morreram no dia 5 e dia 9.

Com a huKS-ala-IL2(N88R) também foi clara a suscetibilidade aumentada de ratinhos DBA/2 a proteínas de fusão Ig-IL2: pelo dia 8 todos os animais tinham morrido, e mesmo a metade da dose (100 pg) os animais tinham morrido pelo dia 9. Mais uma vez, a proteína de fusão foi melhor tolerada em ratinhos beije, ao passo que os ratinhos SCID/beije perderam peso significativo (permaneceram estáveis a cerca de 80% do controlo pseudotratado pelo dia 10). 43

Exemplo 7: Eficácia de uma proteína de fusão Ig-IL2 com características modificadas de ligação a recetores no tratamento de vários tumores num mamífero a) Tratamento de um tumor subcutâneo CT26/KSA em ratinhos Balb/C. Utilizaram-se células de carcinoma do cólon CT26, transduzidas com o gene que codifica o antigénio KS (KSA) humano, para induzir um tumor subcutâneo. Suspenderam-se 2 x 10E6 células viáveis em 100 pL de PBS, tendo sido injetadas subcutaneamente nos dorsos de ratinhos Balb/C com 6 semanas de idade. Quando a dimensão tumoral atingiu 100 -200 mm3, grupos de 8 ratinhos foram sujeitos a uma de três condições de tratamento: em cinco dias consecutivos administraram-se injeções intravenosas com 15 pg de huKS-ala-IL2 ou de huKS-ala-IL2(N88R) diluídos em 200 pL de PBS, ou PBS isoladamente. Avaliou-se a progressão da doença medindo o volume tumoral duas vezes por semana durante 50 dias. Nos animais de controlo, o volume tumoral aumentou regularmente, atingindo um tamanho de aproximadamente 3500 até 6000 mm3 na altura do sacrifício, que foi cerca do dia 32. Em contraste, os volumes tumorais para ambos os grupos experimentais permaneceram essencialmente constantes até aos 50 dias, indicando que a huKS-ala-IL2(N88R) foi tão eficaz quanto a huKS-ala-IL2 na prevenção do crescimento tumoral. b) Tratamento de um tumor subcutâneo LLC/KSA em ratinhos C57BL/6. Num segundo modelo tumoral induziu-se um tumor subcutâneo utilizando Células de Carcinoma de Pulmão de Lewis transduzidas com o gene que codifica o antigénio KS. Suspenderam-se 1 x 10E6 células LLC viáveis que expressam EpCAM em 100 pL de PBS, tendo sido injetadas subcutaneamente nos dorsos de ratinhos C57BL/6 com 6-8 semanas de idade. Quando a dimensão tumoral atingiu 100 - 44 150 mm3, grupos de oito ratinhos foram tratados e avaliados como acima, com a exceção de a dose administrada ter aumentado para 20 pg por injeção. Nos animais de controlo, o volume tumoral aumentou rapidamente, excedendo 6500 mm3 em 20 dias; o crescimento do tumor para ambas as condições experimentais foi retardado na mesma extensão, atingindo 4000 mm3 no mesmo período, indicando novamente que não houve diferenças de eficácia entre o tratamento com a huKS-ala-IL2 e huKS-ala-IL2(N88R) à mesma dose. c) Tratamento de um tumor subcutâneo LLC/KSA em ratinhos B6. CB17-Prkdcscld/Sz J. As proteínas de fusão da invenção também podem ser eficazes em células diferentes de células T maduras. Por exemplo, numa experiência, as proteínas de fusão da invenção conduziram ao retardamento do crescimento tumoral mesmo em ratinhos desprovidos de células T maduras. Estes resultados sugerem que as proteínas de fusão da invenção podem ser úteis no tratamento de tumores, por exemplo, em pacientes imunocomprometidos.

Um modelo de tumor subcutâneo LLC/KSA foi avaliado em ratinhos B6. CB17-Prkdcscld/Sz J com 11 semanas de idade, com resposta imunológica mediada por células T e células B comprometida. Seguiu-se o mesmo protocolo de tratamento descrito acima. Os tumores em animais de controlo cresceram rapidamente para 3500 mm3 em 15 dias. A huKS-ala-IL2 e huKS-ala-IL2(N88R) foram eficazes de modo semelhante no retardamento do crescimento tumoral para menos de metade do tamanho no mesmo período. Além disso, as diferenças nas taxas de crescimento tumoral entre os ratinhos C57BL/6, que têm um sistema imunológico intacto, e os ratinhos B6.CB17-Prkdcscld/SzJ, desprovidos de células T e células B, foram mínimas. 45

Além disso, o facto de a KS-ala-IL2 ter conduzido ao tratamento do tumor igualmente bem em ratinhos com um sistema imunológico intacto e em ratinhos desprovidos de células T funcionais indicou que, neste modelo tumoral, a resposta imunológica operou através de um mecanismo não mediado por células T. Em consequência, é valioso manter, numa molécula terapêutica, a opção de estimular uma resposta imunológica através de uma variedade de células efetoras. No caso da KS-ala-IL2 (N88R) , que foi tão eficaz quanto a KS-ala-IL2 em qualquer dos contextos de ratinho, as atividades de células efetoras que atuam independentemente de células T foram aparentemente conservadas. d) Tratamento de metástases LLC/KSA nos pulmões de ratinhos C57BL/6. Também se utilizaram células LLC/KSA num modelo de metástases pulmonares. Suspenderam-se 1 x 10E6 células viáveis em 200 pL de PBS, tendo sido injetadas intravenosamente em ratinhos C57BL/6 com 6-8 semanas de idade. No dia 4, grupos de oito ratinhos foram sujeitos a uma das seguintes condições de tratamento: em cinco dias consecutivos injetaram-se intravenosamente os ratinhos com 200 pL de PBS, ou com 20 pg de KS-ala-IL2 ou KS-ala-IL2 (N88R) diluídos em 200 pL de PBS. Os animais foram sacrificados cerca do dia 27, e os pulmões foram dissecados e fixados em solução de Bouin. Avaliou-se a extensão das metástases nos pulmões através da pontuação da percentagem de área superficial coberta por metástases e através do peso pulmonar.

Os pulmões do grupo de controlo exibiram mais de 96% da sua área superficial coberta por metástases, e um aumento de 46 aproximadamente cinco vezes do peso pulmonar (0,75 g) relativamente a um pulmão normal. Em contraste, os pulmões de ratinhos tratados com huKS-ala-IL2 estavam cobertos com metástases de forma mínima (5,6%), e os de ratinhos tratados com huKS-ala-IL2(N88R) estavam virtualmente livres de metástases (0%) . Os pulmões de animais tratados com huKS-ala-IL2 e huKS-ala-IL2(N88R) tinham peso normal. Em consequência, a huKS-ala-IL2(N88R) demonstrou ser tão eficaz quanto a huKS-ala-IL2 no tratamento das metástases pulmonares a qualquer dose muitas vezes inferior ao limite que teria afetado a sua sobrevivência.

Exemplo 8: Variantes KS-IL2 em terapia de combinação

Investigou-se o efeito da administração de uma variante KS-IL2 de baixa toxicidade, como huKS-ala-IL2(N88R), em conjunção com um segundo agente imunomodulador para o tratamento de tumores, empregando o modelo de tumor subcutâneo LLC/KSA em ratinhos como descrito no Exemplo 7b. a) Variantes huKS-ala-IL2 e ciclofosfamida. Para a terapia de combinação administrou-se ciclofosfamida pela via intraperitoneal a uma dose de 75 mg/kg no dia 0, altura em que a dimensão média dos tumores perfez 90 mm3, tendo-se seguido uma administração diária da proteína de fusão durante cinco dias (no dia 1 até ao dia 5) . A huKS-ala-IL2 (N88R) foi administrada a uma dose de 20 pg ou de 100 pg. Condições de controlo incluíram animais pseudotratados e animais tratados com huKS-ala-IL2 isolada a uma dose de 20 pg, ou com huKS-ala-IL2 (N88R) isolada a uma dose de 20 pg ou de 100 pg. Os tumores em animais pseudotratados tinham progredido para cerca de 5000 mm3 pelo dia 19, ao passo que tumores de ratinhos tratados com huKS-ala-IL2 tinham cerca de 2200 mm3, e de ratinhos tratados com 20 pg 47 ou 100 μg de huKS-ala-IL2 (N88R) tinham cerca de 2600 mm3 e 1700 mm3, respetivamente. A coadministração de ciclofosfamida deu origem a um tumor de 1700 mm3 à dose de 20 pg de huKS-ala-IL2 (N88R) e de 1250 mm3 à dose mais elevada, significativamente menor do que o tratamento com huKS-ala-IL2 isolada. b) Variantes huKS-ala-IL2 e indometacina. Para a terapia de combinação administrou-se indometacina oralmente a uma dose de 35 pg/ratinho/dia juntamente com uma administração diária da proteína de fusão durante cinco dias (dia 1 até ao dia 5) . A média dos tumores foi inicialmente 90 mm3. A huKS-ala-IL2 (N88R) foi administrada a uma dose de 20 pg. Condições de controlo incluíram animais pseudotratados e animais tratados com huKS-ala-IL2 isolada a uma dose de 20 pg, ou com huKS-ala-IL2(N88R) isolada a uma dose de 20 pg. Os tumores em animais pseudotratados tinham progredido para cerca de 5000 mm3 pelo dia 19, ao passo que tumores de ratinhos tratados com huKS-ala-IL2 tinham cerca de 2200 mm3, e de ratinhos tratados com 20 pg de huKS-ala-IL2(N88R) tinham cerca de 2 600 mm3 e 17 00 mm3, respetivamente. A coadministração de indometacina deu origem a um decréscimo da dimensão tumoral para 850 mm3 à dose de 20 pg de huKS-ala-IL2(N88R), um tumor significativamente menor do que o obtido por tratamento com huKS-ala-IL2 isolada.

Exemplo 9: Variantes KS-IL2 com vim índice terapêutico melhorado

Constroem-se variantes KS-IL2 com mutações em posições particulares na sequência da IL-2. Por exemplo, criam-se substituições em posições de interface provável com a subunidade α do recetor da IL-2. Um resíduo adequado é, por exemplo, F42 na sequência madura da huIL-2. Pensa-se que a 48 estrutura de anel aromático deste aminoácido estabiliza a conformação local da IL-2 (Mott et al., JMB 1995, 247: 979) e verifica-se que substituições nesta posição, por exemplo, com Y, A ou K na imunocitoquina, conduzem a uma molécula com afinidade e bioatividade para recetores da IL-2 progressivamente decrescidas. Estas moléculas são testadas em animais, e verifica-se que se obtém um aumento do índice terapêutico no tratamento de tumores em comparação com a forma inalterada da imunocitoquina. Outras substituições que são eficazes localizam-se nas posições R38 e K43.

Outras substituições na porção IL-2 da imunocitoquina localizam-se numa região de interface provável com a subunidade β, por exemplo, na posição E15 ou L19 da hu IL-2 madura. Quando estes resíduos são mutados, por exemplo, em A ou R na imunocitoquina, verifica-se que as imunocitoquinas variantes têm afinidade decrescida para a subunidade β do recetor da IL-2 em comparação com a forma inalterada da imunocitoquina. Geralmente verifica-se que os efeitos com substituições para R são mais graves do que com substituições para A, o que pode estar relacionado com o carácter volumoso da cadeia lateral de R. Estas moléculas são testadas em animais, e verifica-se que se obtém um aumento do índice terapêutico no tratamento de tumores em comparação com a forma inalterada da imunocitoquina. Introduzem-se outras substituições nas posições D48 e V91, e também se verifica que são eficazes no aumento do índice terapêutico.

Uma substituição na porção IL-2 da imunocitoquina que provavelmente afeta uma região de interface da molécula com a subunidade γ do recetor da IL-2 é introduzida na posição NI19 da hu IL-2 madura. Uma variante de imunocitoquina mais 49 subtil é criada com uma mutação para A, e é criada uma mutação mais disruptiva com uma mutação para R. 0 efeito destas variantes é testado em animais com tumores, e verifica-se que estas imunocitoquinas variantes têm um indice terapêutico melhorado em comparação com a forma inalterada da imunocitoquina.

Também se verifica que se pode obter um aumento do índice terapêutico gerando múltiplas mutações na imunocitoquina IL-2, particularmente para moléculas onde mutações únicas na imunocitoquina exibiram um aumento apenas marginal ou desprezável do índice terapêutico. Por exemplo, verifica-se que uma imunocitoquina contendo a combinação F42A com L19A, ou L19A com N119A, é mais eficaz do que qualquer das variantes de imunocitoquinas isoladas. Para uma aplicação envolvendo múltiplas mutações é particularmente útil utilizar mutações que diminuem a dimensão da cadeia lateral de um aminoácido. Outra substituição introduzida na porção IL-2 da imunocitoquina localiza-se em T51 da huIL-2 madura. Enquanto uma mutação para A não exibe uma melhoria do índice terapêutico, a mutação para P cria uma imunocitoquina com índice terapêutico melhorado, quando comparada com a forma inalterada da imunocitoquina, no tratamento de tumores.

Exemplo 10: Variante da proteína de fusão Ig-IL2 huKS-ala-IL2(D20T) e seus derivados

Geraram-se variantes baseadas em Ig-IL2(D20T), que contém a substituição de um aspartato numa treonina na posição 20 da huIL-2 madura. Estas variantes contêm substituições adicionais no domínio Ig, tal como na porção Fc ou nos domínios de direcionamento do anticorpo. Para gerar as construções de DNA que codificam estas moléculas seguiram- 50 se procedimentos essencialmente como descrito no Exemplo 1, utilizando uma abordagem de PCR com "primers" específicos para a construção para introduzir a mutação e estratégias de clonagem apropriadas, familiares para os razoavelmente peritos na área. a) huKS-ala-IL2(D20T). Para introduzir a mutação D20T utilizou-se uma abordagem de mutagénese por PCR com o "primer" set 5'-CAGCTG€AACTCMjAOCAICTCCTOCTGACCCTCCAOÃTOÁTrCT6AAT -3* (o s nucleótidos a cheio indicam o codão substituído) (SEQ ID NO: 28) e "primer" T3 (5' - ATTAACCCTCÀCrAAAGGGA -3') (SEQ ID NO: 29), o fragmento de DNA foi amplificado a partir de DNA de huIL-2 de tipo selvagem num plasmídeo pBS e foi inserido num vetor TA (Invitrogen) para gerar TA-IL2(D20T). A mutagénese foi verificada por sequenciação. Para substituir a sequência IL-2 original na huKS-ala-IL2, um fragmento PvuII/XhoI de 385 bp de TA-IL2(D20T) foi clonado no plasmídeo de imunocitoquinas paterno numa reação de ligação tripla. A proteína de fusão foi expressa e purificada essencialmente como descrito no Exemplo 3. As sequências de aminoácidos correspondentes às regiões variáveis da cadeia pesada e leve de hu-KS estão apresentadas nas SEQ ID NOs: 30 e 31, respetivamente.

Geraram-se outras variantes de huKS-ala-IL2(D20T) incorporando o mesmo fragmento derivado por PCR em diferentes cadeias principais plasmídicas.

d) dI-KS-ala-IL2(D20T). Foi previamente descrita uma versão de KS-ala-IL2 com uma alteração que remove um epítopo de células T potencial. A proteína de fusão foi expressa e purificada essencialmente como descrito no Exemplo 3. A 51 sequência de aminoácidos correspondente à cadeia pesada do anticorpo dl-KS fundido à variante IL2(D20T) está ilustrada na SEQ ID NO: 32. As SEQ ID NO: 33 e 34 correspondem às regiões variáveis da cadeia pesada e cadeia leve de dl-KS, respetivamente. c) dI-KS-ala-IL2(D20T) desglicosilada. Efetuou-se desglicosilação enzimática, empregando N-Glicanase, na proteína dI-KS-ala-IL2(D20T) essencialmente como descrito no Exemplo 2. d) dl-KS (Y4h) (FN>AQ)-ala-IL2 (D20T) . A fração Ig para esta proteína de fusão IL-2(D20T) foi derivada da região constante de uma subclasse de IgG γ4 (SEQ ID NO: 7), que adicionalmente reteve características da região conetora de IgG γΐ (SEQ ID NO: 10). Além disso introduziram-se mutações que removem epítopos de células T potenciais. Adicionalmente, esta proteína de fusão contém a substituição de asparagina em glutamina, que elimina o sítio de glicosilação em Fc (ver Exemplo 4). A substituição concomitante de uma fenilalanina em alanina remove o epítopo de células T potencial. A proteína de fusão foi expressa e purificada essencialmente como descrito no

Exemplo 3. e) dI-NHS76 (γ21ι) -ala-IL2 (D20T) . A fração Ig para esta proteína de fusão IL-2(D20T) foi derivada da região constante de uma subclasse de IgG γ2, que adicionalmente reteve características da região conetora de IgG γ1. Em NHS76, as regiões variáveis de Ig são dirigidas contra epítopos contidos em complexos de DNA-histona e reconhecem especificamente centros necróticos de tumores (Williams et al., PCT WO 00/01822). Também foi introduzida uma mutação 52 que elimina um potencial epitopo de células T na região variável da cadeia leve. Este resíduo, leucinal04, situa-se na junção CDR3 V-J, e foi substituído por uma valina. A proteína de fusão foi expressa e purificada essencialmente como descrito no Exemplo 3. f) dI-NHS76 (γ2ϊι) (FN>AQ) -ala-IL2 (D20T) . Esta proteína, baseada na proteína do Exemplo lOe, contém adicionalmente as mutações que eliminam glicosilação N-ligada em Fc e um epitopo de células T potencial, como descrito no Exemplo lOd. A proteína de fusão foi expressa e purificada essencialmente como descrito no Exemplo 3. Numa forma de realização, proteínas de fusão da invenção incluem a sequência da cadeia pesada da molécula NHS76(Y2h)(FN>AQ) fundida à variante IL2(D20T), como ilustrado na SEQ ID NO: 35, e a sequência das regiões variável e constante da cadeia leve correspondente à SEQ ID NO: 36. No entanto, a região da cadeia pesada da SEQ ID NO: 35 pode ser utilizada em combinação com qualquer região variável ou constante da cadeia leve de IgG. g) dI-NHS76 (γ4ϊι) -ala-IL2 (D20T) . Esta proteína é semelhante à descrita no Exemplo lOe, mas contém uma cadeia pesada derivada da subclasse de IgG γ4 em vez de γ2. A proteína de fusão foi expressa e purificada essencialmente como descrito no Exemplo 3. h) dI-NHS76(Y4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T). Esta proteína, baseada na proteína do Exemplo lOg, contém adicionalmente as mutações que eliminam glicosilação N-ligada em Fc e um epitopo de células T potencial, como descrito no Exemplo lOd. A proteína de fusão foi expressa e purificada essencialmente como descrito no Exemplo 3. Numa forma de 53 realização, proteínas de fusão da invenção incluem a sequência da cadeia pesada da molécula dI-NHS76 (y4h) (FN>AQ) fundida à variante IL2(D20T), ilustrada na SEQ ID NO: 37, e a sequência das reqiões variável e constante da cadeia leve correspondente à SEQ ID NO: 36. No entanto, a reqião da cadeia pesada da SEQ ID NO: 37 pode ser utilizada em combinação com qualquer reqião variável ou constante da cadeia leve de IgG. A fração Ig de uma proteína de fusão da invenção pode incluir domínios de regiões constantes de cadeias pesadas derivados de qualquer subclasse de IgG, incluindo combinações contendo domínios de moléculas IgG derivadas de espécies diferentes. Em conformidade, as proteínas de fusão da invenção podem incluir regiões conetoras derivadas de qualquer subclasse de IgG, por exemplo, uma região conetora derivada de IgG gama 1 (SEQ ID NO: 10) , gama 2 (SEQ ID NO: 11) ou gama 4 (SEQ ID NO: 12).

Atividade de variantes Ig-IL2(D20T) em bioensaios: As proteínas de fusão Ig-IL2(D20T) foram testadas em bioensaios que medem a capacidade de proliferação de células cujo crescimento depende da IL-2, que foi expressa na forma de um valor ED50 (ver Exemplo 4). Os ensaios foram conduzidos em células CTLL-2 murinas ou células Kit-225 humanas (que expressam IL-2Rc^y) , e células TF-1 β humanas ou células NK murinas isoladas (que expressam IL-2R^y) .

Por exemplo, numa experiência representativa verificou-se que, em comparação com huKS-ala-IL2, o valor ED50 para dl-KS-ala-IL2(D20T) em células CTLL-2 contendo IL-2Rc^y permaneceu inalterado, ao passo que, em células TF-Ιβ contendo IL-2R^y, foi aproximadamente 900 vezes mais 54 elevado. Em consequência, a razão ED50, como definida no Exemplo 4, foi cerca de 150, revelando um desvio da seletividade de aproximadamente 750 vezes para células CTLL-2 contendo IL-2Ro^Y em comparação com huKS-ala-IL2. Em comparação com o desvio da seletividade de aproximadamente 20 000 vezes (relativamente a KS-ala-IL2) observado com huKS-ala-IL2(N88R) neste par de linhas de células, a seletividade foi reduzida cerca de 10 até 20 vezes para di-KS-ala-IL2(D20T), que refletiu a resposta proliferativa mensurável obtida de células que expressam IL-2R3y. Esta tendência também foi clara quando se utilizaram células Kit 225 humanas. Como verificado com outras proteínas de fusão de Ig contendo o anticorpo KS, a desglicosilação da porção de anticorpo teve um efeito pequeno mas consistente na redução da atividade da proteína de fusão em células que expressam IL-2Rβγ.

Também se mediu a proliferação celular dependente da IL-2 em variantes Ig-IL(D20T) contendo uma fração de anticorpo diferente. Verificou-se que, em comparação com dl-NHS76(γ2)-ala-IL2, o valor ED50 para dI-NHS76(γ2)-ala-IL2(D20T) em células Kit-225 contendo IL-2Rc^y aumentou 3 vezes, ao passo que, em células TF-Ιβ contendo ΙΤι-2Εβγ, aumentou aproximadamente 230 vezes. A razão ED50 resultante de 350 situou-se na mesma gama foi observada com dl-KS(y4)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) e foi pelo menos 10 vezes menos seletiva do que huKS-ala-IL2(N88R). Apresentam-se resultados representativos na Tabela 4.

Tabela 4

Proteína Razão ED50 TF-ip/CTLL-2 Razão ED50 TF-ip/Kit-225 dl-KS(γ4)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) 150 3000 dl-KS(γ4)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) 5600* dI-NHS76(γ2)-ala-IL2(D20t) 350 55 * = média de lotes diferentes

Farmacocinética de variantes Ig-IL2(D20T): Para avaliar a interação de variantes Ig-IL2 com recetores Fc da superfície celular avaliou-se a ligação das proteínas de fusão Ig-IL2 a recetores FcyR numa ELISA à base de células, utilizando células U937. As proteínas de fusão (huKS-ala-IL2, dI-huKS-ala-IL2, dI-KS-ala-IL2(D20T) e dl-KS(Y4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T)) foram diluídas 2 vezes numa gama desde 100 pg/mL até 780 ng/mL, foram incubadas com as células e detetou-se a ligação utilizando F(ab')2 de Ab Fc de IgG anti-humana conjugada a FITC (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) . A concentração da ligação semimáxima de huKS-ala-IL2 e dI-KS-ala-IL2 para estas células foi cerca de 5 pg/mL e, de modo interessante, aumentou duas vezes com a proteína dI-KS-ala-IL2(D20T) . Apesar de a introdução da mutação que previne a glicosilação da fração Ig (dl-KS (γ4ϊι) (FN>AQ)-ala-IL2 (D20T) ) ter reduzido 5 a 10 vezes a ligação desta proteína a células U973, a ligação não foi completamente anulada.

Investigaram-se as propriedades farmacocinéticas das variantes Ig-IL2(D20T) em ratinhos essencialmente como descrito no Exemplo 5. Surpreendentemente, em comparação com dI-KS-ala-IL2, a semivida de dI-KS-ala-IL2(D20T) foi drasticamente reduzida. A análise do perfil PK indicou que o efeito foi particularmente dramático durante a fase a: enquanto 50% de dI-KS-ala-IL2 ainda estava disponível passada 1 hora, só estava presente aproximadamente 5% de dI-KS-ala-IL2 (D20T) . Os declives da fase β do perfil PK para estas proteínas foram semelhantes. Um perfil PK essencialmente idêntico ao observado com dl-KS-ala-IL2 (D20T) foi obtido com a proteína de fusão dI-NHS76 (γ2ϊι) - 56 ala-IL2 (D20T) , que contém uma IgG da subclasse γ2, que normalmente exibe a menor afinidade de ligação para FcR. Assim, o efeito da fração proteica IL2(D20T) na proteína de fusão não se limitou ao anticorpo dl-KS.

Observou-se geralmente que a desglicosilação de uma proteína de fusão de Ig tem o efeito de aumentar a fase α de um perfil PK. Em consequência, investigou-se o efeito da desglicosilação enzimática de dI-KS-ala-IL2(D20T) no perfil PK. De facto, a fase α do perfil PK foi essencialmente restabelecida para a que havia sido observada com dl-KS-ala-IL2. Obteve-se o mesmo efeito quando a glicosilação foi anulada por mutagénese, tal como na proteína de fusão dl-KS(Y4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T). Assim, é provável que o efeito no perfil PK se deva a ligação reduzida de FcR.

Toxicidade de variantes Ig-IL2(D20T): Comparou-se a toxicidade da variante de Ig-IL2 (D20T) KS (γ41ι) (FN>AQ)-ala-IL2(D20T) com a de di-KS-ala-IL2 em ratinhos Balb/C, como descrito no Exemplo 6.

Ambas as proteínas de fusão exibiram uma semivida no soro semelhante em ratinhos. A dl- (γ41ι) (FN>AQ)-ala-IL2 (D20T) foi administrada em cinco doses diárias de 100 pg/ratinho, 200 pg/ratinho ou 400 pg/ratinho, ao passo que a dI-KS-ala-IL2 foi administrada em cinco doses diárias de 40 pg/ratinho. Verificou-se que os ratinhos sobreviveram mesmo a uma dose de 400 pg/ratinho de dl-KS(y4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T), ao passo que ratinhos de controlo, que receberam um décimo da dose de di-KS-ala-IL2, tinham morrido pelo dia 6. Os pesos corporais dos ratinhos tratados com dl-KS (γ4ϊι) (FN>AQ)-ala-IL2(D20T) foram ligeiramente afetados, diminuindo de modo transitório para 97% do peso inicial no dia 7. Uma 57 diferença de mais de 10 vezes na dose tolerada pode indicar uma melhoria substancial do índice terapêutico.

Eficácia de variantes Ig-IL(D20T) para o tratamento de tumores: Avaliou-se a eficácia de variantes Ig-IL2(D20T) em ratinhos Balb/C com um tumor subcutâneo derivado de células CT26/KSA, como descrito no Exemplo 7a. A proteína de fusão dl-KS (γ4ϊι) (FN>AQ) -ala-IL2 (D20T) foi administrada a doses de 15 pg/ratinho e 30 pg/ratinho. Os tumores começaram com uma dimensão média de 126 mm3 e atingiram dimensões entre 1800 mm3 e 5000 mm3 pelo dia 28. Os tumores em ratinhos tratados com 15 pg/ratinho de dl-KS-ala-IL2 cresceram para uma dimensão média de 355 mm3, ao passo que tumores em ratinhos tratados com 15 pg/ratinho de dI-KS-ala-IL2(D20T) atingiram uma dimensão média de 2250 mm3. Isto deveu-se muito provavelmente à fraca PK da molécula. Tumores em ratinhos tratados com dl-KS (y4h) (FN>AQ)-ala-IL2 (D20T) à dose mais baixa de 15 pg/ratinho cresceram um pouco para uma dimensão média de 1450 mm3; no entanto, enquanto os tumores da dose de 30 pg/ratinho atingiram uma dimensão média de 950 mm3, de modo significativo, em mais de metade dos ratinhos os tumores não cresceram de modo apreciável. Assim, a doses aumentadas, a dl-KS(y4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) teve um efeito significativo na inibição do crescimento tumoral. De facto, a dose utilizada nesta experiência foi pelo menos 12 vezes menor do que uma dose máxima tolerada para esta molécula e, assim, é provável que tenha um índice terapêutico melhorado relativamente a huKS-ala-IL2 que, comparativamente, foi administrada a um terço até metade da dose máxima tolerada. 58

Exemplo 11: Afinidades relativas de proteinas de fusão de IL-2 de tipo selvagem e mutantes para diferentes recetores da IL-2 A afinidade diferencial das várias proteinas de fusão da invenção para um recetor IL-2R^y relativamente a um recetor IL-2Rc^y pode ser medida por qualquer ensaio, como um radioimunoensaio. Números iguais de células que expressam o recetor IL-2Rc^y ou células que expressam o recetor IL-2Rβγ são plaqueados em placas de plástico. Efetua-se uma diluição em série com uma quantidade igual da proteína de fusão de IL-2 de tipo selvagem ou mutante adicionada a números iguais de células que expressam o recetor Ιύ-2ύαβγ ou células que expressam o recetor IL-2Rβγ, para se obter uma curva padrão. As proteínas de fusão não ligadas são removidas por lavagem e deteta-se a quantidade de proteína de fusão ligada a cada tipo de célula com um ligando etiquetado de modo radioativo. No caso de uma proteína de fusão Fc-IL-2, o ligando pode ser uma molécula como proteína A de estafilococos, que se liga à porção Fc de uma IgG. 0 ligando também pode ser outro anticorpo que reconhece uma porção de uma subclasse particular da molécula IgG, por exemplo, anticorpos para regiões constantes de IgG gama 1, IgG gama 2 ou IgG gama 4. 0 ligando não ligado é removido por lavagem e mede-se, num contador gama, a radioatividade da placa contendo células que expressam IL-2Roí3y ligadas à proteína de fusão de IL-2 de tipo selvagem; células que expressam Ιύ-2αβγ ligadas à proteína de fusão de IL-2 mutante; células que expressam Ιύ-2Αβγ ligadas à proteína de fusão de IL-2 de tipo selvagem ou células que expressam Ιύ-2Αβγ ligadas à proteína de fusão mutante. Os dados obtidos do ensaio de ligação são normalizados para tomar em consideração o número de células e recetores expressos nas células. 59

Ainda noutro ensaio, as próprias proteínas de fusão podem ser etiquetadas, de modo radioativo ou não radioativo, utilizando uma variedade de técnicas bem conhecidas na área. De modo semelhante ao ensaio descrito acima para um ligando etiquetado, a proteína de fusão etiquetada de tipo selvagem ou mutante é adicionada a número igual de células plaqueadas, e mede-se a quantidade de proteína de fusão etiquetada. A afinidade de ligação de uma proteína de fusão para um recetor particular é medida pela razão entre a concentração do ligando ligado ou proteína de fusão ligada, como descrito acima, e o produto da concentração de ligando não ligado ou proteína de fusão não ligada e a concentração total da proteína de fusão adicionada a cada reação. Em comparação com uma proteína de fusão de IL-2 de tipo selvagem, certas mutações na fração IL-2 alteram a afinidade relativa da proteína de fusão para um recetor IL-2Κβγ e um recetor ΙΕ-2Καβγ. 60 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Gillies, Stephen <120> Imunocitoquinas com Seletividade Modulada

<130> LEX-020PC <150> 60/337,113 <151> 2001-12-04 <150> 60/371,966 <151> 2002-04-12 <160> 37 <170> Patentln versão 3.1

<210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de IgG gama 1 <4 0 0> 1 SM lyy A#a sar Thí· "Fysr 1 5

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<210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial 69 <22 0> <223> Região conetora de IgG gama 1 <4 0 0> 10

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<210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Região conetora de IgG gama 2 <400> 11 <*1« &tg í.y» Cys Cys Vai «31u Cys Fr® Fra· Cy® Fr® x. s k;

<210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Região conetora de IgG gama 4 <400> 12 slu set Lye Tyr $!y Wte> Pto Cye Fro Sssr Cys í>» i $ l;> <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial humana Eírçs Cys humana humana 70 <22 0> <223> Terminal C de regiões constantes de Ig G gama 1 e gama 2 <4 0 0> 13 I»y* ser Ley. ser Leií ser Fre siy hys <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Terminal C da região constante de IgG gama 4 <4 0 0> 14

Isys Ser Ser L-iSU ser Leu sly I»ya 1 s <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> terminal C mutado de regiões constantes de IgG gama <4 0 0> 15

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<210> 16 <211> 32 <212> DNA 71 <213> Sequência Artificial <22 0> <223> "primer" sentido para gerar a proteína de fusão huKS-ala-IL2 (N88R) <400> 16 egccccaact «a 32

<210> 17 <211> 53 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> "primer" antissentido para gerar a proteína de fusão huKS-ala-IL2(N88R) <4 0 0> 17 &geecfcçK.ag attseerttga tcctgctgat taagtççct» ggt S3

<210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> segundo "primer" sentido <4 0 0> 18 isgttcfcggse ctsáagggct 40 <210> 19 72

<211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sequência mutante na variante huKS Ml IL-2 <4 0 0> 19

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<210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sequência da junção anticorpo-IL-2 <400> 20 fcys Ser Leu Ser Leu Ser Pr® Qly ais Ais Pra jter 1 5 13

<210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sequência da junção anticorpo-IL-2 mutante <400> 21

Ser Ais* Thr Ale Thr Pre aly Ale Ale »r® Thr 1 S 13 73 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sequência na variante huKS M1-IL2 <4 0 0> 22 Αΐφ :£>«uí 11« Ssí: fosít TÀ 1 s <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sequência mutante na variante huKS M1-IL2 <4 0 0> 23 Asp T&r Tta Ê&jr ftspg Ϊ1® <210> 24 <211> 43 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> "primer" sentido para gerar a mutação N88R <4 0 0> 24 tagfgracsce seeagcaggs tssasgtsst agt 43 74

<210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> "primer" antissentido para a mutação N88R <400> 25 s&estfcgEetf g&E.eeefc.e 5.6

<210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> mutação N em Q no domínio CH2 da região constante de Fc de gama 1 <400> 26

Sln Tyr (31» Thr TjfT Arg 1 5

<210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> mutação FN em AQ na porção Fc de regiões constantes de gama 2 ou 4 75

<4Ο0> 27 <31« ΛΙλ Qlrí Ser ΤS 1 S

<210> 28 <211> 48 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> "primer" sentido para a mutação D20T <4 0 0> 28 ç&gefcgcaae t.gga#c«tcfc çc&sçtgsçe: etee&gtóga fefccfcgsat 48 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> "primer" antissentido para a mutação D20T <4 0 0> 29 attaaceetc 20 <210> 30 <211> 116 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0>

<223> região variável da cadeia pesada de hu-KS 76 <400> 30 çlft xle eia teu v«l ei» 8*r «ly Ala Sííí vai hy* ay* fro siy alu X $ 18 is

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leve de hu-KS <400> 31 77

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<210> 32 <211> 579 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> fundida a <223> cadeia pesada de dl-KS-ala IL2 (D20T) variante da IL-2 <400> 32

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cadeia pesada de dl-KS <400> 33ela 51« ela s**a vai eis ser1 s

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<212> PRT 87 <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia pesada de dI-NHS76(gama4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) fundida a variante da IL2 <400> 37

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Lisboa, 15 de Março de 2012

Claims

REIVINDICAÇÕES Proteína de fusão compreendendo uma fração de domínio de anticorpo fundida a uma fração de IL-2 mutante, em que a fração de IL-2 mutante compreende uma substituição de aminoácidos que altera um ácido aspártico numa treonina numa posição correspondente à posição 20 (D20T) da sequência de aminoácidos da proteína IL-2 humana madura apresentada na SEQ ID NO: 3, em que a proteína de fusão exibe maior seletividade, do que uma proteína de referência, para células que expressam um recetor de afinidade elevada, em que a referida proteína de referência compreende a fração de domínio de anticorpo fundida a uma fração de IL-2 não mutante, e em que a referida seletividade é medida na forma de uma razão de ativação de células que expressam o recetor IL-2Rc^y relativamente à ativação de células que expressam o recetor IL-2RPy.
Proteína de fusão da reivindicação 1, em que a referida seletividade para células que expressam um recetor de afinidade elevada se situa entre 0, 1% e 100% da seletividade de uma proteína de fusão de referência compreendendo a fração de domínio de anticorpo fundida a uma fração de IL-2 humana mutante que compreende a substituição de aminoácidos asparagina em arginina numa posição correspondente à posição 88 (N88R) da sequência de aminoácidos da proteína IL-2 humana madura apresentada na SEQ ID NO: 2
3. Proteína de fusão da reivindicação 2, em que a referida seletividade se situa entre o\o \—1 O e 30% da seletividade da referida proteína de fusão de referência.
4. Proteína de fusão da reivindicação 2, em que a referida seletividade se situa entre o\o \—1 O e 20% da seletividade da referida proteína de fusão de referência.
5. Proteína de fusão da reivindicação 2, em que a referida seletividade se situa entre 2% e 20% da seletividade da referida proteína de fusão de referência.
6. Proteína de fusão da reivindicação 1, em que as células que expressam o recetor IL- 2]3αβγ são selecionadas do grupo que consiste em células CTLL2, Kit 225 e células T maduras.
7. Proteína de fusão da reivindicação 1, em que as células que expressam o recetor IL -2Rpy são selecionadas do grupo que consiste em células TF-Ιβ e células NK.
8. Proteína de fusão da reivindicação 1, em que mais do que uma posição de aminoácidos na fração de IL- -2 estão mutadas.
9. Proteína de fusão da reivindicação 1, em que o referido domínio de anticorpo está mutado. 3
10. Proteína de fusão da reivindicação 1 ou 9, em que o domínio de anticorpo é selecionado do grupo de anticorpos que consiste em KS-1/4, dl-KS, dl-KS (γ4ϊι) (FN>AQ) , huKS, huKS (N em Q) , dI-NHS76 (y2h) , dl-NHS (γ4ϊι) dI-NHS7 6 (Y2h) (FN>AQ) , dI-NHS7 6 (y4h) ( FN>AQ) e 14.18.
11. Proteína de fusão anticorpo-IL2 da reivindicação 10 selecionada do grupo que consiste nas seguintes: KS-ala-IL2(D20T) KS(Y4h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) NHS76(y2h)-ala-IL2(D20T) NHS76(Y2h)(FN>AQ)-ala-IL2(D20T) NHS76(γ2)-ala-IL2(D20T).
12. Utilização de uma proteína de fusão de qualquer uma das reivindicações 1-11 para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de tumores.
13. Proteína de fusão de qualquer uma das reivindicações 1 - 11 para utilização no tratamento de tumores. Lisboa, 15 de Março de 2012