JPH11508895A - 糖尿病を処置する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、肥満性II型糖尿病患者の糖尿病を処置する方法を記載するものである。特に、様々な体内レプチンレベルを伴う肥満性II型糖尿病患者を処置する方法が特許請求される。

Description

【発明の詳細な説明】 糖尿病を処置する方法 真性糖尿病は、身体組織が炭水化物を正常な比率で蓄積することができないこ とを特徴とする代謝性疾患である。インシュリンの作用に対する抵抗性が、II型 糖尿病の最も重要な因子である。この抵抗性が、β細胞のインシュリン産生能力 を超える時、人は糖尿病になる。ここ７０年間の間、糖尿病に罹患している人々 は、制御された量のインシュリンを投与されることにより、非常に助けられてき た。 肥満、とりわけ上体肥満は、しばしばインシュリン非依存性真性糖尿病（ＮＩ ＤＤＭ）に結びついている。これらのいわゆるII型糖尿病患者は、β細胞が、し ばしば低レベルではあるにせよインシュリンを分泌することができるため、イン シュリンが絶対的に必要である訳ではない。さらに、このような患者はしばしば 肥満しており、インシュリンに対する応答不能性を示すかも知れない。 体重減少につながる食事および運動療法が、肥満性II型糖尿病患者の処置のた めの最良のアプローチであるという事は良く知られている。都合の悪いことに、 これらの療法は通常成功しない。減量の失敗は、亢進した食欲、高カロリー食物 への嗜好、少ない身体活動、および亢進した脂質生成代謝に寄与する、遺伝的に 受け継がれた因子によるかも知れない。このような遺伝的素因を受け継いでいる 人々は、その状況と戦おうとする彼等の努力にも拘わらず、肥満傾向があり、し ばしばII型糖尿病となる。ob/obマウスは、第六染色体の突然変異と連鎖した常 染色体劣性素質を持っていることが知られている、肥満および糖尿病のモデルで ある。近年、イイング・ザングおよび共同研究者は、この条件と連鎖した該マウ スの遺伝子（ｏｂ）の位置クローニングを公表した。イイング・ザング等、Natu re、３７２巻４２５−３２頁（１９９４）。この報告は、専ら脂肪組織で発現さ れる、２１アミノ酸シグナルペプチドを有する１６７アミノ酸蛋白（以後レプチ ンと称する）をコードしている遺伝子を開示した。 肥満個体中のレプチンの循環レベルは大きく異なっていることが示されている 。 その結果、現在では、肥満性II型糖尿病患者の集団は特にレプチンによる処置に 反応し易いと信じられている。故に、生物活性であり、且つレプチンに活性が類 似する薬理学的物質は、肥満性II型糖尿病患者、特に循環レプチンのレベルが異 常に高いまたは低い患者の処置に有用である。 本発明の一つの態様は、肥満性II型糖尿病患者に、レプチン、擬似レプチン、 またはその薬学上許容し得る塩の有効量を投与することを含む、糖尿病を処置ま たは防止する方法である。好ましい態様において、本発明は、レプチンの体内レ ベルが低い肥満性II型糖尿病患者を処置する方法を包含する。 肥満とは、その個体が１立方メートル当たり２７ｋｇより大きい身体質量指数 を有する状態を指す。 レプチンとは、転写およびイントロンの除去、蛋白への翻訳および分泌シグナ ルペプチドが除去された成熟蛋白へのプロセシングの後の肥満遺伝子から産生さ れた蛋白、例えば成熟蛋白のＮ末端バリン−プロリンからＣ末端システインまで を指す。マウスおよびヒトレプチン蛋白配列は、ザング等、Nature、３７２巻４ ２５−３２頁（１９９４）に公表されている。ラットのレプチン配列は、ムラカ ミ等、Biochemical and Biophysical Research Comm.、２０９（３）巻９４４− ５２頁（１９９５）に公表されている。ヒト、マウスおよびラットのレプチンで は、ジスルフィド形成を伴うＣｙｓは９６および１４５位である。しかし、特に マウスおよびヒトレプチンには、ｄｅｓＧｌｎ（２８）変異体が観察されている 。よって、ジスルフィド結合の形成を伴うＣｙｓ残基は９５または９６位および １４５または１４６位であるかも知れない。レプチンはまた、本明細書全体を通 じ、肥満蛋白、ＯＢ、またはｏｂ遺伝子産物と呼称されるかも知れない。故にレ プチンは配列番号１−６を包含する。 当業者には、或る種のアミノ酸は再編成を受け易いことが理解できるであろう 。例えば、Ａｓｐは、Ｉ.シェーン等、International Journal of Peptide and Protein Research、１４巻４８５−９４頁（１９７９）およびその引用文献に記 載されるように、アスパルチミドおよびイソアスパリジンに再編成され得る。こ れらの再編成誘導体は、本発明の範囲内に包含される。別途指摘の無い限り、ア ミ ノ酸はＬコンフィグレーションである。 ここに特許請求される方法において有用な好ましいレプチンの型は、天然配列 である。ヒトレプチンの使用がより好ましい。本方法での使用において最も好ま しいレプチンは、配列番号１−６の蛋白を包含する。 マウスレプチン 配列番号１ ［式中、２８位のＸａａはＧｌｎであるかまたは存在しない］ ブタレプチン 配列番号２ ウシレプチン 配列番号３ ［式中、２８位のＸａａはＧｌｎであるかまたは存在しない］ ヒトレプチン 配列番号４ ［式中、２７位のＸａａはＴｈｒまたはＡｌａであり；そして、 ２８位のＸａａはＧｌｎであるかまたは存在しない］ アカゲザルレプチン 配列番号５ ラットレプチン 配列番号６ 上に特定される蛋白配列に加えて、１または２アミノ酸リーダー配列、特にメ チオニンを含むリーダーを有する抗糖尿病蛋白を製造することがしばしば能率的 であると考えられる。頻繁に使用される二つのリーダーはＭｅｔ−Ａｒｇおよび Ｍｅｔ−Ａｓｐである。このような蛋白は、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−レプチンまたはＭ ｅｔ−Ａｓｐ−レプチンとして下に特定することができ、またはＭｅｔ−Ａｒｇ −配列番号Ｘ［ここでＸは１ないし６である］として特定することができる。 擬似レプチンおよびフラグメントもまた本発明方法において有用である。擬似 レプチンは一般に式（Ｉ）（配列番号７）により以下のように定義される： ［式中、 ２２位のＸａａはＡｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり； ２７位のＸａａはＴｈｒまたはＡｌａであり； ２８位のＸａａはＧｌｎ、Ｇｌｕであるかまたは存在せず； ５４位のＸａａはＭｅｔまたはＡｌａであり； ６８位のＸａａはＭｅｔまたはＬｅｕであり； ７２位のＸａａはＡｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり； ７７位のＸａａはＳｅｒまたはＡｌａであり； １１８位のＸａａはＧｌｙまたはＬｅｕであり； 該蛋白は、 ９７位のＨｉｓがＳｅｒまたはＰｒｏで置換され； １００位のＴｒｐがＧｌｎ、ＡｌａまたはＬｅｕで置換され； １０１位のＡｌａがＴｈｒまたはＶａｌで置換され； １０２位のＳｅｒがＡｒｇで置換され； １０３位のＧｌｙがＡｌａで置換され； １０５位のＧｌｕがＧｌｎで置換され； １０６位のＴｈｒがＬｙｓまたはＳｅｒで置換され； １０７位のＬｅｕがＰｒｏで置換され； １０８位のＡｓｐがＧｌｕで置換され；または、 １１１位のＧｌｙがＡｓｐで置換されている、 より成る群から選ばれる少なくとも一つの置換を有する］。 好ましくは擬似レプチンは以下の式（II）（配列番号８）で示されるものであ る： ［式中、 ２７位のＸａａはＴｈｒまたはＡｌａであり； ７７位のＸａａはＳｅｒまたはＡｌａであり； １１８位のＸａａはＧｌｙまたはＬｅｕであり； 該蛋白は、 ９７位のＨｉｓがＳｅｒで置換され； １００位のＴｒｐがＧｌｎで置換され； １０１位のＡｌａがＴｈｒで置換され； １０５位のＧｌｕがＧｌｎで置換され； １０６位のＴｈｒがＬｙｓで置換され； １０７位のＬｅｕがＰｒｏで置換され； １０８位のＡｓｐがＧｌｕで置換され；または、 １１１位のＧｌｙがＡｓｐで置換されている、 より成る群から選ばれる少なくとも一つの置換、好ましくは１ないし５個の置換 、そして最も好ましくは１ないし２個の置換を有する］。 本発明に係る好ましい蛋白の例は、配列番号８［式中、２７位のＸａａはＴｈ ｒであり；７７位のＸａａはＳｅｒであり；１１８位のＸａａはＧｌｙであり； そして９７、１００、１０１、１０５、１０６、１０７、１０８、および１１１ 位のアミノ酸残基は第Ｉ表に示される通りである］で示される蛋白を包含する。 本発明方法に使用される蛋白との比較として天然ヒト配列を提示する。 その他の好ましい蛋白は、２７位のＸａａがＡｌａであり；７７位のＸａａが Ｓｅｒであり；１１８位のＸａａがＧｌｙであり；そして９７、１００、１０１ 、１０５、１０６、１０７、１０８、および１１１位のアミノ酸残基が第Ｉ表に 記載される通りである蛋白である。 本発明は、肥満性II型糖尿病患者のための有効な処置を提供する、生物活性蛋 白を提供する。意外なことに、第Ｉ表のレプチン蛋白は、ヒト肥満蛋白との特異 的置換により、改善された性質を有する。これらの蛋白はマウスおよびヒト肥満 蛋白の両者より安定であり、故に優れた治療薬となる。 実験は、５ないし６ヶ月齢の雄の同系繁殖体の正常なＩＣＲマウス、同系繁殖 体の正常（ｏｂ／＋）、肥満−糖尿病マウス（ｏｂ／ｏｂ）（ジャクソン・ラボ ラトリーズ（バー・ハーバー、マイン）またはハーラン（英国）より）、および 肥満−糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウスを用いて実施した。 正常のおよび糖尿病のマウスの両方をプラスチックケージ（敷きわら付き）当 たり３または６匹ずつ住まわせ、水および餌を自由に摂取させた。動物室の温度 は２３±２℃に維持し、６時から１８時まで照明を点灯した。血液試料は尾静脈 から採取した。故に、最も密接に関連する生物学的試験は、被験物質を幾つかの 投与経路（例えばi.v.、s.c.、i.p.、またはミニポンプもしくはカニューレによ る）のうちのいずれかによって注射し、次いで、食物および水の消費、体重増加 、血漿化学またはホルモン（グルコース、インシュリン、ＡＣＴＨ、コルチコス テロン、ＧＨ、Ｔ４）を様々な時間にわたって監視することである。適切な試験 動物は、正常マウス（ＩＣＲ等）および肥満マウス（ｏｂ／ｏｂ、Ａｖｙ／ａ、 ＫＫ−Ａｙ、ずんぐりした、肥満の）を包含する。これらの注射の非特異的効果 のための対照は、類似の組成の被験物質有りまたは無しの媒質を使用し同じ動物 で同じパラメータを監視することにより、または、レセプターを欠失すると思わ れ る動物（ｄｂ／ｄｂマウス、ｆａ／ｆａまたはｃｐ／ｃｐラット）において被験 物質自身を使用することにより、実施することができる。 血液のグルコースレベルはグルコースオキシダーゼ法または共役ヘキソキナー ゼ法によって測定した。血漿インシュリンはラットインシュリンを標準として用 いるラジオイムノアッセイキットで測定した。血漿トリグリセリドはグリセロー ルを標準とする市販のキットを用いて測定した。 前述の研究は、レプチンおよび擬似レプチンが、正常ＩＣＲおよび遺伝的に肥 満のｏｂ／ｏｂマウスにおいて食物摂取および体重を調節することを証明した。 ｏｂ／ｏｂマウスへのレプチンおよび擬似レプチンの長期投与は、これらの動物 の糖尿病の状態を完全に改善し、この事は、これら抗糖尿病蛋白の肥満性II型糖 尿病の処置としての見込みの可能性を示すものである。したがって、本発明は、 肥満性II型糖尿病患者、とりわけレプチンの循環レベルの低い患者を処置するた めの方法を提供する。 本発明に係る化合物は、良く知られる化学的方法、例えば溶液もしくは固相ペ プチド合成、または常套的溶液法によって結合させた蛋白フラグメントで始ま溶 液中での半合成によって製造することができる。このような方法は当分野で良く 知られており、H.デューガスおよびC.ペニー、Bioorganic Chemistry、（１９８ １）、５４−９２頁といったような当分野の一般的教科書に見出すことができる 。 本発明で特許請求される方法に役立つ蛋白は、マニアティス等（１９８８）、 Molecular Cloning:A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ プレス、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリン グ・ハーバー、ニューヨーク、またはCurrent Protocols in Molecular Biology （１９８９）および追補に記載のような良く知られる組換えＤＮＡ技術により製 造することもできる。既知の配列を有するＤＮＡの前もって定められた部位に置 換突然変異を作成するための技術、例えばＭ１３プライマー突然変異誘発は良く 知られている。本発明に係る抗糖尿病蛋白をコードしているＤＮＡ中に作られ得 る突然変異は、該配列をリーディングフレーム外に位置させてはならず、好まし くは二次ｍＲＮＡ構造を生成し得る相補領域を作り出さない。デボア等、欧州特 許公開０７５４４４Ａ（１９８３）を参照されたい。 本発明は肥満性II型糖尿病患者を処置する方法を提供する。この方法は、有効 量のレプチンまたは擬似レプチンを、約１および１００００μｇ／ｋｇの間の用 量で投与することを含む。好ましい用量は約２０ないし１００００μｇ／ｋｇで ある。より好ましい用量は約２００ないし６００μｇ／ｋｇである。この方法を 実施するにあたり、抗糖尿病蛋白は一回の日用量または一日当たり複数回の用量 で投与することができる。処置の投与計画は長期にわたる投与を必要とするかも 知れない。投与用量当たりの量または投与される総量は医師により決定され、患 者の質量、患者の年齢および一般健康状態および該化合物に対する患者の耐性と いったような因子に依存するであろう。 本発明はさらに、本発明化合物を含む薬用製剤を提供する。好ましくは薬学上 許容し得る塩の形であるこの蛋白は、非経口投与用に調合することができる。例 えば、化合物を常套的薬用担体および賦形剤と混合することができる。特許請求 されている蛋白を含む組成物は、好ましくは可溶性型で約０．１ないし９０％（ 重量）の活性蛋白、そしてより一般的には約１０ないし３０％の活性蛋白を含有 する。さらに、この蛋白は、単独で、または他の抗肥満薬もしくは糖尿病の処置 に役立つ物質と組み合わせて投与することができる。 静脈内使用のためには、この蛋白を一般に使用される静脈内液体中で投与し、 そして注入によって投与する。筋肉内製剤のためには、無菌調合物、好ましくは 該蛋白の適当な可溶性塩型、例えば塩酸塩を溶解し、発熱性物質を含まない水も しくは生理食塩水のような薬用希釈剤中で投与することができる。該化合物の好 適な不溶性型を製造し、水性塩基または薬学上許容し得る油性基剤、例えばオレ イン酸エチルのような長鎖脂肪酸のエステル中の懸濁液として投与することがで きる。 好ましい態様において、本発明は、レプチンレベルの低い肥満性II型糖尿病患 者を処置するための方法を提供するが、体内レプチンレベルの高い糖尿病患者も またここに特許請求される方法から恩恵を受けることができる。血清および血漿 のレプチンレベルを検定する方法は、標準的な抗体を基礎とする方法論を用いて 達成することができる。レプチン検定キットは、リンコ・リサーチ、Inc．（１ ４リサーチ・パーク・Ｄｒ．、セントルイス、ＭＯ６３３０４）からの市販品も また入手可能である。 レプチンレベルが０および８０ｎｇ／ｍＬの間である肥満性II型糖尿病患者の 処置が好ましい。レプチンレベルが０および５０ｎｇ／ｍＬの間である肥満性II 型糖尿病患者を処置することは、より好ましい。レプチンレベルが０および３０ ｎｇ／ｍＬの間である肥満性II型糖尿病患者を処置することは、さらにずっと好 ましい。レプチンレベルが０および１５ｎｇ／ｍＬの間である肥満性II型糖尿病 患者を処置する事は最も好ましい。 例示によって、本発明の様々な態様を如何に作成し実施するかの記載を助ける ため、以下の実施例を供する。これらの実施例は本発明の範囲を限定することを 意図している訳では決してない。 実施例１ 以下の蛋白配列： Ｍｅｔ−Ａｒｇ−配列番号４ をコードしているＤＮＡ配列を、標準的ＰＣＲ法を用いてヒト脂肪細胞ライブラ リー（クローンテクより市販品が入手可能）から取得した。簡潔に述べると、縮 重プライマーを、公表されているヒトｏｂ遺伝子のアミノ酸配列に基づいて設計 した。このプライマーは、モデル３８０Ａ ＤＮＡ合成機（ＰＥ−アプライド・ バイオシステムズ、Inc.、８５０リンカーン・センター・ドライブ、フォスター ・シティー、ＣＡ９４４０４）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅 法での使用のために製造した。前進プライマーＯＢ．Ｆ１Ｍ（５−ＧＧ ＧＧ Ｃ ＡＴ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＡ ＣＣＴ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＡＡ ＧＴＣ ＣＡＧ ＧＡ Ｔ ＧＡＣ ＡＣ）およびＯＢ．Ｆ２Ｈ（５−ＧＧ ＧＧ ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＡ ＣＣＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＧＡＣ ＧＡ）ならびに逆 プライマーＯＢ．Ｒ１Ｍ（５−ＧＧ ＧＧ ＧＧＡＴＣ ＧＡＴ ＡＡＴ ＴＴＡ Ｇ ＣＡ ＴＣＣ ＡＧＧ ＧＣＴ ＡＡＧ ＡＴＣ ＣＡＡ ＣＴＧ ＣＣＡ ＡＡＧ ＣＡ Ｔ） およびＯＢ．Ｒ２Ｈ（５−ＧＧ ＧＧ ＧＧＡＴＣ ＣＴＡ ＴＴＡ ＧＣＡ ＣＣＣ ＧＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＣＡ ＣＡＡ ＣＡＴ）を、鋳 型としてのＰＣＲ用に準備されたヒト脂肪細胞ｃＤＮＡと混合した（クローンテ ク・ラボラトリーズ、Inc.、４０３０ファビアン・ウェイ、パロ・アルト、ＣＡ ９４３０３；製品＃７１２８−１）。 ２組のＰＣＲ増幅を、反応１００ｕＬ中で、アンプリタグＤＮＡポリメラーゼ （パーキン・エルマー・シータス）２．５単位またはヴェントＤＮＡポリメラー ゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）２単位を用いて実施した。ＰＣＲ反 応は、ヒト脂肪細胞ｃＤＮＡ１ｕＬ、各プライマー１０ｐｍｏｌ（４種全てを混 合した）を含んでいた。「タッチダウンＰＣＲ」のために以下の条件を使用した ：２サイクル：９４℃ｘ３０秒、６０℃ｘ３０秒、７２℃ｘ４５秒；２サイクル ：９４℃ｘ３０秒、５６℃ｘ３０秒、７２℃ｘ４５秒；２サイクル：９４℃ｘ３ ０秒、５２℃ｘ３０秒、７２℃４５秒；２サイクル：９４℃ｘ３０秒、４８℃ｘ ３０秒、７２℃ｘ４５秒；２サイクル：９４℃ｘ３０秒、４４℃ｘ３０秒、７２ ℃ｘ４５秒：２８サイクルの９４℃ｘ３０秒、５２℃ｘ３０秒、７２℃ｘ４５秒 。 得られたＰＣＲ反応生成物を１％アガロースゲル上に流し、およそ４５０ｂｐ のサイズのバンドをエチジウムブロミド染色により可視化した。このバンドはＰ ＣＲ反応の両方の組に存在した。このバンドを切り取り、上の条件を用いて３０ サイクル（９４ｘ３０秒、５２ｘ３０）７２ｘ４５）再増幅した。ヴェントＤＮ Ａポリメラーゼを用いて得られたＰＣＲ生成物をゲル精製し、ｐＣＲ−スクリプ ト・クローニングベクター（ストラタジーン）中にクローニングした。次にこの ベクターを用いて大腸菌細胞を形質転換した。大腸菌の白色コロニー２０個から プラスミドＤＮＡを分離し、３個のクローンからの試料を配列決定した。これら 二つのコロニーＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ／ｐＯＪ７１７およびＥ．ｃｏｌｉ Ｄ Ｈ１０Ｂ／ｐＯＪ７１８は、ブダペスト条約の約定の下にノーザン・リージョナ ル・リサーチ・ラボラトリーズ（ＮＲＲＬ）に寄託され、各々受理番号Ｂ−２１ ４０８およびＢ−２１４０９の下で入手可能である。 実施例２ ベクターの組み立て 所望の蛋白をコードしているＤＮＡ配列を含むプラスミドを、ＮｄｅＩおよび ＢａｍＨＩ制限部位を含むよう組み立てる。クローニングされたＰＣＲ生成物を 持っているプラスミドをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化する。小さな 〜４５０ｂｐフラグメントをゲル精製し、Ａ−Ｃ−Ｂプロインシュリンのコード 化配列が除去されているベクターｐＲＢ１８２中にライゲーションする。ライゲ ーション生成物をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ（市販品が入手可能）中に導入し、 テトラサイクリン１０μｇ／ｍＬを添加したトリプトン−酵母平板上で生育する コロニーを分析する。プラスミドＤＮＡを分離し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで 消化し、得られたフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離する。予想 される〜４５０ｂｐＮｄｅＩないしＢａｍＨＩフラグメントを含むプラスミドを 保存する。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ＢＬ２１（ＤＥ３）を、蛋白産生のための培養に好 適なこの第二のプラスミド発現で形質転換する。 前記のベクターによる細胞の形質転換の技術は当分野で良く知られており、マ ニアティス等、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、 コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー・ ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８８）、 またはカレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（F.オーサ ベル編、１９８９）ならびにそれらの追補といったような一般的文献に見出すこ とができる。本明細書に例示されるような、本発明の好ましい実施で使用される 大腸菌細胞の形質転換に関わる技術は、当分野で良く知られている。形質転換さ れた大腸菌細胞を培養する正確な条件は、その大腸菌宿主細胞の性質および使用 される発現またはクローニングベクターに依存する。例えば、ｃ１８５７熱誘導 性λファージプロモーター−オペレーター領域のような熱誘導性プロモーター− オペレーター領域を含んでいるベクターは、蛋白合成を誘導するために、培養条 件中に約３０℃から約４０℃への温度の移行を必要とする。 本発明の好ましい態様においてはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ３０８細胞を宿主 細胞として使用するが、例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｌ２０１、Ｌ６８７、Ｌ６ ９３、Ｌ５０７、Ｌ６４０、Ｌ６４１、Ｌ６９５、Ｌ８１４（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ ）といったような他の多数のセルラインもまた利用可能である。次いで、形質転 換された宿主細胞を、発現プラスミド上に存在する耐性遺伝子に対応する抗生物 質の選択圧の下に、適当な培地上で平板培養する。次にこの培養を、使用された 宿主セルラインにとって適当な温度および時間でインキュベートする。 高レベル細菌発現系で発現される蛋白は、高レベルの過剰発現された蛋白を含 有する顆粒または封入体中に凝集するという特徴を有する。例えば、クロイガー 等、プロテイン・フォールディング（ギーラッシュおよびキング編、１９９０） の１３６−１４２頁、アメリカン・アソシエーション・フォア・ジ・アドヴァン スメント・オブ・サイエンス・パブリケーション第８９−１８Ｓ、ワシントンD. C.を参照されたい。このような蛋白凝集体は、所望の蛋白生成物のさらなる精製 および分離のために可溶化しなければならない。同著。該蛋白を可溶化するため に、グアニジニウム−ＨＣｌのような強力な変性溶液および／またはジチオトレ イトール（ＤＴＴ）のような弱い変性溶液を用いる様々な技術が使用される。 溶液中の変性剤を徐々に除去（しばしば透析による）すると、変性した蛋白が その天然コンホメーションをとるようにさせることができる。変性および折り畳 みのための個々の条件は、個々の蛋白発現系および／または問題の蛋白により決 定される。 好ましくは、本発明に係る蛋白はＭｅｔ−Ａｒｇ−配列番号Ｘとして発現され 、その結果、発現された蛋白はカテプシンＣ（ジアミノペプチダーゼとしても知 られる）を用いて、特許請求される蛋白へと容易に変換することができる。蛋白 の精製は当分野で知られる技術により、逆相クロマトグラフィー、親和クロマト グラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーを包含する。 特許請求される蛋白は２個のシステイン残基を含む。したがって、ジスルフィ ド結合が形成されて蛋白が安定化するかも知れない。本発明は、９６位のＣｙｓ が１４６位のＣｙｓと架橋している蛋白およびこのようなジスルフィド結合の無 い蛋白を包含する。 さらに、本発明において有用な蛋白は、特に調合される場合、二量体、三量体 、 四量体、およびその他の多量体として存在し得る。このような多量体は本発明の 範囲に包含される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．真性糖尿病を処置または防止するための薬物を製造するためのレプチンま たは擬似レプチンの用途。 ２．該レプチンまたは擬似レプチンが、 （ａ） ［式中、２８位のＸａａはＧｌｎであるかまたは存在しない］(配列番号１); （ｂ） （ｃ） ［式中、２８位のＸａａはＧｌｎであるかまたは存在しない］(配列番号３); （ｄ） ［式中、２７位のＸａａはＴｈｒまたはＡｌａであり；そして、 ２８位のＸａａはＧｌｎであるかまたは存在しない］（配列番号４）； （ｅ） （ｆ） （ｇ） ［式中、 ２２位のＸａａはＡｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり； ２７位のＸａａはＴｈｒまたはＡｌａであり； ２８位のＸａａはＧｌｎ、Ｇｌｕであるかまたは存在せず； ５４位のＸａａはＭｅｔまたはＡｌａであり； ６８位のＸａａはＭｅｔまたはＬｅｕであり； ７２位のＸａａはＡｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり； ７７位のＸａａはＳｅｒまたはＡｌａであり； １１８位のＸａａはＧｌｙまたはＬｅｕであり； 該蛋白は、 ９７位のＨｉｓがＳｅｒまたはＰｒｏで置換され； １００位のＴｒｐがＧｌｎ、ＡｌａまたはＬｅｕで置換され； １０１位のＡｌａがＴｈｒまたはＶａｌで置換され； １０２位のＳｅｒがＡｒｇで置換され； １０３位のＧｌｙがＡｌａで置換され； １０５位のＧｌｕがＧｌｎで置換され； １０６位のＴｈｒがＬｙｓまたはＳｅｒで置換され； １０７位のＬｅｕがＰｒｏで置換され； １０８位のＡｓｐがＧｌｕで置換され；または、 １１１位のＧｌｙがＡｓｐで置換されている、 より成る群から選ばれる少なくとも一つの置換を有する］（配列番号７）；およ び、 （ｈ） ［式中、 ２７位のＸａａはＴｈｒまたはＡｌａであり； ７７位のＸａａはＳｅｒまたはＡｌａであり； １１８位のＸａａはＧｌｙまたはＬｅｕであり； 該蛋白は、 ９７位のＨｉｓがＳｅｒで置換され； １００位のＴｒｐがＧｌｎで置換され； １０１位のＡｌａがＴｈｒで置換され； １０５位のＧｌｕがＧｌｎで置換され； １０６位のＴｈｒがＬｙｓで置換され； １０７位のＬｅｕがＰｒｏで置換され； １０８位のＡｓｐがＧｌｕで置換され；または、 １１１位のＧｌｙがＡｓｐで置換されている、 より成る群から選ばれる少なくとも一つの置換、好ましくは１ないし５個の置換 、そして最も好ましくは１ないし２個の置換を有する］（配列番号８）、 またはそれらの薬学上許容し得る塩もしくは溶媒和物より成る群から選ばれる、 請求項１に記載の方法。 ３．真性糖尿病が高い体内レプチンレベルと結びついている、請求項１または ２のいずれか１項に記載の方法。 ４．真性糖尿病が低い体内レプチンレベルと結びついている、請求項１または ３のいずれか１項に記載の方法。 ５．該肥満性II型糖尿病患者が０ないし８０ｎｇ／ｍＬの範囲の体内レプチン レベルを有する、請求項１または３のいずれか１項に記載の方法。 ６．該肥満性II型糖尿病患者が０ないし５０ｎｇ／ｍＬの範囲の体内レプチン レベルを有する、請求項１または３のいずれか１項に記載の方法。 ７．該肥満性II型糖尿病患者が０ないし３０ｎｇ／ｍＬの範囲の体内レプチン レベルを有する、請求項１または３のいずれか１項に記載の方法。 ８．該肥満性II型糖尿病患者が０ないし１５ｎｇ／ｍＬの範囲の体内レプチン レベルを有する、請求項１または３のいずれか１項に記載の方法。 ９．罹患している患者にレプチンまたは擬似レプチンを投与することを含む、 真性糖尿病を処置または防止する方法。 １０．該レプチンまたは擬似レプチンが、配列番号１、配列番号２、配列番号 ３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８より 成る群から選ばれる、請求項９に記載の方法。 １１．真性糖尿病が高い体内レプチンレベルと結びついている、請求項９また は１０のいずれか１項に記載の方法。 １２．真性糖尿病が低い体内レプチンレベルと結びついている、請求項９また は１０のいずれか１項に記載の方法。 １３．該肥満性II型糖尿病患者が０ないし８０ｎｇ／ｍＬの範囲の体内レプチ ンレベルを有する、請求項９または１０のいずれか１項に記載の方法。 １４．該肥満性II型糖尿病患者が０ないし５０ｎｇ／ｍＬの範囲の体内レプチ ンレベルを有する、請求項９または１０のいずれか１項に記載の方法。 １５．該肥満性II型糖尿病患者が０ないし３０ｎｇ／ｍＬの範囲の体内レプチ ンレベルを有する、請求項９または１０のいずれか１項に記載の方法。 １６．該肥満性II型糖尿病患者が０ないし１５ｎｇ／ｍＬの範囲の体内レプチ ンレベルを有する、請求項９または１０のいずれか１項に記載の方法。 １７．活性成分としてレプチンまたは擬似レプチンを含む、真性糖尿病を処置 または防止するための調合物。 １８．該レプチンまたは擬似レプチンが、配列番号１、配列番号２、配列番号 ３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８より 成る群から選ばれる、請求項１７に記載の調合物。 １９．真性糖尿病が低いまたは高い体内レプチンレベルと結びついている、請 求項１７または１８のいずれか１項に記載の方法。