KR19990028388A - 당뇨병 치료 방법 - Google Patents

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토마스 더블유. 스티븐스
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피터 지. 스트링거
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Abstract

본 발명은 비만성 II형 당뇨병 환자의 당뇨병 치료 방법을 기재한다. 특히, 다양한 농도의 내인성 렙틴을 이용한 비만성 II형 당뇨병 치료 방법을 특허 청구한다.

Description

당뇨병 치료 방법
당뇨병은 정상 속도로 탄수화물을 저장하는 신체 조직의 기능 부전을 특징으로 하는 대사 장애이다. 인슐린 작용에 대한 저항성은 II형 당뇨에 있어서 가장 중요한 인자이다. 이 저항성이 인슐린을 생성하는 베타 세포의 능력을 초과할 경우, 이 사람은 당뇨가 있게 된다. 최근 70년간 당뇨병을 앓는 사람들은 조절된 인슐린 양을 투여함으로써 상당히 도움을 받아왔다.
비만, 특히 상체 비만은 종종 인슐린 비의존성 당뇨병 (NIDDM)과 관련된다. 소위 II형 당뇨병이라 불리는 이들은 그들의 베타 세포들이 비록 종종 감소된 농도이긴 하지만 인슐린을 분비할 수 있기에, 절대적으로 인슐린을 필요로 하지는 않는다. 또한 그러한 환자들은 종종 비만이고 인슐린에 대해 반응할 수 있는 능력이 없음을 나타낼 수 있다.
체중 감량을 위한 식이 요법 및 운동 요법이 비만성 II형 당뇨병의 치료를 위한 최선의 방법이라는 것은 공지된 것이다. 불행하게도, 이들 요법은 일반적으로 성공하지 못한다. 감량 실패는 증가된 식욕, 고칼로리 음식에 대한 선호, 감소된 물리적 활동, 및 증가된 지방 형성 대사의 원인이 되는 유전적 요인에 기인할 수 있다. 그러한 유전적 소인을 물려받은 사람들은 비만이 될 경향이 있고 질병과 싸우는 그들의 노력에도 불구하고 II형 당뇨에 걸리기 쉽다. 제6번 염색체에서의 돌연변이와 연관된 상염체성 열성 체질을 담지하는 것으로 알려진 ob/ob 생쥐는 비만 및 당뇨의 한 모델이다. 최근, 이잉 장 (Yiying Zhing) 등은 이 질병과 연관된 생쥐 유전자 (ob)의 위치별 클로닝법을 발표하였다 [Yiying Zhing 등,Nature 372: 425-32 (1994) 참조]. 이 보고서는 지방 조직에서 배타적으로 발현된 21 아미노산 신호 펩티드와 함께 167 아미노산 단백질 (이하 렙틴)을 코딩하는 유전자를 개시하였다.
비만 개체에서 렙틴의 순환 농도는 폭 넓은 것으로 나타났다. 결론적으로, 비만성 II형 당뇨병의 부분 모집단은 특히 렙틴으로 치료 가능한 것으로 여겨진다. 그러므로 생물학적 활성을 가지고 렙틴의 활성을 모방하는 약제가 비만성 II형 당뇨병, 특히 순환하는 렙틴의 농도가 비정상적으로 높거나 낮은 당뇨병의 치료에 유용하다.
본 발명의 일면은 비만성 II형 당뇨에 렙틴, 렙틴 유사체 (類似體) 또는 그의 제약적으로 허용 가능한 염을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 당뇨병의 치료 또는 예방법이다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 낮은 농도의 내인성 렙틴을 가지는 비만성 II형 당뇨병의 치료 방법을 포함한다.
비만은 개체가 평방 미터 당 27 kg 보다 더 큰 체중 지수를 가지는 상태를 일컫는다.
렙틴은 인트론의 전사 및 결손, 단백질로 번역 및 성숙 단백질의 N-말단 발린-프롤린에서 C-말단 시스테인과 같은 분비 신호 펩티드를 제거한 성숙 단백질로 프로세싱한 비만 유전자로부터 생성되는 단백질을 일컫는다. 생쥐 및 사람 렙틴 단백질의 서열은 문헌 [Zhang 등,Nature 372: 425-32]에 발표되어 있다. 래트 (rat) 렙틴 서열은 문헌 [Murakami 등,Biochemical and Biophysical Research Comn. 209(3): 944-52 (1995)]에 발표되어 있다. 사람, 쥐 및 래트 렙틴에서, 이황화 결합의 형성과 연관된 Cys 잔기는 위치 96 및 145에 존재한다. 그러나, 특히 쥐 및 사람 렙틴에서, desGln(28) 변이체가 관찰되었다. 따라서, 이황화결합 형성과 연관된 Cys 잔기는 위치 95 또는 96 및 위치 145 또는 146에 존재할 수 있다. 또한 렙틴은 본 명세서 전체를 통해 비만 단백질, OB 또는ob유전자 생성물이라고 언급될 수 있다. 그러므로 렙틴은 서열 1-6을 포함한다.
당업자들은 특정 아미노산들이 재배열하려는 경향이 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, Asp는 문헌 [I. Schoen 등,International Journal of Peptide and Protein Research, 14: 485-94 (1979)] 및 이 문헌에 인용된 참고 문헌들에 기재된 것과 같이 아스파르티미드 및 이소아스파리긴으로 재배열할 수 있다. 이들 재배열 유도체들은 본 발명의 범위안에 포함된다. 달리 표시되지 않은 한 아미노산은 L형이다.
특허 청구된 본 발명의 방법에 유용한 렙틴의 바람직한 형태는 자연적인 서열이다. 사람 렙틴을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 방법에서 유용한 가장 바람직한 렙틴은 서열 1-6의 단백질을 포함한다.
쥐의 렙틴
상기 서열에서, 위치 28의 Xaa는 Gln이거나 결손이다.
돼지의 렙틴
소의 렙틴
상기 서열에서, 위치 28의 Xaa는 Gln이거나 결손이다.
사람의 렙틴
상기 서열에서, 위치 27의 Xaa는 Thr 또는 Ala이고, 위치 28의 Xaa는 Gln이거나 결손이다.
붉은털원숭이의 렙틴
래트의 렙틴
상기 단백질 서열에 덧붙여, 하나 또는 두 개의 아미노산 리더 서열, 특히 메티오닌을 함유하는 리더를 가진 항 당뇨병 단백질을 제조하는 것은 종종 긴급하게 고려된다. 빈번히 사용되는 2개의 리더는 Met-Arg 및 Met-Asp이다. 그러한 단백질은 이하 Met-Arg-렙틴 또는 Met-Asp-렙틴으로 나타내거나 Met-Arg-서열 X (여기서, X는 1 내지 6이다)로 나타낼 수 있다.
또한, 렙틴 유사체 및 단편들이 본 발명의 방법에 유용하다. 렙틴 유사체들은 일반적으로 아래 식 I (서열 7)로 정의되며, 97의 His가 Ser 또는 Pro로 치환, 위치 100의 Trp가 Gln, Ala 또는 Leu로 치환, 위치 101의 Ala가 Thr 또는 Val으로 치환, 위치 102의 Ser이 Arg으로 치환, 위치 103의 Gly가 Ala으로 치환, 위치 105의 Glu가 Gln으로 치환, 위치 106의 Thr이 Lys 또는 Ser으로 치환, 위치 107의 Leu가 Pro로 치환, 위치 108의 Asp가 Glu으로 치환, 또는 위치 111의 Gly가 Asp로 치환되는 것으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체를 가지는 단백질이다.
상기 서열에서, 위치 22의 Xaa는 Asn, Asp 또는 Glu이고, 위치 27의 Xaa는 Thr 또는 Ala이고, 위치 28의 Xaa는 Gln, Glu이거나 결손이고, 위치 54의 Xaa는 Met 또는 Ala이고, 위치 68의 Xaa는 Met 또는 Leu이고, 위치 72의 Xaa는 Asn, Asp 또는 Glu이고, 위치 77의 Xaa는 Ser 또는 Ala이고, 위치 118의 Xaa는 Gly 또는 Leu이다.
바람직하게는, 렙틴 유사체는 하기 식 II (서열 8)의 것들이며, 이들 단백질은 위치 97의 His이 Ser로 치환, 위치 100의 Trp가 Gln으로 치환, 위치 101의 Ala가 Thr로 치환, 위치 105의 Glu가 Gln으로 치환, 위치 106의 Thr이 Lys로 치환, 위치 107의 Leu가 Pro로 치환, 위치 108의 Asp가 Glu로 치환 또는 위치 111의 Gly가 Asp로 치환되는 것으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체, 바람직하게는 1 내지 5개의 치환체들, 가장 바람직하게는 1 내지 2개의 치환체를 가진다.
상기 서열에서, 위치 27의 Xaa는 Thr 또는 Ala이고, 위치 77의 Xaa는 Ser 또는 Ala이고, 위치 118의 Xaa는 Gly 또는 Leu이다.
본 발명의 바람직한 단백질의 예는 위치 27의 Xaa는 Thr이고, 위치 77의 Xaa는 Ser이고, 위치 118의 Xaa는 Gly이고, 위치 97, 100, 101, 105, 106, 107, 108 및 111의 아미노산 잔기는 아래 표 1과 같은 서열 8의 단백질을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용된 단백질과 비교하기 위하여 천연적인 사람 서열을 제공하였다.
다른 바람직한 단백질은 위치 27의 Xaa가 Ala이고, 위치 77의 Xaa가 Ser이고, 위치 118의 Xaa가 Gly이고, 위치 97, 100, 101, 105, 106, 107, 108 및 111의 아미노산 잔기가 표 1에 기재된 것과 같은 것들이다.
본 발명은 비만성 II형 당뇨병에 대한 효과적인 치료를 제공하는 생물학적 활성 단백질을 제공한다. 뜻하지 않게도, 표 1의 렙틴 단백질은 사람의 비만 단백질에 대한 특정 치환체로 인해 특성을 향상시켰다. 이들 단백질은 생쥐 및 사람 모두의 비만 단백질에 비해 더욱 안정하므로, 월등한 치료제임을 나타낸다.
잭슨 래버러터리스 (미국 메인주 바 하버) 또는 할란 (영국)으로부터 5 내지 6개월 된 암컷, 근친 교배 정상 ICR 생쥐, 근친 교배 정상 (ob/+), 비만성 당뇨병 생쥐 (ob/ob) 및 비만성 당뇨병 (db/db) 생쥐로 실험을 수행하였다.
정상 및 당뇨병 생쥐를 플라스틱 우리 (침상을 갖춘) 당 3 또는 6마리 가두어 두고 물 및 사료를 제한없이 제공하였다. 우리의 온도를 23 ± 2℃로 유지시키고 600 내지 1800시간 동안 전구를 켜 두었다. 혈액 시료를 꼬리 정맥으로부터 채취하였다. 그러므로, 가장 관련있는 생물학적 시험은 몇 가지의 투여 경로 (예, 정맥내 (i.v.), 피하 (s.c.), 복강내 (i.p.), 또는 미니 펌프 또는 카눌라) 중 어느 하나로 시험 제품을 주사하고, 다양한 시간 간격에 대해 사료 및 물 소비, 체중의 증가, 혈장 화학 또는 호르몬 (글루코스, 인슐린, ACTH, 코르티코스테론, GH, T4)을 관찰하는 것이다. 적합한 시험 동물은 정상 생쥐 (ICR 등) 및 비만 생쥐 (ob/ob, Avy/a, KK-Ay, 살찐, 지방이 많은)를 포함한다. 이러한 주사의 비특이적 효과를 위한 대조군은 동일 파라메터들을 관찰하는 동일 동물에서 유사한 조성의 시험 제품이 있거나 없는 비히클 또는 수용체가 결핍된 것으로 생각되는 동물 (db/db 생쥐, fa/fa 또는 cp/cp 래트)에서 시험 제품만을 사용하여 행할 수 있다.
글루코스 옥시다제 방법 또는 커플링된 헥소키나제 방법으로 혈액 글루코스 농도를 측정하였다. 표준 물질로서 래트 인슐린을 사용하는 방사면역검정 키트를 이용하여 혈장 인슐린을 측정하였다. 표준 물질로서 글리세롤을 이용하는 상용 키트를 사용하여 플라스마 트리글리세리드를 측정하였다.
상기 연구 결과, 정상 ICR 및 유전적으로 비만인 ob/ob 생쥐에서 렙틴 및 렙틴 유사체가 사료 섭취 및 체중을 조절할 것으로 나타났다. ob/ob 생쥐에 대한 렙틴 및 렙틴 유사체의 만성 투여는 비만성 II형 당뇨병에 대한 치료로서 이러한 항당뇨성 단백질에 대한 잠재적인 기대를 나타내는 이들 동물들의 당뇨병 상태를 전체적으로 개선시켰다. 따라서, 본 발명은 비만성 II형 당뇨병, 특히 낮은 순환 렙틴 농도의 환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 화합물은 용액 또는 고체상 펩티드 합성과 같은 공지의 화학적 방법, 또는 통상적인 용액법을 통해 커플링된 단백질 단편으로부터 출발하여 용액 상태의 반합성법에 의해 제조될 수 있다. 그러한 방법은 당업계에 공지된 것이고 문헌 [H.Dugas 및 C.Penney, Bioorganic Chemistry, (1981) p.54-92] 등의 당업계의 일반 교과서에서 찾을 수 있다.
또한, 본 출원에서 특허 청구된 방법에 유용한 단백질은 미국 뉴욕주의 콜드 스프링 하버에 소재한 콜드 스프링 하버 래버러터리스의 콜드 스프링 하버 프레스에서 발행한 문헌 [Maniatis 등,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1988)] 또는Current Protocols in Molecular Biology(1989) 및 부록에 기재된 것과 같은 공지의 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 공지의 서열을 가지는 DNA의 예정된 위치에서 치환 돌연변이를 일으키는 기술은 공지된 것이고, 예를 들어 M13 프라이머 돌연변이이다. 본 발명의 항당뇨성 단백질을 코딩하는 DNA에서 일어날 수 있는 돌연변이는 리딩 프레임 외의 서열에서는 일어나지 않아야 하고, 바람직하게는 이차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보적 영역을 만들지 않아야 한다 [드보어 (DeBoer) 등의 유럽 특허 공개 제075,444호 (1983) 참조].
본 발명은 비만성 II형 당뇨병의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 약 1 내지 10,000 ㎍/kg의 유효 투여량으로 렙틴 또는 렙틴 유사체의 투여를 포함한다. 바람직한 투여량은 약 20 내지 10,000 ㎍/kg이다. 보다 바람직한 투여량은 약 200 내지 600 ㎍/kg이다. 본 발명의 방법을 실시함에 있어서, 항당뇨 단백질은 일일 일회 또는 일일 수회 투여될 수 있다. 치료 요법은 지효성 투여를 필요로 할 수 있다. 1회 투약량 또는 총투약량에 대한 상기 유효량은 환자의 체중, 환자의 연령 및 일반적인 건강 및 화합물에 대한 환자의 내성에 따라 의사에 의해 결정될 것이다.
본 발명은 본 발명의 화합물을 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다. 바람직하게는 제약적으로 허용되는 염의 형태인 단백질은 비경구적 투여를 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 화합물은 통상적인 제약 담체 및 부형제와 혼합될 수 있다. 특허 청구된 단백질을 함유하는 조성물은 바람직하게는 가용성 형태의 활성 단백질을 약 0.1 내지 90 중량%, 및 더욱 일반적으로 약 10 내지 30 중량% 함유한다. 더욱이, 본 발명의 단백질은 단독으로 또는 다른 비만 억제제 또는 당뇨병 치료에 유용한 약물과의 배합물로 투여될 수 있다.
정맥내 사용을 위해, 단백질은 통상적으로 사용된 정맥내 유체 형태로 투여되거나 주입에 의해 투여된다. 근육내 제제로는 멸균 제제, 바람직하게는 염산염과 같은 단백질의 적합한 가용성 염을 무피로겐수 또는 생리 식염수와 같은 제약 희석액에 용해시켜 투여될 수 있다. 적절한 불용성 형태의 화합물은 수성 기제 또는 예를 들어 에틸 올레에이트와 같은 장쇄 지방산의 에스테르와 같은 제약적으로 허용되는 오일상 기제 중의 현탁액으로서 제조되어 투여될 수 있다.
바람직한 양태에서, 비록 고농도의 내인성 렙틴을 가진 당뇨병 환자도 본 발명의 특허 청구된 방법으로 혜택을 받을 수 있지만, 본 발명은 저농도 렙틴의 비만성 II형 당뇨병의 치료 방법을 제공한다. 혈청 및 혈장 렙틴 농도의 분석은 항체를 기초로 하는 표준 방법론을 사용하여 수행할 수 있다. 또한 렙틴 분석 키트는 린코 리서치 인크. (미국 미주리주 세인트 루이스 리서치 파크 드라이브 14에 소재)로부터 시판되고 있다.
0 내지 80 ng/ml의 렙틴 농도를 가지는 비만성 II형 당뇨병을 치료하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 0 내지 50 ng/ml의 렙틴 농도를 가지는 비만성 II형 당뇨병을 치료하는 것이다. 더더욱 바람직한 것은 0 내지 30 ng/ml의 렙틴 농도를 가지는 비만성 II형 당뇨병을 치료하는 것이다. 가장 바람직한 것은 0 내지 15 ng/ml의 렙틴 농도를 가지는 비만성 II형 당뇨병을 치료하는 것이다.
예시를 목적으로, 아래의 실시예는 본 발명의 다양한 양태를 설정하고 실시하는 방법을 설명하기 위해 제공되었다. 이들 실시예는 본 발명의 범위를 어떤 식으로도 제한하지 않는다.
<실시예 1>
단백질 서열 'Met-Arg-서열 4'를 코딩하는 DNA 서열을 휴먼 패트 셀 라이브러리 (클론테크에서 시판)로부터 표준 PCR 방법을 사용하여 제조하였다. 간단히 말해서, 사람 ob 유전자의 발표된 아미노산 서열을 기초로 해서 축중된 프라이머를 디자인하였다. 모델 380A DNA 합성기 (PE-Applied Biosystems, Inc., 미국 94404 캘리포니아주 포스터 시티 링컨 센터 드라이브 850에 소재)를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭 방법에 사용하기 위한 프라이머를 제조하였다. 전향 (forward) 프라이머 OB.F1M (5-GG GG CAT ATG AGG GTA CCT ATC CAG AAA GTC CAG GAT GAC AC) 및 OB.F2H (5-GG GG CAT ATG AGG GTA CCC ATC CAG AAG GTG CAG GAC GA)와 역향 (reverse) 프라이머 OB.R1M (5-GG GG GGATC GAT AAT TTA GCA TCC AGG GCT AAG ATC CAA CTG CCA AAG CAT 및 OB.R2H (5-GG GG GGATC CTA TTA GCA CCC GGG AGA CAG GTC CAG CCA CTG CAA CAT)를 주형으로서 PCR-레디 사람 지방 세포 cDNA (클론테크 래버러터리, 인크., 미국 94303 캘리포니아주 팔로 알토 파비안 웨이 4030 소재, 품목 #7128-1)와 함께 혼합하였다.
100 uL 반응물 중의 앰플리택 (Amplitag) DNA 폴리머라제 (펄킨 엘머 세투스제) 2.5 단위 또는 벤트 (Vent) DNA 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩제) 2 단위를 사용하여 2세트의 PCR 증폭을 수행하였다. PCR 반응물은 사람 지방 세포 cDNA 1 uL, 각 프라이머 10 pmol (모두 4개가 혼합됨)를 함유하였다. 아래의 조건을 "터치다운 PCR"에 사용하였다. 2 사이클: 94℃×30초, 60℃×30초, 72℃×45초; 2 사이클: 94℃×30초, 56℃×30초, 72℃×45초; 2 사이클: 94℃×30초, 52℃×30초, 72℃×45초; 2 사이클: 94℃×30초, 48℃×30초, 72℃×45초; 2 사이클: 94℃×30초, 44℃×30초, 72℃×45초; 28 사이클: 94℃×30초, 52℃×30초, 72℃×45초.
생성된 PCR 반응 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 계속하고 약 450 bp 크기의 밴드를 에티듐 브로마이드 염색으로 가시화시켰다. 이 밴드는 2 세트의 PCR 반응에 모두 나타났다. 밴드를 오려내고 30 사이클에서 위의 조건 (94×30초, 52×30, 72×45)을 사용하여 재증폭시켰다. 벤트 DNA 폴리머라제를 사용하여 생성된 PCR 생성물을 겔 정제시키고, pCR-SCRIPT 클로닝 벡터 (스트라겐)로 클로닝시켰다. 그 다음, 벡터를 사용하여E. coli세포를 형질전환시켰다.E. coli로 이루어진 20개의 백색 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 단리하고, 3개의 클론으로부터 얻은 시료를 서열화시켰다. 그러한 콜로니 2개, 즉E. coliDH10B/pOJ717 및E. coliDH10B/pOJ718을 부다페스트 조약하에서 노던 리져널 리서치 래버러터리즈 (NRRL)에 기탁하였고, 각각 B-21408 및 B-21409의 기탁번호로 입수할 수 있다.
<실시예 2>
벡터 구성
원하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드를NdeI 및BamHI 제한 위치를 포함하도록 구성하였다. 복제된 PCR 생성물을 담지하는 플라스미드를NdeI 및BamHI 제한 효소로 분해하였다. 작은 (∼450bp) 단편을 겔 정제시키고 A-C-B 프로인슐린을 코딩하는 서열이 결손된 벡터 pRB182에 접합시켰다. 접합 생성물을E. coliDH10B (시판되고 있음)로 형질전환시키고, 10 ㎍/ml의 테트라사이클린이 공급된 트립톤-이스트 플레이트상에서 성장하는 콜로니를 분석하였다. 플라스미드 DNA를 단리하고,NdeI 및BamHI로 분해시킨 다음, 생성된 단편을 아가로스 겔 전기 영동으로 분리하였다. 예상된 (∼450bp)NdeI 및BamHI 단편을 함유하는 플라스미드를 유지시켰다.E. coliB BL21 (DE3)를 단백질 생산을 위한 배양에 적합한 상기 이차 플라스미드 발현물로 형질전환시켰다.
상기 벡터로 세포를 형질전환하는 기술은 당업계에 공지된 것이고, 미국 뉴욕주의 콜드 스프링 하버에 소재한 콜드 스프링 하버 래버러터리의 콜드 스프링 하버 프레스에서 발행한 참고 문헌 [Maniatis,et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; F. Ausabel, ed., Current Protocols In Molecular Biology. (1989)] 및 그의 부록에서 찾을 수 있다. 본 명세서에서 예시된 것과 같은 본 발명의 바람직한 실제에서 사용된E. coli세포의 형질전환에 포함된 기술은 당업계에 공지된 것이다. 형질전환된E. coli세포를 배양하는 상태의 정밀한 조건은E. coli숙주 세포주와 사용된 발현 또는 클로닝 벡터의 성질에 의존한다. 예를 들어 c1857 열유도성 람다-파지 프로모터-오퍼레이터 영역과 같은 열유도성 프로모터-오퍼레이터 영역을 혼입하는 벡터는 단백질 합성을 유도하도록 배양 조건에서 온도를 약 30℃에서 약 40℃로 변화시키는 것을 필요로 한다.
본 발명의 바람직한 양태에서E. coliK12 RV308 세포를 숙주 세포로서 사용하였지만, 수 많은 다른 세포주가 이용될 수 있으며, 이에 한정하는 것은 아니지만E. coliK12 L201, L687, L693, L507, L640, L641, L695, L814 (E. coliB)와 같은 예가 있다. 이어서, 발현 플라스미드 상에 존지하는 제한 유전자에 대응하는 항생제의 선택적인 압력하에 적합한 배지에서 형질전환된 숙주 세포를 배양하였다. 그 다음, 사용된 숙주 세포주에게 적합한 시간 및 온도로 배양물을 배양시켰다.
고농도 박테리아 발현 시스템에서 발현된 단백질은 과립 또는 과발현된 단백질을 고농도로 함유하는 봉입체로 특징적으로 응집하였다 [미국 와싱톤 디.씨.에 소재한 아메리칸 어소시에이션 포 더 어드밴스먼트 오브 사이언스 퍼블리케이션 [American Association for the Advancement of Science Publication 넘버 89-18S Kreuger 등, Protein Folding, (Gierasch 및 King 편집 1990) p.136-142 참조]. 그러한 단백질 응집체는 용해되어 원하는 단백질 생성물의 추가 정제 및 단리가 가능하여야 한다. 단백질을 용해시키는 데에는 구아니디늄-HCl과 같은 강력한 변성 용액 및(또는) 디티오트레이톨 (DTT)과 같은 약한 변성 알콜을 사용하는 다양한 기술을 사용된다.
용액 중에서 변성제를 점차적으로 제거 (흔히 투석에 의함)하면 변성된 단백질의 원래 구조를 추측할 수 있게 한다. 변성 및 폴딩 (folding)을 위한 구체적인 조건은 구체적인 단백질 발현 시스템 및(또는) 문제의 단백질에 의해 결정된다.
바람직하게는, 본 발명의 단백질은 Met-Arg-서열 X로서 발현됨으로써, 발현된 단백질이 카텝신 C (소위 디아미노펩티다제)에 의해 특허 청구된 단백질로 쉽게 전환되도록 한다. 단백질의 정제는 당업계에 공지된 기술에 의하고, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 사이즈 배제 크로마토그래피를 포함한다.
특허 청구된 단백질은 두 개의 시스테인 잔기를 함유한다. 따라서, 이황화 결합이 형성되어 단백질을 안정화시킬 수 있다. 본 발명은 위치 96의 Cys가 위치 146의 Cys와 가교결합된 단백질 및 그러한 이황화 결합이 없는 단백질을 포함한다.
또한, 본 발명에 유용한 단백질은, 특히 제제화될 경우, 이량체, 삼량체, 사량체 및 그 외의 다량체로 존재할 수 있다. 그러한 다량체도 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims (19)

  1. 당뇨병의 치료 또는 예방용 의약의 제조를 위한 렙틴 또는 렙틴 유사체의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 상기 렙틴 또는 렙틴 유사체가 하기 서열 1-8의 단백질 또는 그의 제약적으로 허용되는 염 또는 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
    <서열 1>
    상기 서열에서, 위치 28의 Xaa는 Gln이거나 결손이고,
    <서열 2>
    <서열 3>
    상기 서열에서, 위치 28의 Xaa는 Gln이거나 결손이고,
    <서열 4>
    상기 서열에서, 위치 27의 Xaa는 Thr 또는 Ala이고, 위치 28의 Xaa는 Gln이거나 결손이고,
    <서열 5>
    <서열 6>
    <서열 7>
    상기 서열에서, 위치 22의 Xaa는 Asn, Asp 또는 Glu이고, 위치 27의 Xaa는 Thr 또는 Ala이고, 위치 28의 Xaa는 Gln, Glu이거나 결손이고, 위치 54의 Xaa는 Met 또는 Ala이고, 위치 68의 Xaa는 Met 또는 Leu이고, 위치 72의 Xaa는 Asn, Asp 또는 Glu이고, 위치 77의 Xaa는 Ser 또는 Ala이고, 위치 118의 Xaa는 Gly 또는 Leu이고,
    상기 단백질은 위치 97의 His가 Ser 또는 Pro로 치환, 위치 100의 Trp가 Gln, Ala 또는 Leu로 치환, 위치 101의 Ala가 Thr 또는 Val으로 치환, 위치 102의 Ser이 Arg으로 치환, 위치 103의 Gly가 Ala으로 치환, 위치 105의 Glu가 Gln으로 치환, 위치 106의 Thr이 Lys 또는 Ser으로 치환, 위치 107의 Leu가 Pro로 치환, 위치 108의 Asp가 Glu으로 치환, 또는 위치 111의 Gly가 Asp로 치환되는 것으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체를 가지고,
    <서열 8>
    상기 서열에서, 위치 27의 Xaa는 Thr 또는 Ala이고, 위치 77의 Xaa는 Ser 또는 Ala이고, 위치 118의 Xaa는 Gly 또는 Leu이고,
    상기 단백질은 위치 97에서 His가 Ser로 치환, 위치 100에서 Trp가 Gln으로 치환, 위치 101에서 Ala가 Thr로 치환, 위치 105에서 Glu가 Gln으로 치환, 위치 106에서 Thr이 Lys로 치환, 위치 107에서 Leu가 Pro로 치환, 위치 108에서 Asp가 Glu로 치환 또는 위치 111에서 Gly가 Asp로 치환되는 것으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환체, 바람직하게는 1 내지 5개의 치환체들, 가장 바람직하게는 1 내지 2개의 치환체를 가진다.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서, 당뇨병이 고농도의 내인성 렙틴과 연관되는 방법.
  4. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 당뇨병이 저농도의 내인성 렙틴과 연관되는 방법.
  5. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 비만성 II형 당뇨병이 0 내지 80 ng/ml 범위의 내인성 렙틴 농도를 가지는 방법.
  6. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 비만성 II형 당뇨병이 0 내지 50 ng/ml 범위의 내인성 렙틴 농도를 가지는 방법.
  7. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 비만성 II형 당뇨병이 0 내지 30 ng/ml 범위의 내인성 렙틴 농도를 가지는 방법.
  8. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 비만성 II형 당뇨병이 0 내지 15 ng/ml 범위의 내인성 렙틴 농도를 가지는 방법.
  9. 당뇨병 환자에게 렙틴 또는 렙틴 유사체를 투여하는 것을 포함하는 당뇨병의 치료 또는 예방 방법.
  10. 제9항에 있어서, 렙틴 또는 렙틴 유사체가 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7 및 서열 8로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  11. 제9항 또는 10항에 있어서, 당뇨병이 고농도의 내인성 렙틴과 연관되는 방법.
  12. 제9항 또는 10항에 있어서, 당뇨병이 저농도의 내인성 렙틴과 연관되는 방법.
  13. 제9항 또는 10항에 있어서, 비만성 II형 당뇨병이 0 내지 80 ng/ml 범위의 내인성 렙틴 농도를 가지는 방법.
  14. 제9항 또는 10항에 있어서, 비만성 II형 당뇨병이 0 내지 50 ng/ml 범위의 내인성 렙틴 농도를 가지는 방법.
  15. 제9항 또는 10항에 있어서, 비만성 II형 당뇨병이 0 내지 30 ng/ml 범위의 내인성 렙틴 농도를 가지는 방법.
  16. 제9항 또는 10항에 있어서, 비만성 II형 당뇨병이 0 내지 15 ng/ml 범위의 내인성 렙틴 농도를 가지는 방법.
  17. 활성 성분으로 렙틴 또는 렙틴 유사체를 함유하는, 당뇨병 치료 또는 예방용 제제.
  18. 제17항에 있어서, 렙틴 또는 렙틴 유사체가 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7 및 서열 8로 구성된 군으로부터 선택되는 제제.
  19. 제17항 또는 18항에 있어서, 당뇨병이 저농도 또는 고농도의 내인성 렙틴과 연관된 방법.
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