PT1572748E - Anticorpo humanizado (h14.18) do anticorpo 14.18 de rato que se liga ao gd2 e a sua fusão com a il-2 - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO "ANTICORPO HUMANIZADO (H14.18) DO ANTICORPO 14.18 DE RATO QUE SE LIGA AO GD2 E A SUA FUSÃO COM A IL-2" A presente invenção é em geral relativa a anticorpos modificados. Mais em particular, a invenção é relativa a anticorpos modificados com uma reduzida imunogenicidade, que se ligam de forma especifica ao glicosfingolipido GD2 da superfície das células humanas, e a sua utilização como agentes terapêuticos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Houve progressos significativos no desenvolvimento de terapias com base em anticorpos ao longo dos anos. Por exemplo, os investigadores identificaram não só uma série de marcadores específicos do cancro, como também uma série de anticorpos que se ligam de forma específica a esses marcadores. É possível empregar os anticorpos para fornecer determinadas moléculas, por exemplo, uma toxina ou uma fracção de estimulação imunitária, por exemplo, uma citoquina, a uma célula cancerígena que expressa o marcador, de modo a matar de forma selectiva a célula cancerígena. 0 anticorpo 14.18 é um anticorpo monoclonal derivado de rato, dirigido contra o glicosfingolipido GD2 da superfície celular. 0 GD2 é um disialogangliosido que normalmente é apenas expresso a um nível significativo nas membranas superficiais exteriores das células neuronais, onde a sua exposição ao sistema imunitário está limitada pela barreira sangue-cérebro. 2

Em contraste, muitas células tumorais têm níveis anormais de expressão na superfície celular do glicosfingolípido. Por exemplo, o GD2 é expresso nas superfícies de uma grande variedade de células tumorais, inclusive neuroblastomas, meduloblastomas, astrocitomas, melanomas, cancro do pulmão de pequenas células, osteossarcomas e outros sarcomas dos tecidos moles. Assim, o GD2 é um marcador específico de tumores conveniente para o direccionamento (targeting) dos domínios proteicos imunoestimuladores contra as células tumorais, no sentido de desencadear uma resposta imunitária eficaz contra essas células tumorais com vista a destrui-las. Enquanto o anticorpo de rato 14.18 (anticorpo ml4.18) poderá auxiliar o direccionamento ou targeting destes domínios proteicos contra células tumorais, as respectivas sequências de aminoácidos derivadas de rato podem afectar negativamente o efeito terapêutico pretendido.

Se ministrados a um doente, os anticorpos poderão ter uma imunogenicidade associada no mamífero hospedeiro. Isto ocorre mais provavelmente se os anticorpos não forem autólogos. Consequentemente, a eficácia das terapias com base em anticorpos está com frequência limitada por uma resposta imunogénica dirigida contra o anticorpo terapêutico. Esta resposta imunogénica é tipicamente aumentada, se o anticorpo derivar total ou parcialmente de um mamífero diferente do mamífero hospedeiro, por exemplo, se o anticorpo derivar de um rato e o hospedeiro for um humano.

Com vista à utilização clínica nos humanos, poderá ser útil modificar os anticorpos derivados de rato para se assemelharem mais aos anticorpos humanos, de modo a reduzir ou a minimizar a imunogenicidade do anticorpo derivado de 3 rato. É possível reduzir a imunogenicidade do anticorpo derivado de rato pela criação de um anticorpo quimérico, no qual as regiões constantes de um anticorpo humano estão fundidas com domínios variáveis de rato. No entanto, os restantes domínios variáveis de rato continuam em geral ainda imunogénicos nos humanos e podem, por isso, afectar negativamente a eficácia de uma terapia com base em anticorpos.

Algumas abordagens para reduzir a imunogenicidade, como "veneering" e "humanização", implicam a introdução de muitas substituições de aminoácidos e poderão interromper a ligação de um anticorpo a um antigénio. 0 anticorpo ml4.18 liga-se ao GD2 com uma afinidade moderada. Por conseguinte, prevê-se que as mutações que reduzem de forma significativa a afinidade do ml4.18 em relação ao GD2, o tornem menos eficaz com vista a fins terapêuticos nos humanos. Em conformidade, existe na técnica a necessidade de anticorpos terapêuticos que se possam dirigir de forma eficaz ao GD2 e tenham uma menor imunogenicidade quando ministrados nos humanos. 0 WO 01/23573 e Derwent Publications AN 2001-266163 XP002280627 (Kyowa Hakko Kogyo KK) revelam um anticorpo anti-GD2 quimérico recombinante específico, com uma reduzida imunogenicidade. 0 WO 02/066514 (Merck Patent GmbH) descreve inúmeras versões do mAb 14.18, que foram desumanizadas pela remoção de epítopos das células T do anticorpo parental murino, de acordo com um método informático especifico. 0 pedido de patente descreve, sem indicar os dados biológicos, as respectivas proteínas de fusão dos anticorpos 14.18 desumanizados com a IL-2. 4

RESUMO DA INVENÇÃO

Em geral, a presente invenção fornece uma proteína de fusão incluindo uma forma modificada do anticorpo ml4.18, que é menos imunogénica nos humanos mas que mantém ainda a afinidade de ligação do ml4.18 em relação ao GD2 humano.

Mais em particular, a invenção fornece uma proteína de fusão incluindo uma forma humanizada do anticorpo ml4.18 (o anticorpo hul4.18), na qual diversos aminoácidos específicos de rato foram substituídos por diferentes aminoácidos numa ou em mais regiões framework, para reduzir a respectiva imunogenicidade nos humanos. A invenção fornece fusões do anticorpo hul4.18 numa ou em mais fracções de não-imunoglobulina, de preferência na IL-2, para aumentar os efeitos da imunoterapia dirigida ao alvo.

Num aspecto, a presente invenção fornece uma região variável de anticorpo, inclusive a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, que define uma região variável de cadeia leve (Região VL) de imunoglobulina. Noutro aspecto, a invenção é relativa a uma região variável de anticorpo que inclui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, que define uma região variável de cadeia pesada (região VH) de imunoglobulina. Numa execução, a invenção fornece uma região variável de anticorpo, na qual a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 está ligada à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. As sequências de aminoácidos podem estar ligadas, através, por exemplo, de uma ligação dissulfureto ou de uma ligação peptídica.

Noutro aspecto, a invenção é relativa a uma região variável de anticorpo, que se liga especificamente ao GD2 e inclui 5 pelo menos os aminoácidos 1-23 da SEQ ID NO: 1, os aminoácidos 1-25 da SEQ ID NO: 2, ou os aminoácidos 67-98 da SEQ ID NO: 2. Estas sequências definem regiões framework nas regiões variáveis de imunoglobulina do anticorpo hul4.18. As regiões framework encontram-se descritas em maior detalhe em baixo.

Um aspecto da invenção é relativo a um método para o direccionamento (targeting) contra uma célula com o GD2 na sua superfície, e inclui a administração de uma região variável de anticorpo da presente invenção num doente. Numa execução, a célula-alvo é uma célula tumoral. Outros aspectos da invenção incluem um ácido nucleico que codifica a região variável de anticorpo ou uma célula que inclui este ácido nucleico, podendo qualquer um deles ser ministrado a um doente ou empregue na produção in vitro de proteínas. A invenção também fornece um polipéptido, que inclui uma região variável de anticorpo da invenção e uma porção Fc que contém pelo menos um domínio CH2, ácidos nucleicos que codificam o polipéptido, células que incluam os ácidos nucleicos, e métodos para o direccionamento contra uma célula com o GD2 na sua superfície, através da administração do polipéptido, do ácido nucleico ou da célula num doente. Em algumas execuções da invenção, a porção Fc deriva da IgGl. A região variável de anticorpo está ligada, com ou sem uma porção Fc interveniente, a uma fracção de não-imunoglobulina. Especificamente, a fracção de não-imunoglobulina é uma citoquina. 6

Observe-se que as características das diversas execuções, descritas no presente documento, não são mutuamente exclusivas e podem existir em diversas combinações e permutações.

Descrição das Figuras A Figura IA mostra a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina de acordo com a invenção. A Figura 1B mostra a sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de acordo com a invenção. A Figura 2A-D mostra a sequência de nucleótidos de um vector de expressão, inclusive os constructos de ácidos nucleicos que codificam uma cadeia leve de imunoglobulina e uma proteína de fusão de cadeia pesada de imunoglobulina-IL-2 de acordo com a invenção. A Figura 3A mostra a sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de imunoglobulina de acordo com a invenção. A Figura 3B mostra a sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de imunoglobulina de acordo com a invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO nos domínios A presente invenção fornece uma proteína de fusão que inclui uma forma modificada do anticorpo ml4.18, sendo esta menos imunogénica nos humanos mas ainda capaz de se ligar de forma específica ao GD2 humano. A reduzida imunogenicidade é proporcionada por uma ou mais sequências de aminoácidos alteradas nos domínios variáveis da 7 imunoglobulina. 0 anticorpo pode ser empregue no tratamento de tumores positivos para o GD2 (GD2-positivos) , em particular se fundido numa citoquina ou noutro imunomodulador.

Como empregues no presente documento, os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" tratam-se (i) de um anticorpo intacto (por exemplo, um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal), (ii) das respectivas porções de ligação de antigénios, inclusive, por exemplo, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento (Fab')2, um fragmento Fv, um local de ligação de anticorpo de cadeia simples, um sFv, (iii) de anticorpos biespecificos e das respectivas porções de ligação de antigénios, e (iv) de anticorpos multiespecíficos e das respectivas porções de ligação de antigénios.

Como empregues no presente documento, os termos "liga-se de forma específica", "ligar de forma específica" e "ligação específica" tratam-se de o anticorpo ter uma afinidade de ligação em relação a um antigénio particular de pelo menos cerca de 106 M_1, com maior preferência, de pelo menos cerca de 107 M_1, com maior preferência de pelo menos de cerca de 108 FT1 e, com total preferência, de pelo menos cerca de IO10 FT1.

Como empregues no presente documento, os termos "Regiões Framework" e "FR" tratam-se de regiões de uma região variável de imunoglobulina adjacente às Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR). As CDR são as porções de uma região variável da imunoglobulina que interagem principalmente com um antigénio. Como mostrado na FIG. 1, as regiões VH e VL contêm as duas quatro FR e estão 8 localizadas nas porções em caixa das sequências de aminoácidos.

Em particular, com referência à sequência de aminoácidos mostrada na FIG. IA (SEQ ID NO: 1), as FR de cadeia leve são definidas pelas sequências de aminoácidos de Aspl a Cys23 (huVLFRl), de His39 a His54 (huVLFR2), de Gly62 a Cys93 (huVLFR3), e de Phel04 a Lysll3 (huVLFR4) . Com referência à sequência de aminoácidos mostrada na FIG. 1B (SEQ ID NO: 2), as FR de cadeia pesada são definidas pelas sequências de aminoácidos de Glul a Ser25 (huVHFRl), de Trp36 a Gly49 (huVHFR2), de Arg67 a Ser98 (huVHFR3), e de Trpl03 a Serll3 (huVHFR4).

Sequências proteicas da invenção A presente invenção contempla anticorpos que se ligam, de preferência de forma especifica, ao glicosfingolipido GD2 da superfície das células humanas e têm regiões modificadas derivadas do anticorpo ml4.18. As sequências de aminoácidos VH ou VL (ou ambas) são modificadas ou humanizadas, para reduzir a respectiva imunogenicidade quando ministradas nos humanos. De acordo com a invenção, o anticorpo ml4.18 pode ser humanizado, por exemplo, pela utilização de métodos de desumanização, nos quais epítopos potenciais das células T são eliminados ou atenuados pela introdução de mutações que reduzem a ligação de um epítopo peptídico a uma molécula do MHC classe II (ver, por exemplo, o W098/52976 e o WOOO/34317). Em alternativa, os epítopos das células T não humanos são mutados para que correspondam aos epítopos self humanos que estão presentes nos anticorpos humanos (ver, por exemplo, a patente US 5 712 120) . A presente invenção fornece anticorpos GD2, tendo regiões VL e VH que incluem pelo menos uma sequência FR humanizada, reduzindo assim a 9 imunogenicidade aquando da respectiva administração nos humanos. I. Regiões Variáveis de Cadeias Pesadas e Leves

Como referido anteriormente, o hul4.18 inclui regiões variáveis humanizadas derivadas do anticorpo ml4.18, que conservam ligação especifica do antigénio GD2 humano. Em algumas execuções da invenção, a região VL do anticorpo hul4.18 inclui o seguinte polipéptido: p_V-v-M-T-Q-T-P-L-S-L-P-V-T-P-G-E-P-A-S-I-S—C-R—S-S-Q-S-L-V-H-R-N-G-N-T-Y-L-H—W-Y-L-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-H—K-V—S-N-R-F-S-G—V-P-d-r-f-s-g-s-g-s-g-t-d-f-t-l-k-i-s-r-v-e-a-e-d-l-g-v-y-f-c-s-q-s-T-H-V-P-P-L-T-F-G-A-G-T-K-L-E-L-K (SEQIDNO: 1).

Em execuções particulares, o anticorpo hul4.18 inclui uma FR1 de cadeia leve, que é definida pelos resíduos 1 a 23 da SEQ ID NO: 1, nomeadamente, D-V-V-M-T-Q-T-P-L-S-L-P-V-T-P-G-E-P-A-S-I-S-C (huVLFRl).

Noutras execuções da invenção, a região VH do anticorpo hul4.18 inclui o seguinte polipéptido: E-V-Q-L-V-Q-S-G-A-E-V-E-K-P-G-A-S-V-K-I-S-OK-A-S-G-S-S-F-T-G-Y-n-m-n-w-v-r-q-n-i-g-k-s-l-e-w-i-g-a-i-d-p-y-y-g-g-t-s-y-n-q-k-f-K-G-R-A-T-L-T-V-D-K-S-T-S-T-A-Y-M-H-L-K-S-L-R-S-E-D-T-A-V-Y-Y-C-V-S-G-M-E-Y-W-G-Q-G-T-S-V-T-V-S-S (SEQ ID NO: 2).

Em execuções particulares, o anticorpo hul4.18 inclui uma FR1 de cadeia pesada, que é definida pelos resíduos 1 a 25 da SEQ ID NO: 2, nomeadamente E-V-Q-L-V-Q-S-G-A-E-V-E-K-P-G-A—S—V—K—I—S—C—K—A—S (huVHFRl).

Noutras execuções da invenção, o anticorpo hul4.18 inclui uma FR3 de cadeia pesada, representada pelos resíduos 67 a 98 da SEQ ID NO: 2, nomeadamente R-a-t-l-T-V-D-K-S-t-S-t-a-y- 10 M-H-L-K-S-L-R-S-E-D-T-A-V-Y-y-C-V-S (huVHFR3) .

Diversas combinações das execuções anteriores também se encontram no âmbito da presente invenção. Por exemplo, o anticorpo hul4.18 poderá incluir a sequência VL apresentada na SEQ ID NO: 1 e a sequência VH apresentada na SEQ ID NO: 2. As regiões VL e VH podem estar ligadas por uma ligação dissulfureto ou por uma ligação peptidica, em função de como estão construídas as respectivas sequências de ácidos nucleicos. Em geral, as regiões V estão ligadas por uma ligação dissulfureto quando as suas sequências são codificadas por constructos de ADN separados. Em contraste, as regiões V estão tipicamente ligadas por uma ligação peptidica, quando as respectivas sequências são codificadas num constructo de ADN de cadeia simples. A presente invenção também contempla um anticorpo que liga especificamente o GD2 e inclui pelo menos uma porção das regiões V humanizadas. Por exemplo, o anticorpo hul4.18 poderá incluir uma região VL como definido pela SEQ ID NO: 1 e uma região VH tendo pelo menos uma FR humanizada, como a huVHFRl ou a huVHFR2. Em alternativa, o anticorpo da presente invenção poderá incluir uma região VH como definido pela SEQ ID NO: 2 e uma região VL tendo pelo menos uma FR humanizada, como a huVLFRl. O anticorpo hul4.18 também poderá incluir uma região VH tendo pelo menos uma FR humanizada e/ou uma região VL tendo pelo menos uma FR humanizada.

Em determinadas execuções da invenção, a região variável de cadeia leve e a região variável de cadeia pesada podem estar acopladas, respectivamente, a uma região constante de cadeia leve e a uma região constante de cadeia pesada de 11 uma imunoglobulina. As cadeias leves de imunoglobulina têm regiões constantes concebidas como cadeias capa ou cadeias lambda. Numa execução particular da invenção, a região constante de cadeia leve é uma cadeia capa. As regiões constantes de cadeia pesada e diversas modificações e combinações das mesmas encontram-se abaixo debatidas em detalhe. II. Porção Fc

Os domínios variáveis de anticorpo da presente invenção estão opcionalmente fundidos numa porção Fc. Como empregue no presente documento, a porção Fc engloba domínios derivados da região constante de cadeia pesada de uma imunoglobulina, de preferência de uma imunoglobulina humana, inclusive um fragmento, análogo, variante, mutante ou derivado da região constante. A região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina é definida como um homólogo polipeptídico sintético ou de origem natural, em relação a pelo menos uma porção da região de terminação C da cadeia pesada, inclusive os domínios CHI, hinge, CH2, CH3 e, no caso de algumas classes de cadeias pesadas, domínios CH4. A região "hinge" une o domínio CHI à região CH2-CH3 de uma porção Fc. A região constante das cadeias pesadas de todas as imunoglobulinas de mamíferos apresenta uma grande semelhança nas sequências de aminoácidos. As sequências de ADN destas regiões de imunoglobulina são bem conhecidas da técnica. (ver, por exemplo, Gillies et al., (1989) J. Immunol. Meth. 125: 191).

Na presente invenção, a porção Fc inclui tipicamente pelo menos um domínio CH2. Por exemplo, a porção Fc pode incluir toda a região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (CHl-hinge-CH2-CH3) . Em alternativa, a porção Fc poderá 12 incluir toda ou uma porção da região hinge, o domínio CH2 e o domínio CH3. A região constante de uma imunoglobulina é responsável por muitas funções efectoras de anticorpos importantes, inclusive a ligação do receptor Fc (FcR) e a fixação do complemento. Existem cinco classes principais da região constante de cadeia pesada, classificadas por IgA, IgG, IgD, IgE e IgM, cada uma com funções efectoras características designadas por isotipo. A IgG, por exemplo, está dividida em quatro isotipos γ: γΐ, γ2, γ3 e γ4, também conhecidos por IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, respectivamente. As moléculas IgG podem interagir com múltiplas classes de receptores celulares, inclusive três classes de receptores Fcy (FcyR) específicos da classe IgG de anticorpo, nomeadamente FcyRI, FcyRII e FcyRIII. Relatou-se que as sequências importantes para a ligação da IgG aos receptores FcyR encontram-se nos domínios CH2 e CH3. 0 tempo de semi-vida sérica de um anticorpo é influenciado pela capacidade de um anticorpo se ligar a um receptor Fc (FcR). De forma semelhante, o tempo de semi-vida sérica das proteínas de fusão da imunoglobulina também é influenciado pela incapacidade de ligação a esses receptores (Gillies et al., Câncer Research (1999) 59: 2 159-66). Os domínios CH2 e CH3 dos IgG2 e IgG4 têm uma afinidade de ligação não detectável ou reduzida em relação aos receptores Fc, em comparação com os do IgGl. Em conformidade, o tempo de semi-vida sérica do anticorpo em questão pode ser aumentado pela utilização do domínio CH2 e/ou do domínio CH3 dos isotipos IgG2 ou IgG4. Em alternativa, o anticorpo poderá 13 incluir um domínio CH2 e/ou um domínio CH3 do IgGl ou IgG3 com modificação num ou em mais aminoácidos nestes domínios, para reduzir a afinidade de ligação aos receptores Fc (ver, por exemplo, o pedido de patente US 09/256,156, publicado como publicação de pedido de patente US 2003-0105294-A1). A região hinge da porção Fc junta-se normalmente à terminação C do domínio CHI da região constante de cadeia pesada. Se incluída nas proteínas da presente invenção, a hinge é homóloga a uma região de imunoglobulina que ocorre naturalmente e contém, tipicamente, resíduos de cisteína que ligam duas cadeias pesadas por meio de ligações dissulfureto, como acontece nas imunoglobulinas naturais. É possível encontrar as sequências representativas de regiões hinge para a imunoglobulina humana e de rato in "ANTIBODY ENGINEERING, a PRACTICAL GUIDE", (Borrebaeck, ed., W. H. Freeman and Co., 1992).

As regiões hinge adequadas à presente invenção podem derivar de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 e de outros isotipos de imunoglobulina. 0 isotipo IgGl tem duas ligações dissulfureto na região hinge, o que permite a ligação com dissulfureto eficiente e consistente. Por isso, uma região hinge preferida da presente invenção deriva do IgGl. Opcionalmente, a primeira cisteína mais N-terminal de uma hinge de IgGl sofre mutação para aumentar a expressão e a montagem de anticorpos ou de proteínas de fusão de anticorpos da invenção (ver, por exemplo, o pedido de patente US 10/093,958, publicado como publicação de pedido de patente US 2003-0044423-A1).

Em contraste com o IgGl, a região hinge do IgG4 é conhecida por formar ligações dissulfureto de forma ineficiente entre 14 cadeias (Angal et ai., (1993), Mol. Immunol. 30: 105-8). Também a região hinge do IgG2 tem quatro ligações dissulfureto, que tendem a promover a oligomerização e a ligação dissulfureto possivelmente incorrecta durante a segregação em sistemas recombinantes. Uma região hinge adequada à presente invenção pode derivar da região hinge do IgG4, contendo de preferência uma mutação que aumenta a formação correcta de ligações dissulfureto entre fracções derivadas de cadeias pesadas (Angal et ai., (1993), Mol, Immunol. 30(1): 105-8). Outra região hinge preferida deriva de uma hinge de IgG2, na qual as primeiras duas cisteinas estão cada uma mutada noutro aminoácido, como, em ordem de preferência geral, serina, alanina, treonina, prolina, ácido glutâmico, glutamina, lisina, histidina, arginina, asparagina, ácido aspártico, glicina, metionina, valina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina, triptofano ou selenocisteina (ver, por exemplo, a publicação do pedido de patente US 2003-0044423-A1).

Uma porção Fc fundida numa região variável de anticorpo da invenção pode conter domínios CH2 e/ou CH3 e uma região hinge derivados de diferentes isotipos de anticorpos. Por exemplo, a porção Fc pode conter domínios CH2 e/ou CH3 do IgG2 ou do IgG4 e uma região hinge do IgGl. A montagem destas porções Fc híbridas foi descrita na publicação do pedido de patente US 2003-0044423-A1.

Se fundida numa região variável de anticorpo da invenção, a porção Fc conterá de preferência uma ou mais modificações de aminoácidos, que geralmente aumenta(m) o tempo de semi-vida sérica de uma proteína de fusão Fc. Estas modificações de aminoácidos incluem mutações que eliminam ou diminuem substancialmente a actividade de fixação do complemento ou 15 de ligação do receptor Fc. Por exemplo, um tipo de mutação deste género remove o local de glicosilação da porção Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina. No IgGl, o local de glicosilação é o Asn297 (ver, por exemplo, o pedido de patente US 10/310,719, publicado como publicação de pedido de patente US 2003-0166163-A1). III. Região da junção da fusão

As regiões variáveis de anticorpos da presente invenção podem estar opcionalmente ligadas ou fundidas numa fracção de não-imunoglobulina directa ou indirectamente, como através de um péptido ligante (por exemplo, (Gly4-Ser)3 (SEQ ID NO: 3)). É possível reduzir a imunogenicidade das proteínas de fusão reveladas, ao impedir a capacidade da junção de fusão ou do epítopo de junção interagir com um receptor das células T, como descrito na publicação do pedido de patente US 2003-0166877-A1. Mesmo numa fusão entre duas proteínas humanas, por exemplo, Fc humana e IL-2 humana, a região que circunda a junção de fusão ou o epítopo de junção inclui uma sequência peptídica que normalmente não está presente no corpo humano e não pode assim ser imunogénica. É possível reduzir a imunogenicidade do epítopo de junção pela introdução, por exemplo, de um ou mais locais de glicosilação perto da junção de fusão, ou pela identificação de um epítopo das células T candidato abrangendo a junção, como descrito na publicação do pedido de patente US 2003-0166877-A1, e alterando um aminoácido próximo da junção, para reduzir a capacidade de o epítopo das células T candidato interagir com um receptor das células T.

Também é possível aumentar o tempo de semi-vida sérica da proteína pela introdução de mutações na região da junção da 16 fusão. Por exemplo, numa proteína que inclua um domínio CH3 fundido numa fracção de não-imunoglobulina, é possível transformar a lisina de terminação C do domínio CH3 noutro aminoácido, como a alanina, que poderá proporcionar um aumento substancial do tempo de semi-vida sérica da proteína de fusão resultante.

Em determinadas execuções, é desejável a clivagem proteolítica da junção da fusão. Em conformidade com isso, a região intergénica poderá incluir uma sequência nucleotídica que codifica um local de clivagem proteolítica. Este local, situado entre a imunoglobulina e a citoquina, pode ser concebido para fornecer uma libertação proteolítica da citoquina no local-alvo. Por exemplo, sabe-se bem que a plasmina e a tripsina clivam após os resíduos de lisina e de arginina, em locais que são acessíveis às proteases. São bem conhecidas outras endoproteases especificas de locais e as sequências de aminoácidos por elas reconhecidas. IV. Tratamento de doenças humanas com as proteínas de fusão do anticorpo hu!4.18 A região variável de anticorpo da invenção está ligada a uma citoquina. De preferência, o imunoconjugado ou a proteína de fusão de anticorpo-citoquina exibe actividade biológica de citoquina. Na execução preferida, o domínio variável de anticorpo está fundido na IL-2. De preferência, vários aminoácidos na fracção IL-2 estão mutados para reduzir a toxicidade, como descrito na publicação do pedido de patente US 2003-0166163-A1.

Por exemplo, as FIG. 3A e 3B mostram as sequências de aminoácidos de uma execução particular de uma proteína de 17 fusão de anticorpo de acordo com a invenção. Especificamente, a FIG. 3A mostra a sequência peptidica de uma cadeia leve de imunoglobulina humanizada, que inclui uma região variável e constante. A FIG. 3B mostra a sequência peptidica de uma cadeia pesada de imunoglobulina humanizada, ligada à IL-2. Os polipéptidos fornecem uma proteína de fusão de anticorpo humanizado, capaz de se ligar de forma específica ao GD2 e de estimular o sistema imunitário.

Opcionalmente, os complexos proteicos podem ainda incluir um segundo agente, como é o caso de uma segunda citoquina. Numa execução, uma proteína de fusão do anticorpo hul4.18 inclui a IL-12 e a IL-2. A construção de complexos proteicos, contendo um domínio de imunoglobulina e duas citoquinas diferentes, está descrita em detalhe na patente US 6,617,135.

As proteínas de fusão da presente invenção podem ser empregues no tratamento de doenças humanas, como é o caso do cancro. Ao tratar tumores humanos, é de particular utilidade ministrar uma proteína de fusão de anticorpo-IL-2 contendo as regiões V da invenção, por infusão ou por injecção subcutânea, com doses de 0,1 a 100 miligramas/metro2/doente. Numa execução preferida, é de particular utilidade ministrar uma proteína de fusão de anticorpo-IL-2 contendo as regiões V da invenção, por infusão ou por injecção subcutânea, com doses de 1 a 10 miligramas/metro2/doente e, com maior preferência, cerca de 3 a 6 miligramas/metro2/doente.

Estudos clínicos mostraram que, a seguir à administração da hul4.18-IL-2, a proteína de fusão retém a sua capacidade de 18 activar as células que respondem à IL-2 através do receptor da IL-2, e retém a sua capacidade de se ligar às células tumorais positivas para o GD2 e de fornecer a IL-2 à sua superfície. Além disso, a administração da proteína de fusão hul4.18-IL-2 a doentes com cancro teve por resultado a estabilização da progressão da doença num número surpreendentemente grande de doentes (ver o Exemplo 1). É possível utilizar as composições farmacêuticas da invenção em formas de dosagem sólidas, semi-sólidas ou líquidas, tais como, por exemplo, comprimidos, cápsulas, pós, líquidos, suspensões ou outros do género, de preferência em formas de dosagem unitárias adequadas à administração de dosagens precisas. As composições incluem um suporte ou excipiente farmacêutico convencional e, além disso, poderão incluir outros agente medicinais, agentes farmacêuticos, suportes, adjuvantes, etc. Estes excipientes poderão incluir outras proteínas, como, por exemplo, a albumina sérica humana ou proteínas plasmáticas. Os métodos concretos de preparação destas formas de dosagem são conhecidos ou serão evidentes aos especialistas da técnica. A composição ou a formulação a ser ministrada conterá, em qualquer caso, uma quantidade tal do(s) componente(s) activo(s) que seja eficaz para alcançar o efeito pretendido no indivíduo que está a ser tratado. A administração das respectivas combinações pode ser realizada por qualquer um dos métodos aceites de administração de agentes que exibem essa actividade. Estes métodos incluem as formas de administração oral, parenteral ou tópica ou outras formas sistémicas. A injecção intravenosa num suporte aceitável a nível farmacêutico constitui um método preferido de administração (ver o 19

Exemplo 1). A quantidade de composto activo ministrado dependerá, claro está, do indivíduo que é tratado, da gravidade da situação, da forma de administração e do parecer do médico assistente. Ácidos nucleicos da invenção I. Constructos do anticorpo hu!4.18 A invenção também contempla ácidos nucleicos, capazes de expressar cada um dos tipos anteriores de proteínas. Estes incluem, por exemplo, os ácidos nucleicos que codificam a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1; a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; uma região VL do anticorpo hul4.18, que inclui a sequência de aminoácidos huVLFRl; uma região VH do anticorpo hul4.18, que inclui a sequência de aminoácidos huVHFRl; uma região VH do anticorpo hul4.18, que inclui a sequência de aminoácidos huVHFR3; e proteínas de fusão contendo um anticorpo hul4.18, que inclui pelo menos uma das sequências FR humanizadas anteriores e um ou mais agentes terapêuticos. É possível produzir os anticorpos hul4.18 da presente invenção por técnicas de engenharia genética; ou seja, pela formação de um constructo de ácidos nucleicos que codifica um anticorpo específico do GD2, contendo as FR pretendidas da presente invenção. Numa execução, o constructo genético que codifica o anticorpo em questão inclui, na orientação de 5' a 3', um segmento de ADN que codifica uma região variável de cadeia pesada, que engloba aí pelo menos uma FR humanizada e um segmento de ADN que codifica uma região 20 constante de cadeia pesada. Noutra execução, outro segmento de ADN que codifica uma citoquina está fundido na extremidade 3' do segmento de ADN que codifica a região constante de cadeia pesada. Numa execução diferente, o constructo genético inclui, na orientação de 5' a 3', um segmento de ADN que codifica uma região variável de cadeia pesada, que engloba pelo menos uma FR humanizada, e um segmento de ADN que codifica uma citoquina. Em alternativa, um ácido nucleico da invenção pode incluir, na orientação de 5' a 3', um segmento de ADN que codifica uma região variável de cadeia leve, que engloba ai pelo menos uma FR humanizada, e um segmento de ADN que codifica uma citoquina. Em algumas execuções, um ácido nucleico que codifica uma citoquina é juntado in-frame à extremidade 3' de um gene que codifica uma região constante (por exemplo, o exão CH3), seja directamente ou através de uma região intergénica (por exemplo, por meio de ligantes apropriados, como por codificação de ADN (Gly4-Ser)3 (SEQ ID NO: 3)). II. Expressão de constructos do anticorpo hu!4.18

As proteínas que codificam os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser montadas ou inseridas num ou em mais vectores de expressão, com vista à introdução numa célula hospedeira apropriada onde ocorre a sua expressão. É possível conseguir a introdução de ácidos nucleicos em vectores de expressão, recorrendo a técnicas padrão de biologia molecular. Os vectores de expressão preferidos incluem aqueles a partir dos quais pode ser expressa a proteína codificada em células bacterianas ou em células humanas.

De acordo com a invenção, uma cadeia pesada de uma região variável de anticorpo é de preferência co-expressa na mesma 21 célula com uma cadeia leve correspondente. Para as proteínas de fusão que contêm múltiplas cadeias polipeptídicas, é possível empregar mais do que um vector de expressão. Os métodos de co-transfecção com a utilização, por exemplo, de dois vectores de expressão resultam com frequência no fornecimento dos dois vectores a uma célula-alvo. Em alternativa, é por vezes útil empregar um único vector que codifique uma série de polipéptidos para a co-expressão na mesma célula.

Por exemplo, as FIG. 2A-D mostram a sequência de ácidos nucleicos de um único vector, que codifica tanto as cadeias leves como as pesadas de uma imunoglobulina de acordo com a invenção. 0 vector também inclui um ácido nucleico que codifica a IL-2 fundida na extremidade 3' da cadeia pesada de imunoglobulina. Assim, quando introduzido numa célula, este vector pode por si só fornecer uma proteína de fusão de anticorpo humanizado-IL-2, que se liga de forma específica ao GD2 e estimula a função imunitária.

Além disso, poderá ser conveniente expressar as proteínas da presente invenção na forma de moléculas de cadeia simples. Por exemplo, é possível expressar uma região variável de anticorpo na forma de anticorpo de cadeia simples ou de sFV opcionalmente fundido numa proteína de não-imunoglobulina. Noutra execução, combina-se uma cadeia pesada (com ou sem uma citoquina fundida) com uma contraparte de cadeia leve (ou pesada) (com ou sem uma citoquina fundida), para produzir imunoconjugados monovalentes ou bivalentes.

As linhas celulares hospedeiras são de preferência células linfóides, como um mieloma (ou hibridoma). Os mielomas são 22 capazes de sintetizar, montar e segregar imunoglobulinas codificadas por genes transfectados, e são capazes de glicosilar proteínas. Uma célula hospedeira particularmente preferida é o mieloma Sp2/0, que normalmente não produz imunoglobulina endógena. Quando transfectada, a célula produzirá apenas imunoglobulinas codificadas pelos constructos de genes transfectados. É possível fazer crescer mielomas transfectados em cultura ou nos peritoneus de ratos, onde é possível recuperar os imunoconjugados segregados do fluido ascítico. Também é possível empregar outras células linfóides, como os linfócitos B, como células hospedeiras.

Existem vários métodos de transfecção de células linfóides com vectores contendo os constructos de ácidos nucleicos que codificam a cadeia de Ig quimérica. Uma forma preferida de introduzir um vector em células linfóides é através da fusão de esferoblastos. (ver, por exemplo, Gillies et al. (1989) Biotechnol. 7: 798 - 804) . Os métodos alternativos contemplam electroporação ou precipitação de fosfato de cálcio. Outros métodos, que podem ser empregues para produzir os imunoconjugados, contemplam a preparação de uma sequência de ARN que codifica o constructo, e a sua tradução num sistema in vivo ou ín vitro apropriado. Uma vez expressas, é possível fazer a colheita das proteínas da invenção por procedimentos de purificação de proteínas padrão (ver, por exemplo, a patente US 5,650,150). III Tratamento oncológico por meio de terapia genética É possível utilizar os ácidos nucleicos da invenção como agentes de terapia genética, no tratamento do cancro e de outras doenças, em que seja desejável direccionar o sistema imunitário contra um tipo específico de célula. Por 23 exemplo, é possível retirar células de um humano ou de um animal, e é possível transfectar um ou mais ácidos nucleicos, que codificam um anticorpo da presente invenção, para as células. As células são depois reintroduzidas no humano ou no animal. As células transfectadas podem ser células normais ou cancerígenas. Em alternativa, é possível introduzir um ácido nucleico em células in situ. 0 humano ou o animal desencadeia depois uma resposta imunitária contra as células cancerígenas, que pode curar ou atenuar a gravidade do cancro. Uma região variável de anticorpo da invenção, ligada a elementos reguladores apropriados para promover a expressão nas células de mamíferos, pode ser transfectada para células recorrendo a uma série de técnicas, inclusive pela via do fosfato de cálcio, uma "pistola de genes", vectores de adenovírus, lipossomas catiónicos, vectores retrovirais ou qualquer outro método eficiente de transfecção.

Numa execução particular da invenção, utiliza-se um anticorpo hul4.18 para fornecer de forma selectiva uma citoquina a uma célula-alvo in vivo, de modo a que a citoquina consiga produzir um efeito biológico localizado, como uma resposta inflamatória local, a estimulação do crescimento e da activação das células T, ou actividade ADCC. Ministra-se uma quantidade de eficácia terapêutica do anticorpo no sistema circulatório de um indivíduo que hospede a célula-alvo. A invenção é ainda descrita com base em exemplos não restritivos. EXEMPLOS Exemplo 1 24

Purificação e formação da hul4.18-IL2

Num estudo, expressou-se a hul4.18-IL2 a partir de células NS/0, colheu-se o sobrenadante de cultura de tecido e purificou-se a proteína hul4.18-IL2, utilizando, em sequência, cromatografia de coluna de Abx Mixed Resin, cromatografia de Protein A recombinante e cromatografia de coluna de Q Sepharose, a que se segue diafiltração de fluxo tangencial Pellicon 2 para a conversão do tampão em tampão de formulação. Os detalhes acerca destas etapas de purificação encontram-se abaixo descritos. A desactivação virai e as etapas de remoção foram interdigitadas nestas etapas como abaixo descrito. A desactivação virai e as etapas de remoção não foram necessárias à purificação propriamente dita, mas foram utilizadas para satisfazer considerações reguladoras.

Dois litros do sobrenadante de cultura de tecido NS/0, contendo a hul4.18-IL2, foram ajustados para um pH de 5,9 com ácido acético 1 M e foram aplicados a uma coluna Abx (J. T. Baker); lavou-se com MES 10 mM, acetato de sódio 100 mM pH de 6,2; e eluíu-se com acetato de sódio 500 mM, pH de 7. Carregou-se este material numa coluna de Protein A recombinante (Pharmacia); lavou-se com fosfato de sódio 100 mM, NaCl 150 mM, pH de 7; lavou-se com fosfato de sódio 100 mM, NaCl 150 mM, pH de 6; lavou-se com fosfato de sódio 10 mM, pH de 7; e eluíu-se com fosfato de sódio 100 mM, NaCl 150 mM, pH de 3,5. O pH do material eluído era 4,2. Para promover a desactivação virai, reduziu-se este pH para 3,8 e incubou-se a preparação durante 30 minutos, tendo-se depois neutralizado o pH para 7 com NaOH 1 M. Para remover o ácido nucleico, carregou-se este material numa coluna de Q Sepharose (Pharmacia) e lavou-se com fosfato de sódio 100 25 mM, NaCl 150 mM, pH de 7. Ligação do ácido nucleico à coluna, enquanto a proteína foi encontrada no fluxo de passagem e nas lavagens, que foram repetidas até ο A280 regressar ao valor de referência. Realizou-se a diafiltração Pellicon 2 (Millipore) de acordo com as instruções do fabricante, pelo que o material hul4.18-IL2 final foi colocado na seguinte formulação. 1. Manitol 4% 2 . hidrocloreto de arginina USP/NF 100 mM 3. Ácido cítrico USP-FCC 5 mM 4. Polysorbate 80 0,01%

Ajustou-se o valor de pH do tampão de formulação para 7 com

NaOH 1 M.

Como etapa final, filtrou-se a preparação através de uma membrana Viresolve 180 (Millipore), que tem uma separação do peso molecular de 180 000 Daltons. Isto produziu o efeito de "polimento" do material, pelo que em resultado se removeu dímeros agregados e oligómeros de elevada ordem.

Exemplo 2

Actividade anti-tumoral da proteína de fusão hul4.18-IL-2 Observada na Fase I dos Ensaios Clínicos

De modo a avaliar a segurança e a eficácia da hul4.18-IL-2, realizou-se um ensaio clínico de Fase I. Os doentes passíveis de ser seleccionados tinham melanoma confirmado por histologia, considerado incurável tanto a nível cirúrgico como médico. Estes doentes poderiam ter doença metastática mensurável ou avaliável, ou poderiam não apresentar indícios de doença a seguir a ressecção 26 cirúrgica de metástases distantes ou de doença regionalmente recidivante. Os doentes com múltiplas (duas ou mais) recidivas locais ou regionais apenas foram incluídos, caso tivessem indícios anteriores da implicação de nodos linfáticos e caso cada recidiva distasse no tempo em pelo menos 2 meses. Era necessário que todos os doentes tivessem um funcionamento adequado da medula óssea (definido pelo total de glóbulos brancos do sangue (WBC) > 3 500/mL, ou total de granulócitos > 2 000/mL, plaquetas > 100 000/mL e hemoglobina > 10,0 g/dl), um funcionamento hepático adequado [definido por uma aspartato aminotransferase (AST) < 3 x o normal e uma bilirrubina total < 2,0 mg/dl], e um funcionamento renal adequado (definido por um valor da creatinina sérica <2,0 mg/dl ou uma depuração da creatinina > 60 mL/minuto). Todos os doentes tinham um status de desempenho electrocorticográfico (ECOG) de 0 ou 1 e uma esperança de vida de pelo menos 12 semanas. Excluiu-se os doentes que tivesses recebido anteriormente quimioterapia, radioterapia ou outra terapia imunossupressora nas 4 semanas anteriores ao estudo. Os doentes poderiam ter metástases anteriores no sistema nervoso central (SNC), caso tivessem sido tratados e estivessem estáveis nas pelo menos 4 semanas anteriores ao início do estudo. Obteve-se o consentimento informado de todos os doentes.

Este ensaio de Fase I foi concebido como um estudo de aumento gradual da dosagem não-aleatorizado aberto, no qual grupos de 3 a 6 doentes receberam a hul4.18-IL-2 com um dos seguintes níveis de dosagem: 0,8, 1,6, 3,2, 4,8, 6,0 ou 7,5 mg/m2/dia. Ministrou-se a hul4.18-IL-2 com base em doentes internados, na forma de uma infusão intravenosa (IV) de 4 horas ao longo de 3 dias consecutivos, durante a primeira 27 semana de cada regime. Ministrou-se a proteína de fusão hul4.18-IL-2 a doentes numa formulação contendo manitol a 4%; arginina HC1, 100 mM; citrato, 5 mM; e Tween 80 a 0,01%, com um pH de 7. Foi dada alta do hospital aos doentes, se estáveis, passadas aproximadamente 24 horas de terminada a terceira infusão. Classificou-se as reacções adversas e as toxicidades de acordo com os Critérios Comuns de Toxicidade NCI (versão 2.0) e de acordo com a classificação de toxicidade do University of Wisconsin Comprehensive Câncer Center para a IL-2 (status de desempenho, aumento de peso e temperatura). Definiu-se a toxicidade limitadora da dose (DLT - Dose-Limiting toxicity) como a ocorrência de toxicidade de grau 3 ou 4 que não a linfopenia, hiperbilirrubinémia, hipofosfatémia ou hiperglicémia de grau 3. Definiu-se a dose máxima tolerada (MTD) como o nível de dosagem com o qual dois de seis doentes apresentavam DLT durante o regime 1. Era necessário que os doentes com níveis de toxicidade relacionados com o tratamento de grau 3, recuperassem até pelo menos o grau 1 antes de poderem retomar o tratamento com uma redução de 50% da dosagem para o regime 2. Retirou-se do estudo os doentes com uma progressão da doença ^ 25%. Aos doentes com a doença estabilizada ministrou-se o regime 2 .

Avaliou-se as propriedades farmacocinéticas da hul4.18-IL-2 nos doentes. Quando se avaliou os níveis da hul4.18-IL-2 em amostras em série de todos os 33 doentes, logo a seguir à primeira infusão de 4 horas (dia 1, regime 1), determinou-se que o tempo de semi-vida era de 3,7 horas (+/- SD de 0,9 h). Este é um valor intermédio entre os tempos de semi-vida dos seus 2 componentes (aproximadamente 45 minutos para a IL-2 e 3 dias para o anticorpo ml4.18 quimérico), e é 28 comparável ao observado para o tempo de semi-vida da ml4.18-IL-2 quimérica nos ratos. A seguir à depuração da hul4.18-IL-2 do soro destes doentes, não se conseguia detectar nem o componente IL-2 nem o componente anticorpo hul4.18. 0 soro de pico e a área abaixo da curva (AUC) durante o regime 1 mostravam um aumento significativo em função da dose (p < 0,001).

Tratou-se trinta e três doentes neste estudo. A Tabela 1 lista os resultados clínicos. Dois doentes (6%) completaram apenas os primeiros 2 dos 3 dias do regime 1. Um destes doentes (nível de dosagem 3) apresentava uma hiperbilirrubinémia de grau 3 no dia 2 do tratamento, e o outro doente (nível de dosagem 6) apresentava uma hipotensão e uma hipóxia de grau 3, sendo necessário suspender o tratamento. Estes dois doentes apresentavam uma progressão da doença e não receberam um segundo regime de terapia. Dezanove doentes (58%) apresentavam uma estabilização da doença, a seguir ao primeiro regime da terapia, e receberam um segundo regime de terapia. Cinco doentes (15% de todos os doentes) tiveram de ter uma redução de 50% da dosagem para o regime 2, devido a reacções adversas no regime 1. Dezassete doentes (52% de todos os doentes) terminaram o regime 2. Um doente (nível de dosagem 4) recusou-se a receber a infusão final durante o regime 2, e um doente (nível de dosagem 6) teve a infusão final suspensa durante o regime 2 devido a hipotensão. Oito doentes (24% de todos os doentes) apresentavam uma estabilização da doença a seguir ao segundo regime de tratamento. Os resultados indicam que a hul4.18-IL-2 levou à estabilização da progressão da doença num número surpreendentemente elevado de doentes. 29

Oito dos 33 doentes mantiveram a doença estabilizada após 2 regimes de terapia, e 4 destes 8 doentes continuaram sem indícios de progressão da doença (1 com doença estabilizada e 3 sem indícios de doença) durante 20 - 52 meses depois de terminada a terapia protocolar.

Cinco destes 33 doentes entraram no estudo com doença não mensurável, a seguir a ressecção cirúrgica de recidivas de metástases. Dois destes cinco doentes apresentavam progressão da doença, enquanto os restantes 3 doentes continuaram sem indícios de doença (20 - 52 meses) . Estas descobertas são consistentes com a hipótese de o benefício clínico de uma intervenção imunoterapêutica ser mais provável num doente com uma baixa carga tumoral. Um doente adicional apresentava uma diminuição objectiva num nódulo pulmonar a seguir a dois regimes de terapia, mas a resposta patológica geral foi classificada como progressão da doença, devido ao crescimento num nodo distante. Fez-se a ressecção do nodo a seguir à terapia com a hul4.18-IL-2, e o doente ficou sem progressão da doença durante 3 anos. TABELA 1

Resultados clínicos Número de doentes Doentes que terminaram o regime 1 31 Estabilização da doença a seguir ao regime 1 19 Redução de 50% da dosagem para o regime 2 5 Doentes que terminaram o regime 2 17 Estabilização da doença a seguir ao regime 2 8 A imunoestimulação in vivo pela hul4.18-IL-2 num ensaio clínico de Fase 1.

Também se examinou os doentes tratados com a hul4.18-IL-2, 30 à procura de sinais de imunoestimulação. Ocorreu uma linfopenia do sangue periférico nos dias 2 - 4, a que se seguiu uma linfocitose reactiva nos dias 5-22. Estas duas alterações foram em função da dose (p < 0,01 e p < 0,05, respectivamente) . As contagens dos linfócitos nos dias 5, 8, 15 e 22 eram significativamente maiores que os valores de referência para o regime 1. A contagem dos linfócitos dos valores de referência para o regime 2 (dia 29 do regime 1) aumentou em relação à contagem dos linfócitos dos valores de referência para o regime 1, indiciando que os efeitos do primeiro regime de tratamento ainda estão presentes no dia 29. Além disso, as contagens dos linfócitos durante o regime 2 nos dias 5, 8 e 15 são superiores aos valores correspondentes para os dias 5, 8 e 15 durante o regime 1, no caso destes 12 doentes. 0 fenótipo da superfície celular dos linfócitos mostrava uma expansão dos linfócitos CD16+ e CD56+ (marcadores celulares das natural killers (NK)) a seguir à primeira semana da terapia com a hul4.18-IL-2. Este efeito ainda estava presente no dia 29 do regime 1 (dia 1, regime 2). No caso dos doentes 19 - 33 (que recebiam 4,8 - 7,5 mg/m2/dia) , determinou-se o fenótipo da superfície celular dos linfócitos nos dias 15 e 22 além dos dias 1 e 8. Esta análise demonstrou que o aumento das células que co-expressam os CD56 e CD56/CD16 continuou a ser significativamente grande (p < 0,01) nos dias 8, 15 e 22.

Como medida de activação imunitária, obteve-se níveis de proteína C-reactiva (PCR) no caso dos doentes 13 - 33, e níveis do receptor da IL-2 solúvel (sIL-2R) no caso dos 31 doentes que terminaram o regime 1. Um aumento significativo da PCR média verificou-se nos dias de tratamento 3-5, 31 tanto no regime 1 como no regime 2, em comparação com os valores de referência para cada regime. Este aumento da PCR regressou aos níveis de referência no dia 8 de cada regime de tratamento. 0 nível de sIL-2R aumentou de forma significativa em relação ao valor de referência, com início 24 horas após a infusão com a hul4.18-IL-2, durante tanto o regime 1 como o regime 2, persistindo ao longo do dia 8. Descobriu-se que o aumento do sIL-2R era em função da dose (p = 0,014). Verificou-se um aumento dos valores do sIL-2R do regime 2 relativamente aos valores correspondentes no regime 1 para os dias 1 - 5, no caso de doentes a receber a mesma dose em ambos os regimes (p < 0,05) .

Utilizou-se a linha celular de neuroblastoma LA-N-5, que expressa o GD2 e liga a hul4.18-IL-2, para avaliar a função das NK activadas pela IL-2 e a citotoxicidade celular mediada por anticorpos (ADCC), nas células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de 31 doentes a terminar o regime 1. Verificou-se um aumento significativo na morte (killing) mediada por linfócitos a partir do dia 8, em comparação com o dia 1 destes dois ensaios. Os 12 doentes, que receberam o regime 2 com a mesma dosagem que no regime 1, mostraram resultados de ADCC muito semelhantes aos obtidos durante o regime 1. O único parâmetro que se descobriu ser diferente para o regime 2 em relação ao regime 1 foi o aumento de morte (killing) na presença da IL-2 no dia 1, o que é indicador de que a morte aumentada neste ensaio continuou elevada no dia 29 (dia 1, regime 2).

Como o alvo LA-N-5 é relativamente resistente a células NK frescas, o mesmo pode ser empregue para medir a morte aumentada por IL-2, e a ADCC. No entanto, a morte fraca da LA-N-5 mediada por PBMC frescas em meio (sem IL-2 32 suplementar ín vitro) não era significativamente maior no dia 8 do que no dia 1).

No caso dos doentes 19 - 33, realizaram-se ensaios com NK padrão nos dias 1, 8, 15 e 22, recorrendo à linha celular-alvo K562 susceptivel às NK. Observou-se um aumento significativo da lise mediada pelas NK das células-alvos K562, quando se testou em meio ou na presença da IL-2, nos dias 8 e 22 relativamente ao dia 1. Também se avaliou amostras séricas de doentes seleccionados, de modo a determinar a actividade da IL-2 funcional e o anticorpo anti-GD2 funcional. A linha celular Tf-lb, que reage à IL-2, demonstrou uma proliferação induzida pela IL-2 com o soro de doentes obtido a seguir a infusão com a hui4.18-IL-2. Verificou-se um aumento progressivo da proliferação durante as primeiras 4 horas a seguir à infusão de 4 horas. Os valores regressaram aos valores de referência nas 16 horas após esta infusão, o que era consistente com o tempo de semi-vida sérica no caso da hul4.18-IL-2 de aproximadamente 4 horas. Também se analisou as amostras séricas destes pontos no tempo por meio de citometria de fluxo, relativamente à presença da imunocitoquina (IC) hul4.18-IL-2 intacta, que conserva a sua actividade do componente IL-2 e a sua actividade de anticorpo anti-GD2. A hui4.18-IL-2, capaz de se ligar à linha celular M21 (GD2-positiva) , era detectável nas amostras séricas dos doentes a seguir a infusão com a IC. A quantidade de IC capaz de se ligar à M21 aumentou de forma progressiva durante as primeiras 4 horas a seguir à infusão de 4 horas, e diminuiu depois disso, o que era de novo consistente como o tempo de semi-vida de aproximadamente 4 horas. 33

Por fim, realizou-se ensaios ín vitro com espécimes de doentes, para determinar se a administração da hul4.18-IL-2 tem por resultado condições ín vivo consistentes com as necessárias para atingir a ADCC. As PBMC do dia 8 mostram maior ADCC nas células-alvos GD2+, caso se adicione a hul4.18-IL-2 ao ensaio citotóxico. Realizou-se este mesmo ensaio de ADCC com as PBMC do dia 8, mas, em vez de se adicionar a hul4.18-IL-2 ao ensaio, adicionou-se o soro do doente obtido antes ou depois da administração da hul4.18-IL-2. As PBMC obtidas dos doentes no dia 8 do regime 2 eram capazes de mediar a morte aumentada da linha celular LA-N-5, na presença do soro obtido a seguir à administração da hul4.18-IL-2, em comparação com aquela que se observou com o soro obtido antes da infusão. Por conseguinte, a hul4.18-IL-2, que circulava nos doentes após a administração IV, é capaz de promover a ADCC com as PBMC activadas in vivo pela hul4.18-IL-2 desse mesmo doente.

Em suma, estes resultados indicam que houve alterações imunológicas associadas a esta terapia com a hul4.18-IL-2, inclusive um aumento na contagem dos linfócitos, um aumento da percentagem das PBMC CD16+ e CD56 + , um aumento da lise mediada pelas NK e um aumento da ADCC. Os indicios adicionais de activação imunitária incluíam um aumento dos níveis séricos da PCR e do sIL-2R. As análises laboratoriais do soro e das PBMC mostraram que a molécula hul4.18-IL-2 em circulação no soro dos doentes, a seguir à administração IV, conservava a sua capacidade de activar as células que reagem à IL-2 através do receptor da IL-2, e conservava a sua capacidade de se ligar às células tumorais GD2-positivas e de fornecer a IL-2 à sua superfície, como detectado por citometria de fluxo As células NK eram activadas in vivo com base na sua capacidade de mediar a 34 função de NK e ADCC in vitro. Além disso, as células NK activadas in vivo pela hul4.18-IL-2 ministrada nestes doentes eram capazes de mediar a ADCC, promovida pela hul4.18-IL-2 em circulação no soro desses mesmos doentes. Assim, alcançou-se as condições para conseguir a activação imunitária em todos os doentes do presente estudo. 35

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS •<1XS> Gillios , Sfc.epfesn D,

XiõKiS-MiSXg <X30» Sequências de iimnocitGquiua e as soas utilizações <I30> LSX-S23 m se/433,M3 <1SI» 2002-12:-17 < Ã € 0 > 6 •<170» Fatexs-fela ·ν&£·&1«8» 3 51. <23.0> I <211» 1X3

<313> PRT <213> Sequência artificial <22 0» <223» Região- wriável de cadeia leve de imnoglcfeulina hassanizaáa <409> 1

Aep Vsl Vai Thr Gin ΊΧγγ Pro 1,¾¾ Ser Len Fro Vai fhr Pro- Gly 1 S 10 15

Sl«. fro Ms Ssr Ila .Se^r Cy® Sm. Ser ®Xú. Bex Leu Vai Mis Am ao as só &s® Gly As® Tkr Tyr L®u Mis Trp Tyr 1,-¾¾. Gin Lys Pr» Gly Gin Ser 33 40 45

Pr» Xy® teu L®b XI® Hl.® Hyss Vai G®r ksn Krg Phs Ser Gly ¥al Pro 50 55 ' 60

Ssp Axg &hm Bsr Qly Sèn Sly W®x Gly 'fhx &sp Hh® 1¾¾ Less Lys Ile 65 70 7S BO

Ssr Argf Vai Giu Ma Olo Ãsp Leu Gly Vai Tyr Fhe Ser Gin Sar 85 30 55

Thr Mis Vai Fro Pro I,eu Thr Ph® Gly Ma Gly Thr Lys La» Glu Leu 100 105 110 36

Lys «3X0» 3 <212» 1X3

«2X2» M «21-3*· Seqnência artificial «22 ΰ» «333 » Região variava! de cadeia, pesada de issoEsoglobiillna hossaai.sada «COD> ,3 SXtt V&X Sln. tou Vai Sla S®r Gly Ala <Slu Y&X <3lu Hf® «ro Gly Alai 1 S ÍO .13

Ser y&l !>ys 11« Cys Xyss AI® S®r Sly Ser Ser I?hs> l!&y Qly 3¾¾ 30 25 30

Asei Mst &sn Trp vai Arg @im Asas Xis Gly Ays Ser &ôtx 0-1« ftp Ile 35 ' «0 " 4S

Gly Ala Ils Asp 2rc Tyr Tyr ®ly V?s v Ihr Ser Tyr to Glss. X.sya Fha so ss se hym Sly Arg Ais Thr l»s« “Xte VAI Assp t,y® Ser Ttsr Ser Xhr Ala Tyx 65 ' 7õ 75 βο

?fet. H£» Iaíi l»vs §®r tou Axe* Ser <31« &&p Tnr AX® Vai Tyt Tyr Cys $ft $0 S?S VAI Ser &.Ύ Mtet Tv* Trp Qly GIs Gly yhr a&r Vai &r VaX Sssr 100 · 10« lio

Sex «210» 3

«2XX» 15 <2X2* «ST «233> Sequência artificiai 37 «222:> Sequência de ligante «4005· 2

fí3.y (Sly Sly Kl/y Ser (sly Sly Sly Gly Ser Sly ®.y Siy Sly Sêx I 5 ' ’ 10· * IS <: .210 > 4 <21I> I0S31 κ2Χ2> ΑΠΜ «213» Sequência artifíciai «0205 <£.KS> Vfecfcor c<m tendo immeglobnlina bussanizada cadela leve e pesada e XL-2 <4005 4 gtegssafcfcg at.tstt.gadt sgt.t-sfcta&fc agfcaatoaafc t&eggsfgfcea fc.fcagtfc.eafca "«0 gcscafcatafc ggsgtfc.odgc gtfcaeafca&s tteacggfcsaa iggaocgKcfc. ggçtgac«g« 12 δ ccjsáogated «cgfccaafc&a tg&ogtstgt fteccafcag&a iss ggactttaea bbgaosjfcesa tgggtggagt atttacxggt.a aacKsjsceac tfcggcagtsa 243 atcaagtdta tc&tatgcca agtacç$cccc ctafctqacgt caafcssacçsct aaatggeccg 300 ~ cctggcatta tscccagtac atg&ccttat gggactttcc tactfcggcag tacatctaeg

3SG

tsfctagtcst: cg-ctafetadí? atggtgabgc ggttttggoá gàaeafcéaát gggsgfcggafe 42 Q agsggfct&ga e&sasrgggga. tt&ddaagt-s fcsscaseccafc tgacgtgas.b gggagmgt

Xis tttggcaeta aaataaacgg gsstttóQàs astgtçgfc&a «ss&ertcsge© ccãttgasgs S40 aaatgggcgg taggcgtgia cggfcgggagg tçfc&fcataag eagagctectc feggcfcasets

SOO cagaaceisac fegattsactg gcttatssaa abt&afcacga ctcasfcstag ggagaeastc 38 66 Ο tagaatgaag ttgcctgtta ggctgttggt gctgatgtte tggattcctg gtgaggagag 720 agggaagtga gggaggagaa tggacaggga gcaggagcac tgaatcccat tgctcattcc 780 atgtatctgg catgggtgag aagatgggtc ttatcctcca gcatggggcc tctggggtga B40 atacttgtta gagggaggtt ccagatggga acatgtgcta taatgaagat tatgaaatgg 900 atgcctggga tggtctaagt aatgccttag aagtgactag acacttgcaa ttcacttttt 960 ttggtaagaa gagattttta ggçtataaaa aaatgttatg taaaaataaa cgatcacagt 1020 tgaaataaaa aaaaaatata aggatgttca tgaattttgt gtataactat gtatttctct 1080 ctcattgttt cagcttcctt aagcgacgtg gtgatgaccc agacccccct gtccctgccc 1140 gtgacccccg gcgagcccgc ctccatctcc tgcagatcta gtcagagtct tgtacaccgt 1200 aatggaaaca cctatttaca ttggtacctg cagaagccag gccagtctcc aaagctcctg 1260 attcacaaag tttccaaccg atfcttctggg gtcccagaca ggttcagtgg cagtggatca 1320 gggacagatt tcacactcaa gatcagcaga gtggaggctg aggatctggg agtttatttc 1380 tgttctcaaa gtacacatgfc tcctccgctc acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg 1440 aaacgtatta gtgtgtcagg gtttcacaag agggactaaa gacatgtcag ctatqtgtga 1500 ctaatggtaa tgtcactaag ctgcgggatc ccgcaattct aaactctgag qgggtcggat 1560 gacgtggcca ttctttgcct aaagcattga gtttactgca aggtcagaaa agcatgcaaa 1620 gccctcagaa tggctgcaaa gagctccaac aaaacaattt agaactttat taaggaatag 1680 39 39 caaaacatca agattttaaa catgctgttt tctgtctgtc gggcagaact ttgttactta gcaccatctg tcttcatctt gttgtgtgcc tgctgaataa aacgccctcc aatcgggtaa acctacagcc tcagcagcac tacgcctgcg aagtcaccca ggagagtgtt agagggagaa catccttcgg cctctgaccc tcatctttca cctcaccccc aatgaataaa taaagtgaat tattatctgt tgtttaocaa cctaaggcgc ataaccattt tgcaagacag tcctccctca gtaggagaga çttgcttcct gggtgacagg tcttacggtc ggggaagcta ggaagaaact 1740 ctataattat ctgggataag 1800 tccgcaaaca acacacccaa 1860 tttcctcagg aactgtggct 1920 tgaaatctgg aactgcctct 1980 aagtacagtg gaaggtggat 2 040 agcaggacag caaggacagc . 2100 actacgagaa acacaaagtc • 2160 tcacaaagag cttcaacagg 2220 gttccagcct gaccccctcc 2280 ccctattgcg gtcctccagc 2340 ttatgctaat gttggaggag 2400 tctttcctca atttaataat 2460 gggactaaat atgtagtcat 2520 tattttaccc tatcatcctc 2580 tcacagtccc ctgggccatg 2640 qccctcatag tcctttttaa 2700 tacgcttatt ggtctccttg ectaacatgc cctgtgatta aacaccatcc tgtttgcttc cccgccatct gatgagcagt cttotatccc agagaggcca ctcccaggag agtgtcacag cctgacgctg agcaaagcag tcagggcctg agctcgcccg gtgcccccac ctgctcctca tttttccaca ggggacctac ctcctcctcc ttggctttaa ctttgcaçct gfcggtttctc ctactcaatt tctettataa ataaaaatca tccttcattc aacccacaag ccttctgtcc tgttttcccc tcctcagcaa atatatcctt tgattcaatt 40 40 aaatttttca aa®ga&cf.aaa atascaacae sat&aaagea tggfcactfceg scttaatgaa actcctgtçt gccaagggdo actgfcgagat taaaaacatt atatatteta taactcagca gaefcagtfcafc taatagtaaí: ccgcgttaca taactfcacgg atfcgacgtca ataatg&cgt toaattgggtg gagtatttac gocaagtaeg ccaectattg gtacafcgacc ctatgggact taocaeggtg atgoggtttt gggãtt.çeca agfcçtcseacc: aggggatctfct ccaàaatgtc tgfcacggfcgg gaggtcfcsts acfcggcttat cgaaattaat atgaagtfcge efcgttaggct cccfcggga&t ca&ccaaggo 2760 taatfcgcaac atgatatsaa 2820 ggasatgbt t aagl:tcat ca 2880 tet-taaacag gt.aetgaggg 2940 eefcaafctfcaa tccacactat 3000 tctatãaage tgagagac&a 3060 cgaegttgac afctgstx&tfc 3120 cafcagcccafc atatggagtt 3180 ecgcceaacg accecogccsc 3840 atagggacfct tccattgacg 3300 át&catcaaq feqtaKcatat 33 S0 cccgcctggc akfcatgccsca 3420 fc&cgtattag tcategctafc 3480 ggatagaggt ttgací;cacg 3540 ttgttttaqc accaaaaóca 3600

acgcãaãtgg geggtaggcg 3SSQ astaeagsac ecsetgetta 3720 coasgctcot cgaggct aga csctgct&taa agag&atcat attsaataaa caaacaafcag afegtcâtgcc ttatttacat gtattgagfca «tttccaoaa catt:a&áatg tfcgeastaggt sfccceaefcte tagggtcgat caa&feaaggg gtuattagtfc taaatggccc gcctggetga atg&tcccat agcaacgcca ggtsaactgc ccaettggca aogtcaatga cggtaaatgg ttcetscttg gcagtacatc ggcagtacat caatgggcgt ccsttgacgt caatgggagt gta&caacfcc cgccccattg taagcagagc tctefcggcts acgac t cacfc atagggagac gfctggtgctg etgfctetgga 41 3780 ttcctggtga ggagagaggg aagtgaggga ggagaatgga cagggagcag gagcactgaa 3840 tcccattgct cattccatgt atctggcatg ggtgagaaga tgggtcttat cctccagcat 3900 ggggcctctg gggtgaatac ttgttagagg gaggttccag atgggaacat gtgctataat 3960 gaagattatg aaatggatgc ctgggatggt ctaagtaatg ccttagaagt gactagacac 4020 ttgcaattca ctttttttgg taagaagaga tttttaggct ataaaaaaat gttatgtaaa 4080 aataaacgat cacagttgaa ataaaaaaaa aatataagga tgfctcatgaa ttttgtgtat 4140 aactatgtat ttctctctca ttgtttcagc ttccttaagc gaggtgcagc tggtgcagtc 4200 cggcgccgag gtggagaagc ccggcgcctc cgtgaagatc tcctgcaagg cctccggctc 4260 ctccttcacc ggctadaaca tgaactgggt gcgecagaac atcggcaagt ccctggagtg • 4320 gatcggcgcc atcgacccct actacggcgg cacctcctac aaccagaagt tcaagggccg 4380 cgccacccfcg accgtggaca agtccacctc caccgcctac atgcacctga agtccctgcg 4440 ctccgaggac accgccgtgt actactgcgt gtccggcatg gagtactggg gccagggcac 4500 ctccgtgacc gtgtcctccg gtaagctttt ctggggcagg ccaggcctga ccttggcttt 4560 ggggcaggga gggggctaag gtgaggcagg tggegccagc caggtgcaca cccaatgccc 4620 atgagcccag acactggacg ctgaacctcg cggacagtta agaacccagg ggcctctgcg 4680 ccctgggccc agctctgtcc cacaccgcgg tcacatggca ccacctctct .tgcagcctcc 4740 aecaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 4800 42 42 cggctatgca gtcccagtcc agggcagcaa 5160 gcctctgccc gccccactca tgctcaggga 5220 gggcaggcac aggctaggtg cccctaaccc 5280 gctcagacct gccaagagcc atatccggga 5340 aaggccaaac tctccactcc ctcagctcgg 5400 tcccaatctt ctctctgcag agcccaaatc 5460 cccaggtaag ccagcccagg cctcgccctc 5520 agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg 5580 cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag 5640 ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca 5700 accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg 5760 agccgcgggá ggagcagtac aacagcacgt 5820 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac 4660 tcaggcgecc tgaccagcgg cgtgcacacc 4920 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc 4980 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc 5040 gcacagggag ggagggtgtc tgctggaagc 5100 ttcçccgaac cggtgacggt gtcgtggaac ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tccagcagct tgggcaccca gacetacatc aaggtggaca agagagttgg tgagaggcca caggctcagc gctcctgcct ggacgcatcc ggcaggcccc gtctgcctct tcacccggag gagggtcttc tggctttttc cccaggctct aggccctgca cacaaagggg caggtgctgg ggaccctgcc cctgacctaa gcccacccca acaccttctc tcctcccaga ttccagtaac ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt cjtgctgacac gtccacctcc atctcttcct tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc 43 accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag 5880 cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aaggtgggac ccgtggggtg cgagggccac 5940

atggacagag gccggctcgg cccaccctct gccctgagag tgaccgctgt accaacctct SOOO gtccctacag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc acgggaggag 6060 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 6120 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 6180 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 6240 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 6300 cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa gccccaactt caagttctac aaagaaaaca 6360 cagctgcaac tggagcatct cctgctggat ctccagatga ttctgaatgg aattaacaac 6420 tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc acattcaagt tctacatgcc caagaaggcc 6480 acagagctca aacatctcca gtgtctagag gaggaactca aacctctgga ggaagtgcta 6540 aacctcgctc agagcaaaaa cttccactta agacctaggg acttaatcag caatatcaac 6600 gtaatagttc tggaactaaa gggatccgaa acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag 6660 acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga tggattacct tttgtcaaag catcatctca 6720 acactaactt gataattaag tgctcgaggg atccagacat gataagatac attgatgagt 6780 ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg 6840 ctattgcttt atttgtaacc attagaagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca 44 6900 ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc 6960 tctacaaatg tggtatggct gafctatgatc ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 7020 aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 7080 gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat 7140 gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tacfcggctta actatgcggc atcagagcag 7200 attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 7260 taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 7320 ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 7380 gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 7440 gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 7500 cgctcaagtc agaggtggcg saacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 7560 ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 7620 tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg 7680 gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt. gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 7740 tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 7800 ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 7860 ttcttgaagt ggtggoctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 7920 45 ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg cáaacaaacc 7980 accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 8040 tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctqacg ctcagtggaa cgaaaactca 8100 agttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 8160 taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 8220 caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtç tatttcgttc atccatagtt 8280 gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 8340 gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 8400 ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtet 8460 attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 8520 gtcgccattg ctgcaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcactcagc 8580 tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 8640 agctccttcg ghcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 8700 gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 8760 actggtgagt,actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 8820 tgc.ccggcgt caacacggga taataccgcg ccacatagca gâactttaaa agtgctcatc 8880 attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 8940 46 tcçfafcgt**C! cftsctcgtgc aaccaaetga ècttcagcat ctfcttacttfc caccagcgtt 3000 tctgggtgag oa&aaacagrg **ggrca««Afc gccgcsaaaa agggaataag ggcgacacgg 9060 aaafcgttgaa fcaotcatact cfcfcccfctttfc caatattatt gaagcatct-a tcagggfctai 3120 tgtçfcaatga goggataeat atfctgaatgfc atttagaaaa ataaacftaat aggggttccg 9180 ogcaeatbto cccgaaaagt gccaectgac gtctaagaaa csfettaUtãt catgacatta 3240 aeetata&aa ataggcgtat caegaggcca tttagrtcfctc &ftgast£ceg atceagacat 93 00 gataagatac attgatgagt t.tggacaasa c&caactaga afccjcsgfcgaa aaaaatgett 9360 tafctfcgtgma atttgtgatg ctatfcgcfctt attfcgfcaacc sttagsagct <jc&a£aaaea 9420 agttaacaao aa.caattgca ttcatfcfct&t. gtttcággtt cagggqgagg fcgfcgggaggt ' 3480 fcfcfcttaaagc aagtaaaaec tebac&aafcg tggtat-ggcfc: gatfcatgatc tasagccage 9540 aasagtcccã tggccetafca aaaatrgcata gctttcgpgag gggagcagag aacrttgaaag 9600 cafcettcctg «.tagtctittc ttctcgtaga. ecttaa&fcfcc atacfetgatt octttttíjct. 9600 çctggacetc agagaggacg cctgqgtatt ct-gggagaag fctfeatsttfca ceeaaafcaaa 9720 tttctgggas aaaegtgtca cttbcaaatt cctgcafcgat ccfctgfcoaoa aagagtctga 97S0 ggtggcctgg tfcgátccacg gefctcc^ggt, aaacagaacfc gectcoasct «fcccaaaeca 9840 tgtctacttt: acfcfcgecaat taeggtsgirt· esafcaagtet taaggcatca fcceaaact.tt. 9900 tggcaagaaa afcgaçjctacfc cgfeggfeggttti ctttgagfetc totaetgag® actat&ttâa 9960 ttctgfccctt fcaaaggçcga ttcttctcag gaatggagaa ccaggtttfce ctaoccat&a 47 aa«t.;*ctt9& as os® ^m^mm miAú: pit^SsgSvs; .«&&£££$«$» isass ^sgcrotS·^® fc&ètfcs£§â& &fc«gKSfc«S!8t& asa ao 0C®O ofags?§9s: ®feg«4ft®sM5.fe : ®®.s«ás>s®tfe : :.s í.; 3 í ·> 1^9¾¾^¾¾ g*v S^vK-^ps 99>s«tst^t: *·«<». ;1U>a&0

tt^ssásófs» $«fcf$Êgg»fS3 efeggggMeftfc. ^®w»«ÍS ..¾¼% :-^fct:§cs0ást e^SSaStfess s»s&t«tg>s stgstei ^sôioo gáwsat^t^is?«c & OK» i-<ai> np··.· *Sl:3v && ··.; 17 v seçraêrímft ârts.f ieisl •tf. ΐίχΐΟ^·

«tOOs S ^ tesls l%x Ϊ?«ϊ> 3¾¾ S«5? JS»® fôsxs v«:| 1S3« ??rc· Sl;f •Ϊ 4 S 1.¾ %:? ,-><;. S>XV5 ja& âí&r 11» a<p? £íps Ms? &sr Sás® «I® S^a; 3*1 ¥sl Si» %ftr " m. ' ss st

&««s aslv &s»S Tfhr a^Sr as® &i*s fap syr &&&.'<&&& i-ys fa?s> Si;y c$a« ásssr .3» :, '%&' «S 48 fro ím hm. S»eu. rle Si® &«a Arg £he &er Sly Vai pro m ss so

Asp &rg Ffts Ser GXy Ser Sly Ser fôly fíur Asp Vhe ac LíSU 1¾¾ χχ® SS 70 75 §0 teg ?&! (SXu Ale íllu Asp X*su <lly y&X lyr Pfea Cys Ser Glu Sex ss &o ' m

Thr Sis Tal lírp ?r* L$u Ihr Ê>h® fíly M* Gig írhr Lys I*@e Glu Lee. κ>0 ias no

Lvs Arg 7&r Vai Ale Ala Fro Ser Vai Mie Ile Mis Pró Pro Ser &ép 13,5 ISO 115 01.U. Sla Lee Itm Ssr Sly Thr M.a Ssr V&X Tal Cyo Lee. tóu Jtos Asm 130 ' " 13 S 140

Fh.® Tyr Fro ârg 0lu Ala Lys ¥'ai Cãln Trp Lys ¥®1 Asp &&t% Alo Leu 145 ISO XS§ l€Qt

ííIís Ser Oly Asn Ser Glia Olu Ser Vai Tísr <Slu Sla Asp Ser Lye Asp 1«5 170 17S

Ser 5ta $yxr Ser Leu ser Ser TJar ímx fffet- Leu Per Ay» Ala Ά&& *£#%· ISO IBS 1P0

Glu %'.§ H;is tije Tal Tvx Ala Cys Slu Vai TAr Hia Glrs íXXy Lev S®* .' 1SS ' * 20® S 0 S

Ser Oro ¥«1 Thr Lys Ser fh.e Aso Arg Giy CSlts εΑκ; 210 315 220 <210> 5 «211» 575 «2.22» Ρ&Χ' «211» Seípisnela artificial «220» «222» Cadela pesada de issancgl caulina htraanizada e IL-2 49 <400> 6

Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Glu Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe 1hr Gly Tyr 20 25 30

Asn Met Asn Trp Vai Arg Gin Asn Ile Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Vai Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 ~ 70 75 80

Met His Leu Lys Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Vai Ser Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Vai Thr Vai Ser 100 ' 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 115 120 125

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp 130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160

Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175

Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin 180 -185 190

Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp 195 200 ’ 205 50

Lys Arg Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Hia Thr Cys Pro Pro 210 " 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr 245 250 255

Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn· 260 265 270

Trp Tyr Vai Asp Gly \7al Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 ' 280 285

Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai 290 295 300

Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser 305 310 315 320

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu • 340 345 350

Glu Met Thr' Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe 355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 405 410 415 51

Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430

Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser 435 440 445

Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gin 450 455 460

Met Ile Leu Asn- Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg 465 470 475 " 480

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys 485 * 490 495

His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Vai Leu 500 505 510

Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile 515 520 525

Ser Asn Ile Asn Vai Ile Vai Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr 530 535 540

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Vai Glu Phe Leu 545 550 555 560

Asn Arg Trp' Ile Thr Phe Cys Gin Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 565 570 575

Lisboa, 21 de Setembro de 2010

Claims (5)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma proteína de fusão de anticorpo humanizado-IL2 com a designação de hul4.18-IL2, que se liga de forma específica ao GD2 e estimula a função imunitária, contendo a cadeia leve da SEQ ID NO: 5 e a cadeia pesada da SEQ ID NO: 6.

2. Um vector abrangendo a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 4, que contém as sequências de ácidos nucleicos que codificam a proteína de fusão da reivindicação 1.

3. Composição farmacêutica contendo a proteína de fusão da reivindicação 1 e um excipiente ou um suporte farmacêutico.

4. Utilização da proteína de fusão da reivindicação 1, na produção de um medicamento para estabilizar a progressão da patologia em doentes cancerosos positivos para o GD2.

5. Utilização da proteína de fusão da reivindicação 1, na produção de um medicamento para aumentar a actividade de lise mediada pelas NK e ADCC em doentes cancerosos positivos para o GD2. Lisboa, 21 de Setembro de 2010