EA016429B1 - Антитела против cd19 с пониженной иммуногенностью - Google Patents

Abstract

Раскрыты антитела В4 против CD19 с модифицированными вариабельными областями. Полипептиды модифицированных вариабельных областей антитела против CD19 имеют изменения в одной или более чем в одной каркасной области или участке, определяющем комплементарность, вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, что приводит к ослаблению Т-клеточного ответа.

Description

Изобретение относится в основном к вариабельным областям легкой цепи и тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела В4 против СИ19, модифицированным с целью снижения их иммуногенности.

Предшествующий уровень техники

СИ19 представляет собой поверхностный белок, найденный на В-клетках и на некоторых раковых клетках, происходящих от В-клеток, например на многих В-клеточных лимфомах. Уже получены в мышах моноклональные антитела против СИ19, и в доклинических экспериментальных моделях на животных с В-клеточными раковыми опухолями показана их перспективность. Однако антитела, происходящие от мыши, обычно являются иммуногенными для человека. С целью минимизации их иммуногенности для человека разработано несколько стратегий изменения антител, происходящих от мыши. Одна из таких стратегий, химеризация, включает слияние вариабельных областей мышиного антитела с константными областями антитела человека. Однако остающиеся после химеризации последовательности вариабельных областей, происходящие от мыши, часто являются иммуногенными. Другая такая стратегия, гуманизация, включает замещение происходящих от мыши каркасных областей (ЕВ), расположенных в вариабельных областях, последовательностями, происходящими от организмов, наиболее близкородственных человеку, с возможной реверсией некоторых аминокислот снова к соответствующим мышиным аминокислотам для сохранения связывающей активности. Однако даже гуманизированные антитела могут быть иммуногенными, так как участки антитела, определяющие комплементарность (СИК.), обычно содержат эпитопы, распознаваемые В-клетками, и эпитопы, распознаваемые Т-клетками, являющиеся не-своими. Действительно, даже полностью человеческие антитела являются иммуногенными, и это является основой для образования антиидиотипических антител в процессе иммунного ответа. Все эти проблемы можно отнести к антителам против СИ19, происходящим от мыши, точно так же, как они относятся к любому другому типу антитела. Поэтому существует необходимость в антителах против СИ19 с пониженной иммуногенностью.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к мышиному моноклональному антителу В4 против СИ19, которое модифицировано с целью снижения его иммуногенности по сравнению с антителом В4 дикого типа. Более конкретно, вариабельная область антитела В4 по изобретению модифицирована с целью удаления потенциальных эпитопов, распознаваемых Т-клетками. В результате, антитела В4 по изобретению имеют улучшенные биологические свойства по сравнению с антителами В4 дикого типа.

Соответственно, в одном аспекте отличительным признаком изобретения является аминокислотная последовательность, определяющая модифицированную каркасную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащая аминокислотные остатки 1-30 8ЕЦ ГО N0: 22, где один или более чем один из аминокислотных остатков в позициях Х5, Х12, Х19, Х20, Х23 и Х24 является следующим: Х5 представляет собой О или Е, Х12 представляет собой V или К, Х19 представляет собой В или К, Х20 представляет собой Ь или V, Х23 представляет собой К, Е или Ό, или Х24 представляет собой Т или А. Согласно данному аспекту изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков в позициях Х5, Х12, Х19, Х20, Х23 или Х24 отличается от аминокислоты в соответствующей позиции в немодифицированной каркасной области тяжелой цепи иммуноглобулина, соответствующей аминокислотным остаткам 1-30 в 8ЕЦ ГО N0:13. В одном воплощении Х23 представляет собой Е или Ό.

В другом аспекте отличительным признаком изобретения является аминокислотная последовательность, определяющая модифицированную каркасную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащая аминокислотные остатки 1-14 8ЕЦ ГО N0: 23, где один или более чем один из аминокислотных остатков в позициях Х3, Х5, Х7 и Х8 является следующим: Х3 представляет собой К или В, Х5 представляет собой В, Т или А, Х7 представляет собой О, Ό или Е, или Х8 представляет собой О или К. Согласно данному аспекту изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков в позициях Х3, Х5, Х7 или Х8 отличается от аминокислоты в соответствующей позиции в немодифицированной каркасной области тяжелой цепи иммуноглобулина, соответствующей аминокислотным остаткам 36-49 в 8ЕЦ ГО N0: 13. В одном воплощении Х7 представляет собой Е или Ό.

В другом аспекте отличительным признаком изобретения является аминокислотная последовательность, определяющая модифицированную каркасную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащая аминокислотные остатки 1-39 8ЕЦ ГО N0: 24, где один или более чем один из аминокислотных остатков в позициях Х6, Х10, Х26, Х29 и Х34 является следующим: Х6 представляет собой К, Ό или Е, Х10 представляет собой К, Е или Ό, Х26 представляет собой 8, Ό или Е, Х29 представляет собой 8 или А, или Х34 представляет собой V или Т. Согласно данному аспекту изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков в позициях Х6, Х10, Х26, Х29 или Х34 отличается от аминокислоты в соответствующей позиции в немодифицированной каркасной области тяжелой цепи иммуноглобулина, соответствующей аминокислотным остаткам 60-98 в 8ЕЦ ГО N0: 13. В одном воплощении Х10 представляет собой Е или Ό.

Согласно другому аспекту отличительным признаком изобретения является аминокислотная последовательность, определяющая модифицированную каркасную область легкой цепи иммуноглобулина,

- 1 016429 содержащая аминокислотные остатки 1-23 δΕΟ ГО N0: 32, где один или более чем один из аминокислотных остатков в позициях Х1, Х3, Х7, Х10, Х11 и Х19 является следующим: Х1 представляет собой О или Ό, Х3 представляет собой V или А, Х7 представляет собой δ или Е, Х10 представляет собой I или Т, Х11 представляет собой М или Ь, или Х19 представляет собой V или А. Согласно данному аспекту изобретения по меньшей мере один из аминокислотных остатков в позициях Х1, Х3, Х7, Х10, Х11 или Х19 отличается от аминокислоты в соответствующей позиции в немодифицированной каркасной области легкой цепи иммуноглобулина, соответствующей аминокислотным остаткам 1-23 в δΕΟ ГО N0: 25. В одном воплощении Х3 представляет собой А и Х7 представляет собой Е. В другом воплощении Х1 представляет собой Ό, Х10 представляет собой I и Х11 представляет собой Ь.

В другом аспекте отличительным признаком изобретения является аминокислотная последовательность, определяющая модифицированный участок, определяющий комплементарность, легкой цепи иммуноглобулина, содержащая аминокислотные остатки 24-33 в δΕΟ ГО N0: 28.

В другом аспекте отличительным признаком изобретения является аминокислотная последовательность, определяющая модифицированную каркасную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащая аминокислотные остатки 56-87 в δΕΟ ГО N0: 28.

Согласно другому аспекту отличительным признаком изобретения является вариабельная область антитела, содержащая аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из δΕΟ ГО N0: 14, δΕΟ ГО N0: 15, δΕΟ ГО N0: 16, δΕΟ ГО N0: 17, δΕΟ ГО N0: 20, δΕΟ ГО N0: 21, δΕΟ ГО N0: 26, δΕΟ ГО N0: 27, δΕΟ ГО N0: 28, δΕΟ ГО N0: 29, δΕΟ ГО N0: 30 или δΕΟ ГО N0: 31, где вариабельная область антитела специфически связывается с СБ19.

Согласно другому аспекту отличительным признаком изобретения является полипептид, который по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентичен вариабельной области тяжелой цепи антитела В4, содержащий аминокислотную замену одного или более чем одного остатка, соответствующего να112, Ьеи20, Ьу823, Тйт24, Ьу538, С1у42, С1и43, Ьу8б5, Ьу8б9, 8ет85, 8ег88 или να193. В одном из воплощений данный полипептид содержит одну или более чем одну замену, выбранную из С1и5С1и, να112Εν5. Атд19Ьу8, Ееи2(№а1. Ьу823С1и, Ьу823А8р, Тйт24А1а, Ьу538Агд, Атд40Тйт, С1у42А§р, С1у42С1и, С1и43Еу8, Ьу8б5А8р, Ьу865С1и, Ьу869С1и, Ьу8б9А8р, 8ет85А§р, 8ет85С1и, 8ет88А1а или ν;·ι193Τ1ΐΓ.

Согласно другому аспекту отличительным признаком изобретения является полипептид, который по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентичен вариабельной области легкой цепи антитела В4, содержащий аминокислотную замену одного или более чем одного остатка, соответствующего να13, 8ет7, 11е10, Ме111, να119, να129, 8ет51, Ьеи53, А1а54 или 8ет75. В одном из воплощений данный полипептид содержит одну или более чем одну замену, выбранную из С1и1А8р, Vа13А1а, 8ет7С1и, 11е10Тйт, Ме111Ьеи, Vа119А1а, Vа129А1а, 8ет51А§р, Ееи53Тйт, А1а54А§р или 8ет75С1и.

В другом аспекте отличительным признаком изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по любому из воплощений изобретения.

В другом аспекте отличительным признаком изобретения является способ лечения пациента, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества полипептида по любому из воплощений изобретения пациенту.

В другом аспекте отличительным признаком изобретения является способ направленной доставки к клетке, имеющей на своей поверхности СБ19, включающий стадию введения вариабельной области антитела по любому из воплощений изобретения. В одном из воплощений данного способа данная клетка представляет собой опухолевую клетку.

Таким образом, изобретение относится к модифицированному антителу В4, которое является менее иммуногенным, чем немодифицированное антитело В4 при введении человеку, но все еще остается способным специфически связываться с СБ19 и распознавать клетки-мишени, экспрессирующие СБ19, и которое содержит по меньшей мере одну из следующих каркасных областей тяжелой цепи иммуноглобулина:

(1) ^V^^X5^Ρ6АЕVX₁₂ΚΡ6АδVX₁₉X₂₀δСX₂зX₂₄δ6ΥΤΕΤ (δΕΟ ГО N0: 22), где Х₅ представляет собой О или Е, Х₁₂ представляет собой V или К, Х₁₉ представляет собой В или К, Х₂₀ представляет собой Ь или V, Х₂₃ представляет собой К, Е или Ό и Х₂₄ представляет собой Т или А, при условии, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков в указанных позициях отличается от аминокислоты в соответствующей позиции в аминокислотных остатках 1-30 в δΕΟ ГО N0: 13;

(2) №¹УХ₃ОХ5РХ7Х8СЬЕ№1С (δΕΟ ГО N0: 23), где Х₃ представляет собой К, Х₅ представляет собой В, А или Т, Х₇ представляет собой С и Х₈ представляет собой О или К, при условии, что один из аминокислотных остатков в позиции Х₅ или Х₈ отличается от аминокислоты в соответствующей позиции в аминокислотных остатках 36-49 в δΕΟ ГО N0: 13;

(3) ΥN^КΕX₆СКАX₁₀^ΤV^КδδδΤАΥМΕVδX₂₆^ΤX₂₉Ε^δАX₃₄ΥΥСАВ (δΕΟ ГО N0: 24), где Х₆ представляет собой К, Ό или Е, Х₁₀ представляет собой К, Е или Ό, Х₂₆ представляет собой δ, Ό или Е, Х₂₉ представляет собой δ или А и Х₃₄ представляет собой V или Т, при условии, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков в указанных позициях отличается от аминокислоты в соответствующей позиции в аминокислотных остатках 60-98 в δΕΟ ГО N0: 13.

Соответствующему модифицированному антителу, содержащему каркасные области тяжелой цепи

- 2 016429 (1), (2) и (3).

Соответствующему модифицированному антителу В4, которое является менее иммуногенным, чем немодифицированное антитело В4 при введении человеку, но все еще остается способным специфически связываться с ΕΌ19 и распознавать клетки-мишени, экспрессирующие С019, и которое содержит следующие каркасные области легкой цепи иммуноглобулина:

(4) Х₁1Х₃ЬТрХ7РАХ₁оХ118А§Р6ЕКХ₁₉ТМТС (8ЕС ΙΌ N0: 32), где Х₁ представляет собой О или Ό, Х₃ представляет собой V или А, Х₇ представляет собой 8 или Е, Х₁₀ представляет собой Ι или Т, Х₁₁ представляет собой М или Ь и Х₁₉ представляет собой V или А, при условии, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков в указанных позициях отличается от аминокислоты в соответствующей позиции в аминокислотных остатках 1-23 в 8Е0 ΙΌ N0: 25.

Соответствующему модифицированному антителу В4, где Х3 представляет собой А и Х7 представляет собой Е.

Соответствующему модифицированному антителу В4, где Х1 представляет собой Ό, Х₁₀ представляет собой Ι и Х_п представляет собой Ь.

Соответствующему модифицированному антителу В4, содержащему каркасные области тяжелой цепи (1), (2) и (3) и каркасную область легкой цепи (4).

Соответствующему модифицированному антителу В4, содержащему следующий участок, определяющий комплементарность, (СОВ) легкой цепи иммуноглобулина: 8А88САХУМН (аминокислотные остатки 24-33 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 28).

Модифицированному антителу В4, которое является менее иммуногенным, чем немодифицированное антитело В4 при введении человеку, но все еще остается способным специфически связываться с СП19 и распознавать клетки-мишени, экспрессирующие ΕΌ19. и которое содержит по меньшей мере одну из следующих аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи, выбранных из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 14, 8ЕЦ ΙΌ N0: 15, 8ЕЦ ΙΌ N0: 16, 8ЕЦ ΙΌ N0: 17, 8ЕЦ ΙΌ N0:18, ЛЕС ΙΌ N0: 19, ЛЕС ΙΌ N0: 20, ЛЕС ΙΌ N0: 21.

Модифицированному антителу В4, которое является менее иммуногенным, чем немодифицированное антитело В4 при введении человеку, но все еще остается способным специфически связываться с СП19 и распознавать клетки-мишени, экспрессирующие С019, и которое содержит по меньшей мере одну из следующих аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи, выбранных из группы, состоящей из ЛЕС ΙΌ N0: 26, ЛЕС ΙΌ N0: 27, ЛЕС ΙΌ N0: 28, ЛЕС ΙΌ N0: 29, ЛЕС ΙΌ N0: 30 и ЛЕС ΙΌ N0: 31.

Соответствующему модифицированному антителу В4, содержащему по меньшей мере одну из следующих аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи, выбранных из группы, состоящей из ЛЕС ΙΌ N0: 14, ЛЕС ΙΌ N0: 15, ЛЕС ΙΌ N0: 16, ЛЕС ΙΌ N0: 17, ЛЕС ΙΌ N0:18, ЛЕС ΙΌ N0:19, ЛЕС ΙΌ N0: 20, ЛЕС ΙΌ N0: 21, и по меньшей мере одну из следующих аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи, выбранных из группы, состоящей из ЛЕС ΙΌ N0: 26, ЛЕС ΙΌ N0: 27, ЛЕС ΙΌ N0: 28, ЛЕС ΙΌ N0: 29, ЛЕС ΙΌ N0: 30 и ЛЕС ΙΌ N0:31.

Соответствующему модифицированному антителу В4, содержащему следующие тяжелую и легкую цепи, выбранные из группы, включающей:

(1) вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую ЛЕС ласть легкой цепи, соответствующую ЛЕС ΙΌ N0: 26;

(2) вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую ЛЕС ласть легкой цепи, соответствующую ЛЕС ΙΌ N0: 27;

(3) вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую ЛЕС ласть легкой цепи, соответствующую ЛЕС ΙΌ N0: 28;

(4) вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую ЛЕС

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

N0:

N0:

N0:

14,

15,

16, вариабельную вариабельную вариабельную

N0:

17, вариабельную обобобобобобоби ласть легкой цепи, соответствующую ЛЕС ΙΌ N0: 29; что является предпочтительным;

(5) вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую ЛЕС ΙΌ N0: 18, и вариабельную ласть легкой цепи, соответствующую ЛЕС ΙΌ N0: 29, что является предпочтительным;

(6) вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую ЛЕС ΙΌ N0: 20, и вариабельную ласть легкой цепи, соответствующую ЛЕС ΙΌ N0: 30; и (7) вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую ЛЕС ΙΌ N0: 21, и вариабельную ласть легкой цепи, соответствующую ЛЕС ΙΌ N0: 31.

Соответствующему модифицированному антителу В4, содержащему следующий участок, определяющий комплементарность, (СОВ) легкой цепи иммуноглобулина: 8А88САХУМН (аминокислотные остатки 24-33 в ЛЕС ΙΌ N0: 28).

Полипептиду, который по меньшей мере на 90% идентичен вариабельной области тяжелой цепи антитела В4, которое является менее иммуногенным, чем немодифицированное антитело В4 при введении человеку, но все еще остается способным специфически связываться с СО 19 и распознавать клеткимишени, экспрессирующие С019, и который содержит аминокислотную замену одного или более чем одного остатка, соответствующего ναΙ 12, Ьеи20, Ьу823, Тйт24, С1у42, Ьу538, Ьу865, Ьу869, 8ег85 или να193.

- 3 016429

Соответствующему полипептиду, где полипептид по меньшей мере на 95% идентичен вариабельной области тяжелой цепи антитела В4.

Соответствующему полипептиду, где полипептид содержит одну или более чем одну замену, выбранную из С1и5С1и, Уа112Ьуб, Атд19Ьу8, Ьеи20Уа1, Ьуб23С1ц, Ьуб23Абр, Т1г24А1а, Ьуб38Агд, С1у42Абр, С1у42С1и, Ьу8б5Абр, Ьубб5С1и, Ьубб9С1и, Ьу8б9Абр, 8ет85Абр, 8ет85С1и или Уа193Т1п.

Соответствующему полипептиду, который по меньшей мере на 90% идентичен вариабельной области легкой цепи антитела В4, которое является менее иммуногенным, чем немодифицированное антитело В4 при введении человеку, но все еще остается способным специфически связываться с С.П19 и распознавать клетки-мишени, экспрессирующие СЭ19, и который содержит аминокислотную замену одного или более чем одного остатка, соответствующего Уа13, 8ет7, 11е10, МеП1, Уа119, Уа129, 8ет51, Ьеи53, А1а54 или 8ет75.

Соответствующему полипептиду, где полипептид по меньшей мере на 95% идентичен вариабельной области легкой цепи антитела В4.

Соответствующему полипептиду, где полипептид содержит одну или более чем одну замену, выбранную из С1и1Абр, Уа13А1а, 8ет7С1и, 11е10Т1г, МеШЬеи, Уа119А1а, Уа129А1а, 8ет51Абр, Ьеи53Тйт, А1а54Азр или 8ет75С1и.

Модифицированному антителу В4, содержащему полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотные замены С1и5С1и, Уа112Ьуб, Атд19Ьуб, Ьеи20Уа1, Ьуб23С1и, Ьуб23Абр, Т1г24А1а, Ьуб38Атд, С1у42Абр, С1у42С1и, Ьубб5Абр, Ьубб5С1и, Ьубб9С1и, Ьубб9Абр, 8ет85Абр, 8ет85С1и или Уа193Т1г, и полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотные замены С1и1Абр, Уа13А1а, 8ет7С1и, 11е10Т1г, МеШЬеи, Уа119А1а, Уа129А1а, 8ет51Абр, Ьеи53Тйт, А1а54Азр или 8ет75С1и.

Молекуле ДНК, кодирующей модифицированное антитело В4 или соответствующий полипептид, такие, как определено выше и ниже. Экспрессирующему вектору, содержащему соответствующую молекулу ДНК.

Клетке-хозяину, экспрессирующей модифицированное антитело В4 или соответствующий полипептид, такие, как определено в данном описании. Фармацевтической композиции, подходящей для лечения онкологического заболевания и аутоиммунных заболеваний, содержащей фармакологически эффективное количество антитела или полипептида, таких как определено выше и ниже, возможно вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или эксципиентом. Применению соответствующей фармацевтической композиции в изготовлении лекарства для лечения аутоиммунных заболеваний или онкологического заболевания.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела В4 (В4 УН0) (8Εβ ΙΌ N0: 1).

На фиг. 2 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область тяжелой цепи антитела В4, включающая кодоны для мутаций К23Е, Ο42Ό, Кб9Е и 885Ό (В4 УНу1) (8Εβ ΙΌ N0: 2).

На фиг. 3 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область тяжелой цепи антитела В4, включающая кодоны для мутаций Кб9Е и 885Ό (В4 УНу2) (8Εβ ΙΌ N0: 3).

На фиг. 4 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область тяжелой цепи антитела В4, включающая кодоны для мутаций β5Ε, У12К, К19К, Ь20У, Т24А, 885Ό и 888А (В4 УНу3) (51 У) ΙΌ N0: 4).

На фиг. 5 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область тяжелой цепи антитела В4, включающая кодоны для мутаций β5Ε, В19К, Ь20У, К40Т, Р43К, Кб5Э, 885Ό, 888А и У93Т (В4 УНу4) (51 У) ΙΌ N0:5).

На фиг. б показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область тяжелой цепи антитела В4, включающая кодоны для мутаций β5Ε, У12К, К19К, Ь20У, Т24А, К38В, В40А, Р43К, Кб5Э, 885Ό и У93Т (В4 УНу5) (51Т) ΙΌ N0: б).

На фиг. 7 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область тяжелой цепи антитела В4, включающая кодоны для мутаций β5Ε, В19К, Ь20У, Кб5Э, 885Ό и У93Т (В4 УНуб) (51 У) ΙΌ N0: 7).

На фиг. 8 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область легкой цепи антитела В4 (В4 УК0) (8Εβ ΙΌ N0: 8).

На фиг. 9 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область легкой цепи антитела В4, включающая кодоны для мутаций У3А, 87Ε и А54Э (В4 УКу1) (51Т) ΙΌ N0: 9).

На фиг. 10 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область легкой цепи антитела В4, включающая кодоны для мутаций β1Ό, П0Т, М11Ь и А54Э (В4 УКу2) (51Т) ΙΌ N0: 10).

На фиг. 11 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область легкой цепи антитела В4, включающая кодоны для мутаций П0Т, М11Ь, У19А, У29А и

- 4 016429

875Е (В4 νΚν3) (8Ер ΙΌ N0: 11).

На фиг. 12 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая типичную вариабельную область легкой цепи антитела В4, включающая кодоны для мутаций 110Т, М11Ь, νΐ9Α, 851Ό и Ь53Т (В4 νΚν4) (8ЕО ΙΌ N0: 12).

На фиг. 13 показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела В4 (В4 νΗ0) (8ЕО ΙΌ N0: 13).

На фиг. 14 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области тяжелой цепи антитела В4 с мутациями К23Е, 642Ό, К69Е и 885Ό (В4 νΗν1) (8Е0 ΙΌ N0: 14).

На фиг. 15 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области тяжелой цепи антитела В4 с мутациями К69Е и 885Ό (В4 νΗν2) (8Е0 ΙΌ N0: 15).

На фиг. 16 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области тяжелой цепи антитела В4 с мутациями СУЕ. У12К, К.19К, Ε20ν, Т24А, 885Ό и 888Α (В4 νΗν3) (8ЕО ΙΌ N0: 16).

На фиг. 17 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области тяжелой цепи антитела В4 с мутациями Р5Е. К.19К, Ь20У, В40Т, Р43К, Κ65Ό, 885Ό, 888Α и ν93Τ (В4 νΗν4) (8ЕО ΙΌ N0: 17).

На фиг. 18 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области тяжелой цепи антитела В4 с мутациями Р5Е. У12К, К.19К, Ь20У, Т24А, К38В, Κ.40Α, Р43К, Κ65Ό, 885Ό и ν93Τ (В4 νΗν5) (8ЕО ΙΌ N0: 18).

На фиг. 19 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области тяжелой цепи антитела В4 с мутациями СУЕ. К.19К, Ь20У, Κ65Ό, 885Ό и У93Т (В4 νΗν6) (8ЕО ΙΌ N0: 19).

На фиг. 20 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области тяжелой цепи антитела В4 с мутациями У12К, К23Е, 642Ό, Κ65Ό, К69Е и 885Ό (В4 νΗν11) (8ЕО ΙΌ N0: 20).

На фиг. 21 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области тяжелой цепи антитела В4 с мутациями СУЕ. У12К, К.19К, Ь20У, Т24А, К.40Т, Р43К, Κ65Ό, 885Ό, 888Α и У93Т (В4 νΗν34) (8ЕО ΙΌ N0: 21).

На фиг. 22 показана аминокислотная последовательность типичной каркасной области тяжелой цепи антитела В4 с неопределенными аминокислотными остатками Х5, Х12, Х19, Х20, Х23 и Х24 (В4 νΗίτ1) (8ЕО ΙΌ N0: 22).

На фиг. 23 показана аминокислотная последовательность типичной каркасной области 2 тяжелой цепи антитела В4 с неопределенными аминокислотными остатками Х3, Х5, Х7 и Х8 (В4 УШИ) (8Е0 ΙΌ N0: 23).

На фиг. 24 показана аминокислотная последовательность типичной каркасной области 3 тяжелой цепи антитела В4 с неопределенными аминокислотными остатками Х6, Х10, Х26, Х29 и Х34 (В4 УШт3) (8ЕО ΙΌ N0: 24).

На фиг. 25 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела В4 (В4 УК0) (8ЕО ΙΌ N0: 25).

На фиг. 26 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области легкой цепи антитела В4 с мутациями У3Л. 87Е и Α54Ό (В4 νΚν1) (8Е0 ΙΌ N0: 26).

На фиг. 27 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области легкой цепи антитела В4 с мутациями ρΐΌ. Н0Т, М11Ь и Α54Ό (В4 νΚν2) (8Е0 ΙΌ N0: 27).

На фиг. 28 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области легкой цепи антитела В4 с мутациями Н0Т, М11Ь, νΐ9Α, ν29Α и 875Е (В4 νΚν3) (8Е0 ΙΌ N0: 28).

На фиг. 29 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области легкой цепи антитела В4 с мутациями Н0Т, М11Ь, νΐ9Α, 851Ό и Ь53Т (В4 νΚν4) (8Е0 ΙΌ N0: 29).

На фиг. 30 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области легкой цепи антитела В4 с мутациями ν3Α. 87Е. νΐ9Α, Α54Ό и 875Е (В4 νΚν11) (8Е0 ΙΌ N0: 30).

На фиг. 31 показана аминокислотная последовательность типичной вариабельной области легкой цепи антитела В4 с мутациями Н0Т, М11Ь, νΐ9Α, ν29Α, 851Ό, Ь53Т и 875Е (В4 νΚν34) (8ЕО ΙΌ N0: 31).

На фиг. 32 показана аминокислотная последовательность типичной каркасной области легкой цепи антитела В4 с неопределенными аминокислотными остатками Х1. Х3. Х7. Х10, Х11 и Х19 (В4 УКГг1) (8ЕО ΙΌ N0: 32).

На фиг. 33 показана аминокислотная последовательность типичного участка. определяющего комплементарность, легкой цепи антитела В4 с неопределенными аминокислотными остатками Х3. Х5 и Х6 (В4 УКебт2) (8ЕО ΙΌ N0: 33).

На фиг. 34 показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела В4. Участки. определяющие комплементарность, подчеркнуты. Модифицируемые аминокислотные остатки выделены жирным шрифтом.

На фиг. 35 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела В4. Участки. определяющие комплементарность. подчеркнуты. Модифицируемые аминокислотные остатки выделены жирным шрифтом.

На фиг. 36 показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельной области

- 5 016429 тяжелой цепи антитела В4 УН0 (8ЕС ГО N0: 13), УНу1 (8ЕС ГО N0: 14), УНу2 (8ЕС ГО N0: 15), УНуЗ (8ЕС ГО N0: 16), УНу4 (8ЕС ГО N0: 17), УНу5 (8ЕС ГО N0: 18), УНу11 (8ЕС ГО N0: 20) и УНуЗ4 (8ЕС ГО N0: 21).

На фиг. 37 показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи антитела В4 УК0 (8 ЕС) ГО N0: 25), УКу1 (8 ЕС) ГО N0: 26), УКу2 (8 ЕС) ГО N0: 27), УКуЗ (8ЕС) ГО N0: 28), УКу4 (8ЕС) ГО N0: 29), УКу11 (8ЕС) ГО N0: 30) и УКуЗ4 (8ЕС) ГО N0: 31).

На фиг. 38 приведены результаты анализа ЛЭСС (антитело-зависимой клеточной цитотоксичности), выполненного на клетках лимфомы Беркитта линии Дауди с использованием антитела В4 УНу4/УКу4, экспрессированного либо в клетках НЕК 293Т (незакрашенные треугольники), либо в клетках ΥΒ2/0 (закрашенные треугольники), и антитела В4 УНу5/УКу4, экспрессированного либо в клетках линии N8/0 (незакрашенные кружки), либо в клетках ΥΒ2/0 (закрашенные кружки), в соответствии с тем, как описано в примере 4.

На фиг. 39 приведены результаты лечения мышей, которым трансплантировали РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) человека и давали в качестве лечения либо антитело по изобретению В4 УНу4/УКу4 (заштрихованные прямоугольники), либо Ьеи 16 антитело (белые прямоугольники), либо ΡΒ8 (фосфатно-солевой буфер) (черные прямоугольники) в соответствии с тем, как описано в примере 5.

На фиг. 40 приведены результаты лечения мышей, несущих клетки лимфомы линии Намальва, которые получали в качестве лечения либо антитело по изобретению В4 УНу4/УКу4 (незакрашенные кружки), либо ΡΒ8 (звездочки) в соответствии с тем, как описано в примере 6.

На фиг. 41 приведены результаты лечения мышей, несущих клетки лимфомы Беркитта линии Дауди, которые получали в качестве лечения либо антитело по изобретению В4 УНу4/УКу4 (незакрашенные треугольники), либо циклофосфамид (незакрашенные квадраты), либо комбинацию антитела В4 УНу4/УКу4 и циклофосфамида (незакрашенные кружки), либо ΡΒ8 (звездочки) в соответствии с тем, как описано в примере 7.

На фиг. 42 приведены результаты лечения мышей, несущих клетки лимфомы линии Намальва, антителом по изобретению в комбинации с различными химиотерапевтическими агентами в соответствии с тем, как описано в примере 8. На фиг. 42(а) приведены результаты лечения циклофосфамидом (незакрашенные квадраты), антителом В4 УНу4/УКу4 (X), комбинацией антитела В4 УНу4/УКу4 и циклофосфамида (закрашенные квадраты) или ΡΒ8 (звездочки). На фиг. 42(б) приведены результаты лечения винкристином (незакрашенные треугольники), антителом В4 УНу4/УКу4 (X), комбинацией антитела В4 УНу4/УКу4 и винкристина (закрашенные треугольники) или ΡΒ8 (звездочки). На фиг. 42(в) приведены результаты лечения доксорубицином (незакрашенные кружки), антителом В4 УНу4/УКу4 (X), комбинацией антитела В4 УНу4/УКу4 и доксорубицина (закрашенные кружки) или ΡΒ8 (звездочки).

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к белкам В4, которые обладают пониженной иммуногенностью по сравнению с В4 дикого типа, а также к способам получения и применения таких белков. Более конкретно, в изобретении предложены мутации в антителе В4, которые приводят к снижению иммуногенности антитела В4, в основном за счет удаления распознаваемых Т-клетками эпитопов, имеющихся на В4, которые могут стимулировать иммунный ответ.

Настоящее изобретение относится к семейству модифицированных вариабельных областей тяжелой цепи (УН) и легкой цепи (УК) мышиного антитела В4 против СИ 19 (№1б1ег е! а1., (1983) 1. 1ттипо1. 130:2947 - 2951; Водикка е! а1., (1994) Ρτοο. ИаИ. Асаб. 8с1. И8А 91:969 - 973), которые в данном описании имеют общие названия В4 УНух и В4 УКуу соответственно. Для сравнения, последовательность вариабельной области тяжелой цепи исходного мышиного антитела В4 (В4 УН0) и последовательность вариабельной области легкой цепи исходного мышиного антитела В4 (В4 УК0), с подчеркнутыми СЭВ, приведены на фиг. 34 и 35 соответственно.

По сравнению с исходными полипептидами В4 УН0 и Β4 УК0 полипептиды В4 УНух и В4 УКуу обладают пониженной иммуногенностью. Более конкретно, в изобретении предложены мутации в В4 УН и/или В4 УК, которые приводят к снижению иммуногенности полипептидов вариабельной области В4, в основном за счет удаления распознаваемых Т-клетками эпитопов, имеющихся на этих полипептидах, которые могут стимулировать иммунный ответ. Согласно изобретению белковые композиции, содержащие модифицированные формы вариабельных областей В4, являются менее иммуногенными при введении человеку, но все еще остаются способными специфически связываться с СГО19 и распознавать клетки-мишени, экспрессирующие СГО19.

В контексте данного описания подразумеваться, что термины участки, определяющие комплементарность и СЭВ означают гипервариабельные области или петли вариабельной области иммуноглобулина, которые в основном и взаимодействуют с антигеном. Вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина (УН) и вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина (УК) содержат по три СЭВ, расположенные между каркасными областями, как показано на фиг. 34 и 35 соответственно. Например, согласно аминокислотной последовательности, определяющей вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина для антитела В4, приведенной на фиг. 34 (8Е0 ГО N0: 13), СЭВ определены аминокис

- 6 016429 лотными последовательностями от 8ет31 до Ηί§35 (СОВ1). от С1и50 до А§п59 (СОВ2) и от С1у99 до Тук109 (СОВЗ). Согласно аминокислотной последовательности. определяющей вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина для антитела В4. приведенной на фиг. 35 (8ЕО ГО N0: 25). СЭВ определены аминокислотными последовательностями от 8ет24 до Ηί§33 (СЭВ1). от А§р49 до 8ет55 (СОВ2) и от Ηί§88 до Т1г94 (СОВ3).

В контексте данного описания подразумеваться. что термины каркасные области и ЕВ означают области вариабельной области иммуноглобулина. примыкающие к участкам. определяющим комплементарность. Вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина (УН) и вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина (УК) содержат по четыре ЕВ. как показано на фиг. 34 и 35. Например. согласно аминокислотной последовательности. определяющей вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина для антитела В4. приведенной на фиг. 34 (8Е0 ГО N0: 13). ЕВ определены аминокислотными последовательностями от С1и1 до Т1г30 (ЕВ1). от Тгр36 до С1у49 (ЕВ2). от Туг60 до Атд98 (ЕВ3) и от Тгр110 до 8ет120 (ЕВ4). Согласно аминокислотной последовательности. определяющей вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина для антитела В4. приведенной на фиг. 35 (8Е0 ГО N0: 25). ЕВ определены аминокислотными последовательностями от С1и1 до Су§23 (ЕВ1). от Тгр34 до Туг48 (ЕВ2). от С1у56 до Су§87 (ЕВ3) и от Р1е95 до Ьу§104 (ЕВ4). Кроме того. аминокислотные остатки. выделенные жирным шрифтом на фиг. 34 и 35. представляют собой аминокислотные остатки. которые могут быть мутированы согласно различным воплощениям изобретения.

Эпитопы. распознаваемые Т-клетками. могут быть идентифицированы с помощью ряда компьютерных и некомпьютерных методик. включая предсказания на основе компьютерного моделирования. основанного на анализе структур. или путем синтеза пептидов и тестирования их связывания со специфическими молекулами МНС класса II или анализа их иммуногенности. Согласно изобретению потенциальный эпитоп. распознаваемый Т-клетками. представляет собой последовательность. которая. будучи представленной в виде отдельного пептида. согласно предсказанию связывается с молекулой МНС класса II или ее эквивалентом в другом виде. не относящемся к человеку. Потенциальный эпитоп. распознаваемый Т-клетками. определяют без учета других аспектов процессинга антигена. таких как эффективность поглощения белка антиген-презентирующими клетками. эффективность расщепления в сайтах. находящихся на интактном белке. с получением пептида. который может связываться с МНС класса II. и так далее. Соответственно. популяция эпитопов. распознаваемых Т-клетками. которые после введения белка животному фактически презентированы на МНС класса II. представляет собой субпопуляцию потенциальных эпитопов. распознаваемых Т-клетками. Согласно изобретению эпитоп. распознаваемый Тклетками. представляет собой эпитоп белка. который взаимодействует с молекулой МНС класса II. Безотносительно к какой-либо теории понятно. что эпитоп. распознаваемый Т-клетками. представляет собой аминокислотную последовательность в белке. которая не исключается в процессе отрицательной селекции Т-клеток во время формирования Т-клеток. и поэтому можно ожидать. что она будет презентирована молекулой МНС класса II и будет распознаваться Т-клеточным рецептором.

Согласно одному из воплощений в изобретении предложены способы. относящиеся к снижению иммуногенности областей В4 УН и В4 УК. Согласно одному из воплощений изобретения потенциальные не-свои эпитопы. распознаваемые Т-клетками. идентифицируют в последовательностях В4 УН или В4 УК. Например. потенциальные не-свои эпитопы. распознаваемые Т-клетками. идентифицируют с помощью компьютерных методик. основанных на моделировании связывания пептидов с молекулами МНС класса II. Затем производят замены на такие специфические аминокислотные остатки. что способность пептидов. содержащих потенциальные эпитопы. распознаваемые Т-клетками. связываться с МНС класса II уменьшается или полностью подавляется.

Модифицированные белковые последовательности вариабельных областей по изобретению.

Согласно одному из воплощений эффект от конкретной аминокислотной мутации или мутаций предсказывают на основе компьютерного моделирования. основанного на анализе структур. Например. РгоРгей (1Шр://\у\у\у.1т1ес11.ге5.т/гад11ауа/ргорге± 8ίη§1ι апй Вадйауа (2001) ВюшГоттаИск 17:1236 - 1237) представляет собой программу. находящуюся в открытом доступе в сети. которая может быть использована для предсказания пептидов. которые связываются с аллелями НЬА-ОВ. РгоРгей основана на матричном алгоритме предсказания. описанном 8Шгпю1о для популяции 50 аллелей НЬА-ОВ (81итшо1о е1 а1.. (1999) №Шге Вю1ес1шо1. 17:555 - 561). В результате использования такого алгоритма в В4 УН и В4 УК были обнаружены последовательности различных пептидов. которые. согласно предсказанию. связываются с несколькими аллелями МНС класса II и поэтому. по-видимому. являются иммуногенными. Последовательности данных пептидов и их предсказанная частотность связывания (Ьшйшд Ггесщепсу) с аллелями НЬА-ОВ приведены в табл. 1.

В табл. 1 последовательность каждого 9-членного пептида. который связывается с по меньшей мере 5 аллелями НЬА-ОВ. приведена вместе с его позицией (#) в области В4 УН (левая колонка) или в области В4 УК (правая колонка). Частотность связывания относится к количеству аллелей. из общего количества возможных 50 аллелей. связывание пептида с которыми превышает произвольно заданный порог связывания. в данном случае 20%. Частотность связывания + показывает. что пептид связывается с 5-9 аллелями. ++ показывает. что пептид связывается с 10-19 аллелями. и +++ показывает. что пептид

- 7 016429 связывается с 20-50 аллелями. 20% порог связывания указан относительно теоретической максимальной оценки связывания, рассчитанной с помощью алгоритма, в соответствии с тем, как описано 8ίυτηίο1ο с1 а1.

Таблица 1. Выборка пептидов из областей В4 V, связывающихся согласно предсказанию с аллелями НЬА-ЭВ человека

Эпитопы области	УН,	Частотность	Эпитопы области	νκ,	Частотность
распознаваемые	τ-	связывания	распознаваемые	Τ-	связывания
клетками, (начальная		клетками, (начальная
позиция)			позиция)
(2) УОТООРСАЕ		+	(2) !У1_Т08РА1		+4+
(12) νΚΡΘΑδνΡΙ.		4-	(3) νΐ-ΤΟδΡΑΙΜ		+ +
(18) νρίδοκτεο		4-++	(19) νΤΜΤΟδΑδδ		+
(36) νννκοκροοο		4-	(29) νΝΥΜΗ'Λ/ΥΟΟ		+
(60) ΥΝΟΚΕΚΟΚΑ		4*	(46) ννΐΥϋΤδΚΙ-Α		++
(64) ΕΚΘΚΑΚΙ-Τν		+++	(47) ΙΥΟΤ5ΚΙΑ5		+
(80) ΥΜΕνδδίΤδ		++
(93) νΥΥΟΑΡΟδΝ		+

Данные потенциально иммуногенные последовательности в полипептидах В4 νΗ и В4 νκ могут быть сделаны менее иммуногенными путем введения специфических мутаций, которые уменьшают или полностью подавляют связывание конкретного пептида с аллелью НЬА-ЭВ человека (см., например У098/52976 и У000/34317). Альтернативно, распознаваемые Т-клетками эпитопы, не относящиеся к человеку, мутируют таким образом, чтобы они соответствовали своим эпитопам человека, которые присутствуют у человеческих антител эмбрионального типа (см., например И8 5712120).

Руководством для выбора подходящих мутаций могут служить данные по третичной и четвертичной структуре вариабельных областей антител. Кристаллические структуры вариабельных доменов антител известны в данной области техники, и установлено, что структуры ЕВ обычно имеют большое сходство. Теоретическая модель вариабельной области антитела против СЭ19 В4 νΗ0/νΚ0 может быть сконструирована исходя из наиболее близкородственных вариабельных областей тяжелых и легких цепей антител, структуры которых уже определены и которые могут быть идентифицированы путем выравнивания первичных структур (А1(8сйц1 с1 а1., (1990) 1. Μοί. Βίο1. 215:403-415). Для моделирования легкой и тяжелой цепей В4 на рассчитанных структурах (юВсб ЧгисШгеО использован алгоритм прошивания ((йтеабшд αϊβοιϊΐΐιιη) (Майт-Вегот е£ а1., (2000) Аппи Веу Вюрйук Βίοιηοί 8(гис( 29:291-325), и данные прошитые структуры могут быть дополнительно улучшены с целью получения стереохимически подходящих энергий (ХУешег е£ а1., (1984) 1 Ат Сйет 8οс 106:765-784). Установлено, что для этой цели полезными базовыми структурами являются рассчитанные структуры тяжелой цепи и легкой цепи, имеющие в базе данных ΡΌΒ (банка белковых структур) регистрационные коды 1ΕΒΙ (ЕаЬ-фрагмент моноклонального антитела Е9.13.7) и 1ΜΙΜ (ЕаЬ-фрагмент химерного антитела против ί.Ό25 8άζ СЫ621) соответственно.

Предпочтительные мутации чрезмерно не нарушают экспрессию, фолдинг или активность белка. Согласно изобретению аминокислоты в позициях 05. ν12, В19, Ь20, К23, Т24, К38, В40, 042, 043. К65, К69, 885, 888 или ν93 в В4 νΗ и аминокислоты в позициях р1, ν3, 87, Ι10, М11, ν19, ν29, 851, Ь53, А54 или 875 в В4 νκ могут быть мутированы, но антитело все еще сохраняет способность экспрессироваться и связываться с СЭ19 на уровне, сравнимом с немодифицированной формой В4. Соответственно, изобретение включает антитела В4, имеющие по меньшей мере одну модификацию в νΗпоследовательности в аминокислотных позициях, выбранных из группы, состоящей из 05, ν12, В19, Ь20, Κ23, Т24, К38, В40, 042, 043, Κ65, Κ69, 885, 888 и ν93, и/или имеющие по меньшей мере одну модификацию в νΚ-последовательности в аминокислотных позициях, выбранных из группы, состоящей из 91, ν3, 87, Ι10, М11, ν19, ν29, 851, Ь53, А54 и 875.

Неполный перечень конкретных позиций, в которых, как установлено, допустимы аминокислотные замены по изобретению, приведен в табл. 2 вместе с типичными заменами в данных позициях.

- 8 016429

Таблица 2. Замены в У-областях В4
Позиция в В4 УН	Замена	Позиция в В4 УК	Замена
Θ1η5	<Э1и	Θ1η1	Азр
Уа112	Ьу®	Уа13	А!а
Агд19	Ьу®	Зег7	<Э1и
Ьеи20	Уа1	Не 10	Тпг
Ьуз23	С1и, Азр	Ме(11	Ьеи
ТНг24	А1а	Уа119	А1а
Ьуз38	Агд	Уа129	А1а
Агд40	А1а, ТЬг	8ег51	Азр
С1у42	А®р, С1и	Ьеи53	ТНг
(31п43	Ьу®	А1а54	Азр
Ьу®65 Ьуз69 Зег85 5ег88 Уа193	А®р, С1и С1и, Азр Азр, <31и А1а ТЬг	Зег75	Ши

Один ряд воплощений включает аминокислотные замены в полипептиде В4 УН, выбранные из О5Е, У12К, Е19К, Ь20У, К23Е, Т24А, К38Е, Е40Т, Ο42Ό, О43К, Κ65Ό, К69Е, 885Ό, 888А и У93Т. Дополнительно используемые замены представляют собой Κ23Ό, О42Е, К65Е и Κ69Ό. Также установлено, что являются полезными определенные комбинации мутаций. Например, одно конкретное воплощение включает замены К23Е и К69Е. Другое конкретное воплощение дополнительно включает замены Ο42Ό и 888А, как показано, например, для В4 νΗν1 (8ЕО ГО N0: 14). Согласно еще одному конкретному воплощению УНу1 дополнительно включает замены У12Κ и Κ65Ό (В4 ΥΗν11) (8Е0 ΙΌ N0: 20). Другое конкретное воплощение включает замены 05 Е, У12К, Е19К, Ь20У, 885Ό и 888А, в качестве примера можно привести В4 νΗν3 (8Е0 ГО N0: 16). Еще одно конкретное воплощение включает замены 05Е. Е19К, Ь20У, Е40Т, О43К, Κ65Ό, 885Ό, 888А и У93Т, в качестве примера можно привести В4 νΗν4 (8Е0 ΙΌ N0: 17). Еще одно конкретное воплощение включает замены 05Е, Е19К, Ь20У, К38Е, Е40А, О43К, Κ65Ό, 885Ό и У93Т, в качестве примера можно привести В4 νΗν5 (8Е0 ΙΌ N0: 18). В другом конкретном воплощении использованы комбинации замен из В4 νΗν3 и В4 νΗν4, как показано на последовательности В4 νΗν34 (8Е0 ΙΌ N0: 21).

Другой ряд воплощений включает аминокислотные замены в полипептиде В4 УК, выбранные из РГО, У3А, 87Е, 110Т, М11Ь, У19А, У29А, 851Ό, Ь53Т, А54О и 875Е. Одно из конкретных воплощений включает замену Λ54Ω. Также установлено, что являются полезными определенные комбинации мутаций. Например, более конкретные воплощения дополнительно включают замены У3А и 87Е, в качестве примера можно привести В4 νΚν1 (8Е0 ГО N0: 26), или включают замены 01Ό, 110Т и М11Ь, в качестве примера можно привести В4 УКу2 (8Е0 ГО N0: 27). В другом воплощении В4 УК1 дополнительно включает замены У19А и 875Е, в качестве примера можно привести В4 νΚν11 (8Е0 ГО N0: 30). Еще одно воплощение включает замены 110Т, М11Ь, У19А, У29А и 875Е, в качестве примера можно привести В4 УКу3 (8Е0 ГО N0: 28). Еще одно конкретное воплощение включает замены 110Т, М11Ь, У19А, 851Ό и Ь53Т, в качестве примера можно привести В4 νΚν4 (8Е0 ГО N0: 29). В другом конкретном воплощении использованы комбинации замен из В4 νΚν3 и В4 νΚν4, как показано на последовательности В4 νΚν34 (5ЕО ΙΌ N0: 31).

Выравнивание первичных структур нескольких типичных последовательностей В4 νΗνχ и В4 νΚνχ по изобретению, описанных выше, представлено на фиг. 36 и 37 соответственно. Аминокислоты, выделенные жирным шрифтом, находятся в тех позициях νΗ0 и УК0, которые могут быть мутированы согласно изобретению, и подчеркнутые аминокислоты представляют собой СЭЕ. νΗν1 - νΗν34 и νΚν1 - νΚν34 представляют собой, соответственно, типичные тяжелые и легкие цепи с конкретными аминокислотными заменами, которые снижают иммуногенность.

Композиции вариабельных областей по изобретению включают по меньшей мере тяжелую цепь или легкую цепь по изобретению. Например, в одном воплощении вариабельная область содержит В4 νΗν1 (8Е0 ΙΌ N0: 14) и В4 УК0 (8Е0 ГО N0: 25). В другом воплощении вариабельная область содержит В4 νΗν1 (8Е0 ГО N0: 14) и В4 νΚν1 (8Е0 ГО N0: 26). В еще одном воплощении вариабельная область содержит В4 νΗν4 (8Е0 ΙΌ N0: 17) и В4 νΚν4 (8Е0 ΙΌ N0: 29). В еще одном воплощении вариабельная область содержит В4 νΗν5 (8Е0 ΙΌ N0: 23) и В4 νΚν4 (8Е0 ΙΌ N0: 29). Понятно, что путем комбинаторного паросочетания В4 νΗνχ и В4 УКуу из полного набора полипептидов В4 νΗνχ и В4 УКуу, предполагаемых согласно изобретению, легко получить другие воплощения изобретения. Затем полезные комбинации определяют экспериментально, путем анализа содержащих данные комбинации

- 9 016429 белковых композиций, таких как антитело В4 УНух/УКуу, на способность экспрессироваться и связываться с СИ-19, а также на пониженную иммуногенность, в соответствии с тем, как описано более подробно ниже.

Подтверждение пониженной иммуногенности вариабельных областей по изобретению

Для подтверждения того факта, что мутация по изобретению действительно приводит к снижению иммуногенности, могут быть использованы стандартные экспериментальные тесты, которые хорошо известны в данной области техники. Например, может быть использован анализ стимуляции Т-клеток (например, 1опс5 с1 а1., (2004), 1. 1п1сгГсгоп Су1окте Кек., 24:560). Для выполнения такого анализа получают и культивируют в стандартных условиях мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) человека. После возможной предварительной стимуляции пептид, соответствующий потенциальному эпитопу, презентируемому молекулой МНС класса II, добавляют к культуре РВМС; РВМС дополнительно инкубируют и затем добавляют меченый тритием тимидин. Минимальный пептид может представлять собой 9-мер или может содержать приблизительно от 10 до 15 или более 15 аминокислот. После дополнительной инкубации клеток с помощью стандартных методик измеряют включение меченого тритием тимидина в ДНК.

Считают, что анализ стимуляции Т-клеток основан на следующих механизмах. Во-первых, если пептид используют в качестве стимулятора, данный пептид должен сначала связаться с молекулой МНС класса II, присутствующей на клетке РВМС-популяции. Во-вторых, комплекс МНС класса ΙΙ/пептид должен эффективно взаимодействовать с Т-клеточным рецептором на СИ4+ Т-клетке. Если тестируемый пептид не способен связываться с молекулой МНС класса II достаточно сильно, сигнал будет отсутствовать. Если пептид способен связываться с молекулой МНС класса II и существуют Т-клетки, экспрессирующие Т-клеточный рецептор с подходящей структурой, способный распознавать конкретный комплекс МНС класса П/пептид, должен появляться сигнал. Однако, если такие Т-клетки были элиминированы в результате процесса отрицательной селекции, сигнал будет отсутствовать. Считают, что данные механизмы имеют отношение к иммуногенности белковой последовательности, такой вывод основан на том факте, что данный пептид способен или не способен вызывать стимуляцию.

Если распознающие Т-клетки присутствуют в РВМС-популяции в очень низком количестве по случайным причинам, относящимся к недостатку подходящего Т-клеточного рецептора, что может случиться, или к пролиферации других, неродственных Т-клеток с последующим гомеостазом популяции Тклеток, сигнал также может отсутствовать, даже несмотря на то, что следовало ожидать появление сигнала. Соответственно, может иметь место ложный отрицательный результат. На основе этих соображений важно использовать РВМС из большого числа различных источников и тестировать данные пробы независимо. Обычно также является полезным тестирование РВМС от этнически разных популяций людей и определение аллелей МНС класса II, присутствующих в каждой РВМС-популяции.

Стандартный анализ с участием Т-клеток имеет тот недостаток, что сигнал от включения трития часто только в два раза превышает сигнал фонового включения. Белки и пептиды по изобретению также могут быть тестированы с использованием модифицированного анализа с участием Т-клеток, в котором, например, очищенные СИ4+ Т-клетки и очищенные дендритные клетки культивируют вместе в присутствии тестируемого пептида, затем подвергают воздействию меченого тритием тимидина и затем анализируют включение меченого тритием тимидина. Второй анализ имеет то преимущество, что включение меченого тритием тимидина в другие клетки, такие как СИ8+ Т-клетки, по существу, исключается, и фон, соответственно, уменьшается.

Третий анализ включает тестирование белка-кандидата с пониженной иммуногенностью в животном, например в приматах. Такой анализ обычно включал тестирование белковой композиции В4 УНух/УКуу, например антитела, которая была создана путем тестирования потенциальной иммуногенности отдельных пептидных компонентов с использованием анализа, предполагающего участие клеток, например такого, как описано выше. Когда такая белковая композиция-кандидат В4 УНух/УКуу создана и экспрессирована, иммуногенность белка тестируют путем инъекции животному.

Инъекцию белковой композиции В4 УНух/УКуу обычно выполняют таким же путем, как предполагаемый путь доставки при терапевтическом применении в лечении человека. Например, может быть использована интрадермальная, подкожная, внутримышечная, внутрибрюшинная инъекция или внутривенная инфузия. Если используют более одного введения, введение может осуществляться разными путями.

Для целей тестирования иммуногенности может оказаться полезным совместное введение с адъювантом для усиления сигнала и сведения к минимуму количества животных, которое необходимо использовать. Если используют адъювант, можно использовать адъювант, не содержащий белковый компонент, такой как ДНК с неметилированными динуклеотидами СрО, бактериальный липид А, Νформилметионин или другие бактериальные небелковые компоненты. Безотносительно к какой-либо теории обоснование исключения белок-содержащих адъювантов состоит в том, что другие белки могут иметь эпитопы, распознаваемые Т-клетками, которые, в конечном счете, будут способствовать образованию антител против белка-кандидата.

После одного или более чем одного введения белковой композиции-кандидата В4 УНух/УКу при

- 10 016429 сутствие антиидиотипических антител тестируют в соответствии со стандартными методиками, такими как методика ЕЬ1§Л. Установлено, что белковые композиции В4 УНух/УКуу по изобретению индуцируют образование антител менее часто и в меньшей степени, чем соответствующие молекулы, содержащие исходные последовательности В4 УН/УК.

Другие конфигурации вариабельных областей по изобретению

Кроме применения У-областей по изобретению в голом антителе (пакеб аийЬобу) У-области по изобретению также можно использовать в конфигурациях слитых белков-антител, которые распознают мишени-токсины, иммуностимуляторы и другие белка, а также в ЕаЬ, одноцепочечных Εν, биспецифических антителах и в других конфигурациях, известных в области инженерии антител.

В некоторых воплощениях изобретения вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи могут быть соединены, соответственно, с константной областью легкой цепи и константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина. Легкие цепи иммуноглобулина содержат константные области, которые созданы на основе либо каппа-, либо лямбда-цепей. В конкретном воплощении по изобретению константная область легкой цепи представляет собой каппа-цепь. Константные области тяжелой цепи и их различные модификации и комбинации более подробно рассмотрены ниже.

Ее-фрагмент

Вариабельные домены антитела по настоящему изобретению возможно слиты с Ес-фрагментом. В контексте данного описания Ес-фрагмент включает домены, происходящие от константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, предпочтительно иммуноглобулина человека, включая фрагмент, аналог, вариант, мутант или производное константной области. Константную область тяжелой цепи иммуноглобулина определяют как природный или искусственно полученный полипептид, гомологичный по меньшей мере части С-концевой области тяжелой цепи, включающей домены СН1, шарнирный, СН2, СН3 и, для некоторых классов тяжелых цепей, СН4. Шарнирная область свывает СН1-домен с областью СН2СН3 Ес-фрагмента. Аминокислотные последовательности константной области тяжелых цепей иммуноглобулинов у всех млекопитающих проявляют большое сходство. Последовательности ДНК данных областей иммуноглобулина хорошо извести в данной области техники. (См., например, СППез е1 а1. (1989) 1. 1ттипо1. Ме111. 125:191).

В настоящем изобретени Ес-фрагмент обычно включает по меньшей мере СН2-домен. Например, Ес-фрагмент может включать всю константную область тяжелой цепи иммуноглобулина (СН1шарнирная область-СН2-СН3). Альтернативно, Ес-фрагмент может включать всю шарнирную область или ее часть, СН2-домен и СН3-домен.

Константная область иммуноглобулина ответственна за многие важные эффекторные функции антитела, включая функции, которые опосредованы связыванием с Ес-рецептором (ЕсК) и связыванием с комплементом. Существует пять основных классов константной области тяжелой цепи, классифицированных как 1дА, 1дС. Ι§Ό, 1дЕ и 1дМ, каждый со своими характерными эффекторными функциями, определяемыми изотипом.

1дС, например, представлен четырьмя γ-изотипами: γ1, γ2, γ3 и γ4, которые также известны как 1§С1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4 соответственно. Молекулы 1дС могут взаимодействовать с несколькими классами клеточных рецепторов, включая три классса Εсγ-рецепторов (Ес'/К.) со специфичностью к антителам 1дС-класса, а именно Ес-ЩЕ ЕСуКЛ и ЕСуКШ. Согласно опубликованным данным, последовательности, важные для связывания 1дС с ЕСуК-рецепторами, находятся в СН2- и СН3-доменах.

Наиболее известные эффекторные функции антител, в особенности антител 1дС-класса, включают комплемент-зависимую цитотоксичность (СЭС) и антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС). Все подклассы 1дС (1§61, 1д62, 1§63, 1§64) в некоторой степени опосредуют СЭС и АЭСС, но наиболее эффективно обе эти функции осуществляют 1дС1 и 1дС3 (СйарЕет 3, ТаЬ1е 3 ίη Раи1, Е§8епЕ1а1 1ттипо1оду 4.5ир.111 Еб., р. 62). Считается, что существует несколько механизмов СЭС: один механизм инициируется, когда антитело связывается с антигеном на поверхности клетки. Считается, что после образования комплекса антиген-антитело молекула О1с.| связывается с комплексом антиген-антитело. Затем О1с.| саморасщепляется и инициирует каскад ферментативной активации и расщепления других белков комплемента, которые затем связываются с поверхностью клетки-мишени и способствуют ее гибели в результате, например, клеточного лизиса и/или разрушения макрофагом. Считается, что АЭСС имеет место в том случае, когда Ес-рецепторы цитотоксических клеток, таких как природные киллеры (ΝΚклетки), макрофаги и нейтрофилы, связываются с Ес-областью антител, связанных с антигеном на поверхности клетки. Связывание Ес-рецептора является сигналом для цитотоксической клетки к уничтожению клетки-мишени. Характерно, что ΝΚ-клетки, которые, как считают, являются первичными медиаторами АЭСС, экспрессируют только Ес'/КШа.

Часто является полезным изменение эффекторных функций антитела. Например, для лечения онкологических заболеваний, ассоциированных с В-клеточной неоплазией, или для лечения аутоиммунных заболеваний с В-клеточным компонентом, является полезным повышение АЭСС-активности антитела. В особенности полезным может оказаться повышение АЭСС-активности антитела против поверхностых антигенов В-клетки, плотность которых является относительно низкой (Νί\νη е1 а1., (2005) С11п. Сапсег

- 11 016429

Кек. 11:2327-2336), такого как антитело против СБ19. Считается, что плотность антигена СБ19 по сравнению с плотностью СБ20 на поверхности В-клеток приблизительно в 10 раз ниже. Изменения антител, которые повышают АБСС-активность антитела относительно соответствующего исходного антитела известны в данной области техники и обычно коррелируют с модификациями, которые повышают аффинность связывания вариантного антитела с РсуКШ (см., например, патент И8 6737056). Например, мутации вводят в Рс-область в одной или более чем одной позиции (согласно их позиции в 1дСу1), выбранной из 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333, 334, 339, 360, 378 и 430 (нумерация согласно КаЬа! е! а1. 8есщепсек οί Рто!еш8 οί 1ттипо1одюа1 1п!егек!, 1991). Предпочтительно мутации вводят в одну или более чем одну позицию, выбранную из 298, 333 и 334. Например, могут быть введены аланиновые замены.

На АБСС-активность антитела также оказывает влияние конкретная клеточная линия, используемая для получения антитела. Например, антитела, продуцированные в клетках мышиной миеломы N8/0 (или в клетках 8Р2/0) обычно имеют низкую АБСС-активность, а антитела, продуцированные в клетках крысиной миеломы ΥΟ (или в клетках ΥΒ2/0) имеют высокую АБСС-активность (ЫГе1у е! а1., (1995) С1усоЬю1оду 5:813 - 822). В данной области техники известно, что тип клеточной линии, используемой для экспрессии антитела, влияет на углеводную структуру Ν-связанной гликозильной цепи, которая соединена с Рс-областью антитела в позиции, соответствующей N297 в 1дСу1. Углеводная структура антител, продуцированных в клетках СНО, фукозилирована, тогда как на углеводной цепи антител, продуцированных в ΥΒ2/0, фукоза почти совершенно отсутствует (8Ыика^а е! а1., (2003) 1ВС 278:3466- 3473). Антитела, у которых углеводная структура не содержит фукозы, связываются с РсуКШа человека с большей аффинностью (8Ые1бк е! а1., (2002) 1ВС 277:26733-26740). В некоторых воплощениях антитела против СБ19 с вариабельными областями по изобретению отличаются уменьшенным фукозилированием Ν-связанной гликозильной цепи Рс-фрагмента антитела.

Часто является полезным изменение времени полужизни антитела в сыворотке крови. На время полужизни в сыворотке крови такого антитела, как слитый белок иммуноглобулина, оказывает влияние способность этого антитела связываться с Рс-рецептором (РсК) (С1Ше8 е! а1., Сапсег Кекеатсй (1999) 59:2159-66). СН2- и СН3-домены 1дС2 и 1дС4 имеют необнаруживаемую или уменьшенную аффинность связывания с Рс-рецепторами по сравнению с СН2- и СН3-доменами 1дС1. Соответственно, время полужизни в сыворотке крови антитела по изобретению может быть увеличено путем использования СН2и/или СН3-домена от изотипов 1дС2 или 1дС4. Альтернативно, антитело может включать СН2- и/или СН3-домен от 1дС1 или 1дС3 с одной или более чем одной модифицированной аминокислотой в данных доменах для уменьшения аффинности связывания с Рс-рецепторами (см., например, заявку на патент США 09/256156, опубликованную как публикация заявки на патент США 2003-0105294).

Шарнирная область Рс-фрагмента в норме примыкает к С-концу СН 1-домена константной области тяжелой цепи. Шарнирная область, включенная в белки по настоящему изобретению, гомологична природной области иммуноглобулина и обычно включает цистеиновые остатки, связывающие две тяжелые цепи посредством дисульфидных связей, как в природных иммуноглобулинах. Типичные последовательности шарнирных областей иммуноглобулинов человека и мыши можно найти в ΛΝΤΙΒΟΟΥ ΕΝΟΙΝΕΕΒΙΝ6, а РКАСТ/САР СИ1БЕ, (ВоггеЬаеск, еб., №. Н. Ргеетап апб Со., 1992).

Подходящие шарнирные области по настоящему изобретению могут происходить от 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4 и других изотипов иммуноглобулинов. Изотип 1дС1 имеет две дисульфидные связи в шарнирной области, что позволяет образовать эффективную и прочную дисульфидную связь. Поэтому предпочтительная шарнирная область по настоящему изобретению происходит от 1дС1. Возможно, чтобы первый с Ν-конца цистеин шарнирной области 1дС1 был мутирован с целью повышения экспрессии и эффективности сборки антител или слитых белков антител по изобретению (см., например, заявку на патент США № 10/093958, опубликованную как публикация заявки на патент США 2003-0044423).

Как известно, в отличие от 1дС1, образование межцепочечных дисульфидных связей в шарнирной области 1дС4 происходит неэффективно (Апда1 е! а1., (1993), Мо1. 1ттипо1. 30:105-8). Также, шарнирная область 1дС2 имеет четыре дисульфидные связи, которые имеют тенденцию увеличивать олигомеризацию и вероятность неправильного дисульфидного связывания во время секреции в рекомбинантных системах. Одна подходящая шарнирная область по настоящему изобретению может происходить от шарнирной области 1дС4, предпочтительно содержащей мутацию, которая повышает вероятность образования правильных дисульфидных связей между группировками, происходящими от тяжелых цепей (Апда1 е! а1., (1993), Мо1. 1ттипо1. 30(1):105-8). Другая предпочтительная шарнирная область происходит от шарнирной области 1дС2, в которой первые два цистеина мутированы путем замены на другую аминокислоту, такую как (в порядке предпочтения) серин, аланин, треонин, пролин, глутаминовая кислота, глутамин, лизин, гистидин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, глицин, метионин, валин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, триптофан или селеноцистеин (см., например, публикацию заявки на патент США 2003-0044423).

Рс-фрагмент, слитый с вариабельной областью антитела по изобретению, может содержать СН2и/или СН3-домены и шарнирную область, которые происходят от разных изотипов антител. Например, Рс-фрагмент может содержать СН2- и/или СН3-домены от 1дС2 или 1дС4 и шарнирную область от 1дС1

- 12 016429

Сборка таких гибридных Ес-фрагментов описана в публикации заявки на патент США 2003-0044423.

Рс-фрагмент, слитый с вариабельной областью антитела по изобретению, может содержать одну или более чем одну аминокислотную модификацию, которая обычно увеличивает время полужизни в сыворотке крови слитого белка, включающего Рс. Такие аминокислотные модификации включают мутации, по существу, уменьшающие или полностью подавляющие связывание с Рс-рецептором или комплемент-фиксирующую активность. Например, один тип такой мутации удаляет сайт гликозилирования на Рс-фрагменте тяжелой цепи иммуноглобулина. В 1дС1 сайтом гликозилирования является А§п297 (см., например, заявку на патент США № 10/310719, опубликованную как публикация заявки на патент США 2003-0166163).

Вариабельные области антитела по изобретению могут быть присоединены к диагностическому и/или терапевтическому агенту. Данный агент может быть слит с антителом с получением слитого белка. Альтернативно, данный агент может быть химически соединен с антителом с получением иммуноконъюгата. Данный агент может представлять собой, например, токсин, радиоактивную метку, радиофармацевтический агент, иммуностимулирующую группировку или тому подобное.

Вариабельная область антитела по изобретению может быть присоединена к цитокину. Предпочтительные цитокины включают интерлейкины, такие как интерлейкин-2 (1Ь-2), Ш-4, Ш-5, Ш-6, 1Ь-7, 1Б-10. Ш-12, Ш-13, 1Ь-14, Ш-15, 1Ь-16, Ш-18, Ш-21 и 1Ь-23, гемопоэтические факторы, такие как гранулоцитмакрофаг колониестимулирующий фактор (СМ-С8Р), гранулоцит-колониестимулирующий фактор (СС8Р) и эритропоэтин, факторы некроза опухоли (ΤΝΡ), такие как ΤΝΡα, лимфокины, такие как лимфотоксин, регуляторы метаболических процессов, такие как лептин, интерфероны, такие как интерферон α, интерферон β и интерферон γ, и хемокины. Предпочтительно, слитый белок или иммуноконъюгат антитело-цитокин обладают биологической активностью цитокина. В одном воплощении вариабельный домен антитела слит с Ш-2. Предпочтительно, чтобы несколько аминокислот 1Ь-2-группировки были мутированы с целью уменьшения токсичности, как описано в публикации заявки на патенте США 20030166163.

Возможно, белковые комплексы могут дополнительно включать второй агент, например второй цитокин. В одном воплощении слитый белок антитела В4 УНух/УКуу включает Ш-12 и Ш-2. Конструкция белковых комплексов, содержащих домен иммуноглобулина и два разных цитокина, подробно описана в патенте И.8. 6617135.

Продуцирование антител

Для продуцирования антител по изобретению, а также других белков, содержащих вариабельные области, по изобретению, используют методики, хорошо известные в области белковой инженерии. Нуклеиновую кислоту векторов, способных экспрессировать тяжелую цепь и легкую цепь, которые содержат последовательности по изобретению, вводят в подходящую клетку и продукт, представляющий собой рекомбинантный белок, экспрессируют и очищают. Например, антитела по изобретению могут быть продуцированы в специализированных линиях клеток млекопитающих, таких как клетки N8/0, клетки СНО, клетки 8Р2/0 (8Р2/0-А§14; АТСС-СКЬ 1581), клетки ΥΒ2/0 (УБ2/3НЬР2.С11,16А§.20; АТСС СКЬ1662), или в других клетках млекопитающих, хорошо известных в области продуцирования антител. В одном воплощении антитела В4 УНух/УКуу продуцируют в клетках N8/0. В другом воплощении антитела В4 УНух/УКуу продуцируют в клетках ΥΒ2/0. Альтернативно, для продуцирования белков, содержащих вариабельные области по изобретению, могут быть использованы клетки дрожжей, растений, насекомых или бактерии.

Введение

Антитела по изобретению предпочтительно применяют в лечении пациентов с В-клеточными расстройствами, такими как В-клеточные лимфомы или аутоиммунные расстройства с В-клеточным компонентом, такие как ревматоидный артрит, злокачественная миастения, рассеянный склероз, системная красная волчанка и так далее. В зависимости от заключения врача, они могут оказаться полезными в лечении пациента с В-клеточной лимфомой, когда другие терапии не дают положительных результатов. Например, некоторые пациенты, которых лечат КДихап™, сначала могут отвечать на это лечение, но могут возникнуть К.йихап™-резистентные раковые клетки. Такие пациенты в большинстве случаев все еще должны реагировать на лечение антителами по изобретению.

В случае антител против СО19 иногда полезно вывести из организма нормальные В-клетки, так как существует вероятность, что эти клетки будут оттитровывать антитело по изобретению. Для этой цели может быть использован Кйихап™, в соответствии со стандартными методиками. Альтернативно, для выведения из организма нормальных В-клеток могут быть использованы антитела против СО 19 по изобретению, например, таким образом, как описано в примере 5 и примере 9.

Предпочтительным способом введения является инфузия. Другие способы введения включают инъекцию, такую как подкожная, интрадермальная, внутримышечная, внутрибрюшинная или внутривенная (болюсная) доставка. Ингаляция и пероральная доставка также являются возможными путями доставки.

Для человека с массой тела 70 кг типичная доза находится в диапазоне от приблизительно 50 мг до 2 гм, предпочтительная доза находится в диапазоне приблизительно 400-600 мг. Введение можно повто

- 13 016429 рять приблизительно один раз кажды три - шесть недель, например, в течение которых осуществляют мониторинг нормальных В-клеток и опухолевых клеток.

Слитые белки по настоящему изобретению являются полезными в лечении у человека такого заболевания, как онкологическое заболевание. При лечении онкологического заболевания является полезным, например, введение слитого белка антитело-1Ь-2, содержащего вариабельные области по изобретению, путем инфузии или подкожной инъекции, с использованием доз от 0,1 до 100 мг/метер²/пациента. В предпочтительном воплощении в особенности полезным является введение слитого белка антитело-1Ь-2, содержащего вариабельные области по изобретению, путем инфузии или подкожной инъекции, с использованием доз от 1 до 10 мг/метер²/пациента и более предпочтительно с использованием доз приблизительно 3-6 мг/метер²/пациента.

Фармацевтические композиции по изобретению можно применять в форме твердых, полутвердых или жидких лекарственных форм, таких как, например, пилюли, капсулы, порошки, жидкости, суспензии или тому подобное, предпочтительно в стандартных лекарственных формах, подходящих для введения точных доз. Данные композиции включают стандартный фармацевтический носитель или эксципиент и, кроме того, могут включать другие лекарственные агенты, фармацевтические агенты, носители, адъюванты и так далее. Такие эксципиенты могут включать другие белки, такие как, например, человеческий сывороточный альбумин или белки плазмы. Современные методики приготовления таких лекарственных форм являются известными или обычно очевидны специалистам в данной области техники. Композиция или препарат, которые будут вводить, в любом случае, должны содержать активный(е) компонент(ы) в количестве, эффективном для достижения желаемого эффекта у субъекта, которого лечат.

Введение композиций по изобретению может быть выполнено любым способом введения, принятым для агентов, которые обладают такой активностью. Данные способы представляют собой местное или системное введение. Предпочтительным способом введения является внутривенная инъекция в фармацевтически приемлемом носителе. Количество вводимого активного соединения, конечно, должно зависеть от субъекта, которого лечат, тяжести заболевания, способа введения и заключения врача, назначающего лекарство.

Изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.

Пример 1. Конструирование антител против СЭ19, содержащих вариабельную область тяжелой и легкой цепей по изобретению.

Для введения последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих область тяжелой цепи и область легкой цепи по изобретению, в подходящий вектор для экспрессии в клетках млекопитающих использовали стандартные методики генной инженерии. Типичные стратегии клонирования описаны ниже. Экспрессирующий вектор ркНЬ12 представляет собой вектор, который относится к более поздней генерации экспрессирующего вектора ркНЬ и содержит уникальные рестрикционные сайты для встраивания кассет нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные области тяжелой и легкой цепей. Конструкция ркНЬ12 позволяет встраивать нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи, как N110 Ι/Ηίηά III фрагмент, а нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельную область легкой цепи, как Ай ΙΙ/Ват ΗΙ фрагмент, и совместно экспрессировать интактные тяжелую и легкую цепи антитела (смотри, например, заявку на патент США 2003/0157054).

Последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующие вариабельным областям тяжелой цепи по изобретению, фланкированные последовательностями, содержащими последовательности, узнаваемые эндонуклеазами рестрикции, а именно последовательностью 5-СТТААОС-3' (на 5'-конце; содержащей N10 I сайт) и последовательностью 5-С6ТАА6Т66АТСС-3' (на 3'-конце; содержащей Ηίηά III сайт), синтезировали ке ηονο и встраивали в плазмидный вектор, являющийся производным рИС-вектора (В1ие Негоп В1о1есйпо1оду, ΒοϊΗοΙΙ, ОТА). Нуклеиновую кислоту вырезали из плазмидного вектора в виде N10 !/Н1пк III фрагмента и лигировали с подходящим фрагментом вектора плазмиды ркНЬ12, расщепленной таким же образом. Последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующие В4 7Н0 (8ЕЦ ГО N0: 1), В4 7Ну1 (81Т) ГО N0: 2), В4 ν»ν2 (81 ОТ) ГО N0: 3), В4 ν»ν3 (81 ОТ) ГО N0: 4), В4 ν»ν4 (81 ОТ) ГО N0: 5), В4 ν»ν5 (81 ОТ) ГО N0: 6) и В4 ν»ν6 (81 ОТ) ГО N0: 7) приведены.

Аналогично, нуклеиновые кислоты вариабельных областей легкой цепи по изобретению, фланкированные последовательностями, содержащими последовательности, узнаваемые эндонуклеазами рестрикции, а именно последовательностью 5'-6СТА6СТССА6С-3' (на 5'-конце; содержащей Ай II сайт) и последовательностью 5-66ТАА6СТТ-3' (на 3'-конце; содержащей Ват Ш сайт), синтезировали ке ηονο и встраивали в плазмидный вектор, являющийся производным рИС-вектора (В1ие Негом В^есй^^^у, Вοΐ1е11, ОТА). Нуклеиновую кислоту вырезали из плазмидного вектора в виде АД П/Ват Ш фрагмента и лигировали с подходящим фрагментом вектора плазмиды ркНЬ12, расщепленной таким же образом. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие В4 7К0 (8ЕЦ ГО N0: 8), В4 νΐ<ν1 (8ЕЦ ГО N0: 9), В4 (81 ОТ) ГО N0: 10), В4 7Ку3 (81 ОТ) ГО N0: 11) и В4 7Ку4 (81 ОТ) ГО N0: 12) приведены.

В результате комбинаторного встраивания в ркНЬ12 последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих разные вариабельные области тяжелой и легкой цепей, получали набор плазмид, кодирующих антитела В4 по изобретению, В4 АНух/УКуу.

Пример 2. Экспрессия и очистка антител по изобретению. Далее в примерах использованы сле

- 14 016429 дующие общие методики.

1А. Культура клеток и трансфекция.

Для временной экспрессии антител в клетках млекопитающих плазмидную ДНК вводят в клетки почек эмбриона человека (линии 293) или в клетки почек детеныша хомяка (ВНК) путем копреципитации плазмидной ДНК фосфатом кальция и клетки выращивают без использования селекции для поддерживания плазмиды [8атЬгоок е1 а1. (1989) Мо1еси1аг С1оп1пд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог. Ν.Υ.].

Стабильно трансфицированные клоны получают с помощью одной из стандартных методик, например, путем электропорации или путем нуклеофекции. Электропорацию ДНК в клетки мышиной миеломы N3/0 выполняют следующим образом. Клетки N8/0 выращивают в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (ИМЕМ, Ь1Ге Тес11по1още5) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 1х пенициллина/срептомицина. Приблизительно 5х10⁶ клеток промывают один раз РВ8 и ресуспендируют в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера (РВ8). Затем 10 мкг линеаризованной плазмидной ДНК инкубируют с данными клетками в Оепе Рикег Сиуейе (межэлектродное расстояние 0,4 см, ВюВай) в течение 10 мин на льду. Электропорацию выполняют с использованием Оепе Рикег (ВюКаб) в режиме 0,25 У и тюгоЕ. Клетки выдерживают на льду в течение 10 мин для регенерации, затем их ресуспендируют в ростовой среде, и затем высевают в два 96-луночных планшета. Стабильно трансфицированные клоны отбирают по их способности расти в присутствии 100 нМ метотрексата (МТХ), который вводят через двое суток после трансфекции. Клеткам заменяют питательную среду каждые 3 суток, эту операцию повторяют два-три раза, и клоны, устойчивые к МТХ, обычно появляются через 2-3 недели. С целью идентификации суперпродуцентов супернатанты клонов анализируют с помощью апй-йиЕс ЕМ8А [О1Ше8 е1 а1. (1989) 1. Iттиηо1. МеШобз 125:191]. Клоны-суперпродуценты выделяют и размножают в ростовой среде, содержащей 100 нМ МТХ.

Аналогично, для получения стабильно трансфицированных клонов с помощью, по существу, той же самой методик могут быть использованы другие клеточные линии, такие как клетки СНО, клетки ВНК, клетки 8Р2/0 и клетки ΥΕ2/0. Когда использовали клетки ΥΕ2/0, стабильно трансфицированные клоны обычно отбирали по их способности расти в присутствии 50 нМ МТХ.

Стабильно трансфицированные клоны, например, клеток крысиной миеломы ΥΕ2/0 также получали путем нуклеофекции. Приблизительно 2х10⁶ клеток ΥΗ2/0, выращенных в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (ИМЕМ) с добавлением инактивированной теплом 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 1 х пенициллина/срептомицина, центрифугировали при 90хд при комнатной температуре в течение 10 мин и ресуспендировали в 100 мкл раствора Νυс1еоГес1ог 8о1ийоп У (из набора). 100 мкл данной клеточной суспензии смешивали с 2 мкг линеаризованной плазмидной ДНК (линеаризованной по Екр I сайту в последовательности β-лактамазы), переносили в кювету (Атаха) и выполняли нуклеофекцию с использованием подходящей М.1с1еоГес1ог (Атаха) программы, 0-20. Добавляли 500 мкл предварительно нагретой культуральной среды и данную пробу переносили в лунку 12-луночного планшета. Через сутки после трансфекции клетки ресуспендировали в ростовой среде и высевали в 96-луночные планшеты с плотностью клеток в диапазоне от приблизительно 10 клеток/лунку до приблизительно 600 клеток/лунку. Стабильно трансфицированные клоны отбирали по способности расти в присутствии 50 нМ метотрексата (МТХ), который вводили через двое суток после трасфекции. Клеткам заменяли питательную среду каждые 2 или 3 суток, эту операцию повторяли дважды, и клоны, устойчивые к МТХ, обычно появлялись через 2-3 недели. С целью идентификации суперпродуцентов супернатанты клонов анализировали с помощью апЦ-НиЕс ЕМ8А [О1Ше8 е1 а1. (1989) 1. Оптипо1. МеШойз 125:191]. Клоны-суперпродуценты выделяли и размножали в ростовой среде, содержащей 50 нМ МТХ.

Клетки могут быть выращены в другой среде, известной в данной области техники, такой как Н8ЕМ с добавлением 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки и 100 нМ метотрексата, или безбелковая среда, такая как среда СИ.

1Б. ЕЫ8А (твердофазный иммуноферментный анализ).

Для определения концентрации белковых продуктов в супернатантах клонов, устойчивых к МТХ, и в других тестируемых пробах используют различные ва рианты ЕМ8А. Например, ап0-1шЕс ЕЫ8А используют для измерения количества белков, содержащих человеческий Ес, например, химерных антител, а апй-йи карра ЕЫ8А используют для измерения количества легкой цепи каппа (химерных или человеческих иммуноглобулинов).

Апй-йиЕс ЕЫ8А описан подробно ниже.

А. Покрытие планшетов.

Планшеты для ЕМ8А покрывают антителом АГйшРиге Соа1 Апй-Нитап [дС (Н+Ь) (1аскзоп Ептипо КекеагсН) в концентрации 5 мкг/мл в РВ8, внося в 96-луночные планшеты (Шпс-Еитипо р1а1е Мах1когр) 100 мкл/лунку. Покрываемые планшеты накрывают крышкой и инкубируют при 4°С в течение ночи. Затем планшеты промывают 4 раза 0,05% Твином (Твин 20) в РВ8 и блокируют 1% В8А/1% сывороткой козы в РВ8, 200 мкл/лунку. После инкубации с блокирующим буфером при 37°С в течение 2 ч

- 15 016429 планшеты промывают 4 раза 0,05% Твином в РВ8, и удаляют жидкость путем стряхивания на бумажные полотенца.

Б. Инкубация с тестируемыми пробами и вторичным антителом.

Тестируемые пробы разбавляют до подходящих концентраций в буфере для проб, который содержит 1% В8А/1% сыворотку козы/0,05% Твин в РВ8. Для построения калибровочной кривой используют химерное антитело (с человеческим Рс), концентрация которого известна. Для построения калибровочной кривой выполняют серию разведений в буфере для проб, и получают калибровочную кривую в диапазоне от 125 до 3,9 нг/мл. Разбавленные пробы и стандарты добавляют в планшет, 100 мкл/лунку, и данный планшет инкубируют при 37°С в течение 2 ч.

После инкубации планшет промывают 8 раз 0,05% Твином в РВ8. Затем в каждую лунку добавляют 100 мкл вторичного антитела, антитела АпД-Нитап Ι§Ο, конъюгированного с пероксидазой хрена (НКР) (Засккоп Iттиηο КекеагсН), разбавленного приблизительно 1:120000 буфером для проб. Точное разбавление вторичного антитела должно определяться для каждой партии НКР-конъюгированного АпД-Нитап ЦС. После инкубации при 37°С в течение 2 ч планшет промывают 8 раз 0,05% Твином в РВ8.

В. Проявление.

В планшет добавляют раствор субстрата, 100 мкл/лунку. Раствор субстрата готовят путем растворения 30 мг дигидрохлорида орто-фенилендиамина (0РИ) (1 таблетка) в 15 мл буфера 0,025 М лимонная кислота/0,05 М №₂НР0₄, рН 5, который содержит 0,03% свежедобавленной Н₂О₂. Для появления окраски выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Время проявления меняется от партии к партии в зависимости от возможных изменений, связанных с покрытием планшетов, вторичного антитела и так далее. Для определения момента остановки реакции наблюдают за появлением окраски в стандартах, соответствующих калибровочной кривой. Реакцию останавливают путем добавления 4 н. Н₂80₄, 100 мкл/лунку. Планшет считывают с помощью планшет-ридера, который настраивают на 490 нм и 650 нм и программируют на вычитание фонового значения 0Ό при 650 нм из 0Ό при 490 нм.

АпБ-1ш карра ЕЫ8А выполняют в соответствии с той же методикой, которая описана выше, за исключением того, что используемое вторичное антитело представляет собой антитело Соа! АпД-Ди карра, конъюгированное с пероксидазой хрена (8ои111егп Вю1есНпо1оду Аккос. Шс., ВиттдДат, А1а.), которое используют в разведении 1:4000.

Очистка.

Стандартные методики очистки антител заключались в следующем. Обычно композиции антитела В4 АНух/АКуу по изобретению очищали из супернатантов клеточных культур путем хроматографии на сорбентах с белком А, которая основана на аффинности Рс-фрагмента к белку А. Подготовленный супернатант клеток, экспрессирующих композиции антитела В4 АНух/АКуу, загружали на предварительно уравновешенную колонку Рак!-Р1оте Рто!ет А-8ерНагоке. Колонку интенсивно промывали натрийфосфатным буфером (50 мМ фосфат натрия, 150 мМ ИаС1, нейтральный рН). Связанный белок элюировали натрий-фосфатным буфером с низким рН (рН 2,5-3) (состав см. выше), и элюированные фракции сразу нейтрализовали 1 М Тпк-Ьаке до приблизительно рН 6,5. Композиции хранили в буфере 50 мМ фосфат натрия, 150 мМ ИаС1, рН 6,5 с добавлением Твина 80 до 0,01%.

Степень чистоты и целостности продукта обычно определяли путем ЖХВД эксклюзионной хроматографии и путем ДСН-ПААГ-электрофореза. Результаты показывали, что антитела В4 АИух/АКуу по изобретению обычно более чем на 90% являются неагрегированными и интактными, с небольшими признаками продуктов деградации.

Пример 3. Определение относительной аффинности связывания антител В4 по изобретению с СИ19-презентирующими клетками.

Чтобы убедиться в том, что антитела по изобретению сохраняют способность связываться с СИ19, использовали конкурентный анализ, где измеряли эффективность, с которой данные антитела ингибируют связывание меченого исходного антитела В4 (В4 АИ0/АК0) с клетками лимфомы линии Дауди, которые несут антиген СИ19.

Меченое биотином антитело В4 АИ0/АК0 получали с использованием набора Е2-Дпк 8и1Ро-ИН8ЬС-ВюДпу1аДоп Κίΐ (Р1егсе, # 21430) согласно прилагаемому протоколу. Продукт диализировали на 8Дбеа-1ухег (Р1егсе, # 66425) и анализировали путем ЖХВД эксклюзионной хроматографии.

В общих чертах, готовили серию титрований меченого биотином антитела В4 νΉ0/νΚ0, предварительно смешанного в конечной концентрации 100 нг/мл с одним из немеченых тестируемых антител В4 АНух/АКуу в концентрации 800 нг/мл, 400 нг/мл, 200 нг/мл, 100 нг/мл и 50 нг/мл в буфере РВ8/2% сыворотка. В качестве контроля использовали меченое биотином антитело, предварительно смешанное с немеченым антителом В4 АН0/АК0 в тех же концентрациях, что и выше (контроль ингибирования), или только с одним буфером (положительный контроль связывания). Смешанные антитела добавляли к клеткам Дауди и выдерживали в течение 30 мин при 4°С. К клеткам добавляли стрептавидин, меченый МТС (флюоресцеин-изотиоцианатом), в разведении 1:200, и данные пробы инкубировали дополнительно в течение 30 минут при 4°С. Количество связанного меченого антитела В4 АН0/АК0 измеряли с помощью РАС8-анализа и результаты измерений выражали в виде процента ингибирования относительно положительно контроля связывания. Тестировали антитела В4 та/ТО (С), В4 АНу1/АКу1 (1), В4

- 16 016429

А^гНу2/'УКу1 (2), В4 ¹УНу1/’УКу2 (3), В4 ¹УНу2/¹УКу2 (4), В4 ¹УНу3/’УКу3 (5), В4 ¹УНу4/’УКу3 (6), В4 У^гНу3/'УКу4 (7), В4 'УНу4/'УКу4 (8), В4 У^гНу5/'УКу4 (9) и В4 А^гНу6/А^гКу4 (10). Типичные результаты двух экспериментов приведены в табл. 3 и 4.

Таблица 3. Ингибирование связывания биотин-В4 А^гН0/'УК0 с клетками Дауди антителами по изобретению

Соотношение (немеченное/меченное)	Антитело
С	(% ингибирования связывания меченого В4)	8
1 2	3	4	5	6	7
8х	68	56	56	56	56	60	56	60	60
4х	56	44	40	44	44	40	44	52	48
2х	44	28	28	32	32	36	32	36	32
1х	28	16	16	20	16	20	16	20	16
0,5х	16	12	8	12	8	12	12	12	12

Таблица 4. Ингибирование связывания биотин-В4 А^гН0/'УК0 с клетками Дауди антителами по изобретению

Соотношение (немеченное/меченное)	Антитело (% ингибирования связывания меченого В4)
С	9	10
8х	93	90	87
4х	90	87	80
2х	83	70	70
1х	67	57	60
0,5х	50	47	53

Данные, приведенные в табл. 3 и 4, показывают, что антитела В4 АИух/УКуу ингибируют связывание меченого антитела В4 с клетками Дауди в такой же степени, как и немеченое антитело В4 А^гН0/'УК0, что свидетельствует о том, что антитела В4 АИух/УКуу и антитело В4 А^гН0/'УК0 обладают сходной аффинностью.

Пример 4. АИСС-активность антител по изобретению.

Оценивали АИСС-активность, опосредуемую антителами по изобретению, продуцированными различными клеточными линиями. АИСС определяли путем стандартного анализа высвобождения ⁵¹Сг, как практикуется в данной области техники. Готовили последовательные разбавления антител (4-кратные разбавления в диапазоне от 100 до 0,025 нг/мл), и лизис ⁵¹Сг-меченых клеток Дауди (мишеней; отношение Е:Т составляло 100:1) в присутствии антител, вызываемый очищенными РВМС (эффекторными клетками) человека, измеряли по специфическому высвобождению ⁵¹ Сг относительно общего клеточного ⁵¹Сг (корректировка для спонтанного высвобождения ⁵¹Сг). Тестировали антитела В4 А^гНу4/А^гКу4, продуцированные эмбриональными клетками почки человека 293Т или клетками ΥΒ2/0, и антитела В4 АН^/УК^, продуцированные клетками линии N8/0 или клетками ΥΒ2/0.

На фиг. 38 приведены результаты такого эксперимента. Оба антитела, полученнные путем экспрессии в клетках ΥΒ2/0, проявляли равную активность, приводящую к опосредованной АИСС, и по меньшей мере 50-кратную активность по сравнению с соответствующим антителом, полученным путем экспрессии в клетках линии δ/0 или в клетках 293Т. В4 VΗν4/VКν4, продуцированное клетками 293Т, проявляло большую активность, чем В4 VΗν5/VКν4, продуцированное клетками линии N8/0.

Пример 5. Истощение В-клеток человека, привитых δСI^-мышам, антителами по изобретению.

Истощение В-клеток является полезным в нескольких терапевтических аспектах. Например, аутоиммунные и воспалительные расстройства, стимулированные антителами, можно лечить антителами по изобретению, уменьшая или, по существу, элиминируя В-клетки. Альтернативно, при лечении агентом для направленной доставки к опухоли, таким как 2еуа1т™ или Веххаг™ или слитый белок Ьеи16-1Ь2 (^02005/016969), сначала полезно элиминировать нормальные В-клетки.

Чтобы выяснить, можно ли применять антитело по изобретению для истощения В-клеток человека, проводили следующий эксперимент. В начале эксперимента (0-е сутки) самцам мышей δίΊΩ СВ17 (η = 3) прививали очищенные РВМС человека путем интраперитонеальной инъекции приблизительно 4,5 х 10⁷ клеток в 0,2 мл ΡΒδ, по существу, в соответствии с описанным ранее протоколом переноса клеток селезенки человека ШасоиЬ№ои55еГ е( а1., Ттап§р1. 1ттипо1. (2005) 15:157-164). На 3 сутки мышам интраперитонеально инъецировали либо ΡΒδ, либо 50 мкг Ьеи16, антитела против СИ20, или К4Н4, антитела против СИ19. Уровень 1дМ человека измеряли с помощью набора Нитап 1дМ ΕυδΛ диапШаНоп кН (ВеШу1 ЬаЬотаШпек; Са(# Е80-100) на 7, 14 и 21 сутки.

На фиг. 39 приведены типичные результаты. В контрольной группе, получавшей в качестве лечения ΡΒδ, титр 1дМ человека постоянно увеличивался и достигал приблизительно 800 мкг/мл на 42 сутки. У мышей, которые получали лечение либо антителом Ьеи 16, либо антителом В4 VΗν5/VКν4, титры 1дМ

- 17 016429 человека по существу отсутствовали, что свидетельствовало о том, что В-клетки человека истощались при лечении данными антителами.

Пример 6. Лечение лимфомы у млекопитающего антителом по изобретению.

Чтобы выяснить, являются ли антитела по изобретению функциональными ίη νίνο, антитело В4 νΗν4/νΚν4, экспрессированное в клетках ΥΒ2/0, тестировали на животной модели лимфомы человека. В начале эксперимента (0-е сутки) мышам 8СГО СВ17 в возрасте восьми недель (η = 6) внутривенно инъецировали приблизительно 1 х 10⁶ жизнеспособных клеток Намальвы №11т-6-иМ-1. На 1, 3 и 5 сутки мыши получали в качестве лечения 500 мкг антитела интраперитонеально или ΡΒ8. Приблизительно один - два раза в неделю мышей обследовали, чтобы выяснить, у каких из мышей развитие болезни достигло стадии, требующей эвтаназии.

На фиг. 40 приведены типичные результаты такого эксперимента. Все мыши, получавшие в качестве лечения ΡΒ8, заболевали в течение 10 недель после инъекции опухолевых клеток, тогда как мыши, которые получали лечение антителом В4 νΗν4/νΚν4, заболевали позднее, и три из шести мышей в данной группе оставались здоровыми на протяжении всего 30-недельного эксперимента.

Пример 7. Лечение лимфомы Беркитта у млекопитающего антителом по изобретению в комбинации с химиотерапией.

Чтобы выяснить, можно ли применять антитела по изобретению ίη νίνο в комбинации с химиотерапией, антитело В4 νΗν4/νΚν4 тестировали на животных моделях лимфомы человека, которые были более убедительными, чем в предыдущем примере, соответствуя более запущенным или с трудом поддающимся лечению формам лимфомы. В одном типичном эксперименте лимфому, моделированную с помощью клеточной линии Дауди, которая представляет собой клеточную линию лимфомы Беркитта, лечили антителом В4 νΗν4/νΚν4, экспрессированным в клетках ΥΒ2/0, с циклофосфамидом (СРА) или без циклофосфамида. В начале эксперимента (0-е сутки) мышам 8СГО СВ17 в возрасте восьми недель (η = 6) инъецировали внутривенно приблизительно 5х10⁶ жизнеспособных клеток Дауди. На 8 и 12 сутки мыши получали в качестве лечения 100 мкг антитела или ΡΒ8. На 7 сутки мыши получали в качестве лечения ΡΒ8 или 75 мкг СРА на килограмм массы тела. Для лечения использовали интраперитонеальное введение в объеме 0,2 мл. Приблизительно один - два раза в неделю мышей обследовали, чтобы выяснить, у каких из мышей развитие болезни достигло стадии, требующей эвтаназии.

На фиг. 41 приведены данные типичного эксперимента. В контрольной группе, которая не получала лечения ни антителом, ни СРА, все мыши заболевали в течение четырех недель после инъекции клеток лимфомы. В группе мышей, которые получали лечение либо только одним антителом В4 νΗν4/νΚν4, либо только одним СРА, 5 из 6 мышей оставались здоровыми в течение по меньшей мере пяти недель, но заболевали в течение приблизительно шести недель. В группе мышей, которые получали лечение как антителом В4 νΗν4/νΚν4, так и СРА, все мыши оставались здоровыми в течение по меньшей мере восьми недель.

Пример 8. Лечение диссеминированной лимфомы антителом по изобретению в комбинации с химиотерапией.

В другой серии экспериментов мышам внутривенно инъецировали клетки Намальвы, в соответствии с тем, как описано в предыдущем примере, за исключением того, что использовали 2 х 10⁶ клеток вместо 1х10⁶ клеток. Данное увеличение количества клеток приводит к более активному развитию болезни, на что указывает сравнение фиг. 42, где все мыши, получавшие в качестве лечения ΡΒ8, заболевали в течение трех недель, с фиг. 40, где в отличие от фиг. 42, мыши, получавшие в качестве лечения ΡΒ8, заболевали в диапазоне от 5 и 10 недель. Мыши (η = 5) получали в качестве лечения 500 мкг антитела интраперитонеально или ΡΒ8 на 3, 7 и 11 сутки. На 3, 7 и 11 сутки мыши также получали лечение либо циклофосфамидом (75 мг/кг, интраперитонеально), либо винкристином (0,4 мг/кг, внутривенно), либо доксорубицином (3 мг/кг, внутривенно), либо ΡΒ8 (внутривенно). Результаты приведены на фиг. 42 (а-в). Данные результаты свидетельствуют о том, что каждый из трех химиотерапевтических агентов мог бы применяться в комбинации с антителом по изобретению.

Пример 9. Применение антител и способов по изобретению в лечении пациента-человека.

Антитела против ί.Ό19 по изобретению применяют в лечении заболеваний и расстройств человека следующим образом. В общем случае предпочтительным способом введения является внутривенная инфузия или внутривенная инъекция, хотя также возможна подкожная инъекция, ингаляция, пероральная доставка и другие способы доставки. Введение выполняют приблизительно один раз каждые 2, 3 или 4 недели, хотя частота введения может изменяться в зависимости от потребностей пациента. Типичная доза для взрослого человека составляет приблизительно 100-800 мг. За пациентами, которых лечат, осуществляют наблюдение с целью выявления признаков инфекции, которая может быть вызвана иммунодепрессией.

Например, пациент с болезнью Кастлемена получает лечение антителом В4 νΗν4/νΚν4 против ί.Ό19 по изобретению приблизительно один раз каждые две недели с использованием дозы приблизительно 8 мг/кг, которую вводят путем капельной инфузии в течение приблизительно 1 ч.

Пациент с ревматоидным артритом получает лечение антителом В4 νΗν4/νΚν4 против СЭ19 при

- 18 016429 близительно один раз каждые четыре недели с использованием дозы приблизительно 8 мг/кг, которую вводят путем капельной инфузии в течение приблизительно 1 ч. Установлено, что монотерапия в значительной степени ингибирует прогрессирование разрушения суставов, даже по сравнению с симптоммодифицирующими противоревматическими лекарствами.

Пациент с болезнью Крона получает лечение антителом В4 УНу4/УКу4 против СЭ19 приблизительно один раз каждые четыре недели с использованием дозы приблизительно 8 мг/кг, которую вводят путем капельной инфузии в течение приблизительно 1 ч.

Пациент с множественной миеломой получает лечение антителом В4 УНу4/УКу4 против СЭ19 приблизительно один раз каждые три недели с использованием дозы приблизительно 8 мг/кг, которую вводят путем капельной инфузии в течение приблизительно 1 ч. Лечение антителом В4 УНу4/УКу4 против ί.Ό19 комбинируют со стандартным лечением множественной миеломы, назначаемым врачом в качестве лечения, подходящего для данного пациента.

Пациент с В-клеточной лимфомой получает лечение антителом В4 УНу4/УКу4 против СЭ19 приблизительно один раз каждые три недели с использованием дозы приблизительно 8 мг/кг, которую вводят путем капельной инфузии в течение приблизительно 1 ч, возможно в комбинации с таким антителом, как Кйихал™, приблизительно 375 млг/м² площади поверхности тела, которое вводят каждую неделю, или с эпратузумабом, антителом против СЭ22. Альтернативно, в случае пациента с рефрактерной лимфомой, лечение антителом В4 УНу4/УКу4 против СЭ19 комбинируют с радиоиммуноконъюгатом, таким как Веххаг™ или 2еуа1ш™.

Более конкретно, пациент с В-клеточной лимфомой получает лечение антителом В4 УНу4/УКу4 против ί.Ό19 приблизительно один раз каждые три недели с использованием дозы приблизительно 8 мг/кг, которую вводят путем капельной инфузии в течение приблизительно 1 ч, возможно в комбинации с химиотерапевтической схемой лечения, такой как циклофосфамид плюс винкристин плюс доксорубицин плюс преднизолон (СН0Р), или СН0Р плюс блеомицин, или СН0Р плюс этопозид, или митоксантрон плюс винкристин плюс тиотепа, или этопозид плюс преднизолон плюс цитарабин плюс цисплатин, или месна плюс ифосфамид плюс митоксантрон плюс этопозид, или бендамустин, или флударабин и 2СбА.

Согласно альтернативной стратегии лечения пациент с В-клеточной лимфомой сначала получает лечение антителом В4 УНу4/УКу4 против СЭ19 с использованием дозы приблизительно 8 мг/кг и, кроме того, затем получает лечение слитым белком анти-С^20-I^2, таким, как описано в \У02005/01б9б9. Например, в первый день пациент получает лечение антителом В4 УНу4/УКу4 против СЭ19, которое вводят путем капельной инфузии в течение приблизительно 1 ч, и затем, на второй день и на четвертый день, получает лечение слитым белком ημη^Ό20-ΙΕ2 с использованием дозы приблизительно 150 мкг/кг, которую вводят путем капельной инфузии в течение приблизительно 4 ч, и данный цикл повторяют приблизительно каждые 3 недели. Безотносительно к какой-либо теории антитело В4 УНу4А/Ку4 против ί.Ό19 обладает действием, которое приводит к очищению организма пациента от большей части нормальных В-клеток, так что слитый белок анти-С.'О20-[Ь2 оказывает действие, связываясь с оставшимися опухолевыми клетками.

- 19 016429

Перечень последовательностей <110> Зирег, М1с11ае1 ϋβνίε, ДопаЬНап

ЗЬе1п, Разса1 Апдге <120> АпЫ-СЕ>19 АпЫЬосЦез \νίθ+ КескюеЗ ХгптиподепхсШу

Антитела против СЭ19 с пониженной иммуногенностью <130> Р05/226-Ьк/Ьз (ЬЕХ-040) <150> РСТ/ЕР2006/012365.

<151> 2006-12-21 <160>33 <170> Расепсш уегзхоп 3.3 <210> 1 <211>360 <212> ГМА <213> вариабельная область тяжелой цепи антитела В4 мыши (В4УНО) <400> 1

саддбдсаас	Ьдсадсадсс	ЬддддсЬдаа	дЬддЬдаадс	ссддддсРЬс	адЬдадасбд	60
бссбдсаада	сьисСддсСа	сассЫсасс	адсаасбдда	лдсасСдддР	даадсададд	120
ссЬддасаад	дсс СХдад^д	да+сддадад	а+бдаРссЬС	сЬдабадбба	басбаасбас	180
ааСсаааадб.	Исаадддсаа	ддссаадЬЬд	асВдРадаса	ааРссЬссад	сасадссЬас	240
абддаадЬса	дсадссЬдас	абсУдаддас	бсбдсддбсе	аНасбдЬдс	аададдбадс	300
аасссЬбасЬ	асЪа'ЬдсЬа^	ддасЬасЬдд	ддбсааддаа	ссбсадЬсас	сдесессЬса	360

<210> 2 <211>360 <212> ОНА <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела В4, включающая кодоны для аминокислотных замен К23Е, С42Э, К69Е и 3850 (В4 УНу1) <400> 2

саддбдсаас	бдсадсадсс ЬддддсЬдаа дСддСдаадс сСддддсЬЕс адРдадасСд	60
бссбдсдада	сЬбсбддсба сассббсасс адсаасЬдда Ьдсасбдддб даадсададд	120
ссбдассаад	дасььдадбд дабсддадад а!ОдаСссИ сбдаПадРСа Сас1аасСас	180
аабсаааадб	бсаадддсаа ддссдааббд асбдбадаса ааЬссбссад сасадссбас	240
аДддаадбса	дсдассбдас абсбдаддас ЬсЕдсддРсЬ аРЬасбдбдс аададдбадс	300
йа_с с с Е	асЮабдсЦар ддасЬасбдд ддЬсааддаа ссРсадбсас сдбсбссбса	360

<210> 3

- 20 016429 <211> 350 <212> ϋΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела В4, включающая кодоны для аминокислотных замен К69Е и 3850 (В4 νΗν2) <400> 3

садд^дсаас	Ёдсадсадсс	Ёддддсхдаа	дЁддЪдаадс	сЬддддсЁЁс	адЁдадасЁд	60
ЬссСдсаада	сЁЁсЁддсЁа	сассЁЁсасс	адсаасЁдда	ЁдсасЁдддЁ	даадсадада	120
ссЁддасаад	дасЁЁдадЁд	даЁсддадад	аЁЁдаЁссЁЁ	сЁдаЁадЬЬа	ЁасЁаасЁас	180
аэЁсаааадЁ	Ёсаадддсаа	ддесдааЪЁд	асЁдЁадаса	ааЁссЁссад	сасадссЪас	240
аЁддаадЁса	дсдассЁдас	аХс^даддас	ЁсЁдсддЁсС	аЁЁасЁдЁдс	аададдьадс	300
аасссЁЁасЁ	асЁаЁдсЁаЁ	ддасЁасЁдд	ддЁсааддаа	ссЁсадЁсас	сдЁсЁссЁса	360

<210> 4 <211> 360 <212> ГВДА <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела В4, включающая кодоны для аминокислотных замен ОЗЕ, ν12Κ, Н19К, Ь20У, Т24А, 3850 и 388А (В4 νΗν3₂ <400> 4

саддЁдсаас	Сддадсадсс	СддддсЬдаа	дЁдаадаадс	сЛддддсССс	адЁдааддЁд	60
ЁссСдсаадд	сЫссСддсСа	сассшсасс	адсаасЁдда	СдсасЬдддЬ	даадсададд	120
ссЁддасаад	дасседадЬд	даосддадад	аЁХдаЁссЁЁ	сЪдаОадООа	ЁасЁаасЁас	180
ааЁсаааадЁ	ксаадддсаа	ддссаадЬРд	асЁдЁадаса	аабссЬссад	сасадссЁас	240
аЁддаадЁса	дсдассЬдас	адсбдаддас	ЁсЁдсддЪсЁ	аЬРасЪдЪдс	аададдЁадс	300
аасссЁЁасЁ	асьаСдсСа!:	ддасбасТдд	ддЁсааддаа	ссесад-Ссас	сдЁсЁссЁса	360

<210> 5 <211> 360 <212> ГМА <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела В4, включающая кодоны для аминокислотных замен <25Е, К19К, Ι,20ν, К40Т, β43Κ, Κ65ϋ, 585ϋ, 388Α и У93Т (Β4 ΫΗν-Ι) <400>5 саддЬдсаас 1ддадсадсс ЪддддсЬдаа дСддЬдаадс сЬддддсЬЬс адбдааддЬд60

Ьссбдсаада сВЬсЬддсЬа сассЬЬсасс адсаасЬдда кдсасВдддб даадсадасд120

- 21 016429

ссХддаааад	дасСЪдадЪд	даЪсддадад	аМзда^ссИ:	сЬдаЪадСЪа	еас-еаасеас	180
ааМсаааадЦ	'ЬсдаЬддсаа	ддссаад£1;д	ас^дсадаса	ааЪссГ-сеад	сасадссЪас	240
аЪддаад^са	дсдассЪдас	адспдаддас	ЬсХдсдассМ	а^Хас^дСдс	аададд±адс	300
аассс^асЪ	ас£а£дсЪа£	ддас^ас^дд	дд^сааддаа	ссЬсадЬсас	сдЪс^ссЪ-са	360

<210> 6 <211> 360 <212> Ε’ΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела В4, включающая кодоны для аминокислотных замен 05Ξ, νΐ2Κ, В19К, 12 ОУ, Т24А, К38К, К40А, 043К, Κ65ϋ, Ξ85Ώ и У93Т (В4 \ΖΗν5) <400> б

саддЕдсаас	Лддадсадсс Рддддсбдаа дрдаадаадс сРддддсбЬс адбдааддрд	60
сссЬдсэ.адд	сЫсЛддсба сассЛХсасс адеаасОдда рдсасЬдддЬ дадасаддса	120
ссбддаааад	дасЛЛдадбд даЛсддадад аЬсдаСссЕо сРдаЛадЛЛа ЬасЬаасЬас	180
ааЛсаааадЕ	ЕсдаЛддсаа ддссаадблд асрдрадаса ааЛссбссад сасадссЛас	240
аЬддаадбса	дсдассЛдас аЛсЛдаддас ЛсЛдсдассЛ аЛЛасЛдЛдс аададдЛадс	300
аасссЫасЛ	асЛаЛдсЛаЛ ддасЛасЛдд ддЛсааддаа ссЛсадЛсас сдЛсЛссЛса	360

<210> 7 <211> 360 <212> ода .

<213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела В4, включающая кодоны для аминокислотных замен 05Е, Е19К, Ь20У, Κ65Ώ, 885ϋ и ν93Τ (В4 УНл/б} <400> 7

саддЛдсаас	Лддадсадсс	ЛддддсЛдаа	дЛддЛдаадс	сЛддддсЛЕс	адидааддид	60
ЛссЛдсаада	сЛЛсЛддсЬа	сассЛЛсасс	адсаасЛдда	ЛдсасЬдддЛ	даадсададд	120
ссЛддасаад	дасЛЛдадЛд	даЛсддадад	аЛЛдаЛссЛЛ	сЛдаЛадЛЛа	£ас£аас£ас	180
аабсаааадЛ	ЛсдаЛддсаа	ддссаадЛЛд	асЛдЛадаса	ааЛссЛссад	сасадссЪас	240
абддаадЛса	дсдассЛдас	аЛсЛдаддас	ЛсЛдсдассЛ	алласлдлдс	аададд^адс	300
аасссЛЛасЛ	асЛаЛдсЛаЛ	ддасЛасЛдд	ддЛсааддаа	ссЛсадЛсас	сд£сЁсс£са	360

<210> 8 <211> 312 <212> ША <213> вариабельная область легкой цепи антитела В4 мыши (В4УК0)

- 22 016429

<400> 8
саааЕЕдбЕс	ДсасссадЕс	ЁссадсааЕс	апдбсЕдсаб	сЕссадддда	дааддСсасс	60
аСдассЕдса	дЕдссадсЕс	аддДдЬсаас	ЬасаДдсасЕ	ддСассадса	даадссаддс	120
ассСссссса	ааадаЕддаС	ЕЬаЕдасаса	ДссааасИдд	сСДсбддадЕ	сссЕдсЕсдс	180
ЬЕсадЕддса	дЕдддЕСЕдд	дассЕсЕк-аЬ	ЕсЪсЕсасаа	Есадсадсаб	ддаддсбдаа	240
даЬдсЕдсса	сЕЕаЕЕасЕд	ссаЕсадсда	ддЕад^Еаса	сдГЛсддадд	ддддассаад	300
сЕддаааЕаа	аа					312

<210>9 <211>312 <212> ША <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную

область легкой цепи антитела В4, УЗА, 57Е и Ά54Ό ίΒ4 νκνΐ Ϊ	включающая	КОДОНЫ ДЛЯ	аминокислотных замен
<400> 9
саааСЕдсЕс	Есасссадда	дссадсааЕс	аЬдСсЬдса-р	с^ссадддда	дааддЬсасс	60
аЬдассДдса	дЬдссадсЕс	аддЪдЕсаас	ЕасаСдсасД	ддбаЕсадса	даадссаддс	120
ассЬссссса	ааадабддаС	ббаЕдасаса	Иссааасбдд	абЕсЕддадб	сссЕдсЕсдс	180
ЕЬсадЕддса	дГдддЪсЬдд	дассбсЕСаб	Ьсбсбсасаа	Есадсадсаб	ддаддсЕдаа	240
даЕдсЕдсса	сЬЕаЕЕасЕд	ссаЪсадсда	ддЕад£1:аса	сдЛЪсддадд	ддддассаад	300

сЪддаааЕаа аа 312 <210> 10 <211>312 <212> ΜΙΑ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область легкой цепи антитела В4, включающая кодоны для аминокислотных замен £)1О, НОТ, М11Ь и Α54Ώ (В4 νΚν2)

<400> 10
дасаЕрдбСс	Есасссадбс	Ессадсаасс	ДЬдбсЬдсаЛ	сбссадддда	дааддЕсасс	60
аЕдасс^дДа	дЬдссадсЕс	аддбдЕсаас	ЕасаЕдсасб	ддСаЕсадса	даадссаддс	120
ассЕссссса	ааадаЕдда!:	ЪЕабдасаса	Ессааас^дд	аЪЕсбддадб	сссЬдсЬсдс	180
СЕсадбддса	дбдддЕсЕдд	дассбсЕЕа^	ЕсЕсЕсасаа	бсадсадсаб	ддаддсДдаа	240
даЕдсЕдсса	с^^аььасед	ссаЕсадсда	ддЕадЬЬаса	сдСЕсддадд	ддддассаад	300
сЕддаааЕаа	аа					312

- 23 016429 <210> 11 <211> 312 <212> ΕΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область легкой цепи антитела В4, включающая кодоны для аминокислотных замен

НОТ, Ш1Ь, ν19Α, Υ29Α и 375Е (В4 ΥΚν3) <400> 11

саааХЪд£Ьс	бсасссадьс	ЬссадсаасЬ	ЬЬдСсЬдсаб	соссадддда	дааддсЪасс	60
аСдассЬдса	дбдссадсЬс	аддбдсбаас	сасаодсасс	ддбассадса	даадссаддс	120
ассЪссссса	ааадасддаб	ПаЕдасаса	сссааасбдд	сбЬсбддадб	сссЬдсЕсдс	180
ЁЁсадЁ.ддса	дСдддЬсЕдд	дассбсббаб	Ссбсбсасаа	бсдададсаЬ	ддаддс^даа	240
даЁдсЁдсса	сЕбаббасбд	ссабсадсда	ддгадсхаса	сдЬСсддадд	ддсгдассаад	300
с£ддаааЪаа	аа					312

<210> 12 <211> 312 <212> ΕΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область легкой цепи антитела В4, включающая колоны для аминокислотных замен

НОТ, М11В, ν19Ά, 35Ш и Ь53Т (В4 νΚν4) <400> 12

сааабЬдббс бсасссадбс	йссадсаасЪ Ъид^сЪдсаЪ сСссадддда дааддсС.асс	60
абдассСдба дСдссадсбс	адд^сгСсаас ЕасаЬдсасЕ ддЬассадса даадссаддс	120
ассбссссса ааадабддаС	££а£дасаса дасаааасдд сИИсЬддадЬ ссс£дс£сдс	130
ЬЬсадбддса дсдддбсбдд	дассЪс^ЪаХ Ес^сЕсасаа Ссадсадсас ддаддс^даа	240
дабдсЬдсса сСЬаСОасбд	сса^садсда дд^ад^аса сдЪЪсддадд ддддаасаад	300
сбддааабаа аа		312

<210>13 <211> 120 <212> РЕТ <213> вариабельная область тяжелой цепи антитела В4 мыши (В4УНО) <400>13

С1п Уа1 О1п Веи <31п С1п Рго С51у А1а <31и Уа1 νβΐ Вуз Рго С1у А1а 15 1015

- 24 016429

Зет Уа1 Агд Ьеи

Зег

Суз Ьуз

ТЬг

Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг

£ег Азп

20

25

30

Тгр

Мер

ΗΪΞ

Тгр

УаЬ

Ьуз

С1п.

Агд

Рго

сьу

С1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

11е

35

40

45

СЬу

СЬи

Не

Азр

Рго

Зег

Азр

Зег

Туг

ТЬг

Азп

Туг

Азп

С1П

Ьуз

РЬе

50

55

60

Ьуз

СЬу

Ьуз

А1а

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Зег

Зег

ТЬг

АЬа

Туг

65

70

75

80

Мер

СЬи

УаЬ

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

СЬи

Азр

Зег

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

СЬу

Зег

Азп

Рго

Туг

Туг

Туг

АЬа

Мер

Азр

Туг

Тгр

СЬу

С1п

100

105

110

СЬу

ТЬг

Зег

Уа1

ТЬг

УаЬ

Зег

Зег

115

120

<210>14 <211> 120 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <22 0>' <223> Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела В4 с аминокислотными заменами К23Е, С42Г, К69Е и 885Ю (В4 УНУ1) <400>14

С1п 1

Уа1

С1п

Ьеи

С1п 5

С1п

Рго

СЬу

АЬа

С1и 10

Уа1

Уа1

Ьуз

Рго

СЬу 15

А1а

Зег

УаЬ

Агд

Ьеи 20

Зег

Суз

СЬи

ТЬг

Зег 25

СЬу

Туг

ТЬг

рЬе

тЬг 30

Зег

Азп

Тгр

Мее

НЬз 35

Тгр

УаЬ

Ьуз

С1п

Агд 40

Рго

Азр

СЬп

СЬу

Ьеи 45

СЬи

Тгр

Не

С1у

С1и 50

11е

Азр

Рго

Зег

Азр 55

Зег

Туг

ТЬг

Азп

Туг 60

Азп

С1п

Ьуз

РЬе

Ьуз 65

СЬу

Ьуз

АЬа

СЬи

Ьеи 70

ТЬг

УаЬ

Азр

ьуз

Зег 75

Зег

Зег

ТЬг

АЬа

Туг 80

Мер

С1и

Уа!

Зег

Азр 85

Ьеи

ТЬг

Зег

СЬи

Азр 90

Зег

АЬа

УаЬ

Туг

Тут- 95

Суз

А1а Агд Я1у Зег Азп Рго Туг Туг Туг А1а Мер Азр Туг Тгр С1у С1п

100 105110

С1у ТНг Зег Уа1 ТЬг '.'а1 Зег Зег

115120 <210>15 <211> 120 <212> РНТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела В4 с аминокислотными заменами К69Е и 3850 (В4 νΗν2) <400> 15

С1п Уа1 С31п Ьеи <31п С1п Рго С1у А1а С1и Уа1 Уа1 Ьуз Рго <31у А1а

1

5

10

15

Зег

Уа1

Агд

Веи 20

Зег

Суз

Ьуз

ТЬг

Зег 25

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг 30

Зег

Азп

Тгр

МеС

ΗΪΞ 35

Тгр

ν«ι

Ьуз

О1П

Агд 40

Рго

С1у

(31п

С1у

Ьеи 45

С1и

Тгр

11е

<31у

С1и 50

Не

Азр

Рго

Зег

Азр 55

Зег

Туг

Пи-

Азп

Туг 60

Азп

С1п

Ьуз

РЬе

Вуз 65

С1у

Вуз

А1а

О1и

Ъеи 70

ТНг

νθΐ

Азр

Вуз

Зег 75

Зет*

Зег

ТЬг

А1а

Туг 80

МеЕ

С1и

ναΐ

Зег

Азр 85

Веи

Тпх

Зег

С1и

Азр 90

Зег

А1а

Уа1

Туг

Туг 95

Суз

А1а

Агд

С1у

Зег 100

Азп

Рго

Туг

Туг

Туг 105

А1а

Меб

Азр

Туг

Тгр 110

О1у

С1п

С1у ТНг Зег ν&1 ТНг Уа1 5ег Зег

115 120 <210> 16 <211> 120 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

- 26 016429 <223> Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела В4 с аминокислотными заменами β5Ε_Γ Ч12К, К19К, Ь20Ч, Т24А, 385Ώ и 388А (В4 ЧНчЗ) <400> 16

С1п Ча1 1

Шп Ьеи <31и (31п Рго С1у А1а 61и Ча1 Ьуз Ьуз

РГО

С1у 15

А1а

5

10

Зег

Ча1

Ьуз

Ча1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Зег

Азп

20

25

30

тгр

Меб

Н1з

Тгр

Ча1

Ьуз

С1п

Агд

Рго

С1у

О1п

С1у

Ьеи

(31и

Ткр

Не

35

40

45

<31у

С1и

Не

Азр

Рго

Зег

Азр

Зег

Туг

ТЬг

Азп

Туг

Азп

О1п

Ьуз

РЬе

50

55

60

Ьуз

С1у

Ьуз

А1а

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Ча1

Азр

Ьуз

Зег

Зег

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Меб

(31ц

Ча!

Зег

Азр

Ьеи

ТЬг

А1а

С1и

Азр

Зег

А1а

Ча1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

<3.1 у

Зег

Аеп

Рго

Туг

Туг

Туг

А1а

Меб

Азр

Туг

Тгр

С1у

С.1п

100

105

110

С1у

ТЬг

Зег

Ча1

ТЬг

Ча!

Зег

Зег

115

120

<210> 17 <211> 120 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела В4 с аминокислотными заменами 05Е, В.19К, Ь20Ч, П40Т, 043К, Κ65Ώ, 385ϋ, 388А и Ч93Т (В4 4Ην4) <400> 17

С1п Уа1 С1п Ьеи. 1

С1и С1п Рго С1у А1а С1и Ча!

Ча! Ьуз

Рго

С1у 15

А1а

5

10

Зег

Ча!

Ьуз

Ча1

Зег

Суе

Ьуз

ТЬг

Зег

61у

ТУг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Зег

Азп

20

25

30

Тгр

Меб

Н1з

Тгр

Ча1

Ьуз

С1п

ТЬг

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Т1е

35

40

45

- 27 016429

С1у

С1и 50

Не

Азр

Рго

Зег

Азр 55

Зег

Туг

ТЬг

Азп

Туг 60

Азп

<31п

Ьуэ

РЬе

Азр 65

С1у

Ьуз

А1а

Ьуз

Ьеи 70

ТНг

νβΐ

Аэр

Ьуэ

Зег 75

Зег

Зег

ТЬг

А 1а

Туг 80

меб

<31и

νβΐ

Зег

Азр 35

Ьеи

ТЬг

А1а

С1и

Азр 90

Зег

А1а

ТЬг

Туг

Туг 95

Суз

А1а

Агд

С1у

Зег 100

Азп

Рго

Туг

туг

Тут- 105

А1а

МеЬ

Азр

Тус

Тгр но

Й1у

С1п

С1у ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115	120
<210>	18
<211>	120
<212>	РКТ
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела В4 с аминокислотными заменами £>5Ε_Γ νΐ2Κ, Н19К, Ь20У, Т24А, К38Н,

Κ40Ά, 043К, Κ65Ώ, 385Р и ν93Τ (В4 νΗν5) <400> 18

С1п Уа1 1

С1п Ьеи

С1и С1п Рго С1у А1а С1и Уа1

Ьуз

Ьуз

Рго

□1у 15

А1а

5

10

Зег

Уа1

Ьуэ

νβΐ

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Зег

Азп

20

25

30

Тгр

МеЬ

Н1з

Тгр

Уа1

Агд

(31x1

А1а

Рго

<31у

Ьуз

<31у

Ьеи

С1и

Тгр

Не

35

40

45

<31у

С1и

Не

Азр

Рго

Зег

Азр

Зег

Туг

ТЬг

Азп

Туг

Азп

С1п

Ьуз

РЬе

50

55

60

Азр

С1у

Ьуз

А1а

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Зег

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЬ

С1и

Уа1

Зег

Аэр

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр

Зег

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

<31у

Зег

АЗП

РГО

Туг

Туг

туг

А1а

Меб

Аэр

1уг

тгр

С1у

С1п

100

105

НО

С1у

ТЬг

Зег

Уа1

ТЬх-

Уа1

Зег

Зег

115

120

- 28 016429 <210> 19 <211> 120 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела В4 с аминокислотными заменами ζ)5Ε, Н19К, Ь20У, Κδ5ϋ, 585ϋ и ν93Τ (Β4 УНуб) <400> 19

С1п 17а 1 С1п Ьеи С1и С1п Рго С1у А1а С,1и Х7а1 17а1 Ьуз Рго С1у А1а

1

5

10

15

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1 20

Зег

Суз

Ьуз

Ткг

Зег 25

С1у

Туг

ткг

РЬе

Ткг 30

Зег

Азп

Тгр

мед

Н1з 35

Тгр

17а 1

Ьуз

С1п

Азод 40

Рго

С1у

αΐη

<31у

Ьеи 45

(31и

Тгр

Не

С1у

С1и 50

Не

Азр

Рго

Зег

Азр 55

Зег

Туг

Ткг

Азп

Туг 60

Азп

61п

Ьуз

РЬе

Азр 65

<31у

Ьуз

А1а

Ьуз

Ьеи 70

Ткг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег 75

Зег

Зег

Ткг

А1а

Туг 80

МеЬ

С1и

Уа1

Зег

Азр 85

Ьеи

ТЬд-

Зег

С1и

Азр 90

Зег

А1а

Ткг

Туг

туг 95

Суз

А1а

Агд

61у

Бег 100

Азп

Рго

Тут

ТУг

Туг 105

А1а

Меб

Азр

Тут

Тгр 110

С1у

С1п

С1у Ткг Йег Уа1 Ткг Уа1 Зег Зег
115	120
<210>	20
<211>	120
<212>	РКТ
<213>	Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела В4 с аминокислотными заменами ν12Κ, К23Е, <342Э, К65О, К69Е и 385ϋ (В4 νΗνΙΙ) <400> 20

С1п Уа1 С1п Ьеи <31 η С1п Рго С1у А1а С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго <31у А1а 15 10 15

- 29 016429

Вег Уа1 Агд Ьеи

Зег

Суз О1и

ТЬг

8ег С1у Туг ΤΙέτ Ρϊιθ ΤΙιγ

Зел

Азп

20

25

30

Тгр

Мер

Н1з

Тгр

Уа1

Ьуз

С1п

Агд

Рго

Азр

С1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Не

35

40

45

С1у

С1и

Не

Азр

Рго

Зег

Азр

Зег

Тус

ТЬг

Азп

Туг

Азп

С1п

Ьуз

РЬе

50

55

60

Азр

В1у

Ьуз

А1а

С1и

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Вег

Вег

Вег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Мер

С,1и

Уа1

Зег

Азр

Ьеи

ТЬг

Вег

С1и

Азр

Зег

А1а

Уа1

ТУг

Туг

Суз

35

90

95

А1а

Агд

С1у

Зег

Азп

Рго

Туг

Туг

Туг

А1а

Мер

Азр

Туг

Тгр

С1у

31п

100

105

110

С1у

ТЬг

Вег

Уа1

ТЬг

Уа1

Вег

Зег

115

120

<210> 21 <211> 120 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела В4 с аминокислотными заменами С5Е, ν12Κ, К19К, Ь20У, Т24А, К40Т, <Э43К, К65П, 385ϋ, Ξ88Α и У93Т (В4 ¥Ην34) <400> 21

С1п Уа1 1

С1п ьеи (Э1и 5

С1П Рго С1у

А1а

С1и 10

Уа1 Ьу$ Ьуз Рго <31у 15

А1а

Вег

νηΐ

Ьуз

Уа1

Вег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Зег

Азп

20

25

30

Тгр

Мер

Н1з

Тгр

Уа1

Ьуе

С1п

ТЬг

Рго

<31у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Не

35

40

45

31у

С1и

Не

Азр

Рго

£ег

Азр

Зег

туг

ТЬг

АЗП

туг

Азп

Е1п

Ьуз

РЬе

50

55

60

Азр

С1у

Ьуз

А1а

Ьуз

Ьеи

ТЬг

ν&1

Азр

Ьуз

Зег

Вег

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЬ

<31 и

Уа1

Зег

Азр

Ьеи

ТЬг

А1а

С1и

Азр

Зег

А1а

ТЬг

ТУг

Туг

Суз

85

90

95

- 30 016429

А1а Агд С1у Зег Αξπ Рго Туг Туг Туг А1а Меб Азр Туг Тгр <31у С1п

100 105110

С1у ТЬг Зег ν&1 ТИг Уа1 Зег Зег

115120 <210> 22 <211>30 <212> РНТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аминокислотная последовательность каркасной области 1 тяжелой цепи антитела В4 с вариабельными аминокислотными остатками Х5, Х12 , Х19, Х20, Х23 и Х24 (В4 УН£г1) <220>

<221> М15С_РЕАТГтЕ <222> (5). . (5)

<223>	Хаа	обозначает	(31η	ИЛИ	С1и
<220>
<221>	М13С	_ΡΕΑΤϋΉΕ
<222>	(12)	..(12)
<223>	Хаа	обозначает	Уа1	ИЛИ	Ьуз
<220>
<221=·	МТЗС	_РЕАТиКЕ
<222>	(19)	..(19)
<223>	Хаа	обозначает	Агд	или	Ьуз
<220>
<221>	М18С	_РЕАТ0ВЕ
<222>	(20)	. . (20)
<223>	Хаа	обозначает	Ьеи	ИЛИ	Уа1

<220>

<221> М13С_РЕАТ0ЙЕ <222> (23),,(23) <223> Хаа обозначает Ьуз, О1и или Азр <220>

<221> М13С_РЕАТТЛЖ <222> (24)..(24) <223> Хаа обозначает ТЬг или А1а <400>22

С1п Уа1 С1п ьеи хаа О1п Рго С1у А1а С1и Уа1 Хаа Ьуз Рго С1у А1а 15 1015

Зег Уа! Хаа Хаа Зег Суз Хаа Хаа Зег С1у Туг Т?±г рИе Тпг

2530 <210=·23

- 31 016429 <211> 14 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аминокислотная последовательность каркасной области 2 тяжелой цепи антитела В4 с вариабельными аминокислотными остатками ХЗ, Х5, Х7 и Х8 (В4 УН£г2) <220>

<221> ΜΙ 5С_РЕАТиКЕ <222> (3}..(3) <223> Хаа обозначает Ьуз или Агд <220>

<221> МТ5С_ЕЕАТЦКЕ <222> (5)..(5) <223> Хаа обозначает Агд, ТЬг или А1а <220>

<221> М13С„РЕАТЦКЕ <222> (7)..(7) <223> Хаа обозначает С1у, Азр или <31и <220>

<221> М13С_РЕАТиНЕ <222> (8)..(8) <223> Хаа обозначает С1о или Ьуа <400>23 тгр νβΐ Хаа С1п Хаа Рго Хаа хаа <31у Ьеи. <31и Тдр Не 31у

1510 <21024 <211>39 <212> РЕТ <213> Искусственная последовательность <220 <223> Аминокислотная последовательность каркасной области 3 тяжелой цепи антитела В4 с вариабельными аминокислотными остатками Хб, ХЮ, Х26, Х29 и Х34 (В4 УН£гЗ) <220>

<221> М13С_РЕАТиКЕ <222> (6)..(6)

<223>	хаа обозначает	Ьуз,	Азр или С1и
<220
<221>	М15С	_ΡΈΆΤϋΚΕ
<222>	(10)	..(10)
<223>	Хаа	обозначает	Ьуз,	С1и	ИЛИ	Азр
<220>
<221>	М15С	:_РЕАТиКЕ
<222>	(26)	. . (26)
<223>	Хаа	обозначает	Зег,	Азр	или	С1и

- 32 016429 <220>

<221> М13С_ГЕАТЦЕЕ <222> (29)..(29) <223> Хаа обозначает Зег^- или А1а <220>

<221> М13С_ГЕАТОКЕ <222> (34)..(34) <223> Хаа обозначает Уа1 или ТЪг <400> 24

Туг 1

Αεη

<31 η

Ьуэ

РИе 5

Хаа

С1у

Ьув

А1а

Хаа 10

Ьеи

ТЪг

Уа1

Азр

Ьуз 15

Зег

Зег

Зег

Ткг

А1а 20

Туг

Мер

С1и

Уа1

Зег 25

Хаа

Ьеи

ТЪг

Хаа

С1и 30

Азр

Зег

А1а

Хаа

Туг 35

Туг

Суз

А1а

Агд

<210> <211> <212> <213>

25 104 РНТ вариабельная

область

легкой цепи

антитела В4

мыши (В4УК0

<400>

25

<31п 1

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг 5

(31п

Зег

Рго

А1а

11е 10

Меб

Зег

А1а

Зег

Рго 15

СДу

<31и

Ьуэ

Уа1

ТЬг 20

Мер

ТЪг

Суз

Зег

А1а 25

Зег

Зег

О1у

Уа1

Азп 30

Туг

Мер

Н1з

Тгр

ТУг 35

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у 40

ТЪг

Зег

Рго

Ьуз

Агд 45

тгр

11е

Тус

Аэр

ТЬг 50

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег 55

О1у

Уа1

Рго

А1а

Агд 60

РЬе

Зег

С1у

Зег

<31у 65

Зег

С1у

ТЪг

Зег

тус 70

Зег

Ьеи

Тйг

11е

Зег 75

Зег

Мер

С1и

А1а

С1и 80

Азр

А1а

А1а

ТЪг

Туг 85

Туг

Суз

Н18

С1п

Агд 90

С1у

Зег

Туг

ТЬх·

РЬе 95

С1у

С1у С1у ТТсс Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз

100 <210> 26 <211> 104 <212 > РРТ

- 33 016429 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи

антитела В4

с аминокислотными заменами УЗА,

37Е и Α54Ώ (В4 УКу!)

<400> 26

61п 1

11е

А1а

Ьеи

ТЬг 5

<31п

е1и

Рго

А1а

Не 10

МеЬ

Зег

А1а

Зег

Рго 15

С1у

С1и

Ьуэ

Уа1

Т1’-Г 20

Меб

ТЬг

суз

Зег

А1а 25

Зег

Зег

С1у

Уа1

Азп 30

Тут

Мер

Н1з

Тгр

Туг 35

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у 40

ТЬг

Зег

Рго

Ьуз

Агд 45

Тгр

Не

Туг

Азр

ТЬг 50

Зег

Ьуз

Ьеи

Азр

Зег 55

С1у

Уа1

Рго

А1а

Агд 60

РЬе

Зег

С1у

Зег

С1у 65

Зег

С1у

ТЬг

Зег

Туг 70

Зег

Ьеи

Т1хс

11е

Зег 75

Зег

МеЬ

С1и

А 1а

С1и 80

Азр

А1а

А1а

ТЬг

Туг 85

туг

Суз

Н1з

С1п

Агд 90

С1у

Зег

туг

ТЬг

РЬе 95

С1у

С1у <31у ТЬг Ьу® Ьеи С1и Не Ьуз

100 <210> 27 <211> 104 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела В4 с аминокислотными заменами 01ϋ, НОТ, М11Ь и А54Ь (В4 νΚν2) <400> 27

Азр 1

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг 5

С1п

Зег

Рго

А1а

ТЬг 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Рго 15

С1у

С1и

Ьуэ

Уа1

ТЬг 20

Меб

ТЬг

Суз

Зег

А1а 25

Зег

Зег

С1у

Уа1

АЗП 30

Туг

мес

ΗΪΞ

Тгр

ТУг 35

С1п

<31п

Ьуз

Рго

С1у 40

ТЬг

Зег

Рго

Ьуз

Ахд 45

Тгр

Не

Туг

Азр

ТЬг 50

Зег

Ьуз

Ьеи

Азр

Зег 55

С1у

Уа1

Рго

А1а

Агд 60

РЬе

Зег

С1у

Зег

- 34 016429

□Ту Зег СЬу Инг Зег Туг Вег Ьеи тЪх Х1е зег Зег Меб СЬи АЬа СЬи
65	70	75	80
Азр АЬа АЬа ТЬг Тух	Туг Суз НЬе	СЬп Агд СЬу Зег	Туг ТНг РЬе СЬу
85		90	95
СЬу СЬу ТЬг Ьуз Ьеи	СЬи ЬТе Ьуз
ТОО

<210> 28 <21Ь> 104 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела В4 с аминокислотными заменами НОТ, МТЬЬ, У19А, У29А и 375Е (В4 ΛΖΚν3} <400>23

С1п Т

1Ье

УаТ

Ьеи

ТЬг 5

СЬп

Зег

Рго

АЬа

тьг то

Ьеи

Зег

АЬа

Зег

Рго Т5

СЬу

С1и

Ьуе

АЬа

ТЬг 20

Меб

ТЬг

Суз

Зег

АЬа 25

Зег

Зег

СЬу

АЬа

Азп 30

Туг

Меб

НЬз

Тгр

Туг 35

С1П

СТп

Ьуз

РГО

СЬу 40

ТЬг

Зег

РГО

Ьуз

Агд 45

Тгр

Не

Тух

Азр

ТЬг 50

Зех

Ьуз

Ьеи

АЬа

Зег 55

СЬу

УаТ

РГО

АЬа

Агд 60

РЬе

Зег

СЬу

Зег

СЬу 65

Зег

СЬу

ТЬг

Зег

Тух 70

Вег

Ьеи

ТЬг

1Те

СЬи 75

Зег

Меб

СЬи

АЬа

СЬи 80

Авр

АЬа

АЬа

ТЬг

Тух 85

Тух

Суз

НЬз

СЬл

Ахд 90

СЬу

Зег

Тух

ТЬг

РЬе 95

сьу

СЬу СЬу ТЬг Ьуз Ьеи СЬи Не Ьуй

100 <210>29 <211>104 <2Т2> РКТ <213> Искусственная последовательность <22 0 >

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела В4 с аминокислотными заменами НОТ, М11Ь, У19А, Е5Ю и Ь53Т (В4

УКу4)

- 35 016429 <400> 29

С1П 1

Не

Уа1

Ьеи

ТЬг 5

С1П

Зег

РГО

А1а

ТЬг 10

Ьеи

Бег

А1а

Бег

Рго 15

С1у

С1и

Ьуз

А1а

ТЬг 20

Меб

ТЬг

Суз

Зег

А1а 25

Зег

Зег

С1у

Уа1

Азп. 30

Туг

Меб

Н15

Тгр

Туг 35

С1п

<31п

Ьуз

Рго

С1у 40

ТЬг

Бег

РГО

Ьуз

Агд 45

Тгр

Не

Тух

Азр

ТЬг 50

Азр

Ьуз

ТЬг

А1а

Зег 55

61у

Уа1

Рго

А1а

Агд 60

РНе

Зег

С1у

Бег

С1у 65

Зег

С1у

ТЬг

Зег

Туг 70

Зег

Ьеи

ТЬг

Не

Зег 75

Бег

меб

<31и

А1а

С1и 80

Азр

А1а

А1а

ТЬг

Тух 85

Тух

Суз

Н13

Θΐη

Агд 90

С1у

Бег

Туг

ТЬг

РЬе 95

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

Х1е

Ьуз

100 <210> 30 <211> 104 <212> РИТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи, антитела В4 с аминокислотными заменами УЗА, 57Е, У19А, А54В и Б75Е (В4 νΚνΙΙ) <400> 30

С1п 1

Не

А1а

Ьеи

ТЬг 5

С1п

01и

Рго

А1а

Не 10

Меб

Зег

А1а

Зег

Рго 15

С1у

С1и

Ьуз

А1а

ТЬг 20

Меб

ТЬг

Суз

Зег

А1а 25

Зег

Зег

01у

Ча1

Азп 30

Туг

Меб

Нхз

Тгр

Туг 35

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у 40

ТЬг

Зег

РГО

Ьуз

Агд 45

Тгр

Не

Туг

Азр

ТЬх 50

Бег

Ьуз

Ьеи

Азр

Зег 55

С1у

Уа1

Рго

А1а

Агд 60

РЬе

Зег

С1у

Зег

С1у 65

Бег

С1у

ТЬг

Зег

туг 70

Зег

Ьеи

ТЬг

Не

<31и 75

Бег

Меб

С1и

А1а

С1и 80

Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз Н13 31п Агд С1у Зег Туг ТЬг РЬе С1у

9095

О1у С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз

100 <210>31 <211>104 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела В4 с аминокислотными заменами 110т, М11ь, ν19Α, ν29Α, 351П, Ь53т и 375Е (В4 νΚν34) <400>31

С1п 1

Не Уа1

Ьеи ТЬг (31п 5

Зег Рго

А1а

ТЬг Ьеи Зег А1а Зег Рго С1у

10

15

С1тд

Ьуз

А1а

ТЬг

МеЬ

ТЪд?

Суэ

Зег

А1а

Зег

Зег

С1у

А1а

Азп

Туг

МеЬ

20

25

30

Н1э

Тгр

1уг

С1П

С1п

Буе

Рго

С1у

ТЬг

Зег

Рго

Ьуз

Агд

Тгр

Не

Туг

35

40

45

Азр

ТЬг

Азр

Ьуз

ТЬг

А1а

Зег

С1у

Уа1

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

50

55

60

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Зег

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

11е

<31и

Зег

МеЬ

<31и

А1а

С1и

65

70

75

80

Азр

А1а

А1а

ТЬг

Туг

туг

Суз

ΗΪ3

С1п

Агд

С1у

Зег

Туг

ТЬг

РЬе

С1у

85

90

95

С1у С1у ТЬг Ьуэ Ьеи С1и Не Ьуз

100 <210>32 <211>23 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аминокислотная последовательность каркасной области 1 легкой цепи антитела В4 с вариабельными аминокислотными остатками XI, ХЗ, Х7, ХЮ, XII и Х19 (В4 УМЫ) <220>

<221> МТЗС_ЕЕАТОТ1Е

- 37 016429

<222> <22 3>	(1) · Хаа	. (1) обозначает С1п или Азр
<220>
<221>	М13С	_РЕАТиКЕ
<222>	(3} .	. (3)
<223>	Хаа	обозначает	Уа1	ИЛИ	А1а
<220>
<221>	МТЗС	_РЕАТЦКЕ
<222>	17) .	. (7)
<223>	Хаа	обозначает	Зег	или	С1и
<220>
<221>	М13С	„РЕАТиКЕ
<222>	(10)	..(10)
<223>	Хаа	обозначает	Не	или	Ткг
<220>
<221>	№ЗС	уРЕАТиКЕ
<222>	(11)	..(11)
<223>	Хаа	обозначает	Меб	или	Ьеи
<220>
<221>	МЬЗС_РЕАТЦКЕ
<222>	(19)	..(19)
<223>	хаа	обозначает	Уа1	или	А1а

<400>32

Хаа 11е Хаа Ьеи Ткг С1п Хаа Рго А1а Хаа Хаа Зег А1а Зег Рго С1у

1015 <31и Ьуз Хаа Ткг Мек Ткг Суз <210>33 <211>7 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Аминокислотная последовательность участка, определяющего комплементарность, 2 легкой цепи антитела В4 с вариабельными аминокислотными остатками ХЗ, Х5 и Хб (В4 УКсс1г2) <220>

<221> т1зс„£еабшге <222> (3)..(3) <223> Хаа может быть любой природной аминокислотой <220>

<221> т1зс„£еаЬиге <222> (5)..(б) <223> Хаа может быть любой природной аминокислотой <400> 33

Азр Ткг Хаа Ьуз Хаа Хаа Зег

5

- 38 016429

Claims (7)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Сконструированное и модифицированное антитело против СО-19, полученное из мышиного антитела В4 против СО-19 с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 13 и последовательностью вариабельной области легкой цепи 8Е0 ГО N0: 25, где указанное модифицированное антитело (ί) является менее иммуногенным, чем указанное немодифицированное родительское антитело при введении человеку, но все еще остается способным специфически связываться с СО19 и клетками-мишенями, экспрессирующими СО19, (ίί) содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 17 и последовательность вариабельной области легкой цепи 8Е0 ГО N0: 29 и (ίίί) получено путем его экспрессии в клетках ΥΕ2/0 или НЕК 293Т.
2. 2. Молекула ДНК, кодирующая модифицированное антитело против СО-19 по п.1.
3. 3. Экспрессирующий вектор, содержащий молекулу ДНК по п.2.
4. 4. Клетка-хозяин, экспрессирующая антитело против СО-19 по п.1.
5. 5. Фармацевтическая композиция, содержащая фармакологически эффективное количество антитела по п.1, возможно вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или эксципиентом.
6. 6. Применение фармацевтической композиции по п.5 в изготовлении лекарственного средства для лечения аутоиммунных заболеваний или онкологического заболевания.
7. 7. Применение антитела против СО-19 по п.1 для лечения аутоиммунных заболеваний или онкологического заболевания.