KR100827757B1 - 복수의 시토킨-항체 복합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 2종 이상의 다른 시토킨 분자를 포함하는 단백질 복합체 및 융합 단백질에 관한 것이다. 단백질 복합체 및 융합 단백질은 면역글로불린 영역과 같은 표적화 부분을 추가로 포함할 수 있다. 단백질 복합체 및 융합 단백질을 사용하는 방법도 개시되어 있다.

Description

복수의 시토킨-항체 복합체{MULTIPLE CYTOKINE-ANTIBODY COMPLEXES}
관련 출원의 참조
본 발명은 본 명세서에서 참고로 인용한 미국 특허 출원 일련 번호 60/147,924호(1999년 8월 9일 출원)의 이익을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 복수의 시토킨 단백질 복합체의 작제 및 발현 방법과 그 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 복수의 시토킨과 표적 성분으로 구성된 융합 단백질과, 암 및 바이러스 감염 등의 질병 치료용으로 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
면역계를 제어하는 조절망은 면역 세포의 기능을 개폐하고 그 증식을 조절하는 시토킨이라 불리우는 분비된 단백질 신호 전달 분자에 좌우된다. 이들 반응은 일반적으로 소정의 생물학적 효과를 얻기 위해서 협력하여 작용하는 복수의 시토킨과 관련이 있다. 인터루킨-2(IL-2)와 같은 일부 시토킨은 그 자체가 면역 세포 증식을 유도할 수 있으며, 2차 시토킨 분비를 비롯한 기타 기능을 활성화시킬 수 있다. 또 다른 시토킨인 인터루킨-12(IL-12)[Trinchieri, 1994, Blood 84:4008-4027]는 일부 특정 면역 세포의 증식을 유도하고 또 다른 주요 면역 조절인자인 인터페 론-γ(IFN-γ)를 유도할 수 있다. IL-12가 IFN-γ와 무관한 다른 중요한 활성들을 보유하긴 하지만, IFN-γ의 유도는 IL-12의 주요 활성이다. IL-12 자체는 감염성 질병 상황의 초기 단계에서 유도되기 때문에, 이 IL-2가 선천성 및 후천성 면역계를 연결시키는 것으로 생각된다.
마우스 및 인간 면역 세포를 이용한 여러 시험관내 연구 결과 최적 면역 반응의 진행에 있어서 시토킨 조합의 중요성이 확인되었다. 예를 들어, 대부분의 T 세포는 고 농도의 IL-2에서 배양되거나 미토겐으로 활성화될 때까지 IL-12 수용체(IL-12R)를 발현하지 않는다[Desai 등(1992), J.Immunol.148:3125-3132)]. 일단 수용체가 발현되면, 세포는 IL-12에 대한 반응성이 휠씬 향상된다. 또한, IL-12는 IFN-γ 전사를 유도하지만, 그 직후 IFN-γ mRNA가 분해된다. IL-2의 존재하에 mRNA가 안정화되면, 생성되는 IFN-γ의 양이 현저히 증가한다[Chan 등(1992) J.Immunol. 148:92-98]. 다른 연구에서, 시토킨 조합 IL-3과 IL-11 또는 IL-3과 강철 인자(Steel Factor)는 IL-12와 함께 초기 조혈 선조 세포의 증식에 상승적 효과를 제공하는 것으로 밝혀졌다[Trinchieri, 1994, 상기 문헌 참조]. 인터루킨-4와 GM-CSF의 조합은 수지상 세포를 자극하는 데 특히 유용하다(Palucka 등. [1998] J.Immunology 160:4587-4595). 세포 매개형 면역 반응의 자극을 위해서, IL-12에 상보적인 일부 활성을 보유하는 Th1-촉진 시토킨인 최근 발견된 IL-18과 IL-12를 병용하는 것도 유용하다(Hashimoto 등, [1999] J.Immunology 163:583-589; Barbulescu 등 [1998] J.Immnunolgy 160:3642-3647). 또한, IL-2 및 인터페론-γ는 일부 환경에서 상승작용이 있다[Palladino, M.A., 미국 특허 제5,082,658호].
이들 상승작용 연구 중 대부분의 연구에서는, 각 시토킨의 상대적 수준이 매우 중요한 것으로 밝혀졌다. 최적 이하량의 IL-2의 존재하에 IL-12를 첨가하면 증식 유도, 세포 용해 활성 및 IFN-γ 유도에 있어 상승 작용을 초래하지만, 하나의 시토킨을 고 용량으로 사용한 IL-2 및 IL-12의 조합은 길항작용을 나타내는 것으로 확인되었다[Perussia 등, J.Immnuology 149:3495-3502(1992); Mehrotra 등, J.Immnol. 151:2444-2452(1993)]. 유사한 상황이 IL-12와 IL-17의 조합에서도 존재한다.
마우스에서 항종양 반응을 형성하기 위한 IL-12와 다른 시토킨 간의 상승 작용 연구는 서로 다른 결과를 나타내었다. 일부 모델에서는 최적 이하량의 각 시토킨에서 상승 작용이 관찰되었고 더 높은 용량에서는 독성 증가를 초래한 반면, 다른 모델에서는 IL-12와 IL-2의 병용이 거의 또는 전혀 상승 작용을 나타내지 않았다[예컨대 Nastala 등, J.Immunol. 153:1697-1706. (1994)]. 이들 결과는, 특히 상이한 약리학적 특성, 예컨대 상이한 순환 반감기 및 생체분포를 보유한 2종의 제제의 활성을 고정 비율로 유지해야 하는 경우, 생체내 2종의 잠재적으로 상승 작용하는 제제를 조합하는데 있어 본질적인 어려움을 반영하는 것이다.
시험관내 세포 배양물 실험에서, 시토킨 수준을 조절하는 것은 수월하지만, 생체내에서는 여러 인자들이 시토킨의 상대적 생체분포 및 국소편재화에 관여하여, 면역조절능에 영향을 미친다. 이들 인자 중 반감기가 가장 중요하다. 환괴 주사 후에 IL-2의 반감기는 약 10분이다. 이들 약물 생체 반응 특성과 현저하게 대조적으로, IL-12의 순환 반감기는 마우스에서 >3 시간 [Wysocka 등(1995) Eur.J.Immnol. 25:672], 인간에서 5∼10 시간[Lotze 등(1996) Ann NY Acad Sci 795:440-454]인 것으로 보고되고 있다.
이러한 차이는 IL-2와 GM-CSF의 크기가(15∼25 kD 대비 IL-12의 경우 75 kD) 비교적 작아서, IL-2 및 GM-CSF가 신장 여과에 의해 제거되기 때문인 것으로 생각된다. 분자량이 약 50 kD 이하인 단백질은 신장 여과로 제거된다. 거의 대부분의 시토킨은 50 kD 이하이며, 신장 여과에 의해 유사하고 신속한 제거가 진행된다. 이렇게 작고 신속하게 제거되는 2종의 시토킨으로 치료하는 것이 필요한 경우에는, 이들 시토킨을 단순히 동시 투여하는 것으로 충분하다. 그러나, 반감기가 상당히 다른 시토킨의 경우에는 동시 투여가 최선은 아니다.
시토킨은 유해한 부작용으로 인해 전신 투여가 어렵다. 예를 들어, 고용량의 인터페론-알파는 피부, 신경, 면역 및 내분비 독성을 비롯한 상당한 부작용을 초래한다.
시토킨 전신 투여의 부작용을 줄이기 위한 한 방법은, 시토킨을 표적 능력을 갖는 제2의 분자와 융합시키는 것이다. Fc 영역이 또 다른 단백질의 N-말단에 위치하는 융합("면역융합" 또는 "Fc-X" 융합[여기서 X는 인터페론 알파와 같은 리간드임]이라고 부름)은 다수의 독특하고 유리한 생물학적 특성을 보유한다[Lo 등 미국 특허 제5,726,044호 및 제5,541,087호; Lo 등, Protein Engineering 11:495]. 특히, 이러한 융합 단백질은 세포 표면에서 적절한 Fc 수용체와 결합할 수 있다. 그러나, 리간드가 세포 표면에서 그 수용체에 결합하면, Fc 영역의 방향이 변경되고 항체-의존성 세포 매개형 세포독성(ADCC) 및 보체 고정을 매개하는 서열이 폐색되 는 것으로 보인다. 결과적으로, Fc-X 분자의 Fc 영역은 ADCC 또는 보체 고정을 효과적으로 매개하지 않는다. N-말단 시토킨 및 C-말단 Fc 영역의 융합에 기인한 세포독성 효과는 공지되어 있다. 예를 들어, IL-2를 Fc 영역의 N-말단에 융합시키면 IL-2 수용체를 보유하는 세포에 결합하고, 보체를 고정하며, 결과적으로 세포를 용해시킬 수 있는 분자가 형성된다[Landolfi, N.F.(1993) 미국 특허 제5,349,053호]. 대조적으로, Fc-IL-2 융합 단백질은 이러한 특성을 보유하지 않는다. 따라서, Fc-X 융합은, ADCC 및 보체 고정의 유해한 효과 없이 혈청 반감기 및 간에서의 상대적 농도의 증가를 나타낼 것으로 예상된다.
혈청 반감기가 짧은 여러 다른 단백질을 Fc-X 형태로 Fc 영역에 융합시킬 수 있으며, 그 결과 생긴 융합체는 혈청 반감기가 휠씬 길어진다는 것이 입증되었다. 그러나, 2개의 다른 Fc 융합체의 혈청 반감기는 일반적으로 동일하지 않다. 따라서, 2개의 다른 X 부분을 전달하고자 하는 경우, 2개의 상이한 Fc-X 단백질을 동시 투여하는 것은 일반적으로 최선이 아니다.
일부 환경에서, 더 좋은 방법은 항원에 대한 특이성과 친화성을 보유한 항체(또는 이로부터 유도된 단편)에 시토킨을 융합시키거나(Gillies, 미국 특허 제5,650,150호; Gillies 등, Proc.Natl.Acad.Sci. 89:1428), 또는 융합 단백질의 형태로 단백질 항원과 조절 시토킨을 펩티드 연결을 통해 결합시켜(Hazama 등, Vaccine 11:629) 세포 표면 항원으로 시토킨의 효과를 집중시키는 것이다. 항체가 융합된 시토킨의 반감기를 증가시킬 수 있지만, 동일한 항체와 다른 시토킨 융합체 사이에는 표적 부위에서 동시 배치를 어렵게 하는 차이가 여전히 있다[예컨대, Gillies 등, Bioconjugate chem. 4:230-235(1993); Gillies 등, J.Immunol. 160:6195-6203]. 상기 논의한 바와 같이, 이는 시토킨 활성의 불균형을 초래하고, 소정의 상승작용 효과를 감소시킨다. 또한, 2종의 다른 융합 단백질을 사용하려면 각 융합체를 안전성 및 효과 프로필에 대해 별도로 시험하고, 차후에 혼합물로서 추가로 시험해야 한다.
발명의 개요
본 발명은 일반 면역 요법과 표적화된 면역 요법에 유용한 2종 이상의 시토킨 간의 복합체 또는 융합체를 제공한다. 이들 복합체 또는 융합체는 경우에 따라 다른 단백질 부분을 포함한다. 이러한 복합체 또는 융합체의 하나의 특징은 이들이 고정 비율로 성분 시토킨들의 활성을 제공한다는 것이다.
일반적으로, 본 발명은 2종 이상의 상이한 시토킨을 함유하는 단백질 복합체에 관한 것이다. 시토킨은 동일한 폴리펩티드 사슬내에 있거나, 또는 이황화 결합이나 화학적 가교에 의해 형성된 결합과 같은 공유 결합으로 연결되어 있다. 대안적으로, 시토킨들은 안정하고 비공유적인 회합으로 존재할 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 단백질 복합체는 포유류의 일정 위치에 복합체를 표적화하는 항체 또는 항체 단편 등의 표적화 부분을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 IL-12와 같은 2사슬 시토킨의 생활성을 제2의 시토킨의 것과 조합한 단백질 복합체를 제공한다. 시토킨은 서로 공유 결합(예컨대 융합)되어 있을 수 있다. 시토킨은 다른 부분을 통해 회합되어 있을 수 있다. 예를 들어, 제2 시토킨을 함유하는 폴리펩티드 사슬은 IL-12에 대한 항체 또는 IL-12에 대한 수용체와 같이, IL-12와 특이적으로 결합하는 결합부를 포함한다. 또는, 결합부는 IL-12와 회합되어 있는 제2 부분과 상호작용할 수 있다. 예를 들어, IL-12의 서브유닛을 암호화하는 폴리펩티드 사슬이 아비딘을 포함하는 경우, 제2 시토킨을 함유하는 그 폴리펩티드는 표적 부분으로서 비오틴을 포함할 수 있다. 하나의 바람직한 구체예에서, 제2 시토킨은 IL-2이다.
본 발명은 IL-12와 제2 시토킨의 활성을 유지하는 IL-12의 융합 단백질의 제조 방법을 제공하는데, 이 융합 단백질은 제2 시토킨의 활성의 지속성을 증가시키고 동물에게 주사한 후에 2종의 시토킨의 활성 균형을 유지하는 IL-12와 유사한 장기간의 단일 약물 생체 반응 작용을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 융합 단백질은 IL-12의 p35 및 p40 서브유닛이 이황화 결합에 의해 연결되어 있고 IL-12의 p35 또는 p40 서브유닛의 아미노 또는 카르복실 말단에서 제2 시토킨에 공유 결합되어 있는 IL-12의 헤테로이량체 형태를 포함하며, 일반식 IL-12-X 또는 X-IL-12[여기서 X는 제2 시토킨임]로 표시된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 융합 단백질은 가요성 펩티드 링커를 통해 연결된 2개의 폴리펩티드 서브유닛을 포함하는 IL-12의 단일쇄(sc) 형태에 아미노 또는 카르복실 말단에서 공유 결합된 제2의 시토킨을 포함하며, 일반식 scIL-12-X 또는 X-scIL-12로 표시된다.
또 다른 구체예에서, 2종의 시토킨은 상기 단백질의 아미노 또는 카르복실 말단에서 이량체 또는 다량체 구조를 형성할 수 있는 단백질에 추가로 융합된다. 이 구체예의 바람직한 형태에서, IL-12와 제2 시토킨의 융합 단백질 형태 중 하나는 이량체화할 수 있는 면역글로불린(Ig) 사슬의 일부, 예컨대 Fc 영역에 추가로 융합된다. 또 다른 구체예는 Ig 사슬 일부의 말단에서 IL-12의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬과 다른 말단에 융합되는 제2의 시토킨의 융합을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 2종 이상의 시토킨은 특이적 수용체에 결합하여 표적화하는 능력을 보유하는 단백질에 융합된다. 예를 들어, Fc 영역은 간에 풍부한 Fc 수용체에 결합할 수 있다. Fc 영역과 복수의 시토킨의 융합은 이량체화 및 표적화 측면에서 잇점이 있으나, 일부 환경에서는 다량체화 또는 표적화 능력 중 하나의 능력만을 보유한 복수의 시토킨의 융합체를 작제하는 것이 유용하다.
또 다른 구체예에서, 복수의 시토킨을 포함하는 융합 단백질은 아미노 또는 카르복실 말단에서 다양한 표적화 능력을 보유한 종류의 구성원 분자, 예컨대 스캐폴드(scaffold)의 존재 또는 부재하에 항체 또는 펩티드 압타머(aptamer)에 추가로 융합된다(Colas 등 [1998] Proc Natl Acad Sci USA. 95:14272-7). 특정 구체예는 완전한 항체, 단일쇄 항체 또는 단일쇄 Fv 영역과 같이 항원에 결합할 수 있는 항체의 적어도 일부에 복수의 시토킨을 융합시킨 것이다. 추가의 구체예는 항원에 결합할 수 있는 항체 사슬의 적어도 일부의 한 말단에 IL-12의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬과, 다른 말단에 융합된 제2 시토킨의 융합을 포함한다.
상기 설명한 바와 같이, 유전 공학 기법으로 복수의 시토킨 융합 단백질과 복수의 시토킨-항체 융합 단백질을 작제하여 성분 단백질이 아미드 결합 도는 이황 화결합과 같은 공유 결합으로 연결되는 것이 일반적으로 바람직하다. 그러나, 화학적 가교제를 이용하여 그러한 단백질 복합체를 작제하는 것도 유용하다. 이 방법도 단백질 화학 분야에 잘 공지되어 있다. 대안적으로, 안정한 비공유 복합체를 형성하는 파트너 단백질과 상이한 시토킨을 융합시켜 단백질 복합체를 형성하는 것으로 충분한 경우도 있다. 예를 들어, 비공유 헤테로이량체 지지 단백질이 사용된다. 제1 시토킨은 헤테로이량체의 한 서브유닛에 융합되어 있고, 제2 시토킨은 헤테로이량체의 제2 서브유닛에 융합되어 있는데, 이 2종의 융합 단백질을 적절한 조건에서 혼합한다. 예를 들어, 2개의 서브유닛-시토킨 융합 단백질을 암호화하는 핵산이 동일한 세포에서 발현된다. 이러한 방식에서는, 성분 시토킨이 직접 또는 간접적으로 공유 결합되지 않은 복수의 시토킨 단백질 복합체를 작제할 수 있다. 본 발명의 목적상, 이러한 복합체는 동물에게 투여시 충분한 안정성이 유지되고 생물학적 효과를 얻을 수 있어야 한다.
또한, 본 발명은 2종 이상의 시토킨을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 제공하는데, 시토킨 중 하나는 IL-12인 것이 바람직하고 상기 핵산이 암호화하는 융합 단백질은 임의로 다른 단백질 부분을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예는 2종 이상의 시토킨을 이량체화 단백질, 예컨대 항체쇄의 Fc 부분으로 융합시킨 융합체를 암호화하는 핵산을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예는 표적화 능력을 보유한 단백질, 예컨대 항체로의 2종 이상의 시토킨의 융합체를 암호화하는 핵산이다.
또한, 본 발명은 2종 이상의 시토킨의 융합체의 제조 방법과 그러한 융합 단 백질의 발현 방법을 제공한다.
또, 본 발명은 질병 및 기타 의학 증상의 치료 방법을 제공하는데, 여기서 치료는 2종 이상의 단백질의 활성의 유용한 조합을 포함한다. 일 구체예에서, 단백질 중 하나 이상은 혈청 반감기가 짧거나(예컨대, 20분 이하) 또는 중간 정도로 길다(예, 40분 이하). 단백질은 유전 공학 또는 기타 기법으로 융합되어 인간이나 동물에게 투여된다. 이러한 방식에서, 2종의 단백질의 활성은 고정 비율로 존재하고, 2종의 단백질을 상이한 투여량 스케줄로 별도로 투여하지 않아도 된다. 또한, 융합 단백질의 혈청 반감기는 일반적으로 혈청 반감기가 긴 단백질 성분과 더욱 유사하여, 혈청 반감기가 더 짧은 단백질(들)의 유효 반감기를 연장시킨다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 IL-12와 같은 2쇄 시토킨을 제2 시토킨과 병용하여 유용하게 치료할 수 있는 질병(예, 암 또는 감염성 또는 기타 질병)의 면역 요법 치료 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, IL-12는 IL-2 또는 GM-CSF와 융합시켜 동물이나 인간에게 투여한다. 다른 바람직한 구체예에서, GM-CSF를 IL-4에 융합시켜 동물이나 인간에게 투여한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, IL-12를 IL-18에 융합시켜 동물이나 인간에게 투여한다. 이러한 치료를 다른 질병 치료와 병행하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 각종 질병을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있는 다양한 항원에 대한 예방접종 방법을 제공한다.
이들 방법의 다른 구체예에서, 2종의 상이한 시토킨을 이량체 단백질 부분(예, 항체의 Fc 영역)에 융합시켜, 동물이나 인간에게 투여한다. 이들 방법의 바람직한 형태에서, 시토킨 IL-12는 제2 시토킨, 더욱 바람직하게는 IL-2 또는 GM-CSF 와 함께 Fc 영역에 융합시킨다.
이들 방법의 다른 구체에에서, 2종의 상이한 시토킨을 온전한 항체에 융합시켜, 인간이나 동물에게 투여한다. 이들 방법의 바람직한 형태에서, 시토킨 IL-12는 제2 시토킨, 더욱 바람직하게는 IL-2 또는 GM-CSF와 함께 항체 부분에 융합시킨다. 또한, 본 발명은 질병 치료에 유용한 항체-시토킨 융합 단백질의 혼합물을 개시하고 있다. 일 구체예에서, 항체-IL-2 융합 단백질과 항체-IL-12 융합 단백질의 혼합물을 사용하여 질병을 치료한다. 예를 들어, 암, 바이러스 감염 또는 박테리아 감염을 치료한다.
본 발명의 상기 목적 및 기타 목적과 이의 다양한 특징은, 첨부되는 도면과 함께 살펴보면 다음 설명으로부터 더욱 명확하게 이해할 수 있다. 도면에서 동일 번호는 동일 구조를 나타낸다.
도 1A는 가장 단순한 형태의 2종의 시토킨 융합체의 개략도이다. 한 시토킨은 제2 시토킨에, 경우에 따라 링커를 통해 융합되어 있다. 도 1B-1I는 제2 시토킨("cyt"로 표시됨)이 헤테로이량체 시토킨 IL-12에 부착될 수 있는 여러 방법을 도시한다. 구체적으로, 제2 시토킨은 p40의 C-말단(도 1B), p40의 N-말단(도 1C), p35의 C-말단(도 1D) 또는 p35의 N-말단(도 1E)에 융합될 수 있다. 또한, 도 1은 제2 시토킨이 IL-12의 단일쇄 형태에 융합할 수 있는 방법을 도시한다. 구체적으로, 단일쇄 IL-12 분자는 C-말단(도 1F) 또는 N-말단(도 1G)에서 제2 시토킨과 p40에 대한 N-말단의 p35를 보유할 수 있다. 대안적으로, 단일쇄 IL-12 분자는 C- 말단(도 1H) 또는 N-말단(도 1I)에서 제2 시토킨과 함께, p35에 대한 N-말단의 p40을 보유할 수 있다.
도 2A-2C는 도 1에 도시된 복수의 시토킨 융합체(상자형으로 표시)가 힌지(H), CH2 도메인 및 CH3 도메인(타원형으로 표시)으로 나타나는 항체의 Fc 영역에 추가로 융합될 수 있는 방법을 개략적으로 도시한다. 구체적으로, 도 1의 8개의 분자 중 임의의 분자를 Fc 영역의 C-말단(도 2A) 또는 N-말단(도 2B)에 융합시킬 수 있다. 또한, 제1 시토킨과 제2 시토킨(각각 상자형으로 표시)은 서로 직접 결합될 필요는 없지만, Fc 부분을 통해 연결될 수 있다(도 2C).
도 3A 내지 도 3G는 복수의 시토킨 융합 단백질을 IgG와 같은 온전한 면역글로불린에 추가로 융합시킬 수 있는 방법의 부분집합을 개략적으로 도시한다. 중쇄 V 영역은 타원형으로 표시된 VH로 나타내고, 경쇄 V 영역은 타원형으로 표시된 VL로 나타내며, 불변부는 비어 있는 타원형이다. 도 1에 예시된 바와 같이, 복수의 시토킨 융합체를 중쇄의 C-말단(도 3A), 중쇄의 N-말단(도 3B), 경쇄의 N-말단(도 3C) 또는 경쇄의 C-말단(도 3D)에서 교체할 수 있다. 또한, 제1 및 제2 시토킨을 중쇄 및 경쇄의 N-말단 및 C-말단에 따로 결합시킬 수 있는 여러 방법이 있다. 이들 중 3가지 방법이 도 3E 내지 3G에 도시되어 있다.
도 4A 내지 도 4C는 가변 경쇄 및 가변 중쇄가 융합되고 단백질이 단일 폴리펩티드로서 발현되어 차후에 헤테로이량체화되는 '단일쇄' 항체에 제1 및 제2 시토킨이 융합할 수 있는 방법을 개략적으로 도시한다. 구체적으로, 복수의 시토킨 융 합체는 C-말단(도 4A) 또는 N-말단(도 4B)에 위치할 수 있다. 또한, 제1 시토킨 및 제2 시토킨은 직접 결합될 필요는 없지만, 단일쇄 항체 부분을 통해 연결될 수 있다(도 4C).
도 5A-5C는 제1 시토킨 및 제2 시토킨이 중쇄 및 경쇄 유래의 융합된 가변부로 구성된 단일쇄 Fv 영역에 융합될 수 있는 방법을 개략적으로 도시한다. 구체적으로, 제1 시토킨-시토킨 융합은 C-말단(도 5A) 또는 N-말단(도 5B)에 위치할 수 있다. 또한, 제1 시토킨과 제2 시토킨은 직접 결합될 필요는 없지만, 단일쇄 Fv 부분을 통해 연결될 수 있다(도 5C).
도 6A 및 도 6B는 별도의 시토킨 또는 융합 단백질에 반응하는 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 의한 IFN-γ의 유도에 있어 IL-12와 IL-2 간의 상승 작용을 도시한다. 도 6A에서, 세포를 식물성혈구응집소 활성화 전(■) 또는 후(X)에 인간 IL-12로 처리하거나, 또는 식물성혈구응집소 활성화 전(◆) 또는 후(△)에 IL-12-IL-2 융합 단백질로 처리하였다. 도 6B는 세포를 1:1 몰비로 첨가된 IL-12와 IL-2의 혼합물(◆), 인간 Fc-IL-12-IL-2 융합 단백질(■) 및 인간 항체 IL-12-IL-2 융합 단백질(△)로 처리한 실험을 도시한다. X 축은 온전한 단백질 또는 융합 단백질로서의 존재 여부와 관련 없이 IL-12의 농도(pg/㎖)를 나타낸다. y축은 IFN-γ 농도(ng/㎖)를 나타내며, 이는 ELISA로 분석하였다.
도 7은 융합 단백질의 활성을 따로 측정하고 이를 융합되지 않은 IL-12 분자의 것과 비교하는 전형적인 IL-12 생물검정법을 도시한다. 표시된 것은 쥐 IL-12(○), 1:1 몰비로 첨가된 쥐 IL-12와 IL-2의 혼합물(■), 쥐 IL-2(△), 및 항-쥐 IL-12-IL-2 융합 단백질(◆)에 반응하는 인간 PBMC의 H3-티미딘 흡수 자극이다. x 축은 온전한 단백질 또는 융합 단백질로서 존재 여부와 관련 없이 단량체 시토킨(들)의 농도(pM)를 나타내며, y 축은 삼중수소화된 티미딘 혼입의 cpm을 나타낸다.
도 8은 표준 IL-2 생활성 분석을 도시한다. 그래프는 쥐 IL-2(○), 항-쥐IL-12-IL-2 융합 단백질(◇) 및 쥐 IL-12(□)에 반응하는 마우스 CTLL 세포 증식의 자극을 도시한다. x축은 온전한 단백질 또는 융합 단백질로서 존재 여부와 관련 없이 단량체 시토킨(들)의 농도(pM)를 나타낸다. 다양한 양의 시토킨 또는 융합 단백질을 함유하는 배지에서 48시간 동안 세포를 항온배양하고, MTT/MTS 분석을 이용하여 생세포수를 분석하였다. y 축은 광학 밀도(OD) 단위로 490 nm에서의 흡광도를 나타낸다.
도 9는 쥐 IL-12(○), 1:1 몰비로 첨가된 쥐 IL-12와 IL-2의 혼합물(●), 쥐 Fc-단일쇄-IL-12-IL-2 융합 단백질(▲) 및 쥐 IL-2에 융합된 쥐 단일쇄 IL-12(◆)에 반응하는 인간 PMBC에 의한 H3-티미딘 흡수의 자극을 도시한다. x 축은 온전한 단백질 또는 융합 단백질로서 존재 여부와 관련 없이 단량체 시토킨(들)의 농도(pM)를 나타내며, y 축은 삼중수소화된 티미딘 혼입의 cpm을 나타낸다.
도 10은 쥐 IL-12(○), 1:1 몰비로 첨가된 쥐 IL-12와 GM-CSF의 혼합물(●), 쥐 GM-CSF(▲), 및 쥐 Fc-쥐 IL-12-GM-CSF 융합 단백질(X)에 반응하는 인간 PMBC에 의한 H3-티미딘 흡수의 자극을 도시한다. x 축은 온전한 단백질 또는 융합 단백질로서 존재 여부와 관련 없이 단량체 시토킨(들)의 농도(pM)를 나타내며, y 축은 삼중 수소화된 티미딘 혼입의 cpm을 나타낸다.
도 11은 KS-1/4에 대한 항원인 인간 EpCAM을 발현하도록 조작한 CT26 결장암 세포로부터 유도된 피하 종양을 보유하는 Balb/C 마우스의 항체-시토킨-시토킨 융합 단백질 치료 효과를 도시한다. ◆는 대조군으로서 PBS를 0, 1, 2, 3 및 4일에 주사한 마우스의 평균 종양 체적을 나타낸다. ▲은 6 ㎍의 KS-IL-12-IL-2로 처리한 마우스의 평균 종양 체적을 나타낸다. ■는 3.4 ㎍의 KS-IL2 및 5.3 ㎍의 KS-IL12로 처리한 마우스의 평균 종양 체적을 나타낸다. 종양내 주사를 실시하였다. x축은 제1 주사후 경과 일수를 나타내며, y축은 mm3로 표시된 평균 종양 체적을 나타낸다.
도 12는 인간 EpCAM을 발현하도록 조작한 CT26 결장암 세포로부터 유도된 피하 종양을 보유하는 SCID 마우스의 항체-시토킨-시토킨 융합 단백질 치료 효과를 도시한다. ◆는 대조군으로서 PBS를 0, 1, 2, 3 및 4일에 주사한 마우스의 평균 종양 체적을 나타낸다. ▲은 6 ㎍의 KS-IL-12-IL-2로 처리한 마우스의 평균 종양 체적을 나타낸다. ■는 3.4 ㎍의 KS-IL2 및 5.3 ㎍의 KS-IL12로 처리한 마우스의 평균 종양 체적을 나타낸다. 종양내 주사를 실시하였다. x축은 제1 주사후 경과 일수를 나타내며, y축은 mm3로 표시된 평균 종양 체적을 나타낸다.
도 13은 인간 EpCAM을 발현하도록 조작한 루이스 폐암(LLC) 세포의 피하 종양을 보유하는 마우스의 항체-시토킨 및 항체-시토킨-시토킨 융합 단백질 치료 효과를 비교한다. ◆는 대조군으로서 PBS를 0, 1, 2, 3 및 4일에 종양내 주사한 마우스의 평균 종양 체적을 나타낸다. ■는 0, 1, 2, 3 및 4일에 20 ㎍의 KS-IL2를 종 양내 주사한 마우스의 평균 종양 체적을 나타낸다. ▲은 0, 1, 2, 3 및 4일에 20 ㎍의 KS-IL12를 종양내 주사한 마우스의 평균 종양 체적을 나타낸다. X는 0, 1, 2, 3 및 4일에 20 ㎍의 KS-IL-12-IL-2를 종양내 주사한 마우스의 평균 종양 체적을 나타낸다. x축은 1회 주사후 경과 일수를 나타내며, y축은 mm3로 표시된 평균 종양 체적을 나타낸다.
도 14는 인간 EpCAM을 발현하도록 조작한 루이스 폐암 세포로부터 유도된 피하 종양을 보유하는 마우스의 항체-시토킨-시토킨 융합 단백질 치료 효과를 도시한다. ◆는 대조군으로서 PBS를 0, 1, 2, 3 및 4일에 주사한 마우스의 평균 종양 체적을 나타낸다. ▲은 20 ㎍의 KS-IL-12-IL-2로 처리한 마우스의 평균 종양 체적을 나타낸다. ■는 11.5 ㎍의 KS-IL2 및 18 ㎍의 KS-IL12로 처리한 마우스의 평균 종양 체적을 나타낸다. 종양내 주사를 실시하였다. x축은 1회 주사후 경과 일수를 나타내며, y축은 mm3로 표시된 평균 종양 체적을 나타낸다.
도 15는 인간 EpCAM을 발현하거나 또는 발현하지 않는 루이스 폐암 세포 유래의 피하 종양을 보유한 마우스의 항체-시토킨-시토킨 융합 단백질 치료 효과를 도시한다. □는 LLC/KSA 유도 종양을 보유한 마우스의 평균 종양 체적을 나타낸다. ◆는 LLC 유도 종양을 보유한 마우스의 평균 종양 체적을 나타낸다. 마우스는 0, 1, 2, 3 및 4일에 20 ㎍의 KS-IL-12-IL-2로 처리하였다. 종양내 주사를 실시하였다. x축은 1회 주사후 경과 일수를 나타내며, y축은 mm3로 표시된 평균 종양 체적을 나타낸다.
도 16은 루이스 폐암 세포로부터 유도된 피하 종양을 보유한 마우스의 항체-시토킨-시토킨 융합 단백질 치료 효과를 도시한다. 약 106 세포를 0일째에 피하 주사하였다. ◆는 실험된 적이 없는 마우스의 평균 종양 체적을 나타낸다. ■는 인간 EpCAM을 발현하도록 조작된 루이스 폐암 세포 유래의 피하 종양이 이전에 있었고, KS-IL12-IL2로 처리하여 이들 종양을 치유한 마우스의 평균 종양 체적을 나타낸다. x축은 1회 주사후 경과 일수를 나타내며, y축은 mm3로 표시된 평균 종양 체적을 나타낸다.
도 17A 및 17B는 정상 면역계를 갖는 동물에서 종양을 형성하는 세포의 능력에 대한 종양 세포에 의한 단일-시토킨 또는 복수-시토킨 단백질 분비의 효과를 도시한다. 도 17A에서, 4세트의 마우스를 비교한다. 1×106 LLC 종양 세포를 피하 주사한 C57BL/6 마우스(◆); 5 ×106 LLC 종양 세포를 피하 주사한 C57B/6 마우스(◇); scIL-12를 발현하는 1×106 LLC 종양 세포를 피하 주사한 C57BL/6 마우스(▲); 및 scIL-12를 발현하는 5×106 LLC 종양 세포를 피하 주사한 C57BL/6 마우스(△). 도 17B는 1×106 LLC 종양 세포를 피하 주사한 C57BL/6 마우스(◆); 5 ×106 LLC 종양 세포를 피하 주사한 C57B/6 마우스(◇); scIL-12-IL-2를 발현하는 1×106 LLC 종양 세포를 피하 주사한 C57BL/6 마우스(X); 및 scIL-12를 발현하는 5 ×106 LLC 종양 세포를 피하 주사한 C57BL/6 마우스(○)와 비교하였다. x축은 종양 세포의 주사후 경과 일수를 나타낸다. y축은 mm3로 표시된 종양 체적을 나타낸다.
도 18은 면역 결손 동물에서 종양을 형성하는 세포의 능력에 대한 종양 세포에 의한 단일 시토킨 또는 복수 시토킨 단백질 분비의 효과를 도시한다. 이 도면은 1×106 LLC 종양 세포를 피하 주사한 SCID 마우스(◆); scIL-12를 발현하는 1×106 LLC 종양 세포를 피하 주사한 SCID 마우스(▲); 및 scIL-12를 발현하는 1×106 LLC 종양 세포를 피하 주사한 SCID 마우스(○)를 비교한다. x축은 1회 주사후 경과 일수를 나타내며, y축은 mm3로 표시된 종양 체적을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 2이상의 별개 시토킨이 융합 또는 복합체화된 단백질 분자를 제공한다. 단백질 복합체 또는 융합 단백질은 경우에 따라 추가의 단백질 부분, 에컨대 항원 결합 부위를 포함하는 항체 영역 및 항체 Fc 영역과 같이 다량체화 및 표적화할 수 있는 부분을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 복수의 시토킨 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 복수 시토킨 융합 단백질을 암호화하는 핵산의 작제 방법, 복수 시토킨 융합 단백질의 제조 방법, 질병 및 의학 증상 치료에 있어서 복수의 시토킨 융합 단백질의 사용 방법을 제공한다.
본 명세서에서 "시토킨"은 면역계의 세포 활성을 조절하는 분비 단백질 또는 활성 단편이나 이의 돌연변이체를 의미한다. 시토킨의 예로는 인터루킨, 인터페론, 케모킨, 종양 괴사 인자, 면역 세포 전구체용 콜로니 자극 인자 등이 있다.
본 명세서에서 "헤테로이량체 시토킨"은 2개의 별개 단백질 서브유닛으로 구성된 시토킨을 의미한다. 현재, IL-12는 공지된 유일한 자연 발생적 헤테로이량체 시토킨이다. 그러나, 인공 헤테로이량체 시토킨을 작제할 수 있다. 예를 들어, IL-6 및 IL-6R의 가용성 단편을 조합하여 CNTF 및 CNTF-R 알파에서와 같이 헤테로이량체 시토킨을 형성할 수 있다[Trinchieri(1994) Blood 84:4008].
본 명세서에서, "인터루킨-12"(IL-12)는 p35 및 p40 서브유닛, 또는 p35 및 p40의 활성 단일쇄 융합체, 또는 이의 종 변형체, 단편 또는 유도체로 구성된 2개의 서브유닛 시토킨을 의미한다.
본 명세서에서, "인터루킨-2"(IL-2)는 임의의 포유류 IL-2, 예컨대 인간 IL-2, 마우스 IL-2 또는 이의 활성 종 또는 대립유전자 변형체, 단편 또는 유도체를 의미한다.
본 명세서에서, "GM-CSF"는 포유류 과립구/대식세포-콜로니 자극 인자 시토킨 단백질, 예컨대 인간 GM-CSF, 마우스 GM-CSF 또는 이의 활성 종 또는 대립유전자 변형체, 단편 또는 유도체를 의미한다.
본 명세서에서, "면역글로불린 Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄 불변부의 카르복실 말단 부분, 또는 이의 유사체나 일부를 의미한다. 예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역 IgG는 적어도 힌지 영역의 일부, CH2 도메인 및 CH3 도메인를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, Fc 영역은 적어도 힌지 영역의 일부 및 CH3 도메인을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, Fc 영역은 적어도 CH2 도메인을 포함하 고, 더욱 바람직하게는 적어도 힌지 영역의 일부를 포함한다.
본 명세서에서, "펩티드 링커'는 2개의 단백질(예, 단백질 및 Fc 영역)을 함께 커플링시키는데 사용되는 1 이상의 펩티드를 의미한다. 펩티드 링커는 종종 일련의 아미노산(예, 주로 글리신 및/또는 세린)이다. 펩티드 링커는 주로 글리신과 세린 잔기의 혼합형 연속물이며, 약 10∼15 아미노산 길이이다.
본 명세서에서, "다량체"는 공유 또는 비공유 상호작용, 예컨대 이황화결합을 통한 2 이상의 단백질 서브유닛의 안정한 회합을 의미한다.
본 명세서에서, "이량체"는 공유 또는 비공유적 상호작용을 통해 2개의 단백질 서브유닛이 안정하게 회합된 특정 다량체 분자를 의미한다. 안정한 복합체는 해리 속도 또는 분리 속도(off-rate)가 수분 이상이어서, 이 복합체가 생체내에서 사용하는 동안 충분히 장기간 안정하여 표적 조직에 도달하여 생물학적 효과를 발휘할 수 있는 복합체이다. Fc 단편 자체는 힌지 영역의 일부, CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 단편의 이량체를 형성한다. 그러나, 여러 단백질 리간드는 이량체로서 그 수용체에 결합하는 것으로 알려져 있다. 시토킨 X가 자연적으로 이량체화하는 경우, 이량체화 과정은 농도 의존성이기 때문에 Fc-X 분자의 X 부분이 더 광범위하게 이량체화한다. Fc에 의해 연결된 2개의 X 부분이 물리적으로 근접하게 되어 분자내 과정으로 이량체화되어, 평형을 이량체 쪽으로 상당히 이동시켜 수용체에 대한 결합을 증가시킨다.
본 명세서에서, "벡터"는 숙주 세포내로 삽입하고 숙주 세포 게놈으로 재조합하여 그 내부로 통합시키고자 하거나, 또는 에피좀으로서 자율적으로 복제하는 뉴클레오티드 서열 성분을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 바이러스 벡터의 비제한적인 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스 등이 있다.
본 명세서에서, "유전자 발현" 또는 "단백질 발현"은 DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 분리가능한 형태로 단백질 생성물의 생성 또는 단백질 생성물의 분비를 의미한다.
본 명세서에서, "면역시토킨"은 미국 특허 제5,650,150호에 개시된 바와 같이 항체 및 시토킨을 포함하는 융합 단백질이다.
본 명세서에서, "리더 서열"은 일반적으로 N-말단에서 제2 단백질 서열에 결합되고, 세포로부터 분비하고자 하는 제2 단백질 서열을 유도하는 단백질 서열이다. 리더 서열은 제2 단백질 서열로부터 절단 및 제거되어, 성숙 단백질이 된다. 용어 "리더 서열"은 일반적으로 "신호 서열"과 동의어이다.
본 명세서에서, "EpCAM"은 상피 세포 유착 분자이며(Cirulli 등, [1998] 140:1519-1534), "KSA"와 유의어로서, 단일클론 항체 KS-1/4가 결합된 항원을 의미한다. EpCAM은 상피 세포로부터 유도된 암 세포에서 풍부하게 발현되는 세포 표면 단백질이다.
본 명세서에서, "KS-1/4"는 EpCAM에 결합하는 특정 단일클론 항체를 말한다.
본 명세서에서, "KS-IL2", "KS-IL12" 및 "KS-IL12-IL2" (등)는 각각 KS-1/4와 인터루킨-2, KS-1/4와 인터루킨-12, 및 KS-1/4, 인터루킨-12와 인터루킨-2로 구 성된 항체-시토킨 융합 단백질을 의미한다. 유사하게 명칭을 정한 융합 단백질 작제물이 본 명세서에서 사용된다. 여러 위치에서 시토킨을 항체 분자에 융합시킬 수 있기 때문에, "KS-IL12-IL2"와 같은 기술은, 특별한 설명이 없으면, 임의의 가능한 위치에서 융합된 인터루킨-12 및 인터루킨-2와 KS-1/4를 포함하는 단백질 부류를 의미한다.
본 명세서에서, "14.18"은 종양 특이적 항원 GD2에 결합하는 특정 단일클론 항체를 의미한다.
본 발명을 구체화하는 단백질 작제물의 일부 예는 도 1 내지 도 5에 예시되어 있다. 도 2 내지 5에 다이아그램으로 표시된 분자의 일부는 IA-1I로 표시되어 있으며, 이는 도 1A-1I에 제시된 융합 단백질에 관한 것으로서 도 1의 임의의 융합 단백질을 제시한 바와 같이 다른 단백질과 추가로 융합시킬 수 있음을 예시한다. 시토킨은 사각형으로 도시되어 있고, 항체의 불변부는 타원형으로서 도시되어 있으며, 중쇄 가변부 및 경쇄 가변부는 표지된 타원형으로 제시되어 있다.
본 발명은 2개의 다른 시토킨과 경우에 따라 추가의 단백질 부분을 포함하는 단백질 복합체를 개시한다. 호모이량체 시토킨(예, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, IL-5, IL-8 등)은 복수의 서브유닛을 함유하지만, 단일 시토킨이다. 유사하게, IL-12와 같은 헤테로이량체 시토킨은 상이한 서브유닛을 포함하지만, 단일 시토킨이다. 또한, MCP-1/MCP-2 헤테로이량체와 같이 보통 호모이량체 시토킨의 헤테로이량체 형태, 또는 보통 호모이량체 시토킨의 2개의 대립유전자의 헤테로이량체 형태(예, Zhang, J.Biol.Chem. [1994] 269:15918-24)는 단일 시토킨이 다. 본 발명의 복합체는 2개의 상이한 시토킨을 함유하며, 각각(예, IL-2 및 IL-12; IL-4 및 GM-CSF; MCP-1 및 에오탁신 등)은 면역계의 세포 활성을 조절할 수 있다.
도 1A는 본 발명의 바람직한 구체예를 도시한다. 융합 단백질(10)에서, 제1 시토킨(12)의 C-말단을, 경우에 따라 링커 영역(도시되지 않음)을 통해 제2 시토킨(14)의 N-말단에 융합시킨다. 본 발명의 일부 구체에에서, 본 발명의 단백질 복합체는 혈청 반감기가 상당히 다른 2개 이상의 시토킨을 포함한다. 예를 들어, 크고 작은 단백질을 사용하여 더 큰 단백질의 순환 반감기 특성을 갖는 융합 단백질을 산출한다. 따라서, IL-12와 제2 시토킨의 조합 효과를 목적하는 경우, IL-12-X 또는 X-IL-12[X는 제2 시토킨임]의 융합 단백질로서 2개의 시토킨을 발현하는 것이 유리하다. 2가지 특별한 장점이 관찰된다. 첫번째 장점은 제거 속도가 더 빠른 시토킨의 혈청 반감기가 연장된다는 것이다. 두번째는 2개의 시토킨의 혈청 반감기가 서로 매우 유사해진다는 것이다.
IL-12와 같은 2쇄 시토킨을 2쇄 시토킨의 어느 하나의 사슬의 N- 또는 C-말단에서 또 다른 시토킨에 융합시킬 수 있다. 일 구체예에서, 제2 시토킨은 IL-12의 p35 또는 p40 서브유닛의 N-말단 또는 C-말단에 융합시킨다(도 1B-1E). 도 1B의 융합 단백질(16)에서, 제1 시토킨(12)의 N-말단을 IL-12 서브유닛 p40(18)의 C-말단에 융합시킨다. 서브유닛 p40(18)은 공유 결합(22)에 의해 IL-12 서브유닛 p35(20)에 연결시킨다. 도 1C의 융합 단백질(24)에서, p40 서브유닛(18)의 N-말단은 제1 시토킨(12)의 C-말단에 융합시키고, 공유 결합(22)에 의해 p35 서브유닛(20)에 연 결시킨다. 도 1D는 제1 시토킨(12)의 N-말단이 p35 서브유닛(20)의 C-말단에 융합되고, 공유 결합(22)에 의해 p40(18)에 연결된 융합 단백질(26)을 도시한다. 도 1E에서, 융합 단백질(28)은 N-말단에서 제1 시토킨(12)의 C-말단에 융합되고 공유 결합(22)에 의해 p40(18) 서브유닛에 연결된 p35 서브유닛(20)을 포함한다.
제2 구체예에서, IL-12의 서브유닛은 N-말단 위치에서 p35 서브유닛 또는 p40 서브유닛과 융합되어 단일쇄 단백질 scIL-12를 형성할 수 있다; 제2 시토킨은 생성된 scIL-12의 N- 또는 C-말단에 결합시킬 수 있다(도 1F-1I). 따라서, 도 1F에 도시된 바람직한 구체예에서, 융합 단백질(30)은 단일쇄 IL-12를 포함하는데, p40 서브유닛(18)의 N-말단은 경우에 따라 펩티드 링커를 통해 p35 서브유닛(20)의 C-말단에 융합된다. 이 구체예에서, 시토킨(12)의 N-말단은 p40 서브유닛(18)의 C-말단에 융합된다. 도 1G에 도시된 구체예에서, p35 서브유닛(20)의 N-말단은, 경우에 따라 펩티드 링커를 통해 시토킨(12)의 C-말단에 융합된다. 도 1H 및 1I는 p35 서브유닛의 N-말단이 경우에 따라 펩티드 링커를 통해 p40 서브유닛의 C-말단에 융합된 IL-12의 또 다른 단일쇄 형태를 포함하는 융합 단백질(34 및 36)을 도시한다. 도 1H에 도시된 융합 단백질(34)에서, 시토킨(12)의 N-말단은 p35 서브유닛(20)의 C-말단에 융합된다. 도 1I에 도시된 융합 단백질(36)에서, p40 서브유닛(18)의 N-말단은 시토킨(12)의 C-말단에 융합된다. 매우 바람직한 구체예에서, IL-12는 IL-2에 융합된다.
이러한 분자의 생성은 실시예에 추가로 예시되어 있다.
동일하지 않은 서브유닛이 짧은 아미노산 링커에 의해 연결되는 단일쇄 분자 로서 헤테로이량체 분자, 예컨대 IL-12 또는 항체를 발현하는 것이 종종 편리하다[Huston 등(1988) Proc.Nat.Acad.Sci. 85.5879; Lieschke 등(1997) Nat Biotechnol. 15:35; Lieschke G.J. 및 Mulligan, R.C., 미국 특허 제5,891,680호]. 유전자 융합체를 작제한 다음, 단일 재조합 DNA 작제물을 함유하는 세포에서 목적하는 단백질을 발현시킬 수 있다. 그러한 헤테로이량체 시토킨의 단일쇄 형태를 제2 시토킨에 추가로 융합시킬 수 있는데, 이는 목적하는 활성을 보유한 융합 단백질을 단일 재조합 DNA 작제물로부터 발현시킬 수 있다. 이러한 분자의 발현은 실시예에 예시되어 있다.
본 발명은 IL-4 및 GM-CSF를 함유하는 융합 단백질도 개시하고 있다. 이 조합은 수지상 세포에 의한 항원 제시를 기능적으로 자극하는데 특히 유용하다. 또 다른 유용한 융합체는 IL-12 및 IL-18을 포함한다. 이들 시토킨은 Th1 반응을 촉진하지만, 다소 상이한 상보적 활성을 보유한다.
본 발명은 복수개의 별개의 융합된 시토킨이 호모이량체 또는 헤테로이량체와 같은 다량체를 형성할 수 있는 단백질에 추가로 융합된 융합 단백질을 개시한다. 이러한 분자의 잇점은 시토킨 중 하나 이상의 효능이 이량체화에 의해 향상될 수 있다는 것이다. 일부 경우, 이량체화에 의한 효능의 증가는 시토킨이 이량체로서 수용체에 결합하기 때문에 발생할 수 있다. 일 구체예에서, 복수 시토킨을 Fc 영역과 같은 항체 분자의 일부에 융합시킨다(도 2). 또 다른 구체에에서, IL-12 및 제2 시토킨은 호모이량체화 단백질 부분에 융합된다. 바람직한 구체예에서, 제2 시토킨은 IL-2 또는 GM-CSF이다. 융합 단백질은 각종 방법으로 형성할 수 있는데, 이 는 융합 단백질의 N-말단에서 C-말단에 이르는 몇개의 별개 단백질 부분의 모든 정렬을 반영한다. 예를 들어, 인터루킨-12 및 제2 시토킨이 Fc 영역에 융합되는 경우, 2개의 시토킨은 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단에 임의의 순서로 융합될 수 있다. 또는 하나의 시토킨이 N-말단에 융합되고 다른 시토킨이 C-말단에 융합될 수 있다.
이들 변경 중 일부가 도 2에 예시되어 있다. 예를 들어, 도 2A에 제시된 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질(44)은 힌지 영역(38), CH2 영역(40) 및 CH3 영역(42)을 함유하는 Fc 영역의 C-말단에 융합된다. 융합 단백질(44)은, 예를 들어 도 1A-1I에 도시된 융합 단백질의 구조(10, 16, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 또는 36)를 비롯하여 각종 구조를 보유할 수 있다. 융합 단백질(44)이 융합 단백질(16, 24, 26, 28)에서와 같이 하나 이상의 N-말단 및 C-말단을 보유하는 경우, Fc 영역은 융합 단백질(44)의 N-말단에 융합된다. 도 2B에 도시된 바와 같이, 융합 단백질(44)은 Fc 영역의 N-말단에 융합될 수 있다. 도 2C에 도시된 구체예에서, 제1 시토킨(12)은 Fc 영역의 N-말단에 융합되고, 제2 시토킨(14)은 Fc 영역의 C-말단에 융합될 수 있다.
구조적 고려사항
단백질의 한 종류로서 시토킨은 크기와 일반적인 폴딩 특성에 있어 유사하다는 점을 주의하는 것이 중요하다. 따라서, 본 명세서에 개시된 특정 실시예는 시토킨 단백질류에 대한 복수의 시토킨 융합 단백질을 작제하는 방법을 예시한다. 예를 들어, 여러 시토킨은 "4개의 나선형 번들" 이라고 명명되는 단백질 폴딩 종류에 속 한다. 4개의 나선형 번들 단백질로는 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), 인터루킨-6(IL-6), 백혈병 억제 인자(LIF), 성장 호르몬, 모양체 향신경성 인자(CNTF), 렙틴 에리트로포이에틴, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터루킨-5(IL-5), 대식구 콜로니-자극 인자(M-CSF), IL-2, IL-4, 인터루킨-3(IL-3), IL-10, 인터페론 베타, 인터페론 알파 및 밀접하게 관련된 인터페론 타우, 및 인터페론 감마(IFN-γ) 등이 있다.
IL-5 및 IFN-감마를 제외하고, 이들 단백질은 모두 대체로 평행한 4개의 알파 나선과 2개의 교차 연결점을 갖는 단량체로서 폴딩된다. IL-5 및 IFN-γ를 제외한 각 경우에, N-말단 및 C-말단은 단백질의 동일면상에 있다. IL-5 및 IFN-감마를 제외하고 4-나선 번들 단백질은 동일한 폴딩 패턴을 보유하기 때문에, IL-2, IL-4 및 GM-CSF에 대해 본 명세서에 개시된 방법은 다른 4-나선 번들 단백질과 단량체로서 폴딩되는 다른 작은 시토킨 단백질에 적용된다.
케모킨은, 세포외 구배를 형성하고 면역 세포의 특정 부류의 주화성을 매개하는 것으로 생각되는 시토킨의 특정 부류이다. 예를 들어, MCP-1은 단핵구, 대식세포 및 활성화된 T 세포에 대한 화학유인제이며, 에오탁신은 호산구에 대한 화학유인제, 인터루킨-8은 호중구에 대한 화학유인제이다. 화학유인 기능 외에, 다른 시토킨과 같이 케모킨은 특정 표적 세포에서 특정 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 예를 들어, MCP-1은 혈관 평활근 세포에서 조직 인자의 발현을 유도하는 것으로 생각된다(Schecter 등, J Biol Chem. [1997] 272:28568-73).
본 발명은 1종 이상의 시토킨이 케모킨인 시토킨-시토킨 융합체와 항체-시토 킨-시토킨 융합체를 개시하고 있다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 시토킨이 케모킨인 3 이상의 시토킨을 보유한 단백질 작제물을 개시하고 있다. 예를 들어, 케모킨 IP-19, RANTES, MIP-1 알파, MIP-1 베타, 대식 세포 화학유인성 단백질, 에오탁신, 림포탁틴, BLC는 항체 부분과 같은 기타의 부분의 존재 또는 부재하에 제2 시토킨에 융합시킬 수 있다.
인간 게놈은, 예를 들어 50 이상의 케모킨을 암호화한다. 공지된 케모킨은 일반적으로 유사한 3차원 단량체 구조와 단백질 폴딩 패턴을 공유한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 일반적인 유형의 단백질 작제물 및 작제 방법은 기존의 또는 아직 발견되지 않은 각종 케모킨에 적용할 수 있다.
케모킨은 3개의 베타 가닥과 하나의 알파 나선을 보유한 특징적인 폴딩 패턴을 갖는다. 캐모킨은 단량체로서 폴딩되고, 모든 경우에서는 아니지만 일부 경우 폴딩 후에 이량체화된다. 모든 케모틴의 경우, 단량체 서브유닛의 폴딩 패턴은 동일하며, 전체 구조는 상당히 유사하다. 예를 들어, 인터루킨-8, 혈소판 인자 4, 흑색종 성장 자극 활성(MGSA), 대식세포 염증성 단백질, MIP, RANTES(활성화시 조절되고, 정상 T 세포를 발현하고, 분비함), 단핵구 화학유인성 단백질-1(MCP-1, MCAF), 에오탁신, 단핵구 화학유인성 단백질-3(MCP-3), 프락트알킨의 케모킨 도메인, 호중구 활성화 펩티드-2(NAP-2), 스트로마 세포 유래의 인자-1(SDF-1), 대식세포 염증성 단백질-2, 케모킨 hcc-2(대식세포 염증성 단백질-5), Gro 베타, 시토킨 유도된 호중구 화학유인제 및 CINC/Gro의 입체 구조는 X-선 결정학 및/또는 NMR 방법으로 결정하였다. 이들 구조는 모두 동일한 폴딩을 나타내며 일반적으로 유사하 다. 케모킨은 폴딩 패턴이 동일하기 때문에, 림포탁신에 대해 본 명세서에 개시된 방법이 기타 케모킨에 적용된다.
케모킨의 유리 N-말단은 그 기능에 중요할 때가 흔히 있다. 따라서, 일부 구체예에서 제2 시토킨, 항체 부분 또는 기타 단백질 부분이 케모킨의 C 말단 부분에 융합될 수 있는 융합체를 작제하는 것이 유리하다. 2개의 활성 케모킨을 함유하는 단백질 복합체를 작제하기 위해서, 예를 들어 항체의 중쇄 및 경쇄의 N-말단에 2개의 다른 케모킨을 융합시키는 것이 유용하다. IL-8과 같은 일부 케모킨은 생리학적 조건 하에서 이량체이다. 일부 용도에서, 융합되지 않은 IL-8 부분 또는 항체 부분과 상호작용하지 않는 상이한 융합 파트너를 보유한 IL-8 부분과 함께 IL-8-항체-시토킨 융합체와 같은 복수의 시토킨 항체 융합체를 동시 발현시키는 것이 유용하다. 이러한 방식에서, 다른 IL-8 부분은 모든 IL-8 부분이 항체 사슬에 융합되는 경우 초래될 수 있는 공간적 제약 또는 중합화 없이 헤테로이량체화될 수 있다. 소정의 복수의 시토킨 융합 단백질은 크기를 기준으로 또는 스타필로코커스 A 단백질과 같은 항체 결합 단백질에 대한 결합을 기준으로 분리할 수 있다.
케모킨을 포함하는 복수의 시토킨 융합 단백질의 경우, 바람직한 구체예에서는 융합 단백질이 항원에 결합하는 항체 부분과 같이 정위 기능을 포함한다. 이론에 구애받고자 하는 것은 아니자만, 일반적으로 케모킨의 체내 광범위한 분포는 영향을 주지 않거나 또는 케모킨에 대한 세포의 일반적 탈 감작을 초래하는 것으로 생각된다. 또한, 케모킨의 화학유인성 기능은 케모킨의 농도차가 있는 경우 명백해지는 것으로 생각된다.
바람직한 구체예는 림포킨-항체-인터루킨-2 융합 단백질이다. 또 다른 바람직한 구체예는 케모킨과 제2 시토킨이 Th1 반응을 촉진하는 것이다. 예를 들어, IP-10 및 IL-12를 포함하는 융합 단백질은 매우 바람직한 일구체예이다.
혈청 반감기가 짧은 복수의 시토킨의 반감기 연장
본 발명은 혈청 반감기가 긴 제3 부분에 융합된 혈청 반감기가 짧은 2개의 시토킨을 포함하는 융합 단백질을 개시하고 있다. 예를 들어, 수지상 세포의 자극이 필요한 경우, IL-4 및 GM-CSF의 활성을 조합하는 것이 유용하다(Thurner, J.Immunol.Methods[1999] 223:1-15; Palucka 등 [1998] J.Immunol. 160:4587-4595). IL-4 및 GM-CSF는 혈청 반감기가 짧은 작은 분자이기 때문에, Fc 영역, IL-4 및 GM-CSF를 포함하는 융합 단백질을 작제하는 것이 유용하다. 생성된 분자는 수지상 세포 증식 및 활성의 강력한 자극제이다. 유사하게, IL-4 및 GM-CSF는 조합된 시토킨 활성을 소정의 항원을 발현하는 세포 부위로 전달할 목적으로 항체 같은 표적 성분에 융합시킬 수 있다.
온전한 항체로서 또는 그 일부로서 Fc 영역은, 특정 용도에 따라서 유리하거나 불리할 수 있는 일부 특성을 복수의 시토킨 융합체에 부여할 수 있다. 이들 특성으로는 이량체화, 혈청 반감기 연장, 보체 고정 능력, 항체-의존성 세포 매개형 세포독성(ADCC)의 매개 능력 및 Fc 수용체에 대한 결합 등이 있다. 목적하는 제1 특징이 혈청 반감기의 연장이고 Fc 영역의 면역학적 특성이 중요하지 않거나 바람직하지 않은 경우, 하나 이상의 면역학적 특성이 결여된 천연 변종 또는 돌연변이인 Fc 영역을 이용하는 것이 좋다. 예를 들어, 혈청 반감기가 짧은 2종 이상의 시 토킨의 혈청 반감기를 동일하게 연장하는 것이 바람직한 경우, Fc 수용체에 대한 친화도가 각각 감소되거나 없는 인간 IgG2 또는 IgG4로부터의 Fc 영역을 포함하는 복수의 시토킨 융합 단백질을 작제하거나, 또는 Fc 수용체 결합 부위 내에 돌연변이를 보유하는 Fc 영역을 이용하는 것이 좋다. 실제로, 항체에 일부 시토킨을 융합시키면 Fc 수용체에 대한 융합 단백질의 친화도가 증가되고, 그 결과 동물에서 더 빠른 속도로 제거된다는 것이 이미 밝혀졌다. Fc 수용체에 대한 친화도가 감소된 Fc 영역을 사용하는 것은 이들 분자의 혈청 반감기를 상당히 향상시키는 것으로 확인되었다(Gillies 등 [1999] Cancer Res. 59:2159-2166). 일부 상황하에서 사용된 시토킨에 따라, Fc 수용체에 결합하는 Fc 영역은 복수의 시토킨 융합 단백질의 내재화와 1 이상의 시토킨 부분의 분해를 초래한다.
표적화
본 발명은 시토킨을 특정 표적 분자, 세포 또는 체내 위치에 배치할 수 있는 단백질에 2종 이상의 시토킨이 결합된 융합 단백질을 개시하고 있다. 정위 능력을 갖는 바람직한 분자는 항체 또는 항체의 항원 결합 가변부를 포함하는 부분이다. 그러나, 다른 정위 분자 또는 이의 도메인, 예컨대 특정 리간드나 수용체, 자연 발생적 결합 단백질, 특정 기질에 결합하는 효소, 특정 결합 또는 정위 능력으로 선별된 인공적으로 형성된 펩티드, 표적 능력을 산출하는 특유의 물리-화학적 특성을 갖는 펩티드, 표적화된 또 다른 분자에 결합하여 표적화 능력을 보유하는 단백질, 또는 다른 종류의 단백질을 사용할 수 있다. 2개의 시토킨이 표적 분자에 융합된 경우, 바람직한 제1 시토킨은 IL-12이다. IL-12가 사용되면, 바람직한 제2 시토킨 은 IL-2 또는 GM-CSF이다.
항체의 경우, 몇몇 가능한 결합 부위가 있기 때문에 2종 이상의 시토킨이 융합되는 다수의 방법이 있다. 예를 들어, IgG 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된다. 2종의 시토킨이 서로 융합된 후 중쇄 또는 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 대안적으로, 각 시토킨은 항체 분자 상에 N-말단 또는 C-말단 중 하나에 따로 융합될 수 있다.
도 3은 2개의 시토킨이 항체 분자에 융합될 수 있는 방법의 부분집합을 예시한다. 예를 들어, 도 3A에서 본 발명의 융합 단백질(44)은 면역글로불린 경쇄(48)와 회합되어 있는 면역글로불린 중쇄(46)의 C-말단에 융합될 수 있다. 도 2에서와 같이, 융합 단백질(44)은 각종 구조, 예컨대 도 1A-1I에 도시된 융합 단백질(10, 16, 24, 26, 28, 30, 32, 34 또는 36)의 구조를 보유할 수 있다. 도 3B에 도시된 바와 같이, 융합 단백질(44)은 면역글로불린 경쇄(48)와 회합된 면역글로불린 중쇄(46)의 N-말단에 융합될 수 있다. 도 3C 및 도 3D에 도시된 구체예에서, 융합 단백질(44)은 면역글로불린 중쇄(46)와 회합된 면역글로불린 경쇄(48)의 N-말단(도 3C) 또는 C-말단(도 3D)에 융합되어 있다. 도 3E 및 3F에 도시된 바와 같이, 제1 시토킨(12)은 제2 시토킨(14)에 융합된 면역글로불린 중쇄(46)와 회합된 면역글로불린 경쇄(48)에 융합될 수 있다. 시토킨(12 및 14)은 면역글로불린쇄의 N-말단(도 3E) 또는 C-말단(도 3F)에 융합될 수 있다. 대안적으로, 도 3G에서와 같이 제1 시토킨(12)은 면역글로불린 경쇄(48)의 N-말단에 융합될 수 있고, 제2 시토킨(14)은 면역글로불린 중쇄(46)의 C-말단에 융합된다.
단일쇄 항체에 대한 융합
단일쇄 분자로서 항체를 발현하는 것이 편리할 때가 종종 있다. 본 발명은 2 이상의 시토킨이 단일쇄 항체에 융합된 융합 단백질을 제공한다. 이는 소정의 융합 단백질을 발현하는 경우, 사용된 DNA 작제물의 수를 줄일 수 있는 잇점이 있는데, 이는 유전자 치료에서 특히 유용할 수 있다. 특히, 시토킨이 단일쇄 분자인 경우, 시토킨이 단일쇄 항체에 융합하면 단일 단백질 사슬로서 융합 단백질을 발현하게 된다.
도 4A-4C에 도시된 바와 같이, 일부 구체예에서 시토킨은 N-말단, C-말단 또는 양 말단에서 단일쇄 항체에 융합될 수 있다. 예를 들어, 도 4A에 도시된 바와 같이, 융합 단백질(44)은 경쇄 가변부(52)와 중쇄 가변부(54)를 보유하는 단일쇄 항체(50)의 C-말단에 융합될 수 있다. 도 4B에 도시된 바와 같이, 융합 단백질(44)은 단일쇄 항체(50)의 N-말단에 융합될 수 있다. 도 4C에 도시된 구체예에서, 제1 시토킨(12)은 항체(50)의 N-말단에 융합되고, 제2 시토킨(14)은 단일쇄 항체(50)의 C-말단에 융합된다.
바람직한 구체예는 단일쇄 항체에 대한 IL-12와 제2 시토킨의 융합을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서는 IL-2 또는 GM-CSF을 제2 시토킨으로서 포함한다.
항체의 불변부는 각종 효과기 기능을 매개할 가능성이 있다. 예를 들어, IgG1은 보체 고정, ADCC 및 Fc 수용체에 대한 결합을 매개한다. 시토킨이 융합되는 위치는 항체의 불변부의 효과기 기능을 변경시킬 수 있으며, 이는 이들 효과기 기능의 조절이 필요한 경우 유용하다.
일부 경우, 불변부 없이 항체의 표적화 영역을 보유하는 부분에 2종 이상의 시토킨을 융합시킨 융합체를 작제하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 2 이상의 시토킨에 대한 완전한 항체의 융합체보다 작은데, 이것이 일부 용도에서는 유리한 특성이 될 수 있다. 또한, 이러한 융합 단백질에는 온전한 항체의 효과기 기능 중 하나 이상의 기능이 결여되어 있지만, 항체의 표적화 능력은 보유한다.
따라서, 본 발명은 2 이상의 시토킨이 단일쇄 Fv 영역에 융합된 융합 단백질을 특징으로 한다. 도 5A-5C에 묘사된 구체예에 도시된 바와 같이, 2종의 시토킨이 Fv 영역의 N-말단 또는 C-말단에 융합되거나, 또는 하나의 시토킨이 각 말단에 융합될 수 있다. 예를 들어, 도 5A에 도시된 바와 같이, 본 발명의 융합 단백질(44)은 면역글로불린 경쇄 가변부(52) 및 면역글로불린 중쇄 가변부(54)를 포함하는 단일쇄 Fv 영역의 C-말단에 융합될 수 있다. 융합 단백질(44)은 도 5B에 도시된 Fv 영역의 N-말단에 융합될 수 있다. 도 5C에 도시된 바와 같이, 제1 시토킨(12)은 Fv 영역의 N-말단에 융합될 수 있고, 제2 시토킨(14)은 Fv 영역의 C-말단에 융합될 수 있다.
복수의 시토킨에 대한 헤테로이량체 비히클로서의 항체
일부 환경에서, 시토킨 중 2종이 활성을 위해 단백질의 동일한 말단을 필요로 하는 2종 이상의 시토킨의 융합체를 작제하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 2종의 상이한 시토킨의 자연 발생적 N-말단이 각 시토킨의 활성에 필요할 수 있다. 2종의 시토킨 부분이 활성일 수 있는 단일 폴리펩티드 사슬 융합 단백질을 작제하는 것은 불가능하다.
항체는 이황화 결합으로 공유 결합된 중쇄 및 경쇄로 구성된 헤테로이량체 단백질이다. 온전하고 융합되지 않은 N-말단을 필요로하는 2종의 시토킨 부분을 보유한 복수의 시토킨 융합 단백질을 작제하기를 목적하는 경우, 항체의 중쇄 및 경쇄의 N-말단에 2개의 시토킨을 별도로 융합시키는 것이 바람직하다(도 3E). 유사하게, 온전하고 융합되지 않은 C-말단을 필요로하는 2종의 시토킨 부분을 보유한 복수의 시토킨 융합 단백질을 작제하기를 목적하는 경우, 항체의 중쇄 및 경쇄의 C-말단에 2개의 시토킨을 별도로 융합시키는 것이 바람직하다(도 3F). 이러한 방식으로 항체를 2개의 시토킨 연결용 비히클로서만 사용한 경우, 면역 기능과 관련된 추가의 특성을 부여하는 항체의 일부를 돌연변이시키거나 결실시키는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, Fab 영역은 항체의 헤테로이량체 특징은 보유하지만 Fc 영역의 특징적인 기능은 결여되어 있기 때문에, Fab 영역을 비히클로서 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 항원 조합 부위가 비작용성인 항체 또는 항체 단편을 사용하는 것도 유용할 수 있다.
항체에 대한 복수의 시토킨 융합체는 본 발명의 신규 특징 중 여러 특징을 조합시킨다. 항체-복수의 시토킨 융합체에서, 시토킨의 혈청 반감기는 동일하게 연장된다. 양 시토킨의 활성은 표적에 집중되므로, 복수의 상승작용하는 시토킨의 전신 투여에 의한 특정 독성 효과는 피할 수 있다. 각 시토킨은 효과적으로 이량체화 또는 다량체화된다. 시토킨은 직접 융합될 필요는 없으나, 항체 분자의 중쇄 및 경쇄 상의 다른 부위에 융합될 수 있다.
복수의 시토킨 및 항체를 포함하는 융합 단백질을 고안하는데 있어서, 일반적인 실험으로 구별할 수 있는 다수의 선택사항과 구성이 있다. 구조적 생물학 고려 사항이 유용하다. 예를 들어, 여러 시토킨은 4-나선 번들이라 불리우는 종류에 속한다. 이들 구조는 4개의 알파 나선으로 구성되고, 동일 부근에 N-말단 및 C-말단을 보유한다. 일반적으로, N-말단 및 C-말단 주변의 시토킨의 면은 시토킨 수용체에 결합하는데 사용되지 않으므로, 항체 또는 제2 시토킨에 대한 융합을 위해 한 말단을 사용할 수 있다. 그러나, 입체적 이유로 인하여 4-나선 번들 시토킨의 N-말단 및 C-말단을 상이한 부분에 직접 융합시키는 것이 어려울 때가 흔히 있다. 2개의 다른 4-나선 번들 시토킨을 항체에 융합시키는 것이 바람직한 경우, 각 시토킨을 항체 상의 다른 부위에 융합시키는 것이 유용하다. 대안적으로, Ig쇄-시토킨-시토킨 형태의 폴리펩티드 사슬을 작제할 필요가 있는 경우, 하나 이상의 가요성 링커를 사용하여 입체 문제를 해결할 수 있다.
항체 대신에 다른 분비된 헤테로이량체 분자를 사용하여 복수의 시토킨을 보유할 수 있다. 예를 들어, 전립선 특이적 항원과 이것이 함께 복합체를 형성하는 프로테아제 억제제를 포함하는 복합체, IgA 중쇄 및 J쇄, TGF 베타 계열의 구성원과 이의 아스타신 유사 결합 파트너, 또는 IL-12를 사용할 수 있다.
핵산
본 발명은 상기 종류의 단백질 각각을 발현할 수 있는 핵산을 특징으로 한다. 이들은 2종 이상의 시토킨을 포함하는 융합 단백질, 2종 이상의 시토킨과 Fc 영역과 같은 이량체화 도메인을 포함하는 융합체, 항체에 융합된 2종 이상의 시토 킨을 포함하는 융합체, 및 Fv 영역에 융합된 2종 이상의 시토킨을 포함하는 융합체를 암호화하는 핵산을 포함한다. 핵산의 바람직한 형태는 융합 단백질이 박테리아 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있는 DNA 벡터이다. 복수의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 융합 단백질의 경우, 하나 이상의 암호화 핵산을 사용할 수 있다. 대안적으로, 2 이상의 융합 단백질 암호화 서열을 단일 핵산 분자에 배치하는 것이 유용할 수 있다. 실시예에서는 복수의 시토킨을 암호화하는 특징적인 핵산의 특정 형태를 예시한다.
본 발명의 핵산은, 단백질의 생산이나 유전자 치료 용도로 복수의 시토킨 융합 단백질 발현에 특히 유용하다.
본 발명의 유용한 구체예를 합성하는 방법과 약리학적 활성을 시험하는데 유용한 분석법이 실시예에 개시되어 있다.
본 발명은 각종 질병의 치료 및 예방, 비제한적인 예로서 각종 감염 및 암의 치료, 여러 질병에 대한 예방 접종을 위한 약학 조성물 및 이의 사용 방법을 제공한다.
복수의 시토킨 융합 단백질을 사용하여 박테리아, 기생체, 진균류 또는 바이러스 감염이나, 또는 암을 치료할 수 있다. 예를 들어, IL-12는 여러 종류의 감염, 비제한적인 예로서 박테리아인 리스테리아 모노시토겐스(Listeria monocytogenes), 기생체인 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii), 레이쉬마니아 메이저(Leishmania major) 및 쉬스토소마 만소니(Schistosoma mansoni), 진균류인 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 바이러스인 코리오메닌기티스(chroiomeningitis) 바 이러스 및 시토메갈로바이러스에 의한 감염에 예방 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 시토킨들은 일반적으로 함께 작용하기 때문에 상승작용이 있는 것으로 알려진 2종 이상의 시토킨을 포함하는 융합 단백질을 사용하는 것이 유용할 때가 종종 있다. 예를 들어, IL-2는 IL-12의 효과를 강화시키기 때문에, 박테리아, 기생체, 진균류 및 바이러스 질병의 치료에 있어 이들 시토킨을 병용하는 것이 유용하다.
감염성 질병 치료의 바람직한 방법은 감염 부위에 복수의 시토킨을 배치하는 표적화제에 추가로 융합된 복수의 시토킨 융합 단백질을 사용하는 것이다. 각종 표적화 방법은 후술되어 있다.
본 발명의 약학 조성물은 고체, 반고체 또는 액체 용량 형태, 예컨대 환제, 캡슐, 분말제, 액체, 현탁제 등의 형태로, 바람직하게는 정확한 용량을 투여하기에 적절한 단위 용량 형태로 사용할 수 있다. 조성물은 통상의 약학적 담체 또는 부형제를 포함하고, 또한 기타 의학제, 약학제, 담체, 보조제 등을 포함할 수 있다. 그러한 부형제는, 예를 들어 인간 혈청 알부민 또는 혈장 단백질과 같은 기타 단백질을 포함할 수 있다. 그러한 용량 형태를 제조하는 실제 방법은 공지되어 있거나, 또는 당업자에게는 자명할 것이다. 투여하고자 하는 조성물 또는 제제는, 여하튼 치료하고자 하는 피험체에서 소정의 효과를 달성하기에 충분한 양으로 활성 성분(들)을 포함할 것이다.
조성물의 투여는 이러한 활성을 나타내는 제제에 대해 허용되는 임의의 투여 방식을 통해 실시할 수 있다. 이들 방법은 경구, 비경구 또는 국소 투여를 포함하며, 그 외에 전신 투여 형태를 포함한다. 주사는 바람직한 투여 방법이다.
투여되는 활성 화합물의 양은 물론 치료되는 피험체, 고통의 경중, 투여 방식 및 처방 의사의 판단에 따라 달라진다.
전술한 바와 같이, IL-2, IL-12, GM-CSF, IL-4 등의 시토킨을 암 치료를 위해 조사하였다. 일부 환경하에서, 투여가 더 간단하고, 성분 시토킨 중 하나의 혈청 반감기가 증가되며, 및/또는 2종 시토킨의 상대적 활성의 조절이 양호하다는 이유에서, 암 치료에 복수의 시토킨 융합 단백질을 사용하는 것이 유리하다.
암의 바람직한 치료 방법은 특정 기관이나 조직에 시토킨을 표적화시켜, 시토킨의 효과를 집중시키고 전신 분포의 부작용을 피할 수 있다. 예를 들어, 복수의 시토킨을 Fc 영역에 융합시킨 융합체는 간에 집중될 것으로 예상되며, 이는 간에 한정된 암 치료에 유용할 것이다. 더욱 바람직한 방법은 항체로서 표적화제에 추가로 융합된 복수의 시토킨 융합 단백질을 이용하는 것이다. 특히, 항체 KS-1/4 및 14.18은 종양 특이적 항원에 대해 유도된다(Varki NM 등, Cancer Res [1984] 44:681-7; Gillies 등, Journal of Immunological Methods 125:191[1989]; 미국 특허 제4,975,369호 및 제5,650,150호). 항체-복수의 시토킨 융합체를 사용한 경우, 종양의 종류를 조사하고 그 종양 종류에 존재할 것 같은 항원에 대해 유도된 항체를 선별하는 것이 흔히 유용하다. 예를 들어, FACS 분석, 웨스턴 블롯, 종양 DNA 검사 또는 단순이 종양 세포의 종류 확인으로 종양의 특성을 규명하는 것이 유용할 수 있다. 이러한 종양 특성 규명 방법은 종양 특성규명 분야의 업자들, 예컨대 종양학자 및 종양 생물학자에게는 공지되어 있다. 특정 리간드 또는 수용체 부분에 대한 융합, 미리 선별된 결합 활성을 갖는 펩티드 앱타머에 대한 융합, 정위 특성 을 보유한 소분자에 대한 화학적 접합 등의 각종 수단으로 복수의 시토킨 융합 단백질을 표적화할 수 있다. 이들 표적화 방법은 감염 등의 기타 질병 치료에 사용할 수 있다.
암 및 기타 세포성 질병의 유전자 요법에 의한 치료
본 발명의 핵산은 특정 세포 종류에 면역계를 표적화시키는 것이 바람직한 암 및 기타 질병 치료용 유전자 요법제로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 암 세포를 인간 또는 동물로부터 취하여, 복수의 시토킨 융합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산으로 암세포를 형질감염시킨 다음, 암세포를 인간 또는 동물에게 재도입한다. 대안적으로, DNA를 암 세포에 동일계로 도입할 수 있다. 인간 또는 동물은 암 세포에 대한 면역 반응을 나타내는데, 이는 심한 암을 치료하거나 또는 경감시킬 수 있다. 포유류 세포에서의 발현을 촉진하기 위해서 적절한 조절 성분에 커플링된 복수의 시토킨 유전자 융합체를 임의의 각종 기법으로 암세포로 형질감염시킬 수 있다. 이러한 기법의 예로는 인산칼슘법, "유전자 총", 아데노바이러스 벡터, 양이온 리포좀, 레트로바이러스 벡터 또는 임의의 다른 효과적인 형질감염법 등이 있다. 핵산은 다른 부분에 추가로 융합된 복수의 시토킨 융합 단백질을 암호화할 수 있다.
하나 이상의 융합된 시토킨의 융합체를 발현하는 핵산을 이용한 항암 유전자 요법을, 다른 암 치료, 예컨대 융합된 시토킨 단백질의 면역 자극 특성을 증대시킬 수 있는 치료와 병행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산은 암 세포가 발현하는 항원에 대한 면역 반응의 형성을 보조할 수 있는 기타 단백질 부분을 발현할 수 있 다. 또는, 그러한 단백질 부분을 발현하는 다른 핵산으로 동시 형질감염시킬 수 있다. 특히, B7 동시조절 표면 단백질을 발현하는 핵산을 암 세포 내로 동시 형질감염시킬 수 있다[Robison 등, 미국 특허 제5,738,852호]. 복수의 시토킨 융합체를 발현하는 핵산을 이용하여 암 세포를 형질감염시킨 후 암 세포를 표적화하는 항체 또는 면역시토킨으로 처리할 수 있다[Lode 등(1998) Proc.Nat.Acad.Sci. 95:2475]. 복수의 시토킨 융합체를 발현하는 핵산을 이용한 암 세포의 형질감염 후 혈관생성 차단제로 처리할 수 있다[Lode 등(1999) Proc.Nat.Acad.Sci. 9:1591].
추가의 면역 자극제 및/또는 혈관형성 차단제를 사용한 요법을 복수의 시토킨 융합 단백질을 이용한 전신 치료와 병행할 수 있다. 추가의 면역 자극제 또는 혈관형성 차단제를 이용한 동시 치료의 장점은, DNA 손상제 및 세포 주기 차단제와 달리 이들 치료가 복수의 시토킨 융합 단백질에 의한 자극으로 인해 분열될 수 있는 면역 세포를 죽이지 않는다는 것이다.
이 요전자 요법의 바람직한 구체예는 IL-12 및 제2 시토킨을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 암 세포내로 도입한 다음, 암 세포를 인간이나 동물 내로 재도입하는 것이다. 제2 시토킨은 IL-2 또는 GM-CSF인 것이 바람직하다.
본 발명은 신규 백신 조성물과 융합된 2종 이상의 시토킨을 보조제로서 사용하여 일부 병원체에 대해 예방 접종된 숙주 포유류의 보호성 세포 매개형 면역 반응을 제공하고자 하는 백신을 보조하는 방법을 제공한다. 예를 들어, Th1 면역 반응이 바람직한 경우, 복수의 Th1 촉진 시토킨을 융합시키고, 그 결과 생성된 융합 단백질을 항원과 함께 동물에게 투여할 수 있다.
특히, IL-12 및 IL-2를 융합시켜 항원과 함께 투여할 수 있다. 대안적으로, IL-12 및 IL-2를 항원성 단백질 자체에 추가로 융합시켜 면역 반응을 자극하는데 사용할 수 있다. 이 경우, 본 발명은 숙주의 세포 매개형 면역, 즉 특정 병원체에 의한 감염을 예방하기 위한 세포독성 T 림프구 및 활성화된 식세포의 유도에 좌우되는 백신에 관한 것이다. IL-12, IL-2 및 항원을 포함하는 융합 단백질은, 이러한 조합이 항원에 대한 Th1 반응을 유도하기 때문에 예방접종을 실시하는데 특히 유용하다. 인간에게 사용되는 통상적인 보조제, 예컨대 명반은 Th2 반응을 유도하는 경향이 있다.
Th2 면역 반응을 원하는 경우, Th2 촉진 시토킨의 융합된 조합체를 사용할 수 있다. 예를 들어, IL-4 및 IL-10을 융합시켜 단일 분자를 형성하고, 생성된 융합 단백질을 보조제로서 사용하는 것이 유용할 수 있다. 특히, 동물에서 수지상 세포를 강화시키기를 원하는 경우, IL-4 및 GM-CSF의 융합된 조합체를 Fc 영역과 추가로 융합시켜 항원 제시 세포로의 결합을 촉진하거나, 또는 융합된 시토킨을 종양과 같은 표적 조직으로 유도할 수 있는 항체에 추가로 융합시킬 수 있다.
본 발명은 신규 치료 조성물과 소위 "암 백신"으로 불리우는 것을 비롯하여 일부 치료 조성물과 함께 상승 작용을 제공하는 보조 방법을 제공한다. 상기 치료 조성물은 암 세포 상에서 발생하는 선별된 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2종 이상의 융합된 시토킨을 포함하는 단백질은, 적절하게 처리된 암 세포와 함께 적절한 경로로 직접 투여될 수 있다.
실시예 1
시토킨-시토킨 융합 단백질을 발현할 수 있는 유전자 융합체의 작제
다수의 시토킨을 보유한 다작용성 단백질을 형성하기 위해서, IL-12의 p40과 IL-2 간의 유전자 융합체와, IL-12의 p40과 GM-CSF 간의 유전자 융합체를 합성하였다. 또한, 성숙 쥐 p35에 대한 암호화 서열(서열 번호 1)을 고 수준의 발현 및 효율적인 분비를 가능하게 하는 프로모터 및 리더 서열에 융합시켰다. 쥐 p40-IL-2 및 p40-GM-CSF의 암호화 서열은 서열 번호 2 및 서열 번호 3에 각각 도시되어 있다. 인간 p40-IL-2 융합체도 작제하였다(서열 번호 4). 마우스 p35에 대한 IgG2a의 마우스 Fc 영역의 융합체(서열 번호 5)와 IgG1의 인간 Fc 영역에 대한 인간 p35의 융합체(서열 번호 6)를, 이미 개시되어 있는 발현 플라스미드를 사용하여 작제하였다(Lo 등, Protein Engineering 11:495-500 [1998]; Lo 등, 미국 특허 제5,726,087호).
KS-1/4 항체 중쇄의 C-말단으로의 성숙 마우스 및 인간 p35의 융합은 Gillies 등의 문헌(J.Immunology [1998] 160:6195-6203)에 개시되어 있다. 14.18 항체 중쇄의 C-말단에 성숙 마우스 및 인간 p35가 융합된 융합체는 유사한 방식으로 작제하였다(PCT 국제 공개 공보 WO 99/29732).
p40을 IL-2 및 GM-CSF에 융합시키기 위해 본 명세서에 개시된 종류의 방법은 일반적으로 2종 이상의 시토킨의 융합에 적용할 수 있다. 구체적으로, 대부분의 N-말단 부분의 암호화 서열은 분비에 대한 신호 서열을 포함하는 반면, C-말단 부분은 신호 서열을 필요로 하지 않는다. 일부 환경에서, 짧은 펩티드 링커, 바람직하 게는 10∼15 아미노산 길이이고 글리신과 세린이 풍부한 암호화 서열을, 2개의 시토킨에 대한 암호화 서열 사이에 배치하는 것이 유용할 수 있다. 모든 종류의 융합체를 형성하는데 관련된 DNA 조작은 당업계의 수준 내에 있다.
예를 들어, 쥐 IL-12 p40 서브유닛과 쥐 IL-2의 융합체 작제에 관한 세부사항은 다음과 같다. 쥐 IL-12의 p40 서브유닛의 전장 cDNA를 콘카발린 A(3일 동안 배양 배지 중 5 ㎍/㎖)로 활성화된 마우스 비장 세포로부터 PCR로 클로닝하였다. 정방향 프라이머는 서열 AA GCT AGC ACC ATG TGT CCT CAG AAG CTA ACC(서열 번호 7)이고, 여기서 NheI 부위 GCTAGC(서열 번호 7의 잔기 3-8)는 번역 개시 코돈 ATG의 상류에 위치하였다. 역방향 프라이머는 서열 CTC GAG CTA GGA TCG GAC CCT GCA GGG(서열 번호 8)이고, 여기서 XhoI 부위 CTCGAG(서열 번호 8의 잔기 1-6)은 번역 종지 코돈 TAG(안티코돈 CTA)의 바로 하류에 위치하였다. 서열 확인 후에, 이의 천연 리더와 함께 mu-p40 DNA를 함유하는 NheI-XhoI 단편을 XbaI-XhoI 분해된 발현 벡터 pdC로 결찰시켰다[Lo 등, (1998) Protein Engineering 11:495-500]. 제한 부위 NheI 및 XbaI는 혼화성의 점착성 말단을 보유하며, mu-p40이 내부 XbaI 부위를 보유하기 때문에 NheI 부위를 mu-p40의 클로닝에 사용하였다.
mu-p40-muIL-2를 암호화하는 DNA를 작제하기 위해서, 올리고뉴클레오티드 링커를 사용하여 mu-p40 DNA를 PstI 부위(C TGC AG)를 통해 성숙 쥐 IL-2의 cDNA를 함유하는 SmaI-XhoI 단편에 결합시켰다. 융합 단백질의 연결부에서 DNA 서열은 C TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGT AAA GCA CCC(서열 번호 9)였으며, 여기서 C TGC AG(서열 번호 9의 잔기 1-6)는 PstI 부위이고, C CCG GG(서열 번호 9의 잔기 15-20)는 SmaI 부위이며, TCC는 쥐 p40의 C-말단 아미노산 잔기이며, GCA는 성숙 쥐 IL-2의 N-말단 잔기이다.
단일쇄 muIL-12-muGMCSF를 암호화하는 DNA는, SmaI 부위에서 muIL2 cDNA를 muGMCSF cDNA로 치환하여 상기 단일쇄 muIL-12-muIL2를 암호화하는 DNA 작제물로부터 유도하였다. 단일쇄 muIL12 및 muGMCSF의 연결부에서 DNA 서열은 C TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGA AAA GCA(서열 번호 10)이었으며, C TGC AG(서열 번호 10의 잔기 1-6)은 PstI 부위이고, C CCG GG(서열 번호 10의 잔기 17-22)는 SmaI 부위이며, TCC는 쥐 p40의 C-말단 아미노산 잔기이고, GCA는 성숙 쥐 GMCSF의 N-말단 잔기이다.
실시예 2
IL-12 융합 단백질의 발현
IL-12-IL-2 융합 단백질을 다음과 같이 발현시켰다. p40 융합체를 암호화하는 개개의 벡터와 p35를 포함하는 단백질을 암호화하는 벡터의 상이한 조합체를 융합 단백질의 일시적인 발현을 위해 인간 293 상피암 세포로 형질감염시켰다. 정제용 키트(위자드, 프로메가 인코포레이티드)를 사용하여 DNA를 정제하고, 살균을 위해 에탄올 침전시키고, 살균수 중에 재현탁시켰다.
생물학적으로 활성인 IL-12 융합 단백질 헤테로이량체의 발현을 위해서, 서브유닛의 융합 형태 및 비융합 형태를 암호화하는 각 벡터의 상이한 조합체를 인간 293 상피암 세포의 동시 형질 감염으로 일시적으로 발현시켰다. 정제용 키트(위자드, 프로메가 인코포레이티드)를 사용하여 DNA를 정제하고, 살균을 위해 에탄올 침 전시킨 다음, 살균수 중에 재현탁시켰다. 1 ㎖당 DNA 10 ㎍(2종의 플라스미드를 동시 형질감염시키는 경우 각 5 ㎍)을 사용하여 표준 방법으로 인산칼슘 침전물을 제조하고, 대략 70% 전면성장(confluency)로 60 mm 평판에서 성장하는 293의 배양물에 평판당 0.5 ㎖를 첨가하였다(MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). 16 시간 후에, 침전물을 함유하는 배지를 제거하고, 새로운 배지로 교체하였다. 3일후, 상청액을 제거하고, ELISA, IL-12 활성의 생물학적 측정, 또는 방사능 표지된 단백질의 SDS 겔 상에서의 분석으로 형질감염된 유전자 발현의 생성을 분석하였다. 표지를 위해서, 메티오닌을 함유하지 않은 배지를 사용하여 배양 2일째 성장 배지를 교체하고, 35S-메티오닌(100 μCi/㎖)을 첨가하였다. 16시간 더 항온배양한 후에, 배지를 수거하고, 원심분리(테이블 탑 미세원심분리기에서 13,000 rpm으로 5분)로 정화하고, 단백질 A 세파로스 비드(배양물 상청액 1 ㎖당 비드 부피 10 ㎕)와 함께 항온배양하였다. 실온에서 1시간 후에, 반복 원심분리와, 1% Nonidet-P40(NP-40)을 함유하는 PBS 완충액에서 재현탁으로 비드를 세척하였다. SDS-함유 겔 완충액에서 최종 펠렛을 재현탁시키고 2분 동안 비등시켰다. 원심분리로 비드를 제거한 후에, 상청액을 2개의 분액으로 나누었다. 환원제(5% 2-머캅토에탄올)을 한 샘플에 첨가하고, 2개 샘플을 5분 동안 비등시킨 후에 SDS 폴리아크릴아미드 겔에 적재하였다. 전기영동 후에, 겔을 X-선 필름에 노출시켰다(방사선 사진).
다음 발현 플라스미드를 이용한 형질감염을 실시하였다: mu.p35와 mu.p40-IL-2, KS-1/4-mu.p35와 mu.p40, KS-1/4-mu.p35와 mu.p40-IL-2, 14.18-mu.p35와 mu.p40-IL-2, hu.Fc-p35와 hu.p40-IL-2, KS-1/4-hu.p35와 hu.p40-IL-2, 및 14.18-hu.p35와 hu.p40-IL-2. 여기서 "mu"는 쥐 단백질이고, "hu"는 인간 단백질이다.
35S-메티오닌으로 세포를 대사 표지하고 환원성 SDS 겔 전기영동 및 방사선 사진으로 분비 단백질을 검사하는 경우, 높은 수준의 발현이 각 경우에 관찰되었다. 환원된 융합 단백질의 분자량은 성분 단백질의 분자량을 기준으로 하여 다음과 같이 예측하였다: IL-12의 p35, 35 kD; IL-12의 p40, 40 kD; IL-2, 16 kD; Fc, 32 kD; Ig 중쇄, 55 kD; 및 Ig 경쇄, 28 kD. 분자량이 대략 추정한 것과 같은 단백질 이동이 관찰되었다.
복수의 시토킨 융합 단백질을 발현하는 안정하게 형질감염된 세포주를 분리하였다. 헤테로이량체 작제물의 경우, IL-12 p40-IL-2 또는 IL-12 p40-GM-CSF 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터는 IL-12 p40 서브유닛에 대해 앞서 개시한 바와 같다(Gillies 등 [1998] J.Immunol.160:6195-62030). p40 융합 단백질을 발현하는 형질감염된 세포주는 IL-12 p35 서브유닛을 암호화하는 발현 벡터, 전술한 바와 같은 Fc-p35 융합 단백질 또는 항체-p35 융합 단백질 박현 벡터로 2차 형질감염시켰다(Gillies 등 [1998] J.Immunol. 160:6195-62030).
인간 Fc-IL-12-IL-2를 발현하는(즉, KS-p35 및 p40-IL-2를 발현) 안정하게 형질감염된 세포에서 얻은 상청액을 수거하고, 제조업자의 절차(레플리겐, 미국 매 사츄세츠주 니드함)에 따라서 단백질 A 세파로스에 결합시키고 이로부터 융출시켜 생성물을 정제하였다. 순수한 단백질은 IL-12 및 IL-2 함량에 대해 ELISA로 분석하였다. 그 결과 개별 시토킨 성분이 대략 4배의 질량 차이가 있는 것으로 나타났는데, 이는 IL-12와 IL-2의 분자량 차이가 4배인 것과 관련이 있다. 유사하게, IL-12 및 IL-2 수준에 대한 ELISA로 인간 KS-IL-12-IL-2를 발현하는 형질감염된 세포의 생성물을 분석한 결과 IL-12 및 IL-2의 유사한 값을 얻었다. 따라서, ELISA의 정확도 범위에서 측정된 값은 IL-12 및 IL-2가 약 1:1의 몰비로 생성된다는 것을 보여준다. Fc 또는 전체 항체를 이용하여 제조된 IL-12-GM-CSF 융합 단백질로 동일한 결과를 얻었다.
실시예 3
IFN-γ 유도 분석에서 융합 단백질의 상승적 활성
IL-12-IL-2 융합 단백질의 생물학적 활성은, 인간 지원자로부터 얻은 휴지 또는 미토겐 활성화된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하여 IFN-γ 유도 분석에서 측정하였다(도 6). IFN-γ 생성은 ELISA로 측정하였다.
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 건강한 지원자로부터 취하고, Ficoll-Hypaque(파마시아) 구배(20분 동안 1700 rpm)로 원심분리로 정제하였다. PBMC를 함유하는 "연층(buffy coat)"을 무혈청 배양 배지(SF-RPMI)로 50 ㎖ 부피로 희석하고, 5분 동안 1500 rpm에서 원심분리로 수거하였다. 구배 원심분리 후에, 5 ×106 세포/㎖의 밀도로 식물성혈구응집소(PHA; 10 ㎍/㎖)의 유무 하에 10% 태아 소 혈청(RPMI-10)을 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 재현탁하고, 가습 CO2 항온조에서 37℃에서 3일 동안 배양하였다. 세포를 원심분리로 수거하고, 동부피의 SF-RPMI로 3회 세척한 다음 새로운 RPMI-10(1 ×106 세포/㎖)에 재현탁시켰다. 분액(100 ㎕)을 다중 96웰 평판의 웰에 분배하여 최종 세포 수가 웰당 105이 되도록 하였다. 배양 배지 유래의 시험 샘플을 새로운 배양 배지로 차례로 희석하고, 96웰 평판의 웰에 첨가하였다. 대조 웰에는 IL-2(도 6A) 또는 시판용 IL-2 및 IL-12의 동몰 혼합물(도 6B; R&D 시스템즈에서 구입한 시토킨)을 두었다. 제조자(엔도겐 인코포레이티드, 미국 매사츄세츠주 워번)의 지시에 따라 평판을 CO2 항온조에서 37℃에서 48시간 동안 항온배양하고, 이 때 IFN-γ 농도를 ELISA로 분석하기 위해서 분액(20 ㎕)을 제거하였다.
도 6A에서, 인간 IL-12-IL-2 융합 단백질의 활성을 IL-12만의 활성과 비교하였다. 그 결과는 IL-12가 IFN-γ를 중간 수준으로 유도하는 반면, IL-12-IL-2 융합 단백질은 IFN-γ 합성을 강하게 유도함을 예시한다. IL-2는 IFN-γ 합성에 불충분한 것으로 알려져 있기 때문에, 이들 결과는 IL-12 및 IL-2 부분이 융합 단백질 내에서 함께 작용하여 상승적으로 기능하는 것임을 제시하는 것이다.
이어서, Fc-IL-12-IL-2 융합 단백질, KS-IL-12-IL-2 융합 단백질 및 1:1 몰비의 IL-12와 IL-2의 혼합물의 활성을 IFN-γ를 유도하는 능력에 대해 비교하였다. 도 6B의 결과는 Fc-IL-12-IL-2 융합 단백질과 KS-IL-12-IL-2 융합 단백질이 IL-12 및 IL-2의 동몰 혼합물과 거의 동일한 활성을 보유함을 제시한다. 인간 형태에 대해 실시예 1에 개시된 방식으로 작제된 IL-2 및 IL-12의 마우스 형태를 융합 단백질 작제에 사용한 경우에도 동일한 결과를 얻었다.
실시예 4
IL-12-IL-2 융합 단백질의 IL-2 및 IL-12 생활성
융합 단백질에서 IL-2 및 IL-12의 활성을 증식계 분석에서의 유리 시토킨과 비교하였다. 쥐 항체 14.18-IL-12-IL-2 분자의 활성을 통상적인 IL-12 증식 분석으로 시험하였다. 표준 절차에 따라서, 인간 PBMC를 지원자로부터 얻고, 3일 동안 식물성혈구응집소-P 5 ㎍/㎖와 함께 배양한 후, 행크스 HBSS로 세척하고, 웰당 105 세포로 미량역가 평판에서 평판배양하였다(Gately, M.K., Chizzonite, R., 및 Presky, D.H. Current Protocols in Immunology [1995] p6.16.1-6.16.15). 각종 시험 단백질의 존재하에 48 시간 동안 세포를 항온배양하고, 3H-티미딘 0.3 마이크로큐리를 첨가한지 10시간 후에 방사능 도입 레벨을 측정하였다. IL-12와 IL-12 및 IL-2의 동몰 혼합물은 용량 의존 방식으로 세포내로의 3H-티미딘 도입을 자극하였으며, 14.18-IL-12-IL-2 융합 단백질은 3H-티미딘의 도입을 자극하는데 있어서 대략 동일한 효과가 있었다. IL-2는 높은 몰농도에서만 3H-티미딘의 도입을 자극하는데, 이는 14.18-IL-12-IL-2 융합 단백질에 의해 자극된 3H-티미딘의 관찰된 도입이 주로 IL-12 활성에 기인한다는 것을 제시한다. 결과는 도 7에 도시되어 있다.
또한, IL-2 부분의 생물학적 활성은, 표준 절차에 따라서 상이한 세포 증식 분석으로 시험하였다(Davis L.S., Lipsky, P.E., 및 Bottomly, K. Current Protocols in Molecular Immunology [1995] p6.3.1-6.3.7). 마우스 CTLL-2 세포주는 증식에 있어 IL-2에 좌우된다. CTLL-2 세포주는 IL-4에 반응하여 증식할 수 있지만, IL-12에 대한 반응성은 없다. 활성 대수기 성장에서의 CTLL-2 세포를 IL-2 결핍 배지로 2회 세척하고, 시판용 쥐 IL-2, 쥐 14.18-IL-12-IL-2 융합 단백질 또는 시판용 쥐 IL-12의 양을 다양하게 하여 미량역가 웰에서 웰당 약 1×104 세포로 평판배양하였다. 정상 기간의 말미에, MTT/MTS 분석을 이용하여 생존 세포의 수를 정량하였다. 도 8은 IL-2, IL-12 또는 14.18-IL-12-IL-2 융합 단백질의 수준이 변하는 실험을 도시한다. 이 결과는 쥐 IL-2 및 쥐 14.18-IL-12-IL-2 융합 단백질이 증식을 자극하는데 있어서 대략 동일한 효능이 있지만, 쥐 IL-12의 양은 증가시켜도 세포 증식의 검출가능한 자극을 유발하지 않는다는 것을 제시한다. 이 결과는 14.18-IL-12-IL-2 융합 단백질에 의한 CTLL-2 세포 증식의 자극이 IL-12 부분이 아니라 IL-2 부분에 기인한 것임을 제시한다.
실시예 5
항체 부분의 존재 및 부재하에 단일쇄 및 복수쇄 IL-12-IL-2 융합 단백질의 작제 및 발현
단일쇄 쥐 IL-12-IL-2 융합 단백질은 다음과 같이 작제하였다. p40-IL-2 암 호화 서열 융합체는 실시예 1에서 인간 p40-IL-2 융합체의 작제에 사용된 것과 유사한 방법으로 작제하였다. IL-12의 p35 및 p40 서브유닛을 암호화하는 DNA를 연결하고 단일 암호화 서열을 형성하기 위해서, 링커를 암호화하는 DNA를 5' 말단에서 XhoI 부위 및 3' 말단에서 BamHI 부위로 합성하였다. 성숙 p40-IL-2 암호화 서열의 5' 말단을 변형시켜 제한 부위를 도입한 다음, 링커의 3' 말단에 결찰시켰다. 쥐 p35 암호화 서열의 3'말단을 변형시켜 제한 부위를 형성하고, 링커의 XhoI 부위에 결찰시켰다. 실시예 1에 개시된 단일쇄 muIL12 및 mu-p40-muIL2를 암호화하는 cDNA를, p40내의 편리한 제한 부위를 사용하여 조합시켜 단일 muIL12-muIL2를 암호화하는 제3의 DNA 작제물을 제공하였다. 이들 단계는 필요에 따라 각종 벡터 및 DNA 단편 분리를 사용하여 실시하였다. 생성된 쥐 p35-링커-p40-IL-2 암호화 영역의 서열은 서열 번호 11이다.
동시에, 해당 단일쇄 쥐 IL-12 암호화 서열을 해당 방법으로 작제하였다. 암호화 서열은 서열 번호 12이다.
또한, 본 발명자들은 p35-링커-p40-IL-2의 N-말단에 융합된 쥐 IgG2aFc 영역을 암호화하는 DNA 서열을 추가로 작제하였다. 암호화 서열은 서열 번호 13이다.
배양된 293 세포는 쥐 단일쇄 Fc-IL-12-IL-2 및 Fc-IL-12 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 융합 단백질의 발현은 실시예 2에 개시된 바와 같이 분석하였다. Fc 융합 단백질은 단백질 A 세파로스에 융합 단백질을 결합시켜 정제하고, Fc-IL-12-IL-2 및 Fc-IL-12의 고 수준 발현을 관찰하였다. SDS 겔 상에서의 이동으로 겉보기 분자량을 추정했을 때, 온전한 단백질이 합성되었다: Fc-IL-12-IL-2, 123 kD; Fc-IL-12, 107 kD.
실시예 1에 개시된 KS-scIL12-IL2 융합 단백질은 2개의 상이한 폴리펩티드 사슬을 보유한 사량체이다: C-말단에서 scIL-12-IL-2 부분을 보유한 KS-1/4 경쇄 및 KS-1/4 중쇄. 항체 분자 상에서의 부위가 시토킨 부분 결합에 적합한지를 조사하기 위해서, KS-1/4 항체, IL-12 및 IL-2 부분이 실시예 1의 KS-IL12-IL2 구성과 다른 구성을 갖는 제2 융합 단백질을 작제하였다. 제2 단백질은 사량체이며, 2개의 상이한 폴리펩티드로 구성되었다. 하나의 폴리펩티드는 KS-1/4 항체의 경쇄로 구성되었다. 다른 하나의 폴리펩티드는 KS1/4 항체의 중쇄의 성숙 N-말단에 융합된 단일쇄 muIL-12와 중쇄의 카르복실 말단에 있는 쥐 IL-2로 구성된다.
쥐 IL-12의 p35 서브유닛을 암호화하는 cDNA는 콘카나발린 A(3일 동안 배양 배지 중 5 ㎍/㎖)로 활성화된 마우스 비장 세포로부터 PCR로 클로닝하였다. 정방향 프라이머는 서열 AAGCTT GCTAGCAGC ATG TGT CAA TCA CGC TAC(서열 번호 14)이고, HindIII 부위 AAGCTT(서열 번호 14의 잔기 1-6)는 번역 개시 코돈 ATG의 상류에 있으며, 역방향 프라이머는 서열 CTCGAG CTT TCA GGC GGA GCT CAG ATA GCC(서열 번호 15)이며, 여기서 XhoI 부위 CTCGAG(서열 번호 15의 잔기 1-6)는 번역 종지 코돈 TGA(안티코돈 TCA)의 상류에 위치한다.
단일쇄 IL-12를 암호화하는 DNA는 글리신 및 세린 잔기가 풍부한 링커를 암호화하는 올리고뉴클오티드에 결합된 mup35 DNA와 mup40 DNA를 포함한다. 생성된 작제물은 올리고뉴클레오티드 연결부에서 다음과 같은 서열을 보유한다.
Figure 112002004074438-pct00001
여기서 G AGC TC(서열 번호 16의 잔기 1-6)은 쥐 p35 번역 종지 코돈의 바로 상류에 있는 SacI 제한 부위이며, GCG는 쥐 p35의 C-말단 아미노산 잔기를 암호화하고, GGA TCC(서열 번호 16의 잔기 50-55)는 쉽게 결찰시키기 위해 도입한 BamHI 제한 부위이고, ATG는 성숙 mu-p40의 N-말단 잔기를 암호화한다.
단일쇄 muIL12-KS 중쇄-muGMCSF를 암호화하는 DNA는 mup40의 연결부와 KS 중쇄의 성숙 N-말단에서 다음과 같은 서열을 갖는다.
Figure 112002004074438-pct00002
여기서 C TGC AG(서열 번호 18의 잔기 1-6)는 쥐 p40 번역 종지 코돈의 바로 상류에 있는 PstI 부위이고, TCC는 쥐 p40의 C-말단 아미노산 잔기를 암호화하며, CAG는 성숙 KS 중쇄의 N-말단 잔기를 암호화한다. 단일쇄 muIL12-KS 중쇄-muIL2를 암호화하는 생성된 DNA를 KS 경쇄와 함께 동시발현시켰다.
항체 분자의 말단이 융합체 연결부 형성에 이용가능한지를 추가로 조사하고 여러개의 다른 폴리펩티드를 복수의 시토킨 융합 단백질로 조립할 수 있는 방법을 연구하기 위해서, KS-1/4, IL-12 및 IL-2를 포함하는 제3 단백질, 즉 IL12-KS(경쇄) + KS(중쇄)-IL2를 발현시키고 활성에 대해 시험하였다. 이 융합 단백질은 육량 체이며, 3개의 다른 폴리펩티드를 포함한다. 하나의 폴리펩티드는 KS1/4 항체의 경쇄에 융합된 쥐 p35로 구성된다. 제2 폴리펩티드는 인간 IL-2에 융합된 KS1/4 항체의 중쇄로 구성되며[Gillies 등, (1992) Proc.Natl.Acad.Sci. 89:1428], 제3 폴리펩티드는 쥐 p40이다. 발현시, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄가 이황화 결합되어 사량체 항체-시토킨 구조를 형성한다. 또한, 경쇄의 N-말단에서의 p35도 p40과 이황화 결합되어 있다.
mup35-KS 경쇄를 암호화하는 DNA는 연결부에서 다음과 같은 서열을 보유한다:
Figure 112002004074438-pct00003
여기서 G AGC TC(서열 번호 20의 잔가 1-6)는 쥐 p35 번역 종지 코돈의 바로 상류에 있는 SacI 제한 부위이고, GCG는 쥐 p35의 C-말단 아미노산 잔기를 암호화하며, GGA TCC(서열 번호 20의 잔기 50-55)는 쉽게 결찰시키기 위해 도입된 BamHI 제한 부위이고, GAG는 경쇄의 N-말단 아미노산 잔기를 암호화한다.
육량체 융합 단백질을 발현하기 위해서, 네오마이신 내성 유전자를 함유하는 발현 벡터로 형질감염시킨 후 G418로 선별하여 쥐 p40 발현 세포주를 형성하였다. 그 다음 경쇄 및 중쇄 전사체 단위와, 메토트렉세이트에 의한 선별을 가능하게 하는 디히드로폴레이트 리덕타제 선별 마커를 포함하는 발현 벡터로 쥐 p40 발현 세포주를 형질감염시켰다[Gillies 등 (1998) J.Immunol. 160:6195].
실시예 6
쥐 단일쇄 IL-12-IL-2 융합 단백질의 활성
실시예 4에 사용된 동일한 방법을 이용하여 일시적 발현으로 생성된 쥐 단일쇄 IL-12-IL-2의 활성을 시험하였다. 세포 배양 상청액에서의 각 시토킨의 양은 ELISA로 먼저 측정하고, 용량 의존 곡선을 설정하는데 사용하였다. 활성은 Fc 및 항체 IL-12-IL-2 융합 단백질에서 발견된 것과 상당히 유사하였으며, 전술되어 있다.
구체적으로, 쥐 단일쇄(sc) IL-12-IL-2와 쥐 Fc-scIL-12-IL-2 분자의 IL-12 활성은 실시예 4에 개시된 인간 PBMC 세포 증식 분석에서 시험하였다. IL-12와 IL-12 및 IL-2의 동몰 혼합물은 용량 의존 방식으로 세포내로의 3H-티미딘 도입을 자극한다. 1몰을 기준으로, scIL-12-IL-2 및 Fc-ScIL-12-IL-2 융합 단백질은 3H-티미딘의 도입을 자극하는데 있어 그 효과가 IL-12와 대략 유사하였다(도 9). 실시예 4에 개시된 바와 같이, IL-2는 휠씬 높은 몰 농도에서만 3H-티미딘의 도입을 자극하는데, 이는 scIL-12-IL-2 융합 단백질에 의해 자극되는 3H-티미딘의 도입 관찰이 주로 IL-12 활성에 기인하는 것임을 제시한다.
또한, scIL-12-IL-2 융합 단백질에서의 IL-2 부분의 생물학적 활성을 세포계 분석에서 시험하였으며, 분석의 정확도 내에서 1몰을 기준으로 시판용 IL-2와 대략 동일한 것으로 밝혀졌다. IL-2 부분의 생물학적 활성을, 실시예 4에 개시된 바와 같이 CTLL-2 세포 증식 분석에서 시험하였다. 그 결과는 쥐 IL-2, 쥐 scIL-12-IL-2 및 쥐 Fc-IL-12-IL-2 융합 단백질이 증식을 자극하는데 있어 대략 동일한 효능을 나타냄을 제시한다. 쥐 IL-12는 CTLL-2 세포 증식의 검출가능한 자극을 유발하지 않았다. 이들 결과는 scIL-12-IL-2 융합 단백질에 의한 CTLL-2 세포 증식의 자극이 IL-12 부분이 아니라 IL-2 부분에 기인하는 것임을 제시한다.
실시예 5에 개시된 Fc-IL12-IL2, IL12-KS-IL2 및 IL12-KS(경쇄)+KS(중쇄)-IL2 단백질의 IL-12 및 IL-2 활성을 세포계 분석으로 시험하였다. PBMC 세포 증식/삼중수소화된 티미딘 도입 분석을 이용하여, Fc-IL12-IL2, IL12-KS-IL2 및 IL12-KS(경쇄)+KS(중쇄)-IL2 단백질은 모두 유효 IL-12 활성을 나타내었다. 유사하게, CTLL-2 세포 증식 분석을 이용하여, Fc-IL12-IL2, IL12-KS-IL2 및 IL12-KS(경쇄)+KS(중쇄)-IL2 단백질은 모두 유효 IL-2 활성을 나타내었다. 또한, ELISA에서 중쇄 및 경쇄 V 영역이 각각 N-말단에서 다른 단백질에 융합되어 있을 지라도, IL12-KS-IL2 및 IL12-KS(경쇄)+KS(중쇄)-IL2 단백질은 둘다 EpCAM 항원에 강하게 결합되었다.
실시예 7
쥐 IL-12-GM-CSF 융합 단백질의 활성
쥐-Fc-IL-12-GM-CSF 분자의 IL-12 활성은 세포 증식 분석에서 시험하였다(도 10). 표준 절차에 따라서, 인간 PBMC를 3명의 지원자로부터 얻어서, 3일동안 식물성혈구응집소-P 5 ㎍/㎖와 함께 배양하고, 행크스 HBSS로 세척하고, 웰당 105 세포 로 미량역가 평판에서 평판배양하였다(Gately, M.K., Chizzonite, R., 및 Presky, D.H. Current Protocols in Immunology [1995] p6.16.1-6.16.15). 각종 시험 단백질의 존재하에 48 시간 동안 세포를 항온배양하고, 3H-티미딘 0.3 마이크로큐리를 첨가한지 10시간 후에 방사능 도입 레벨을 측정하였다. IL-12와 IL-12 및 GM-CSF의 동몰 혼합물은 용량 의존 방식으로 세포내로의 3H-티미딘 도입을 자극하였으며, 14.18-IL-12-GM-CSF 융합 단백질은 3H-티미딘의 도입을 자극하는데 있어서 대략 동일한 효과가 있었다. GM-CSF는 시험된 농도에서 3H-티미딘의 도입을 자극하지 않았는데, 이는 14.18-IL-12-GM-CSF 융합 단백질에 의해 자극된 3H-티미딘의 관찰된 도입이 주로 IL-12 활성에 기인한다는 것을 제시한다.
또한, 각종 IL-12-GM-CSF 융합 단백질의 GM-CSF 부분의 생물학적 활성은 세포계 분석으로 시험한다. GM-CSF 부분이 활성임을 발견하였는데, 1몰당 활성은 시판용 GM-CSF와 동일한 일반 범위이다. 예를 들어, GM-CSF 부분의 생물학적 활성은, 분자 면역학 분야의 업자들에게 공지된 절차에 따라 상이한 세포 증식 분석에서 시험한다(Cooper, S.C., and Broxmeyer, H.E. Current Protocols in Molecular Immunology[1996] p6.4.1-6.4.20). 마우스 32D(GM) 세포주는 증식과 관련하여 GM-CSF에 좌우된다. 이 세포주는 Cooper 및 Broxmeyer가 개시한 본래의 32D 세포주를 GM-CSF에 특히 민감성이 되도록 한 것이다(Fass 등, Eur.J.Immunol. [1993] 23:1201-14). 32D(GM) 세포주는 IL-12에 반응성이 없다. 활성 대수기 성장에서 32D(GM) 세포를 GM-CSF 결핍 배지로 2회 세척하고, 시판용 쥐 GM-CSF 또는 쥐 IL-12-GM-CSF 융합 단백질의 다양한 양의 존재하에 미량역가 웰에서 웰당 약 5×103 세포로 평판배양하고, 48 시간 동안 성장시킨다. 3H-티미딘 0.3 마이크로큐리를 첨가한지 16시간 후에 방사능 도입 레벨을 측정한다. IL-12-GM-CSF 융합 단백질의 수준 증가와 함께 3H-티미딘 도입의 용량 반응성이 증가하는데, 이는 IL-12-GM-CSF 융합 단백질의 GM-CSF 부분이 활성임을 제시한다. 또한, 몰 기준으로 계산된 융합 단백질의 GM-CSF 생물학적 활성은 시판용 쥐 GM-CSF와 유사하다.
실시예 8
복수의 시토킨 융합 단백질과 면역 단련 포유류에서의 결장암 치료
복수의 시토킨-항체 융합 단백질을 사용하여 온전한 면역계를 갖는 포유류에서의 결장암을 치료할 수 있는지를 시험하기 위해서, 다음 실험을 실시하였다. CT26은 Balb/C 마우스 유래의 결장암 세포주이다. 표준 유전자 공학 기법으로, 세포주를 조작하여 인간 상피세포 유착 분자(EpCAM)를 발현시켰는데, 이 분자는 KS-1/4 항체가 인식하는 항원이다. 이들 세포를 CT26/KSA 세포라 명명한다.
Balb/C 마우스에게 2 ×106 CT26/KSA 세포를 피하 접종하였다. 종양의 체적이 약 100∼200 mm3가 되면, 추가의 연구를 위해 마우스를 9마리씩 3그룹으로 나누었다. 0일에 시작하여, 종양 보유 마우스를 PBS, KS-IL12 약 5.3 ㎍과 혼합된 KS-IL2 약 3.4 ㎍, 또는 KS-IL2-IL12 약 6 ㎍으로 처리하였다. 이들 용량은 동수의 IL-12 및 IL-2 분자를 각 세트의 마우스에게 전달하도록 정한 것이다. 5일 동안 1일 1회 마우스에게 종양내 주사하였다. 종양 크기를 캘리퍼로 측정하였다.
이러한 실험 결과는 도 11에 도시되어 있다. 이 실험에서, KS-IL12-IL2는 종양 성장을 상당히 억제하였다. KS-IL12 및 KS-IL2의 혼합물도 종양 성장을 유의적인 수준으로 억제하였으나, KS-IL12-IL2 처럼 완전하지는 않았다. KS-IL12-IL2로 처리한 마우스 그룹에서, 9마리 마우스 중 6마리는 종양이 외관상 치유되었다. 이들 6마리의 마우스는 실험이 끝날 때 93일까지 생존하였다. 이들 마우스에서 종양은 줄어들어 없어져서, 39일 내지 93일에 피하 종양을 감지할 수 없었다. 다른 3마리의 마우스에서는 종양의 성장이 지연되어, 87일 후에만 종양 체적이 4,000 mm3를 초과하였다.
KS-IL12 및 KS-IL2의 혼합물로 처리된 마우스 중에서, 2마리의 마우스는 피하 종양이 외관상 치유되어 실험이 끝날 때까지 생존하였다. 남아있는 7 마리의 마우스에서 종양은 사라지지 않고, 결국 1,000 mm3(1 마리 마우스) 또는 4,000 mm3 이상(6 마리 마우스)의 체적으로 커졌다.
KS-IL12-IL2가 KS-IL12와 KS-IL2의 동몰 혼합물보다 효과적이라는 사실은 놀랍다. 이 실험에서 투여량은 1회 용량당 융합 단백질 약 15 pmol을 전달하는데, 이는 약 9×1012 분자에 해당한다. 치료 개시시, 각 종양은 체적이 약 160 mm3이며, 이는 약 1600만 세포에 해당한다. 각 세포는 약 106 분자의 EpCAM을 발현하므로, KS 항체가 결합할 약 1.6×1014 EpCAM 항원 분자가 있다. 따라서, KS-IL12 및 KS-IL2를 혼합하여 종양이 있는 마우스에게 주사하면, 이들 2종의 면역시토킨 융합 단백질이 항원 결합 부위에 대해 서로 경쟁할 것 같지 않다. 따라서, 종양 부위에서 IL-12 및 IL-2의 유효 용량은 KS-IL12-IL-2의 경우보다 KS-IL12 및 KS-IL2의 혼합물의 경우에서 더 높아야 한다.
실시예 9
복수의 시토킨 융합 단백질을 이용한 면역결핍 포유류에서의 결장암 치료
여러 형태의 암 요법은 면역계의 세포를 비롯하여 분열 세포를 죽이는 효과를 갖는다. 결과적으로, 암 환자는 종종 면역억제된다. 복수의 시토킨 융합 단백질을 사용하여 면역계가 억제된 포유류를 치료할 수 있는지를 알아보기 위해서, CT26/KSA 종양을 보유한 SCID 마우스를 KS-IL12-IL2, KS-IL12 및 KS-IL2의 혼합물, 또는 PBS로 처리하였다. SCID 마우스는 B 세포 및 T 세포가 결여되어 있어, 감염에 대항하는 능력을 위해서는 NK 세포와 같이 고유 면역계의 분지에 의존한다.
피하 CT26/KSA 종양이 있는 마우스는 실시예 8에 개시된 바와 같이 형성하였다. 약 100∼200 mm3의 종양을 갖는 8마리의 3그룹을, 실시예 8에 개시된 바와 동일한 용량 및 계획으로 종양내 주사로 처리하였다. 결과는 도 12에 도시되어 있다. 이 경우, KS-IL12-IL2 융합 단백질과 KS-IL12 및 KS-IL2 혼합물은 효과가 대략 동일하였다. 25일까지 각 그룹에서 8마리의 마우스 중 5마리가 치유되었다. 그러나, 치유되지 않은 마우스에서 6개의 종양 중 5개가 미처리 동물에서의 특징적인 속도 로 성장하기 시작하였다. 효과적인 지연 기간은 약 14∼21일이엇다. 이는 실시예 8에서 면역 단련 마우스의 종양과는 대조적인 것이다. 실시예 8에서는 종양이 KS-IL12-IL2의 치료로 완전히 제거되지 않은 때에도, 실험 개시 약 60일 까지는 종양이 공격적으로 성장하지 않았다.
이들 실험은 복수의 시토킨 항체 융합 단백질을 사용하여 면역억제된 동물에서 암을 치료할 수 있음을 입증한다.
실시예 10
복수의 시토킨 융합 단백질의 종양내 주사에 의한 폐암 치료: 개개의 면역시토킨에 의한 치료와의 비교
복수의 시토킨 융합 단백질과 폐세포 유래의 암에 대항하는 단일 시토킨 부분을 보유하는 면역 시토킨의 효과를 살펴보기 위해서, 다음 실험을 실시하였다.
루이스 폐암(LLC)은 C57BL/6 마우스에서 유도된 공격적 종양이다. 인간 EpCAM 단백질을 발현하는 LLC 세포주는 표준 유전자 공학 기법으로 작제하였다. 세포주는 LLC/KSA라 명명하였다.
피하 LLC/KSA 종양이 있는 C57BL/6 마우스는 실시예 8에 개시된 바와 같이 형성하였다(KML을 갖는 세포의 수 검사). 약 100∼200 mm3 종양을 갖는 5마리씩 4개 그룹의 마우스를 5일 동안 종양내 주사로 처리하였다. PBS, KS-IL12 약 20 ㎍, KS-IL12 약 20 ㎍ 또는 KS-IL12-IL2 약 20 ㎍를 마우스에게 주사하였다.
결과는 도 13에 도시되어 있다. 이 경우, KS-IL12-IL2 융합 단백질은 KS- IL12 또는 KS-IL2보다 휠씬 효과적이었다. KS-IL12-IL2 융합 단백질로 치료된 모든 마우스에서, 종양은 27일 까지 사라졌다. 74일째, 이들 마우스를 실시예 14에 개시된 바와 같이 폐 전이 분석에 사용하였다. 본래의 피하 종양은 중간 기간 또는 제2 실험 과정에서 다시 나타나지 않았다. 대조적으로, KS-IL2 또는 KS-IL12로의 처리는 일부 분명한 종양 수축과 종양 성장의 상당한 지연을 초래하였지만, 종양은 결국 성장하였다. 본 실시예와 이전 실시예들의 결과를 비교하면, 일부 질병 및 투여 방식에서 상이한 시토킨 부분을 보유하는 면역시토킨의 혼합물을 이용한 치료가 단일 종류의 면역시토킨을 이용한 치료보다 우월하다는 것을 제시한다.
실시예 12
복수의 시토킨 융합 단백질의 종양내 주사에 의한 폐암 치료: 면역시토킨의 혼합물에 의한 치료와의 비교
복수의 시토킨 융합 단백질과 폐세포 유래의 암에 대항하는 상이한 시토킨 부분을 보유하는 면역 시토킨 혼합물의 효과를 살펴보기 위해서, 다음 실험을 실시하였다.
피하 LLC/KSA 종양을 갖는 C57BL/6 마우스는 실시예 11에 개시된 바와 같이 제조하였다. 약 100∼200 mm3 종양을 갖는 7마리씩 3개 그룹의 마우스를 5일 동안 종양내 주사로 처리하였다. PBS, KS-IL12 약 18 ㎍ 및 KS-IL12 약 11.5 ㎍의 혼합물 또는 KS-IL12-IL2 약 20 ㎍을 마우스에게 주사하였다.
결과는 도 14에 도시되어 있다. 이 경우, KS-IL12-IL2 융합 단백질은 KS- IL12와 KS-IL2의 혼합물보다 휠씬 효과적이었다. KS-IL12-IL2 융합 단백질로 치료된 모든 마우스에서, 종양은 27일 까지 사라졌다. 대조적으로, KS-IL12 및 KS-IL2의 혼합물 치료는 일부 분명한 종양 수축과 종양 성장의 상당한 지연을 초래하였지만, 이 치료 그룹에서의 모든 종양은 결국 다시 성장하였다.
실시예 13
복수의 시토킨-항체 융합 단백질의 항종양 활성의 항원 의존성
종양 치료에 있어서 복수의 시토킨-항체 융합 단백질의 효과가 항체에 의해 인식되는 항원의 종양 특이적 발현에 좌우되는지 여부를 조사하기 위해서, 다음 실험을 실시하였다.
피하 LLC/KSA 종양이 있는 7마리의 C57BL/6 마우스 세트와 어버이 LLC 세포주로부터 유도된 종양이 있는 9마리의 마우스의 제2 세트를 실시예 11에 개시한 바와 같이 형성하였다. 약 100∼200 mm3 종양을 갖는 2 그룹의 마우스를 5 동안 종양내 주사로 처리하였다. KS-IL12-IL2 약 20 ㎍을 마우스에게 주사하였다.
결과는 도 15에 도시되어 있다. 이 경우, LLC/KSA 종양 세포를 보유한 마우스는 모두 종양이 완전히 치유되었다. 대조적으로, LLC 종양을 보유한 마우스 중 2마리만이 치유되었다. 다른 LLC 종양 보유 마우스는 모두 종양 체적의 일시적인 감소를 나타내었으나, 종양은 결국 거대 체적으로 성장하였다.
이들 결과는 EpCAM 표면 항원의 인식이 KS-IL12-IL2의 LLC/KSA 종양 세포 표면으로의 부착을 촉진한다는 것과, 생성된 면역 반응이 증가된다는 것을 제시한다. 또한 LLC-유도된 종양에 대해 일부 항종양 효과가 관찰되었다. 이론에 구애받지 않고, 이 경우 KS-IL12-IL2의 항종양 효과는 융합 단백질이 종양으로 직접 주사되어 종양에 일시적으로 배치된다는 사실에 기인하는 것일 수 있다.
실시예 14
종양 세포 종류에 대한 면역 메모리의 형성
전이 발생은 암 치료에 있어서 중요한 문제이다. 복수의 시토킨 항체 융합 단백질을 이용한 치료가 종양 세포 종류에 대해 장기간 지속되는 면역 메모리의 형성을 초래하며, 전이의 형성을 방지할 수 있는지를 시험하기 위해서, 다음 실험을 실시하였다.
실시예 11에서 얻은 5마리의 C57BL/6 마우스를 KS-IL12-IL2로 치료한 결과, 피하 종양이 외관상 치료되었다. 실시예 14에 개시된 바와 같이 치료 개시 74일째에, 이들 5마리의 마우스에게 106 LLC/KSA 세포를 정맥내 주사하였다. 대조군으로서, 8마리의 C57BL/6 마우스에게 106 LLC/KSA 세포를 정맥내 주사하였다.
28일째에, 마우스를 죽이고, 전이에 대해 폐를 검사하였다. 8마리의 대조 마우스의 폐는 70∼100%가 전이로 덮여있었고, 평균 85% 폐 표면이 전이되어 있었다. 이들 마우스에 대한 평균 폐 중량은 0.86 g이었다. 대조적으로, 5마리의 전처리된 마우스의 폐 표면에는 전이가 발견되지 않았으며, 평균 폐 중량은 0.28 g이었는데, 이는 정상 마우스 폐 중량에 해당하는 것이다. 이들 결과는 본래의 종양 세포의 치료가 종양 세포에 대항하여 장기간 지속되는 면역 메모리를 생기게 한다는 것을 제 시한다. 이 메모리는 이 종양 세포 종류의 전이가 형성되는 것을 막는다.
LLC-KSA 폐 전이로부터 "퇴행"된 마우스의 생성
전처리 전이 스코어 폐 중량(g)
없음 4, 4, 4, 4, 4, 4, 3, 3 0.88 +/- 0.27
KS-IL12/IL2 0, 0, 0, 0, 0 0.27 +/- 0.03
종양이 없는 대조 그룹의 평균 폐 중량은 0.2 g이었다. 전이 스코어는 융합된 전이 덩어리의 표면 피복율(%)을 기초로 한 것이다. 0=전이 없음; 1= 1∼25% 피복; 2= 25∼50% 피복; 3= 50∼75% 피복; 및 4= 75∼100% 피복.
사용된 면역 메모리 형성에 대하여 LLC/KSA 종양 세포를 주사한 실시예 12의 7마리 마우스 중 6마리를 시험하기 위한 제2 실험은 피하 종양을 형성하였으며, 이들 종양은 사라졌다. 실시예 12의 처리를 개시한 지 62일 후에, 6마리의 전처리 마우스와 10마리의 천연 미처리 C57BL/6 대조군 마우스에게 106 LLC 세포를 피하 주사하였다. 이들 세포는 인간 KS 항원인 EpCAM을 발현하지 않았다.
천연 마우스에서, 주사된 LLC 세포는 모든 마우스에서 급속한 속도로 성장하는 종양을 형성하였다. 대조적으로, 전처리 마우스의 종양은 휠씬 서서히 성장하였으며, 한 마우스에서는 피하 종양이 검출되지 않았다. 결과는 도 16에 도시되어 있다. 인간 KS 항원인 EpCAM이 LLC 세포에서 발현되지 않기 때문에, LLC 세포에 대한 면역 반응은 이들 세포가 발현하는 다른 항원을 기초로 하였다.
실시예 15
백신으로서의 복수의 시토킨 융합 단백질
복수의 시토킨 융합 단백질을 항원 단백질에 융합시켜 백신으로서 사용할 수 있다. N-말단으로부터 C-말단에 이르는 부분의 특별한 순서, 또는 융합 단백질이 단일 폴리펩티드쇄 또는 올리고머인지 여부는 발현 플라스미드의 작제 편리성에 따라 달라질 수 있다. 단백질은, 정맥내, 피하, 복강내 등의 각종 경로로 투여할 수 있다. 유사하게, 인간 백신에 대한 표준 관행 또는 백신 개발 분야의 당업자에게 공지된 바와 같이, 투여 용량 및 빈도는 일반적으로 실험적으로 결정할 필요가 있다.
예를 들어, 항원-IL-12-시토킨 형태의 융합 단백질을 마우스에게 투여하는데, 여기서 융합 단백질 내의 시토킨은 IL-12와 다른 제2 시토킨이다. 대조군 마우스에게는 동량의 항원-시토킨, 항원-IL-12 또는 항원만을 투여한다. 항원 융합 단백질의 투여 과정 및/또는 투여 후 각 시점에서, 후방-안와(retro-orbital) 출혈로 혈액 샘플을 수거하고, 혈장을 준비하여 항원에 대해 유도된 항체의 존재를 분석한다. 항체는 항원에 대해 형성되는 것으로 확인된다. 또한, 항원에 대한 면역 반응의 특성은 Th1 반응의 특징이다. 항체 반응은 더 강하며, 생성된 항체의 종류는 일부 대조군 면역화에서와 다르다.
더욱 구체적으로, PBS 완충액 중 인간화된 항체-쥐 IL-12-IL-2 융합 단백질을 Balb/c 마우스에게 정맥내 주사한다(5 ㎍/일 ×5). 대조 마우스에게 동일한 항체를 동량으로 제공하나, 결합형 IL-12-IL-2는 제공하지 않는다. 주사 용액은 어떤 다른 종류의 보조제도 함유하지 않는다. 10일째에, 후방 안와 출혈로 미세원심분리관에 혈액 샘플을 수거하고, 구연산나트륨을 함유하는 플라스틱관에서 혈액 샘플을 수거한 다음, 에펜도르프 테이블탑 미세원심분리에서 전속력으로 원심분리하여 혈장을 준비한다. ELISA 평판(96웰)은, 인간 불변부를 포함하고 면역화에 반응하여 만들어진 임의의 마우스 항체를 포집하는데 사용되는 인간화된 항체 단백질로 피복한다. 미결합 물질을 세척한 후에, 호스-래디쉬 퍼옥시다제에 커플링된 염소 항-마우스 Fc 항체(잭슨 이뮤노리서치)로 결합된 마우스 항체를 검출한다. 임의의 결합된 항체를 인간 불변부 또는 가변부로 유도하는데, 이들은 인간화된 항체와 융합 단백질 사이에 공유된다.
융합된 IL-12-IL-2 없이 인간화된 항체에 대한 반응성은 거의 없거나 전혀 없다. 한편, 융합 단백질은, 정맥내 투여 경로가 피하 또는 복강내 투여와 비교하여 그러한 반응을 유도하는데 매우 바람직하지 않다는 사실에도 불구하고 외인성 보조제의 부재하에 강력한 항체 반응을 유도한다. IL-12에 의해 증가된 반응의 전형인 IgG2a 이소타입의 항체는 항체-IL-12-IL-2 주사된 그룹에서 확인되지만, 인간화된 항체를 주사한 그룹에서는 확인되지 않는다.
각종 경로로 투여된 항원-IL-12 복수의 시토킨 융합 단백질의 면역원성을 PBS 또는 생체적합성 완충액 중의 융합 단백질(예컨대, 전술한 것들) 용액, 또는 프로인트 불완전 또는 완전 보조제와 같은 기존의 보조제를 주사하여 시험한다. 예를 들어, 격주로 1회 또는 복수회 피하, 피내 또는 복강내 주사를 실시할 수 있다. 대안적으로, 융합 단백질은 먼저 피하 주사로 투여한 다음 복강내 주사로 투여할 수 있다. 프로인트 보조제는 주사 부위에서의 자극 때문에 인간 용도로 사용할 수 없다. 수산화알루미늄(명반)의 침전물과 같은 대체 보조제가 인간 용도로 허가되어 있고, 본 발명에 사용할 수 있다. 스쿠알렌 및 지질을 주성분으로 하는 신규 유기 화학적 보조제를 피부 주사에 사용할 수 있다.
실시예 16
복수의 시토킨 융합 단백질을 이용한 유전자 요법
폐암 치료를 위해 유전자 요법에 의해 전달된 복수의 시토킨 융합 단백질의 항암 활성을 입증하였다. 전술한 바이러스 벡터 시스템(PA317 패키징 세포주로 형질감염된 pLNCX-scIL-12-IL-2 또는 pLNCX-scIL-12 DNA)을 이용하여 루이스 폐암 세포를 안정하게 형질감염시켰다. 이들 작제물은, p35 및 p40 서브유닛이 링커로 연결되어 있는 IL-12의 단일쇄 형태를 암호화한다. G418 함유 배지를 이용하여 시험관 내에서 클론을 선별하고, 약 50∼60 ng/㎖의 IL-12를 안정하게 발현하는 클론을 ELISA로 확인하였다(R&D 시스템즈).
scIL-12 또는 scIL-12-IL-2를 발현하는 약 1×106 및 약 5×106 LLC 세포를 C57BL/6 마우스 및 SCID 마우스 내로 피하 주사하였다. 대조군으로서, 2 ×106 LLC 세포를 C57BL/6 마우스 및 SCID 마우스 내로 주사하였다. IL-12를 발현하는 LLC 세포는, 시토킨을 발현하도록 조작되지 않은 LLC 세포에서 유도된 종양과 대략 동일한 속도로 성장하는 종양을 형성한다. 그러나, C57BL/6 마우스와 SCID 마우스에서, scIL-12-IL-2를 발현하는 LLC 세포는 피하 종양을 형성하지 않거나, 또는 이후에 수축하여 없어지는 종양을 형성하였다(도 17 및 도 18).
실시예 17
IL-4 및 GM-CSF를 포함하는 복수의 시토킨 융합 단백질의 작제
시토킨 IL-4 및 GM-CSF를 병용하는 경우, 이들은 수지상 세포의 유효 활성인자이다. IL-4 및 GM-CSF 활성을 함유하는 복수의 시토킨-항체 융합 단백질은 다음과 같이 작제하였다. 리더 서열 뒤에 있는 GM-CSF에 대한 암호화 서열을 프레임 내에서 KS-1/4 항체 중쇄 암호화 서열의 3' 말단에 융합시켰다. 또한, 리더 서열을 포함하는 IL-4에 대한 암호화 서열을 프레임 내에서 성숙 KS-1/4 항체 경쇄에 대한 암호화 서열의 5' 말단에 링커를 이용하여 융합시켰다.
구체적으로, 성숙 IL-4의 융합 단백질 및 KS-1/4 항체의 경쇄를 암호화하는 DNA를 작제하기 위해서, 쥐 IL-4 cDNA에 정방향 프라이머 TCTAGACC ATG GGT CTC AAC CCC CAG C(서열 번호 22)와 역방향 프라이머 C GGA TCC CGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GCT CTT TAG GCT TTC CAG G(서열 번호 23)를 사용한 PCR을 적용하였다. 정방향 프라이머에서 XbaI 부위 TCTAGA(서열 번호 22의 잔기 1-6)는 번역 개시 코돈 ATG의 상류에 위치하며, 역방향 프라이머는 쥐 IL-4의 C-말단 아미노산 잔기를 암호화하는 TCG 코돈(안티코돈 CGA)에 바로 3'에 있는 BamHI 부위 GGA TCC(서열 번호 23의 잔기 2-7)를 포함한다. PCR 단편의 클로닝 및 서열 확인 후에, 쥐 IL-4 cDNA를 함유하는 XbaI-BamHI 단편을, 글리신과 세린 잔기가 풍부한 가요성 펩티드 링커를 암호화하는 BamHI-AflII 올리고뉴클레오티드 듀플렉스에 결찰시켰다. AflII 말단은 성숙 KS-1/4 경쇄의 N-말단 앞에 인공적으로 배치된 AflII 부위에 결합되었 다. 2개의 결찰로부터 생긴 연결부에서의 DNA 및 단백질 서열은 다음과 같다.
Figure 112002004074438-pct00004
이 DNA 서열에서, GGATCC(서열 번호 24의 잔기 4-9) 및 CTTAAG(서열 번호 24의 잔기 48-53)은 각각 재구성용으로 사용된 2개의 제한 부위 BamHI 및 AflII이며; TCG는 쥐 IL-4의 C-말단 세린 잔기를 암호화하며; GAG는 KS-1/4 경쇄의 성숙 N-말단을 암호화하며, GlySer 풍부 펩티드 링커의 아미노산 서열은 DNA 서열 아래에 제시되어 있다. 강력한 프로모터를 포함하는 고수준의 발현을 위한 보조 서열은, 앞의 실시예에 개시된 기법과 기타 분자 생물학의 표준 기법을 사용하여 융합 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 단편 주변에 적절하게 배치하였다.
IL4-KS(경쇄) 및 KS(중쇄)-GM-CSF 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열로 NS/0 세포를 형질감염시키고, 해당 폴리펩티드를 고 레벨로 발현시켰다. 환원 조건하에서 SDS-PAGE는 중쇄-GM-CSF 폴리펩티드에 해당하는 약 80 kD에서의 확산 밴드와 IL4-경쇄 융합체에 해당하는 약 50 kD의 복수 밴드를 나타내었다. 확산 및 복수 밴드의 외관은 각각 IL-4 및 GM-CSF의 다양한 글리코실화에 기인한 것이었다.
서브유닛은 도 3G의 일반 구조에 해당하는 구조를 갖는 이황화 결합된 사량체 단백질로 조립하였다. 이 단백질은 KS-1/4의 항원 결합 활성, Fc 영역을 통해 Staph A 단백질에 결합하는 능력과, IL-4 및 GM-CSF의 시토킨 활성을 보유하였다. IL-4 활성은 CTLL-2 세포에서 삼중수소화된 티미딘 도입의 IL-4 의존적 자극으로 측정하였다. GM-CSF 활성은 32(D) GM 세포에서 삼중수소화된 티미딘 도입의 GM-CSF 의존적 자극으로 측정하였다. 몰 단위에서, KS-IL4-GMCSF의 IL-4 활성 및 GM-CSF 활성은 정제된 IL-4 및 GM-CSF와 유사하였다.
회합된 항체 서열 없이, 시토킨 IL-4 및 GM-CSF의 융합체는 다음과 같이 작제하였다. 쥐 IL-4는 쥐 비장 세포의 RNA로부터 PCR로 클로닝하였다. 정방향 프라이머는 TCTAGACC ATG GGT CTC AAC CCC CAG C(서열 번호 26)이고, 이 중 XbaI 부위 TCTAGA(서열 번호 26의 잔기 1-6)는 번역 개시코돈 ATG의 상류에 배치되며, 역방향 프라이머는 서열 CGA TAT CCC GGA CGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GCT CTT TAG GCT TTC CAG G(서열 번호 27)을 보유하며, 쥐 IL-4의 C-말단 아미노산 잔기를 암호화하는 TCG 코돈(안티코돈 CGA)의 바로 3'에 EcoRV 부위 GAT ATC(서열 번호 27의 잔기 2-7)가 배치된다. 서열 확인 후에, 그 천연 리더와 muIL-4 cDNA를 함유하는 XbaI-EcoRV 단편을 muGM-CSF cDNA를 포함하는 SamI-XhoI 단편에 결찰시켜 muIL-4와 muGM-CSF 사이의 융합체 연결부에 다음 서열을 제공한다: ATG GAT TAC TCG TCC GGG ATG GGA AAA GCA CCC GCC CGC(서열 번호 28). 여기서 muIL4의 C-말단 서열과 muGM-CSF의 N-말단 서열은 굵은 글씨로 표시되어 있고, G ATG GG(서열 번호 28의 잔기 17-22)는 EcoRV 평활 말단을 SmaI 평활 말단에 결찰시켜 생긴 서열이다. muIL4-muGMCSF를 암호화하는 생성된 DNA를 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 발현된 단백질은 SDS-PAGE로 분석하고, 겉보기 분자량이 45∼50 kD인 확산 밴드로서 전개시켰다. 몰 기준으로, IL4-GMCSF의 IL-4 활성 및 GM-CSF 활성은 정제된 IL-4 및 GM-CSF와 유사하였다.
실시예 18
림포액틴-KS-IL2를 암호화하는 DNA의 작제와 림포액틴-KS-IL2 단백질의 발현
케모킨은 구배를 형성하고 면역세포의 주화성을 매개하는 것으로 생각되는 시토킨의 특정 부류이다. 또한, 다른 시토킨과 달리, 케모킨은 표적 세포에서 특정 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 케모킨의 특징 중 하나는 자유 N-말단이 종종 활성에 필요하며, 따라서 융합 단백질이 작제되는 방식에 한계가 있다는 것이다.
케모킨인 시토킨 림포액틴, 항체 KS-1/4 및 시토킨 IL-2로 구성된 시토킨-항체-시토킨 융합 단백질을 작제하였다. 이 융합 단백질은 사량체이며, 2개의 상이한 폴리펩티드를 포함한다. 하나의 폴리펩티드는 KS-1/4 항체의 중쇄의 N-말단에 융합된 쥐 림포액틴과, 그 뒤에 C-말단의 IL-2로 구성된다. C-말단에서 IL-2와 KS-1/4 중쇄의 융합인 "KS-IL2 중쇄"가 이미 문헌[Gillies 등 (1992) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:1428]에 개시되어 있다. 또 다른 폴리펩티드는 KS-1/4 항체의 경쇄로 구성되었다.
쥐 림포액틴의 완전 암호화 서열은 Kelner 및 Zlotnik(Science 266:1395[1998])에 의해 공개되었다. 쥐 림포액틴과 KS-IL2 중쇄의 융합 단백질을 암호화하는 DNA를 작제하기 위해서, 정방향 프라이머 TCTAGAGCCACC ATG AGA CTT CTC CTC CTG AC(서열 번호 29)와 역방향 프라이머 GGA TCC CCC AGT CAG GGT TAC TGC TG(서열 번호 30)을 이용한 PCR을 쥐 림포액틴 cDNA에 적용하였다. 정방향 프라이머에서 XbaI 부위 TCTAGA(서열 번호 29의 잔기 1-6)는 번역 개시 코돈 ATG의 상류에 위치하고, 역방향 프라이머에서 쥐 림포액틴의 C-말단 아미노산 잔기를 암호화하는 GGG 코돈(안티코돈 CCC)의 바로 3'에 BamHI 부위 GGA TCC(서열 번호 30의 잔기 1-6)가 위치한다. PCR 단편의 클로닝 및 서열 확인 후에, 쥐 림포액틴 cDNA를 포함하는 XbaI-BamHI 단편을, 글리신과 세린 잔기가 풍부한 가요성 펩티드 링커를 암호화하는 BamHI-AflII 올리고뉴클레오티드 듀플렉스에 결찰시켰다. AflII 말단은 KS-IL2 중쇄의 성숙 N-말단 앞의 인공 AflII 부위에 결합시켰다. 2회 결찰로 생긴 연결부에서의 DNA 서열은 다음과 같다.
Figure 112002004074438-pct00005
여기서, GGATCC(서열 번호 31의 잔기 4-9) 및 CTTAAG(서열 번호 31의 잔기 48-53)는 각각 재구성에 사용된 2개의 제한 부위 BamHI 및 AflII이며, CCC는 쥐 림포액틴의 C-말단 아미노산 잔기를 암호화하고, CAG는 KS-IL2 중쇄의 성숙 N-말단을 암호화하며, GlySer-풍부 펩티드 링커의 아미노산 서열은 DNA 서열 위에 제시되어 있다. 쥐 림포액틴-KS-IL2 중쇄를 암호화하는 DNA를 발현 벡터 내로 클로닝한 다음, KS1/4 경쇄와 동시 발현시켰다.
발현된 림포액틴-KS-IL2 융합 단백질은 T 세포를 사용하여 Boyden 챔버 이동 분석으로 림포액틴 활성에 대해 시험한다(Leonard 등, [1999] Current Protocols in Immunology p.6.12.3). 대안적으로, NK 세포가 사용된다. 또는, 림포액틴 활성은 G-단백질 커플링된 수용체의 활성화에 반응한 칼슘 흐름에 대해 표준 세포 분석 에서 관찰한다(Maghazachi 등, FASEB J.[1997]; 11:765-74). 또한, 림포액틴-KS-IL2 융합 단백질을 시험하여, EpCAM에 결합하는 능력에 대해 분석에서 활성임을 확인하고, CTLL-2 세포 증식 분석과 같은 IL-2 활성 분석에서 활성이다.
참고 인용
상기 언급된 모든 공개 문헌은 그 전문을 본 출원에 참고로 인용한다.
등가물
본 발명은 취지 또는 이의 본질적 특성으로부터 벗어나지 않고 다른 특정 형태로 구체화할 수 있다. 따라서, 전술한 구체예들은 본 명세서에 개시된 발명을 제한하는 것이라기 보다는 예시적인 것으로 간주된다. 그러므로, 본 발명의 범위는 전술한 설명에 의해서보다는 첨부되는 청구항에 의해 지정되며, 청구범위의 등가 범위 및 의미 내에 있는 모든 변화는 본 발명에 포함되는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Gillies, Stephen Lo, Kin Ming <120> Multiple Cytokine Protein Complexes <130> LEX-010PC <150> 60/147,924 <151> 1999-08-09 <160> 32 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 582 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> Description of Artificial Sequence: murine p35 coding sequence for mature protein <400> 1 agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60 accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120 gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 180 ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 240 agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 300 atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360 aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 420 atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480 gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540 gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcct ga 582 <210> 2 <211> 1472 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: murine p40-IL-2 fusion protein coding sequence <400> 2 atgtgtcctc agaagctaac atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg 60 ttttgctggt gtctccactc atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag 120 aggtggactg gactcccgat gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg 180 aagaagatga catcacctgg acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga 240 ccctgaccat cactgtcaaa gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag 300 gcgagactct gagccactca catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca 360 ctgaaatttt aaaaaatttc aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact 420 ccggacggtt cacgtgctca tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca 480 agagcagtag cagttcccct gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg 540 cagagaaggt cacactggac caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg 600 atgtcacctg cccaactgcc gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc 660 agcagaataa atatgagaac tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag 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murine p40-GM-CSF fusion protein coding sequence <400> 3 atgtgtcctc agaagctaac atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg 60 ttttgctggt gtctccactc atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag 120 aggtggactg gactcccgat gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg 180 aagaagatga catcacctgg acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga 240 ccctgaccat cactgtcaaa gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag 300 gcgagactct gagccactca catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca 360 ctgaaatttt aaaaaatttc aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact 420 ccggacggtt cacgtgctca tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca 480 agagcagtag cagttcccct gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg 540 cagagaaggt cacactggac caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg 600 atgtcacctg cccaactgcc gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc 660 agcagaataa atatgagaac tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag 720 acccgcccaa gaacttgcag atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg 780 agtaccctga ctcctggagc actccccatt 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tcataatggc 1140 gagactctgc gccagaaacc tcctgtggga gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag 1200 ctctgcatcc tgcttcacgc cttcagcacc cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc 1260 tatctgagct ccgcctga 1278 <210> 6 <211> 1287 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: human Fc-p35 fusion protein coding sequence <400> 6 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcacgg 420 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 600 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660 tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggaagaaacc tccccgtggc cactccagac 720 ccaggaatgt tcccatgcct tcaccactcc caaaacctgc tgagggccgt cagcaacatg 780 ctccagaagg ccagacaaac tctagaattt tacccttgca cttctgaaga gattgatcat 840 gaagatatca caaaagataa aaccagcaca gtggaggcct gtttaccatt ggaattaacc 900 aagaatgaga gttgcctaaa ttccagagag acctctttca taactaatgg gagttgcctg 960 gcctccagaa agacctcttt tatgatggcc ctgtgcctta gtagtattta tgaagacttg 1020 aagatgtacc aggtggagtt caagaccatg aatgcaaagc ttctgatgga tcctaagagg 1080 cagatctttc tagatcaaaa catgctggca gttattgatg agctgatgca ggccctgaat 1140 ttcaacagtg agactgtgcc acaaaaatcc tcccttgaag aaccggattt ttataaaact 1200 aaaatcaagc tctgcatact tcttcatgct ttcagaattc gggcagtgac tattgacaga 1260 gtgacgagct atctgaatgc ttcctaa 1287 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: forward primer for construction of murine p40-IL-2 fusion protein <220> <221> misc_feature <222> (12)..(14) <223> translation initiation codon <400> 7 aagctagcac catgtgtcct cagaagctaa cc 32 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: reverse primer for construction of murine p40-IL-2 fusion protein <220> <221> misc_feature <222> Complement((7)..(9)) <223> translation stop codon <400> 8 ctcgagctag gatcggaccc tgcaggg 27 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence at the junction of murine p40-IL-2 fusion protein <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> encodes the C-terminal amino acid residue of murine p40 <220> <221> misc_feature <222> (26)..(28) <223> encodes the N-terminal amino acid residue of mature murine IL-2 <400> 9 ctgcagggtc cgatccccgg gtaaagcacc c 31 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA sequence at the junction of single-chain murine IL12 and GMCSF <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> encodes the C-terminal amino acid residue of murine p40 <220> <221> misc_feature <222> (26)..(28) <223> encodes the N-terminal amino acid residue of mature murine GMCSF <400> 10 ctgcagggtc cgatccccgg gaaaagca 28 <210> 11 <211> 2013 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: murine p35-linker-p40-IL-2 fusion protein coding sequence <400> 11 agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60 accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120 gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 180 ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 240 agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 300 atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360 aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 420 atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480 gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540 gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcgt cgagcggggg cagcgggggc 600 ggaggcagcg gcgggggcgg atccgccatg tgggtgctgg agaaagacgt ttatgttgta 660 gaggtggact ggactcccga tgcccctgga gaaacagtga acctcacctg tgacacgcct 720 gaagaagatg acatcacctg gacctcagac cagagacatg gagtcatagg ctctggaaag 780 accctgacca tcactgtcaa agagtttcta gatgctggcc agtacacctg ccacaaagga 840 ggcgagactc tgagccactc acatctgctg ctccacaaga aggaaaatgg aatttggtcc 900 actgaaattt taaaaaattt caaaaacaag actttcctga agtgtgaagc accaaattac 960 tccggacggt tcacgtgctc atggctggtg caaagaaaca tggacttgaa gttcaacatc 1020 aagagcagta gcagttcccc tgactctcgg gcagtgacat gtggaatggc gtctctgtct 1080 gcagagaagg tcacactgga ccaaagggac tatgagaagt attcagtgtc ctgccaggag 1140 gatgtcacct gcccaactgc cgaggagacc ctgcccattg aactggcgtt ggaagcacgg 1200 cagcagaata aatatgagaa ctacagcacc agcttcttca tcagggacat catcaaacca 1260 gacccgccca agaacttgca gatgaagcct ttgaagaact cacaggtgga ggtcagctgg 1320 gagtaccctg actcctggag cactccccat tcctacttct ccctcaagtt ctttgttcga 1380 atccagcgca agaaagaaaa gatgaaggag acagaggagg ggtgtaacca gaaaggtgcg 1440 ttcctcgtag agaagacatc taccgaagtc caatgcaaag gcgggaatgt ctgcgtgcaa 1500 gctcaggatc gctattacaa ttcctcatgc agcaagtggg catgtgttcc ctgcagggtc 1560 cgatccccgg gtaaagcacc cacttcaagc tctacagcgg aagcacagca gcagcagcag 1620 cagcagcagc agcagcagca gcacctggag cagctgttga tggacctaca ggagctcctg 1680 agcaggatgg agaattacag gaacctgaaa ctccccagga tgctcacctt caaattttac 1740 ttgcccaagc aggccacaga attgaaagat cttcagtgcc tagaagatga acttggacct 1800 ctgcggcatg ttctggattt gactcaaagc aaaagctttc aattggaaga tgctgagaat 1860 ttcatcagca atatcagagt aactgttgta aaactaaagg gctctgacaa cacatttgag 1920 tgccaattcg atgatgagtc agcaactgtg gtggactttc tgaggagatg gatagccttc 1980 tgtcaaagca tcatctcaac aagccctcaa taa 2013 <210> 12 <211> 1569 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: murine p35-linker-p40 fusion protein coding sequence <400> 12 agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60 accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120 gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 180 ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 240 agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 300 atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360 aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 420 atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480 gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540 gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcgt cgagcggggg cagcgggggc 600 ggaggcagcg gcgggggcgg atccgccatg tgggtgctgg agaaagacgt ttatgttgta 660 gaggtggact ggactcccga tgcccctgga gaaacagtga acctcacctg tgacacgcct 720 gaagaagatg acatcacctg gacctcagac cagagacatg gagtcatagg ctctggaaag 780 accctgacca tcactgtcaa agagtttcta gatgctggcc agtacacctg ccacaaagga 840 ggcgagactc tgagccactc acatctgctg ctccacaaga aggaaaatgg aatttggtcc 900 actgaaattt taaaaaattt caaaaacaag actttcctga agtgtgaagc accaaattac 960 tccggacggt tcacgtgctc atggctggtg caaagaaaca tggacttgaa gttcaacatc 1020 aagagcagta gcagttcccc tgactctcgg gcagtgacat gtggaatggc gtctctgtct 1080 gcagagaagg tcacactgga ccaaagggac tatgagaagt attcagtgtc ctgccaggag 1140 gatgtcacct gcccaactgc cgaggagacc ctgcccattg aactggcgtt ggaagcacgg 1200 cagcagaata aatatgagaa ctacagcacc agcttcttca tcagggacat catcaaacca 1260 gacccgccca agaacttgca gatgaagcct ttgaagaact cacaggtgga ggtcagctgg 1320 gagtaccctg actcctggag cactccccat tcctacttct ccctcaagtt ctttgttcga 1380 atccagcgca agaaagaaaa gatgaaggag acagaggagg ggtgtaacca gaaaggtgcg 1440 ttcctcgtag agaagacatc taccgaagtc caatgcaaag gcgggaatgt ctgcgtgcaa 1500 gctcaggatc gctattacaa ttcctcatgc agcaagtggg catgtgttcc ctgcagggtc 1560 cgatcctag 1569 <210> 13 <211> 2709 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: murine Fc-p35-linker-p40-IL-2 fusion protein coding sequence <400> 13 gagcccagag ggcccacaat caagccctgt cctccatgca aatgcccagc acctaacctc 60 ttgggtggac catccgtctt catcttccct ccaaagatca aggatgtact catgatctcc 120 ctgagcccca tagtcacatg tgtggtggtg gatgtgagcg aggatgaccc agatgtccag 180 atcagctggt ttgtgaacaa cgtggaagta cacacagctc agacacaaac ccatagagag 240 gattacaaca gtactctccg ggtggtcagt gccctcccca tccagcacca ggactggatg 300 agtggcaagg agttcaaatg caaggtcaac aacaaagacc tcccagcgcc catcgagaga 360 accatctcaa aacccaaagg gtcagtaaga gctccacagg tatatgtctt gcctccacca 420 gaagaagaga tgactaagaa acaggtcact ctgacctgca tggtcacaga cttcatgcct 480 gaagacattt acgtggagtg gaccaacaac gggaaaacag agctaaacta caagaacact 540 gaaccagtcc tggactctga tggttcttac ttcatgtaca gcaagctgag agtggaaaag 600 aagaactggg tggaaagaaa tagctactcc tgttcagtgg tccacgaggg tctgcacaat 660 caccacacga ctaagagctt ctcccggacc ccgggtaggg tcattccagt ctctggacct 720 gccaggtgtc ttagccagtc ccgaaacctg ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg 780 gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc actgctgaag acatcgatca tgaagacatc 840 acacgggacc aaaccagcac attgaagacc tgtttaccac tggaactaca caagaacgag 900 agttgcctgg ctactagaga gacttcttcc acaacaagag ggagctgcct gcccccacag 960 aagacgtctt tgatgatgac cctgtgcctt ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac 1020 cagacagagt tccaggccat caacgcagca cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt 1080 ctagacaagg gcatgctggt ggccatcgat gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc 1140 gagactctgc gccagaaacc tcctgtggga gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag 1200 ctctgcatcc tgcttcacgc cttcagcacc cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc 1260 tatctgagct ccgcgtcgag cgggggcagc gggggcggag gcagcggcgg gggcggatcc 1320 gccatgtggg tgctggagaa agacgtttat gttgtagagg tggactggac tcccgatgcc 1380 cctggagaaa cagtgaacct cacctgtgac acgcctgaag aagatgacat cacctggacc 1440 tcagaccaga gacatggagt cataggctct ggaaagaccc tgaccatcac tgtcaaagag 1500 tttctagatg ctggccagta cacctgccac aaaggaggcg agactctgag ccactcacat 1560 ctgctgctcc acaagaagga aaatggaatt tggtccactg aaattttaaa aaatttcaaa 1620 aacaagactt tcctgaagtg tgaagcacca aattactccg gacggttcac gtgctcatgg 1680 ctggtgcaaa gaaacatgga cttgaagttc aacatcaaga gcagtagcag ttcccctgac 1740 tctcgggcag tgacatgtgg aatggcgtct ctgtctgcag agaaggtcac actggaccaa 1800 agggactatg agaagtattc agtgtcctgc caggaggatg tcacctgccc aactgccgag 1860 gagaccctgc ccattgaact ggcgttggaa gcacggcagc agaataaata tgagaactac 1920 agcaccagct tcttcatcag ggacatcatc aaaccagacc cgcccaagaa cttgcagatg 1980 aagcctttga agaactcaca ggtggaggtc agctgggagt accctgactc ctggagcact 2040 ccccattcct acttctccct caagttcttt gttcgaatcc agcgcaagaa agaaaagatg 2100 aaggagacag aggaggggtg taaccagaaa ggtgcgttcc tcgtagagaa gacatctacc 2160 gaagtccaat gcaaaggcgg gaatgtctgc gtgcaagctc aggatcgcta ttacaattcc 2220 tcatgcagca agtgggcatg tgttccctgc agggtccgat ccccgggtaa agcacccact 2280 tcaagctcta cagcggaagc acagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcac 2340 ctggagcagc tgttgatgga cctacaggag ctcctgagca ggatggagaa ttacaggaac 2400 ctgaaactcc ccaggatgct caccttcaaa ttttacttgc ccaagcaggc cacagaattg 2460 aaagatcttc agtgcctaga agatgaactt ggacctctgc ggcatgttct ggatttgact 2520 caaagcaaaa gctttcaatt ggaagatgct gagaatttca tcagcaatat cagagtaact 2580 gttgtaaaac taaagggctc tgacaacaca tttgagtgcc aattcgatga tgagtcagca 2640 actgtggtgg actttctgag gagatggata gccttctgtc aaagcatcat ctcaacaagc 2700 cctcaataa 2709 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: forward primer for PCR amplification of murine p35 subunit of IL-12 <220> <221> misc_feature <222> (16)..(18) <223> translation initiation codon <400> 14 aagcttgcta gcagcatgtg tcaatcacgc tac 33 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: reverse primer for PCR amplification of murine p35 subunit of IL-12 <220> <221> misc_feature <222> Complement((10)..(12)) <223> translation stop codon <400> 15 ctcgagcttt caggcggagc tcagatagcc 30 <210> 16 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: coding sequence at the junction between p35 and p40 that comprise the murine single-chain IL-12 <220> <221> misc_feature <222> (8)..(10) <223> encodes the C-terminal amino acid residue of murine p35 <220> <221> misc_feature <222> (59)..(61) <223> encodes the N-terminal amino acid residue of mature murine p40 <400> 16 gagctccgcg tcgagcgggg gcagcggggg cggaggcagc ggcgggggcg gatccgccat 60 g 61 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Protein sequence at the junction between p35 and p40 that comprise the murine single-chain IL-12 <400> 17 Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala 1 5 10 15 <210> 18 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: coding sequence at the junction between murine p40 and the mature N-terminus of KS heavy chain <220> <221> misc_feature <222> (14)..(16) <223> encodes the C-terminal amino acid residue of murine p40 <220> <221> misc_feature <222> (71)..(73) <223> encodes the N-terminal residue of mature KS heavy chain <400> 18 ctgcagggtc cgatccccgg gatccggagg ttcagggggc ggaggtagcg gcggaggggg 60 ctccttaagc cag 73 <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: protein sequence at the junction between murine p40 and the mature N-terminus of KS heavy chain <400> 19 Pro Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Ser <210> 20 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: coding sequence at the junction between murine p35 and the KS light chain <220> <221> misc_feature <222> (8)..(10) <223> encodes the C-terminal amino acid residue of murine p35 <220> <221> misc_feature <222> (62)..(64) <223> encodes the N-terminal amino acid residue of the light chain <400> 20 gagctccgcg tcgagcgggg gcagcggggg cggaggcagc ggcgggggcg gatccttaag 60 cgag 64 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: protein sequence at the junction between murine p35 and the KS light chain <400> 21 Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu 1 5 10 15 Ser <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: forward primer for the PCR amplification of murine IL-4 <220> <221> misc_feature <222> (9)..(11) <223> translation initiation codon <400> 22 tctagaccat gggtctcaac ccccagc 27 <210> 23 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: reverse primer for the PCR amplification of murine IL-4 <220> <221> misc_feature <222> Complement((8)..(10)) <223> encodes the C-terminal amino acid residue of murine IL-4 <400> 23 cggatcccga gtaatccatt tgcatgatgc tctttaggct ttccagg 47 <210> 24 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: coding sequence at the junction of murine IL-4 and the mature KS-1/4 light chain <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> encodes the C-terminal serine residue of murine IL-4 <220> <221> misc_feature <222> (55)..(57) <223> encodes the N-terminal amino acid residue of the mature KS-1/4 light chain <400> 24 tcgggatccg gaggttcagg gggcggaggt agcggcggag ggggctcctt aagcgag 57 <210> 25 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: protein sequence at the junction of murine IL-4 and the mature KS-1/4 light chain <400> 25 Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Ser Glu <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: forward primer for the PCR amplification of murine IL-4 <220> <221> misc_feature <222> (9)..(11) <223> translation initiation codon <400> 26 tctagaccat gggtctcaac ccccagc 27 <210> 27 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: reverse primer for the PCR amplification of murine IL-4 <220> <221> misc_feature <222> Complement((13)..(15)) <223> encodes the C-terminal amino acid residue of murine IL-4 <400> 27 cgatatcccg gacgagtaat ccatttgcat gatgctcttt aggctttcca gg 52 <210> 28 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: coding sequence at the junction between murine IL-4 and murine GM-CSF <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> encodes the C-terminal sequence of muIL4 <220> <221> misc_feature <222> (28)..(39) <223> encodes the N-terminal sequence of muGM-CSF <400> 28 atggattact cgtccgggat gggaaaagca cccgcccgc 39 <210> 29 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: forward primer for the PCR amplification of murine lymphotactin <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> translation initiation codon <400> 29 tctagagcca ccatgagact tctcctcctg ac 32 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: reverse primer for the PCR amplification of murine lymphotactin <220> <221> misc_feature <222> Complement((7)..(9)) <223> encodes the C-terminal amino acid residue of murine lymphotactin <400> 30 ggatccccca gtcagggtta ctgctg 26 <210> 31 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: coding sequence at the junction between murine lymphotactin and KS-IL2 heavy chain <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> encodes the C-terminal amino acid residue of murine lymphotactin <220> <221> misc_feature <222> (55)..(57) <223> encodes the N-terminal amino acid residue of the KS-IL2 heavy chain <400> 31 cccggatccg gaggttcagg gggcggaggt agcggcggag ggggctcctt aagccag 57 <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: protein sequence at the junction between murine lymphotactin and KS-IL2 heavy chain <400> 32 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu 1 5 10 15 Ser

Claims (53)

  1. 면역글로불린 및 시토킨 융합 단백질을 포함하는 다작용성 시토킨-항체 융합 단백질로서,
    상기 면역글로불린은 중쇄 불변 영역(CH), 암 특이적 항원 또는 바이러스 항원과 면역학적으로 반응성인 중쇄 가변 도메인(VH) 및 면역글로불린 중쇄와 회합된 면역글로불린 경쇄를 포함하고,
    상기 시토킨 융합 단백질은 두개의 서로 다른 시토킨을 포함하되, 여기에서 제1 시토킨은 IL-12이고, 제2 시토킨은 IL-2이며, 이것은 IL-12의 p35 또는 p40 서브유닛의 아미노 또는 카르복실 말단에 공유 결합되며,
    상기 시토킨 융합 단백질은 상기 면역글로불린의 중쇄 불변 영역의 카르복실 말단에 융합된 것인 다작용성 시토킨-항체 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    IL-12의 p35 및 p40 서브유닛은 폴리펩티드 링커를 통해 융합된 것인 다작용성 시토킨-항체 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 시토킨 융합 단백질의 IL-2 및 IL-12가 폴리펩티드 링커를 통해 융합된 것인 다작용성 시토킨-항체 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 시토킨 융합 단백질 및 상기 면역글로불린의 중쇄 불변 영역은 폴리펩티드 링커를 통해 융합된 것인 다작용성 시토킨-항체 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 힌지 영역 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 것인 다작용성 시토킨-항체 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 Fc 영역인 다작용성 시토킨-항체 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 CH1 도메인을 더 포함하는 것인 다작용성 시토킨-항체 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 다작용성 시토킨-항체 융합 단백질을 암호화하는 핵산.
  9. 암 및 바이러스성 감염을 치료하기 위한 약학적 조성물로서, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 다작용성 시토킨-항체 융합 단백질과, 임의적으로 약학적 담체 또는 부형제를 포함하는 것인 조성물.
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