KR20190134832A - 종양 형성 치료방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종양 형성을 치료하는 방법으로서, IL-2 융합 단백질 및 하나 이상의 치료제를 투여함으로써 예를 들어, 방광암과 같은 종양 형성을 치료하며, 여기서 IL-2 융합 단백질은 종양 형성을 반드시 표적할 필요가 없는, 종양 형성을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

종양 형성 치료방법{METHODS FOR TREATING NEOPLASIA}

연방정부가 후원하는 연구하에 이루어진 발명에 대한 권리의 진술

본 연구는 미국 국립보건원으로부터 받은 하기의 승인, 승인번호: CA097550에 의해 지지된다. 정부는 본 발명에 특정한 권리를 갖는다.

미국에서, 방광암(이하, 요로 상피암이라고도 칭함)은 남성에서 4번째로 가장 흔한 타입의 암이며, 여성에서는 9번째로 가장 흔한 암이며, 해마다 70,500건의 추정되는 새로운 환자(남성 52,760명 및 여성 17,770명)가 발생하고, 14,680명이 사망(남성 10,410명 및 여성 4,270명)한다(Jemal, A. et al., CA Cancer J Clin, 60: 277-300, 2010). 국소 병변은 종종 면역치료법(Bacillus Calmette-Guerin), 방광경에 연결된 전기 소작 기구를 이용하거나, 또는 방광 절제술에 의해 치료된다. 진전된 질병은 종종 화학 요법 또는 화학 요법과 방사선의 조합에 의해 치료된다. 통상적인 단일 제제 화학 요법으로 치료받는 전이성 근육-침습성 방광암 환자에 있어서, 평균 생존률은 약 7 내지 8개월이다(Raghavan, D. et al., N Engl J Med, 322: 1129-1138, 1990). 전이성 방광암의 관리를 위해 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 독소루비신, 및 시스플라틴(MVAC) 및 젬시타빈 및 시스플라틴(GC)을 포함하는 조합 세포독성 요법의 도입을 이용한 경우에, 평균 생존 수치는 거의 두 배로 13개월을 넘으며, 약 20-25%는 3년 생존 기간을 갖는다(Loehrer, P. J. et al., J Clin Oncol, 10: 1066-1073, 1992; von der Maase, H. et al., J Clin Oncol, 18: 3068-3077, 2000). 그럼에도 불구하고, 암으로 인한 사망은 최종적으로 이러한 사례의 90% 이상에서 발생하며, 진전된/전이성 방광암에 대한 신약은 지난 20년간 승인된 적이 없다. 현재의 치료 선택의 제한된 효능을 고려해 볼 때, 부가적인 치료 양상이 요구된다.

이하 기술되는 바와 같이, 본 발명은 암 치료 방법을 제공한다. 바람직한 구현으로, 본 발명은 암에 걸린 환자에게 암을 치료하는 유료량으로 하나 이상의 치료제와 함께 IL-2 융합 단백질을 투여하는 것을 제공한다.

일 견지로, 본 발명은 일반적으로 유효량의 IL-2 융합 단백질 및 하나 이상의 치료제를 암 치료가 요구되는 대상자에게 투여하여, 암을 완화시키는 것을 포함하는, 대상자에서 암을 완화하는 방법을 특징으로 한다.

다른 견지로, 본 발명은 유효량의 IL-2 융합 단백질 및 치료제를 종양 치료가 요구되는 대상자에게 투여하여, 종양 용적을 감소시키는 것을 포함하는, 대상자에서 종양 부담을 감소시키는 방법을 제공한다.

다른 견지로, 본 발명은 유효량의 IL-2 융합 단백질 및 치료제를 화학-내성 암의 치료가 요구되는 대상자에게 투여하여, 화학-내성 암을 치료하는 것을 포함하는, 대상자에서 화학-내성 암을 치료하는 방법을 제공한다.

다른 견지로, 본 발명은 유효량의 IL-2 융합 단백질 및 치료제를 암에 대해 내구성이 있는 면역학적 메모리 반응을 유도하는 것이 요구되는 대상자에게 투여하여, 암에 대해 내구성이 있는 면역학적 메모리 반응을 유도하는 것을 포함하는, 대상자에서 암에 대해 내구성이 있는 면역학적 메모리 반응을 유도하는 방법을 제공한다.

다른 견지로, 본 발명은 유효량의 IL-2 융합 단백질 및 치료제를 암에 걸린 대상자의 생존을 증가시키는 것이 요구되는 대상자에게 투여하여, 대상자의 생존을 증가시키는 것을 포함하는, 암에 걸린 대상자의 생존을 증가시키는 방법을 제공한다.

다른 견지로, 본 발명은 IL-2 융합 단백질 및 하나 이상의 치료제를 함유하는 방광암 치료용 키트를 제공한다.

상기 어느 견지 또는 본 명세서에 기술된 본 발명의 어느 다른 견지의 다양한 구현에서, IL-2 융합 단백질은 암에 특이적으로 표적하거나 바인딩하지 않는다. 다른 구현으로, IL-2 융합 단백질은 T 세포 리셉터(TCR) 도메인을 포함한다. 다른 구현으로, T 세포 리셉터 도메인은 단쇄 T 세포 리셉터이다. 다른 구현으로, 하나 이상의 치료제는 아비라테론 아세테이트, 알트레타민, 안하이드로빈블라스틴, 아우리스타틴, 아자시티딘, AZD 8477, 벤다무스틴, 베바시주맵, 벡사로텐, 비칼루타미드, BMS184476, 2,3,4,5,6-펜타플루오로-N-(3-플루오로-4-메톡시페닐)벤젠 설폰아미드, 블레오마이신, 보르테조밉, N,N-디메틸-L-발릴-L-발릴-N-메틸-L-발릴-L-프롤릴-1-L프롤린-t-부틸아미드, 카켁틴, 카페시타빈, 세마도틴, 세툭시맵, 클로람부실, 시클로포스파미드, 3',4'-디데히드로-4'-데옥시-8'-노르빈-칼루코블라스틴, 도세탁솔, 도세탁셀, 시클로포스파미드, 카보플라틴, 카머스틴(BCNU), 시스플라틴, 크립토피신, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다카바진(DTIC), 닥티노마이신, 다사티닙, 다우노루비신, 돌라스타틴, 도비티닙, 독소루비신(아드리아마이신), 에피루비신, 에포틸론 B, 엘로티닙, 에리뷸린, 에토포사이드, 에버롤리머스, 5-플루오로우라실, 피나스테라이드, 플루타미드, 게피티닙, 겜시타빈, 히드록시우레아 및 히드록시우레아탁산, 이포스파미드, 인터페론 알파, 이매티닙, 이필리무맵, 이리노테칸, 라르고탁셀, 라파티닙, 레날리도미드, 리아로졸, 로나파닙, 로니다민, 로머스틴(CCNU), 메클로레타민(니트로겐 머스타드), 멜팔란, 미보불린 이세티오네이트, 리족신, 세르테네프, 스트렙토조신, 미토마이신, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 닐루타미드, 오나프리스톤, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파니투무맵, 파조파닙, 프랄라트렉세이트, 프레드니머스틴, 피리트렉심, 프로카바진, 피라졸로아크리딘, 리투식맵, RPR109881, 로미뎁신, 소라피닙, 스트라머스틴 포스페이트, 서니티닙, 타목시펜, 타소너민, 탁솔, 테모졸로미드, 토포테칸, 트랜스투주맵, 트레티노인, 트리메트렉세이트, 베뮤라페닙, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 설페이트, 빈플루닌 및 보리노스태트로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 다른 구현으로, 하나 이상의 치료제는 시스플라틴을 포함하는 겜시타빈 및 플래티늄계 화합물로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 다른 구현으로, 암은 방광암, 요도의 요로 상피암, 신우요관암, 신장암, 유방암, 결장암, 두경부암, 폐암, 전립선암, 교아종, 골육종, 지방육종, 연부조직육종, 난소암, 흑색종, 간암, 식도암, 췌장암 및 위암으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 다른 구현으로, 암은 방광암 또는 요로 상피암이다. 다른 구현으로, 암은 화학-내성이다. 다른 구현으로, IL-2 융합 단백질 및 하나 이상의 치료제는 약 7-14일 이내에 투여된다. 다른 구현으로, IL-2 융합 단백질 및 하나 이상의 치료제는 약 3-5일 이내에 투여되거나 또는 동시에 투여된다. 부가적인 구현으로, IL-2 융합 단백질은 ALT-801이며, 하나 이상의 치료제는 시스플라틴이다. 다른 구현으로, 하나 이상의 치료제는 겜시타빈이다. 부가적인 구현으로, IL-2 융합 단백질은 암 세포를 특이적으로 표적한다. 일부 구현에서 IL-2 융합 단백질은 암 세포의 표면상의 p53 펩타이드/HLA 복합체를 특이적으로 표적한다.

본 발명에 의해 정의된 조성물 및 물품은 분리되거나 또는 하기 제공된 실시예에 따라 제조된다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 상세한 설명 및 청구범위로부터 분명해질 것이다.

정의

"종양 부담(tumor burden)"는 "종양 부하(tumor load)"라고도 불리며, 이는 체내에서 암세포의 수, 종양의 크기 또는 암의 양을 의미한다.

"IL-2 융합 단백질"은 제2 폴리펩타이드에 융합된 전장 IL-2 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성적인 프레그먼트를 함유하는 폴리펩타이드를 의미한다. 제2 폴리펩타이드는 표적 폴리펩타이드, 즉, 이의 항체 또는 항원 바인딩 프레그먼트; 이의 T 세포 리셉터(TCR) 또는 펩타이드 바인딩 프레그먼트; 이의 리셉터 또는 리간드 바인딩 도메인; 등일 수 있으며, 여기서 제2 폴리펩타이드는 IL-2 융합 단백질을 암 세포에 표적하거나 향하게 한다. 변형적으로, 제2 폴리펩타이드는 비-표적 폴리펩타이드, 즉, 암세포에 IL-2 융합 단백질을 특이적으로 표적하지 않거나 향하게 하지 않는 폴리펩타이드일 수 있다.

"T 세포 리셉터(TCR) 도메인"은 적절한 MHC 또는 HLA 분자에 존재하는 동족 펩타이드에 바인딩하는데 필수적인 T 세포의 모든 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. TCR 도메인의 비-제한적 예는 미국 특허 제 7,456,263호; 미국 특허 제 6,534,633호; 및 미국 특허 출원 공개 제 US2003/0144474호; 및 미국 특허 출원 공개 제 US2011/0070191호에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.

"ALT-801"은 IL-2와 인간 p53 펩타이드(aa 264-272) HLA-A*0201에 바인딩할 수 있는 TCR 도메인 사이의 융합체(c264scTCR-IL-2)를 의미한다. 신호 서열을 포함하는 ALT-801의 예시적인 아미노산 서열은 다음과 같다:

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신호 서열이 없는 성숙 ALT-801의 예시적인 아미노산 서열은 다음과 같다:

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dpvvqgvngfeaefsksnssfhlrkasvhwsdsavyfcvlsedsnyqliwgs

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ALT-801을 암호화하는 예시적인 핵산은 다음과 같다:

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"MART-1scTCR/IL-2"는 IL-2와 HLA-A*0201의 콘텍스트에 존재하는 MART-1 펩타이드(aa 27-35)에 바인딩할 수 있는 TCR 도메인 사이의 융합체를 의미한다. 신호 서열을 포함하는 MART-1scTCR/IL-2의 예시적인 아미노산 서열은 다음과 같다:

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신호 서열이 없는 성숙 MART-1scTCR/IL-2의 예시적인 아미노산 서열은 다음과 같다:

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MART-1scTCR/IL-2를 암호화하는 예시적인 핵산은 다음과 같다:

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"제(agent)"는 어느 소분자 화학적 화합물, 항체, 핵산 분자, 또는 폴리펩타이드, 또는 이의 프레그먼트를 의미한다.

"치료제(therapeutic agent)"는 암 치료에 사용되는 어느 화학치료제 또는 생물치료제를 의미한다. 치료제의 비제한적인 예시적 예는 아비라테론 아세테이트, 알트레타민, 안하이드로빈블라스틴, 아우리스타틴, 아자시티딘, AZD 8477, 벤다무스틴, 베바시주맵, 벡사로텐, 비칼루타미드, BMS184476, 2,3,4,5,6-펜타플루오로-N-(3-플루오로-4-메톡시페닐)벤젠 설폰아미드, 블레오마이신, 보르테조밉, N,N-디메틸-L-발릴-L-발릴-N-메틸-L-발릴-L-프롤릴-1-L프롤린-t-부틸아미드, 카켁틴, 카페시타빈, 세마도틴, 세툭시맵, 클로람부실, 시클로포스파미드, 3',4'-디데히드로-4'-데옥시-8'-노르빈-칼루코블라스틴, 도세탁솔, 도세탁셀, 시클로포스파미드, 카보플라틴, 카머스틴(BCNU), 시스플라틴, 크립토피신, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다카바진(DTIC), 닥티노마이신, 다사티닙, 다우노루비신, 돌라스타틴, 도비티닙, 독소루비신(아드리아마이신), 에피루비신, 에포틸론 B, 엘로티닙, 에리뷸린, 에토포사이드, 에버롤리머스, 5-플루오로우라실, 피나스테라이드, 플루타미드, 게피티닙, 겜시타빈, 히드록시우레아 및 히드록시우레아탁산, 이포스파미드, 인터페론 알파, 이매티닙, 이필리무맵, 이리노테칸, 라르고탁셀, 라파티닙, 레날리도미드, 리아로졸, 로나파닙, 로니다민, 로머스틴(CCNU), 메클로레타민(니트로겐 머스타드), 멜팔란, 미보불린 이세티오네이트, 리족신, 세르테네프, 스트렙토조신, 미토마이신, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 닐루타미드, 오나프리스톤, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파니투무맵, 파조파닙, 프랄라트렉세이트, 프레드니머스틴, 피리트렉심, 프로카바진, 피라졸로아크리딘, 리투식맵, RPR109881, 로미뎁신, 소라피닙, 스트라머스틴 포스페이트, 서니티닙, 타목시펜, 타소너민, 탁솔, 테모졸로미드, 토포테칸, 트랜스투주맵, 트레티노인, 트리메트렉세이트, 베뮤라페닙, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 설페이트, 빈플루닌 및 보리노스태트로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

"화학-내성(chemo-resistant)"은 하나 이상의 치료제에 내성적으로 되는 암 또는 암세포를 의미한다.

"완화(ameliorate)"는 질병의 발달 또는 진행을 감소, 억제, 약화, 축소, 억류 또는 안정화시키는 것을 의미한다.

"종양에 대해 내구성이 있는 면역학적 메모리 반응을 유도하는 것"은 종양 또는 암 성장의 후속적인 저항 또는 재성장에 대해 치료-유도된 저항성을 의미한다.

"변화(alteration)"는 본 명세서에 기재된 바와 같은 당해 기술분야에 알려진 표준 방법에 의해 검출시 유전자 또는 폴리펩타이드의 발현 수준 또는 활성의 변화(증가 또는 감소)를 의미한다. 본 명세서에 사용된, 변화는 발현 수준의 10% 변화, 바람직하게는 발현 수준의 25% 변화, 보다 바람직하게 40% 변화, 그리고 가장 바람직하게 50% 이상의 변화를 포함한다.

"유사체(analog)"는 동일하진 않으나, 유사한 기능적 또는 구조적 특징을 갖는 분자를 의미한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 유사체는 상응하는 자연-발생 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 보유하나, 자연 발생 폴리펩타이드에 비해 유사체의 기능을 증진시키는 특정 생화학적 변형을 갖는다. 이러한 생화학적 변형은 예를 들어, 리간드 바인딩과 같은 변화없이 유사체의 프로테아제 내성, 멤브레인 투과성 또는 반감기를 증가시킬 수 있다.

본 명세서에서, "포함하다(comprise)", "포함하는(comprising)", "함유하는(containing)" 및 "갖는(having)" 등은 미국 특허법에 주어진 의미를 가질 수 있으며, "포함하다(include)", "포함하는(including)" 등을 의미할 수 있으며; "필수적으로 구성된(consisting essentially of)" 또는 "필수적으로 구성되다(consists essentially)"는 마찬가지로 미국 특허법에 주어진 의미를 가지며, 이러한 용어는 개방형으로, 인용된 기본적 또는 새로운 특성이 인용된 것 이상의 존재에 의해 변화되지 않는 한, 인용된 것 이상의 존재를 허용하나, 종래 기술 구현을 배제한다.

"검출(detect)"은 검출되는 분석물의 존재, 부재 또는 양을 확인하는 것을 칭한다.

"검출가능한 표지(detectable label)"는 관심있는 분자에 결합될 경우에, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단을 통해 검출가능한 래터(latter)를 제공하는 조성물을 의미한다. 예를 들어, 유용한 표지는 방사성 동위원소, 자성 비드, 금속 비드, 콜로이드 입자, 형광 염료, 고전자 밀도 시약, 효소(예, ELISA에 통상적으로 사용되는), 바이오틴, 디그옥시제닌 또는 합텐을 포함한다.

"질병"은 세포, 조직 또는 기관의 정상적인 기능에 손상을 주거나 방해하는 어느 컨디션 또는 질환을 의미한다. 질병의 예는 암을 포함한다.

"유효량(effective amount)" 또는 "치료량(therapeutic amount)"은 미치료된 환자에 비해 질병의 증상을 치료, 억제 또는 완화하는데 필요한 양을 의미한다. 질병의 치료학적 처리를 위해 본 발명을 수행하는데 사용되는 활성 화합물(들)의 유효량은 투여방식, 나이, 체중 및 대상자의 일반 건강에 따라 달라진다. 궁극적으로, 의사 또는 수의사는 적절한 양 및 투여 요법을 결정할 것이다. 이러한 양은 "유효"량으로 지칭된다.

"프레그먼트(fregment)"는 폴리펩타이드 또는 핵산 분자의 일부를 의미한다. 이러한 일부는, 바람직하게 레퍼런스 핵산 분자 또는 폴리펩타이드의 전체 길이의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 함유한다. 프레그먼트는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 함유할 수 있다.

"하이브리드화(hybridization)"는 상보적인 뉴클레오베이스 사이에 왓슨-크릭, 후그스틴 또는 리버스 후그스틴 수소결합이 존재할 수 있는 수소 결합을 의미한다. 예를 들어, 아데닌 및 티민은 수소결합의 형성을 통해 쌍을 이루는 상보적인 뉴클레오베이스이다.

"분리된 폴리뉴클레오타이드(isolated polynucleotide)"는 본 발명의 핵산 분자가 유도되는 유기체의 자연 발생 게놈에서 유전자의 측면에 배치되는 유전자로부터 유리된 핵산(예, DNA)을 의미한다. 이에 따라, 상기 용어는 예를 들어, 벡터; 자가복제 플라스미드 또는 바이러스; 또는 원핵 또는 진핵 생물의 게놈 DNA에 편입되는 재조합 DNA; 또는 다른 서열에 독립적으로 개별 분자로 존재하는(예, PCR 또는 제한효소 다이제스션에 의해 생성되는 cDNA 또는 게노믹 또는 cDNA 프레그먼트) 재조합 DNA를 포함한다. 또한, 상기 용어는 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자뿐만 아니라, 부가적인 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.

"분리된 폴리펩타이드(isolated polypeptide)"는 자연적으로 수반되는 성분들로부터 분리된 본 발명의 폴리펩타이드를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩타이드는 적어도 60중량%가 단백질 및 이와 자연적으로 연결된 자연 발생 유기 분자로부터 유리되는 경우에 분리된다. 바람직하게, 제조물은 본 발명의 폴리펩타이드가 적어도 75중량%, 보다 바람직하게 적어도 90중량%, 그리고 가장 바람직하게 적어도 99중량% 존재한다. 본 발명의 분리된 폴리펩타이드는 예를 들어, 천연 공급원으로부터 추출에 의해, 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 핵산의 발현에 의해; 또는 화학적으로 상기 단백질을 합성함으로써 획득될 수 있다. 순도는 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 HPLC 분석에 의한 것과 같이 어느 적절한 방법에 의해 측정될 수 있다.

"마커(marker)"는 질병 또는 질환과 관련된 발현 수준 또는 활성의 변화를 갖는 어느 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다.

본 명세서에 사용된, "제제를 획득하는(obtaining an agent)"에서 "획득(obtaining)"은 제제를 합성, 구입 또는 습득하는 것을 포함한다.

"프라이머 세트"는 예를 들어, PCR에 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 세트를 의미한다. 프라이머 세트는 적어도 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 또는 그 이상의 프라이머로 구성될 수 있다.

본 명세서에 사용된, "재조합"은 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 세포를 이용하여 생성된 폴리펩타이드에 대한 언급을 포함한다. 세포는 일반적으로 적절한 분리된 핵산 서열의 도입에 의해 유전적으로 변화되기 때문에 재조합 폴리펩타이드를 생성한다. 또한, 상기 용어는 이종성 핵산의 도입 또는 그 세포에 고유하지 않은 형태로 본래의 핵산의 변환에 의해 변형되거나, 또는 이렇게 변형된 세포로부터 세포가 유도되는 세포 또는 핵산, 또는 벡터에 대한 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 본래(재조합되지 않은) 형태로 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 본래 형태로 발견되는 유전자의 돌연변이를 발현하거나, 또는 비정상적으로 발현되거나, 언더-발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는 본래의 유전자를 발현한다.

"감소"는 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%의 네거티브 변화를 의미한다.

"레퍼런스(reference)"는 스탠다드 또는 컨트롤 컨디션을 의미한다.

"레퍼런스 서열"은 서열 비교를 위한 기준으로 사용되는 정의된 서열이다. 레퍼런스 서열은 예를 들어, 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 세그먼트, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열과 같은 명시된 서열의 서브셋 또는 전체일 수 있다. 폴리펩타이드에 있어서, 레퍼런스 폴리펩타이드 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 16 아미노산, 바람직하게 적어도 약 20 아미노산, 보다 바람직하게 적어도 약 25 아미노산, 그리고 보다 바람직하게 약 35 아미노산, 약 50 아미노산, 또는 약 100 아미노산일 것이다. 핵산에 있어서, 레퍼런스 핵산 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 50 뉴클레오타이드, 바람직하게 적어도 약 60 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게 적어도 약 75 뉴클레오타이드, 그리고 보다 바람직하게 약 100 뉴클레오타이드 또는 약 300 뉴클레오타이드 또는 대략 이들 사이의 어느 정수일 것이다.

"특이적으로 바인딩"한다는 것은, 특정 마커를 발현하는 암세포를 인지하고 바인딩하나, 시료에서 다른 세포를 실질적으로 인지하지 않고 바인딩하지 않는 융합 단백질을 의미한다.

"실질적으로 동일한(substantially identical)"이란, 레퍼런스 아미노산 서열(예, 본 명세서에 기재된 아미노산 서열들 중 어느 하나) 또는 핵산 서열(예, 본 명세서에 기재된 핵산 서열들 중 어느 하나)에 대해 적어도 50% 동일성을 나타내는 폴리펩타이드 또는 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게, 이러한 서열은 비교용으로 사용된 서열에 대해 아미노산 수준 또는 핵산에서 적어도 60%, 보다 바람직하게 80% 또는 85%, 그리고 보다 바람직하게 90%, 95% 또는 99% 동일하다.

서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어(예, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 이용하여 측정된다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및/또는 다른 변형에 대해 상동성 정도를 부여함으로써 동일하거나 유사한 서열을 매치시킨다. 보존적 치환은 전형적으로 하기 그룹내에서의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소루신, 루신; 아스파트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성 정도를 측정하는 예시적인 방법으로, BLAST 프로그램이 사용될 수 있으며, e^-3과 e^-100 사이의 가능성 스코어는 근접하게 관련된 서열을 나타낸다.

"대상자(subject)"는 이에 한정하는 것은 아니나, 인간 또는 소, 말, 개, 양 또는 고양이와 같은 비-인간 포유류를 포함하는 포유류를 의미한다.

본 명세서에 사용된, "종양(tumor)"은 악성 또는 양성에 관계없이 모든 신생 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암(precancerous) 및 암 세포 및 조직을 칭한다.

본 명세서에 제공되는 범위는 그 범위내의 모든 값에 대하여 속기인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1-50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 구성되는 그룹으로부터 어느 수, 수의 조합 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.

본 명세서에 사용된, 용어 "치료(treat, treating, treatment)" 등은 이와 관련된 질병 및/또는 증상을 감소 또는 완화시키는 것을 칭한다. 배제하는 것은 아니나, 질병 또는 컨디션의 치료는 이와 관련된 질병, 컨디션 또는 증상이 완전히 제거되는 것을 요구하지 않는 것으로 인식될 것이다.

본 명세서에 사용된, 용어 "또는(or)"은, 특별히 언급하지 않는 한 또는 정황상 명백한 경우가 아니면, 포괄적인 것으로 이해된다. 본 명세서에 사용된, 용어 "하나(a, an)" 및 "상기 또는 그(the)"는, 특별히 언급하지 않는 한 또는 정황상 명백한 경우가 아니면, 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.

본 명세서에 사용된 용어 "약(about)"은 예를 들어, 평균의 2 표준편차 이내인 것과 같이, 당해 기술분야에서 정상 허용 범위 내에 있는 것으로 이해된다. "약"은 언급된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 이내인 것으로 이해될 수 있다. 정황상 명백한 경우가 아니면, 본 명세서에 제공된 모든 수치는 용어 약으로 변경될 수 있다.

본 명세서에서 변수의 어느 정의시 화학기의 리스트의 언급은 어느 단일 기 또는 열거된 기들의 조합으로서 변수의 정의를 포함한다. 본 명세서에서 변수 또는 견지에 대한 구현의 언급은 어느 단일 구현 또는 어느 다른 구현 또는 이의 일부와의 조합으로서의 구현을 포함한다.

본 명세서에 제공된 어느 조성물 또는 방법은 본 명세서에 제공된 다른 조성물 및 방법들 중 어느 하나 이상과 조합될 수 있다.

도 1은 겜시타빈 + 시스플라틴; ALT-801; 또는 겜시타민 + 시스플라틴 + ALT-801의 2 치료 사이클을 적용한 누드 마우스에서 40일에 걸쳐 피하 인간 UMUC-14 방광 종양 이종이식의 평균 종양 용적의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2는 11일 휴식 후 겜시타빈 + 시스플라틴; 겜시타빈 + MART-1scTCR/IL-2; ALT-801; 또는 겜시타빈 + ALT-801의 별도의 2 치료 사이클을 적용한 누드 마우스에서 48일에 걸쳐 피하 인간 UMUC-14 방광 종양 이종이식의 평균 종양 용적의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 화학치료 요법과 결합된 ALT-801 및 MART-1scTCR/IL-2가 누드 마우스에서 피하 인간 방광 UMUC-14 이종이식의 성장에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 4는 화학치료 요법과 결합된 ALT-801 및 MART-1scTCR/IL-2가 마우스 체중에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 5는 화학치료 요법과 결합된 ALT-801 및 MART-1scTCR/IL-2가 누드 마우스에서 피하 인간 방광 KU7P 이종이식의 성장에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 6은 화학치료 요법과 결합된 ALT-801 및 MART-1scTCR/IL-2가 마우스 체중에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 7은 겜시타빈, ALT-801 및 MART-1scTCR/IL-2이 누드 마우스에서 피하 인간 방광 KU7P 이종이식의 성장에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 8은 ALT-801 또는 PBS(컨트롤)로 처리된 동소(orthotopic) MB49luc 종양을 가진 알비노 C57BL/6 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 9a는 ALT-801 또는 PBS(컨트롤)로 처리된 동소(orthotopic) MB49luc 종양을 가진 C57BL/6 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다. 도 9b는 나이브(naive) 또는 ALT-801 처리된 C57BL/6 마우스의 치료시 동소 MB49luc 종양의 생체 발광을 나타내는 이미지이다.
도 10은 ALT-801 또는 PBS(컨트롤)로 처리된 동소 MB49luc 종양을 가진 C57BL/6 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 11은 ALT-801로 처리된 MB49luc 표재성 방광 종양을 가진 C57BL/6 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 12a 및 12b는 4주 동안에, 일주일에 1회("1X4")(도 12a) 또는 일주일에 2회("2X4")(도 12b) ALT-801로 처리된 MB49luc 표재성 방광 종양을 가진 C57BL/6 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 13은 PBS 또는 ALT-801로 처리한 다음에 정상 및 MB49luc 종양을 함유한 C57BL/6 마우스로부터 얻어진 H&E-염색된 방광 조직 부분의 이미지이다.
도 14a 및 14b는 PBS 또는 ALT-801로 처리한 다음에 정상 및 MB49luc 종양을 함유한 C57BL/6 마우스로부터 얻어진 PMBCs(도 14a) 및 비장(도 14b)에서 면역세포 집단을 나타내는 그래프이다.
도 15는 PBS 또는 ALT-801로 처리한 다음에 시험 10일에서 MB49luc 종양을 함유한 C57BL/6 마우스로부터 얻어진 방광 조직 부분에서 염색된 마크로파지를 나타내는 이미지이다.
도 16a 및 16b는 PBS 또는 ALT-801로 처리한 다음에 정상(도 16a) 및 MB49luc 종양을 함유한 C57BL/6 마우스(도 16b)로부터 얻어진 마크로파지 수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 17a 및 17b는 PBS 또는 ALT-801로 처리한 다음에 정상 및 MB49luc 종양을 함유한 C57BL/6 마우스에서 소변 IFNγ(도 17a) 및 TNFα(도 17b)의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 18은 IL-2가 아닌 ALT-801을 이용한 치료가 동소 MB49luc 방광 종양을 함유한 마우스의 생존을 연장시켰음을 보여주는 그래프이다. C57BL/6 마우스(10-11주령)는 방광의 폴리리신 전처리 후, 시험 0일에 MB49luc 세포(3x10⁴cells/bladder)로 방광내 주입되었다. ALT-801(1.6mg/kg, n=8), rIL2(0.42mg/kg, n=8) 또는 PBS(100μL, n=8)를 MB49luc 종양 세포 주입 후 7, 10, 14 및 17일에 방광내 투여하였다. 시험 그룹들을 비교한 캐플란-마이어 생존 곡선을 나타내었다.
도 19a-19d는 마우스 MB49luc 동소 방광 종양을 함유한 C57BL/6 마우스에서 ALT-801 효능에 미치는

, NK, CD4 및 CD8 세포 고갈의 영향을 나타낸다. 도 19a는 PBS 투여된 마우스와 비교한 ALT-801 투여된 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다. 도 19b는 PBS 투여된 마우스와 비교한, SD 2, 3, 6, 9, 13 및 16에서 ALT-801 투여되고, 항-NK 항체(Ab)(클론 PK136, 100μL에 함유된 250μg)의 i.p. 주사에 의해 NK 세포 고갈이 이루어지도록 처리된 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다. 도 19c는 PBS 투여된 마우스와 비교한, SD 6, 9, 13 및 16에서 ALT-801 투여되고, 클로포솜(Clophosome)(150μL/dose)의 i.p. 주사에 의해

고갈이 이루어지도록 처리된 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다. 도 19d는 PBS 투여된 마우스와 비교한, SD 2, 3, 6, 9, 13 및 16에서 ALT-801 투여되고, 항-CD4 Ab(클론 GK1.5, 100μL에 함유된 250μg) 및 항-CD8 Ab(클론 53-6.72, 100μL에 함유된 250μg)의 i.p. 주사에 의해 CD4 및 CD8 세포 고갈이 이루어지도록 처리된 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다. 캐플란-마이어 생존 플롯을 그래프로 나타내었다. P 값 ≤ 0.05은 유의한 것으로 간주되었다.
도 20은 마우스 MB49luc 동소 방광 종양을 함유한 C57BL/6 마우스에서 혈중 MDSC 수준의 변화를 나타내는 그래프이다. 막대는 평균±SEM을 나타낸다. * 컨트롤과 비교한 P ≤ 0.05.
도 21은 MB49luc 동소 방광 종양을 함유한 마우스 방광에서 마크로파지의 면역조직화학 염색의 이미지이다. SD 0에서, 마우스에 MB49luc 주입을 하였으며, 11일 후에 PBS 또는 ALT-801(1.6mg/kg)을 i.v. 처리하였다. 24시간 처리 후에 마우스를 희생시키고, 방광을 염색을 위해 수집하였다. 방광 섹션을 항-iNOS(M1 마크로파지 마커), 및 항-MMP-9(M2 마크로파지 마커) 및 항-F4/80(마크로파지 판 마커) Abs로 염색하였다. 대표적인 조직 부분을 나타내었다. 배율 200x.
도 22는 C57BL/6 마우스에서 혈청 IFN-γ 수준의 ALT-801-매개 도입시 면역 세포 서브셋의 역할을 나타낸 그래프이다. C57BL/6 암컷에 항-CD4(GK1.5), 항-CD8(53-6.72), 및/또는 항-NK1.1(PK136) ABs로 복강 주사하여 면역세포 서브셋을 고갈시켰다. 그 다음, 마우스를 1.2mg/kg ALT-801로 정맥내 주사하고, 혈청 IFN-γ 수준을 24시간 후에 ELISA에 의해 측정하였다. 막대는 평균±표준오차를 나타낸다(n=5/그룹).
도 23은 시험관 내에서 MB49luc 세포 성장에 미치는 IFN-γ의 영향을 나타낸 그래프이다. MB49luc 세포(2 x 10⁵/well)를 1ng/mL 또는 10ng/mL에서 2일간 IFN-γ가 함유된 RPMI-10에서 배양하였다. 세포자멸 MB49luc 세포는 플로우 사이토메트리를 수행한 다음 아넥신(Annexin) V 염색에 의해 측정되었다.
도 24는 ALT-801이 MB49luc 종양 세포에 대하여 LAK 세포 세포독성을 유도하였음을 나타내는 그래프이다. 림포카인 활성화 킬러(LAK) 세포는 마우스 비장세포로부터 제조되었으며, 그 후 3일간 20nM ALT-801에 의한 시험관 내 활성화되었다. LAK 세포(4 x 10⁶/well)를 0-50nM ALT-801이 함유된 RPMI-10에서 PKH67-표지된 MB49luc(4 x 10⁵/well)로 배양하였다. 배양된 세포를 24시간 후에 수거하고, 0.001mg/mL PI로 표지하였다. 사멸된 PI⁺ MB49luc 세포의 퍼센트를 플로우 사이토메트리에 의해 검출하였다.
도 25는 MB49luc 종양 함유 마우스에서 겜시타빈이 비장세포 MDSC 수준을 감소시켰음을 보여주는 그래프이다. 암컷 C57BL/6 마우스에 MB49luc 세포(1 x 10⁶/마우스)로 정맥내 주사하였다. 10일 후, 한 그룹의 마우스에 40mg/kg 겜시타빈을 정매내 처리하였다. 3일 후에 마우스를 희생시키고, 비장세포를 분리하였다. 비장세포 Gr1+CD11b+MDSCs의 퍼센트를 플로우 사이토메트리에 의해 측정하였다.
도 26은 자기 정렬(magnetic sorting) 후 MDSC 순도의 플로우 사이토메트리 분석을 나타낸다. MACS 컬럼에 의해 양성적으로 선택된 세포를 항-CD11b-PE 및 항-Gr1-FITC 항체로 염색하였다. 이후에 양자 전이(adoptive transfer)된 CD11b+Gr1+세포는 이후에 96%의 순도를 가졌다.
도 27은 MDSC 양자 전이 후에 면역 세포에 의해 ALT-801이 종양 세포 사멸을 유도하였음을 나타내는 그래프이다. MDSC 수용 마우스(블랙) 또는 비이클 컨트롤 마우스(화이트)로부터 얻어진 비장세포를 수집하고, 50nM ALT-801과 함께 배양하여 LAK 세포로 활성화하였다. 그 다음, LAK 이펙터 세포를 MB49luc 표적 세포와 혼합하여 이들의 세포융해 활성을 평가하였다. ALT-801 활성화가 이루어지지 않은 프레쉬 비장세포로부터 얻어진 데이터뿐만 아니라, 사멸 단계 중에 ALT-801의 첨가 후에 평가된 세포융해 활성을 또한 도시하였다. ***: P<0.001. n=2.
도 28은 요로상피암에서 겜시타빈 및 시스플라틴과 함께 투여된 ALT-801의 단계 I/II 임상 시험에 대한 시험 디자인 및 치료 스킴을 나타낸다.
도 29는 요로상피암에서 겜시타빈 및 시스플라틴과 함께 투여된 ALT-801의 단계 I/II 임상 시험에 대한 시험 디자인 및 치료 스킴을 나타낸다.
도 30은 요로상피암에서 겜시타빈 및 시스플라틴과 함께 투여된 ALT-801의 단계 I/II 임상 시험에 대한 환자 인구 통계학 및 질병 상태를 나타낸다.
도 31은 요로상피암에서 겜시타빈 및 시스플라틴과 함께 투여된 ALT-801의 단계 I/II 임상 시험에서 종양 평가를 나타낸다.
도 32는 요로상피암에서 겜시타빈 및 시스플라틴과 함께 투여된 ALT-801의 단계 I/II 임상 시험에서 ALT-801 투여된 환자에서 객관적인 반응을 나타낸다.
도 33은 요로상피암에서 겜시타빈 및 시스플라틴과 함께 투여된 ALT-801의 단계 I/II 임상 시험에서 ALT-801 투여된 환자에서 무진행 생존율(progression free survival)을 나타낸다.
도 34는 ALT-801 투여된 환자에서 증가된 혈청 IFN-γ 수준을 나타내는 그래프이다(좌측 패널: 0.04mg/kg ALT-801; 우측 패널: 0.06mg/kg ALT-801).

본 발명은 IL-2 융합 단백질 및 하나 이상의 치료제를 포함하는 치료학적으로 유효량의 약학 조성물을 대상자(예, 인간과 같은 포유류)에게 투여하는 것을 포함하는 암 또는 이의 증상 치료 방법을 제공한다. 따라서, 일 구현은 암 또는 이의 증상으로부터 고통받거나 민감한 대상자를 치료하는 방법이다. 상기 방법은 암을 치료하는 조건하에서 암 또는 이의 증상을 치료하기에 충분한 치료량의 IL-2 융합 단백질 및 하나 이상의 치료제를 포유류에 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 치료학적으로 유효량의 IL-2 융합 단백질 단독을 대상자(예, 인간과 같은 포유류)에게 투여하는 것을 포함하는, 암 또는 이의 증상의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 방광암(본 명세서에서 요로상피암이라고도 함)에 걸린 대상자에게 하나 이상의 치료제와 함께 IL-2 융합 단백질을 투여하는 것은, 1) 상기 암을 완화시키고, 2) 종양 크기를 감소시키고, 3) 대상자의 생존율을 증가시키고, 그리고 4) 암에 대해 내구성이 있는 면역학적 메모리 반응을 유도하였다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 또한, 하나 이상의 치료제와 결합된 IL-2 융합 단백질은 화학-내성 방광암 치료에 효과적인 것으로 발견되었다. 더욱이, 암세포 또는 암조직을 특이적으로 표적하지 않는 IL-2 융합 단백질이 암세포를 특이적으로 표적하는 IL-2 융합 단백질과 동등하게 방광암 치료에 효과적인 것으로 발견되었다. 특정 구현으로, IL-2 융합 단백질 단일요법은 화학-내성 암을 포함하는 방광암 치료에 효과적인 것으로 발견되었다.

IL-2를 포함하는 면역치료가 특정 타입의 암에 대한 항-종양 면역력을 증진시키는 효과적인 접근법으로 잘 확립되어 있다. IL-2는 T 및 B 세포, 단핵구, 마크로파지, 림포카인-활성화 킬러 세포(LAK) 및 NK 세포를 포함하는 다수의 면역 세포 타입에 자극 효과를 갖는다(Waldmann, T. A., Nat Rev Immunol, 6: 595-601, 2006). 내구성이 있는 치료적 항종양 반응을 제공하는 이의 능력에 기초하여, 재조합 인간 IL-2(Proleukin®)의 전신성 투여는 전이성 흑색종 또는 신장 세포 암종에 걸린 환자를 치료하는데 승인되었다(Rosenberg, S. A. et al., Ann Surg, 210: 474-484; discussion 484-475, 1989; Fyfe, G. et al., J Clin Oncol, 13: 688-696, 1995; and Atkins, M. B. et al., J Clin Oncol, 17: 2105-2116, 1999). 불행하게도, 이러한 치료와 관련된 상당한 독성은 종양 부위에서 효과적인 투여를 달성하는 것을 어렵게 하며, 치료될 수 있는 집단을 제한한다. 예를 들어, 용인된 투여량에서 IL-2를 이용한 전신성 치료는 사실상 모든 치료된 환자에서 림포이드 활성화를 유도하나, 항-종양 반응은 이들 개체 중 소수에서 관찰되었다(Rosenberg, S. A. et al., Ann Surg, 210: 474-484; discussion 484-475, 1989). 결과적으로, 고 투여 IL-2의 사용은 경험있는 자에게 특성화된 프로그램으로 제한되며, 이는 일반적으로 반응적이고 우수한 장기 기능을 가진 환자에게 제공된다(Tarhini, A. A. et al., Curr Opin Investig Drugs, 6: 1234-1239, 2005). 반면에 덜 독성적이고 보다 편리한 저 투여 IL-2 치료는 보다 낮은 반응 속도를 생성하며 전이성 종양을 치료하는데 효과적인 것으로 나타났다(Yang, J. C. et al., J Clin Oncol, 21: 3127-3132, 2003). IL-2를 이용한 표재성 방광암 환자의 국소 치료는 다수의 임상 시험에서 종양 퇴화를 제공하며, 연장된 퇴화 자유시간을 제공하는 것으로 나타났다(Den Otter, W. et al., J Urol, 159: 1183-1186, 1998; 및 Den Otter, W. et al., Cancer Immunol Immunother, 57: 931-950, 2008). 단계 2 시험에서, 시스플라틴-내화 진행/전이성 요로상피암종(이의 65%가 방광암이었음)에 걸린 환자에게 전신성 IL-2 투여는, 단일 제제 또는 조합 구조 화학치료법을 이용하여 관찰된 6-7개월에 비해 10개월 이상의 평균 생존율을 제공하였으며, 이는 IL-2 치료에 대한 방광암종 민감성의 추가 증거를 제시한다(Kim, J. et al., Urol Oncol, 21: 21-26, 2003; 및 Gallagher, D. J. et al., Cancer, 113: 1284-1293, 2008). 그러나, 이러한 환자에서 IL-2 유도 독성은 현저하였으며, 치료 요법을 제한하였다(Kim, J. et al., Urol Oncol, 21: 21-26, 2003). 따라서, IL-2의 치료 효과를 증진시키고, 현재 승인된 지시보다 임상적 이점을 타협하지 않고 이의 독성을 감소시키며 이의 이용성을 확장시키는 획기적인 전략이 현저히 요구된다.

또한 흑색종을 특이적으로 표적하는 치료학적 전략이 유효한 것으로 나타났다. 그러나, 방광암에 대한 분자 및 유전학적 마커가 잘 특성화되어있음에도 불구하고, 방광암에 대한 분자 표적 제제를 이용한 임상 시험은 거의 없다. 진전된/전이성 방광암에 걸린 환자에서 HER-2/neu 또는 VEGF 또는 경구 EGFR 안타고니스트에 대한 치료 항체(Abs)를 이용한 최근의 임상 시험은, 표준 화학치료에 비해 향상된 효능/독성 프로필을 나타내지 못하였으며(Vaughn, D. J., J Clin Oncol, 25: 2162-2163, 2007; Hussain, M. H. et al., J Clin Oncol, 25: 2218-2224, 2007; 1 Hahn, N. M. et al., J Clin Oncol, 27: 5018, 2009; 및 Philips, G. K. et al., BJU Int, 101: 20-25, 2008), 이는 이러한 표적이 방광암에 적절하지 못함을 나타낸다. 흥미롭게도, 유전학적 연구는, 방광암 종양의 발병은 주로, 2개의 다르지만 중첩되는 경로로 구성되는 것을 보여준다 (Wu, X. R., Nat Rev Cancer, 5: 713-725, 2005). 비-근육 침습성 방광 종양은 단순 및 결정성 과증식, 및 섬유아세포 성장인자 리셉터 3, Ha-Ras 및 PIK3CA 유전자에서 빈번한 은닉처 돌연변이(harbor frequent mutations)로부터 발생되는 것으로 사료된다. 근육-침습성 방광암 종양은 원위치 편평 상피내암(flat carcinoma in situ), 중증 실어증(severe dysphasia)으로부터 기원하거나 새로이 형성되는 것으로 사료된다. 이들 종양의 적어도 50%는 종양 서프레서 p53 및/또는 망막아종 유전자의 결합을 함유한다(Rosser, C. J. et al., Expert Rev Anticancer Ther, 1: 531-539, 2001). 이러한 발견과 일치하는, p53의 상승된 종양 과발현은 방광암 환자에서 전이성 질병의 진행과 관련이 있다(van Rhijn, B. W. G. et al., Cancer Research, 64: 1911-1914, 2004). 또한, 이는 방광암의 형질변환 마우스 모델에 의해 뒷받침된다. 요로상피에서 (p53 단백질에 바인딩하며 이를 불활성화시키는) SV40 라지 T 항원을 발현하는 마우스는 상피내암 및 확률론적인 근육-침습성 암종을 발달시키며, 한편 Ha-ras를 과발현하는 마우스는 과형성 및 표재성 질병을 발달시킨다(Zhang, Z. T. et al., Oncogene, 20: 1973-1980, 2001; 및 Zhang, Z. T. et al., Cancer Res, 59: 3512-3517, 1999).

출원인은 치료학적 개입을 위해 표적으로서 종양 세포에서 p53 단백질을 확인하였다. p53 유전자의 미스센스 돌연변이의 매우 고-빈번 발생 및 종양 세포에서 p53 단백질의 후속적인 과발현은 진전된 또는 전이성 방광암종에 걸린 환자에서 종양 항원으로서 p53을 표적할 기회를 생성한다. p53은 세포의 증식을 저지하기 위해 작용하는 세포내 종양 억제 단백질이다(Levine, A. J. et al., Nature, 351: 453-456, 1991; 및 Vousden, K. H. 및 Prives, C., Cell, 120: 7-10, 2005). 이는 돌연변이될 경우에, 종양 세포의 비정상적인 증식 및 축적을 억제하는 이의 능력을 상실한다(Levine, A. J. et al., Nature, 351: 453-456, 1991; 및 Vousden, K. H. 및 Prives, C., Cell, 120: 7-10, 2005). 결과적으로, p53 돌연변이/과발현은 종양 공격성 및 재발과 관련되며, 방광암을 포함하는 다양한 암 타입에서 보다 낮은 총 생존율 및 화학치료 개입에 대한 내성과 연관된다(van Rhijn, B. W. G. et al., Cancer Research, 64: 1911-1914, 2004; Strano, S. et al., Oncogene, 26: 2212-2219, 2007; 및 Goebell, P. J. et al., Urol Oncol, 28: 377-388, 2010). 3,400명의 방광암 환자의 최근 분석은 종양 시편에서의 검출가능한 p53 과발현과 종양 등급 및 종양 단계 사이의 매우 현저한 상관성을 나타내었다(Goebell, P. J. et al., Urol Oncol, 28: 377-388, 2010). 종양에서 p53의 과발현은 또한 종양 진행 및 진전된 방광암 환자의 저조한 생존율과 현저히 관련되었다. 단지 소량의 본래의 고유 p53만이 정상 조직에서 검출가능하였기 때문에, 종양과 정상 조직에서 p53의 다른 디스플래이는 이러한 단백질을 치료학적으로 표적할 기회를 생성한다. 그러나, p53은 세포내 단백질이며, 세포 표면에 디스플래이되지 않으므로, Ab-기반 제제에 접근가능하지 못하다. 다른 세포내 단백질과 같이, p53은 프로세싱되고, p53 펩타이드는 HLA 분자의 콘텍스트내의 세포 표면에 제시된다. 출원인은, 다양한 인간 종양 세포 및 조직의 표면에서 고 수준으로 디스플래이되는 HLA-A*0201에 의해 제시되나, 정상 조직은 이러한 복합체의 검출가능한 수준을 제시하지 못하는 p53의 펩타이드 에피토프(aa264-272)를 확인하였다. 이 에피토프는 잘 돌연변이되지 않는 p53의 영역내에 존재하기 때문에, 이의 세포 표면 디스플래이는 p53을 과발현하는 종양에 대한 광범위계 표적으로 제공된다. 출원인은, 인간 종양 세포의 표면에서 p53 펩타이드 에피토프의 디스플래이에 부분적으로 기초하는 방법을 청구한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "치료(treat, treating, treatment, therapy)" 등은 이와 관련된 질병 및/또는 증상을 감소 또는 완화시키는 것을 칭한다. 불가능한 것은 아니나, 질병 또는 컨디션 치료는 이와 관련된 질병, 컨디션 또는 증상이 완전히 제거되는 것을 요구하지는 않는다.

본 명세서에 사용된, 용어 "예방(prevent, preventing, prevention, prophylactic treatment)" 등은 질병 또는 컨디션을 가지고 있지 않으나 질병 또는 질환이 발달될 위험이 있거나 민감한 대상자에서 질병 또는 컨디션이 발달될 가능성을 감소시키는 것을 칭한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "효과(effective, efficacy, efficacious)" 등은 이와 관련된 질병, 질환 및/또는 증상을 치료, 억제 또는 완화하는 능력을 칭한다.

(예방적 치료를 포함하는) 본 발명의 치료 방법은 일반적으로 포유류, 특히 인간을 포함하는 치료가 요구되는 대상자(예, 동물, 인간)에게 하나 이상의 치료제와 함께 치료학적 유효량의 IL-2 융합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 치료는 암, 특히 방광(또는 요로상피)암으로부터 고통을 받거나, 상기 암을 가지거나 민감하거나 또는 상기 암에 걸릴 위험이 있는 대상자, 특히 인간에게 적절히 투여될 것이다. "위험이 있는(at risk)" 이러한 대상자들의 검출은 진단 시험 또는 대상자 또는 건강 관리 부양자의 의견에 의한 어느 객관적 또는 주관적 측정(예, 유전학적 시험, 효소 또는 단백질 마커, (본 명세서에 정의된) 마커, 가족력 등)에 의해 이루어질 수 있다.

일 구현으로, 본 발명은 치료 진행을 모니터링하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 암, 특히 방광암과 관련된 질병 또는 이의 증상으로부터 고통받거나 또는 민감한 대상자에서, 진단 마커(마커)(예, 단백질 또는 이의 지표 등) 또는 진단 측정(예, 스크린, 어세이, 종양 크기 평가를 위한 스캔, 수술적으로 제거된 조직/생검에서 조직병리학적 평가 등)의 수준을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 대상자는 상기 질병 또는 이의 증상을 치료하기에 충분한 치료학적 유효량의 본 발명의 화합물을 투여받는다. 마커 또는 상기 방법에거 검출되는 측정치는 대상자의 질병 상태를 확립하기 위해, 건강한 정상 컨트롤 또는 다른 고통받는 환자들에서의 알려진 수준의 마커 또는 측정치와 비교될 수 있다. 바람직한 구현으로, 대상자에서 제2 수준의 마커 또는 측정치는 제1 수준의 측정 보다 늦은 시점에 검출되며, 그리고 두 수준은 질병의 경과 또는 치료 효능을 모니터링하기 위해 비교된다. 특정 바람직한 구현으로, 대상자에서 마커 또는 측정치의 전처리 수준은 본 발명에 따른 치료를 시작하기 전에 측정되며; 그 다음, 이러한 마커 또는 측정치의 전처리 수준은 처리 시작 후에 대상자에서 마커 또는 측정치의 수준과 비교되어 치료 효능을 검출할 수 있다. 특정 바람직한 구현으로, 치료 효능의 모니터링은 고형 종양 위원회에서 응답 평가 기준(RECIST, Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Committee) 1.1에 의해 제시된 새로운 국제 기준을 이용하여 평가되는 암의 객관적 반응에 기초하여 수행된다. 다른 구현으로, 치료 효능은 대상자 총 생존율 또는 무진행 생존 시간 또는 생존율에 기초하여 평가된다.

약학 조성물

본 명세서에 기재된 방법은 IL-2 융합 단백질 단독 또는 하나 이상의 치료제와 함께 투여하는 것에 의존한다. 본 발명의 IL-2 융합 단백질은 완전한 성숙 IL-2 폴리펩타이드 또는 제2 폴리펩타이드에 융합된 이의 생물학적으로 활성적인 프레그먼트를 포함한다. 특정 구현으로, 제2 폴리펩타이드는 암세포상의 에피토프, 펩타이드, 리간드 또는 부분에 특이적으로 바인딩하는 점에서 표적 기능을 갖는다. 따라서, 표적 폴리펩타이드의 비제한적인 예는 항체 및 이의 항원 바인딩 프레그먼트, T 세포 리셉터 및 이의 펩타이드 바인딩 프레그먼트, 및 이의 리셉터 및 리간드 바인딩 프레그먼트를 포함한다. 암세포에 특이적으로 바인딩할 수 있는 어느 폴리펩타이드가 표적 IL-2 융합 단백질에서 제2 폴리펩타이드로 제공될 수 있다.

예기치 않게도, 본 발명은 비-표적 IL-2 융합 단백질이 상술한 방법에서 표적 IL-2 융합 단백질 정도로 효과적인 것을 제공한다. 비-표적 IL-2 융합 단백질의 제2 폴리펩타이드는 항체 및 이의 항원 바인딩 프레그먼트, T 세포 리셉터 및 이의 펩타이드 바인딩 프레그먼트, 및 리셉터 및 이의 리간드 바인딩 프레그먼트를 포함한다. 그러나, 이러한 경우에, 제2 폴리펩타이드는 치료될 암세포에 특이적으로 바인딩하지 않는다. 바람직한 구현으로, 제2 폴리펩타이드는 T 세포 리셉터(TCR)이며, 가장 바람직하게 단쇄 T 세포 리셉터(scTCR)이다. 제2 폴리펩타이드에 적절한 TCR 분자의 예는 미국 특허 제 7,456,263호; 미국 특허 제 6,534,633호; 미국 특허 출원 제 US2003/0144474호; 및 미국 특허 출원 공개 제 US2011/0070191호에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.

특히, 치료 분자로서 현저히 증가된 이용성을 갖는, TCR 융합 및 컨주게이트 복합체가 생성되었다. 특히, 증가된 세포 표면 체류 시간 및 향상된 약물 동력학 프로필을 갖는 새로운 부류의 융합 분자가 생성되었으며, 예를 들어 이들 분자는 보다 긴 혈장 반감기를 갖는다. 또한, 본 발명은 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드 또는 분자에 공유결합된 TCR 분자를 포함하는 이러한 복합체를 암호화하는 발현 벡터를 제공하며, 그리고 이러한 융합 및 컨주게이트 복합체의 제조 방법 및 용도 및 발현 벡터 및 컨주게이트 복합체를 제공한다.

T 세포는 이들의 세포 표면에서 발현되는 T 세포 리셉터에 의해 세포의 표면에 제시되는 항원을 인지한다. TCRs은 이황화 결합 헤테로다이머이며, 대부분 α 및 β 사슬 글리코프로테인으로 구성된다. T 세포는 B 세포에서 작동하는 항체 다양성을 생성하기 위해 이러한 메커니즘과 유사한 이들의 리셉터 분자에서 다양성을 생성하기 위한 메커니즘을 사용한다(Janeway and Travers; Immunobiology 1997). 면역글로블린 유전자와 마찬가지로, TCR 유전자는 T 세포의 발달 중에 재배열하는 세그멘트로 구성된다. TCR 폴리펩타이드는 아미노 말단 가변부 및 카르복시 말단 불변부로 구성된다. 카르복시 말단부는 리셉터로 차지될 경우에 트랜스-멤브레인 앵커로서 작용하며, 세포내 신호전달에 참여하지만, 가변부는 항원의 인지를 담당한다. TCR α 사슬은 단지 V 및 D 세그먼트로 암호화되는 가변부를 함유하나, β 사슬은 부가적인 연결(J) 세그먼트를 함유한다. 이러한 세그먼트의 재배열 및 가변부의 돌연변이 및 성숙은 다양한 TCR 분자의 컨텍스트에 디스플래이되는 믿을 수 없을 정도로 다수의 다양한 항원들을 인지할 수 있는 TCRs의 다양한 레퍼토리를 일으킨다.

특정 항원을 인지하는 고 특이적 T 세포 리셉터(TCR)를 생성하기 위한 기술이 앞서 개발되어왔다. 예를 들어, 본 명세서에 참고자료로 편입된 게류중인 미국 특허출원 U.S.S.N. 08/813,781호 및 미국 특허 제 6,534,633호; 및 국제 공개 PCT/US98/04274 및 PCT/US99/24645, 및 본 명세서에 기재된 참고문헌들에는 특이적 TCRs를 제조 및 사용하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 특정 특이적 TCRs은 가용성, 단일-사슬 TCRs(scTCR)로서 재조합 방법에 의해 생성되었다. scTCRs의 제조 및 사용 방법은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된 국제 공개 PCT/US98/20263에 기재되어 있다. 이러한 TCRs 및 scTCRs은 그 결과 형성된 TCRs 및 scTCRs이 치료에 유용성을 제공하는 융합체 또는 컨주게이트를 생성하도록 변형될 수 있다. 본 발명의 TCR 복합체는 재조합적으로 생성된 TCR 또는 scTCR 암호 영역에 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드 또는 분자를 암호화하는 유전자를 유전학적으로 융합하여 TCR 융합 복합체를 생성함으로써 생성될 수 있다. 변형적으로, 또한 TCR 또는 scTCRs은 생물학적으로 활성적인 분자와 화학적으로 컨주게이션되어 TCR 컨주게이트 복합체가 생성될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "융합 분자(fusion molecule)"는 IL-2와 그리고 재조합, 화학적 또는 다른 적절한 방법에 의해 공유결합된(즉, 융합된) TCR 도메인과 같은 제2 폴리펩타이드를 의미한다. 필요에 따라, 융합 분자는 펩타이드 링커 서열을 통해 하나 또는 여러 부위에 융합될 수 있다. 변형적으로, 펩타이드 링커는 융합 분자의 구성시 도움을 주는데 사용될 수 있다. 본 발명의 융합 분자는 이들을 보다 우수한 치료학적 분자로 만드는 향상된 특성을 나타낸다.

본 명세서에 사용된 용어 "증가된 세포 표면 체류 시간(increased cell surface residency time)"은, 청구된 융합 분자가, 융합 분자의 어느 성분이 단독으로 행하는 것보다 더 긴 기간 동안 세포 표면에서 단백질과 관련되는 것을 나타냄을 의미한다. 특정 구현으로, 세포 표면 체류 시간은 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상 증가된다.

본 명세서에 사용된 용어 "혈청 반감기(serum half-life)" 또는 "혈장 반감기(plasma half-life)"는 체내에서 주어진 농도 또는 양의 정확히 절반으로 감소되는 경우에 본 발명의 융합 분자의 농도 또는 양에 필요한 시간량을 나타내는 것으로 의도된다. 본 발명의 융합 분자는 융합 분자내에 있는 것이 아닌 IL-2에 비해 현저히 보단 더 긴 반감기를 나타낸다. 예를 들어, 개시된 분자의 혈청 반감기는, 융합 단백질의 일부가 아닌 경우에 청구된 분자의 성분들의 혈청 반감기에 비해 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1000%, 1250%, 1500%, 1750%, 2000% 또는 그 이상 증가될 수 있다.

"폴리펩타이드(polypeptide)"는 바람직하게 크기에 관계없이 어느 20 천연 아미노산으로 필수적으로 구성된 어느 폴리머를 칭한다. 용어 "단백질(protein)"은 상대적으로 큰 단백질을 언급하는 경우에 종종 사용되며, 그리고 "펩타이드(peptide)"는 작은 폴리펩타이드를 언급하는 경우에 종종 사용되며, 이러한 용어의 사용은 당해 기술분야에서 종종 중복된다. 용어 "폴리펩타이드(polypeptide)"는 다른 언급이 없는 한 일반적으로 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드를 칭한다. 일반적으로 본 발명에 유용한 펩타이드는, 원심분리 또는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 표준 분자 사이징 기술에 의해 평가시, 일반적으로 약 0.1-100KD 또는 약 1000KD까지이며, 바람직하게 약 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30 및 50KD 일 것이다.

부가적으로, IL-2 융합 단백질은 녹색 형광 단백질, 피코에리트린, 시콤(cychome) 또는 텍사스 레드와 같은 형광 표지; 또는 예를 들어, 요오드-131, 이트륨-90, 레늄-188 또는 비스무스-212와 같은 진단 또는 이미징 시험에 적절한 검출가능하게 표지된 분자일 수 있다. 이펙터 또는 태그를 포함하는 단백질 제조 및 사용에 관한 설명을 예를 들어 다음과 같은 문헌을 참조바란다: Moskaug, et al. J. Biol. Chem. 264, 15709 (1989); Pastan, I. et al. Cell 47, 641, 1986; Pastan et al., Recombinant Toxins as Novel Therapeutic Agents, Ann. Rev. Biochem. 61, 331, (1992); "Chimeric Toxins" Olsnes and Phil, Pharmac. Ther., 25, 355 (1982); 공개된 PCT 출원 제 WO 94/29350호; 공개된 PCT 출원 제 WO 94/04689호; 및 미국 특허 제 5,620,939호.

IL-2 융합 단백질의 특정 예는 다음과 같다: IL-2에 융합된 c264sc-TCR(ALT-801)과 같은 sc-TCR은 포유류 세포를 트랜스펙션함으로써 생성될 수 있다. c264scTCR/IL-2 단백질 융합 복합체는 인간 HLA 항원; HLA-2.1의 컨텍스트에 존재하는 인간 와일드-타입 p53 종양 억제 단백질로부터 얻어진 프로세싱된 펩타이드 프레그먼트를 인지한다. c264scTCR 및 이의 펩타이드 리간드는 Card et al., Cancer Immunol Immunother (2004) 53: 345, Belmont, et al. Clin Immunol. (2006) 121:29, and Wen, et al. Cancer Immunol Immunother. (2008) 57:1781. 에 기재되어 있다. c264scTCR에 의해 인지되는 인간 p53(aa264-aa272) 펩타이드 서열(본 명세서에서 264 펩타이드 또는 p264라고도 함)은 LLGRNSFEV이다. 종양 억제 단백질 p53의 발현은 악성 세포에서 상향조절된다. 본 발명의 특정 구현으로, c264scTCR/IL-2 단백질 융합체에 의한 이들의 표면에서 p53(aa264-aa272) 펩타이드/HLA-A2 복합체를 제시하는 종양 세포의 인지는 종양 세포에 대한 면역 활성을 촉진하여, 항암 치료 활성을 제공한다. 이러한 표적된 인지는 방광 종양을 포함하는 p53을 과발현하는 종양에 걸린 대상자를 치료하는데 유익할 수 있다.

본 발명의 다른 융합 분자는 MART-1, gp100, MAGE, HIV, 헤파타이티스 A, B 또는 C, CMV, AAV, LCMV, JCV, 인플루엔자, HTLV 및 다른 바이러스로부터 유래된 것들을 포함하는, 종양 관련 또는 바이러스 펩타이드 항원에 특이적인 다른 scTCRs에 융합된 IL-2를 포함하며, 여기서 scTCR은 직접 또는 링커를 통해 IL-2에 연결된다.

또한, IL-2 융합 단백질은 부가적인 폴리펩타이드 태그를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 태그는 6xHIS와 같이, 생리학적 pH에서 전하를 함유하는 폴리펩타이드이다. 이러한 예에서, TCR 융합 또는 컨주게이트 복합체는, 약 pH 6-9에서 6xHIS 태그를 특이적으로 바인딩할 수 있는 Ni-세파로즈와 같이 상업적으로 구입가능한 메탈로-세파로즈 매트릭스에 의해 정제될 수 있다. EE 에피토프 및 myc 에피토프는, 에피토프가 하나 이상의 상업적으로 구입가능한 모노클로날 항체에 의해 특이적으로 바인딩될 수 있는 적절한 단백질 태그의 추가적인 예이다.

상술한 바와 같이, 예를 들어 IL-2 및 제2 폴리펩타이드와 같은 본 명세서에 기재된 융합 단백질의 성분들은 IL-2 융합 단백질이 의도하였던 기능을 갖는다면 거의 어떠한 방식으로 준비될 수 있다. 특히, 융합 단백질의 각 성분은 필요에 따라 적어도 하나의 적절한 펩타이드 링커 서열에 의해 다른 성분으로부터 이격될 수 있다. 더욱이, 성분들은 IL-2가 이의 리셉터에 바인딩하고 최적의 면역자극 활성을 제공하고 그리고/또는 제2 폴리펩타이드가 이의 리셉터/리간드에 바인딩하고 이의 활성을 매개할 수 있도록 링커에 의해 배치될 수 있다. 또한, 융합 단백질은 예를 들어, 융합 단백질의 확인 및/또는 정제를 촉진하기 위하여 태그를 포함할 수 있다.

본 발명의 IL-2 융합 단백질은 IL-2의 혈장 반감기를 (IL-2 단독의 혈장 반감기 이상으로) 증가시키거나 또는 예를 들어, 세포 표면 리셉터와 같은 세포 표면 단백질에 바인딩하는 융합 분자에 대한 표면 체류 시간을 (IL-2 단독의 표면 체류 시간 이상으로) 증가시키는 예기치 않은 능력을 갖는다. 본 발명의 IL-2 융합 단백질은 분자의 혈장 반감기를 증가시키고, 분자의 표면 체류 시간을 증가시켜, 이에 따라 청구된 분자에 대한 효능의 현저한 증가를 이끌 수 있는 능력을 가질 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 IL-2 융합 단백질의 제조는 예를 들어, 중합효소 연쇄 증폭 반응(PCR), 플라스미드 DNA의 제조, 제한효소를 이용한 DNA의 분할, 올리고뉴클레오타이드의 제조, DNA의 라이게이션, mRNA의 분리, 적절한 세포내로의 DNA의 도입, 숙주의 형질전환 또는 트랜스펙션, 숙주의 배양을 포함하는 것과 같이 본 명세서에 기재된 방법에 의해 그리고 알려진 재조합 DNA 기술에 의해 수행될 수 있다. 또한, 융합 분자는 카오트로픽 제제(chaotropic agent) 및 잘 알려진 전기영동, 원심분리 및 크로마토그래피 방법을 이용하여 분리 및 정제될 수 있다. 이러한 방법과 관련된 설명은 일반적으로 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. (1989); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989)를 참조바란다.

또한, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 특히 DNA 서열을 제공한다. 바람직하게, 상기 DNA 서열은 파지, 바이러스, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, YAC 또는 에피솜과 같은 염색체외 복제에 적합한 벡터에 의해 운반된다. 특히, 원하는 융합 단백질을 암호화하는 DNA 벡터가 본 명세서에 기재된 제조방법을 용이하게 하고 융합 단백질의 현저한 양을 얻는데 사용될 수 있다. DNA 서열은 적절한 발현 벡터, 즉, 삽입된 단백질-암호 서열의 전사 및 번역에 필수적인 요소를 함유하는 벡터내로 삽입될 수 있다. 다양한 숙주-벡터 시스템은 단백질-암호 서열을 발현하는데 사용될 수 있다. 이들은 바이러스(예, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 등)로 감염된 포유류 세포 시스템을 포함하며; 바이러스(예, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충세포; 이스트 함유 이스트 벡터 또는 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질변형된 박테리아와 같은 미생물을 포함한다. 사용되는 숙주-벡터 시스템에 따라, 다수의 적절한 전사 및 번역 요소 중 하나가 사용될 수 있다. 일반적으로 상기 Sambrook et al., 및 상기 Ausubel et al. 을 참조바란다.

일반적으로, 본 발명에 따른 바람직한 DNA 벡터는 IL-2를 암호화하는 서열에 작용적으로 연결된 TCR 사슬을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열의 도입을 위한 제1 클로닝 사이트를 5'에서 3' 방향으로 포함하는 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

대부분의 예에서, 상기 DNA에 의해 암호화되는 각각의 융합 단백질 성분은 "카세트(cassette)" 형태로 제공되는 것이 바람직할 것이다. 용어 "카세트(cassette)"는, 각 성분이 표준 재조합 방법에 의해 다른 성분에 대해 쉽게 치환될 수 있는 것을 의미한다.

TCR 융합 복합체를 암호화하는 벡터를 제조하기 위해, TCR 분자를 암호화하는 서열은 적절한 라이게이즈의 사용으로 IL-2를 암호화하는 서열에 연결된다. 제시되는 펩타이드를 암호화하는 DNA는 적절한 세포주로부터 얻어지는 것과 같은 천연 공급원으로부터 DNA를 분리하여 얻어지거나, 또는 예를 들어 포스페이트 트리에스테르법과 같은 알려진 합성법에 의해 얻어질 수 있다. 예, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (M.J. Gait, ed., 1984) 참조. 또한, 합성 올리고뉴클레오타이드는 상업적으로 구입가능한 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성기를 이용하여 제조될 수 있다. 분리되면, TCR 분자를 암호화하는 유전자는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 당해 기술분야에 알려진 다른 수단에 의해 증폭될 수 있다. TCR 펩타이드를 증폭시키기에 적절한 PCR 프라이머는 PCR 산물에 대한 제한 부위를 포함할 수 있다. 바람직하게, PCR 산물은 IL-2 폴리펩타이드에 대한 스플라이싱 사이트 및 TCR-IL-2 융합 복합체의 적절한 발현 및 분비에 필요한 리더 서열을 포함한다. 또한, PCR 산물은 바람직하게 링커 서열을 암호화하는 서열, 또는 이러한 서열의 라이게이션을 위한 제한효소 사이트를 포함한다.

본 명세서에 기재된 융합 단백질은 바람직하게, 표준 재조합 DNA 기술에 의해 생성된다. 예를 들어, TCR 단백질을 암호화하는 DNA 분자가 분리되면, 서열은 IL-2 폴리펩타이드를 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 라이게이션될 수 있다. TCR 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 IL-2 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열에 직접 연결되거나, 또는 보다 전형적으로, 본 명세서에 언급된 바와 같은 링커 서열을 암호화하는 DNA 서열이 TCR 분자를 암호화하는 서열과 IL-2 펩타이드를 암호화하는 서열 사이에 개재되고, 적절한 라이게이즈를 이용하여 연결될 수 있다. 그 결과 형성된 하이브리드 DNA 분자는 적절한 숙주세포에서 발현되어 IL-2 융합 단백질을 생성한다. DNA 분자들은 라이게이션 후에, 암호화된 폴리펩타이드의 번역 프래임이 변화되지 않도록 5'에서 3' 방향으로 서로 라이게이션된다(즉, DNA 분자들은 서로 인-프래임(in-frame)으로 라이게이션된다). 그 결과 형성된 DNA 분자는 인-프래임 융합 단백질을 암호화한다.

또한, 다른 뉴클레오타이드 서열이 유전자 구조물에 포함될 수 있다. 예를 들어, IL-2 펩타이드에 융합된 TCR 펩타이드를 암호화하는 서열의 발현을 조절하는 프로모터 서열, 또는 IL-2 융합 단백질을 세포 표면 또는 세포 배양물로 지시하는 리더 서열이 상기 구조물에 포함되거나 또는 상기 구조물이 삽입되는 발현 벡터에 존재할 수 있다. 면역글로블린 또는 CMV 프로모터가 특히 바람직하다.

융합 단백질의 성분들은 각 성분들이 이의 의도된 기능을 수행할 수 있는 한 거의 어떠한 순서로도 조직될 수 있다. 예를 들어, 일 구현으로, TCR은 IL-2 분자의 C 또는 N 말단에 위치한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 융합 분자 또는 컨주게이트 분자는 여러 방식으로 조직될 수 있다. 예시적인 형태로, TCR의 C-말단은 IL-2 분자의 N-말단에 작용적으로 연결된다. 그 결합은 필요에 따라 재조합 방법에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 다른 형태로, TCR의 N-말단은 IL-2 분자의 C-말단에 연결된다.

바람직하게, 링커 서열은 약 1-20 아미노산, 보다 바람직하게 약 1-16 아미노산을 포함한다. 바람직하게, 링커 서열은 단일의 바람직하지 않은 형태로 IL-2를 유지하지 않도록 유연하다. 링커 서열은 예를 들어, 융합 분자로부터 인식 부위를 이격시키기 위해 사용될 수 있다. 특히, 펩타이드 링커 서열은, 예를 들어 이를 화학적으로 가교시키기 위해 그리고 분자 가요성을 제공하기 위해 TCR 사슬과 IL-2 펩타이드 사이에 위치할 수 있다. 바람직하게, 링커는 가요성을 제공하기 위해 주로 글리신, 알라닌 및 세린과 같은 작은 측쇄를 갖는 아미노산을 포함한다. 바람직하게, 링커 서열의 약 80 또는 90퍼센트 이상은 글리신, 알라닌 또는 세린 잔기, 특히 글리신 및 세린 잔기를 포함한다. 헤테로다이머 TCR을 함유하는 IL-2 융합 단백질에 있어서, 링커 서열은 TCR 분자의 β 사슬에 적절히 연결되나, 링커 서열은 또한 TCR 분자의 α 사슬에 결합될 수 있다. 변형적으로, 링커 서열은 TCR 분자의 α 및 β 사슬 모두에 연결되어 단일-사슬 분자를 생성할 수 있다. 적절한 링커 서열은 SGGGGSGGG(즉, Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly), TSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSS 및 VNAKTTAPSVYPLAPVSQ이다. 항체 가변부를 서로 연결하는데 성공적으로 사용되는 어느 다수의 가요성 링커 디자인을 포함하는 다양한 링커 서열이 사용될 수 있다. Whitlow, M. et al., (1991) Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97-105 참조. 또한, 링커 서열의 적절한 크기 및 서열은 TCR 분자의 예측 크기 및 형상에 기초하여 통상적인 컴퓨터 모델링 기술에 의해 검출될 수 있다.

본 발명의 IL-2 융합 단백질을 발현하기 위해 다수의 전략이 이용될 수 있다. 예를 들어, 상기 IL-2 유전자 융합 구조물은 제한효소를 사용하여 구조물의 삽입을 위한 벡터에서 절개를 형성한 다음 라이게이션을 하는 것과 같은 공지 수단에 의해 적절한 벡터내로 편입될 수 있다. 그 다음, 유전자 구조물을 함유하는 벡터는 IL-2 융합 펩타이드의 발현을 위한 적절한 숙주내로 도입된다. 이와 관련하여서는 일반적으로 상기 Sambrook et al.을 참조바란다. 적절한 벡터의 선택은 클로닝 프로토콜과 관련된 팩터들에 기초하여 경험적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 벡터는 사용될 숙주에 대한 적절한 레플리콘과 호환되며 이를 가져야 한다. 또한, 벡터는 발현될 IL-2 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 수용할 수 있어야 한다. 적절한 숙주 세포는 진핵 세포 및 원핵 세포, 바람직하게는 용이하게 형질변형될 수 있으며 배지에서 신속한 성장을 나타내는 세포를 포함한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli), 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtillus) 등과 같은 원핵 생물 및 동물 세포 및 예를 들어, 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae)와 같은 이스트 스트레인을 포함한다. 일반적으로 포유류 세포가 바람직하며, 특히 J558, NSO, SP2-0 또는 CHO가 바람직하다. 다른 적절한 숙주는 예를 들어, Sf9과 같은 곤충 세포를 포함한다. 통상적인 배양 조건이 이용된다. 일반적으로 상기 Sambrook et al.을 참조바란다. 그 다음, 적절한 형질변형된 또는 트랜스펙션된 세포주가 선택될 수 있다. 본 발명의 TCR 융합 복합체를 발현하는 세포는 공지된 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 면역들로블린에 연결된 TCR 융합 복합체의 발현은 결합 면역글로블린에 특이적인 ELISA 및/또는 면역 블롯팅에 의해 검출될 수 있다.

상기 일반적으로 언급된 바와 같이, 숙주 세포는 원하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 증식시키기 위한 제조 목적으로 사용될 수 있다. 따라서, 숙주 세포는 융합 단백질의 생성이 특이적으로 의도되는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 숙주 세포는 융합체를 암호화하는 핵산을 증식시킬 수 있는 이스트, 파리, 벌레, 식물, 개구리, 포유류 세포 및 기관을 특이적으로 포함한다. 사용될 수 있는 포유류 세포주의 비제한적인 예는 CHO dhfr-cells(Urlaub 및 Chasm, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), 293 cells(Graham et al., J Gen. Virol., 36:59 (1977)) 또는 SP2 또는 NSO와 같은 골수세포(Galfre 및 Milstein, Meth. Enzymol., 73(B):3 (1981))를 포함한다.

원하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 증식시킬 수 있는 숙주 세포는 비-포유류 원핵 세포뿐만 아니라, 곤충(예, Sp. frugiperda), 이스트(예., S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris., K. lactis, H. polymorpha; Fleer, R., Current Opinion in Biotechnology, 3(5):486496 (1992)에서 일반적으로 리뷰됨), 균류 및 식물 세포를 포함한다. 또한, 이. 콜라이 및 바실러스와 같은 특정 원핵 생물이 고려된다.

세포를 트랜스펙션하기 위한 표준 기술에 의해 원하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산이 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 용어 "형질변형(transfecting)" 또는 "트랜스펙션(transfection)"은 칼슘 포스페이트 공동 침전, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션, 리포펙션, 전기천공법, 마이크로인젝션, 바이러스 형질 도입 및/또는 인테그레이션을 포함하여 핵산을 숙주 세포내로 도입하는 통상적인 모든 기술을 포함하는 것으로 의도된다. 숙주 세포를 트랜스펙션하는 적절한 방법은 상기 Sambrook et al. 및 기타 실험 교과서에서 찾아볼 수 있다.

또한, 본 발명은 관심있는 IL-2 융합 단백질을 분리하는 제조방법을 제공한다. 상기 방법에서, 조절 서열에 작동적으로 연결된 관심있는 단백질을 암호화하는 핵산이 그 안으로 도입되는 숙주 세포(예, 이스트, 균류, 곤충, 박테리아 또는 동물 세포)는 관심있는 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 전사를 자극하는 융합 단백질의 존재하에서 배지에서 생산 규모로 성장된다. 후속적으로, 관심있는 융합 단백질은 수거된 숙주 세포로부터 또는 배지로부터 분리된다. 표준 단백질 정제 기술이 배지로부터 또는 수거된 세포로부터 관심있는 단백질을 분리하는데 사용될 수 있다. 특히, 정제 기술은 회전 병, 스피너 플라스크, 조직배양 플래이트, 바이오리액터 또는 발효기를 포함하는 다양한 실행으로 대규모로(즉, 적어도 밀리그램 양) 원하는 융합 단백질을 발현 및 정제하는데 사용될 수 있다.

발현된 IL-2 융합 단백질은 공지 방법에 의해 분리 및 정제될 수 있다. 전형적으로, 배지는 원심분리된 다음, 상층액을, 예를 들어, 결합 TCR 또는 이의 면역글로불린 부위와 같은 발현 융합 복합체에 바인딩하는 모노클로날 항체의 사용을 포함하는, 단백질-A 또는 단백질-G 친화도 크로마토그래피 또는 면역친화도 프로토콜과 같은 친화도 또는 면역친화도 크로마토그래피에 의해 정제된다. 본 발명의 융합 단백질은 공지된 기술의 적절한 조합에 의해 분리 및 정제될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 염 침전 및 용매 침전과 같은 용해도를 이용한 방법, 투석, 한외여과, 겔-침투 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 분자량 차이를 이용한 방법, 이온-교환 컬럼 크로마토그래피와 같은 전하의 차이를 이용한 방법, 친화도 크로마토그래피와 같은 특이적 친화도를 이용한 방법, 역상 고성능 액체 크로마토그래프와 같은 소수성 차이를 이용한 방법 및 등전점 전기영동, Ni-NTA와 같은 금속 친화도 컬럼과 같은 등전점 차이를 이용한 방법을 포함한다. 이러한 방법들과 관련하여서는 일반적으로 상기 Sambrook et al. 및 Ausubel et al.을 참조바란다.

본 발명의 IL-2 융합 단백질은 실질적으로 순수한 것이 바람직하다. 즉, 융합 단백질은 융합 단백질이 바람직하게 적어도 80% 또는 90% 내지 95% 균질성(w/w)으로 존재하도록 이를 자연적으로 수반하는 세포 치환체로부터 분리된다. 적어도 98-99% 균질성(w/w)을 갖는 융합 단백질이 다수의 약학, 임상학적 및 연구용으로 가장 바람직하다. 실질적으로 정제되면, 융합 단백질은 치료학적 적용을 위해 실질적으로 오염물이 없어야 한다. 부분적으로 또는 실질적으로 순수하게 정제되면, 가용성 융합 단백질이 치료학적으로 사용되거나 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 시험관내 또는 생체내 어세이를 수행하는데 사용될 수 있다. 실질적인 순도는 크로마토그래피 및 겔 전기영동과 같은 다양한 표준 기술에 의해 검출될 수 있다.

본 발명의 트렁캐이티드 IL-2 융합 단백질은 발현 후에 TCR 융합 복합체가 배지로 분비될 수 있을 정도로 충분히 트렁캐이티드된 TCR 분자를 함유한다. 따라서, 트렁캐이티드 IL-2 융합 단백질은 소수성 잔기, 전형적으로 TCR 분자의 트랜스멤브레인 및 세포질 영역이 풍부한 부위를 포함하지 않을 것이다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 바람직한 트렁캐이티드 TCR 분자에 있어서, 바람직하게 TCR 분자의 β 사슬의 약 199-237 잔기 및 α 사슬의 약 193-230 잔기가 트렁캐이티드 TCR 융합 복합체에 포함되지 않는다.

용어 "미스폴디드(misfolded)"는 융합 단백질과 관련하여, 부분적으로 또는 완전히 폴딩되지 않은(즉, 변성된) 단백질을 의미한다. 융합 단백질은 하기의 하나 이상의 카오트로픽제(chaotropic agent)와의 접촉에 의해 부분적으로 또는 완전히 미스폴딩될 수 있다. 보다, 일반적으로, 본 명세서에 기재된 미스폴딩된 융합 단백질은 이에 상응하는 네이티브 단백질의 고 깁스 자유 에너지(ΔG) 형태를 나타낸다. 일반적으로 바르게 폴딩된 네이티브 융합 단백질이 바람직하며, 이는 수용액에 완전히 가용성이며, 상대적으로 낮은 ΔG를 갖는다. 따라서, 이러한 네이티브 융합 단백질이 대부분의 경우에 안정하다.

융합 단백질 미스폴딩은 통상적인 방법들 중 하나 또는 조합에 의해 검출가능하다. 예를 들어, 미스폴딩은 네이티브(컨트롤) 및 미스폴딩된 분자를 이용한 선광 측정을 포함하는 다양한 통상의 생물물리학적 기술에 의해 검출될 수 있다.

용어 "가용성(soluble)" 또는 유사 용어는 예를 들어, 세포 배지와 같은 수성 버퍼로부터 낮은 관성력(G-force) 원심분리하에서(예, 표준 원심분리에서 약 30,000 rpm(revolutions per minute) 미만) 쉽게 침전되지 않는 융합 분자, 특히 융합 단백질을 의미한다. 또한, 융합 단백질은 약 5-37℃ 이상의 온도에서 그리고 음이온 또는 비이온 세제의 낮거나 또는 무농도의 존재하에서 중성 pH에서 또는 중성 pH 부근에서 수용액으로 유지되는 경우라면 가용성이다. 이러한 조건하에서, 가용성 단백질은 예를 들어, 약 10-50 스베드베리 단위(svedberg units) 미만과 같이 낮은 침전값을 종종 가질 것이다.

본 명세서에서 언급된 수용액은 전형적으로 약 5-9의 pH 범위내의 pH, 그리고 약 2-500mM의 이온 강도 범위를 확립하도록 완충 화합물을 갖는다. 가끔 프로테아제 인히비터 또는 마일드 비이온 세제가 첨가된다. 또한, 소 혈청 알부민(BSA)와 같이 필요에 따라 캐리어 단백질을 수 mg/ml 첨가할 수 있다. 예시적인 수성 버퍼는 표준 PBS(인산염 완충 염수), 트리스-버퍼드 염수 또는 다른 잘 알려진 버퍼 및 세포 배지 배합물을 포함한다.

약학 치료법

본 발명은 종양 형성의 치료에 유용한 IL-2 융합 단백질을 포함한다. 일 특정 구현으로, 본 발명의 IL-2 융합 단백질은 종양 서장을 억제 또는 감소시키거나 또는 종양성 신생세포의 주변 조직으로의 침범 또는 그렇지 않으면 전이되는 경향을 감소시키는데 유용하다. 치료학적 사용에 있어서, 본 명세서에 기재된 IL-2 융합 단백질은 예를 들어, 생리 염수와 같은 약학적으로 허용되는 버퍼에 제형화되는 것과 같이 전신성으로 투여될 수 있다. 환자에서 약물의 계속되는 지속 수준을 제공하는 바람직한 투여 경로는 예를 들어, 피하, 정매내, 복강내, 근육내 또는 피내 주사를 포함한다. 인간 환자 또는 다른 동물의 치료는 생리학적으로 허용되는 캐리어내에서 본 명세서에 확인된 치료제의 치료학적으로 유효량을 이용하여 수행될 것이다. 적절한 캐리어 및 이의 제형은 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences(E. W. Martin.)에 기재되어 있다. 투여될 치료제의 양은 투여 방식, 환자의 나이 및 체중, 그리고 종양 형성의 임상학적 증상에 따라 달라진다. 일반적으로, 양은 종양 형성과 관련된 다른 질병의 치료에 사용되는 다른 제제에 대해 사용되는 것의 범위 이내일 것이나, 특정 예에서 화합물의 증가된 특이성 때문에 보다 낮은 양이 요구될 것이다.

치료 방법

본 발명의 IL-2 융합 단백질은 종양 형성 질병을 예방 또는 완화하는데 유용하다. 일 치료학적 접근으로, 본 명세서에서 확인되거나 기재된 제제는 잠재적이거나 실제 질병-공격받은 조직 부위에 투여되거나 또는 전신성으로 투여된다. 투여되는 제제의 투여량은 각 환자의 크기 및 건강 상태를 포함하는 다수의 인자들에 따라 달라진다. 어느 특정 대상자에 있어서, 특정 투여 요법은 개별적 요구 및 상기 조성물을 투여하는 자 또는 투여를 감독하는 자의 전문적 판단에 따라서 시간이 지남에 따라 조정되어야 한다.

약학 조성물의 제형화

종양 형성의 치료를 위한 치료제의 투여는 다른 성분들과 혼합되는 치료제의 농도가 종양 형성을 완화, 감소 또는 안정화하는데 효과적일 수 있는 어느 적절한 수단에 의해 이루어질 수 있다. 상기 화합물은 어느 적절한 캐리어 물질에 어느 적절한 양으로 함유될 수 있으며, 일반적으로 조성물의 총 중량의 1-95중량%의 양으로 존재한다. 상기 조성물은 비경구(예, 피하, 정맥내, 근육내, 내부 소포로(intravesicularly) 또는 복강내) 투여에 적절한 투여 형태로 제공될 수 있다. 유리한 투여 방법은 정맥내 주입이다. 상기 약학 치료제는 통상의 약학적 수행(예를 들어 하기 참조, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York)에 따라 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 투여시 실질적으로 즉시 또는 어느 미리 정해진 시간에 또는 투여 후 시간 주기에 IL-2 융합 단백질을 방출하도록 제형화될 수 있다. 후자 타입의 조성물은 일반적으로 방출 조절 제형으로 알려져 있으며, 이는 (i) 연장된 기간에 걸쳐 체내에서 약물의 실질적으로 일정한 농도를 생성하는 제형; (ii) 미리 정해진 지체 시간 후에 연장된 기간에 걸쳐 체내에서 약물의 실질적으로 일정한 농도를 생성하는 제형; (iii) 혈장 수준에서 활성 물질의 변동(톱니파 운동 패턴(sawtooth kinetic pattern))과 관련되어 수반되는 원치않는 부작용을 최소화하면서 체내에서 상대적으로, 계속되는 유효 수준을 유지함으로써 미리 정해진 기간 동안에 작용을 지속시키는 제형; (iv) 예를 들어, 흉선에 인접하거나 또는 이와 접촉시 방출 조절 조성물의 공간적 배치에 의한 것과 같이 작용을 국소화시키는 제형; (v) 예를 들어, 1주 또는 2주에 1회와 같이 투여되도록 편리한 투여를 가능케 하는 제형; 및 (vi) 캐리어 또는 화학 유도체를 사용하여 치료제를 특정 세포 타입(예, 신생 세포)으로 운반함으로써 종양 형성을 치료하는 제형을 포함한다. 일부 적용에 있어서, 방출 조절 제형은 혈장 수준을 치료 수준으로 지속하는 당일 동안에 빈번한 투여 필요성을 없앤다.

방출 속도가 문제의 화합물의 대사 속도를 보충하는 조절된 방출을 확보하기 위해 어느 다수의 전략이 추구될 수 있다. 일 예로, 조절된 방출은 예를 들어, 다양한 타입의 방출 조절 조성물 및 코팅제를 포함하는 다양한 제형 파라미터 및 성분의 적절한 선택에 의해 얻어진다. 따라서, 치료제는 투여시 조절된 방식으로 치료제를 방출하는 약학 조성물내로 적절한 부형제와 함께 제형화된다. 예로서 단일 또는 다중 유닛 정제 또는 캡슐 조성물, 오일 용액, 서스펜션, 에멀젼, 마이크로캡슐, 마이크로스피어, 분자 복합체, 나노파티클, 패치 및 리포좀이 포함된다.

비경구 조성물

상기 약학 조성물은 투여 형태, 제형으로 또는 통상적인 무독성의 약학적으로 허용되는 캐리어 및 보조제를 함유하는 적절한 운반 장치 또는 이식을 통해 주사, 주입 또는 이식(피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 내부 소포로 등)에 의해 비경구로 투여될 수 있다. 이러한 조성물의 제형화 및 제조는 약학 제형화 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 제형화는 상기 언급된 Remington: The Science and Practice of Pharmacy에서 찾아볼 수 있다.

비경구용 조성물은 단위 투여량 형태(예, 단일 투여 앰플)로, 또는 수회 투여량을 함유하는 바이얼로 제공될 수 있으며, 여기에 적절한 보존제가 첨가될 수 있다(하기 참조). 상기 조성물은 용액, 서스펜션, 에멀젼, 주입 장치 또는 이식용 운반 장치의 형태로 존재하거나, 또는 사용 전에 물이나 다른 적절한 비이클로 재구성되는 건조 분말로서 제공될 수 있다. 종양 형성을 감소 또는 완화시키는 활성제 외에, 상기 조성물은 적절한 비경구적으로 허용되는 캐리어 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 활성 치료제(들)는 조절된 방출을 위해 마이크로스피어, 마이크로캡슐, 나노파티클, 리포좀 등으로 편입될 수 있다. 더욱이, 상기 조성물은 서스펜션화제, 안정화제, pH-조절제, 긴장성 조정제(tonicity adjusting agents), 및/또는 분산제를 포함할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 약학 조성물은 멸균 주사용으로 적절한 형태로 존재할 수 있다. 이러한 조성물을 제조하기 위해, 적절한 치료제(들)가 비경구적으로 허용되는 액체 비이클에 용해 또는 서스펜션화된다. 이 중에서 사용될 수 있는 허용 비이클 및 용매는 물, 적절한 양의 염산, 소듐 하이드록시드 또는 적절한 버퍼의 첨가에 의해 적절한 pH로 조절된 물, 1,3-부탄디올, 링거액 및 등장성 소듐 클로라이드 용액 및 덱스트로즈 용액이다. 수성 제형은 또한 하나 이상의 보존제(예, 메틸, 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트)를 함유할 수 있다. 상기 화합물들 중 하나가 물에 단지 적게 용해되거나 경미하게 가용성인 경우에, 용해 증진제 또는 가용화제가 첨가되거나, 또는 용매는 10-60% w/w의 프로필렌 글리콜 등을 포함할 수 있다.

방출 조절된 비경구 조성물

방출 조절된 비경구 조성물은 수성 서스펜션, 마이크로스피어, 마이크로캡슐, 자기 마이크로스피어, 오일 용액, 오일 서스펜션 또는 에멀젼의 형태로 존재할 수 있다. 변형적으로, 항체가 생체적합성 캐리어, 리포좀, 나노파티클, 이식물 또는 주입 장치에 편입될 수 있다.

마이크로스피어 및/또는 마이크로캡슐의 제조에 사용되는 재료는, 예를 들어 폴리갈락틴, 폴리-(이소부틸 시아노아크릴레이트), 폴리(2-하이드록시에틸-L-글루탐-나인) 및 폴리(락틱산)과 같은 생분해성/생체흡수성 폴리머를 들 수 있다. 방출 조절된 비경구 제형을 제형화하는데 사용될 수 있는 생체적합성 캐리어는 탄수화물(예, 덱스트란), 단백질(예, 알부민), 리포프로틴 또는 항체이다. 이식물에 사용되는 물질은 비-생분해성(예, 폴리디메틸 실록산) 또는 생분해성(예, 폴리(카프롤락톤), 폴리(락틱산), 폴리(글리콜산) 또는 폴리(오르소 에스테르) 또는 이의 조합)일 수 있다.

경구용 고형 투여 형태

경구용 제형은 무독성의 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 혼합물로 활성 성분(들)을 함유하는 정제를 포함한다. 이러한 제형은 당해 기술분야의 숙련자에게 알려져 있다. 부형제는 예를 들어, 비활성 희석제 또는 필러(예, 수크로즈, 소르비톨, 당, 만니톨, 미정질 셀룰로즈, 감자 전분을 포함하는 전분, 칼슘 카보네이트, 소듐 클로라이드, 락토즈, 칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트 또는 소듐 포스페이트); 과립화제 및 붕해제(예, 미정질 셀룰로즈를 포함하는 셀룰로즈 유도체, 감자 전분을 포함하는 전분, 크로스카멜로즈 소듐, 알기네이트 또는 알긴산); 바인딩제(예, 수크로즈, 글루코즈, 소르비톨, 아카시아, 알긴산, 소듐 알기네이트, 젤라틴, 전분, 전호화분 전분, 미정질 셀룰로즈, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 카르복시메틸셀룰로즈 소듐, 메틸셀룰로즈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로즈, 에틸셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리에틸렌 글리콜); 및 윤활제, 활주제 및 항부착제(예, 마그네슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 스테아르산, 실리카스, 하이드로게네이티드 식물 오일 또는 탤크)일 수 있다. 다른 약학적으로 허용되는 부형제는 착색제, 방향제, 가소제, 습윤제, 완충제 등일 수 있다.

정제는 코팅되지 않거나, 또는 선택적으로, 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시켜 보다 긴 기간에 걸쳐 지속된 작용을 제공하기 위해 알려진 기술에 의해 코팅될 수 있다. 코팅은 미리 정해진 패턴으로(예, 방출 조절된 제형을 달성하기 위해) 활성 약물을 방출하도록 개조되거나, 또는 위의 통과 후 까지 활성 약물을 방출하지 않도록 개조될 수 있다(장용성 제피). 코팅은 당 코팅, 필름 코팅(예, 하이드록시프로필 메틸셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시에틸셀룰로즈, 하이드록시프로필셀룰로즈, 카르복시메틸셀룰로즈, 아크릴레이트 코폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 폴리비닐피롤리돈에 기초한 것과 같은), 또는 장용성 제피(예, 메타크릴산 코폴리머, 셀룰로즈 아세테이트 프탈레이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로즈 프탈레이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로즈 아세테이트 숙시네이트, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 셸락 및/또는 에틸셀룰로즈에 기초한 것과 같은)일 수 있다. 또한, 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질이 이용될 수 있다.

고형 정제 조성물은 원치 않는 화학적 변화(예, 키메릭 항체의 방출 전에 화학적 분해)로부터 조성물을 보호하기 위해 개조된 코팅을 포함할 수 있다. 코팅은 상술한 Encyclopedia of Pharmaceutical Technology에 기재된 것과 유사한 방식으로 고형 투여 형태에 적용될 수 있다.

경구용 제형은 또한 씹을 수 있는 정제로서, 또는 활성 성분이 비활성 고형 희석제(예, 감자 전분, 락토즈, 미정질 셀룰로즈, 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트 또는 카올린)와 혼합된 경질 젤라틴 캡슐로서, 또는 활성 성분이 물 또는 예를 들어, 땅콜 오일, 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 같은 오일 매체와 혼합된 연질 젤라틴 캡슐로서 제공될 수 있다. 분말 및 과립은 예를 들어, 믹서, 유체 베드 장치 또는 분무 건조 장치를 이용하여 통상적인 방식으로 정제 및 캡슐하에 상기한 바와 같은 성분들을 이용하여 제조될 수 있다.

방출 조절된 경구 투여 형태

경구용 방출 조절된 조성물은 예를 들어, 활성 물질의 용해 및/또는 확산을 조절함으로써 키메릭 항체 치료제를 방출하도록 구성될 수 있다. 용해 또는 확산 조절된 방출은 화합물의 정제, 캡슐, 펠렛, 또는 과립 제형의 적절한 코팅에 의해, 또는 화합물을 적절한 매트릭스내로 편입시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 방출 조절된 코팅은 상기한 바와 같은 코팅 물질들 및/또는 예를 들어, 셸락, 비스왁스, 글리코왁스, 캐스터 왁스, 카나우바 왁스, 스테아릴 알코올, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 디스테아레이트, 글리세롤 팔미토스테아레이트, 에틸셀룰로즈, 아크릴 수지, 디-폴리락틱산, 셀룰로즈 아세테이트 부티레이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 아세테이트, 비닐 피롤리돈, 폴리에틸렌, 폴리메타크릴레이트, 메틸메타크릴레이트, 2-하이드록시메타크릴레이트, 메타크릴레이트 하이드로겔, 1,3 부틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 메타크릴레이트, 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 방출 조절된 매트릭스 제형에서, 매트릭스 물질은 또한 예를 들어, 수화 메틸셀룰로즈, 카나우바 왁스 및 스테아릴 알코올, 카보폴 934, 실리콘, 글리세릴 트리스테아레이트, 메틸 아크릴레이트-메틸 메타크릴레이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 및/또는 할로겐화 플루오로카본을 포함할 수 있다.

하나 이상의 치료제 화합물을 함유하는 방출 조절된 조성물은 또한 부력이 있는(buoyant) 정제 또는 캡슐(즉, 경구 투여시 특정 기간 동안 위 내용물의 상부에 부유하는 정제 또는 캡슐)의 형태로 존재할 수 있다. 화합물(들)의 부력이 있는 정제 제형은 화합물(들)을 부형제 및 하이드록시에틸셀루로즈, 하이드록시프로필셀룰로즈 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로즈와 같은 하이드로콜로이드 20-75% w/w와의 혼합물을 과립화함으로써 제조될 수 있다. 그 다음, 이렇게 획득된 과립은 정제로 압축될 수 있다. 위액과 접촉시, 정제는 그 주변에 실질적으로 수-불투과성 겔 배리어를 형성한다. 이 겔 배리어는 1 미만의 밀도를 유지하는데 부분적으로 기여하여, 정제가 위액에서 부유한 상태를 유지하도록 한다.

병용 요법

본 발명은 IL-2 융합 단백질과 하나 이상의 치료제의 복합 투여를 제공한다. IL-2 융합 단백질은 상기 치료제의 투여 전, 동시 또는 후에 투여될 수 있다. 더욱이, 하나 이상의 치료제가 사용되는 경우에, 이러한 제제들은 함께 또는 별도로 투여될 수 있다. 또한, IL-2 융합 단백질 및 하나 이상의 치료제의 투여는 다양한 투여 스케쥴로 투여될 수 있다. 특정 구현으로, IL-2 융합 단백질 및 하나 이상의 치료제는 하나 이상의 휴식기로 분리될 수 있는 다중 투여 스케쥴로 투여된다.

본 발명의 IL-2 융합 단백질과 하나 이상의 치료제의 병용은, 환자의 질병 단계에 따라, 부가적인 치료 또는 수술 전에 신 보조 셋팅(neoadjuvant setting)으로 또는 제1선, 제2선 또는 후방 라인 치료로서 이용될 수 있다. 바람직한 구현으로, 병용 치료는 방광 절제 전에 방광암을 가진 대상자에게 주어진다. 이러한 치료는 미소 전이, 다운 스테이지 종양을 근절하며, 수술 후 순환 종양 세포의 착상을 감소시키고 생존율을 향상시킬 수 있다. 다른 구현으로, 본 발명의 병용 치료는 진전되거나 전이성의 방광암을 가진 대상자에게 제1선 또는 제2선 치료로 주어진다. 이러한 치료는 표준 치료에 내성적이거나 적합하지 않은 대상자에게 제공될 수 있다. 단일 치료법으로서 IL-2 융합 단백질의 사용이 또한 이러한 치료 셋팅에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 IL-2 융합 단백질과 하나 이상의 치료제의 병용은 개별 제제를 이용한 치료에 비해 더 효과적인 치료를 제공하는데 유리할 수 있다. 특정 바람직한 구현으로, 병용 치료는 IL-2 융합 단백질로서 ALT-801 및 치료제로서 시스플라틴 및/또는 겜시타빈을 포함한다. 또한, 본 발명의 구현은 방광(또는 요로 상피) 암을 가진 대상자의 치료를 포함하며, 여기서 상기 암은 이행상피암종(transitional cell carcinoma), 원 위치 암종(또는 종양), 비근육-침윤성, 근육-침윤성, 국소 진행성, 전이성, 단계 I 내지 IV 또는 저등급 또는 고등급일 수 있다.

바람직한 구현으로, IL-2 융합 단백질과 하나 이상의 치료제의 병용 투여는 상기 치료제를 단독으로 이용하여 치료하는 경우에 비해 대상자에서 암을 치료 혹은 예방하는데 더욱 효과적이다. IL-2 융합 단백질 및 하나 이상의 치료제를 이용한 병용 치료의 효과는, 유사한 연구 그룹의 히스로릭 효과 측정 또는 크로스-오버 연구를 이용하여 가능적 또는 회상적 베이시스에서 치료제 단독을 이용한 치료와 비교될 수 있다. 효능의 평가는 암치료에 대해 잘 확립되어 있으며, 전체 종양 반응(즉, RECIST, WHO 또는 다른 기준에 기초한 진행성 질환, 안정한 질환, 부분적 반응 또는 완전한 반응), 무진행 생존율(progression free survival), 진행 시간(time to progression), 전체 생존율 또는 생존율, 위험 비율, 재발율 또는 재발시간, 종양 바이오마커 분석, 생활의 질 평가, 부가적 치료의 비율 또는 시간 등을 포함할 수 있다. 치료제 단독을 이용한 치료와 비교된, IL-2 융합 단백질 및 하나 이상의 치료제를 이용한 병용 치료의 보다 우수한 효과는, 효능 평가에 있어서 전형적으로 통계학적으로 현저한 향상으로 규정되거나(즉, P 값 < 0.10 또는 바람직하게 < 0.05), 또는 주, 월 또는 년의 이벤트 평가에 대한 경우에 증가로서 규정되거나, 또는 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1000%, 1250%, 1500%, 1750%, 2000% 또는 그 이상으로 향상율 평가로서 규정될 수 있다. 비제한적인 예로, 본 발명의 ALT-801과 겜시타빈+시스플라틴의 병용 투여를 이용한 진행성 또는 전이성 방광암에 걸린 대상자의 치료는, 겜시타빈+시스플라틴 또는 다른 시스플라틴계 화학치료 요법으로 치료받은 진행성/전이성 방광암 대상자에 대해 기존에 보고된 것에 비해 더 우수한 항종양 효과를 제공하였다. 구체적으로, von der Maase 등(J. Clin. Oncol. (2000) 17:3068)은 진행성 또는 전이성 방광암에 걸린 환자의 단계 III 임상 시험에서, 겜시타빈+시스플라틴을 이용한 치료는 49.4%(평가된 182명의 환자 중 81명)의 전체 종양 반응율(즉, 부분 반응 및 완전 반응의 비율)을 형성하였으며, 독립적인 방사선학적 견지에 의하면 12.2%의 완전 반응율을 형성한 것으로 보고하였다. 이 연구는 또한 메소트렉세이트, 빈블라스틴, 독소루비신 및 시스플라틴으로 치료받은 환자에서 유사한 전체 반응율(45.7%, 평가된 181명의 환자 중 69명) 및 완전 반응율(11.9%)을 보고하였다. 이 환자 집단에서 다른 화학치료 요법의 후속적 시험(즉, 단일 제제, 더블렛, 트리플렛)은 유사하거나 열등한 반응율을 나타내었다(리뷰, Yafi et al. Curr. Oncol. (2011) 18:e25). 예기치 않게, 진행성/전이성 방광암에 걸린 환자에게 본 발명의 ALT-801과 겜시타빈+시스플라틴의 병용 투여는 von der Maase 등에 의해 겜시타빈+시스플라틴 또는 다른 시스플라틴계 화학치료 요법에 대해 보고된 것보다 훨씬 더 우수한 전체 반응 및 완전 반응율을 제공하였다.

또한, IL-2 융합 단백질과 하나 이상의 치료제의 병용 투여는 화학치료에 내성인 대상자에서 암을 치료 또는 억제하는데 효과적이다. 특정 구현으로, 본 발명의 병용 치료는 암이 내성적인 하나 이상의 치료제를 포함한다. 다른 구현으로, 본 발명의 병용 치료는 암이 내성적인 것과 다른 하나 이상의 치료제를 포함한다. 비제한적인 예로, 본 발명의 병용 투여는 이전의 겜시타빈+시스플라틴 치료시 진행된 방광암에 걸린 환자에서 완전한 반응(CR)을 제공하는데 효과적이었다. 이 결과는 백금-함유 요법 후에 진행된 진전성 요로상피암에 걸린 370명의 환자의 단계 III 시험에서 CRs이 보고되지 않은 사실(Bellmunt et al. J. Clin. Oncol. (2009) 27: 4454)에 견주어 매우 예기치 않은 것이다

본 발명의 IL-2 융합 단백질과 하나 이상의 치료제의 병용은 다양한 메커니즘을 통해 보다 효과적인 치료를 제공할 수 있다. IL-2 융합 단백질 및 세포독성 치료제 요법은 상기 암에서 이러한 제제들의 직접적인 영향들의 조합을 통해 효능을 제공할 수 있다. 일부 환경에서, 이러한 효과의 시기는 향상된 결과를 제공할 수 있다. 예를 들어, 잔류 질병에 대해 IL-2 융합 단백질의 내구성이 있는 장기 활성과 함께 거대 종양에 대한 세포독성 치료제의 신속한 활성은 어느 하나의 단독 제제에 비해 더 우수한 효능을 제공할 수 있다. 변형적으로, 치료제는 종양 세포에 직접 세포독성 효과를 가질 뿐만 아니라, 소위 오프-타겟 효과를 통해 면역 시스템에 약효를 증가시킬 수 있어, 본 발명의 IL-2 융합 단백질과 병용시 효과적인 항암 면역성을 달성할 수 있다(Galluzzi, L. et al., Nat Rev Drug Discov, 11: 215-233). 예를 들어, 상기 치료제를 이용한 치료는 암 세포 표면상에서 항원 표적의 발현을 증가시켜, 이에 따라 보다 효과적인 항종양 면역 반응이 IL-2 융합 단백질에 의해 유도되도록한다. 일부 구현으로, 항원 표적은 IL-2 융합 단백질의 성분에 의해 인지되며, 면역 반응은 IL-2 융합 단백질 상호작용을 통해 종양 세포에 대해 지시된다. 일 예로, 상기 치료제는 종양 세포 표면상에서 HLA 또는 HLA/펩타이드 복합체 수준을 증가시키고, TCR-IL-2 융합 단백질에 의한 인지를 증가시킨다. 다른 특정 예로, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴을 포함하는 백금계 화합물은 클래스 I HLA 발현을 유도할 뿐만 아니라, 인산 종양 세포상에서 T 세포 저해 분자 PD-L2의 발현을 현저히 감소시킨다(Lesterhuis, W. J. et al., J Clin Invest, 121: 3100-3108). PD-L2의 하향 조절은 IL-2 융합 단백질에 의해 자극되는 T 세포의 항종양 효과를 증진시킬 수 있다. 시스플라틴, 파클리탁셀 및 독소루비신을 포함하는 다양한 치료제는 종양 세포의 그램자임(granzyme)의 투과성을 증사기킴으로써 세포독성 T 림프구(CTSs)에 대해 종양 세포를 민감하게 만드는 능력을 가져, CTSs에 의해 인지되는 항원을 발현시키지 않는 경우에도 CTL-매개 융해에 대해 이들을 민감하게 한다(Ramakrishnan, R. et al., J Clin Invest, 120: 1111-1124). 본 발명의 다른 구현으로, 겜시타빈과 IL-2 융합 단백질의 조합은 종양 세포상에서 클래스 I HLA의 발현을 증가시키는 겜시타빈의 능력에 기인하여 보다 효과적인 치료를 이끌 수 있으며, IL-2 융합 단백질에 의해 활성화되는 CD8⁺ T 세포에 대한 종양 항원의 교차 제시(cross-presentation)를 증가시킨다(Liu, W. M. et al., Br J Cancer, 102: 115-123; Nowak, A. K. et al., J Immunol, 170: 4905-4913, 2003; 및 Nowak, A. K. et al., Cancer Res, 63: 4490-4496, 2003). 본 발명의 병용 치료시, 겜시타빈의 사용은 또한 항원-특이적 T-세포 반응을 억제하는 것을 담당하는 골수-유래 억제 세포(MDSCs)를 선별적으로 사멸할 수 있어(Mundy-Bosse, B. L. et al., Cancer Res, 71: 5101-5110; Vincent, J. et al., Cancer Res, 70: 3052-3061; Suzuki, E. et al., Clin Cancer Res, 11: 6713-6721, 2005; 및 Ko, H. J. et al., Cancer Res, 67: 7477-7486, 2007), 이에 따라 IL-2 융합 단백질-매개 항종양 면역 활성을 위해 보다 나은 환경을 제공할 수 있다. 또한 화학치료요법은 종양 자기소화작용을 유도할 수 있으며, 이는 항종양 면역 반응을 이끌고 자극할 수 있는 아데노신 5'-트리포스페이트의 방출을 일으킬 수 있다(Michaud, M. et al., Science, 334: 1573-1577). 본 발명의 병용 치료 작용의 전체적인 항종양 메커니즘은 치료제의 직접적인 세포독성 활성에 의존하지 않을 수 있다. 따라서, 병용 치료는 대상자의 종양이 치료제 성분에 난치성인 대상자에서 효과적일 수 있다.

키트

본 발명은 종양 형성의 치료 또는 예방을 위한 키트를 제공한다. 일 구현으로, 상기 키트는 단위 투여 형태로 치료 유효량의 IL-2 융합 단백질 및 하나 이상의 치료제를 함유하는 치료 또는 예방 조성물을 포함한다. 바람직한 구현으로, IL-2 융합 단백질은 ALT-801이며, 하나 이상의 치료제는 시스플라틴 및/또는 겜시타빈이다. 일부 구현으로, 키트는 치료 또는 예방적 세포 조성물을 함유하는 멸균 용기를 포함하며; 이러한 용기는 박스, 앰플, 병, 바이얼, 튜브, 백, 파우치, 블리스터-팩 또는 당해 기술분야에 알려진 다른 적절한 용기일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 라미네이티드 페이퍼, 금속 호일 또는 약제를 유지하기 위해 적절한 다른 물질들로 이루어질 수 있다.

필요에 따라, 본 발명의 IL-2 융합 단백질 및 하나 이상의 치료제는 암(예, 방광암)에 걸린 또는 암이 발달한 위험에 있는 대상자에게 IL-2 융합 단백질 및 하나 이상의 치료제를 투여하기 위한 설명서와 함께 제공된다. 설명서는 일반적으로 종양 형성의 치료 또는 예방을 위한 조성물의 사용에 대한 정보를 포함할 것이다. 다른 구현으로, 상기 설명서는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: 치료제의 설명; 투여 스케쥴 및 허혈 또는 이의 증상의 치료 또는 예방을 위한 투여; 예방; 주의; 지시; 금기; 과량투여 정보; 거부반응; 동물 약리학; 임상 시험; 및/또는 레퍼런스. 설명서는 (존재할 경우에) 용기에 직접 인쇄되거나, 또는 용기에 적용된 라벨로서, 또는 용기에 제공되거나 함께 제공된 별도의 시트, 팜플렛, 카드 또는 폴더로서 인쇄될 수 있다.

재조합 폴리펩타이드 발현

본 발명의 실행은 다른 언급이 없는 한, (재조합 기술을 포함하는) 분자생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용하며, 이는 당해 기술분야의 숙련자의 범위내에 충분히 포함된다. 이러한 기술은 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition(Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology"(31) "Handbook of Experimental Immunology"(Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology"(Coligan, 1991)과 같은 문헌에서 충분히 설명되어 있다. 이러한 기술은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 생성에 적용가능하며, 마찬가지로 본 발명을 제조 및 실시하는데 고려될 수 있다. 특히, 특정 구현에 유용한 기술은 하기 섹션에 기술될 것이다.

하기 실시예는 본 발명의 어세이, 스크리닝 및 치료 방법을 제조 및 사용하는 방법의 전체적인 기재 및 설명과 함께 당해 기술분야의 숙련자에게 제공되도록 제시되며, 발명자들의 범위를 이들의 발명으로 제한하려는 것은 아닌 것으로 의도된다.

실시예

실시예 1: 새로운 IL-2 융합 단백질, ALT-801의 정맥내 투여는 마우스 모델에서 방광암을 억제한다.

ALT-801은 인터루킨-2와 인간 p53 펩타이드(aa264-272)/HLA-A*0201 복합체를 제시하는 종양을 인지할 수 있는 T 세포 리셉터(TCR) 도메인 사이의 융합 단백질이다. ALT-801의 정맥내 투여는 PBS 처리와 비교하여, MB49luc 동소 근육 침습성 및 표면 방광암을 함유하는 C57BL/6 마우스의 생존율을 현저히 연장시켰다. ALT-801-처리 마우스는 또한 MB49luc 종양 세포를 이용한 리챌린지시 생종하였으며, 이는 장기-지속 면역 반응 및 장기 메모리를 나타낸다. 또한, ALT-801은 누드 마우스에서 인간 방광암 HLA-A*0201+/p53 UMUC-14 및 HLA-A*0201-음성/p53+ KU7 이종 이식에 대하여 강력한 항종양 활성을 나타내었으며, 이는 ALT-801의 TCR 도메인 표적 활성이 효능에 요구되지 않음을 보여준다. 겜시타빈과 복합된 ALT-801은 UMUC-14 및 KU7 이종 이식 모델에서, 이러한 종양 세포의 GC에 대한 다른 민감성에도 불구하고 겜시타빈+시스플라틴(GC) 화학치료에 비해 보다 우수한 항종양 효과와 보다 약한 독성을 나타내었다.

실시예 2: 누드 마우스에서 인간 방광암 UMUC-14의 일차 종양 성장에 미치는 겜시타빈 및 시스플라틴과 조합된 ALT-801의 효과

c264scTCR-IL2(ALT-801) 단독 및 겜시타빈과 시스플라틴과의 조합의 다중 투여의 항종양 효과를, 인간 방광 UMUC-14 및 KU7P 세포를 함유하는 무흉선 누드 마우스에서 일차 종양 성장에 대해 평가하였다. 겜시타빈 및 시스플라틴 요법을 이용한 치료는 전이성 방광암을 가진 환자에 대해 치료기준이다. 인간 방광암 세포에 대한 이러한 화학치료제의 시험관내 효과를 평가하기 위해, HLA-A2⁺ p53⁺ UMUC-14 세포를 겜시타빈 및 시스플라틴 단독 및 조합으로 처리하였다. 24시간 배양 후, 겜시타빈, 시스플라틴 및 겜시타빈+시스플라틴은 G0/G1 세포 사이클 어레스트에 기인하여 UMUC-14 세포 증식에 투여향 의존적 감소를 일으켰다. 이러한 결과는 성장 세포들에서 이러한 제제들의 작용 메커니즘과 일치한다. 겜시타빈+시스플라틴 조합을 이용한 시험관내 배양은 또한 UMUC-14 종양 세포의 표면에서 p53 펩타이드(aa264-272)/HLA-A*0201 복합체의 제시를 유도하였으며, 이는 ALT-801에 대한 항원 표적이 이러한 처리에 의해 증가됨을 나타낸다.

인간 방광 종양세포주의 겜시타빈 및 시스플라틴에 대한 민감성은 세포 증식 어세이를 이용하여 더욱 평가되었다. UMUC-14 및 KU7P 세포는 다양한 양의 겜시타빈 및 시스플라틴을 함유하는 배지에 플래이팅되고, 24시간 후에 WST-1 시약을 이용하여 세포 증식을 검출하였다. 겜시타빈은 2030μM의 IC₅₀으로 UMUC-14 세포 성장을 저해하였으나, KU7P 세포 성장은 0.05μM의 IC₅₀으로 저해되었다. 또한, 시스플라틴은 UMUC-14 세포(IC₅₀, 9.2μM)에 비해 상당히 더 큰 KU7P 세포의 저해(IC₅₀, 1.4μM)를 나타내었다. 전체적인 이러한 결과는 UMUC-14 세포 성장이 상대적으로 내성이며, KU7P 세포 성장이 화학치료제에 대해 민감함을 보여준다.

그 다음, 겜시타빈, 시스플라틴 및 ALT-801 처리의 항종양 효과는 피하 UMUC-14 인간 방광 종양을 함유하는 누드 마우스에서 평가되었다. 이 시험에서, 4 그룹의 UMUC-14 종양을 함유하는 마우스(5마우스/그룹)에게 2 사이클의 시험 약물 처리가 주어졌으며, 각 사이클은 3주간 지속되었다. 겜시타빈 및 시스플라틴과 조합된 ALT-801(Gem+Cis+ALT-801)에 대해, 시스플라틴(Cis)(3mg/kg)을 i.v.로 시험 1일(SD1) 및 시험 22일(SD22)에 투여하고, 겜시타빈(Gem)(40mg/kg)을 SD1, SD8. SD22 및 SD29에 투여하고, 그리고 ALT-801(1.6mg/kg)을 SD3, SD5, SD8, SD10, SD24, SD26, SD29 및 SD31에 투여하였다(도 1). 다른 시험 처리 그룹은 적절한 스케쥴에 주어진 ALT-801 단독 치료, Gem+Cis 병용 치료, 또는 PBS를 포함하였다. 각각의 시험된 3 치료 요법(Gem+Cis+ALT-801; ALT-801; Gem+Cis)은 PBS-처리 마우스에서 관찰된 것에 비해 피하 UMUC-14 인간 방광 종양의 성장에 있어서 통계학적으로 현저한 감소를 일으켰다(도 1). 3 처리 그룹에서 특히 Gem+Cis+ALT-801은 (PBS-처리된 마우스에서의 종양에 비해) 87%의 종양 성장 억제로 가장 우수한 효능을 나타내었으며, 그 다음 ALT-801(77% TGI), 그리고 Cis(52% TGI)가 우수한 효능을 나타내었다. Gem+Cis 처리로 나타난 종양 부피의 감소는 제2 처리 사이클 중에만 관찰되었으며, 직접적인 항종양 활성 보다는 대 종양의 파괴 또는 괴사에 부분적으로 기여할 수 있었다. 겜시타빈 및 시스플라틴 처리와 조합된 ALT-801은 마우스 체중을 현저히 감소시키지 않았으며, 치사율이나 독성의 후처리 징후가 관찰되지 않았으며, 이는 이 처리요법이 안전하였음을 보여주는 것이다.

실시예 3: 누드 마우스에서 UMUC-14 인간 방광암의 일차 종양 성장에 미치는 겜시타빈과 조합된 ALT-801 또는 MART-1scTCR/IL-2 융합 단백질의 효과

본 시험은 ALT-801(c264scTCR-IL2) + 겜시타빈 및 비-표적 scTCR/IL-2 융합 단백질(MART-1scTCR/IL-2) + 겜시타빈의 다중 투여가 인간 방광 UMUC-14 세포를 함유하는 무흉선 누드 마우스에서 일차 종양 성장에 미치는 항종양 효과를 평가하기 위한 후속 시험으로 수행하였다. ALT-801(c264scTCR/IL-2)는 p53(aa264-272)/HLA-A*0201 복합체를 디스플래이하는 종양 세포를 인지하며, 그리고 무흉선 누드 마우스(Belmont, et al. 2006 Clin Immunol. 121:29, Wen, et al. 2008 Cancer Immunol Immunother. 57:1781)에서 HLA-A*0201+/p53 피하 종양의 성장을 억제하는 것으로 나타났다. MART-1scTCR/IL-2, 다양한 scTCR/IL-2 융합 단백질은 HLA-A*0201의 컨텍스트에 존재하는 MART-1(aa27-35)를 인지하나 p53(aa264-272)/HLA-A*A0201은 인지하지 않는다. 이 단백질은 HLA-A*0201⁺/p53⁺ 피하 종양을 이용한 시험에서 비-표적 컨트롤 제제로 제공되었다. ALT-801 및 MART-1scTCR/IL-2는 세포 표면 IL-2 리셉터에 바인딩하는 것과 대등한 능력을 나타내고, NK 세포 반응을 자극하는 것으로 나타났다. 그러나, ALT-801은 마우스 모델(Wen, et al. 2008 Cancer Immunol Immunother. 57:1781)에서 피하 HLA-A*0201⁺/p53⁺ A375 인간 흑색종양에 대해 MART-1scTCR/IL-2에 비해 상당히 보다 우수한 항종양 활성을 나타내었다. 이 효과는 ALT-801 단백질에 의한 종양 특이적 인지에 기인하는 것으로 보여진다.

겜시타빈과 조합된 ALT-801 및 MART-1scTCR/IL-2의 효능은 scTCR/IL-2 융합 단백질의 항종양 활성에 대한 종양 표적의 기여를 측정하기 위해 평가되었다. 겜시타빈+시스플라틴을 투여받은 종양을 함유하는 마우스는 본 시험을 위해 컨트롤 그룹으로 제공되었다.

피하 UMUC-14 종양(평균 용적 80㎣)을 함유하는 무흉선 누드 마우스(4마리/그룹)가 겜시타빈(40mg/kg)(Gem)+시스플라틴(3mg/kg)(Cis), ALT-801(1.6mg/kg)+Gem(40mg/kg) 또는 MART-1scTCR/IL-2(2.4mg/kg, ALT-801의 투여량 등가 활성)+Gem(40mg/kg)을 정맥내 처리되고, 2 처리 사이클이 주어졌다. 제1 처리 사이클은, 제1 사이클에서 시험일(SD) 1에 1 Cis 주사, SD 1 및 SD 8에 2 Gem 주사, 및 SD 3, SD 5, SD 8 및 SD 10에 ALT-801 또는 MART-1scTCR/IL-2의 4 주사로 구성되었다. 11일 휴식기(SD 15 - SD 21) 후, 제2 처리 사이클은 제1 사이클과 동일한 요법을 이용하여 본 시험을 위해 수행되었으며, 6일 후속 기간(SD 42 - SD 47)이 후속되었다.

ALT-801+Gem 또는 MART-1scTCR/IL-2+Gem을 이용한 처리는 Gem+Cis-처리된 마우스에서 관찰된 것과 비교하여 피하 UMUC-14 인간 방광 종양의 성장에 있어서 통계학적으로 현저한 감소를 이끌었다(도 2). ALT-801+Gem과 MART-1scTCR/IL-2+Gem 처리 사이에 있어서, 항종양 활성의 전체적인 현저한 차이가 발견되지 않았으나, ALT-801+Gem은 처리 코스중에 보다 우수한 항종양 효능의 경향을 나타내었다. 이러한 결과는 이 모델에서 ALT-801 치료 요법의 강력한 항종양 활성을 입증하는 이전 결과를 확인시켜 준다. 또한, 비-표적 MART-1scTCR/IL-2 융합 단백질의 관찰된 효능은 UMUC-14 인간 방광 이종 이식이 또한 IL-2 기초 치료에 매우 민감함을 나타낸다. 따라서, 이 데이터는, ALT-801의 c264scTCR 성분의 표적 활성이 UMUC-14 방광 종양 세포에 대한 이의 강력한 효능이 요구되지 않음을 입증한다. 실시예 2와 함께, 상기 결과는 화학치료(겜시타빈+시스플라틴 또는 겜시타빈)와 함께 IL-2 융합 단백질의 조합이 화학치료제에 내성인 종양 세포를 포함하는 인간 방광 종양에 대해 효과적인 치료를 형성함을 분명히 나타낸다.

치료 요법 중에 치사율 또는 후처리 징후가 관찰되지 않았다. 처리 코스 중에 여러 시점에서, Gem+Cis로 처리된 동물들에 비해 ALT-801+Gem 및 MART-1scTCR/IL-2+Gem 처리 그룹에서 현저한 체중 손실이 관찰되었다. 그러나, ALT-801+Gem 및 MART-1scTCR/IL-2+Gem 처리 그룹 모두에 대한 평균 마우스 체중은 11일 휴식기간 중에 그리고 1주일 후속 기간 중에 신속히 회복되었다. 이러한 발견은 ALT-801+Gem 및 MART-1scTCR/IL-2+Gem 치료 요법이 이 모델에서 일시적인 독성에 잘 용인됨을 입증한다.

실시예 4: 누드 마우스에서 UMUC-14 및 KU7 인간 방광암의 일차 종양 성장에 미치는 겜시타빈과 조합된 ALT-801 또는 MART-1scTCR/IL-2 융합 단백질의 효과

이들 시험은 인간 방광 UMUC-14 또는 KU7P 세포를 함유하는 무흉선 누드 마우스에서 일차 종양 성장에 미치는, 겜시타빈 또는 겜시타빈과 시스플라틴과 조합된 ALT-801(c264scTCR/IL-2) 및 겜시타빈과 조합된 비표적 scTCR/IL-2 융합 단백질(MART-1scTCR/IL-2)의 다중 투여의 항종양 효과를 평가하기 위해 수행되었다. PBS 또는 Gem+Cis를 받은 종양-함유 마우스는 본 시험에서 컨트롤 그룹으로 제공되었다. Gem 및 Cis는 전이성 방광암에 걸린 환자에 대한 치료 기준 화학치료이다.

피하 UMUC-14 종양(평균 용적 84㎣)을 함유하는 무흉선 누드 마우스(5마리/그룹)를 PBS, Gem(40mg/kg)+Cis(3mg/kg), MART-1scTCR/IL-2(2.19mg,kg, ALT-801의 투여량 등가 활성)+Gem(40mg/kg), ALT-801(1.6mg/kg)+Gem(40mg/kg) 또는 ALT-801(1.6mg/kg)+Gem(40mg/kg) 및 Cis(3mg/kg)로 처리하였으며, 2 처리 사이클이 주어졌다. 제1 처리 사이클은 제1 사이클에서 시험일(SD) 9에 1 Cis 주사, SD 9 및 SD 16에 2 Gem 주사, 그리고 SD 11, SD 13, SD 16 및 SD 18에 ALT-801 또는 MART-1scTCR/IL-2의 4 주사로 구성되었다. 본 시험에서 11일 휴식기(SD 19 - SD 30) 후에, 제2 처리 사이클은 제1 사이클에서와 동일한 요법을 이용하여 수행되고, 10일 후속 기간(SD 40 - SD 49)이 후속되었다.

MART-1scTCR/IL-2+Gem, ALT-801+Gem 또는 ALT-801+Gem+Cis를 이용한 처리는 PBS 처리된 마우스에서 관찰된 것과 비교하여 피하 UMUC-14 인간 방광 종양의 성장에 있어서 통계학적으로 유의한 감소를 일으켰다(도 3). 종양의 일부 표면이 균열되어 (SD 38에 시작한) PBS 및 (SD 29에 시작한) Gem+Cis 그룹 모두에서 종양 부피 측정의 정확도에 현저하게 영향을 미쳤음에도 불구하고 성장에 있어서 이러한 통계학적으로 현저한 감소가 관찰되었다. 처리 그룹 중에서 MART-1scTCR/IL-2+Gem, ALT-801+Gem 및 ALT-801+Gem+Cis에서 항종양의 현저한 감소가 관찰되지 않았으나, ALT-801+Gem+Cis는 본 시험의 처리 코스 중에 보다 우수한 항종양 효능의 경향을 나타내었다. 이러한 결과는 이 동물 모델에서 ALT-801 치료 요법의 강력한 항종양 활성을 입증하는 이전 결과를 확인해 준다. 또한, 비표적 MART-1scTCR/IL-2 융합 단백질의 관찰된 효능은 UMUC-14 인간 방광 이종이식이 또한 IL-2 기초 치료에 매우 민감함을 나타낸다. 따라서, 이 데이터는 또한 ALT-801의 264scTCR 성분의 표적 활성은 UMUC-14 방광 종양 세포에 대한 이의 강력한 효능이 요구되지 않음을 입증한다.

상기 치료 요법 중에 치사율은 관찰되지 않았다. 그러나, 치료 코스 중에 여러 시점에서, Cis로 처리되지 않은 동물들에 비해 Gem+Cis 및 ALT-801+Gem+Cis 처리 그룹에서 현저한 체중 감소가 관찰되었다(도 4). Cis를 이용한 경우에 항종양 활성에 있어 현저한 차이가 발견되지 않았으며, 체중 감소로부터의 회복은 느렸으며 이는 이러한 모델에서 Cis의 보다 높은 독성을 나타낸다. 이러한 결과는 Cis가 이 치료에서 치료적 유익을 제공하지 못함을 보여준다. 또한, 체중 감소는 PBS 그룹과 비교하였을 때, ALT-801+Gem 및 MART-1scTCR/IL-2+Gem 처리 그룹 모두에서 발견되었으나, ALT-801+Gem 및 MART-1scTCR/IL-2+Gem 처리 그룹 모두에 대한 평균 마우스 체중은 11일 휴식기간 및 13일 후속 기간 동안에 신속히 회복되었다. 이러한 발견은 ALT-801+Gem 및 MART-1scTCR/IL-2+Gem 치료 요법이 이 모델에서 일시적인 독성에 잘 견디는 것을 입증한다.

후속 조치로서, 다른 인간 방광 종양 세포주, KU7P를 사용하여 Gem 또는 Gem+Cis와 조합된 ALT-801 및 MART-1scTCR/IL-2의 효능을 더욱 평가하였다. 이 세포주는 HLA-A*0201 음성이며, p53 과발현 세포주이며, ALT-801 또는 MART-1scTCR/IL-2 분자에 의해 인지되는 항원을 디스플래이하지 않는다. 따라서, 이 모델의 결과는 Gem과 조합된 scTCR/IL-2 융합체의 "비-표적(non-targeted)" 항종양 활성이 누드 마우스에서 일차 인간 방광 종양 이종이식에 대해 효과적이라는 추가 증거를 제공할 수 있었다. PBS 또는 Gem+Cis를 투여받은 종양을 함유하는 마우스는 본 시험에서 컨트롤 그룹으로 제공되었다. 피하 KU7P 종양(PBS 그룹[~70㎣]을 제외하고 평균 용적 81㎣)을 함유하는 무흉선 누드 마우스(5마리/그룹)를 PBS, Gem(40mg/kg)+Cis(3mg/kg), MART-1scTCR/IL-2(2.19mg/kg, ALT-801의 투여량 등가 활성)+Gem(40mg/kg), ALT-801(1.6mg/kg)+Gem(40mg/kg) 또는 ALT-801(1.6mg/kg)+Gem(40mg/kg) 및 Cis(3mg/kg)으로 처리하였으며, 2 처리 사이클이 주어졌다. 제1 처리 사이클은 제1 사이클에서 시험일(SD) 7에 1 Cis 주사, SD 7 및 SD 14에 2 Gem 주사, 그리고 SD 9, SD 11, SD 14 및 SD 16에 ALT-801 또는 MART-1scTCR/IL-2의 4 주사로 구성되었다. 본 시험에서 11일 휴식기(SD 17 - SD 27) 후에, 제2 처리 사이클은 제1 사이클에서와 동일한 요법을 이용하여 수행되고, 10일 후속 기간(SD 37 - SD 45)이 후속되었다.

Gem+Cis, MART-1scTCR/IL-2+Gem, ALT-801+Gem 또는 ALT-801+Gem+Cis를 이용한 처리는 PBS 처리된 마우스에서 관찰된 것과 비교하여 피하 KU7P 인간 방광 종양의 성장에 있어서 통계학적으로 유의한 감소를 일으켰다(도 5). 처리 그룹들, Gem+Cis, MART-1scTCR/IL-2+Gem, ALT-801+Gem 및 ALT-801+Gem+Cis 사이에 항종양 활성에 있어 전체의 통계학적으로 유의한 차이는 발견되지 않았으나, ALT-801+Gem+Cis는 처리 코스 중에 (Gem+Cis에 비해) 보다 우수한 항종양 효능의 경향을 나타내었다. 이러한 결과는 상기 언급된 시험 결과와 일관되며, 이는 UMUC-14 방광 종양 이종이식 모델에서 ALT-801 및 MART-1scTCR/IL-2 치료 요법의 강력한 항종양 활성을 입증한다. 또한, 누드 마우스에서 HLA-A*0201-음성/p53 과발현 KU7P 인간 방광 종양에 있어서, Gem과 조합된 ALT-801 및 MART-1scTCR/IL-2의 관찰된 비-표적 효능은 Gem+IL-2 기초 치료에 대해 고 민감성이다. 따라서, 이 데이터는 또한 ALT-801의 264scTCR 성분의 표적 활성은 KU7P 방광 종양 세포에 대하여 Gem과 조합된 강력한 효능이 요구되지 않음을 입증한다. 또한, 본 시험 결과는 Gem+Cis 요법이 UMUC-14 방광 종양 모델에서 나타난 것에 비해 KU7P 방광 종양의 성장을 억제하는데 보다 효율적이었음을 나타내며, ALT-801은 Gem+Cis 요법에 대한 이들의 민감성과 관계없이 이러한 방광암세포들에 대해 효과적임을 나타낸다. 이러한 결과는 상기 겜시타빈과 시스플라틴에 대한 KU7P 세포의 시험관내 민감성 및 UMUC-14 세포의 내성과 일관된다. IL-2 융합 단백질 ALT-801 또는 MART-1scTCR/IL-2 단독 또는 Gem+Cis와 조합된 치료는 화학치료 민감성 및 내성 방광 종양 모두에 대해 효과적인 것으로 발견되었다.

상기 치료 요법 중에 치사율은 관찰되지 않았다. 그러나, 상기 언급된 시험과 일관되게, Cis로 처리되지 않은 동물들에 비해 Gem+Cis 및 ALT-801+Gem+Cis 처리 그룹에서 현저한 체중 감소가 관찰되었다(도 6). 상기한 바와 같이, KU7P 방광 종양은 Cis에 민감하며, ALT-801+Gem의 조합 투여시 경미하게 더 우수한 항종양 활성을 나타낸다. 그러나, Cis 처리 그룹에서 체중 감소로부터의 회복은 느렸으며, 이는 Cis의 보다 더 높은 독성을 나타내며, 따라서 이 모델에서 비호의적인 치료 지수를 나타낸다. 또한, PBS 그룹에 비해, 특히 제2 처리 사이클에서, ALT-801+Gem 및 MART-1scTCR/IL-2+Gem 처리 그룹 모두에서 체중 감소가 발견되었으나, ALT-801+Gem 및 MART-1scTCR/IL-2+Gem 처리 그룹 모두에서 평균 마우스 체중은 11일 휴식기 및 8일 후속기 중에 신속히 회복되었다. 이러한 발견은 ALT-801+Gem 및 MART-1scTCR/IL-2+Gem 치료 요법이 이 모델에서 일시적인 독성에 잘 견디는 것을 나타낸다.

상기와 동일한 처리 스케쥴을 이용하여, Gem(40mg/kg), MART-1scTCR/IL-2(2.19mg/kg, ALT-801의 투여량 등가 활성) 또는 ALT-801(1.6mg/kg)을 이용한 단일 치료의 항종양 효과를 조사하기 위해 피하 KU7P 방광 종양 이종이식 모델에서 유사한 시험을 수행하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, Gem, MART-1scTCR/IL-2 또는 ALT-801을 이용한 치료는 PBS 처리 마우스에서 관찰된 것과 비교하여 피하 KU7P 인간 방광 종양의 성장에 있어서 통계학적으로 유의한 감소를 일으켰다. 이 효과는 Gem+MART-1scTCR/IL-2 및 Gem+ALT-801 조합으로 관찰된 것에 비해 덜 내구적인 것으로 나타났으며, 여기서 연속 처리 후에 종양의 재성장이 거의 또는 완전히 발견되지 않았다(도 3 및 5). 따라서, IL-2 융합 단백질 및 화학치료(본 경우에 겜시타빈)를 이용한 병용 치료는 인간 방광 종양에 대해 가장 효과적인 항종양 활성을 제공하는 것으로 나타났다.

실시예 5: MB49luc 동소 근육 침윤성 방광 종양을 함유한 C57BL/6 및 Albino C57BL/6 마우스의 생존에 미치는 ALT-801의 효과. ALT-801의 TCR 도메인의 표적 활성은 항종양 활성에 필수적이지 않다.

ALT-801(c264scTCR-IL2)의 다중 투여 효과를 선천성 MB49luc 동소 근육 침윤성 방광 종양을 함유하는 면역적격 C57BL/6 및 albino C57BL/6 마우스의 생존에 대해 평가하였다. 이러한 종양은 ALT-801에 의해 인지되는 p53(aa264-272)/HLA-A*0201 복합체가 결핍되어 있기 때문에, 본 시험은 방광암에 대해 ALT-801의 "비-표적(non-targeted)" 항종양 활성을 평가하도록 디자인된다.

면역적격 albino C57BL/6 마우스에서 관련된 재생가능한 마우스 방광암 모델(뮤린 방광암세포주 MB49luc)을 사용하여 ALT-801의 효능을 평가하였다. MB49luc 세포주는 생물발광 어세이를 이용한 검출이 가능하도록 하는 루시페라아제를 발현한다. 방광의 트립신-EDTA 전처리 후, MB49luc(1x10⁶ cells/bladder)를 시험일 0에 albino C57BL/6 마우스(17주령)의 방광에 방광내 주입하였다. PBS(n=5) 또는 ALT-801(1.6mg/kg, n=4)를 MB49luc 종양 세포 주입 후 9, 16, 23 및 30일에 i.v. 투여하였다. 종양 주입 후 처리 그룹들 중에 생존율을 평가하기 위해 상기 마우스들을 효능 종점으로 유지하였다. ALT-801은 PBS와 비교하여 MB49luc를 함유하는 마우스의 생존율을 현저히 연장시켰다(P = 0.0171)(도 8). ALT-801 처리 그룹에서 생존 동물들은 초기 주입 후 84일에 MB49luc 세포의 방광내 주입(마우스당 1x10⁶ cells)으로 재챌린지되었다. 또한, 나이브 C57BL/6 컨트롤 마우스에 동일한 날에 종양 세포를 주입하여 컨트롤로 제공되었다. 그 다음, MB49luc 세포를 이용한 재챌린지 후 16일에 MB49luc 세포를 검출하기 위한 루시페라아제-기초 이미징을 수행하였다. 사전에 ALT-801-처리된 그룹의 종양 세포 재챌린지된 마우스는 생물발광 종양 신호를 나타내지 않았으나, MB49luc-주입된 나이브 마우스는 종양 세포 신호의 증거를 나타내었으며, 이는 사전에 ALT-801 처리된 그룹의 마우스가 MB49luc 종양 세포의 재-이식에 내성적이었음을 입증한다. 카플란-마이어 생존 곡선은 사전에 ALT-801-처리된 그룹의 재챌린지된 마우스가 나이브 MB49luc-주입된 마우스에 비해 현저히 더 오래 생존하였음을 보여주었다(P = 0.0246).

마찬가지로, 다른 실험으로, C57BL/6 마우스(9-10주령)에 방광의 폴리리신 전처리 후에 시험일 0에서 MB49luc(0.075x10⁶cells/bladder)를 방광내 주입하였다. PBS(n=6) 또는 ALT-801(1.6mg/kg, n=6)을 MB49luc 종양 세포 주입 후 7, 14, 21 및 28일에 i.v. 투여하였다. 처리 그룹 중에서 생존율을 평가하기 위해 마우스들은 효능 종점으로서 유지되었다. ALT-801은 PBS와 비교하여 MB49luc를 함유하는 마우스의 생존율을 현저히 연장시켰다(P = 0.007)(도 9a). ALT-801 처리의 생존자는 초기 주입 후 62일에 MB49luc 세포의 방광내 주입으로 재챌린지되었다(마우스당 0.075x10⁶ cells). 또한, 동일한 날에 나이브 C57BL/6 컨트롤 마우스(n=2)에 상기 종양 세포를 주입하여 컨트롤로서 제공하였다. 그 다음, MB49luc 세포로 재챌린지한 후 16일에 이미징을 수행하였다. 사전에 ALT-801-처리된 그룹의 종양 세포 재챌린지된 마우스는 생물발광 종양 신호를 나타내지 않았으나, MB49luc-주입된 나이브 마우스는 종양 세포 신호의 증거를 나타내었으며, 이는 사전에 ALT-801-처리된 그룹의 마우스가 MB49luc 종양 세포의 재-이식에 내성적이었음을 나타낸다(도 9b). 재챌린지 후 나이브 마우스에 비해 사전에 ALT-801-처리된 그룹의 마우스가 더 오래 생존하였으나, 카플란-마이어 분석은 두 그룹 간에 생존 시간의 통계학적으로 유의성을 나타내지 않았으며(P = 0.0896), 이는 아미도 그룹당 사용된 마우스의 수가 적었기 때문인 것으로 사료된다.

부가적인 시험으로, ALT-801의 정맥내 투여의 효과를 면역적격 C57BL/6 마우스에서 동소 MB49luc 근육 침윤성 방광암에서 더욱 평가하였다. 방광의 폴리리신 전처리 후, MB49luc(100μL에 0.075x10⁶ cells/bladder)를 시험일 0에 C57BL/6 마우스(10-11주령)의 방광에 방광내 주입하였다. PBS(n=10) 또는 ALT-801(1.6mg/kg, n=10)을 MB49luc 종양 세포 주입 후 7, 14, 21 및 28일에 i.v. 투여하였다. 처리 그룹 중에서 생존율을 평가하기 위해 마우스들은 효능 종점으로서 유지되었다. ALT-801은 PBS와 비교하여 MB49luc를 함유하는 마우스의 생존율을 현저히 연장시켰다(P = 0.007)(도 10). 이 모델에서 이전 시험과 일관되게, 동소 MB49luc 근육 침윤성 방광 종양에 대한 ALT-801의 관찰된 항종양 효과는 ALT-801 융합 단백질의 항원 표적 활성에 독립적이다.

요약하면, 이러한 결과는 ALT-801 i.v. 처리가 선천성 MB49luc 동소 근육 침윤성 방광 종양을 함유하는 면역적격 마우스의 생존 시간을 연장시키는데 효과적이었음을 입증하였다. ALT-801 처리는 또한 사전에 노출된 종양에 대하여 내구성 있는 면역학적 메모리 반응을 제공한다. 이러한 효과는 ALT-801 융합 단백질의 표적 활성에 독립적이다.

실시예 6: ALT-801의 정맥내 투여는 MB49luc 동소 표면 방광 종양을 함유하는 C57BL/6 마우스의 생존율을 연장하였다.

본 시험은 ALT-801을 다중 요법으로 정맥내(i.v.) 주입을 통해 투여시, 뮤린 MB49luc 동소 표면 방광 종양을 함유하는 C57BL/6 마우스의 생존에 미치는 ALT-801의 효과를 평가하기 위해 수행되었다. 본 시험은 이전 실시예에 기재된 면역적격 C57BL/6 마우스에서 관련된 재생가능한 뮤린 MB49luc 방광암 모델을 사용하였다. MB49luc 세포를 C57BL/6 마우스의 방광 내로 방광내 주입하는 것은 주입 후 1-2일에 표면 형태의 방광암을 형성하는 것으로 나타났다. 종양은 주입 후 7-9일에 근육 침윤성 형태로 발달되었으며, 종양-매개 치사율은 2-3주 후에 관찰되었다. 본 시험에서, ALT-801의 i.v. 투여의 생존 이익은 MB49luc 세포로부터 유래된 뮤린 동소 표면 방광암을 함유한 C57BL/6 마우스에서 조사되었다. 이러한 종양들은 ALT-801에 의해 인지되는 인간 p53(aa264-272)/HLA-A*0201 복합체가 결핍되어 있기 때문에, 본 시험은 마우스 동소 표면 방광암에 대해 ALT-801의 "비-표적" 항종양 활성을 평가하도록 디자인된다.

MB49luc(100μL에 담긴 0.075x10⁶ cells/bladder)를 방광의 폴리리신 전처리 후 시험일 0에 C57BL/6 마우스(9-11주령)의 방광에 방광내 주입하였다. PBS(n=8) 또는 ALT-801(1.6mg/kg, n=20)을 종양 세포 주입 후 1, 8, 15, 20, 23 및 27일에 i.v. 투여하였다. ALT-801의 정맥내 투여는 PBS 컨트롤과 비교하여 마우스의 생존율을 현저히 지연시켰다(P = 0.0497)(도 11).

또 다른 실험으로, C57BL/6 마우스(9-11주령)에 방광의 폴리리신 전처리 후 시험일 0에 MB49luc 세포(0.075x10⁶ cells/bladder)를 방광내 주입하였다. 한 그룹의 마우스(ALT-801 "1x4", n=9)를 SD 1, SD 8, SD 15, SD 22에 1.6mg/kg으로 일주일에 4회 ALT-801 주입으로 측면 꼬리를 통해 정맥내 처리하고, 두 번째 그룹의 마우스는 SD 1, SD 4, SD 8, SD 12, SD 15, SD 19, SD 22 및 SD 26에 1.6mg/kg(4주간 매주 2회)으로 8회 ALT-801 주입으로 처리하고, 컨트롤 그룹(n=8)은 종양 주입 후 SD 1, SD 4, SD 8, SD 12, SD 15, SD 19, SD 22 및 SD 26에 PBS(100μL)로 처리하였다. 1.6mg/kg에서 ALT-801을 이용한 "1x4" 및 "2x4" 치료 요법 모두 PBS 컨트롤 그룹과 비교하여 마우스 생존율을 현저히 연장시켰다(각각, P = 0.0413 및 P = 0.0010). PBS, ALT-801 "1x4"(도 12a) 및 ALT-801 "2x4"(도 12b) 그룹에 대한 평균 생존 시간은 각각, 15.5, 19 및 22일이었다. 상기 결과는 ALT-801의 매주 2회 투여가 뮤린 MB49luc 동소 표면 방광암에 대해 최상의 항종양 활성을 제공함을 제시한다. 시험물의 관찰된 항종양 효과는 ALT-801 융합 단백질의 항원 표적 활성에 독립적이다.

실시예 7: 면역 세포는 MB49luc 동소 방광 종양을 함유하는 C57BL/6 마우스의 ALT-801 처리에 의해 유도되었다.

본 시험은 뮤린 MB49luc 동소 방광 종양을 함유한 C57BL/6 마우스에서 ALT-801 치료의 면역 세포-기초 작용 메커니즘을 평가하기 위해 수행되었다. 상술한 바와 같이, C57BL/6 마우스에 방광의 폴리리신 전처리 후 시험일(SD) 0에 MB49luc 세포(0.075x10⁶ cells/bladder)를 방광내 주입하였다. 종양 주입되지 않은 마우스를 컨트롤 마우스로 제공하였다. 그 다음, 상기 마우스(6/그룹)를 SD 7, 10, 14 및 17에 PBS 또는 ALT-801로 i.v. 처리하였다. 각 처리 후 3일에(즉, SD 10, 13, 17, 20), 마우스 그룹들을 희생시키고, 종양 진행(혈뇨, 방광 크기, 외관, 신혈관 형성 및 형태)에 대해 방광을 조사하고, 혈액, 비장 및 방광을 면역세포 분석을 위해 수집하였다. PBMCs는 혈액으로부터 준비하였고, 비장세포 서스펜션은 비장으로부터 준비하였으며, 그리고 방광을 면역조직화학 염색을 위해 고정하고 절편화하였다. PMBCs에서 면역 세포(CD3, NK 및 CD8 양성 세포) 및 비장세포를 모노클로날 항체로 염색하고, 플로우 사이토메트리로 분석하였다. 면역 세포(마크로파지, NK 및 CD3 양성 세포)를 IHC에 의해 방광 섹션에서 평가하고, 종양 세포는 H&E 염색으로 조사하였다. 또한, 상기 시험에 걸쳐, 동물들로부터 소변을 수집하여 ELISA에 의해 소변 사이토카인 수준(IFNγ 및 TNFα)을 평가하였다.

이전 시험과 유사하게, MB49luc 세포의 방광내 주입은 방광에서 동소 종양의 확립을 형성하였으며, 이러한 종양이 7-20일 내에 근육층으로 신속히 진행되도록 하였다(도 13). 이러한 변화는 증가된 혈뇨, 방광의 신혈관 형성 및 방광 크기의 증가 및 외관의 다른 변화들로 반영되었다. 이전 시험에서와 같이, ALT-801을 이용한 치료는 이러한 변화를 반전시켰으며, 이는 SD 20에 정상적인 외관의 방광을 형성하였다(도 13). 그러나, MB49luc 종양을 함유하는 마우스 또는 정상 마우스의 ALT-801 치료는 방광 내로의 면역 세포 침투 증가를 일으켰다는 것에 주목할 만하다. 이러한 변화는 ALT-801 처리가 MB49luc 종양-함유 마우스 또는 정상 마우스 모두에서 CD3, CD8 및 NK 세포의 증가를 일으킨 PBMCs 및 비장에서도 반영되었다(도 14a 및 14b). 계속된 ALT-801 처리로, (PBMC CD8 세포를 제외한) 유도된 면역 세포는 SD 20에 정상 수준으로 돌아왔다. 방광에서, 마크로파지 수준은 종양 함유 동물에서 특히 SD 10에서 ALT-801 처리에 의해 가장 분명히 영향을 받았다(도 15). 방광 섹션에서 염색된 마크로파지의 수준을 정량화하고, 그래프화한 데이터를 도 16에 나타내었다. 그 결과는, 정상 마우스(도 16a) 및 MB49luc-종양 함유 마우스(도 16b) 모두에서, ALT-801 처리가 방광 마크로파지 수준을 현저히 증가시킨 것으로 나타났다. 종양 함유 마우스에서, 유도된 마크로파지 수준은, 방광 형태가 정상으로 돌아옴에 따라 SD 20에서 거의 정상 수준으로 돌아왔다. ALT-801 처리된 마우스에서 또한 유사하지만 덜 현저한 NK 및 CD3 양성 세포의 변화가 나타났다. 이러한 결과는 방광에서 마크로파지 및 다른 면역 세포 서브타입의 ALT-801 유도가 이 모델에서 관찰된 항-방광 종양 효과에 책임이 있음을 제시한다.

또한, 소변에서 사이토카인 수준의 분석은 ALT-801 처리가 면역 반응의 자극을 일으켰음을 보여주었다. ALT-801의 각 투여 후, IFNγ 수준의 증가가 MB49luc-종양 함유 마우스의 소변에서 검출되었다. ALT-801 처리는 이러한 동물의 소변에서 TNFα 수준을 유도하지 못하였다(도 17b). 그러나, TNFα 수준은 PBS 처리된 종양 함유 마우스에서 시간 경과에 따라 증가하며, 이는 종양 성장과 소변 TNFα 수준간의 인과관계를 제시한다. 혈청 IFNγ의 ALT-801-매개 유도 및 혈청 IFNγ 수준에 대한 치료 효과의 결여가 암 환자에서 관찰되었으며(Fishman et al. (2011) Clin Cancer Research 17:7765), 이는 ALT-801 치료에 대한 일반적인 면역 반응임을 나타낸다. 더불어, 이러한 관찰은 ALT-801 치료 후에 관찰되는 항종양 활성에서, IFNγ-생성 면역 세포, 아마도 마크로파지의 역할을 뒷받침한다.

실시예 8: ALT-801은 다발성 골수종의 뮤린 모델에서 마우스의 생존율을 증가시켰다.

상기 융합 단백질의 효과 및 작용 메커니즘을 조사하기 위해, ALT-801(c264scTCR-IL2)을 다발성 골수종의 면역적격 C57BL/6 마우스 모델에 다중 투여 요법으로 투여하였다. 인간 다발성 골수종의 재생가능한 뮤린 모델을 5T33 골수 세포주의 유도체인 5T33P 세포를 이용하여 개발하였다. ALT-801은 PBS로 투여된 경우에 비해 5T33P 골수를 함유하는 마우스의 생존율을 현저히 연장시켰으며, ALT-801 그룹의 재챌린지된 마우스는 나이브 5T33P-주입된 마우스보다 현저히 더 오래 생존하였다. 이러한 효과는 ALT-801 융합 단백질의 표적 활성에 독립적이며, ALT-801은 이전에 노출된 종양에 대하여 내구성 있는 면역학적 메모리 반응을 마우스에 제공하는 것으로 나타난다.

상술한 바와 같이, 다양한 시험은 ALT-801이 T 세포가 결핍된 면역결핍 마우스에서 이종이식 모델에서 HLA-A*0201+/p53 과발현(p53+) 인간 흑색종, 유선암종, 방광암 및 췌장암종에 대해 강력한 활성을 나타내는 것으로 나타났다. CD8 이펙터 T 세포는 ALT-801의 항종양 활성에 기여할 수 있기 때문에, 면역적격 마우스에서 부가적인 선천성 종양 모델이 ALT-801의 효능을 더욱 평가하도록 개발되었다. 이러한 종양은 p53 펩타이드(aa264-272)/HLA-A*0201 복합체의 발현에 결핍이 있다. 따라서, 이러한 모델에서 조사된 ALT-801의 효과는 TCR 표적에 독립적이다. 다발성 골수종에 미치는 면역조절 분자의 알려진 항암 효과에 기초하여, 면역적격 마우스에서 뮤린 골수종 모델이 개발되었으며, ALT-801의 효능 및 작용 메커니즘을 평가하기 위해 사용되었다.

C57BL/KalwRij 마우스에서 자발적으로 발생하는 일련의 이식가능한 뮤린 골수종 중 하나인 뮤린 5T33 골수종 세포는 C57BL/KalwRij 마우스에서 고 발암성이며, 500 정도로 적은 세포들이 종양 이식 후 36일 정도로 일찍 마비 및 사멸을 유도한다. 5T33-유도 세포주, 5T33P는 1x10⁷의 모 5T33 세포주가 이전에 주입된, 마비된 C57BL/6 마우스의 BM으로부터 분리되었다. 이 모델에서, 적어도 1x10⁷ 5T33P 세포의 투여가 약 100%의 흡수율로 C57BL/6 마우스에서 마비를 야기하는데 요구된다. 일반적으로, 1x10⁷ 5T33P 세포로 주사된 마우스는 종양 접종 후 SD 20과 SD 30 사이에 뒷다리에서 마비 징후를 나타낸다. 마비 외에, 이 모델에서 종양 발달 상태를 평가하기 위해 BM 세포에 의한 5T33-생성 IgG2b 파라프로틴의 발현이 또한 사용될 수 있다.

초기 시험으로, ALT-801이 5T33P 세포 성장에 미치는 직접적인 영향을 시험관내에서 평가하였다. 아포토시스 분석은, 500nM의 ALT-801이 5T33P 세포 증식에 영향을 주지 못하며 세포성 아포토시스를 유도하는 것으로 나타났다. 이전의 비임상 시험에 기초하여, 이러한 수준의 ALT-801은 치료 범위내에 있는 것으로 기대된다. 따라서, ALT-801은 5T33P 세포에 직접적인 세포독성 효과를 갖는 것으로 보이지 않는다.

그 다음, ALT-801의 생체내 항골수종 활성을 뮤린 5T33P 골수종양을 함유하는 면역적격 C57BL/6 마우스에서 조사하였다. 암컷 C57BL/6 마우스(5마우스/그룹)에 시험일 0(SD 0)에 측면 꼬리 정맥을 통해 i.v.로 5T33P 종양 세포(1x10⁷/마우스)를 주사하였다. 그 다음, 다중 투여 ALT-801 처리를 종양 세포 주사 후 1일(ALT-801-SD1 처리 그룹) 또는 4일(ALT-801-SD4 처리 그룹)에 착수하였다. ALT-801-SD 1 처리 그룹에 있어서, ALT-801은 SD 1, SD 4, SD 8 및 SD 11에(즉, 4 투여) 1.6mg/kg으로 i.v. 투여하였다. 5T33P 종양-함유 마우스는 동일한 날에 (투여 등가 부피의) PBS를 받았으며 컨트롤로서 제공되었다. ALT-801-SD4 처리 그룹에 있어서, ALT-801은 SD 4, SD 8, SD 11 및 SD 15에 1.6mg/kg으로 i.v. 투여하였다. 마우스들들 마비 또는 종양 성장 및 생존의 임상적 징후에 대해 모니터하였다. 뒷다리 마비를 나타내는 마우스는 빈사 상태(moribund)로 간주되었다. PBS 그룹의 모든 마우스들은 SD 22와 SD 34 사이에 마비 징후를 나타내었으며, 이 그룹은 종양 세포 투여 후 29일의 평균 생존을 가졌다. 이와 상반적으로, ALT-801-SD 1 및 ALT-801-SD 4 그룹의 모든 마우스들은 SD 73(ALT-801-SD 1 그룹에 대한 관찰 기간의 마지막)을 넘어 생존하였으며, 이는 이러한 마우스들이 5T33P 종양이 나았음을 나타낸다. 따라서, SD 1 또는 SD 4에 착수된 다중 투여 ALT-801 처리는 PBS 컨트롤 그룹과 비교하여 5T33P 골수종-함유 마우스의 생존을 현저히 연장하는 것으로 발견되었다(ALT-801-SD 1 vs. PBS, P < 0.002; ALT-801-SD 4 vs. PBS, P < 0.002). ALT-801-SD 4 그룹과 ALT-801-SD 1 그룹 사이에 주목할만한 차이가 관찰되지 않았다(P > 0.05). 이러한 결과는 ALT-801 처리가 이 면역적격 마우스 모델에서 5T33P 골수종 세포에 매우 효과적임을 나타낸다.

ALT-801 처리가 장기 항종양 효과를 제공하는지 평가하기 위해, 5T33P 골수종 세포를 이전의 골수종 세포에 챌린지로 생존한 ALT-801-처리 마우스에 재투여하였다. ALT-801-SD1 처리 그룹(n=5)의 마우스에 (초기 종양 세포 챌린지 후) SD 73에 1x10⁷ 5T33P 세포로 재챌린지하고, ALT-801-SD 4 처리 그룹(n=5)의 마우스에 SD 106에 1x10⁷ 5T33P 세포로 재챌린지하였다. 각 경우에, 또한, 5 처리-나이브 마우스에 종양 발달에 대한 컨트롤로서 1x10⁷ 5T33P 세포를 주사하였다. 어느 시험 그룹에도 추가 ALT-801 시험 약물 처리를 투여하지 않았다. 종양 세포 재챌린지 후에, SD 192에서 실험 종료까지 5마리의 모든 ALT-801-SD 1 마우스가 생존하였으나, 이에 반해 SD 73에 5T33P 세포를 받은 5마리의 모든 나이브 마우스는 SD 89와 SD 107 사이에 마비를 나타내었으며, 종양 세포 투여 후 16일의 평균 생존을 나타내었다. 마찬가지로, 5마리의 모든 ALT-801-SD 4 마우스는 SD 192까지 생존하였으나, SD 106에 5T33P 세포를 받은 5마리 나이브 마우스 중 4마리는 SD 124와 SD 138 사이에 마비를 나타내었으며, 종양 세포 투여 후 32일의 평균 생존을 나타내었다. 전체적으로, 5T33P 골수종 세포 재챌린지 전에 100일에 걸쳐 주어진 ALT-801 처리는 마비 및 치사율로부터 마우스를 현저히 보호하였다. 이와 함께, 이러한 결과는 5T33P 골수종에 대한 ALT-801의 효능뿐만 아니라, 장기 지속 면역학적 메모리를 유도하는 능력을 입증한다. 또한, 상기 데이터는 활성화된 작동인자 및 T 세포의 메모리 세포 및/또는 NK 세포 서브셋이 5T33P 종양 세포에 대해 ALT-801의 항종양 활성에 필수적인 역할을 할 수 있으며, 이러한 면역 세포들이 적어도 3개월간 종양 재챌린지로부터 C57BL/6 마우스를 보호하는데 작용할 수 있음을 입증한다.

치료 요법 중에 치사율은 관찰되지 않았다. 대부분의 경우에, 연속적으로 현저한 체중 감소가 PBS 및 나이브 처리 그룹에서 마우스들이 뒷다리 마리를 나타내기 직전에 관찰되었으며, 이는 이러한 모델에서 전형적인 징후이다. ALT-801 처리 그룹에서 현저한 체중 감소가 관찰되지 않았으며, 이는 ALT-801을 이용한 다른 선천성 마우스 모델에서의 관찰과 일치한다. 이러한 발견은 ALT-801 치료 요법이 이러한 모델에서 일시적인 독성에 잘 견디는 것을 보여준다. 다발성 골수종에서 ALT-801 처리의 임상 평가는 환자의 HLA-A*0201 유전적 배경에 관계없이 환자에서 고려되어야 한다.

단일 투여 ALT-801 처리는 PBS와 비교하여 5T33P를 함유하는 마우스의 생존을 현저히 연장시켰다. 이러한 효과는 시험관내 파라프로틴 생성 어세이에 의해 평가된 바와 같이 골수에서 골수종 세포를 감소시키는 시험 약물의 능력과 관련된다. ALT-801의 1 또는 2 투여로 5T33P 종양-함유 마우스를 치료하는 것은 PBS 그룹에 비해 혈액내의 CD8⁺ T 세포 및 NK 세포의 수 및/또는 퍼센트를 현저히 증가시킨다. 면역 세포 고갈 시험은, ALT-801의 항-골수종 활성이 CD8+ T 세포에 주로 기인하였으며, 그리고 NK 세포에 부분적으로 기인하였음을 입증하였다. 또한, 다른 면역 세포가 ALT-801 매개 항-골수 효과에 역할을 할 수 있다.

C57BL/6 마우스 모델에서 마우스 5T33P 골수종 세포의 성장에 미치는 ALT-801의 효과 및 작용 메커니즘을 더욱 평가하였다. 본 시험의 제1 부로, 단일-투여 ALT-801의 항종양 활성을 이 모델에서 평가하였다. 암컷 C57BL/6 마우스(5마우스/그룹)에 5T33P 골수종 세포를 i.v. 주사하였다. 4일 후, 5T33P 종양-함유 마우스에 ALT-801(1.6mg/kg) 또는 PBS(투여량 등가 부피)의 단일 i.v. 주사를 투여하였다. 마우스 생존율은 시험 종점으로 모니터하였으며, 뒷다리 마비를 나타내는 마우스를 빈사 상태로 간주하였다. 치사율은 종양 세포 주사 후 35일까지 PBS 그룹에서 5마리 모두에서 관찰되었으며, 24일의 평균 생존을 나타내었다. 이와 대조적으로, ALT-801 처리된 마우스의 치사율은 현저히 지연되었으며, 49일의 평균 생존을 나타내었다(vs. PBS 그룹, P=0.013). ALT-801 그룹에서 5마리 마우스 중 1마리는 120일 관찰 기간에 걸쳐 살아있는 채로 남아있었다.

상기 시험의 제2 부로, 골수에서 골수종 세포에 미치는 단일-투여 ALT-801의 단기 효과를 5T33P 모델에서 평가하였다. 종양-함유 마우스를 ALT-801(1.6mg/kg) 또는 PBS로 처리하고, 골수 세포를 처리 후 1, 4 및 8일에 수집하였다. 그 다음, 세포들을 6일간 시험관내에서 배양하고, 배양 상층물을 5T33P 세포-생성 파라프로틴(마우스 IgG2b)에 대해 ELISA로 분석하였다. 생체내에서 ALT-801 처리는 PBS 그룹과 비교하여 후속적인 골수 배양에서 현저히 보다 낮은 수준의 파라프로핀을 형성하였다(P<0.05). 파라프로틴 수준의 30배 까지의 감소가 ALT-801 처리 그룹의 배양물에서 관찰되었다. 이 효과는 시험 약물 처리 후 골수 수집의 3 시점 모두에서 관찰되었다. 따라서, 단일 투여 ALT-801 처리의 (파라프로틴 생성으로 측정된) 5T33P 골수 세포를 감소시키는 능력은 이러한 모델에서 생존율을 연장시키는 ALT-801의 효과와 일치하였다.

면역적격 C57BL/6 마우스에서 마우스 5733P 골수 세포에 대한 ALT-801의 항-골수종 효과에 있어서 작동인자 면역 세포의 역할을 조사하기 위해 추가 시험을 디자인하였다. 다른 비-임상 시험 및 임상 시험에서 이전 결과와 일관되게, 1.2mg/kg ALT-801의 1 또는 2 투여량으로 5T33P 종양-함유 마우스의 처리는 PBS 컨드롤 그룹에서 관찰되는 것과 비교하여 혈액에서 CD8⁺ T 세포 및 NK 세포의 수 및/또는 퍼센트의 현저한 증가를 일으켰다. ALT-801 처리는 또한 혈중 CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ Treg 세포의 퍼센트를 증가시켰다. 그러나, 이러한 변화는 이펙터 CD8⁺ T 세포 및 NK 세포 서스셋에서 나타낸 것에 비해 현저히 덜하였으며, 이는 ALT-801 처리의 지배적인 효과가 아님을 나타낸다.

1.2mg/kg ALT-801을 이용한 1 또는 2 투여량 처리는 또한 5T33P-유래 파라프로틴을 검출하기 위한 골수 세포 배양을 이용하여 평가한 경우에, 처리 후 4일에 골수에서 5T33P 골수 세포의 수를 감소시키는데 효과적이었다. 면역 세포 고갈 시험은, ALT-801의 항-골수종 활성이 CD8+ T 세포에 주로 기인하였으며, NK 세포에 부분적으로 기인하였음을 입증하였다. CD8+ 및 NK-세포 고갈이 C57BL/6 마우스에서 5T33P 종양 세포에 대해 항종양 효과를 완전히 제거할 수 없었기 때문에, 다른 면역 세포들이 ALT-801 매개 항-골수종 효과에 역할을 할 수 있다. 이러한 시험 결과는 ALT-801 처리가 골수-함유 면역적격 마우스의 생존 연장에 매우 효과적이었음을 입증하는 이전 시험과 일치하였다.

실시예 9: ALT-801은 MB49luc 종양 함유 마우스의 생존을 현저히 연장시킨다.

ALT-801의 정맥내 투여의 효과를 면역적격 C57BL/6 마우스에서 동소 MB49luc 근육 침윤성 방광암 모델에서 IL-2의 효과와 비교하였다. 전임상 동물 시험은, ALT-801이 누드 마우스에서 피하 HLA-A*0201⁺ p53 과발현(p53⁺) UMUC-14 및 HLA-A*0201-음성 p53 과발현(p53⁺) KU7 인간 방광 종양 이종이식에 대하여 유사한 항종양 활성을 나타내었음을 보여주었으며, 이는 종양 세포 상의 HLA-A*0201/p53 펩타이드 복합체 표적화가 ALT-801 치료 효능에 필수적이지 않음을 나타낸다. 면역적격 C57BL/6 마우스에서 뮤린 MB49luc 동소 근육 침윤성 방광 종양에 대한 ALT-801의 효과에 관한 추가 조사는 또한 ALT-801의 "비-표적" 항종양 활성을 암시하였다. 뮤린 MB49luc 종양 세포는 ALT-801에 의해 인지되는 인간 HLA-A*0201/p53 펩타이드 복합체가 결핍되어 있는 것을 알려져 있다. 임상 시험은, 방광암이 IL-2-기초 치료에 보통의 민감성을 나타내는 것으로 나타났다. ALT-801의 항종양 활성을 이해하기 위해, 방광 종양 모델에서 IL-2 및 ALT-801의 항종양 활성을 비교하는 것에 관심이 있었다.

ALT-801 및 IL-2 정맥내 처리의 항종양 효과를 면역적격 C57BL/6 마우스에서 마우스 방광 동소 모델에서 평가하였다. C57BL/6 마우스(10-11주령)에 방광의 폴리리신 전처리 후 0일에 MB49luc 세포(100μL에 담긴 3x10⁴ cells/bladder)를 방광내 주입하였다. ALT-801(1.6mg/kg, n=8), IL-2(0.42mg/kg, n=8) 또는 PBS(100μL, n=8)을 종양 세포 주입 후 7, 10, 14 및 17일에 i.v. 투여하였다. ALT-801의 4 정맥 투여는 IL-2 및 PBS 컨트롤에 비해 마우스의 생존을 현저히 연장시켰다(P ≤ 0.0002)(도 18). IL-2와 PBS 컨트롤 그룹 사이에 현저하기 유의한 차이는 관찰되지 않았으며(P=0.84), 이는 IL-2가 항종양 효과를 갖지 않았음을 나타낸다. 이러한 결과는 1주일에 2회 ALT-801 처리가 MB49luc 방광 종양에 대해 재조합 인간 IL-2보다 상당히 더 큰 효능을 나타냄을 보여주었다. 유사한 결과가 또한 반복된 시험으로부터 획득되었다.

실시예 10: ALT-801은

, NK 또는 CD4 및 CD8 세포 고갈 후 MB49luc 종양 함유 마우스의 생존을 증가시켰다.

상술한 바와 같이, ALT-801 처리는 MB49luc-함유 마우스의 비장 및 혈액에서 CD3⁺ T 세포, CD8⁺ T 세포 및 NK 세포 퍼센트의 퍼센트를 증가시켰다. 실제로, 혈중 CD8⁺ T 세포는 4 투여 ALT-801 처리 코스에 걸쳐 현저히 상승된 채로 유지되었다. 방광에서 CD3⁺ T 세포 및 NK 세포의 증가된 침투는 또한 MB49luc 종양-함유 마우스에서 ALT-801의 반복 투여 후에 관찰되었다. 이와 상반적으로, 방광 마크로파지 수준은 ALT-801 처리와 관계없이, 동소 MB49luc 종양 진행과 함께 증가되었다. 이러한 결과는, 하나 이상의 이러한 면역 세포 서브셋이 이러한 모델에서 ALT-801의 항종양 활성에 역할을 함을 보여주었다.

ALT-801 정맥내 주사의 항종양 효과는 MB49luc 동소 방광 종양을 함유하는 C57BL/6 마우스에서

, NK 또는 CD4 및 CD8 세포 고갈 후에 평가되었다. 마우스에 SD 0에 MB49luc 주입을 한 다음, SD 7, 10, 14 및 17에 PBS 또는 ALT-801(1.6mg/kg)을 i.v. 주입하였다. ALT-801 또는 PBS 처리 전에, 마우스 그룹들은 SD 6, 9, 13 및 16에 Clophosome(150μL/dose)의 i.p. 주사에 의해

고갈을 받게 하거나; SD 2, 3, 6, 9, 13 및 16에 항-NK Ab(100μL에 담긴 클론 PK136, 250㎍)의 i.p. 주사에 의해 NK 세포 고갈을 받게 하거나; 또는 SD 2, 3, 6, 9, 13 및 16에 항-CD4 Ab(100μL에 담긴 클론 GK1.5, 250㎍) 및 항-CD8 Ab(100μL에 담긴 클론 53-6.72, 250㎍)의 i.p. 주사에 의해 CD4 및 CD8 세포 고갈을 받게하였다. 마우스들은 효능 종점으로서 시험 그룹 중에 생존율을 평가하도록 유지되었다.

정맥내 투여된 ALT-801은 PBS 컨트롤 마우스와 비교하여 마우스의 생존을 현저히 연장시켰다(P=0.0014)(도 19a). 유사한 결과가 PBS 컨트롤 마우스에 비해 NK 세포가 고갈된 ALT-801 처리된 마우스에서 획득되었다(P=0.0068)(도 19b). ALT-801 처리 후에 관찰된 생존에 미치는 항종양 효과는

(P=0.1435)(도 19c) 또는 CD4/CD8 세포(P=0.5993)(도 19d)의 고갈 후에 없어졌다.

결과는,

및/또는 CD4/CD8 세포가 MB49luc 동소 방광 종양을 함유하는 C57BL/6 마우스에서 ALT-801의 항종양 효과에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. MB49luc 종양-함유 마우스에서 NK 세포의 고갈은 ALT-801의 효과에 어떠한 영향을 주는 것으로 나타나지 않았으며, 이는 NK 세포가 ALT-801-매개 항종양 반응에 필요없거나 또는 다른 세포 타입이 NK 세포 활성에 대해 보상하는 것을 제시한다.

골수종 유래 억제 세포(MDSCs)가 다수의 종양 모델에서 확장되는 것으로 보여주는 다수의 문헌이 존재한다. MDSCs는 다양한 메커니즘을 통해 NK 및 T 세포를 억제하는 것으로 작용한다. 특정한 이론으로 규정하려는 것은 아니나, 동소 MB49luc 종양을 함유하는 마우스에서 MDSCs의 존재는 종양 발달을 이끄는 면역억제 메커니즘의 증거를 제공할 수 있다.

이러한 모델에서 MDSC 수준을 평가하기 위해, C57BL/6 마우스에 상술한 바와 같이 MB49luc 종양 세포(0.03x10⁶ cells/mouse)를 주입하였다. 컨트롤 마우스에는 종양 세포를 투여하지 않았다. 종양 세포 주입 후 3, 5, 7, 10 및 13일에 컨트롤 및 종양-함유 C57BL/6 마우스(그룹당 5)로부터 혈액을 수집하였다. 혈액 중에 GR-1⁺/CD11b⁺ MDSCs의 수준을 플로우 사이토메트리에 의해 평가하였다. 혈중 MDSC 수준은 종양 세포 주입 후 3일 정도로 일찍 종양 함유 마우스에서 증가하였으며, 이러한 동물들에서 시간이 지남에 따라 더욱 증가하였다(도 20). 종양 함유 마우스에서 혈중 MDSC 수준은 MB49luc 세포 주입 후 13일에 컨트롤 마우스에 비해 현저히 증가하였다.

이러한 발견은 MDSCs가 면역 시스템을 억제하는데 한 역할을 하여 동소 MB49luc 종양 모델에서 종양 성장을 촉진할 수 있음을 제시한다. 이 시험은 MB49luc 동소 방광 종양을 함유하는 C57BL/6 마우스에서 종양 진행 및 ALT-801의 항종양 활성에 다양한 면역 세포 타입의 역할을 평가하기 위해 수행되었다.

실시예 11: ALT-801의 정맥내 투여는 MB49luc 동소 방광 종양을 함유하는 C57BL/6 마우스의 방광에서 M1-타입 마크로파지를 증가시켰다.

이전의 전임상 동물 시험에서, ALT-801의 정맥내 투여는 MB49luc 동소 방광암을 함유하는 C57BL/6 마우스의 생존을 연장시켰다. MB49luc 종양-함유 마우스로부터 방광의 IHC 염색은 ALT-801을 이용한 반복된 투여 후에, PBS 컨트롤 처리 마우스의 방광에서 보여지는 것보다 더 높은 수준의 CD3 및 NK 세포 침투를 나타내었다. F4/80 판 마크로파지 마커에 의한 마크로파지의 검출은, 보다 많은 마크로파지가, 처리에 관계없이 종양 성장으로서 방광내로 침투되었음을 나타내었다. 이 시험은 MB49luc-함유 마우스의 방광에서 마크로파지의 기능적 표현형에 미치는 ALT-801-매개 효과를 특성화하기 위해 수행되었다.

마크로파지는 이들의 풍부성, 가소성 및 다양성에 기인하여 고형 종양에 중요한 역할을 한다. 마크로파지의 2개의 현저한 활성화 상태가 인식된다: 고전적으로 활성화된 (M1) 표현형 및 변형적으로 활성화된 (M2) 표현형. 각 타입의 마크로파지는 동정을 위해 그 자신의 마커를 갖는다. M1 마크로파지의 특징은 iNOS, ROS의 발현 및 IL-12의 생성을 포함한다. M2 마크로파지는 IL-10, IL-1b, VEGF 및 매트릭스 메탈로프로테이나아제(MMPs)의 고 생성과 연관된다.

2 처리 그룹, PBS 및 ALT-801(3마리의 마우스/그룹)이 본 시험에 포함되었다. 시험일(SD) 0에, 폴리리신 전처리 10분 후, MB49luc 세포(0.06x10⁶ cells/mouse)를 방광내 주입하였다. SD 11에, 100μL의 ALT-801(1.6mg/kg) 또는 PBS를 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 마우스들을 처리 24시간내에 희생시키고, 이들의 방광을 액체 질소를 이용하여 OCT에 스냅-동결(snap-frozen)하였다. IHC 염색을 수행하여 방광에서 마크로파지의 활성화 상태를 체크하였다. iNOS 및 MMP-9를 사용하여 각각, M1 및 M2 마크로파지를 확인하였다.

IHC 결과는 ALT-801의 i.v. 주사가 PBS 처리된 종양-함유 마우스의 방광에 비해 MB49luc 종양-함유 마우스의 방광에서 M1 타입 마크로파지를 증가시켰음을 보여주었다(도 21). MMP-9 양성 세포는 ALT-801 그룹에서 1마리 마우스를 제외하고 PBS 및 ALT-801 양 그룹의 모든 마우스에서 검출가능하였다. 그 특정 마우스는 ALT-801 처리 후에 방광에서 종양-프리인 것으로 보였으며, F4/80 마커가 검출가능하였음에도 불구하고 iNOS 또는 MMP-9을 이용하여서 어떠한 양성 염색을 나타내지 않았다. 이러한 결과는, iNOS 및 MMP-9가 마크로파지 활성화 마커이기 때문에, 마크로파지가 종양-프리 환경에서 활성화되지 않았음을 보여주었다. F4/80 항체 염색은 비-종양 함유 마우스에 비해 MB49luc 동소 종양-함유 마우스의 방광에서 상당수의 마크로파지를 보여주었다. 방광 마크로파지의 F4/80 항체 염색의 수준 면에서, PBS와 ALT-801 처리 그룹 사이에 현저한 차이는 없었다. 결론적으로, MB49luc-함유 마우스의 정맥내 ALT-801 처리 후에 보다 높은 퍼센트의 마크로파지가 방광에서 M1 표현형으로 재분극화(repolarized)되었다. ALT-801 효능은 MB49luc 종양-함유 마우스에서 마크로파지에 의존하였다는 발견과 함께, 이러한 결과는 재분극화된 M1 마크로파지가 ALT-801에 의해 가해진 항종양 효과에 기여할 수 있음을 제시한다.

실시예 12: ALT-801은 C57BL/6 마우스에서 IFN-γ를 생성하는 세포를 유도하였다.

이전 시험은, 면역적격 C57BL/6 마우스에서 동소 MB49luc 근육 침윤성 방광암에서 정맥내 ALT-801 투여의 항종양 활성을 입증하였다. 마우스 MB49luc 세포는 ALT-801에 의해 인지되는 인간 p53(aa 264-272)/HLA-A*0201 복합체를 발현하지 못한다. 따라서, MB49luc 종양에 대한 ALT-801의 "비-표적" 항종양 활성이 가설로 제기되었다. 뮤린 MB49luc 방광 종양 세포에 대한 ALT-801의 작용 메커니즘을 평가하였다.

ALT-801 처리는 동물 모델 및 암 환자에서 IFN-γ의 혈청 수준을 증가시키는 것으로 이전에 나타났다(Fishman et al., Clin Cancer Res, 17: 7765-7775, 2011; Wen et al., Cancer Immunol Immunother, 57: 1781-1794, 2008). IFN-γ는 다양한 종양 세포 성장을 억제하고, 종양 세포에서의 MHC 분자 발현을 상향 조절하고, 다양한 면역 세포 및 항-혈관형성을 활성화시킴으로써 항종양 면역성에 중요한 역할을 한다. IFN-γ는 활성화 후에 예를 들어, CD⁺4 세포, CD8⁺ T 세포 및 NK 세포와 같은 면역 세포들의 다중 서브셋에 의해 생성될 수 있다. 이 보고서에서, IFN-γ 수준은 ALT-801을 1.6mg/kg으로 정맥내 투여 후 24시간에 C57CL/6 마우스로부터 혈액에서 평가되었다. IFN-γ은 컨트롤 마우스의 혈청에서 검출불가 하였으나(n=5), ALT-801 투여 후에는 196(±44)pg/mL의 농도에 도달하였다(n=5)(도 22). 어느 세포 타입이 ALT-801 처리 후 주요한 IFN-γ 생성자인지 조사하기 위해, 마우스 CD4, CD8 및 NK 세포에 대한 모노클로날 항체를 C57BL/6 암컷 마우스에 주기적으로 주사하여 이에 상응하는 면역 세포 서브셋을 고갈시켰다. 면역 세포-고갈된 마우스에서 혈청 IFN-γ 수준을 ALT-801 주사 24시간 후에 검출하였다. 그 결과는, CD4, NK 및 트리플 CD4, CD8 및 NK 세포-매개 마우스(n=5/그룹)의 혈청에서 IFN-γ 농도는 ALT-801 투여 후에 각각, 75(±58)pg/mL, 74(±25)pg/mL 및 82(±52)pg/mL에 도달한 것으로 나타났다(도 22). 이와 상반적으로, CD8 T 세포-고갈된 마우스(n=5)의 혈청 IFN-γ 수준은 257(±60)pg/mL에 도달하였다. 그 결과는, CD⁺8 T 세포가 아니라, CD4⁺ T 세포 및 NK 세포가 ALT-801-유도 IFN-γ의 주 생성자임을 나타내었다. 혈청 IFN-γ의 현저한 유도는 CD4⁺, CD8⁺ T 세포 및 NK 세포의 삼중 고갈과 함께 마우스를 ALT-801 처리한 후에도 여전히 검출될 수 있었다. 이러한 발견은, CD4⁺ T 세포 및 NK 세포 외에 다른 타입의 세포들 또한 ALT-801 처리 마우스에서 IFN-γ 생성에 기여하였음을 나타내었다.

본 시험의 제2 부에서, MB49luc 세포 성장에 미치는 IFN-γ의 효과를 조사하였다. MB49luc 세포(2x10⁵/well)를 1 또는 10ng/mL의 IFN-γ과 함께 RPMI-10에서 배양하였다. IFN-γ 처리된 MB49luc 세포를 수거하고, FITC-표지 Annexin V로 염색하였다. Annexing V 양성 아포토틱 MB49luc 세포는 플로우 사이토메트리에 의해 검출되었다. IFN-γ 처리는 MB49luc 세포에 대해 검출가능한 세포독성을 직접적으로 형성하지 않는다(도 23).

마우스 비장세포는 20nM ALT-801이 함유된 RPMI-10에서 3일간 배양한 다음, 세포독성 어세이에서 PKH67-표지된 MB49luc 표적 세포에 대한 이펙터 LAK 세포로서 사용하였다. 상기 이펙터 세포(4x10⁶/well) 및 표적 세포(4x10⁵/well)를 0-50nM ALT-801을 함유하는 RPMI에서 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. MB49luc 세포에 대한 LAK 세포의 세포독성은 프로피듐 요오드를 이용한 염색에 기초하여 플로우 사이토메트리에 의해 평가하였다. ALT-801 활성화된 비장세포는 세포독성 어세이 중에 존재하는 ALT-801의 농도에 의존하는 방식으로 MB49luc 세포를 효과적으로 용해하였다(도 24).

겜시타빈은 근육 침윤성 방광암을 위한 표준 병용 치료의 약물 중 하나이다. 겜시타빈은 종양-함유 마우스에서 골수종-유래 억제 세포(MDSCs)를 감소시키는 것으로 보고되었다. 이 보고서에서, 출원인은 마우스에서 MB49luc 세포에 의해 유도되는 MDSCs에 미치는 겜시타빈의 영향을 조사하였다. MB49luc 종양-함유 마우스에 40mg/kg으로 겜시타빈을 정맥내 처리하였다. 겜시타빈 처리 후 3일에, 비장세포를 분리하고, Gr1⁺CD11b⁺MDSCs의 퍼센트를 플로우 사이토메트리에 의해 검출하였다. MDSCs는 MB49luc 종양을 함유하지 않은 정상 컨트롤 마우스에서 비장세포의 1.19(±0.25) 퍼센트를 나타낸다. 이러한 MDSCs는 MB49luc 종양-함유 마우스에서 비장세포의 4.29(±1.32) 퍼센트로 증가하였다. 이와 상반적으로, 겜시타빈을 이용한 종양-함유 마우스의 처리는 비장 MDSCs의 1.83(±0.92) 퍼센트로 감소를 일으켰다(도 25). 이러한 결과는 겜시타빈이 MB49luc 종양-함유 마우스의 비장에서 MDSCs의 수준을 현저히 감소시켰음을 입증하였다.

ALT-801은 시험관내에서 인간 T 세포 및 NK 세포를 자극시키는 것으로 IL-2와 동일한 활성을 갖는 것으로 이전에 나타났다. 다양한 종양 세포에 대해 세포독성을 나타내는 IL-2 활성화된 면역 세포는 LAK(림포카인-활성화된 킬러) 세포로 칭하여진다. LAK 세포 활성은 이펙터 세포로서 사용된 ALT-801 사전-활성화된 마우스 비장세포 및 표적으로서 MB49luc 종양 세포를 이용하여 조사되었다. 이 시험의 결과는, ALT-801-활성화된 비장세포가 사멸 단계 중에 ALT-801 농도에 의존하는 방식으로 MB49luc 세포를 효과적으로 용해한 것으로 나타났다. 이러한 발견은, ALT-801이 이펙터 면역 세포를 활성화할 수 있고, 방광 종양 세포에 대해 이들의 세포독성 활성을 증가시킬 수 있음을 보여준다. 또한, 겜시타빈 처리는 MB49luc 종양-함유 마우스의 비장에서 MDSCs의 수준을 현저히 감소시켰다.

실시예 13: ALT-801은 MDSC 어돕티브(adoptive) 트랜스퍼 후에 면역 세포에 의한 종양 세포 사멸을 유도하였다.

C57BL/6 마우스에서 MB49luc 방광 종양 세포의 정맥내 또는 피하 주사 후에 종양의 확립은 혈액 및 비장에서 MDSCs의 수준의 현저한 증가를 일으켰다. MDSCs는 골수종 간세포(progenitor cells), 미성숙 마크로파지, 미성숙 수지상 세포 및 미성숙 과립구로 구성되는 미성숙 골수종 세포의 이종개체군이다. MDSCs는 다수의 종양 모델에서 확장하는 것으로 나타나는 대규모의 문헌이 있다. MDSCs는 직접적인 세포 접촉, 사이토카인 및 대사 경로의 부산물을 통해 NK 및 T 세포를 억제하는 작용을 하며, Tregs의 확장 및 활성화를 조절하고, 종양 세포의 신혈관형성 및 전이성 확장을 뒷받침한다. 마우스에서, MDSCs는 CD11b 및 Gr1의 세포 표면 발현에 의해 형성된다. 정상 마우스는 단지 CD11b⁺Gr1⁺인 비장 세포의 소집단(2-4%)을 가지나, 이러한 표현형을 가진 세포들은 일부 마우스 종양 모델에서 20-40%에 이를 수 있다. 이러한 세포들의 활성을 조사하기 위해, 피하 MB49G 종양을 함유하는 C57BL/6 마우스로부터 비장을 수거하고, 항-Gr1 및 항-Ly6G Ab 비드를 이용한 자기 정렬에 의해 MBSCs를 분리하였다. 이러한 절차를 통해, 96% 순도를 갖는 1x10⁷ MDSCs를 각 동물로부터 수집하였다(도 26).

그 다음, 정제된 MDSCs를 선천성 정상 마우스에 트랜스퍼하여 정상 면역 이펙터 세포에 대한 이들의 면역억제 활성의 평가를 하였다. 어돕티브 트랜스퍼 후 40시간에, 수용자 마우스의 비장 세포를 수집하고 50nM ALT-801로 2일간 배양하여 활성화하였다. 그 결과물인 LAK 이펙터 세포를 PKH67-표지 MB49luc 종양 세포 표적과 함께 밤새 배양하여 종양 세포 사멸을 평가하였다. ALT-801의 항종양 효과에 대한 이전 비임상 시험과 일관되게, 정상 C57BL/6 마우스로부터 ALT-801-활성화 LAK 세포는 MB49luc 종양 세포를 효과적으로 사멸하였으나, ALT-801 활성화되지 않은 후레쉬 비장세포는 세포용해 활성을 거의 나타내지 않은 것으로 발견되었다(도 27). 보다 중요하게도, MDSC 트랜스퍼 후에 마우스로부터 분리된 비장 세포는 ALT-801을 이용한 시험관내 자극 후에 항종양 세포용해 활성을 갖는 LAK 세포와 같이 현저히 감소된 포텐셜을 나타내었다. 특정 이론으로 규정하려는 것은 아니나, 이러한 발견은, 종양-유도된 MDSCs의 존재가 생체내에서 후속적인 ALT-801 활성화에 응하는 비장 이펙터 세포의 능력을 악화시키는 것으로 보여준다. 따라서, 본 시험의 결과는 방광 종양-유도된 MDSCs의 활성이 ALT-801의 항종양 효과에 유해하다는 가설을 뒷받침한다.

다양한 면역 세포 기능의 강력한 억제자로서, MDSCs는 항암 치료를 위한 잠재적 치료 표적이다. 예를 들어, 광범위하게 사용되는 화학치료제인 겜시타빈은 종양-함유 동물에서 MDSCs를 선택적으로 제거하고, 종양-억제 면역 활성을 증가시킨다(Suzuki et al., Clin Cancer Res, 11: 6713-6721, 2005). 마우스 방광 종양 모델에서 비임상 시험에서, 겜시타빈 및 ALT-801과의 병용 치료는 단일 치료로서 어느 한 제제에 비해 보다 효과적인 것으로 발견되었다. 예를 들어, 겜시타빈(40mg/kg)과 함께 ALT-801(0.8mg/kg, 차선 투여량)을 이용한 겜시타빈 내성 피하 MB49G 종양을 함유하는 마우스의 처리는 PBS 처리된 마우스에 비해 현저히 보다 느린 종양 성장을 이끌었으며, 이에 반해 ALT-801(0.8mg/kg) 및 겜시타빈(40mg/kg) 단독으로 처리된 마우스에서 종양 진행은 PBS 그룹롸 현저한 차이가 없었다. 이러한 결과는, 종양 성장에 직접적으로 작용하기 보다는, 겜시타빈 처리는 MDSCs의 면역억제 활성을 감소시켜, ALT-801이 항종양 면역 반응을 보다 효과적으로 활성화시키도록 함을 제시한다.

실시예 14: ALT-801의 항종양 메커니즘 작용의 모델

다양한 동물 모델, 면역결핍 시험, 면역조직화학, 사이토카인 어세이, 넉-아웃 마우스, 세포-매개 사멸 방법론 및 플로우 사이토메트리 분석을 이용하여 암에 대한 ALT-801의 작용 메커니즘을 밝히는데 광범위한 노력이 소모되었다. 특정 이론으로 규정하려는 것은 아니나, 이러한 연구 활동의 결과는 다음 관찰들과 일관된다:

● ALT-801은 CD4 ⁺ 및 NK 세포를 활성화시켜 IFN-γ를 분비시킨다.

● IFN-γ는 마크로파지를 활성화시키고, 종양-촉진 M2로부터 종양-파괴적 M1 단계로 종양-관련 마크로파지(TAMs)을 재분극시키고, 종양 세포에 대한 T _H 1 면역 반응을 유도한다.

● ALT-801 단독은 메모리 CD8 ⁺ T 세포를 자극하여 선척적 타입 킬러 리셉터를 증식시키고 상향조절한다.

● 이러한 활성화된 CD8 ⁺ 메모리 세포는 종양에 대해 강력하지만 항원-특이적인 세포 사멸 면역 반응을 증가시킨다.

● IFN-γ 의존적 경로 및 비-특이적 CD8 ⁺ 메모리 세포 모두 생체내에서 ALT-801의 항종양 효능에 필수적이다.

IFN-γ 및 종양-관련 마크로파지의 재분극화

ALT-801 처리는 정상 및 종양 함유 마우스에서 투입시 IFN-γ의 분비를 유도하였다. IFN-γ는 ALT-801 정맥내 투입 후 약 4-6시간에 혈청 및 소변에서 모두 고 수준이었다(Fishman et al., Clin Cancer Res, 2011. 17:7765). CD4+ 및 NK 세포는 ALT-801 투여에 의해 유도된 IFN-γ의 혈청 수준이 마우스에서 CD4+ T 세포 및 NK 세포의 제거에 의해 실질적으로 감소되었음을 보여주는 면역결핍 시험에 기초하여 혈청 IFN-γ의 주된 공급원이다(실시예 12). IFN-γ는 방광암 세포 성장을 저해하거나 방광암 세포에서 아포토시스를 유도하지 않았다. 그러나, IFN-γ 넉-아웃(KO) C57BL/6 마우스에서, ALT-801은 방광내 이식된 MB49luc 방광 종양에 대해 이의 항방광 암 활성을 상실한다. 특정 이론으로 규정하려는 것은 아니나, 면역조직화학 염색 결과는, 이는 IFN-γ가 M2 TAMs을 M1 TAMs로 재분극하는데 필요하기 때문일 수 있음을 보여주었다(실시예 11). 이러한 M1 TAMs는 종양에 대한 신속하고 강력한 항종양 반응을 증가시킨다.

IFN-γ는 단핵구 및 마크로파지의 가장 강력한 자극자이다(Schroder et al., J Leukoc Biol, 2004. 75:163). ALT-801-매개 항종양 활성에서 단핵구/마크로파지의 중추적인 역할은, 리포좀을 이용한 단핵구의 고갈이 동소 MB49luc 방광 종양에 대한 ALT-801의 효능을 제거하였음을 보여주는 시험 결과에 의해 입증되었다(실시예 10). 따라서, (ALT-801-활성화 CD4⁺ 및 NK 세포로부터) IFN-γ는 순환 단핵구 및 (간세포에서 Kupffer 세포와 같은) 마크로파지를 활성화시켜 종양의 세포-매개 사멸을 위한 종양 병변으로 침투시키는 잠재력을 갖는다(Seki et al., Clin Dev Immunol, 2011, 2011:868345). TAMs의 재분극화 및 단핵구와 마크로파지의 활성화에 부가적으로, IFN-γ- 다면발현성 사이토카인 -은 또한 다양한 항종양 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다(Schroder et al., J Leukoc Biol, 2004, 75:163; Zaidi et al., Clin Cancer Res, 2011, 17:6118). 또한, ALT-801-활성화 CD4⁺ 및 NK 세포로부터 분비된 IFN-γ는 다수의 2차 반응 유전자들의 활성화를 통해 종양 성장에 직접적으로 영향을 주는 것이 생각될 수 있다(Boehm et al., Annu Rev Immunol, 1997, 15:749).

NK 세포 고갈이 아니라 CD4⁺ T 세포 고갈이 또한 C57BL/6 마우스에서 MB49luc에 대한 ALT-801의 항종양 활성을 제거한 것으로 발견되었다. 또한, ALT-801은 T 세포가 결핍된 SCID 마우스에서 이의 항-MB49luc 활성을 상실하였다. 특정 이론으로 규정하려는 것은 아니나, ALT-801-활성화 CD4⁺ T 세포는 종양에 침투할 수 있으며, 종양 미세환경에서 IFN-γ를 분비하여 종양 파괴를 위해 TAMs을 효과적으로 재분극화시킬 수 있다. IHC 시험의 데이터(실시예 11)는 이러한 이론과 일치한다.

새로운 메커니즘을 통한 메모리 CD8 ⁺ 세포-매개 항종양 활성

면역고갈 시험에서, NK 세포 단독이 아닌, CD8⁺ 및 CD4⁺ 세포의 제거는 C57BL/6 마우스에서 동소 MB49luc 방광 종양 모델에서 ALT-801의 항종양 활성을 제거할 수 있었다. 따라서, ALT-801-활성화 CD8⁺ 세포는 ALT-801의 항방광암 활성에 중요하다.

사이토카인-매개 자극은 독특한 표현형을 갖는 메모리 CD8⁺ 세포의 항원-비특이적 확장을 촉진할 수 있는 것으로 최근에 나타났다. PD-1 및 CD25를 상향조절하는 항원-의존적 확장으로부터 형성되는 메모리 CD8⁺ T 세포와 달리, 이러한 시험에서 사이토카인-매개 확장된 메모리 CD8⁺ T 세포는 NKG2D, 그랜자임 B를 발현하며, 광범위한 용해 능력을 가지며, 암 면역-치료의 극적인 항종양 효과에 책임이 있는 것으로 제시된다(Tietze et al., Blood, 2012, 119:3073). 특정 이론으로 규정하려는 것은 아니나, 이러한 타입의 메모리 CD8⁺ T 세포의 ALT-801 활성화는 마우스에서 항-MB49luc 종양 활성에 주요한 역할을 한다. 이러한 가능성을 평가하기 위해, ALT-801 단독이 시험관내에서 메모리 CD8⁺ T 세포 확장을 유도할 수 있는지 우선 조사하였다. CD8⁺CD44^high T 세포의 표현형은 ALT-801 또는 항-CD3 항체를 이용한 활성화(TCR-의존적 인게이지먼트)와 비교하였다. CD8⁺ T 세포의 ALT-801 또는 항-CD3 항체에 대한 노출은 두드러지게 다른 표현형을 갖는 CD8⁺CD44^high T 세포를 생성하였다. ALT-801 자극은 CD25 및 PD-1 발현의 보다 높은 수준이 아니라 NKG2D의 상향 조절을 이끌었으나, 항-CD3 자극은 NKG2D 상향 조절이 아니라 CD25 및 PD-1 발현의 보다 높은 수준을 이끌었다. 유사한 현상이 생체내에서 일어나는지 조사하기 위해, 비-종양 함유 마우스에 1.6mg/kg(100μL에 담긴)의 ALT-801 또는 PBS(100μL)를 2회(72시간 기간을 둠)로 정맥내 주사하고, PBMCs 및 비장세포의 표현형을 2차 PBS 또는 ALT-801 처리 후 1일에 분석하였다. ALT-801 처리 후에 확장된 NKG2D를 발현하는 CD8⁺CD44^high 메모리 T 세포의 수준은 IL-2- 또는 PBS-처리된 마우스에서 나타난 수준과 비교하였다. 이와 상반적으로, CD8⁺CD44^high 메모리 T 세포 집단에서 관찰된 ALT-801에 의한 PD-1 또는 CD25의 상향 조절은 없었다.

유사한 결과가 또한 CD8⁺CD44^high 메모리 T 세포 어돕티브 트랜스퍼 실험에서 관찰되었다. 이 시험에서, Celltrace^TM Violet-표지된 비장 세포(0.5x10⁶)를 나이브 C57BL/6 마우스로부터 나이브 동질유전자 C57BL/6 마우스에 어돕티브 트랜스퍼한 다음, 상기 마우스를 어돕티브 세포 트랜스퍼 후 1일에 ALT-801 또는 PBS로 처리하였다. 그 다음, 2차 ALT-801 또는 PBS 처리 후 1일에 수용자 마우스의 비장으로부터 CD8⁺CD44^high T 세포의 표현형을 분석하였다. IL-2 또는 PBS가 아니라, ALT-801은 CD8⁺CD44^high T 세포의 증식을 유도하였다. 또한, PBS-처리된 수용자 마우스에서가 아니라, ALT-801 처리된 마우스에서 어돕티브 트랜스퍼되고 확장된 메모리 CD8⁺CD44^high T 세포 중에 NKG2d-양성 세포 집단이 증가하였다. 또한, ALT-801 처리 후에 관찰된 이러한 세포들의 표면에서 CD25 또는 PD-1의 상향 조절은 없었다. 따라서, 이러한 데이터는 ALT-801이 항원-의존적 형태로 독특한 표현형을 갖는 CD8⁺CD44^high 메모리 T 세포를 분명히 활성화시킬 수 있음을 입증하였다.

NKG2D를 발현하는 CD8⁺CD44^high T 세포의 증가된 퍼센트는 NKG2D+ 메모리 CD8⁺ T 세포의 기존 집단의 확장보다는 NKG2D의 데노보(de novo)-조절에 기인하는 것임을 더욱 입증하기 위해, 나이브 C57BL/6 마우스로부터 NKG2D^-/CD25^-/CD8⁺/CD44^high T 세포를 정렬하였다. 정렬된 NKG2D^-/CD25^-/CD8⁺/CD44^high T 세포를 Celltrace^TM Violet 트래이서로 표지하고, 나이브 C57BL/6 마우스내로 어돕티브 트랜스퍼하였다(0.4x10⁶ cells/recipient mouse). 트랜스퍼 후 1일에, 마우스들에게 2 투여량의 PBS 또는 ALT-801로 처리하고, 2차 처리 후 1일에 비장 세포를 수거하여 NKG2D 표현형에 대해 분석하였다. NKG2D는 PBS 컨트롤에서가 아니라 ALT-801-처리된 마우스로부터의 Celltrace^TM Violet-표지된 CD8⁺CD44^high T 세포에서 확장되고 상향조절되었다. 시험관내에서, ALT-801-활성화된 CD8⁺CD44^high T 세포는 방광암 세포에 대해 항원-독립적으로 강력한 항종양 활성을 나타내었다.

특정 이론으로 규정하려는 것은 아니나, 상기 결과는 ALT-801이 메모리 CD⁸+ T 세포를 활성화하여 항원-의존적 방식으로 선천성 표면 리셉터를 증식 및 상향 조절하는 모델과 일관된다. 이러한 활성화된 메모리 T 세포는 방광암 세포에 대해 효과적이나 항원-의존적 사멸을 증가시킨다. 이러한 선천적 타입의 항원-의존적 반응은 항종양 활성이 p53-펩타이드/HLA-A*0201 항원을 표적하는데 의존하지 않는 이유가 될 수 있다.

이러한 새로운 작용 메커니즘은, 고형 종양에 대해 항-CTLA 및 항-PD-1 항체와 같이 다른 T-세포-기초 면역치료와 상이하며, 이들 시험들의 효능을 향상시킬 수 있으며, 이는 이러한 결론을 뒷받침한다.

ALT-801을 이용한 최적 병용 치료의 디자인

암에 걸린 환자, 특히 진행된 질병에 걸린 환자는 면역학적으로 타협되는 것으로 알려져 있다. 이는 종양 세포가 항원 제시 세포 및 이펙터 세포의 기능 장애를 활성적으로 유도하고, 조절 면역 세포의 확장을 촉진하며, 이는 항종양 면역성을 하향 조절하여 종양 세포가 면역 반응을 빠져나가게 한다(Whiteside, J Allergy Clin Immunol, 2010, 125:S272; Poschke et al., Cancer Immunol Immunother, 2011, 60:1161; Talmadge, Semin Cancer Biol, 2011, 21:131). 2가지의 가장 잘 특성화된 면역억제 세포 서브셋은 FoxP3⁺ 조절 세포(Tregs) 및 골수종-유래 억제 세포(MDSCs)이다(Qin, Cell Mol Immunol, 2009, 6:3; Gabrilovich et al., Nat Rev Immunol, 2009, 9:162; Ostrand-Rosenberg, Cancer Immunol Immunother, 2010, 59:1593.). MDSCs는 골수종 간세포(progenitor cells), 미성숙 마크로파지, 미성숙 수지상 세포 및 미성숙 과립구로 구성되는 미성숙 골수종 세포의 이종개체군이다(Gabrilovich et al., Nat Rev Immunol, 2009, 9:162). MDSCs는 다수의 이식가능한 자생의 종양 모델에서 확장하는 것으로 나타나는 대규모의 문헌이 있다. 혈액, 비장, 골수 및 종양 부위에서 MDSC 축적은 아마도 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 및 TNF-α와 같은 종양-유래 인자의 분비를 통해 골수로부터 종양 부위로의 세포의 확장 및 모집에 기인하는 종양 진행의 초기 이벤트인 것으로 보인다(Bayne et al., Cancer Cell, 2012, 21:822; Pylayeva-Gupta et al., Cancer Cell, 2012, 21:836; Zhao et al., J Clin Invest, 2012, 122:4094.). MDSCs는 직접적인 세포 접촉, 사이토카인 및 대사 경로의 부산물을 통해 NK 및 T 세포를 억제하는 작용을 하며, Tregs의 확장 및 활성화를 조절하고, 종양 세포의 신혈관형성 및 전이성 확장을 뒷받침한다(Gabrilovich et al., Nat Rev Immunol, 2009, 9:162; Peranzoni et al., Curr Opin Immunol, 2010, 22:238; Marigo et al. Immunol Rev, 2008, 222:162; Chioda et al., Cancer Metastasis Rev, 2011, 30:27; Schlecker et al., J Immunol, 2012, 189:5602).

MDSCs는 보통 M2 분극화를 나타내는 종양 관련 마크로파지(TAMs)와 가깝게 관련되는 것으로 보이며, IL-10, TGBβ, 및 매트릭스 메탈로프로테아제, VEGF 및 혈장-유래 성장인자와 같은 전-신혈관생성 인자를 생성함으로써 종양 진행 및 면역 억제에 기여할 수 있다(Mantovani et al., Hum Immunol, 2009, 70:325). 마우스 모델로부터의 최근 증거는, MDSCs가 종양의 저산소 환경에 도달하였을 때 TAMs으로 분화하고, 이후에 현저한 표현형 및 기능적 특성을 나타낼 수 있음을 제시한다(Corzo et al.,. J Exp Med, 2010, 207:2439).

방광암에 걸린 환자에서 골수종-유래 억제 세포 : MDSCs의 초기 동정 이래로, 여러 후속 공개물들은 다양한 인간 고형 종양을 가진 환자에서 증가된 순환 수준의 MDSCs를 보고하였다(Montero et al., J Immunother, 2012, 35:107.). 비-근육 침윤성 및 근육 침윤성 방광암을 가진 환자에서, 말초 혈액에서 2 구별되는 MDSCs의 집단의 존재가 보고되었다(Eruslanov et al., Int J Cancer, 2012, 130:1109.): (i) 뉴트로필 마커 CD114 및 CD117의 동시-발현을 갖는 CD11b⁺/CD15^high/CD33^low; 및 (ii) 단핵구-마크로파지 마커 CD14, CD115, CD116, 및 CCR2의 동시-발현을 갖는 CD11b⁺/CD15^low/CD33^high. 환자 말초 혈액 시료를 건강한 지원자의 시료와 비교하였을 경우에, 단지 CD11b⁺/CD15^high/CD33^low 세포들이 방광암 환자에서 더 높은 수준으로 존재하는 것으로 발견되었으나, 한편 CD11b+/CD15low/CDhigh 세포는 건강한 지원자에서 현저한 양으로 존재하는 것으로 발견되었다. 양 집단은 모두 상당한 양의 사이토카인을 분비함에도 불구하고, 단지 CD11b⁺/CD15^high/CD33^low 집단은 면역억제 활성을 갖는 것이 주목되었다. 종양 시편에서, 2가지의 구별되는 MDSC 집단은 종양에 침투되는 것으로 발견되었다: 이러한 세포의 60-70%가 CD11b⁺/HLA-DR⁺로 기재되었으며, 나머지 30-40%가 CD11b⁺ 및 CD15⁺로 기재되었다. 이러한 세포의 임상적 유의성은 완전히 연구되지 않았다. 또 다른 시험에서, 증가된 수준의 순환 면역억제 CD14⁺/HLA-DR^-/low 세포와 방광의 요로상피 암종을 가진 환자에서 임상적 암 단계 및 병리학적 등급 사이에 상관성이 발견되었다. 따라서, 방광의 요로상피 암종을 가진 환자는, 진전성 질병과 관련되는 면역억제 표현형을 포함하는 증강된 수준의 MDSCs를 나타낸다.

방광암과 MDSCs를 관련시키는 전임상 시험을 수행하였으며, 하기에 요약하였다:

● C56BL/6 마우스의 동소 MB49luc 모델에서, 방광내 이식된 종양은, 질병이 근육-침윤성 단계로 진행될 경우에 혈중 MDSCs를 실질적으로 증가시킨다(실시예 10).

● 이 모델에서, MB49luc 종양 세포가 피하 또는 정맥내 이식된 경우에, 유사한 결과가 관찰되었다(실시예 12).

● MB49luc 종양-함유 C57BL/6 마우스의 MDSCs를 정렬하고, 어돕티브하게 비-종양 함유(수용자) C57BL/6 마우스에 트랜스퍼하였다. 수용자 마우스 또는 와일드 타입 C57BL/6 마우스의 비장 세포를 분리하고, ALT-801에 의해 시험관내에서 활성화시켰다. 그 다음, ALT-801-활성화된 비장 세포의 세포독성을 MB49luc 세포에 대해 시험관내에서 평가하였다. 와일드-타입 C57BL/6 마우스의 비장 세포는 MDSC 수용자 마우스로부터 분리된 비장 세포보다 MB49luc 세포에 대해 현저하게 더 강한 세포독성을 나타내었다(실시예 13). 이러한 데이터는 ALT-801에 의해 유도된 생물학적 활성에 대해 MB49luc-유도된 MDSCs의 강력한 면역 억제 활성을 입증하였다.

이러한 시험 결과는, 방광 종양 세포에 의해 유도된 MDSCs가 생체내에서 ALT-801의 항종양 활성을 저해하거나 방해할 수 있음을 제시한다.

겜시타빈에 의한 ALT-801 항종양 면역 반응의 향상 : MDSCs의 제거는 현저하게 항종양 반응을 향상시키며, ALT-801과 같은 암 면역치료의 효과를 증가시키는 것이 제시되었다.

겜시타빈은, 인간에서 전이성 방광암에 대한 제1선 화학치료의 주요 성분으로, 치료 투여량으로 CD4⁺ T 세포, CD8⁺ T 세포, NK 세포, 마크로파지, 또는 B 세포의 수에 영향을 미치지 않고 커다란 종양을 함유하는 동물의 비장에서 MDSCs의 수를 실질적으로 감소시키는 것으로 발견되었다(Suzuki et al., Clin Cancer Res, 2005, 11:6713.). MDSCs의 손실은 CD8⁺ T 세포 및 NK 세포의 항종양 활성의 증가를 수반하였다. 겜시타빈을 이용한 전처리는 대 중피종 종양에 미치는 IFN-β의 항종양 효과를 현저히 증가시켰다. C26 뮤린 선암종 모델에서, 종양-함유 마우스는 컨트롤 마우스와 비교하여 비장에서 현저히 증가된 수준의 MDSCs를 가졌으며, STAT1의 인산화에 의해 측정시 IFN-α 및 INF-γ에 대하여 감소된 비장 세포 활성화를 나타내었다(Mundy-Bosse et al., Cancer Res, 2011, 71:5101.). 겜시타빈 또는 항-GR1 항체를 이용한 C26-함유 마우스의 처리는 MDCSs의 고갈 및 비장 세포 IFN 반응성의 회복을 이끌었다.

방광암 세포에 의해 유도되는 MDSCs의 활성의 감소와 겜시타빈을 관련시키는 전임상 시험을 수행하였으며, 하기에 요약하였다:

● 전임상 MB49luc 종양 모델에서, 겜시타빈 처리는 종양-함유 마우스의 MDSCs의 수준을 현저히 감소시켰다(실시예 12). 이러한 데이터는, 겜시타빈이 MDSCs를 제거하는데 유용한 화학치료 약물이 될 수 있어, ALT-801-자극된 면역 이펙터 세포가 방광암에 대한 항종양 활성을 매개하도록 할 수 있음을 제시한다.

● C56BL/6 마우스의 동소 MB49luc 모델에서, 겜시타빈과 조합된 차선 수준의 ALT-801은 효과적이었으나, MB49luc 종양에 대해 시스플라틴+겜시타빈과 조합된 동일한 수준에 비해 적은 독성(즉, 체중 감소)을 나타내었다. 마찬가지로, 피하 MB49luc 종양을 함유하는 C57BL/6 마우스에서, 겜시타빈과 조합된 ALT-801은 ALT-801 또는 겜시타빈 단독에 비해 현저히 보다 큰 항종양 활성을 이끌었다.

● 겜시타빈-내성 MB49luc 종양 세포를 생성하고, 이를 C57BL/6 피하 종양 모델에서 겜시타빈과 조합된 ALT-801의 차선 투여량의 효능을 평가하는데 사용하였다. 그 결과, 겜시타빈과 조합된 차선 투여량 수준의 ALT-801은 ALT-801 또는 겜시타빈 단독에 비해 현저히 더 큰 항종양 활성을 나타낸 것으로 나타났다.

이와 함께 이러한 결과는 ALT-801과 겜시타빈의 조합은 전이성 방광암의 효과적인 치료를 제공할 수 있으며, 한편 시스플라틴은 불필요할 수 있으며, 특히 백금-저항성 종양에 불필요할 수 있음을 제시한다. 따라서, 백금계 치료에 난치성인 진행된 방광암을 가진 환자에서 겜시타빈과 조합된 ALT-801의 항종양 활성을 평가하는데 관심을 갖게 되었다. 이러한 효능 시험의 결과는 시스플라틴+겜시타빈에 난치성인 전이성 요로상피암종을 가진 환자를 치료하는데 현재의 ALT-801+겜시타빈+시스플라틴 요법으로부터 시스플라틴을 제거할지 여부를 알려줄 것이다. 백금계 요법으로서 효과적인 것으로 입증될 경우에, 비-백금계 요법은 또한 신부전을 가진 환자에게 크게 유용할 것이며, 시스플라틴을 함유하는 치료를 받는데 부적합하다. 진행된 방광암 시행에서 14명의 환자에게 ALT-801+겜시타빈 공급으로 등록시키는 제안이 U.S. FDA에 제출되었으며, 이러한 공급에 대한 환자 등록은 2012년 12월에 시작되었다.

실시예 15: 인간 임상 시험 프로토콜

시험 디자인

이는 방광, 신우, 수뇨관 및 요도의 근육 침윤성 또는 전이성 요로상피암을 가진 환자에서 시스플라틴 및 겜시타빈을 함유하는 생화학요법에서 ALT-801의 단계 Ib/II, 오픈-라벨, 멀티-센터, 경쟁 환경 및 용량 증가 용법 연구이다. 의약품의 임상시험 실시에 관한 기준(GCP, Good Clinical Practice)에 준거하여 수행된다.

본 시험은 시스플라틴과 겜시타빈과 조합된 ALT-801의 최대 내성 용량(MTD)을 측정하는 용량 증가 단계 및 상기 MTD에서 2-단계 확장 단계를 포함한다. 본 시험에서 용량 증가는 (3+3) 투여량 증가 디자인을 이용하여 수행되며, MTD에서 2-단계 확장은 변형된 사이몬 2-단계 디자인을 이용하여 수행된다. 본 시험의 용량 증가 단계에서, 2 단계적 축소 수준에 부가적으로 ALT-801(0.04mg/kg, 0.06mg/kg 및 0.08mg/kg, 0.10mg/kg 및 0.12mg/kg)의 5 투여량 수준이 존재한다. 시스플라틴(70mg/㎡/dose) 및 겜시타빈(1000mg/㎡/dose)의 투여량은 모든 ALT-801 투여량 수준에 걸쳐 고정된다. 만일, 용량 증가 단계 중에 MTD에 이르지 못할 경우에, 스폰서인 Data Safety Monitoring Board 및 시험 책임자가 추가적인 ALT-801 투여량 수준을 포함하도록 용량 증가 단계를 확장시키는 것으로 프로토콜을 수정할지 여부를 논의한다.

처리

계획된 연구 초기 처리는 3코스이다. 각 코스는 시스플라틴(#1일), 겜시타빈(#1일), ALT-801(#3일 및 #5일), 겜시타빈(#8일), ALT-801(#8일 및 #10일), 및 휴식기(#11-21일)로 구성된다. 제2 및 제3 코스 시작 전에, 대상자는 연속 기준에 부합할 필요가 있다. 시험 처리의 3가지 전체 코스의 종료시, 등록된 각 환자는 시험 약물 ALT-801의 12 투여량, 시스플라틴의 3 투여량 및 겜시타빈의 6 투여량으로 총 12 투여량을 받도록 스케쥴이 이루어졌다. 3-코스 초기 시험 처리 완료 후, 적어도 안정한 질병을 가지며 다른 처리 기준에 부합하는 환자들은 4회의 추가적인 ALT-801의 매주 투여를 이용한 시험 처리가 반복된다. 지연 또는 변형이 본 프로토콜에서 다루어졌다. 이는 하기 스킴으로 나타내었으며 또한 도 28 및 29에 나타내었다.

초기 시험 처리:

코스 1

코스 2

코스 3

처리일

1

3

5

8

10

11-21

22

24

26

29

31

32-42

43

45

47

50

52

53-63

시스플라틴

X

휴식기

X

휴식기

X

휴식기

겜시타빈

X

X

X

X

X

X

ALT-801

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

반복 시험 처리:

투여#	1	2	3	4
반복	1	8	15	22
ALT-801	X	X	X	X

등록된 환자들은 치료 및 합병증의 적절한 관리를 제공하기 위해 적절한 진단 및 치료 설비를 갖는 자격이 있는 암 치료 센터에서 시험 처리를 받는다. ALT-801, 시스플라틴 및 겜시타빈은 알데스루킨(Proleukin®), 시스플라틴 및 겜시타빈을 포함하는 항암제의 사용에 있어서 경험이 있는 자격을 갖춘 의사의 감독하에서 중심 정맥 또는 말초 정맥으로 정맥내 주입에 의해 투여된다. 다음은 시험의 용량 증가 단계 중에 투여량 수준에 대한 개요이다. ALT-801의 -1 및 -2 투여량 수준은 초기 투여량 수준에서 DLT 이벤트의 경우에 포함된다.

집단	ALT-801 투여량	시스플라틴	겜시타빈
-2	0.01	70	1000
-1	0.02	70	1000
1(초기)	0.04	70	1000
2	0.06	70	1000
3	0.08	70	1000
4	0.10	70	1000
5	0.12	70	1000

용량 증가

본 시험 단계에서, 최소 3명의 환자가 각 투여량 수준에서 등록된다. 모든 환자들은 초기 투여로부터 8주간 독성 제한 투여량(DLT)에 대해 모니터되었다. 만일, 0/3 환자가 초기 투여 후 8주까지 시험 처리-관련된, 독성 제한 투여량을 가질 경우에, 다음 집단은 등록에 대해 오픈된다. 만일, 투여량 수준에 있는 한 환자가 약물-관련 DLT로 발달할 경우에, 최대 6명의 환자가 그 투여량 수준 및 각 후속적인 보다 높은 투여량 수준에 등록된다. 만일 6명의 집단에서 6명 중 0 또는 1명이 시험 처리-관련 DLT에 대한 기준에 부합하는 이벤트를 가질 경우에, 다음 집단은 등록에 대해 오픈된다. 만일 용량 증가 집단에서 3-6 명의 환자 중에 2 이상이 약물-관련된 DLT를 가질 경우에, 그 투여량 수준은 최대 허용 투여량을 초과하는 것으로 디자인된다. 만일, 이 수준 이하의 투여량에 3명의 환자가 있는 경우에, 부가적인 환자들(총 최대 6명)이 그 투여량 수준에 등록된다. 6명의 환자 중에서 0 또는 1명이 DLT를 갖는 투여량 수준에 있으며, 이는 최대 계획된 투여량 수준(수준 5) 또는 허용되지 않는 투여량 이하의 한 수준인 경우에, 최대 허용되는 투여량인 투여량이 형성된 것으로 간주된다. 처리 계획에서 추가 변화는 그 시점에서 프로토콜 보정으로 간주될 수 있다.

6명의 환자 중에서 2 이상이 초기 투여량 수준(수준 1)에서 DLT를 경험할 경우에, 스폰서인 Data Safety Monitoring Board 및 시험 책임자가 논의하여 시스플라틴, 겜시타빈 및/또는 시험 약물의 투여량 수준을 얼마나 감소시키는 것으로 조절하거나 또는 (-1) 및 (-2) 집단으로 계속할지 결정하며, 시험을 어떻게 진행할지 결정한다.

독성 제한 투여량(DLT)은 72시간 이내에 등급 1 이하로 분해되지 않는 등급 3의 어느 독성 및 처리 코스 중에 발생하는 등급 4의 어느 독성으로 정의되며, 본 시험 프로토콜에 기재된 예외 및 구체적인 사항을 갖는다. DLT를 경험한 환자들은 시험 처리가 중단된다. 시험 약물 투여 전에 경험된 유해한 이벤트에 기인한 시험 처리 중단, 질병 진행 또는 어느 시험 처리 중단 이벤트의 발생없이 시험 처리로부터의 철회에 대한 환자의 결정은 반드시 DLT 이벤트를 정의하지 않을 것이다. 시험 처리 중단 이벤트는 프로토콜에 정의된다.

투여량 확장

MTD에서 2-단계 확장 단계는 변형된 사이먼 2-단계 디자인을 이용하여 수행된다. 객관적 반응(OR)(완전 반응(CR)+부분 반응(PR)으로 정의됨) 및 임상적 효과(CB)(CR, PR+안정한 질병(SD)으로 정의됨) 모두 평가하고, 효능 결핍의 공통 집합 역치(common set thresholds of lack of efficacy)(OR 비(ORR)=40%; CB 비(CBR)=78%) 및 관심 대상의 효능 수준(ORR=60%; CBR=92%)을 선택한다. 시료 크기는 각 단계에 대해 보다 큰 시료 크기를 갖는 파라미터에 의해 도출된다.

중단 규칙

환자 등록은 하기 어느 것의 발생에 기초하여 일시적으로 중지되며, 스폰서인 Data Safety Monitoring Board 및 시험 책임자가 논의하여 본 시험에서 앞으로의 환자 등록과 관련된 진행을 어떻게 할 것인지 논의한다:

● 시험의 용량 증가 단계의 어느 시기에서, 3 집단에서 1 이상의 환자 또는 6명의 환장 중 2명이 어느 DLT를 경험할 경우;

● 시험의 확장 단계 중 어느 시기에서, 환자들 중 33% 이상이 어느 약물 관련 DLT를 경험할 경우.

평가

환자들을 처리 중에 임상적 독성에 대해 평가한다. 환자들의 혈액 시료를 수집하여 시험 약물의 약물동력학적 프로파일 및 면역원성을 평가한다. 항종양 반응을 제1 처리 코스의 초기 투여로부터 18주까지 평가한다. 적어도 1 투여의 시험 약물 ALT-801을 받은 모든 환자들이 항종양 반응 평가에 포함된다. 각 집단 사이에, 그리고 시험 마지막에, 모든 임상 데이터 및 안전성 데이터를 투여-반응 효과에 대해 시험에 등록된 모든 환자들에 대해 분석한다.

집단

방광, 신우, 수뇨관 및 요도의 근육 침윤성 또는 전이성 요로상피암의 치료를 위한 전신성 시스플라틴 및 겜시타빈에 대한 후보자인 18세 이상의 환자들은 시험 참여에 대한 적격의 추가 평가를 위해 선택될 수 있다. 또한, 환자들은 적절한 심장, 폐, 간 및 신장 기능을 가질 필요가 있으며, 0 또는 1의 동부 종약학 협력 그룹(ECOG, Eastern Cooperative Oncology Group) 수행 상태 및 적어도 12주의 기대 수명을 가질 필요가 있다.

시료 크기

총 최대 30명의 평가가능한 환자들이 시험의 추기 용량 증가 단계(단계 Ib)에 생기며; 추정 수는 21이다. 최대 추가의 40명의 평가가능한 환자들이 시험(단계 II)의 확장 단계(단계 1 및 2)에 등록된다. 총 약 61명의 평가가능한 환자들이 등록되고 시험을 마친다. 20% 부적격 또는 평가불가능한 케이스로 가정하며, 총 최대 72명의 환자가 시험에 포함될 수 있다.

일차 종점

단계 I에 대해서만

(1) 근육 침윤성 또는 전이성 요로상피암을 가진 환자들의 치료시 시스플라틴과 겜시타빈과 조합된 ALT-801의 MTD를 정의하기.

단계 I 및 II에 대해서

(2) 처리된 환자들에서 조합 시험 처리의 안전성을 평가하기.

(3) 처리된 환자들에서 객관적 반응을 평가하기.

2차 종점

(1) 처리된 환자들에서 무진행 생존율 평가하기.

(2) 처리된 환자들에서 전체 생존율 평가하기.

(3) 처리된 환자들에서 ALT-801의 면역원성 및 약물동력학적 프로파일 평가하기.

(4) HLA-A*0201/p53 aa 264-272 복합체의 종양 제시와 시험 처리의 안전성 및 임상학적 효과 사이의 관련성 평가하기.

약물동력학 및 바이오마커

HLA-A2에 대한 타이핑, 면역 세포 수준, 표현형, 약물동력학, 시험 약물 ALT-801의 면역원성 및 IFN-γ 및 TNF-α의 혈청 수준을 평가하기 위해 혈액 시료를 수집한다. HLA-A*0201/p53 aa 264-272 복합체 제시를 시험하기 위해 종양 시료를 수집한다. ALT-801의 약물동력학 분석을 위한 혈액 시료를 시험 처리의 제1 코스에서 ALT-801 투여의 제1 일에 취한다. ALT-801 혈청 농도의 평가를 위해, 0시간(주입 시작 전), 0시간으로부터 30분(주입 완료 후 15분), 1, 3 및 6시간에 정맥 혈액을 얻는다. 비구획 및 구획 분석을 수행한다. 또한, PK 분석을 위해 수집된 동일한 혈액 시료를 사용하여 시험 약물 ALT-801의 면역원성 및 IFN-γ 및 TNF-α의 혈청 수준을 평가한다. HLA-A2 타이핑, 면역 세포 수준 및 표현형 시험을 위한 새로운 혈액 시료를 시험 처리의 제1 및 제2 코스의 시작 전에 수집한다. HLA-A2 타이핑은 단지 1회 수행될 것이다.

모니터링 시험

소변검사를 위한 소변 시료, 표준 화학, CBC, 미분(differential) 및 응고를 위한 혈액 시료를 각 시험 약물 주입일, 방류일 및 후속 방문일에 스크리닝시 얻는다. 항-ALT-801 및 IL-2 중화 항체에 대한 어세이를 포함하는 면역원성 시험을 위한 혈액 시료는 제1 ALT-801 주입일 및 시험 처리의 초기 투여로부터 9주에 수집한다.

항종양 반응 평가

시험 처리의 초기 투여로부터 최대 18주간 항종양 반응을 평가한다: 무반응자에 대해 9 및 13주; 초기 반응자에 대해 9 및 14주; 말기 반응자에 대해 9, 13 및 18주. 객관적 반응은 고형 종양 위원회에서의 반응 평가 기준(RECIST, Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Committee) 1.1에 의해 제시된 새로운 국제 기준을 이용하여 평가한다. 기준치 평가는 시험 처리 시작 전 28일까지 수행되어야 한다. 동일한 평가 방법 및 동일한 기술을 사용하여 기준치 및 후속 기간 중에서 각각 확인 및 보고된 병변을 특성화한다. 이미징-기초 평가는, 두 가지 모든 방법들이 처리의 항종양 효과를 평가하기 위해 사용된 경우에, 임상학적 조사에 의한 평가를 위해 바람직하다. 그러나, 방사선 시험에 부가적으로, 세포검사 평가가 이러한 집단에서 통상적으로 사용될 수 있다.

생존율 평가

등록된 모든 환자들의 무진행 생존율 및 전체 생존율은 시험 처리 시작으로부터 6, 9, 12, 18, 24, 30 및 36개월에, 또는 시험 후속의 마지막으로서 지정된 시점에 걸쳐 평가된다.

부작용 보고

처리 기간 중에 임상학적 독성에 대해 모든 환자들을 모니터 및 평가하고, 부작용 보고(AEs)에 대해 각 후속 방문시 질의한다. 환자들은 AEs와 관련된 정보를 제의할 수 있다. 모든 부작용 보고는 부작용 보고에 대한 NCI 일반 용어 기준 버전 4.0(CTCAE v4.0)을 이용하여 등급화하고, 환자 사례 보고 형태로 기록하였다. 시험 센터는 이벤트의 학습 후 1일까지 전화, 팩트 또는 이메일(또는 조합)을 통해 스폰서에게 환자의 시험 처리 중단을 유발하는 모든 SAEs 및 모든 이벤트를 보고해야 한다. 스폰서는 투여량 증가, 집단 확장 및 환자 등록을 관리 및 조직화하기 위해 정보를 사용할 것이다. 그 다음, 스폰서는 이벤트의 학습 후 1일 이내에, 현재의 투여량 수준 및 그 수준으로 관리되는 환자의 수, 또는 어느 환자 등록 중지의 모든 참여 임상 사이트를 전화, 팩스 또는 이메일을 통해 통보할 것이다. 시험 센터는 시험 프로토콜에 정의된 하기 지침을 스폰서에게 다른 부작용 보고를 알려야 한다.

심각하고 예기치 않은 모든 시험 약물 관련된 모든 부작용 보고는 21 CFR §312.32에 따라 신속한 방식으로 FDA에 통보될 것이다.

통계학적 계획

각 집단에 대해, 모든 AEs를 표로 만들고, 모든 안전성 및 약물동력학적 데이터를 평가한다. 반응 기간의 추정을 위해, 캐플란-메이어법이 사용된다. P값 <0.05(양방향)은 통계학적 유의성을 나타내는 것으로 간주된다.

실시예 16: 겜시타빈 및 시스플라틴(GC)과 조합된 IL-2/T-세포 리셉터 융합 단백질에 대한 단계 1/2 시험은 국소적으로 진행되거나 또는 전이성의 요로상피암을 가진 환자들에서 양성 반응을 보였다.

ALT-801은 진행된 악성 종양을 가진 환자에서 단계 1에서 기존에 시험된 인간 IL-2/단일-사슬 T-세포 리셉터 융합 단백질이다(Fishman et al. (2011) Clin Cancer Research 17:7765). 다양한 뮤린 모델에서, ALT-801은 선천적이며 이종이식의 요로상피암에 대하여 강한 활성을 나타내었으며, 이는 IL-2 기초 면역치료에 대한 이러한 질병의 민감성을 제시한다(상기 참조). 요로상피암은 백금계 화학치료에 민감하나, 겜시타빈+시스플라틴과 같은 조합은 단지 약 15%의 전체 반응율과 관련되며, 재치료의 제한된 효과로 반응 지속성을 제한한다.

방법: 21 스케쥴에, 3사이클 동안, GC 화학치료가 고려된 자에게 국소적으로 진행되거나 전이성의 요로상피암을 가진 환자에서, 겜시타빈(1000mg/㎡/dose, 1일 및 8일), 시스플라틴(70mg/㎡/dose, 1일) 및 ALT-801(증가하는 투여량, 3, 5, 8, 10일)의 공동-투여의 초기 효능 결과. 환자 인구통계학 및 질병 상태를 도 30에 나타내었다. ALT-801 계획된 투여량은 3+3 증가 디자인을 가진 5 투여량 집단에서 0.04-0.12mg/kg/dose이다. 3 코스 후에 적어도 안정한 질병을 가진 대상자들은 ALT-801 단독의 4회 추가의 매우 투여를 받는다.

결과: 전이성 요로상피암을 가진 환자에서 ALT-801+시스플라틴 및 겜시타민의 진행중 시험이 잘 발생되었다. 전체적으로, ALT-801+시스플라틴 및 겜시타빈의 조합은 환자들에 의해 적절히 용인되었다. 처리요법은 케모-나이브(chemo-naive) 환자 및 화학-난치성 질병을 가진 환자 모두에서 고무적인 객관적 반응율(ORR)을 갖는다. 표적 병변에서 퍼센트 변화로 측정된 종양 평가는 환자의 71%(21명 중 15명)에서 종양 수축을 나타내었다(도 31). 환자들을 화학치료 나이브 및 백금 경험 환자의 카테고리로 그룹화한 경우에, 화학치료 나이브 환자들의 80%(10명 중 8명) 및 백금 경험된 환자들의 55%(11명 중 6명)가 양성적인 객관적 반응(부분 또는 완전한 반응)을 나타내었다(도 32). 무진행 생존율 평가시, 모든 환자들 및 백금 경험 환자들에 대한 중간값은 5.3개월이었다(도 33). 현재, 무진행 생존율은 백금 경험 환자들에서 약 8개월인데 비하여 일부 환자들에서 거의 13개월까지 연장되었다. 또한, ALT-801의 투여 후, 혈청 IFN-γ 수준이 투여 후 6시간까지 증가한 것으로 나타난 바와 같이, 혈장 사이토카인 반응이 유도되었다(도 34). 혈청 IFN-γ 반응은 0.04mg/kg ALT-801의 투여에 비하여 0.06mg/kg ALT-801의 투여에서 지속되었다.

지금까지, 적어도 3개의 단계 IV 요로상피암 환자들(1F, 2M; 59-63세; 2명의 환자는 노드 전이를 가졌으며, 1명의 환자는 간 전이를 가졌음)은 0.04mg/kg ALT-801+GC로 완료된 치료를 갖는다. 2명은 이전에 방사선 방광절세술을 받았으며, 그 이후에 후속의 GC 치료에 실패하였다. 관찰된 등급 3/4 독성은 호중구 감소증(2), 혈소판 감소증(2), 백혈구 감소증(1), 림프구 감소증(1) 및 빈혈증(1)을 포함하며, 이는 GC 및 ALT-801의 알려진 약력학적 효과와 일치한다. 3명 모두 13주까지 방사능 물질에 의한 완전 반응을 가졌다. 그 다음, 방사선 방광절제술을 받은 한 환자는 병리학적으로 종양세포를 함유하지 않는 것으로 확인되었다.

ALT-801+GC 처리 후에 진전성/전이성 요로상피암을 가진 나이브 대상자의 치료에서 관찰된 반응율(완전 반응 포함)은 이 환자 집단에서 이전에 공개된 임상 시험에 기초하여 매우 예상외였다. 예를 들어, von der Maase 등(J. Clin. Oncol. (2000) 17:3068)은 진전성 또는 전이성 방광암을 가진 환자들의 단계 III 임상 시험에서, 겜시타빈+시스플라틴을 이용한 치료는 49.4%(평가된 환자들 182명 중 81명)의 총 종양 반응율(즉, 부분 반응 및 완전 반응의 비율) 및 독립적인 방사선학적 견지에 의해 12.2%의 완전 반응율을 형성한 것으로 보고하였다. 또한, 이 연구는 메소트렉세이트, 빈블라스틴, 독소루비신 및 시스플라틴으로 처리된 환자들에서 유사한 총 반응율(45.7%, 평가된 환자들 181명 중 69명) 및 완전 반응율(11.9%)를 보고하였다. 이 환자 집단에서 다른 화학치료 요법의 후속 연구(즉, 단일 제제, 이중 제제, 삼중 제제)는 유사하거나 열등한 반응율을 보고하였다(리뷰, Yafi et al. Curr. Oncol. (2011) 18:e25).

또한, 화학치료에 내성적인 전이성 요로상피암 환자에서 ALT-801+GC 처리의 관찰된 효능(즉, 완전 및 부분 반응)도 문헌에 기초하여 매우 예상외였다. 예를 들어, 백금-함유 요법 후에 진행된 진전성 요로상피암을 가진 370명의 환자의 단계 III 시험에서 CRs은 보고되지 않았다(Bellmunt et al. J. Clin. Oncol. (2009) 27: 4454). 또한, 백금-경험된 환자들에 대한 다른 제2 선의 단일 치료 및 조합 치료는 단지 보통의 효과 및 현저한 독성을 제공하였다(리뷰, Yafi et al. Curr. Oncol. (2011) 18:e25).

다른 구현들

상술한 설명으로부터, 다양한 사용 및 조건에 대해 이를 적응시키기 위해 본 명세서에 기재된 발명에 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 명백할 것이다. 또한, 이러한 구현들은 하기 특허청구범위의 견지 내에 포함된다.

본 명세서에서 변수의 어느 정의에서 구성분의 리스트의 열거는 열거된 구성분들의 어느 단일 구성분 또는 조합(또는 부조합)으로서 그 변수의 정의들을 포함한다. 본 명세서에서 구현의 열거는 어느 단일 구현 또는 어느 다른 구현들 또는 이의 부분들과의 조합으로서의 구현을 포함한다. 본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공개물은, 각 독립적 특허 및 공개물이 분명히 그리고 개별적으로 참고문헌으로 편입되는 것으로 나타낸 것과 같은 정도로 참고문헌으로 편입된다.

Claims (21)

1. ALT-801; 시스플라틴; 및 겜시타빈을 포함하는 치료 조합물
   을 포함하는 암 완화용 약제.
   
2. 제1항에 있어서,
   약제는 베바시주맵, 세툭시맵, 이필리무맵, 파니투무맵, 리툭시맵 및 트랜스투주맵으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 항체를 추가로 포함하는 약제.
   
3. 제1항에 있어서,
   암은 방광암, 요도의 요로 상피암, 신우요관암, 다발성 골수종, 신장암, 유방암, 결장암, 두경부암, 폐암, 전립선암, 교아종, 골육종, 지방육종, 연부조직육종, 난소암, 흑색종, 간암, 식도암, 췌장암 및 위암으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 약제.
   
4. 제3항에 있어서,
   암은 방광암 또는 요로 상피암인 약제.
   
5. 제1항에 있어서,
   암은 화학-내성인 약제.
   
6. ALT-801; 시스플라틴; 및 겜시타빈을 포함하는 치료제를 포함하는 제제로서,
   대상자에서 종양 용적을 감소시킴으로써 종양 부담을 감소시키기 위한 제제.
   
7. 제6항에 있어서,
   제제는 베바시주맵, 세툭시맵, 이필리무맵, 파니투무맵, 리툭시맵 및 트랜스투주맵으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 항체를 추가로 포함하는 제제.
   
8. 제6항에 있어서,
   겜시타빈은 대상자 체중의 kg당 40mg의 투여량으로 투여되며, 시스플라틴은 3mg/kg의 투여량으로 투여되며, 그리고 ALT-801은 1.6mg/kg의 투여량으로 투여되는 제제.
   
9. 제6항에 있어서,
   종양 부담은 방광암, 요도의 요로 상피암, 신우요관암, 다발성 골수종, 신장암, 유방암, 결장암, 두경부암, 폐암, 전립선암, 교아종, 골육종, 지방육종, 연부조직육종, 난소암, 흑색종, 간암, 식도암, 췌장암 및 위암으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 제제.
   
10. 제9항에 있어서,
    종양 부담은 방광암 또는 요로 상피암인 제제.
    
11. 제9항에 있어서,
    종양 부담은 화학-내성인 제제.
    
12. ALT-801; 시스플라틴; 및 겜시타빈을 포함하는 제제로서,
    암에 대해 내구성이 있는 면역학적 메모리 반응을 유도하기 위한 제제.
    
13. 제12항에 있어서,
    제제는 베바시주맵, 세툭시맵, 이필리무맵, 파니투무맵, 리툭시맵 및 트랜스투주맵으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 항체를 추가로 포함하는 제제.
    
14. 제12항에 있어서,
    암은 방광암, 요도의 요로 상피암, 신우요관암, 다발성 골수종, 신장암, 유방암, 결장암, 두경부암, 폐암, 전립선암, 교아종, 골육종, 지방육종, 연부조직육종, 난소암, 흑색종, 간암, 식도암, 췌장암 및 위암으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 제제.
    
15. 제14항에 있어서,
    암은 방광암 또는 요로 상피암인 제제.
    
16. 제14항에 있어서,
    암은 화학-내성인 제제.
    
17. ALT-801; 시스플라틴; 및 겜시타빈을 포함하는 제제로서,
    암을 가진 대상자의 생존을 증가시키기 위한 제제.
    
18. 제17항에 있어서,
    제제는 베바시주맵, 세툭시맵, 이필리무맵, 파니투무맵, 리툭시맵 및 트랜스투주맵으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 항체를 추가로 포함하는 제제.
    
19. 제17항에 있어서,
    암은 방광암, 요도의 요로 상피암, 신우요관암, 다발성 골수종, 신장암, 유방암, 결장암, 두경부암, 폐암, 전립선암, 교아종, 골육종, 지방육종, 연부조직육종, 난소암, 흑색종, 간암, 식도암, 췌장암 및 위암으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 제제.
    
20. 제19항에 있어서,
    암은 방광암 또는 요로 상피암인 제제.
    
21. 제19항에 있어서,
    암은 화학-내성인 제제.

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