JP2018512047A - 汎用キラーｔ細胞 - Google Patents

Abstract

本発明は、改変ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および個別化医療におけるその使用に関する。本発明の改変ＮＫ細胞は非免疫原性であり、これはそれらがホストの免疫システムによって拒絶されることなく任意のレシピエントである対象に投与することができること（それらが「汎用的」であること）を意味する。第１の実施形態では、ＣＤ３を発現させてＴ細胞受容体（ＴｃＲ）を発現させるように、非免疫原性ＮＫ細胞を改変する。さらなる実施形態においては、非免疫原性ＮＫ細胞は、ＣＤ３共受容体と共にＴｃＲを発現するようにさらに改変される。改変ＮＫ細胞において特定のＴｃＲとＣＤ３とを共発現することで、標的細胞に対して抗原特異的細胞毒性を示す。したがって、汎用ＮＫ細胞は、特異的抗原に対して標的とすることができ、したがって、個別化医療、特に腫瘍学の分野において使用され得る。

Description

本発明はナチュラルキラー細胞およびその治療における使用、特にがんの治療における使用に関する。具体的には、ＣＤ３が発現するように改変されており、さらにがん抗原または他の標的抗原に特異的なＴ細胞受容体に基づいた抗原受容体が共発現するように改変されていてもよい、改変ナチュラルキラー細胞を開発した。改変されたナチュラルキラー細胞は非免疫原性、例えば、ＭＨＣの発現レベルが低いかＭＨＣネガティブであり、これは前記細胞が被験体のＭＨＣ型とは無関係であるような汎用的な使用に適していることを意味している。したがって本発明は、汎用性および個別化という特徴を有利に組み合わせる；そのＴ細胞受容体は病態（がんの種類など）および治療する対象のＭＨＣ型の両方に適合させることができるので、治療を受ける患者に対して個別化された治療において「汎用細胞」を用いることが可能になる。

免疫システムの、ある特定の細胞は、特定の標的細胞に対する細胞障害性活性を示す。細胞障害性Ｔリンパ細胞はＭＨＣクラスＩ分子に結合した抗原由来ペプチドを特異的に認識することができるＴ細胞受容体（ＴｃＲ）を発現する。反対に、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞はＭＨＣに拘束されず、殺傷効果を発揮するためにＭＨＣ分子に提示された抗原を必要としない。それらはペプチドを担持したＭＨＣのない、ストレスを受けた細胞を認識して、ＭＨＣを欠く細胞を殺傷することができる。そうしなければこれらの「非ＭＨＣ」細胞は他の免疫細胞によって検出されたり破壊されたりしないので、ＮＫ細胞は自然免疫において重要な役割を果たす。

細胞障害性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球またはキラーＴ細胞としても知られている）は、ＭＨＣクラス−Ｉ分子により細胞表面に呈示される抗原（ペプチド）との結合により、ＴｃＲを介した抗原特異的な方法で感染細胞または損傷を受けた細胞を認識することができる。ペプチドとＭＨＣクラス−Ｉは、結合相互作用の親和性を高め、ＴｃＲによるシグナル伝達を上昇させるＣＤ８共受容体を介して結合している。他のタイプのＴ細胞におけるＴｃＲ、特にヘルパーＴ細胞は、ＣＤ４共受容体を介して、ＭＨＣクラス−ＩＩ分子に呈示される抗原性ペプチドを認識する。Ｔ細胞において細胞表面へＴｃＲを局在化させるため（Ahmadi et al. 2011. Blood 118, 3528-3537）、また適当な抗原ペプチドを担持したＭＨＣタンパク質と接触することによるＴ細胞の活性化のために、ＣＤ３が必要である。ＣＤ３は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖およびζ鎖の４種の異なる鎖からなるタンパク質複合体であり、ＴｃＲとともにＴｃＲ複合体を形成する。

ＮＫ細胞（「大型顆粒リンパ球」とも定義される）は共通のリンパ球前駆体（Ｂリンパ球およびＴリンパ球も生じる）から分化するという細胞系譜を示す。Ｔ細胞とは異なり、ＮＫ細胞は天然では細胞膜にＣＤ３を有さない。重要なことに、ＮＫ細胞はＴＣＲを発現せず、また通常他の抗原特異的な細胞表面の受容体も欠いており（ＴＣＲおよびＣＤ３と同様にイムノグロブリンＢ細胞受容体を発現せず、通常代わりにＣＤ１６およびＣＤ５６を発現する）。したがってＮＫ細胞はＣＤ３^-、ＣＤ５６⁺のフェノタイプで分化する。ＮＫ細胞の細胞障害性活性は感作を必要としないが、ＩＬ−２を含む種々のサイトカインによる活性化によって増強される。ＮＫ細胞は一般的に、抗原と受容体を介するシグナル伝達に必要である、適切なまたは完全なシグナル伝達経路を欠いていると考えられているので、抗原‐受容体依存性のシグナルの伝達、活性化、および増幅ができるとは考えられていない。

ＮＫ細胞は細胞傷害性であり、その細胞障害活性を調節するために活性型受容体および抑制性受容体のシグナルのバランスをとる。例えば、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ受容体）を発現するＮＫ細胞は感染細胞に結合した抗体のＦｃドメインに結合でき、その結果ＮＫ細胞は活性化される。反対に、ＭＨＣクラスＩタンパク質を高レベルで発現している細胞に対しては、活性は抑制される。標的細胞と接触するとＮＫ細胞はパーフォリン等のタンパク質およびプロテアーゼ（グランザイム）等の酵素を放出する。パーフォリンは標的細胞の細胞膜に穴をあけ、アポトーシスや細胞の溶解を誘導することができる。

がんを治療するための、多くのＴ細胞を基盤とした治療方法が開発されており、養子細胞移入療法（ＡＣＴ）として知られているこれらの治療法は、近年ますます魅力的なものとなっている。３つの主要なＡＣＴ戦略がこれまでに開発されている。これらの一つ目であってもっとも発展しているのは、末梢または腫瘍部から患者本人の腫瘍反応性のＴ細胞（腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬｓ）として知られている）を単離するものである。これらの細胞を体外で増殖させ、患者の体内に再び注入する。しかしながら、この方法は細胞を増殖させる間の数週間の遅れを生じ、また専門の細胞生産設備を必要とする。

腫瘍を認識できる受容体を用いて患者自身のＴ細胞の改変を伴う、２つの他の治療方法が利用できる。一つの選択肢としては、がん抗原に対して活性を有するＴｃＲを単離して特徴づけ、そのＴｃＲをコードしている遺伝子をＴ細胞に挿入して患者へ再注入する。この治療法は一部の患者において固形がんの縮小がみられるが、重大な欠点がある：それは用いられるＴＣＲが患者の免疫型と適合していなければならないということである。そこで、ＴｃＲの使用の代わりに、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をＴ細胞に発現させる治療方法も提案されている。ＣＡＲは、ＴｃＲ複合体のシグナル伝達ドメインに結合した抗体を含む融合タンパク質であり、適切な抗体が選択された場合、Ｔ細胞が腫瘍に照準を合わせるために使用することができる。ＴＣＲとは異なり、ＣＡＲは移植患者とＭＨＣが一致する必要はない。しかしながら、ＣＡＲの適切な標的として使用することができるがん特異的表面抗原はこれまでのところほとんど同定されておらず、したがって、がんの治療におけるＣＡＲの使用は現在のところ限られている。

ＴｃＲまたはＣＡＲを用いてＴ細胞の改変を伴うＡＣＴの方法は全て、患者または組織型が適合するドナーからＴ細胞を単離して改変することが必要になる。自家細胞ではないものを用いた場合の拒絶反応のリスクを避けるためには自家Ｔ細胞の使用が必要となる。このことはＡＣＴに伴うコストを増加させ、またＡＣＴに使用するためのＴ細胞の調製を行うために必要とされる時間の尺度も長くなる。

ＡＣＴの限界を乗り越えるために模索されていた他の方法では、例えばＷＯ９８／４９２６８に記載されているように細胞障害性ＮＫ細胞を用いる。ＮＫ細胞は強力な細胞殺傷力があり、多数の様々な悪性細胞に対して細胞障害性を有している。ＮＫ細胞は自己のものではないＨＬＡ分子を発現する標的細胞は認識するが自己のＨＬＡ抗原は認識しないので、自家ＮＫ細胞は一般的に有効ではなく、同種のＮＫ細胞（移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を避けるためにＴ細胞を注意深く除去する必要がある）または細胞株を用いる必要がある。ＮＫ細胞株ＮＫ−９２の照射を行った細胞に基づいた治療方法は、白血病および他の血液悪性腫瘍の治療において臨床試験にまで進んでいる。照射は細胞が増殖できなくすることで、殺傷能力を限定しその持続期間を限定するためのものである。ＮＫ細胞は健康な細胞を攻撃することもない。しかしながら、ＮＫ細胞の自然の「範囲」は限定されており、またＮＫ−９２細胞は初代ＮＫ細胞よりも広い範囲を有しているがＮＫ細胞は天然には標的細胞上の抗原を特異的に標的とするための好適な受容体を含んでいないので、治療されたり標的となり得るがんの範囲を広げ、または細胞を特定のまたは選択されたがんに対して再指向させるためには、これらの細胞をさらに改変する必要がある。そのような再指向は、当然同種のＮＫ細胞である必要性がなくなるということを意味するが、それにもかかわらず、たとえば細胞毒性がより高いということから、初代細胞または自己のＮＫ細胞に比べてＮＫ細胞株はより有利である。

この目標を達成するため、がんの治療に使用するためにＣＡＲを発現するＮＫ細胞が開発されてきた。がん細胞の表面上の抗原を認識するＣＡＲは、連続的に増殖するＮＫ−９２細胞株に導入され、これらのＣＡＲを含むＮＫ−９２細胞は、元のＮＫ−９２細胞と比較して腫瘍細胞に対する細胞傷害性を増強することが示されている(Uherek et al。2002。Blood 200、1265-1273)。初期の臨床試験がおこなわれている。しかしながら、上記のように、ＣＡＲに対する標的として利用可能な抗原が不足していることから、現在のところ、ＣＡＲに基づく治療方法の使用は限定されている。

本発明は、がん特異的に殺傷する細胞を提供する別のアプローチに基づいている。より詳細には、本発明は、汎用的に使用するためのＮＫ細胞に基づくがん特異的なキラー細胞を提供することを目的とし、これは、現在Ｔ細胞に基づいた治療に必要とされているように細胞を患者の免疫型に適合させる必要がないが、それにもかかわらず、必要に応じて患者の特定の免疫型およびがんのタイプに合わせて調整することができるということを意図している。したがって、この汎用キラー細胞は個別化医療に使用され得る。

したがって、本発明は、ＮＫ細胞をＴ細胞に変化させることでＴｃＲを発現できるようにし、Ｔ細胞のように特異的かつ指向的な様式で細胞を死滅させることを提案する。本発明は、ＴｃＲによってもたらされる特異的標的化および細胞活性化と、ＮＫ細胞の効力および固有の自然殺傷能力とを組み合わせる。ＮＫ細胞におけるＣＡＲの発現は以前から行われていたが、ＮＫ細胞による活性化を成功させて標的を殺傷するようにＴｃＲを首尾よく発現させるための、必要なシグナル伝達経路およびシグナル伝達機構のすべてをＮＫ細胞が有しているという可能性はこれまで考えられていなかった。細胞は被移植者の免疫システムによって異物とは認識されないような非免疫原性であるＮＫ細胞、例えば天然に発現するＭＨＣのレベルが低いＮＫ細胞や増殖能が低いＮＫ細胞の使用により、または、ＮＫ細胞のＭＨＣ（例えば、ＨＬＡ）をネガティブにすることによって汎用化される。したがってＮＫ細胞は、処置を行う対象の免疫型（例えば、ＨＬＡ型）に適合させる必要はなく、被験体の免疫型にかかわらず（すなわち、任意の免疫型、例えば任意のＨＬＡプロファイル／タイプを有する被験体に対して）汎用的に投与することができる。

したがって本発明は、非免疫原性ＮＫ細胞において機能的で活性のあるＴｃＲを発現させる手段を提供する。この方法では、細胞のＭＨＣ適合性には依存せずに細胞に導入されるＴｃＲの特異性によって決定される、制御された特異性を有する汎用性のあるキラーＴ細胞を提供することができる。ＴｃＲがＮＫ細胞の表面に局在するためにはＮＫ細胞におけるＣＤ３とＴｃＲが共発現すれば十分であることが見出され、驚くべきことにＴｃＲを発現するＮＫ細胞は標的細胞に対して抗原特異的細胞毒性を示した。他の観点からみると本発明は、非免疫原性ＮＫ細胞においてＣＤ３とＴｃＲとを共発現させるだけで、ＮＫ細胞を汎用性という利点が加わった細胞傷害性Ｔ細胞に変換する手段を提供する。したがって、本発明は、個別化医療に使用することができる「汎用的な」キラーＴ細胞を提供する。

したがって、第一の側面において、非免疫原性である細胞についてＣＤ３を発現するように改変した、改変ＮＫ細胞を提供する。

特に、例えば増殖能を低下させるための照射により、または細胞が細胞内に導入された場合に免疫応答を生じさせるほど長く生存し続けしないようにするような増殖を抑制する他の手段により、または細胞がＭＨＣ陰性であるように改変することにより、細胞を非免疫原性に改変する。

本発明の細胞はさらに標的細胞上の抗原（つまり標的抗原）に対して特異性を有するＴｃＲを発現するように改変されていてもよい。さらに以下で定義するように、本明細書において用語「ＴｃＲ」は、ＴｃＲの抗原認識領域を含んでいるかそれに基づいている任意の抗原受容体、またはＴｃＲに由来する任意の抗原受容体を含むように広く用いられる。したがって、天然のＴｃＲ、およびＴｃＲバリアントまたは誘導体などの合成ＴｃＲの双方が含まれる。

具体的な実施形態においては、本発明はＣＤ３およびがん細胞上の抗原に特異的なＴｃＲを発現する、非免疫原性ＮＫ細胞を提供する。言い換えれば、本発明はがんに特異的なＮＫ細胞であって、該細胞は非免疫原性であり、がん特異的なＴｃＲおよびＣＤ３の共発現によりがん特異性が示される細胞を提供する。以下でさらに詳細を述べるように、好ましい実施形態においては、該ＴｃＲは共受容体に依存せず、特にＣＤ４および／またはＣＤ８に依存しない。

さらなる側面においては、本発明は、治療において使用するための、より具体的にはがんの治療において使用するための、またはさらに一般的には養子細胞移入療法において（例えばＴ細胞療法に応答し得る任意の疾患の治療において）使用するための、上で定義したような細胞を提供する。

さらなる側面においては、本明細書において上で定義した、がんの治療または養子細胞移入療法において使用する医薬の製造における、改変ＮＫ細胞の使用を提供する。

少なくとも一つの薬学的に許容可能な、担体または賦形剤と共に、本明細書において上で定義した改変ＮＫ細胞を含む治療用組成物、およびがんの治療または養子細胞移入療法における使用のためのそのような治療用組成物も提供する。

またさらなる側面は治療方法、より具体的にはがんの治療方法または養子細胞移入療法の方法であって、それを必要とする被験体（例えばがんに罹患したり、がんと診断された患者）に本明細書において上で定義した、改変ＮＫ細胞の有効量を投与することを含む方法を提供する。

治療における使用のため、本発明の改変ＮＫ細胞はＴｃＲをＣＤ３と共発現するように改変される。したがって治療における使用のための医薬または組成物の調製はＮＫ細胞にＴｃＲを発現させるように改変することを含む。ＴｃＲはまず治療を受ける被験体（つまり改変ＮＫ細胞の被移植者）の免疫型（つまりＭＨＣ）に適合させるように、次に被験体内においてＮＫ細胞の標的となる細胞に適合するように、またはそれを認識するように、デザインまたは選択される。これは被験体における所望の標的抗原を認識するようにデザインまたは選択されるということである。被験体内のがん細胞または養子細胞移入療法により阻害される細胞、例えばウイルス性のまたはその他の病原性抗原を発現（提示）している細胞である感染細胞などによって発現される（提示される）標的抗原であってもよい。

したがって本発明に係るがんの治療または養子細胞移入療法を行い、または治療の使用のための改変ＮＫ細胞の調製を行なうには、次の工程が行われる：
（ａ）ＣＤ３を発現するように改変された非免疫原性のＮＫ細胞を提供し；
（ｂ）治療される被験体のＭＨＣ型を決定し；
（ｃ）例えば被験体内のがんのタイプおよび／または特定のがんマーカー（抗原など）の発現や特定の変異の有無等を特定または決定することにより、被験体の細胞によって発現または提示されている被験体内の標的抗原を特定し；
（ｄ）標的抗原に対して特異性を有し、且つ被験体のＭＨＣ型に適合するＴｃＲを発現するように、工程（ａ）の細胞を改変する。

以下に述べるように、工程は別々に行われてもよいし、順次行われてもよいし、また同時に行われてもよい。したがって、例えば、工程（ａ）および（ｄ）は同時に行われてもよく、より具体的には一以上の同時工程においてＣＤ３およびＴｃＲを発現するように細胞を改変してもよい。しかしながら、他の実施形態においてはＴｃＲを発現させる改変の前の別の工程においてＣＤ３を発現するように細胞を改変してもよい。最後に、治療方法または治療的使用において、工程（ｄ）の改変細胞を（例えば、さらなる工程（ｅ）において）被験体に投与してもよい。

本発明の他の側面においては汎用ＮＫ細胞（治療的使用に好適な（または用いることができる）細胞）の製造、より具体的には個別化治療、つまり養子細胞移入療法のための使用のための細胞の調製における使用のための汎用ＮＫ細胞の製造のための方法が提供される。当該方法は以下を含む：
ａ）非免疫原性であるＮＫ細胞を提供すること、より具体的にはＮＫ細胞を非免疫原性に改変し；および
ｂ）ＣＤ３を発現するように前記細胞を改変する。

さらに養子細胞移入療法において使用するための改変ＮＫ細胞を提供する。前記細胞はさらにＴｃＲを発現するように、特に個別化医療のためには治療を受ける患者のＭＨＣ型に適合しており、改変ＮＫ細胞の標的である標的細胞により発現されるか提示される標的抗原を認識するＴｃＲを発現するように、工程（ｃ）において改変される。

好ましい実施形態においては、がん特異的ＮＫ細胞の製造のための方法が提供される。
前記方法は以下の工程を含む：
ａ）例えばＮＫ細胞を非免疫原性に改変するなど、非免疫原性であるＮＫ細胞を提供し；
ｂ）ＣＤ３を発現するように前記細胞を改変し；
ｃ）がん特異的ＴｃＲを発現するように前記細胞を改変する。

工程（ｂ）および（ｃ）は一緒に（同時に）行われてもよく、別々に、例えば順次に行ってもよい。しかしながら有利な様態においては、以下に述べるように、汎用ＮＫ細胞はＣＤ３を発現するように改変されていてもよく、被験体の診断結果およびＭＨＣ型に基づいて選択されるＴｃＲを発現するようにさらに改変されることで、養子細胞移入療法のための個別化された細胞を調製するための別の工程において引き続き用いられてもよい。したがってＭＨＣ特異性（つまりＭＨＣ型）および標的抗原特異性（例えば、特定の範囲の異なる既知のまたは既に同定された標的抗原（がん抗原など）に対する）に応じた様々なＴｃＲ（より具体的にはＴｃＲをコードする、核酸分子またはベクター）を含むようにＴｃＲ受容体のバンクまたはライブラリを作製してもよい。被験体の診断結果（ある特定の種類のがん、またはある特定の抗原を発現することがしられているか、患者のがんを具体的に解析することにより特定されたがんなど）にしたがって、本発明に係るＮＫ細胞を改変するために特定のＴｃＲを選択したり用いたりすることができる。あるいは、改変ＮＫ細胞のバンクまたはパネルは様々な特異性のＣＤ３およびＴｃＲの双方を発現するように作製してもよく、そこから患者の診断結果およびＭＨＣ型にしたがって好適なＮＫ細胞を選択することができる。

したがって、また本発明のさらなる側面は併用製品またはキット、特に養子細胞移入療法もしくはがんの治療において用いるための製品またはキットを提供し、前記製品またはキットは以下のものを含む：
（ａ）非免疫原性であり且つＣＤ３を発現する改変汎用ＮＫ細胞、より具体的には非免疫原性となるように且つＣＤ３を発現するように改変されたＮＫ細胞；および
（ｂ）それぞれのＴｃＲが様々な抗原特異性および／または様々なＭＨＣ特異性を有する、ＴｃＲをコードする核酸分子のパネル。

好都合にはコーディング核酸分子はベクター、例えば改変ＮＫ細胞に導入（つまりトランスフェクションまたは形質導入など）するために用意されたベクターにおいて提供されることができる。好ましい実施形態においてはＴｃＲはがん抗原に対しての、またはがん細胞上に（優勢的にまたは特異的に）発現されている抗原に対しての特異性を有する。

本発明のまたさらなる側面は、それぞれのＮＫ細胞が非免疫原性であり且つＣＤ３を発現する、例えば、非免疫原性となるように且つＣＤ３を発現するように改変されており、ＴｃＲを発現する（つまり発現するように改変された）改変ＮＫ細胞のパネルまたはライブラリを提供する。ここでそれぞれのＮＫ細胞のＴｃＲは異なった抗原特異性および／または異なったＭＨＣ特異性を有する。

このような側面においては、同じ抗原を認識するがそのＭＨＣ特異性が異なる、またはその逆である、複数のＴｃＲがありうることが理解できる。

本発明においては、がんの治療において免疫系の細胞傷害性細胞を使用する。具体的には本発明は、他の状態ではＴｃＲを発現しないような、免疫系の細胞障害性の細胞におけるＴｃＲの発現、および活性があって機能的なＴｃＲをそのような細胞に発現させる方法に関する。

本明細書において、用語「細胞溶解性」および 「細胞毒性」は、標的細胞に対して溶解による細胞死またはアポトーシスを誘導することができる細胞のことを示すために互換的に用いられる。

用語「標的細胞」は本発明の細胞障害性細胞により殺傷される細胞を指す。より具体的には、標的細胞はＮＫ細胞により標的とされる細胞であり、したがってＴｃＲにより認識される抗原（標的抗原）を発現または提示する細胞である。これらはいかなる細胞種を含んでいてもよく、標的細胞の表面に提示された抗原を介して本発明の細胞により標的とされる。

したがって、標的細胞は、除去、殺傷、不活性化などによって阻害されることが望ましい、被験体内の任意の細胞であってもよい。より好ましい標的細胞はがん細胞であるが、疾患や臨床症状の結果である任意の細胞であってもよい。疾患や症状はしたがって養子細胞移入療法、より具体的には細胞を殺傷または除去等するために該細胞を標的とするＴ細胞療法により恩恵を受け得る任意の疾患であってもよい。がん細胞と同様に、除去することが臨床的に望ましい他の細胞には、感染細胞、すなわち任意の病原体に感染した細胞が含まれる。そのような細胞は典型的にはウイルス感染細胞であるが、他の病原性の生物、例えば任意の微生物、例えば、バクテリア、菌、マイコプラズマ、原虫、プリオンに感染していてもよい。また、標的細胞はアポトーシスまたはプレアポトーシス細胞であってもよく、またストレス状態にある細胞（つまり細胞表面にストレス関連マーカーが発現している）であってもよく、また例えばある特定の突然変異が発現しているような、変異細胞であってもよい。

「標的抗原」は標的細胞に呈示された場合にＴｃＲによって認識される分子（より具体的にはそれを提供するかそれを含む）である。したがって標的抗原、より具体的には標的抗原由来のペプチドは、ＴｃＲによって認識されるために必要となるようにＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣＩＩに拘束された様式で標的細胞に提示される。したがって上述したように標的抗原は、がん細胞に特異的、選択的、もしくは優勢に発現している抗原であるがん抗原、またはがん細胞の特徴であるか、がん細胞マーカーとして公知もしくは用いられているがん抗原、であってもよい。がん抗原は普遍的ながん抗原、つまり様々ながんの広範囲において共通してみられる抗原であってもよいし、またはある特定のがんの種類に特異的なものであってもよい。代わりに、標的細胞に提示されている感染性の病原体由来の抗原であってもよいし、または阻害されることが望ましい他の任意の細胞に発現されているか提示されている、他の任意の抗原であってもよい。

「ＭＨＣ」とは主要組織適合遺伝子複合体タンパク質のことを示しており、ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩタンパク質の双方を含む。ＭＨＣＩＩタンパク質は一般的に樹状細胞、単核食細胞、いくつかの内皮細胞、および胸腺上皮細胞などの抗原提示細胞の表面にのみみられる。ＭＨＣＩＩタンパク質はＢ細胞においても発現するので、悪性化したＢ細胞によって発現されうる。ＭＨＣＩＩタンパク質は高い頻度でメラノーマ細胞にも発現する。用語ＭＨＣはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を含むので、対象がヒトである場合、これらの用語は互換的に用いられてもよい。

任意のＮＫ細胞を本発明において使用することができる。用語「ＮＫ細胞」は大顆粒リンパ球のことを示し、これは天然には抗原特異的受容体（例えばＴ細胞受容体またはＢ細胞受容体）を含まないリンパ球系共通前駆体に由来する細胞障害性のリンパ球である。ＮＫ細胞はそのＣＤ３^-、ＣＤ５６⁺フェノタイプによって識別することができる。したがって明細書において当該用語は、本任意の公知のＮＫ細胞または任意のＮＫ様細胞、またはＮＫ細胞の特徴を有する任意の細胞を含む。

本発明の一実施形態においては、ＮＫ細胞は被験体に由来するものであり、本発明における使用のためのＮＫ細胞の細胞集団を提供するためにインビトロで生育させたものであってもよい。ＮＫ細胞は自己由来のもの（つまり、本発明の細胞および方法を用いて治療を受ける患者に由来するもの）であってもよく、異種起源（つまり、細胞はドナーとなる被験体由来であってもよいし、他の患者の治療を意図したものであってもよい（つまり、同種異系、同系、または異種である）。したがって初代ＮＫ細胞を用いてもよい。他の様態においては、当該技術分野において知られている、これまでに単離され、培養されてきたＮＫ細胞を本発明において用いてもよい。したがってＮＫ細胞株を用いることができる。多くの様々なＮＫ細胞が知られておりまた文献において報告されており、これらの任意のものを用いてもよいし、初代ＮＫ細胞から、例えばウイルスによるトランスフォーメーションにより細胞株を調製してもよい（VogelBetal.2014Leukemia28:192-195）。細胞株は初代ＮＫ細胞よりも、例えば培養における生育および維持が容易であり、さらに増殖も用意であり、養子細胞移入療法のための需要に応じて標準化された品質のものが簡単に入手可能であるという多くの利点を有する。ＮＫ−９２細胞株等の特定の細胞株もより高い細胞障害活性を示すことができ、改変していない状態（本発明による改変は行わない）において、（抑制性受容体の欠如や減少に起因し得る）より広範囲な細胞標的、例えばがん細胞標的を有する。好適なＮＫ細胞としては（これらに限定はされないが）、ｉＮＫ−９２に加えて、ＮＫ−ＹＳ、ＮＫ−ＹＴ、ＭＯＴＮ−１、ＮＫＬ、ＫＨＹＧ−１、ＨＡＮＫ−１、またはＮＫＧ細胞株が挙げられる。

好ましい実施形態においては、前記細胞はＮＫ−９２細胞（Gongetal.,1994,Leukemia8,652-658）であるか、そのバリアントである。元々のＮＫ−９２細胞から多くの様々なバリアントが作製されて報告されていたり、または入手することができ、それには非免疫原性のＮＫ−９２バリアントが含まれている。そのようないかなるバリアントが用いられ得るし、また用語「ＮＫ−９２」に含まれる。他の細胞株のバリアントを用いてもよい。しかしながら、本発明に使用するためのいかなるＮＫ−９２またはＮＫ細胞は、本発明にしたがって改変ＮＫ細胞に導入されているか、導入され得るＴｃＲ以外の抗原特異的受容体を発現するように改変されていてはならない。例えば、前記細胞はＣＡＲ（ＴＣＲ複合体からの細胞内シグナル伝達ドメインに連結しているモノクローナル抗体）を発現してはならない。さらに一般的には、本発明に係る改変ＮＫ細胞は抗体認識領域に基づいた、または含む抗原特異的受容体を発現しない。ＮＫ細胞は天然には抗原特異的受容体を含まず、したがって本発明の細胞に存在する唯一の抗原特異的受容体は前記ＮＫ細胞に導入されているか、または導入され得るＴｃＲのみである。

本発明によると、改変ＮＫ細胞は非免疫原性である。機能的にいえば、これは当該細胞が、導入されたいかなる対象の免疫システムによっても認識されない―免疫レーダーを潜り抜けて、レシピエントとなる対象によって拒絶されたり異物と認められたりしないということを意味する。つまり、ＮＫ細胞が投与された被験体の免疫システムによる改変ＮＫ細胞に対する臨床的に有意な免疫応答は起きない。したがって、細胞は被験体に投与した場合に、治療における細胞の使用に影響を及ぼしたり干渉したりまたは阻害するような免疫応答を生じなければ、細胞は非免疫原性であり得る。

したがって、本明細書において用語「非免疫原性」は、細胞が注射または他の方法で被験体へ投与される場合、細胞に対して実質的にまたは臨床的に有意な免疫反応がないことを意味するように広く用いられる。より具体的には細胞が、該細胞の拒絶反応および／または該細胞の機能に影響を与えるに足りる免疫反応を引き起こさず（または引き起こすことができず）、例えばその免疫反応は細胞の機能や効果（つまり有用性）を抑制したり、実質的にまたは有意に減少させるのに充分でない。したがって、細胞は被験体内で細胞障害活性を維持し、より具体的には標的細胞に対して有意に、実質的に、または測定可能な、細胞障害活性を維持する。具体的な実施形態においては、該細胞は異物として拒絶されない。いかなる生命システムにおいても、免疫反応の欠如は完全（または１００％）ではなく、細胞の機能や有用性が実質的に影響を受けない限り（つまり、細胞が機能し得る限り）、該ＮＫ細胞に対してのわずかな（または軽度、軽微な）免疫反応（例えば僅かな免疫反応）は許容され得る。

したがって、自己由来の細胞（それを取得したのと同じ被験体に投与された、または投与するための細胞）は非免疫原性であることが判るだろう（それは「自己」であるので）。同様に、自己由来ではないＭＨＣ適合ＮＫ細胞も非免疫原性であるか、実質的に非免疫原性である。用語「非免疫原性」はしたがって機能上非免疫原性であることを含む。しかしながら上記のようにある様態においては、本発明の非免疫原性ＮＫ細胞は細胞のレシピエントに関係なく、つまり該細胞が導入された、または導入される被験体に関係なく非免疫原性である（つまり、非自己ではない対象に投与される場合において臨床的に優位な免疫反応を誘導しない）。ある特定の態様では、ＮＫ細胞に非免疫原性とするための処理を行ってもよい（つまり細胞は非免疫原性に改変される）。前記処理は、例えば、物理的、化学的、生物学的な処理であってもよく、細胞の構造的または物理化学的な改変（例えば、細胞の構造的または物理的な変化または変更を引き起こす処理）、例えば細胞によるＭＨＣの発現を減らしたり消失させたりするなどのための照射、または遺伝子改変であってもよい。したがって、いくつかの実施形態においては、ＮＫ細胞は単に機能上免疫原性なだけではなく、それを非免疫原性にする改変を有しているか含んでいる。

したがって、ＮＫ細胞は天然に非免疫原性であってもよいし、非免疫原性となるように改変されていてもよい。天然に非免疫原性のＮＫ細胞はＭＨＣ分子を発現しないか、弱くしか発現しないか、または免疫応答を刺激しないような機能のないＭＨＣ分子を発現していてもよい。免疫原性であるＮＫ細胞はその表面のＭＨＣ分子の発現を消失するように、または弱くしか発現しないように改変する。または、そのような細胞は機能のないＭＨＣ分子を発現するように改変されてもよい。

そのような細胞はいずれも（天然に非免疫原性であっても、ある方法で改変されていたとしても）被験体の免疫反応による、臨床的に優位な免疫反応を引き起こすに足るレベルのＭＨＣを表面には含まず、ＭＨＣネガティブと考えることができる。換言すると、ＭＨＣネガティブ細胞は、免疫学的に機能のあるＭＨＣ分子をその細胞表面に発現しないか、他の免疫細胞、特に非自己の免疫細胞または対象となるレシピエントである被験体由来の免疫細胞によって認識され得るほど十分に高いレベルで細胞表面にＭＨＣ分子を発現していない。細胞はＭＨＣ分子を欠如していてもよく、その細胞表面にＭＨＣを発現していなくてもよく、その細胞表面にＭＨＣを弱くしか発現していなくてもよく、または発現しているＭＨＣ分子が、例えば、変異を起こしているか、そうでなければ機能しないように改変されているなどの、機能しないものであってもよい。機能のあるＭＨＣ分子の発現を阻害するいかなる手段も包含される。したがって、これはＭＨＣ複合体の分子のノックアウトまたはノックダウンを含んでいてもよく、および／または適切な輸送および／または細胞表面におけるＭＨＣ分子または複合体全体の正しい発現を阻害する改変を含んでいてもよい。

特に、本発明の細胞の表面における一以上の機能性ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現は阻害される。本発明の一実施形態においては、細胞はＨＬＡネガティブであるヒトの細胞であってよく、したがって１つ以上のＨＬＡ分子、例えばＨＬＡＭＨＣクラスＩ複合体の分子の発現が阻害されている細胞（ノックアウトなど）であってもよい。

好ましい実施形態においては、成熟ＭＨＣクラス−Ｉ複合体のコンポーネントである、β₂−ミクログロブリンをコードしている遺伝子のノックアウトによって、ＭＨＣクラス−Ｉの阻害が行われてもよい。β₂ｍの発現は、β₂−ミクログロブリン遺伝子（β₂ｍ）の標的破壊、例えばβ₂ｍプロモーターの（プロモーターを不活性化するための）部位特異的突然変異誘発、またはタンパク質の発現を阻害する不活化変異体をの誘導、例えば、遺伝子内のフレームシフト突然変異や中途「停止」コドンなど、β₂ｍタンパク質をコードしている遺伝子内における部位特異的突然変異誘発により、消失させることができる。また、細胞表面の活性化ＭＨＣタンパク質を形成することができない、機能のないβ₂ｍタンパク質を生み出すために部位特異的突然変異誘発を用いてもよい。この手段においては、β₂ｍタンパク質またはＭＨＣは細胞内に保持されていてもよいし、細胞表面に提示されてはいるが機能のないものであってもよい。

また、ＮＫ細胞は被験体への投与に先だって照射を受けていてもよい。照射をうけたＮＫ−９２細胞は臨床試験において非免疫原性であることが認められており、免疫療法に用いることを認可されている（Ton T. et al. 2013 Cytotherapy 15 1563-70）。理論に縛られることを望むものではないが、細胞の照射により被験体において該細胞は一時的にのみ存在することになるため、被験体の免疫システムが改変ＮＫ細胞に対する免疫学的応答を開始するための時間が短縮されるという結果になると考えられる。そのような細胞は機能のあるＭＨＣ分子を細胞表面に発現させることはできるが、非免疫原性であると考えることもできる。

したがって、本発明に係るＮＫ細胞は、増殖するための能力や力、つまり増殖能を低減させることによって非免疫原性となるように改変されてもよい。

本発明のＮＫ細胞はＣＤ３を発現するように改変される。上述したとおり、本発明のＮＫ細胞はＣＡＲ、または実際にＴｃＲ以外のいかなる抗原特異的受容体も発現しない。したがって、特に、ＴｃＲ−ＣＤ３融合体の場合を除いて、ＣＤ３はキメラ受容体の一部としては発現されない。より具体的には、ＣＤ３は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または抗体由来抗原結合領域もしくはＴｃＲではない他の親和性のある結合相手等、例えばＴｃＲ以外のリガンドもしくは受容体に由来する結合分子や結合成分などに由来する結合ドメインに基づいたキメラ受容体の一部としては発現されない。したがって、ＣＤ３は抗原結合ドメイン（つまり、結合部分や結合成分）または任意の結合ドメインを含むキメラ受容体の一部や、ＴｃＲではないかＴｃＲに由来しないリガンドの一部としては発現されない。換言すると、ＣＤ３は独立に（つまり、別々の分子または別々の鎖としてであり、ＣＤ３鎖またはその一部ではない成分との融合体の一部またはリンカーもしくはスペーサーとしてではではない）発現され、および／またはＴｃＲ−ＣＤ３融合体の一部として（またはその内部に）発現される。したがって、特に、本発明のＮＫ細胞はＣＡＲまたはＣＤ３−ＴｃＲ融合体以外の、ＣＤ３鎖もしくはＣＤ３分子を含む他のキメラ受容体を発現しない。ＣＤ３が融合体またはその一部（つまり融合タンパク質）として提供される一つの態様においては、さらに以下で説明するＣＤ３融合体またはＣＤ３−ＴｃＲ融合体である。

ＮＫ細胞は通常（または天然には）ＣＤ３を発現しないので、細胞がＣＤ３を発現できるようにするためにはＣＤ３をコードする核酸分子を細胞に導入する。したがって細胞は組換えによりＣＤ３を発現するように改変される。換言すると細胞はＣＤ３をコードする異種の核酸分子を発現できるように改変される。ＣＤ３は細胞の生物種に適合させてもよい（つまり細胞と同じ生物種）が、異なった生物種のＣＤ３を用いてもよい。したがって、ヒトＮＫ細胞には、ヒトＣＤ３、またはマウス、ラット、ウサギ等の他の哺乳類のＣＤ３が発現され得る。好ましい実施形態においてはすべてのＣＤ３鎖（つまりＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、二本のＣＤ３ε鎖およびζ鎖）がＮＫ細胞において発現する。しかしながら、一つのＣＤ３鎖（例えばＣＤ３γ鎖のみ、ＣＤ３δ鎖のみ、ＣＤ３ζ鎖のみ、ＣＤ３ε鎖のみ）、またはそれらの組み合わせ、が存在することも考慮される。したがってＮＫ細胞はＣＤ３鎖のいずれか単独、または最大では完全なＣＤ３分子を含むような他のＣＤ３鎖との組み合わせを発現するように改変されていてもよい。理論に縛られることを望むわけではないが、一以上のＣＤ３鎖がＮＫ細胞において発現されない場合に、ＴｃＲを細胞表面に誘導すること、および／またはシグナル伝達を開始することが可能であり得るという仮説が立てられる。ＣＤ３の局在およびシグナル伝達に関する機能が保持されている場合、一以上のＣＤ３鎖が融合タンパク質として提供され得ることも予測でき、このとき少なくとも二本の鎖は単鎖ポリペプチドとして提供される。

一以上のＣＤ３鎖は一の核酸分子または一以上の核酸分子、例えば別々の分子によりコードされていてもよい。便宜的には、例えば同一のプロモーターまたはなんらかの方法で互いに結合したプロモーターの制御下にあるすべての３つのＣＤ３鎖をコードしている核酸分子を含むコンストラクトを作製することができる。

本発明のＮＫ細胞はさらにＴｃＲを発現するように改変されていてもよい。ＴｃＲは、標的細胞の表面にある抗原に選択的に結合する、ＴｃＲの抗原認識ドメイン、抗原認識配列、またはそれらのフラグメントを含む、任意の受容体とみなすことができる。したがって本発明の背景においてはＴｃＲはネイティブの（または天然の）状態でＴｃＲ抗原認識ドメインを含む正規のＴｃＲであってもよく、またＴｃＲにおいて天然には一緒にみられることはない（つまりネイティブではない）アミノ酸配列および／またはタンパク質ドメイン（キメラ分子または融合タンパク質の一部として）と連結したＴｃＲ抗原認識ドメイン、抗原認識配列、またはそれらのフラグメントを含んでいてもよい。したがって本明細書において、用語「ＴｃＲ」は抗原受容体であって、その抗原認識領域が、例えばネイティブのＴｃＲの抗原認識領域やネイティブのＴｃＲに由来した抗原認識領域など、ＴｃＲの抗原認識ドメインまたは配列により規定される抗原受容体を含むように広く用いられる。したがって用語「ＴｃＲ」は、ネイティブのおよび非ネイティブのＴｃＲを含み、合成されたものまたは人工のものであるＴｃＲ分子もしくはコンストラクト、ＴｃＲバリアントもしくは誘導体、またはネイティブのＴｃＲに由来するかそれに基づいたＴｃＲ分子を含む。

したがって、ＴｃＲを発現するＮＫ細胞は、標的細胞に対する抗原特異的（つまり抗原を標的とする）細胞障害活性を有する。ＴｃＲは目的となる標的細胞上の抗原（標的抗原）に対して特異性を有するいかなるＴｃＲであってもよい。ＮＫ細胞の特異性、（つまり細胞が結合する抗原）はＴｃＲの特異性によって決定される。換言すると、好適なＴｃＲを選択することは、所望の特異性（つまり標的細胞上の特異的抗原に対する特異性）を有するＮＫ細胞を提供するために必要である。したがって本発明の一実施形態においては、ＣＤ３を発現するように改変され、さらに標的細胞上の抗原に対して特異性を有するＴｃＲを発現するように改変されたＮＫ細胞を提供する。

好ましい実施形態においては、ＴｃＲは標的細胞の表面上の抗原と高い親和性で結合する（つまりＴｃＲは高親和性のＴｃＲである）。そのような有利な様態においては、ＴｃＲ発現細胞が、細胞障害性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞のそれぞれにおいて通常ではＴｃＲを活性化するために必要とされるＣＤ８／ＣＤ４共受容体の不在下においても活性化されるほど、ＴｃＲは標的細胞の表面上のＭＨＣ−抗原複合体に充分に高い親和性で結合することができる。したがって本発明はＣＤ３を発現するように改変され、さらに標的細胞上の抗原に対して特異性を有するＴｃＲを発現するように改変されたＮＫ細胞を提供し、ここで前記ＴｃＲは前記標的細胞と高い親和性で結合し、ＣＤ８および／またはＣＤ４共受容体の非存在下で活性化する。あるいは、本発明によりＮＫ細胞に導入されたＴｃＲは共受容体（またはコファクター）に依存しない；つまり細胞を活性化するため（つまり、ＴｃＲによって誘導される細胞内のシグナル伝達が引き起こされるため）に他の受容体やコファクターを必要としない。したがってＴｃＲは通常の生理学的な範囲におけるｋ_off値で抗原（ＭＨＣ−抗原複合体）に結合してもよい。特にそれはＣＤ８および／またはＣＤ４に依存しない、例えばＣＤ８に依存せず、より具体的にはＣＤ４およびＣＤ８に依存しない。しかしながら、他の様態においてはＮＫ細胞はさらにＣＤ４および／またはＣＤ８を発現するように改変してもよい。

ＴｃＲはＭＨＣクラス−Ｉまたはクラス−ＩＩファミリータンパク質により細胞表面に提示された抗原（ペプチド）を認識して結合する。したがって抗原の認識は、細胞のＭＨＣ型およびペプチド（より具体的にはペプチドの配列）（抗原）の双方に依存する。一般的に言って、標的抗原は公知であり、ＴｃＲはその抗原特異性にしたがって選択される。好ましい実施形態においては、標的細胞に提示されるペプチド抗原の配列は知られている。さらに、標的細胞のＭＨＣ型もまた公知であり得る。したがって好ましい実施形態においては、ＴｃＲは標的細胞の表面の抗原‐ＭＨＣ複合体に特異的に結合できるものを選択し得る。したがって好ましい実施形態においては本発明はＣＤ３を発現するように改変し、さらに標的細胞上の抗原に対して特異性を有するＴｃＲを発現するように改変され、前記ＴｃＲは標的細胞の表面抗原‐ＭＨＣ複合体に特異的に結合できる、ＮＫ細胞を提供する。

本発明の好ましい実施形態においてＴｃＲは、標的細胞またはヘルパーＴ細胞に対して特異的に細胞毒性を示すことが確認されている細胞障害性Ｔ細胞から選択することができる。また、そのようなＴｃＲ抗原認識ドメインまたは配列、またはその断片を選んでもよい。前記Ｔ細胞は治療の対象となる患者から取得してもよいし、第２の被験体（つまりＴｃＲのドナー）から取得してもよい。したがって、ＴｃＲは標的細胞に対して「実証された」活性を有することが確認されたＴ細胞から選択することができる。換言すると、ＴｃＲは標的細胞に対して有効性が示されたものから選択することができる。一例として、腫瘍に浸潤されたリンパ球などのＴ細胞をがん患者から単離してもよい。性質上それらは患者のがんに対して活性のあるＴ細胞であるか、それを含んでいる。そのような細胞のＴｃＲをコードする遺伝子は同定されクローニングされて、本発明に係るＮＫ細胞においてＴｃＲまたはその抗原認識ドメインもしくは配列またはそれらのフラグメントを発現させるために用いられる。Ｔ細胞はがん抗原を含むワクチンの投与によるワクチン接種などにより、患者または被験体において産生されてもよい。それらのワクチン接種によって誘導された細胞であって被験体のがんに対してまたはがん細胞に対して最も活性のあるものをここで選択することができる。例えばもっとも高い親和性のあるＴｃＲまたは共受容体に依存的しないＴｃＲなどのような方法で最も強力であるか効力のあるＴｃＲを選択することができる。最適化されたＴｃＲを得るために親和性成熟を行ってもよい。好都合には、ＴｃＲの由来である患者（ＴｃＲドナー）のＨＬＡプロファイルまたはＭＨＣプロファイルは、治療を受ける患者のＨＬＡプロファイルまたはＭＨＣプロファイルと同じである。上記のとおり、標的細胞に対して特異性を有するＴ細胞のＴｃＲを特定して特性を評価してもよく、ＴｃＲのアミノ酸配列やＴｃＲをコードしている遺伝子の核酸配列を取得してもよい。言い換えると、標的細胞上の特定の抗原に対して特異性を有しているＴｃＲを含む、細胞障害性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞は患者において特定することができ、受容体のアミノ酸配列および受容体をコードしている遺伝子のＤＮＡ配列を取得することができる。そのＤＮＡ配列または遺伝子は、ＮＫ細胞に導入してＴｃＲをホスト（つまりレシピエント）のＮＫ細胞に発現させるための核酸分子またはコンストラクトの調製に用いることができる。

本発明の別の様態においては、人工のＴｃＲ（つまり、細胞障害性の細胞またはヘルパーＴ細胞から同定されたものではないＴｃＲ）を用いてもよい。ＴｃＲは人工的に作製されたアロ反応性のＴｃＲであってもよい。ＴｃＲの結合ドメインはファージディスプレイ法またはリボソームディスプレイ法などの組み合わせを基本とした方法により作製することができ、特定の抗原とＭＨＣ（例えばＨＬＡ）との組み合わせに対して特異的な人工結合ドメインを含むキメラタンパク質を得ることができる。

ＴｃＲは他のタンパク質ドメインを含む、構造体または融合体として提供されてもよい。

一以上のＣＤ３鎖（または完全なＣＤ３構造体）はＴｃＲとの融合タンパク質として発現させてもよい。換言すると、一以上のＣＤ３鎖がＴｃＲと同一のポリペプチド鎖上に存在していてもよい。好ましい実施形態においては、ＣＤ３分子、または一以上のＣＤ３鎖（例えばＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、ＣＤ３ζ鎖、またはＣＤ３ε鎖、またはそれらの任意の組み合わせ）は直接細胞膜を標的にするＴｃＲ−ＣＤ３融合構造体、つまり（融合体のコンストラクトが、例えばＣＤ３鎖などにより提供される膜貫通ドメインを保持している限り、細胞にもさらなるＣＤ３分子を必要としない、ＴｃＲ−ＣＤ３融合構造体として存在していてもよい （Willemsen RM 2000 Gene Therapy 7:1369-1377）。したがってそのような態様においては、同じ構造体または融合体の一部としてＣＤ３およびＴｃＲを同時に発現するように、細胞を改変してもよい。また、別々にＣＤ３を発現させることは必須ではないが、例えばシグナル伝達を向上させ、よって細胞活性の向上をもたらし得る。

上記のとおり、様々なＴｃＲのパネルであって、当該パネルのそれぞれのＴｃＲが特定の抗原‐ＭＨＣ複合体に特異性のある（例えば、抗原‐ＭＨＣ複合体に対して特異的な親和性のある）、パネルを構築してもよい。したがって、様々な標的抗原が認識され、および／または標的抗原上の様々なエピトープ、および／またはＴｃＲｓは、抗原に対して様々な親和性および／または選択性を持ち得る。加えて、所定の標的抗原について、様々なＭＨＣ特異性（またはＭＨＣ型）のＴｃＲを含んでいてもよい。この方法において、特異的抗原−ＨＬＡ複合体に結合できる、ある特定のＴｃＲを本発明の方法において用いられるパネルから選択することができ、これは標的抗原および被験体のＭＨＣ型の双方に適合するＴｃＲである。したがって、ある特定の好ましい様態において、特定のＴｃＲはある標的細胞に提示されている抗原の性質およびそのＭＨＣ（例えばＨＬＡ）型に基づいて選択することができる。そのようなパネルは標的細胞に対する特異的な細胞障害活性を有するＮＫ細胞を迅速に精製するために用いることができると予想される。したがって、標的細胞に対する特異性を有するＮＫ細胞を製造するための本発明の方法は以下を含む：
ａ）ＮＫ細胞をＣＤ３を発現するように改変する；
ｂ）前記標的細胞のＭＨＣプロファイルおよび前記標的細胞により提示された抗原の同一性を決定する；
ｃ）それぞれのＴｃＲが様々な抗原および／またはＭＨＣ型に対して特異性を有するパネルから選択されたＴｃＲであって、ＭＨＣおよび前記標的細胞に提示された抗原に対して特異性を有するＴｃＲを発現するような前記ＮＫ細胞を改変する。

ＴｃＲは、ＴｃＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子の形式のパネルにおいて提供されてもよい。便宜的には、核酸分子ベクターまたはコンストラクト、特にＮＫ細胞に直接導入するのに好適なベクターまたはコンストラクトに含まれていてもよい。核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。例えばＴｃＲはｍＲＮＡまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターとして提供されてもよい。

本発明の一実施形態においては、ＮＫ細胞はＣＤ３を発現するように改変された後にＴｃＲを発現するように改変される。したがって、上記のとおり、汎用ＮＫ細胞はＣＤ３を発現するように非免疫原性のＮＫ細胞を改変することにより調製される。そのような改変ＮＫ細胞培養により生育・維持してもよいし、将来使用するために保存していてもよい。したがって、本発明の一実施形態においてはＴｃＲを発現するように細胞を改変するに先立って、ＣＤ３を発現するＮＫ細胞の細胞集団を生産するために細胞を複製してもよい。ＮＫ細胞は培養によって生育させてもよいし、増殖させてもよい。別の様態においては、同時に、または実質的に同時に、ＣＤ３およびＴｃＲを発現するように改変され得ることが考慮される。本発明の一実施形態においては、ＣＤ３およびＴｃＲの双方の遺伝子を含む単一のベクターまたはコンストラクトが、ＣＤ３およびＴｃＲの双方を細胞に発現させるように改変するために用いられてもよく、他の様態においては別々のベクターを用いてもよい。上述したようにＮＫ細胞においては、単一のポリペプチド分子にＴｃＲとＣＤ３双方の機能を備える融合タンパク質も発現されてもよく、したがってそのような融合タンパク質をコードするベクターまたはコンストラクトが細胞を改変するために用いてもよい。ＣＤ３およびＴｃＲの双方を発現するような改変ＮＫ細胞を複製してもよく、例えば細胞を被験体に導入するに先立って、培養して生育させたり増殖させてもよい。したがって、本発明の実施形態においては、ＣＤ３を発現するＮＫ細胞の集団を作製し、ＮＫ：ＣＤ３細胞の亜集団を標的細胞の表面上の抗原に対する特異性を有するＴｃＲが発現するように改変してもよい。

本発明の改変ＮＫ細胞は他の手段における改変が行われていてもよく、例えば細胞の機能や挙動、および／または他のタンパク質の発現の他の側面を変えたり改変したりする。例えば、細胞は体内の特定の組織または場所について標的としたり細胞の局在を改善したりするように作用する、ホーミング受容体、または局在受容体を発現するように改変されてもよい。ＮＫ細胞により提示される細胞障害性応答を促進するために、細胞は一以上のＴ細胞シグナル伝達経路のコンポーネントも発現するように改変してもよい。そのような任意の改変は、本発明における改変の事前に、事後に、または同時に行うことができる。

本発明の細胞はｉｎ ｖｉｖｏ、および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて複製能力を変化させるために改変されてもよい。本発明の一実施形態においては、細胞の複製能力（細胞が複製する能力、つまり増殖）が促進されていてもよい。好ましい実施形態において、これは細胞をＩＬ−２などのサイトカインの発現を促進するように改変することで達成されてもよい。ＩＬ−２は一般的にＮＫ細胞が、成長し、細胞溶解機能を維持するために必要とされ、したがってＩＬ−２を発現する細胞は、増殖培地にさらにＩＬ−２を添加する必要がなく、被験体に導入した場合細胞障害活性を維持する。サイトカインの発現はサイトカインをコードする核酸分子を含む異種起源の（非ネイティブ）のベクターまたはコンストラクトを細胞に導入することにより促進されていてもよいし、またはサイトカインをコードする内在性の遺伝子の発現を促進してもよい。サイトカインの発現は恒常的なものであってもよいし（つまりサイトカインをコードしている遺伝子の発現を制御しているプロモーターが恒常的に活性化しているか、「オン」の状態であってもよい）、外部からの刺激により誘導されるものであってもよい。

本発明の一実施形態においてはＣＤ３および／またはＴｃＲを発現するように改変する前に、細胞の複製能力を増強するように改変してもよい。他の様態においては、細胞がＣＤ３および／またはＴｃＲを発現するように改変された後に、複製能力を増強するように改変してもよい。他の様態においては、ＣＤ３を発現するように改変された後であって、ＴｃＲを発現するように改変された前に複製能力を増強するように改変してもよい（つまりしたがってＴｃＲを発現するように細胞を改変するに先立ち、ＣＤ３を発現するＮＫ細胞の大きな細胞集団を作製することが可能であろう）。また、任意の２以上の上記の改変は実質的に行ってもよい。本発明の一実施形態においては、３つの改変が実質的に同時に行ってもよい。

本発明のＮＫ細胞の増殖能力および生存力（生存率）は、細胞を患者に導入する前に弱めていてもよい。上記のとおり、このことは細胞を非免疫原性にするために行ってもよい。好ましい実施形態においては、細胞の複製能力および／または生存力は照射により行ってもよい。複製能力および／または生存力は、細胞への照射量や照射の性質によって、抑制されることもあり（つまり複製がさらに遅くなる）、消失することもある。照射はα線、β線またはγ線の放射線源からであってもよく、Ｘ線照射または紫外線であってもよい。５−１０Ｇｙ（グレイ）の照射量は増殖を阻害するために充分であるかもしれないが、他の好適な照射量は１−１０、２−１０、３−１０、４−１０、６−１０、７−１０、８−１０または９−１０Ｇｙであってもよく、また１１、１２、１３、１４、１５または２０Ｇｙなどのより高い照射量であってもよい。また、ＮＫ細胞は細胞を誘導的に殺傷したり外部刺激に応答して複製を阻害する「自殺遺伝子」を発現するように改変されていてもよい。

細胞はＡ）複製能力を増強するようにＢ）複製能力および／または生存力を抑制するように、改変してもよい。この二つの改変は任意の順序で順次行ってもよいし（つまりＡの後にＢ、またはＢの後にＡ）、実質的に同時に（ＡとＢを同時に）行ってもよい。そのような実施形態において、細胞をＣＤ３および／またはＴｃＲが発現するように改変する前に、同時に、または後に、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて細胞の成長を促進するようにサイトカイン（ＩＬ−２などの）を発現するように改変してもよく、次いで細胞を被験体に導入する前に複製能力および／または生存能力を抑制させるように改変してもよい。

上記から本発明の細胞が、一以上の遺伝子の発現レベルを変化させるように、または特に細胞に通常発現しない一以上の遺伝子を発現させるように、改変されることは明らかである。そのように異種の遺伝子を発現させるために、対象となる遺伝子に対応する、またはそれを含む核酸分子を細胞に導入する。便宜的には核酸分子は、ベクターまたは組み換えコンストラクトによって細胞に導入することができる。異種の遺伝子の発現方法は、コンストラクト／ベクター調製、および核酸分子（ベクターまたはコンストラクト）の細胞への導入、の双方に関して当該技術分野において公知である。したがって、哺乳類細胞、特にリンパ系細胞またはＮＫ細胞で用いるのに好適なプロモーターおよび／または他の発現制御配列、および適切なベクター（例えばウイルスベクター）が当該技術分野において公知である。

ベクターまたはコンストラクト（核酸分子）は化学的なトランスフェクション試薬（リン酸カルシウム、分枝状有機化合物、リポソームまたはカチオン性ポリマーなど）、エレクトロポレーション、セルスクイージング（Ｃｅｌｌ Ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、光学的トランスフェクション、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、ハイドロダイナミック法（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、またはウイルスによる形質導入を含む、様々な手段により本発明の細胞に導入することができる。好ましい実施形態においては、ベクターまたはコンストラクトはウイルスによる形質導入により導入される。細胞に導入された異種の核酸分子はエピソーム的に発現してもよく、細胞のゲノムの好適な遺伝子座に組み込まれてもよい。

ＮＫ細胞に好適な細胞培養方法や試薬も当該技術分野において公知である。選択肢や便宜性問に応じて任意の所望の細胞培養方法を用いることができる 。例えば、大容量の培養または自動細胞培養システムにおいてはテフロンバックを用いることができる。

本発明の標的細胞はがん細胞であってもよい。本明細書においては、がんは悪性、前悪性または非悪性のいずれかの新生物病態を含むものとして広く定義される。広く定義される 。 しかしながら一般的に、それは悪性の病態である。固形腫瘍および非固形腫瘍の両方が含まれ、用語「がん細胞」は、「腫瘍細胞」と同義語として使用されることができる。

固体がんおよび造血器系がんの両方を含む任意のタイプのがんが包含される。代表的ながんは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質がん、エイズ関連がん（例えば、カポジ肉腫およびリンパ腫）、肛門がん、虫垂がん、アストロサイト腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、肝外膀胱癌、骨がん（例えば、ユーイング肉腫、骨肉腫および悪性線維性組織球腫）、脳幹グリオーマ、脳がん、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、心臓（Ｃａｒｄｉａｃ（Ｈｅａｒｔ））腫瘍、中枢神経系の癌（非定型奇形／ラブドイド腫瘍、胚腫瘍、生殖細胞腫瘍、リンパ腫を含む）、子宮頸癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、胆管癌、肝外腺管癌（ＤＣＩＳ）、胎児性腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、精巣神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、、肝外胆管癌、眼がん（眼内黒色腫および網膜芽細胞腫を含む）、骨の線維性組織球腫、胆嚢癌、胃（Ｇａｓｔｒｉｃ（Ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞癌（肝臓癌）、組織球増殖症、ランゲルハンス細胞、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内メラノーマ、膵島腫瘍、膵臓神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん（腎細胞およびウィルムス腫瘍を含む）、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、喉頭がん、白血病（急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む）、

口唇および口腔がん、肝臓癌（原発）、非浸潤性小葉癌（ＬＣＩＳ）、肺癌、リンパ腫、マクログロブリン血症、ワルデンストレームマクログロブリン血症、メラノーマ、メルケル細胞癌、中皮腫、潜在性原発巣を有する転移性頸部扁平上皮癌、ＮＵＴ遺伝子の関与する正中管癌腫、口腔（ｍｏｕｔｈ）がん、多発性内分泌腫瘍症候群、小児の、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患、副鼻腔がんと鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、、非小細胞肺がん、口腔（Ｏｒａｌ）がん、口腔（ＯｒａｌＣａｖｉｔｙ）がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵臓神経内分泌腫瘍（膵島腫瘍）、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔がんと鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、脳下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠期乳がん、中枢神経系（ＣＮＳ）原発リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）がん、腎盂および尿管、移行上皮のがん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫；、唾液腺がん、肉腫、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺癌、小腸がん、軟部肉腫、扁平上皮がん、潜在性原発・転移性頸部扁平上皮がん、胃（Ｓｔｏｍａｃｈ（Ｇａｓｔｒｉｃ））がん、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫および胸腺がん、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行上皮細胞がん、尿道がん、子宮がん、子宮内膜・子宮肉腫、膣癌、外陰部がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、、およびウィルムス腫瘍を含むが、これらに限定されるわけではない。

上記のとおり多数のがんについて、特定のまたは特異的ながん抗原を発現することが確認されているか、特定のまたは特異的ながん抗原の発現により特徴づけられている。したがって既知の、または認識されているがん抗原を用いることができる。当該技術分野において知られているように、ある抗原は多数の異なった種類のがんに生じ、他のものはある特定のがんの種類に特異的である。しかしながら、他のケースにおいては被験体のがんを特徴づけ、使用に好適ながん抗原を特定することが、適切であるか必要である。したがっていかなるがんも汎用性のあるがん抗原に対するＴｃＲを用いて処理することができ、そのようなＴｃＲは特定されている。また、現在養子Ｔ細胞療法による治療の対象である、またはその治療が提案されているいかなるがんであってもよく、例えばメラノーマ、血液がん、肺がん、結腸直腸がんなどの一般的ながんであってもよい。さらにまた、現在利用可能な治療の選択肢（例えば希少疾病医薬品による）がほとんどない、例えばすい臓がんまたは肉腫などの、稀ながんであってもよい。

他の様態においては、標的細胞は感染細胞、特にウイルスに感染した細胞であってもよい。ウイルスはいかなるウイルスであってもよいが、一般的には病原性のウイルスである。一例としては、ウイルスはＨＩＶウイルス、肝炎ウイルス（例えばＨＢＶまたはＨＣＶ）、ＨＰＶ、ＣＭＶまたはＥＢＶ、ＨＨＶ−８、ＨＴＬＶ−１、ＳＶ４０、エンテロウイルスであってもよい。他の可能性のある感染物質や感染源としてはヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、クラミジア ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等のバクテリア、並びに日本住血吸虫、肝吸虫、タイ肝吸虫（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ ｖｉｖｅｒｒｉｎｉ）、クロノルキス・シネンシス（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）およびマラリヤ等の寄生虫が挙げられる。

本発明の一実施形態においては、細胞は静脈内に直接投与してもよい。他の様態においては細胞は腫瘍内投与により腫瘍に直接投与してもよい。

被験体に投与される細胞の量は標的細胞の性質によって変更できる。標的細胞ががん細胞である本発明の好ましい実施形態においては、標的となるがんの種類に基づいて投与量を算出した。好ましい実施形態においては、約１０⁹細胞の投与量が被験体に投与され得るが、がんの範囲や種類によって変更してもよい。約１０⁶、１０⁷、または１０⁸細胞が投与され得る可能性がある。また、約１０¹⁰、１０¹¹ｏｒ１０¹²細胞のより多い投与量が投与され得る。投与される細胞の量は患者の体のサイズによっても変更してもよく、したがって患者の体表面積の１ｍ²あたりまたは患者の体重の１ｋｇあたり１０⁵、１０⁶、１０⁷、１０⁸、１０⁹、１０¹⁰、１０¹¹または１０¹²細胞を投与してもよい。

また、被験体を効率よく治療するために複数回の注射が必要とされ得ることも予想される。例えば、２、３、４、５、６回またはそれ以上の回数の注射を独立して、２４時間または４８時間の間隔で、または３、４、５、６または７日ごとに患者に投与することができる。注射は、１週間、２週間または１ヶ月の間隔、または６週間または２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月または６ヶ月の間隔で間隔を空けてもよい。１年に１回の注射による投与も可能である。

本発明の方法および細胞を用いて治療を受ける対象は哺乳類のいかなる種であってもよい。例えば、被験体はマウス、ラット、アレチネズミ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ネコまたはイヌ等の家庭の愛玩動物、またはヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシまたはウマ等の家畜のいかなる種であってもよい。本発明のさらに好ましい態様として、被験体サル、テナガザル、ゴリラ、オランウータン、チンパンジーまたはボノボなどの霊長類であってもよい。しかしながら本発明の好ましい実施形態においては被験体はヒトである。

本発明における使用のためのＮＫ細胞は哺乳類の任意の種から取得することができると考えれるが、好ましい実施形態においてはＮＫ細胞は治療を受ける対象と同じ哺乳類の種からのものである。さらに上記のとおり、好ましい実施形態においては細胞は哺乳類の同じ種のタンパク質を発現する遺伝子を用いて改変される（例えばヒトの被験体には、ヒトＣＤ３およびＴｃＲが用いられる）。しかしながら異なった種からのＣＤ３およびＴｃＲも用いることができる可能性があり、例えば、細胞はマウスのＣＤ３およびヒトのＴｃＲを発現する遺伝子を用いて改変されてもよい。

本発明は、以下の実施例および図面を参照してより完全に理解され得る。

図１は、ＣＤ３がＮＫ−９２細胞において発現され得ることを示している。ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＧＦＰレトロウイルスコンストラクトをＮＫ−９２細胞に形質導入した。蛍光はＦＩＴＣチャンネルで測定を行った。ＧＦＰ⁺細胞はマークした範囲に示されている。黒：トランスフェクションされていない細胞、灰色：トランスフェクトされた細胞。 図２はＴｃＲの存在下では、ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ発現ＮＫ−９２細胞の表面においてＣＤ３が検出されることを示している。ＧＦＰ⁺でソートしたＮＫ−９２（ＮＫ−９２−ＣＤ３）に４つの異なったＴｃＲ、つまりＲａｄｉｕｍ−１（ＴＧＦｂＲＩＩフレームシフト特異的、ＭＨＣ−Ｉ）およびシステインバリアントであるＲａｄｉｕｍ−１_cys、ＤＭＦ−５（ＭＡＲＴ−１特異的、ＭＨＣ−Ｉ）、Ｒａｄｉｕｍ−３（ｈＴＥＲＴ特異的、ＭＨＣ−ＩＩ）を重複発現させ、コントロール細胞として重複感染していないものを行った。細胞表面のＣＤ３を検出するために抗ＣＤ３抗体で染色し、蛍光はＦＩＴＣ（ＧＦＰ）およびＡＰＣ（ａｎｔｉ−ＣＤ３）チャンネルで測定した。右上四分の一の細胞は細胞表面にＣＤ３を発現している。 図３はＲａｄｉｕｍ−１およびＤＭＦ−５が、ＣＤ３−ＧＦＰ発現ＮＫ−９２細胞表面特異的に検出されることを示している。細胞にＣＤ３と二つの異なったＴｃＲ：Ｒａｄｉｕｍ−１（ＴＧＦｂＲＩＩフレームシフト）、ＤＭＦ−５（ＭＡＲＴ−１）、とを発現させるために、およびＣＤ３のみ（ＴｃＲなし）を発現させるために、トランスフェクションを行った。細胞は、Ｒａｄｉｕｍ−１のＶ−β鎖（ＤＭＦ５にはない、上列）を検出できるＶ−ｂｅｔａ特異的抗体、または細胞表面のＤＭＦ−５ＴｃＲ（下列）を検出するためのＭＡＲＴ−１マルチマーで染色した。蛍光はＦＩＴＣ（ＧＦＰ）およびＡＰＣ（抗−Ｖｂ抗体およびＭ１−マルチマー）チャンネルで測定を行った 図４はＣＤ３およびＲａｄｉｕｍ−１ＴｃＲを発現するように改変したＮＫ−９２細胞の抗原特異的細胞障害性活性を示している。ＣＤ３−ＩＲＥＳ−ＧＦＰをトランスフェクトしたＮＫ−９２細胞（ＧＦＰ⁺-ｕｐｐｅｒ ｂｏｘ-ＣＤ３＿ＩＲＥＳ＿ＧＦＰ）、およびトランスフェクトを行っていない細胞（ＧＦＰ^--ｌｏｗｅｒ ｂｏｘ-ＮＴｒ）を二つの独立した細胞集団にゲーティングした。ＴＧＦｂＲＩＩの標的ペプチドと単鎖三量体を発現しているＳｕｐＴ１細胞と共に、および関係のないペプチドと単鎖三量体を発現しているＳｕｐＴ１細胞と共に、または単独で、ＮＫ細胞をインキュベートした。ＳｕｐＴ１細胞はＮＫ細胞マーカーであるＣＤ５６の発現を検出することによりＮＫ細胞から分離した。脱顆粒はＧＦＰ⁺およびＧＦＰ^-細胞集団のＳｕｐＴ１細胞とインキュベートした後にＮＫ細胞のＣＤ１０７マーカーを検出することにより測定し、合わせてプロットした（ヒストグラム、灰色：ＧＦＰ^-、破線：ＧＦＰ⁺）。 図５は、ＤＭＦ５またはＲａｄｉｕｍ−１ＴｃＲと、ＣＤ３とを重複感染させてソートを行ったＮＫ−９２細胞の純粋細胞集団は、適切なペプチドをロードしたＴ２細胞により特異的に活性化されることを示している。上：ゲーティング戦略：二つの細胞株を分離するためにＣＤ３シグナルおよびＧＦＰを用いる。それからＣＤ３＋細胞集団についてＣＤ１０７ａの発現（脱顆粒）について試験を行う。ヒストグラム：示したＮＫ−９２−ＣＤ３−ＴｃＲは１μＭのペプチドをロードしたＴ２細胞とオーバーナイトでインキュベートした（灰色の陰影：ペプチド無し、濃灰色のアウトライン：ＭＡＲＴ−１、淡灰色のアウトライン：ＴＧＦｂＲＩＩ）。 図６はＲａｄｉｕｍ−１ ＴｃＲおよびＤＭＦ−５ ＴｃＲの、ＥＣ５０値の測定値を示す。 図７は、α−ＣＤ３抗体およびα−ＣＤ２８抗体と接触させたＮＫ−９２（ＣＤ３／Ｒａｄｉｕｍ−１）細胞の活性化の、Ｐｈｏｓｓｐｈｏ−フローサイトメトリー解析の結果を示す。フローサイトメトリースペクトルの右へのシフトは、当該タンパク質のリン酸化レベルの上昇を示し、このことは同様にＴＣＲ複合体の活性化を示す。 図８は、ＮＫ−９２（ＣＤ３／Ｒａｄｉｕｍ−１）およびＮＫ９２（ＣＤ３／ＤＭＦ−５）細胞の刺激の特異性について示している。それぞれの受容体に特異的でありかつ同系のペプチド（Ｒａｄｉｕｍ−１発現細胞にはＴＧＦｂＲＩＩ、ＤＭＦ−５発現細胞にはＭＡＲＴ−１）、またはランダムペプチドのどちらかを提示している、抗原提示細胞と共にＮＫ−９２細胞をインキュベートした。ＴＣＲ複合体を介するシグナル伝達の刺激は、様々なＴｃＲ／ＣＤ３−関連タンパク質の様々な時点におけるリン酸化レベルによって測定した。これらのリン酸化レベルはＰｈｏｓｐｈｏ−フローサイトメトリーによって測定した。各グラフにおいて、実線は特異的ペプチド、同系ペプチドによる細胞の活性化を示す；点線はランダムペプチドによる細胞の活性化を示す。 図９は、Ｒａｄｉｕｍ−５ ＴｃＲまたはＲａｄｉｕｍ−６ ＴｃＲのどちらかを形質導入したＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞の刺激のキネティックスを示す。これらの受容体はいずれもＣＤ４⁺ Ｔ細胞に由来し、特異的にＴＧＦｂＲＩＩ フレームシフトペプチドと結合する；Ｒａｄｉｕｍ−５はＨＬＡ−ＤＲ７に関連してそれと特異的に結合し、Ｒａｄｉｕｍ−６はＨＬＡ−ＤＲ４に関連してそれと特異的に結合する。Ｒａｄｉｕｍ−５およびＲａｄｉｕｍ−６のＥＣ５０値はドナー患者の組織を用いて算出した（患者Ｈ、ＳおよびＢ）。患者ＨはＨＬＡ−ＤＲ７ハプロタイプ；患者ＳおよびＢはＨＬＡ−ＤＲ４ハプロタイプ。

実施例１.
ＮＫ９２細胞におけるＣＤ３の発現
ＣＤ３をＮＫ９２細胞にトランスフェクションするためにコドン最適化ｐＭＰ７１−ＣＤ３ζ−ＣＤ３ε−ＣＤ３γ−ＣＤ３δ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（ＣＤ３−ＧＦＰ）ベクター（Ahmadi et al. 2011. Blood 118, 3528-3573）を用い、細胞レトロウィルス導入を用いるてトランスフェクトした。ＣＤ３−ＧＦＰコンストラクトを担持したレトロウイルスはパッケージング細胞株（Ｈｅｋ−Ｐｈｏｅｎｉｘ）により産生され、およびＮＫ細胞はスピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）（０．３Ｍの細胞ウイルス上清と共にインキュベートし、レトロネクチン（登録商標）（Ｔａｎａｋａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でコーティングしたプレート上で３２℃で１時間、９００×ｇでスピンダウンした）を行った。形質導入が成功したことを示すためのマーカーとしてはＧＦＰを用いた。

ＮＫ−９２細胞にＣＤ３（ＮＫ−９２（ＣＤ３））の形質導入が成功したことは、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（登録商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてフローサイトメトリーにより確認した。ＳＳＣおよびＦＩＴＣチャンネルで蛍光を測定し、ＧＦＰチャンネルにおける蛍光の測定によりトランスフェクションの成功を確認した（図１参照）。約５０％のトランスフェクション効率が得られた。純粋な細胞集団を取得するためには他のＧＦＰ＋細胞を選択した。

実施例２.
ＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞におけるＴｃＲの発現
ＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞におけるＣＤ３およびＴｃＲの共発現の能力を評価した。細胞表面を標的にするために、ＣＤ３およびＴｃＲはそれぞれ、ＴｃＲ複合体の他のメンバーの共発現を必要とする。したがって、ＮＫ細胞の表面上におえるＣＤ３の発現を、ＣＤ３およびＴｃＲの両方が共発現できたことへのマーカーとして用いることができる。

ＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞はレトロウイルスの上清を用いて４種の異なるＴｃＲ（Ｒａｄｉｕｍ−１_cys システインバリアント、Ｒａｄｉｕｍ−１−特異的（ＴＧＦｂＲＩＩフレームシフト）、ＤＭＦ−５、ＭＡＲＴ−１特異的（ＤＭＦ−５(Johnson, L.A.et al. 2006 J Immunol 177:6548-6559））、およびＲａｄｉｕｍ−３（ｈＴＥＲＴ、ＭＨＣ−ＩＩ））を重複感染させ、それぞれのＴｃＲのために、ＡＰＣで標識された抗ＣＤ３抗体マルチマーを用いて細胞表面のＣＤ３の発現を測定した。ＣＤ３の発現は細胞のＧＦＰの発現を測定することで検出した。蛍光ＦＩＴＣおよびＡＰＣチャンネルで検出した。ＧＦＰを発現している細胞はドットプロットの右側領域に表れており、細胞表面にＣＤ３を発現している細胞はドットプロットの上側領域に表れている。ＣＤ３およびＴｃＲが共発現している細胞（すなわち細胞表面に局在しているＣＤ３−ＴｃＲ複合体がある細胞）はドットプロットの右上に示されている。

それぞれのＴｃＲを発現するように改変された細胞において、細胞表面にＣＤ３の発現が検出された（図２Ａ〜Ｄ）（各４分割されたドットプロットの右上の細胞）。特に、Ｒａｄｉｕｍ−１ ＴｃＲを発現するように改変された細胞においては細胞表面にＣＤ３の発現が示されている図２Ｂ。図２ＤはＧＦＰ⁺細胞のＡＰＣチャンネルの蛍光は少し増加していることも示しておりＲａｄｉｕｍ−３ ＴｃＲの低レベルでの発現を示している。ＴｃＲのない細胞の細胞表面にはＣＤ３の発現は検出されなかった（図２Ｅ）。

Ｒａｄｉｕｍ１ ＴｃＲおよびＤＭＦ−５ＴｃＲが発現するように改変されたＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞においても、細胞表面のＴｃＲの発現は検出された。細胞表面のＴｃＲの存在は、Ｒａｄｉｕｍ−１のＶ−β鎖を検出できるＶ−β特異的抗体、または細胞表面のＤＭＦ−５ ＴｃＲ（下列）を検出するためのＡＰＣ標識されたＭＡＲＴ−１マルチマーのいずれかを用いて測定された。蛍光はＦＩＴＣ（ＧＦＰ）およびＡＰＣ（抗−ＶｂおよびＭ１−マルチマー）チャンネルで測定した。ＴｃＲを発現するように改変されていないＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞ではＡＰＣチャンネルのシグナルの増加は見られなかった（図３Ａ）。Ｒａｄｉｕｍ−１ ＴｃＲを発現するように改変された細胞では抗Ｖβ抗体で染色したがＭＡＲＴ−１マルチマーで染色していないときＡＰＣチャンネルのシグナルの増加がみられた（図３Ｂ）。ＤＭＦ−５ ＴｃＲを発現するように改変された細胞ではＭＡＲＴ−１マルチマーで染色したときＡＰＣチャンネルのシグナルの増加がみられた（図３Ｃ）。

実施例３.
ＴｃＲ発現ＮＫ−９２（ＣＤ３）は機能を有する
ＮＫ細胞に発現したＴｃＲの機能を確かめるために、ＮＫ細胞に発現したＴｃＲが標的細胞を特異的に認識できるかどうかを確認した。

正しい標的ペプチド（ＴＧＦｂＲＩＩ）または非特異的ペプチド（ｉｒｒ）を含む、単鎖三量体分子を発現する標的細胞と共に、または標的細胞の非存在下（ＮｏＡＰＣ）において、ＴｃＲを発現するＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞を５時間インキュベートして、ＮＫ細胞が標的細胞によって刺激されていることのマーカーとして、脱顆粒マーカーＣＤ１０７を測定した（ＳＣＴは抗原を提示するＭＨＣクラス−Ｉタンパク質のことであり、抗原ペプチド、β₂−ミクログロブリンおよびポリペプチド単鎖として発現されるｈ鎖を含んでいる（US 2010/015954 and Yu, Y. Y. et al. (2002) J Immunol 168: 3145-3149参照）。

ＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞はまず抗ＣＤ５６ ＴｘＲｅｄ（ＣＤ５６はＮＫ細胞のマーカー）およびＴｘＲｅｄおよびＧＦＰで染色し、蛍光を測定した（図４Ａ）。ＮＫ−９２細胞の独立した細胞集団はＧＦＰの発現に基づいて確認した。ＧＦＰ⁺細胞（上）およびＧＦＰ^-ＮＫ細胞（下）は共に検出された。ＣＤ１０７ａの発現を各細胞集団について測定し、ＧＦＰ^-細胞はネガティブコントロール（つまり非ＴｃＲ発現細胞）として用いた。

非特異的ペプチド（図４Ｃ）またはＲａｄｉｕｍ−１標的ペプチドＴＧＦｂＲＩＩ（図４Ｄ）と、単鎖三量体（ＳＣＴ）分子とを発現しているＳｕｐＴ１と共に、Ｒａｄｉｕｍ１−特異的ＴｃＲを発現しているＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞をインキュベートした。抗原提示細胞の非存在下でインキュベートした細胞についても測定した（図４Ｂ）ＮＫ−９２細胞株のＣＤ３の発現を測定し、細胞は上述したようにゲーティングした。ＧＦＰ⁺（点線）およびＧＦＰ^-（実線）細胞集団はそれぞれのヒストグラムで見ることができる。

Ｒａｄｉｕｍ−１ ＳＣＴ発現ＳｕｐＴ１細胞とインキュベートした場合、実線（ＧＦＰ^-ネガティブコントロールｌ）に比べて点線が右側へのシフトを示しているように、Ｒａｄｉｕｍ−１−特異的ＴｃＲ発現ＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞のみがＣＤ１０７の発現増加を示した（図４Ｄ）。非特異的ペプチドを発現しているＳｕｐＴ１細胞とインキュベートした場合（図４Ｃ）または抗原提示細胞非存在下で細胞インキュベートした場合においてはこれらの細胞でＣＤ１０７発現は見られなかった。

これらのデータを合わせると、Ｒａｄｉｕｍ−１特異的ＴｃＲを発現しているＮＫ−９２（ＣＤ３）は、標的ペプチドを発現している標的細胞によって活性化できることを示している。これはＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞に発現しているＴｃＲは活性があり、機能を有していることを示している。したがって、ＴｃＲを発現しているＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞は標的細胞特異的な細胞毒性があることが示されている。

実施例４.
ＴｃＲ発現ＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞の関連ペプチドをロードしたＴ２細胞による活性化
ＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞をＲａｄｉｕｍ−１またはＤＭＦ−５ＴｃＲのいずれかを発現するように改変し、細胞表面のＣＤ３の発現は、ＡＰＣ−標識抗ＣＤ３抗体を用いて検出した。脱顆粒解析のためにＣＤ３⁺細胞を選択して（図５、上のパネル）ソートした。

Ｒａｄｉｕｍ−１またはＤＭＦ−５ＴｃＲを発現するように改変されたＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞を、それぞれＲａｄｉｕｍ−１とＤＭＦ−５ＴｃＲの標的抗原であるＴＧＦｂＲＩＩ（淡灰色のアウトライン）、ＭＡＲＴ１（濃灰色のアウトライン）のいずれかのペプチドをロードさせたＴ２細胞と共にインキュベートした（図５、下のパネル）。Ｔ２細胞と共にインキュベートした、Ｒａｄｉｕｍ−１ ＴｃＲ発現ＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞（図５、左下のパネル）、およびＤＭＦ−５ｄＴｃＲ発現ＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞（図５、右下のパネル）により、いずれかのペプチドの存在下におけるＣＤ１０７ａの発現を測定した。Ｒａｄｉｕｍ−１ ＴｃＲを発現するように改変されたＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞はＴＧＦｂＲＩＩペプチドの存在下で活性化を示し、ＭＡＲＴ−１存在下ではＤＭＦ−５ＴｃＲを発現している細胞は活性化を示した。非特異的な活性化は確認されなかった。

それぞれのＴｃＲのＥＣ₅₀を測定するために同様の実験を行った。Ｒａｄｉｕｍ−１（丸）およびＤＭＦ−５（四角）を発現するように改変したＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞を、それぞれ異なったペプチド濃度のＴＧＦｂＲＩＩまたはＭＡＲＴ−１ペプチドがあるＴ２細胞とインキュベートした。活性化は上述したようにＣＤ１０７ａの発現を検出することによって測定した。それぞれの濃度においてＣＤ１０７ａの発現を測定し、相対的な活性化（ＣＤ１０７ａの発現の最大値に対するＣＤ１０７ａの割合）を算出した。２ｎＭ（Ｒａｄｉｕｍ−１）および７ｎＭ（ＤＭＦ−５）のＥＣ₅₀値を算出した（図６）。

実施例５.
ＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞におけるＴｃＲ／ＣＤ３介在性シグナル伝達
Ｒａｄｉｕｍ−１ ＴｃＲをトランスフェクションしたＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞について、それらのシグナル伝達能を調べるためにＰｈｏｓｐｈｏ−フローサイトメトリーを用いて評価を行った。最初に、ＴＣＲを通じて活性化を刺激する、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で細胞を刺激することにより、通常のＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力を解析した。図７に示すように、ＴｃＲおよびＣＤ３がクラスター化することで、Ｔ細胞において観察されたのと同じようにシグナル伝達カスケードを活性化した。これはいくつかのＺＡＰ−７０、ＳＬＰ−７６ａｎｄＣＤ３ζなどのＴｃＲ／ＣＤ３−関連タンパク質のリン酸化レベルの増加により示されている。

それから抗原提示細胞を用い、Ｐｈｏｓｐｈｏ−フローサイトメトリーによって様々な時点におけるＴＣＲ複合体のシグナル伝達活性を測定することで、特異的抗原による刺激について細胞の評価を行った。ＮＫ−９２（ＣＤ３）−Ｒａｄｉｕｍ−１およびＮＫ−９２（ＣＤ３）−ＤＭＦ−５はいずれも同系のペプチドで刺激した。図８に示すように特異的な刺激のみがシグナル伝達分子のリン酸化を引き起こした。初期および後期のシグナルは異なっており、そのパターンはＴ細胞においてみられたものと似ていた。まとめるとこれらのデータは、基質と接触した場合にＮＫ−９２（ＣＤ３−ＴＣＲ）はＴ細胞と同様に反応することを示している。

実施例６.
ＣＤ４ ⁺ Ｔ細胞由来のＴｃＲによるＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞の刺激
ＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞に、ＣＤ４⁺Ｔ細胞由来のＴｃＲであるＲａｄｉｕｍ５およびＲａｄｉｕｍ６を形質導入した。これらのＴｃＲはＭＨＣクラスＩＩペプチド標的に対して細胞を特異的に再指向することができた。Ｒａｄｉｕｍ−５およびＲａｄｉｕｍ−６のいずれも特異的にＴＧＦｂＲＩＩフレームシフト変異ペプチド（ＫＳＬＶＲＬＳＳＣＶＰＶＡＬＭＳＡＭＴ）を標的とする；Ｒａｄｉｕｍ−５はＨＬＡ−ＤＲ７の存在下で、Ｒａｄｉｕｍ−６はＨＬＡ−ＤＲ４で、このペプチドを特異的に標的にする。ＮＫ−９２（ＣＤ３）−Ｒａｄｉｕｍ５／６細胞における刺激のキネティックスは図９に示す。上記実施例４と同様にＮＫ−９２（ＣＤ３）細胞刺激を測定した。それぞれのＴｃＲのＥＣ５０値を図９に示すように算出した。ＨＬＡ−ＤＲ７ハプロタイプの患者の試料におけるＲａｄｉｕｍ−５のＥＣ₅₀は１９μＭと算出された；ある患者におけるＲａｄｉｕｍ６のＥＣ₅₀は４μＭであり、次の患者は０．４μＭと算出された。いずれの患者試料もＢＨＬＡ−ＤＲ４ハプロタイプであった。

実施例７．
ＣＤ３／ＣＤ３−ＴｃＲ発現の有無におけるＮＫ−９２タンパク質の発現の解析
ＮＫ−９２細胞のタンパク質発現プロファイルを、ＮＫ９２（ＣＤ３／ＣＤ３−ＴｃＲ）細胞と比較した。２つの細胞集団の間に違いは見られなかった（言うまでもなくＮＫ−９２（ＣＤ３／ＣＤ３−ＴｃＲ）細胞にＣＤ３が存在していることを除く。比較したものを以下の表に示す（ＰＢＭＣ＝末梢血単核細胞）。

Claims (22)

1. 改変ＮＫ細胞であって、
   前記細胞が非免疫原性であり、ＣＤ３を発現するように改変された細胞であり、
   前記ＣＤ３が、ＴｃＲ−ＣＤ３融合体以外のキメラ受容体の一部としては発現されない、改変ＮＫ細胞。
2. 前記細胞が非免疫原性であるように改変された、請求項１の細胞。
3. 前記細胞が改変ＮＫ−９２細胞である、請求項１または２の細胞。
4. 前記細胞が照射を受けているか、
   または前記細胞の増殖能がその他の方法で抑制されている、請求項１〜３のいずれか一項の細胞。
5. 前記細胞が、β₂ミクログロブリンの発現を抑制または阻害するように改変されている、請求項１〜４のいずれか１項の細胞。
6. 前記細胞が、標的細胞上の抗原に対して特異性を有するＴｃＲを発現するように、さらに改変されている、請求項１〜５のいずれか一項の細胞。
7. 前記ＴｃＲが共受容体非依存性である、請求項６の細胞。
8. 前記標的細胞ががん細胞である、請求項４〜６のいずれか一項の細胞。
9. 前記標的細胞が感染細胞である、請求項４〜６のいずれか一項の細胞。
10. 治療における使用のための、請求項４〜８のいずれか１項に記載の細胞。
11. 養子細胞移入療法における使用のための、請求項４〜８のいずれか一項の細胞。
12. がんの治療における使用のための、請求項１０の細胞。
13. 前記ＴｃＲが、処理される被験体の標的細胞において発現している抗原と、前記被験体のＭＨＣタイプとの双方に特異的である、請求項９〜１１のいずれか一項の細胞。
14. 養子細胞移入療法において使用するための医薬の製造における改変ＮＫ細胞の使用であって、好ましくは前記療法ががんの治療である、請求項４〜１２のいずれか一項で規定された改変ＮＫ細胞の使用。
15. 少なくとも１つの薬学的に許容される、担体または賦形剤と共に、請求項４〜１２のいずれか一項の改変ＮＫ細胞を含む、治療用組成物。
16. 請求項４〜１２のいずれか１項の改変ＮＫ細胞の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、治療方法。
17. 養子細胞移入療法のための細胞の調製において使用するための汎用ＮＫ細胞の製造方法であって、
    （ａ）非免疫原性ＮＫ細胞を提供する工程；および
    （ｂ）前記細胞を改変してＣＤ３を発現させる工程
    を含む、方法。
18. 治療用途のための、改変ＮＫ細胞を調製するための方法であって、
    （ａ）ＣＤ３を発現するように改変された非免疫原性ＮＫ細胞を提供し；
    （ｂ）処理を行う被験体のＭＨＣ型を決定し；
    （ｃ）前記被験体内の細胞によって発現または提示される抗原である、前記被験体内の標的抗原を特定し；
    （ｄ）前記標的抗原に対する特異性を有するＴｃＲを発現させるために工程（ａ）の細胞を改変し、
    前記被験体のＭＨＣ型と適合させる、
    方法。
19. 前記ＴｃＲががん抗原に特異的である、請求項１７の方法。
20. 養子細胞移入療法に使用するためのキットであって、
    （ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載の改変された汎用ＮＫ細胞；および
    （ｂ）それぞれがＴｃＲをコードする核酸分子のパネルであって、前記ＴｃＲが異なる抗原特異性および／または異なるＭＨＣ特異性を有するパネル、
    を含むキット。
21. 前記核酸分子がベクター、好ましくはウイルスベクターに含まれる、請求項１９のキット。
22. それぞれのＮＫ細胞が非免疫原性であり、ＣＤ３およびＴｃＲを発現するように改変された、改変ＮＫ細胞のパネルであって、前記それぞれのＮＫ細胞のＴｃＲが異なった抗原特異性および／または異なったＭＨＣ特異性を有している、パネル。