ES2922231T3

ES2922231T3 - Célula T asesina universal

Info

Publication number: ES2922231T3
Application number: ES16701339T
Authority: ES
Inventors: Sébastien Wälchli; Else Marit Inderberg; Gustav Gaudernack; Gunnar Kvalheim
Original assignee: Oslo Universitetssykehus hf
Current assignee: Oslo Universitetssykehus hf
Priority date: 2015-01-23
Filing date: 2016-01-22
Publication date: 2022-09-12
Anticipated expiration: 2036-01-22
Also published as: KR102479118B1; KR20170121178A; NZ733855A; AU2016208475B2; EP3247791B1; JP2018512047A; EP3247791A1; IL253464B; US11155786B2; GB201501175D0; WO2016116601A1; AU2022200126A1; JP6899333B2; MX2017009459A; US20180010097A1; US20220127574A1; AU2016208475A1; EP4095239A1; EA201791381A1; IL253464A0

Abstract

La presente invención se relaciona con una célula modificada de asesino natural (NK) y su uso en medicina personalizada. Las células NK modificadas de la presente invención no son inmunogénicas, lo que significa que pueden administrarse a cualquier sujeto receptor sin ser rechazados por el sistema inmune del huésped (son "universales"). En una primera realización, las células NK no inmunogénicas se modifican para expresar CD3 para permitir que se exprese un receptor de células T (TCR). En una realización adicional, las células NK no inmunogénicas se modifican aún más para expresar un TCR junto con el co-receptor CD3. La coexpresión de CD3 con un TCR específico da como resultado las células NK modificadas que muestran citotoxicidad específica de antígeno hacia las células objetivo. Por lo tanto, las células NK universales pueden dirigirse a antígenos específicos y, por lo tanto, pueden usarse en medicina personalizada, particularmente en el campo de la oncología. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Célula T asesina universal

Esta invención se refiere a células asesinas naturales y su uso en terapia, particularmente en el tratamiento del cáncer. Específicamente, se ha desarrollado una célula asesina natural modificada, que se ha modificado para coexpresar CD3 y un receptor de células T específico para un antígeno canceroso u otro antígeno diana. La célula asesina natural modificada puede ser universalmente no inmunogénica, por ejemplo, puede expresar niveles bajos de MHC o ser negativa para MHC, en cuyo caso las células son apropiadas para su uso universal, independientemente del tipo de MHC del sujeto. En una realización, la invención de este modo combina ventajosamente las características de universalidad y personalización: el receptor de células T puede adaptarse tanto a la enfermedad (por ejemplo, tipo de cáncer) como al tipo de MHC del sujeto que se va a tratar, lo que permite que las "células universales" que se van a usar en un tratamiento personalizado para el sujeto que se va a tratar.

Ciertas células del sistema inmunitario demuestran actividad citotóxica contra células diana concretas. Los linfocitos T citotóxicos expresan receptores de células T (TcR) que son capaces de reconocer específicamente péptidos derivados de antígenos unidos a moléculas MHC de clase I. Por el contrario, las células asesinas naturales (NK) no están restringidas por el MHC y no requieren la presentación de antígenos por parte de las moléculas del MHC para ejercer su efecto letal. Son capaces de reconocer células estresadas en ausencia de MHC cargadas de péptidos y de matar células que carecen de MHC. De este modo, las células NK desempeñan un papel importante en la inmunidad innata, ya que estas células "no MHC" no serían detectadas ni destruidas de otro modo por otras células inmunitarias.

Las células T citotóxicas (también conocidas como linfocitos T citotóxicos o células T asesinas) son capaces de reconocer células infectadas o dañadas de una manera específica de antígeno a través del TcR uniéndose a antígenos (péptidos) presentados en la superficie celular por moléculas MHC de clase I. La unión al péptido-MHC de clase I está mediada por el correceptor CD8, que mejora la afinidad de la interacción de unión y aumenta la transducción de señales por parte del TcR. Los TcR de otros tipos de células T, notablemente las células T auxiliares, reconocen péptidos antigénicos presentados por moléculas MHC de clase II, mediados por el correceptor CD4. Se requiere CD3 en las células T para la localización del TcR en la superficie celular (Ahmadi et al. 2011. Blood 118, 3528-3537), y se requiere para la activación de una célula T al entrar en contacto con una proteína MHC cargada con un péptido antigénico apropiado. CD3 es un complejo proteico compuesto por cuatro cadenas distintas: una cadena CD3y, una cadena CD35, dos cadenas CD3e y la cadena Z, que junto con el TcR forman el complejo TcR.

Las células NK (también definidas como "linfocitos granulares grandes") representan un linaje celular diferenciado del progenitor linfoide común (que también da lugar a linfocitos B y linfocitos T). A diferencia de las células T, las células NK no comprenden naturalmente CD3 en la membrana plasmática, aunque las células NK expresan CD3Z, que está asociado con el receptor F^cyRIII, y se ha encontrado que las células NK adultas activadas expresan CD3^ecitoplasmático (Lanier et a/., Journal of Immunology 149:1876-1880, 1992), aunque el propósito de la expresión de CD3^een las células NK no está claro ya que no parece ser necesario para el desarrollo o la funcionalidad de las células NK (Renard et al., PNAS 92: 7545-7549, 1995).

Es importante destacar que las células NK no expresan un TCR y, por lo general, también carecen de otros receptores de superficie celular específicos de antígeno (además de TCR y CD3, tampoco expresan receptores de células B de inmunoglobulina y, en cambio, expresan por lo general CD16 y CD56). De este modo, las células NK se diferencian por su fenotipo CD3', CD56+. La actividad citotóxica de las células NK no requiere sensibilización, pero se potencia mediante la activación con una variedad de citocinas, incluida la IL-2. En general, se cree que las células NK carecen de las vías de señalización apropiadas o completas necesarias para la señalización mediada por el receptor de antígeno y, de este modo, no se cree que sean capaces de señalización, activación y expansión dependientes del receptor de antígeno.

Las células NK son citotóxicas y equilibran la activación y la inhibición de la señalización del receptor para modular su actividad citotóxica. Por ejemplo, las células NK que expresan CD16 (el receptor FcyRIII) pueden unirse al dominio Fc de los anticuerpos unidos a una célula infectada, lo que da como resultado la activación de las células NK. Por el contrario, la actividad se reduce contra las células que expresan altos niveles de proteínas MHC de clase I. Al entrar en contacto con una célula diana, las células NK liberan proteínas tales como la perforina y enzimas tales como las proteasas (granzimas). La perforina puede formar poros en la membrana celular de una célula diana, induciendo apoptosis o lisis celular.

Se han desarrollado un número de terapias basadas en células T para tratar el cáncer, y estos tratamientos, conocidos como transferencia celular adoptiva (ACT), se han vuelto cada vez más atractivos durante los últimos años. Hasta ahora se han explotado tres estrategias principales de ACT. El primero de estos, y el más desarrollado, implica el aislamiento de las células T reactivas del tumor del propio paciente de sitios periféricos o tumorales (conocidos como linfocitos infiltrantes de tumores (TIL)). Estas células se expanden ex vivo y se reinyectan en un paciente. Sin embargo, este método puede implicar demoras de varias semanas mientras se expanden las células y requiere instalaciones de producción de células especializadas.

Están disponibles dos terapias alternativas, que implican la modificación de las propias células T de un paciente con receptores capaces de reconocer un tumor. En una opción, los TcR que tienen actividad hacia un antígeno canceroso pueden aislarse y caracterizarse, y un gen que codifica el TcR puede insertarse en las células T y reinyectarse en un paciente. Se ha demostrado que esta terapia reduce los tumores sólidos en algunos pacientes, pero está asociada con un inconveniente importante: los TcR usados deben coincidir con el tipo inmunitario del paciente. De acuerdo con lo anterior, como alternativa al uso de TcR, también se han sugerido terapias que implican la expresión de receptores de antígenos quiméricos (CAR) en células T. Los CAR son proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo unido al dominio de señalización del complejo TcR y se pueden usar para dirigir las células T contra un tumor si se selecciona un anticuerpo apropiado. A diferencia de un TCR, un CAR no necesita ser compatible con MHC para el destinatario. Sin embargo, hasta ahora se han identificado muy pocos antígenos de superficie específicos del cáncer que puedan usarse como dianas apropiadas para los CAR y, de este modo, el uso de los CAR en terapias contra el cáncer es limitado en la actualidad.

Todos los enfoques de ACT que implican la modificación de una célula T con un TcR o un CAR requieren el aislamiento y la modificación de las células T de un paciente o de un donante compatible con el tipo de tejido. El uso de células T autólogas es necesario para evitar el riesgo de rechazo si se usan células no autólogas. Esto aumenta los costes asociados con ACT y también puede aumentar la escala de tiempo requerida para preparar las células T para su uso en ACT.

Los métodos alternativos que buscan superar las limitaciones anteriores de ACT usan células NK citotóxicas, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 98/49268. Las células NK son potentes células asesinas y son altamente citotóxicas contra un número de células malignas diferentes. Dado que las células NK reconocerán las células diana que expresan moléculas HLA no propias, pero no antígenos HLA propios, las células NK autólogas generalmente no son efectivas y las células NK alogénicas (lo que requiere la eliminación cuidadosa de las células T para evitar la GvHD) o las líneas celulares que se deben usar. Las terapias basadas en células irradiadas de la línea celular NK NK-92 han progresado a ensayos clínicos en el tratamiento de leucemias y otras neoplasias malignas hematológicas. La irradiación significa que las células no pueden proliferar y, por consiguiente, el efecto letal tiene una duración limitada y definida. Las células NK tampoco atacan los tejidos sanos. Sin embargo, la "gama" natural de las células NK es limitado y aunque las células NK-92 tienen una gama más amplia que las células NK primarias, dado que las células NK no comprenden naturalmente receptores apropiados para atacar específicamente un antígeno en una célula diana, la modificación adicional de estas se requiere para ampliar la gama de cánceres que pueden tratarse y para dirigir o redirigir las células contra un cáncer particular o seleccionado. Tal redirección significa, por supuesto, que se elimina el requisito de células NK alogénicas, pero las líneas de células NK aún pueden tener ventajas, por ejemplo, citotoxicidad mejorada, en comparación con las células NK primarias o autólogas.

Con este fin, se han desarrollado células NK que expresan CAR para su uso en el tratamiento del cáncer. Los CAR que reconocen antígenos en la superficie de las células cancerosas se han introducido en la línea celular NK-92 en continuo crecimiento, y se ha demostrado que las células NK-92 que comprenden estos CAR tienen una citotoxicidad mejorada para las células tumorales en relación con las células NK-92 parentales (Uherek et al., 2002, Blood 200, 1265-1273). También se han modificado otras líneas celulares NK para expresar CAR que reconocen antígenos cancerosos, por ejemplo, la línea celular YT NK (Schirrmann & Pecher, Cancer Gene Therapy 9: 390-398, 2002). Los primeros ensayos clínicos están en curso. Sin embargo, como se señaló anteriormente, la falta de antígenos disponibles como dianas para los CAR limita actualmente el uso de terapias basadas en CAR.

La presente invención se basa en un enfoque alternativo para proporcionar células asesinas específicas del cáncer. Más particularmente, la presente invención tiene como objetivo proporcionar células asesinas específicas de cáncer en base a las células NK. Las células proporcionadas pueden ser de uso universal, lo que significa que las células no tienen que ser compatibles con el tipo inmunitario del sujeto que se va a tratar, como se requiere actualmente para las terapias basadas en las células T, pero pueden, no obstante, adaptarse al tipo de cáncer inmunoespecífico del sujeto, según la necesidad. De este modo, las células asesinas universales pueden usarse para la medicina personalizada.

La presente invención propone de este modo transformar una célula NK en una célula T y, por lo tanto, hacerla capaz de expresar un TcR y matar células de forma específica y dirigida, como una célula T. La presente invención combina la potencia y la capacidad de eliminación natural inherente de las células NK con el direccionamiento específico y la activación celular que ofrece el TcR. Aunque los CAR se han expresado previamente en las células NK, hasta ahora no se había pensado posible que una célula NK poseyera todas las vías de señalización y la maquinaria necesarias para permitir que un TcR se exprese con éxito de una manera que resulte en una activación exitosa y una muerte dirigida por la célula NK.

La universalidad se proporciona mediante el uso de una célula NK que es universalmente no inmunogénica, por ejemplo, que expresa naturalmente niveles bajos de MHC, o que tiene una capacidad proliferativa reducida, o haciendo que la célula ⁿK sea negativa para MHC (por ejemplo, HLA-), de manera que el sistema inmunitario del receptor no reconozca la célula como extraña. De este modo, en esta realización, no es necesario que la célula NK coincida con el tipo inmunitario (por ejemplo, HLA-) del sujeto que se está tratando y se puede administrar universalmente, independientemente del tipo inmunitario del sujeto (es decir, a un sujeto que tenga algún tipo de inmunidad, por ejemplo, cualquier perfil/tipo HLA).

De este modo, la presente invención proporciona medios que permiten expresar un TcR activo funcional en una célula NK no inmunogénica. De esta forma, puede proporcionarse una célula T asesina universal que no dependa de la compatibilidad con MHC de la célula, pero que tenga una especificidad controlada dictada por la especificidad del TcR que se introduce en la célula. Se encontró que la coexpresión de CD3 y un TcR en células NK era suficiente para que el TcR se localizara en la superficie de las células NK y, sorprendentemente, las células NK que expresaban el TcR demostraron citotoxicidad específica de antígeno hacia las células diana. Visto de otra manera, la presente invención proporciona medios para convertir una célula NK en una célula T citotóxica con los beneficios añadidos de la universalidad, simplemente mediante la coexpresión de CD3 y un TcR en una célula NK no inmunogénica. De este modo, la presente invención proporciona un linfocito T asesino "universal", que se puede usar en medicina personalizada.

De este modo, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una célula NK modificada para expresar las cadenas CD3 CD3y, CD38, c D3e y CD3Z, y un TcR, en el que un complejo CD3-TcR funcional se localiza en la superficie de la célula NK.

La célula puede modificarse para que sea no inmunogénica, por ejemplo mediante irradiación para reducir la capacidad proliferativa, o por algún otro medio para reducir la proliferación, de modo que la célula no persista durante el tiempo suficiente para generar una respuesta inmunitaria cuando se introduce en un sujeto, o modificando la célula para que sea negativa para MHC.

Las células de la invención se modifican para expresar un TcR que tiene especificidad hacia un antígeno en una célula diana (es decir, un antígeno diana). Como se define más adelante, el término "TcR" se usa ampliamente en este documento para incluir TcR nativos y sintéticos, por ejemplo, variantes o derivados de TcR.

En una realización particular, la presente invención proporciona una célula NK modificada para expresar CD3 y un TcR, en la que dicho TcR es específico para un antígeno en una célula cancerosa. Dicho de otro modo, la presente invención proporciona una célula NK específica de cáncer, en la que la especificidad de cáncer se proporciona mediante la coexpresión de un TcR y un CD3 específicos de cáncer. Como se describirá con más detalle a continuación, en una realización preferida, el TcR es independiente del correceptor, particularmente independiente de CD4 y/o CD8.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona tales células como las definidas anteriormente para su uso en terapia, más particularmente para su uso en terapia contra el cáncer, o más generalmente en terapia de transferencia celular adoptiva (por ejemplo, en el tratamiento de cualquier condición que pueda responder a terapia de células T).

También se proporciona una composición terapéutica que comprende una célula NK modificada como se define anteriormente y al menos un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Las células NK modificadas de la invención se modifican para coexpresar un TcR con CD3. De este modo, la preparación de una célula de la invención para su uso en terapia comprenderá la modificación de la célula NK para expresar un TcR. El TcR se diseñará o seleccionará, en primer lugar, para que coincida con el tipo inmunitario (es decir, MHC) del sujeto que se va a tratar (es decir, el receptor de las células NK modificadas) y, en segundo lugar, para que coincida, o reconozca, las células del sujeto a las que se dirigirá por las células NK. Es decir, el TcR está diseñado o seleccionado para reconocer un antígeno diana deseado en el sujeto. Este puede ser un antígeno diana expresado (o presentado) por una célula cancerosa en el sujeto o por cualquier célula que deba ser anulada por la terapia de transferencia celular adoptiva, por ejemplo, una célula infectada, por ejemplo, una célula que expresa (o presenta) un antígeno viral u otro patógeno.

De este modo, en un aspecto adicional, la invención proporciona un método de preparación de una célula NK modificada para su uso terapéutico, comprendiendo el método:

(a) proporcionar una célula NK que exprese las cadenas CD3 CD3^y, CD38, CD3^ey CD3Z;

(b) determinar el tipo de MHC de un sujeto que se va a tratar;

(c) identificar un antígeno diana en el sujeto, qué antígeno es expresado o presentado por las células en el sujeto, por ejemplo identificando o determinando el tipo de cáncer del sujeto, y/o la expresión de un marcador de cáncer particular (por ejemplo, antígeno) o presencia de una mutación particular, etc.; y

(d) modificar la célula de la etapa (a) para expresar un TcR que tenga especificidad por el antígeno diana y coincida con el tipo de MHC del sujeto, de manera que se localice un complejo CD3-TcR funcional en la superficie de la célula.

Como se discutirá más adelante, las etapas se pueden realizar por separado o secuencialmente, o simultáneamente. De este modo, por ejemplo, las etapas (a) y (d) pueden realizarse simultáneamente, más particularmente la célula puede modificarse para expresar CD3 y un TcR en una o más etapas simultáneas. Sin embargo, en otra realización, la célula puede modificarse para expresar CD3 en una etapa separada antes de la modificación para expresar un TcR.

En uso terapéutico, la célula modificada de la etapa (d) puede administrarse al sujeto.

De manera similar, una célula NK específica de cáncer de la invención se puede producir mediante un método que comprende:

a) proporcionar una célula NK (opcionalmente modificada para hacerla no inmunogénica);

b) modificar dicha célula para expresar CD3; y

c) modificar dicha célula para expresar un TcR específico de cáncer.

Las etapas (b) y (c) se pueden realizar juntos (simultáneamente) o por separado, por ejemplo, secuencialmente. Sin embargo, como se describirá más adelante, se puede preparar una célula NK universal que exprese CD3, cuya célula se puede usar posteriormente en las etapas separadas para preparar células personalizadas para la terapia de transferencia adoptiva, modificando aún más las células para que expresen un TcR que se selecciona en base al diagnóstico y el tipo de MHC del sujeto. De este modo, se puede preparar un banco, o biblioteca, de receptores TcR que contengan diferentes TcR (más específicamente, moléculas de ácido nucleico o vectores que codifican TcR) de acuerdo con la especificidad del MHC (es decir, el tipo) y la especificidad del antígeno diana (por ejemplo, para una gama de diferentes antígenos diana conocidos o identificados previamente, por ejemplo, antígenos del cáncer). Dependiendo del diagnóstico del sujeto (por ejemplo, un tipo de cáncer en particular, o cáncer que se sabe que expresa un antígeno en particular, o identificado mediante un análisis específico del cáncer del sujeto), se puede seleccionar y usar un TcR particular para modificar la célula NK para generar una célula NK modificada según la invención. Alternativamente, se puede preparar un banco o panel de células NK modificadas de la invención que expresen CD3 y TcR de especificidades variables, de las cuales se puede seleccionar una célula NK apropiada según el diagnóstico del sujeto y el tipo de MHC.

De acuerdo con lo anterior, otro aspecto adicional de la presente invención proporciona un kit para su uso en la terapia de transferencia celular adoptiva (que puede estar en el contexto de la terapia del cáncer), comprendiendo dicho kit:

(a) una célula NK modificada para expresar las cadenas CD3 CD3^y, CD38, CD3^ey CD3Z; y

(b) un panel de moléculas de ácido nucleico, cada una de las cuales codifica un TcR, en el que los TcR tienen una especificidad de antígeno diferente y/o una especificidad de MHC diferente.

Convenientemente, las moléculas de ácido nucleico codificantes pueden proporcionarse en vectores, por ejemplo, vectores listos para la introducción (es decir, transfección o transducción, etc.) en la célula NK. En una realización preferida, los TcR tienen especificidad por un antígeno canceroso, o por un antígeno expresado (por ejemplo, preferencial o específicamente) en células cancerosas.

Se entenderá que en este aspecto puede haber múltiples TcR que reconozcan el mismo antígeno pero pueden diferir en su especificidad de MHC y viceversa.

La presente invención emplea células citotóxicas del sistema inmunitario en el tratamiento del cáncer. Específicamente, la presente invención se refiere a la expresión de TcR en células citotóxicas del sistema inmunitario que de otro modo no expresarían un TcR (específicamente células NK) y métodos que permiten la expresión de TcR funcionales activos en tales células.

Los términos "citolítico" y "citotóxico" se usan indistintamente en este documento para referirse a una célula capaz de inducir la muerte celular por lisis o apoptosis en una célula diana.

El término "célula diana" se refiere a cualquier célula que es eliminada por las células NK modificadas de la invención. Más particularmente, la célula diana es la célula diana de las células NK, y por lo tanto una célula que expresa o presenta un antígeno reconocido por el TcR (un antígeno diana). Estos pueden incluir cualquier tipo de célula y están dirigidos por una célula de la invención a través de un antígeno que se muestra en la superficie de la célula diana.

De este modo, la célula diana puede ser cualquier célula del cuerpo del sujeto que se desea anular, por ejemplo, eliminar, matar, inactivar, etc. Una célula diana preferida es una célula cancerosa, pero puede ser cualquier célula resultante de una enfermedad o afección clínica. De este modo, la enfermedad o afección puede ser cualquier afección que pueda beneficiarse de la terapia de transferencia celular adoptiva, o más particularmente de la terapia de células T dirigida a las células para matarlas o eliminarlas, etc. Además de las células cancerosas, otras células que pueden ser clínicamente deseables para eliminar incluyen células infectadas, es decir, células infectadas con cualquier patógeno. Por lo general, tales células serán células infectadas por virus, pero también pueden estar infectadas con cualquier otro organismo patógeno, por ejemplo, cualquier microorganismo, por ejemplo, bacterias, hongos, micoplasmas, protozoos, priones. Alternativamente, la célula diana puede ser apoptótica o preapoptótica, o estar en un estado estresado (es decir, expresar marcadores relacionados con el estrés en su superficie celular), o puede ser una célula mutante, por ejemplo, expresando una mutación particular.

El "antígeno diana" es (o más específicamente proporciona o comprende) la molécula que es reconocida por el TcR cuando se presenta en la célula diana. De este modo, el antígeno diana, o más particularmente un péptido derivado del antígeno diana, se presenta en la célula diana de una manera restringida por MHCI o MHCII, tal como se requiere para ser reconocido por un TcR. De acuerdo con lo anterior, como se discutió anteriormente, el antígeno diana puede ser un antígeno canceroso, es decir, un antígeno que se expresa de manera específica, selectiva o preferencial por una célula cancerosa, o que es característico de una célula cancerosa o conocido o usado como marcador de células cancerosas. El antígeno del cáncer puede ser un antígeno del cáncer universal, es decir, un antígeno que se encuentra comúnmente en una amplia gama de diferentes tipos de cáncer, o puede ser específico de un tipo particular de cáncer. Alternativamente, puede ser un antígeno de un patógeno infectante presentado por la célula diana, o cualquier otro antígeno expresado o presentado por cualquier otra célula que se desee anular.

Un 'MHC' se refiere a una proteína del complejo principal de histocompatibilidad e incluye proteínas MHCI y MHCII. Las proteínas MHCII generalmente solo se encuentran en la superficie de las células presentadoras de antígenos, tales como las células dendríticas, los fagocitos mononucleares, algunas células endoteliales y las células epiteliales del timo. Las proteínas MHCII también son expresadas por las células B y, por consiguiente, pueden ser expresadas por neoplasias malignas de células B. Las proteínas MHCII también se expresan con frecuencia en las células de melanoma. El término MHC abarca el antígeno leucocitario humano (HLA) y, de este modo, cuando el sujeto es un ser humano, estos términos pueden usarse indistintamente.

Se puede usar cualquier célula NK según la presente invención. El término "célula NK" se refiere a un linfocito granular grande, que es un linfocito citotóxico derivado del progenitor linfoide común que no comprende naturalmente un receptor específico de antígeno (por ejemplo, un receptor de células T o un receptor de células B). Las células NK pueden diferenciarse por su fenotipo CD3-, CD56+. El término, como se usa en este documento, incluye cualquier célula NK conocida o cualquier célula similar a NK o cualquier célula que tenga las características de una célula Nk .

En una realización, las células NK pueden derivarse de un sujeto y crecer in vitro para proporcionar una población de células NK para su uso en la presente invención. Las células NK pueden ser autólogas (es decir, derivadas del sujeto que se va a tratar usando las células y los métodos de la presente invención), o pueden ser heterólogas (es decir, las células pueden derivar de un sujeto donante y pueden estar destinadas al tratamiento de un segundo sujeto (es decir, pueden ser alogénicos, singénicos o xenogénicos). De este modo, se pueden usar células NK primarias. En una realización alternativa, se puede usar en la presente invención una célula NK conocida en la técnica que se ha aislado y cultivado previamente. De este modo, se puede usar una línea celular NK. Se conocen y se informan en la literatura un número de células NK diferentes y cualquiera de estas podría usarse, o se puede preparar una línea celular a partir de una célula NK primaria, por ejemplo mediante transformación viral (Vogel B et al., 2014, Leukemia 28:192-195). Las líneas celulares pueden tener un número de ventajas sobre las células NK primarias, por ejemplo, pueden ser más fáciles de cultivar y mantener en cultivo, expandirse más fácilmente y estar fácilmente disponibles bajo demanda en calidad estandarizada para la terapia de transferencia celular adoptiva. Ciertas líneas celulares, por ejemplo, la línea celular NK-92, también puede mostrar una mayor actividad citotóxica, y en su estado no modificado (que no está modificado según la presente invención) pueden tener un espectro más amplio de células diana, por ejemplo, células diana cancerosas (esto puede deberse a una ausencia o reducción en el número de receptores inhibidores). Las células NK apropiadas incluyen (pero no se limitan a estas), además de NK-92, las líneas celulares NK-YS, NK-YT, MOTN-1, NKL, KHYG-1, HANK-1 o NKG.

En una realización preferida, la célula es una célula NK-92 (Gong et al., 1994, Leukemia 8, 652-658), o una variante de la misma. Se han preparado un número de variantes diferentes de las células NK-92 originales y están descritas o disponibles, incluidas las variantes de NK-92 que no son inmunogénicas. Cualquiera de tales variantes se puede usar y se incluye en el término "NK-92". También se pueden usar variantes de otras líneas celulares. Sin embargo, cualquier NK-92 o, de hecho, cualquier célula NK para su uso según la presente invención no debe modificarse para expresar ningún receptor específico de antígeno que no sea el TcR que se introduce o se introducirá en la célula Nk modificada según la presente invención. Por ejemplo, la célula no debe expresar un CAR (un anticuerpo monoclonal vinculado a un dominio de señalización intracelular del complejo TcR). Más generalmente, la célula NK modificada según la invención no expresa un receptor específico de antígeno en base a, o que comprende, regiones de reconocimiento de anticuerpos. Una célula NK no comprende naturalmente receptores específicos de antígeno y, de este modo, el único receptor específico de antígeno presente en las células de la invención es el TcR que se introduce en la célula NK.

Según la presente invención, la célula NK modificada no es inmunogénica. Funcionalmente hablando, esto significa que la célula no es reconocida por el sistema inmunitario del sujeto en el que se introduce; pasa por debajo del radar inmunológico y no es rechazada ni reconocida como extraña por el sujeto receptor. Es decir, no se genera ninguna respuesta inmunológica clínicamente significativa contra las células NK modificadas por parte del sistema inmunitario del sujeto al que se administran las células NK. De este modo, una célula puede ser no inmunogénica si, cuando se administra a un sujeto, no genera una respuesta inmunitaria que afecte, interfiera o impida el uso de las células en la terapia.

De este modo, el término "no inmunogénico" se usa ampliamente en este documento para significar que cuando la célula se inyecta o se administra de otro modo a un sujeto, no hay una respuesta inmune sustancial o clínicamente significativa a la célula. Más particularmente, la célula no genera (o no es capaz de generar) una respuesta inmune suficiente para conducir al rechazo de la célula y/o afectar la función de las células, por ejemplo, la respuesta inmunitaria no es suficiente para anular o reducir sustancial o significativamente la función o el efecto (es decir, la utilidad) de las células. De este modo, las células retienen actividad citotóxica en el sujeto, más particularmente actividad citotóxica significativa o sustancial o medible contra una célula diana. En una realización particular, la célula no es rechazada como extraña. Como ocurre con cualquier sistema biológico, la ausencia de una respuesta inmunitaria puede no ser absoluta (o del 100 %). Puede tolerarse una respuesta inmunitaria pequeña (o leve o menor) a las células NK (por ejemplo, ya que la función o utilidad de las células no se ve sustancialmente afectada (es decir, siempre que las células aún puedan realizar su función).

Se verá, por lo tanto, que una célula autóloga (es decir, una célula administrada o para administración al mismo sujeto del que se obtuvo) no será inmunogénica (porque es "propia"). De manera similar, una célula NK compatible con MHC no autóloga será no inmunogénica o sustancialmente no inmunogénica. El término "no inmunogénico" incluye de este modo la no inmunogenicidad funcional. Sin embargo, en ciertas realizaciones, y como se indicó anteriormente, una célula NK no inmunogénica de la invención no es inmunogénica independientemente del receptor de la célula, es decir, independientemente del sujeto en el que se introduzca o se vaya a introducir (es decir, no induciría una respuesta inmunitaria clínicamente significativa si se administrara a un sujeto no autólogo). En realizaciones particulares, la célula NK se puede someter a un tratamiento que la convierte en no inmunogénica (es decir, se puede modificar para que no sea inmunogénica). Por ejemplo, el tratamiento puede ser un tratamiento físico, químico o biológico, o una modificación estructural o físico-química de las células (por ejemplo, un tratamiento que provoca un cambio o alteración estructural o física de las células), por ejemplo, irradiación, o una modificación genética, por ejemplo, para reducir o eliminar la expresión de MHC por la célula. De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, la célula NK no es simplemente funcionalmente inmunogénica, sino que tiene o comprende una modificación que la convierte en no inmunogénica.

De acuerdo con lo anterior, las células NK pueden ser naturalmente no inmunogénicas o pueden modificarse para que sean no inmunogénicas. Naturalmente, las células NK no inmunogénicas pueden no expresar la molécula MHC o solo expresar débilmente la molécula MHC, o pueden expresar una molécula MHC no funcional que no estimula una respuesta inmunológica. Las células NK que serían inmunogénicas pueden modificarse para eliminar la expresión de la molécula MHC, o para expresar sólo débilmente la molécula MHC en su superficie. Alternativamente, tales células pueden modificarse para expresar una molécula de MHC no funcional.

Las células NK universalmente no inmunogénicas (ya sean naturalmente no inmunogénicas o modificadas de alguna manera) no comprenden MHC en su superficie a un nivel suficiente para desencadenar una respuesta inmunológica clínicamente significativa por la respuesta inmunológica de un sujeto, y se puede considerar que es negativa para MHC. En otras palabras, una célula negativa para MHC no expresa en su superficie ninguna molécula de MHC que sea inmunológicamente funcional, o no expresa en su superficie una molécula de MHC a un nivel lo suficientemente alto como para que pueda ser reconocida por otra célula inmunitaria, en particular una célula no autoinmune o una célula inmune de un sujeto receptor previsto. La célula puede carecer de una molécula de MHC, o puede que no exprese MHC en su superficie celular, o sólo exprese débilmente MHC en su superficie celular, o cualquier molécula de MHC que se exprese puede no ser funcional, por ejemplo, se puede mutar o modificar de otro modo de modo que no sea funcional. Se abarca cualquier medio por el cual se interrumpa la expresión de una molécula MHC funcional. Por consiguiente, esto puede incluir inactivar o modificar una molécula del complejo MHC, y/o puede incluir una modificación que impide el transporte apropiado y/o la expresión correcta de una molécula MHC, o de todo el complejo, en la superficie celular.

En particular, la expresión de una o más proteínas de MHC de clase I funcionales en la superficie de una célula de la invención puede verse interrumpida. En una realización, las células pueden ser células humanas que son negativas para HLA y, de acuerdo con lo anterior, células en las que se interrumpe la expresión de una o más moléculas de HLA (por ejemplo, inactivadas), por ejemplo, moléculas del complejo HLA MHC clase I.

En una realización preferida, la alteración del MHC de clase I se puede realizar inactivando el gen que codifica la p²-microglobulina, un componente del complejo MHC de clase I maduro. La expresión de p²m puede eliminarse a través de la interrupción dirigida del gen de la microglobulina p²(p²m), por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio del promotor p²m (para inactivar el promotor), o dentro del gen que codifica la proteína p²m para introducir una mutación inactivante, que impide la expresión de la proteína p²m, por ejemplo, una mutación de marco de lectura o un codón de 'TERMINACIÓN' prematuro dentro del gen. Alternativamente, la mutagénesis dirigida al sitio puede usarse para generar proteína p²m no funcional que no es capaz de formar una proteína MHC activa en la superficie celular. De esta manera, la proteína p²m o MHC puede retenerse intracelularmente, o puede estar presente pero no funcional en la superficie celular.

Como alternativa, las células NK pueden irradiarse antes de administrarse a un sujeto. Se ha encontrado que las células NK-92 que han sido irradiadas no son inmunogénicas en ensayos clínicos y han sido autorizadas para su uso en inmunoterapia (Ton T. et al. 2013 Cytotherapy 15 1563-70). Sin pretender ceñirse a la teoría, se cree que la irradiación de células da como resultado que las células solo estén presentes de forma transitoria en un sujeto, reduciendo de este modo el tiempo disponible para que el sistema inmunitario de un sujeto genere una respuesta inmunológica contra las células NK modificadas. Aunque tales células pueden expresar una molécula MHC funcional en su superficie celular, también pueden considerarse no inmunogénicas.

De este modo, una célula NK según la invención puede modificarse para que sea no inmunogénica reduciendo su habilidad o capacidad para proliferar, es decir, reduciendo su capacidad proliferativa.

Se modifica una célula NK de la invención para expresar las cadenas CD3 CD3y, CD38, CD3e y CD3Z, y un TcR. Como se mencionó anteriormente, una célula NK de la invención no expresa un CAR ni, de hecho, ningún receptor específico de antígeno que no sea un TcR. De este modo, en particular, excepto en el caso de una fusión TcR-CD3, el CD3 no se expresa como parte de un receptor quimérico. Más particularmente, el CD3 no se expresa como parte de un receptor de antígeno quimérico (CAR), o cualquier receptor quimérico basado en (o que comprende) regiones de unión a antígeno derivadas de anticuerpos, o un dominio de unión derivado de cualquier molécula o unidad estructural de unión que no sea un TcR, por ejemplo, de cualquier otro socio de unión por afinidad, por ejemplo, de un ligando o receptor que no sea un TcR. De este modo, el CD3 no se expresa como parte de un receptor quimérico que comprende un dominio de unión a antígeno (es decir, una parte o unidad estructural de unión) o cualquier dominio de unión o ligando que no sea un TcR o que no se derive de un TcR. En otras palabras, el CD3 se expresa de forma independiente (es decir, como una molécula o cadena separada, o no como parte de una fusión con una unidad estructural que no es una cadena de CD3 o una parte de la misma, o una molécula espaciadora o enlazante), y/o se expresa como parte de (o dentro) de una fusión TcR-CD3. De acuerdo con lo anterior, en particular, una célula N^kde la invención no expresa un CAR u otro receptor quimérico que comprenda una cadena o molécula CD3, que no sea una fusión CD3-TcR. En una realización en la que el CD3 se proporciona como, o como parte de una fusión (es decir, una proteína de fusión), es una fusión de CD3 o una fusión de CD3-TcR, como se describe más adelante.

Las células NK normalmente (o de forma nativa) no expresan CD3 y, por consiguiente, para hacer que la célula sea capaz de expresar CD3, se introduce en la célula una molécula de ácido nucleico que codifica CD3. De este modo, la célula se modifica para expresar de forma recombinante CD3. En otras palabras, la célula se modifica para permitir la expresión de una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica CD3. El CD3 puede coincidir con la especie de la célula (es decir, de la misma especie que la célula), sin embargo, también puede usarse CD3 de una especie diferente. De este modo, para una célula NK humana se puede expresar CD3 humano o CD3 de otra especie de mamífero, tal como ratón, rata, conejo, etc.

Una o más de las cadenas de CD3 se pueden proporcionar como una proteína de fusión, en la que al menos dos de las cadenas se expresan como un solo polipéptido, siempre que se conserven las funciones de localización y señalización de CD3.

Las cadenas de CD3 también pueden estar codificadas por una molécula de ácido nucleico o más de una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, en moléculas separadas. Convenientemente, se preparará una construcción que comprenda una molécula de ácido nucleico que codifique las cuatro cadenas de CD3, por ejemplo, bajo el control del mismo promotor o vinculados entre sí de alguna forma.

Una célula NK de la invención también se modifica para expresar un TcR. En el contexto de la presente invención, un TcR puede ser un TcR canónico que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno TcR en su contexto nativo (o natural). El término "TcR" incluye TcR nativos y no nativos, es decir, moléculas o construcciones de TcR sintéticas o artificiales, variantes o derivados de TcR, o una molécula de TcR derivada o basada en un TcR nativo.

De este modo, una célula NK que expresa un TcR tiene actividad citotóxica específica de antígeno (es decir, dirigida) hacia una célula diana. El TcR puede ser cualquier TcR que tenga especificidad hacia un antígeno en una célula diana de interés (un antígeno diana). La especificidad de la célula NK (es decir, el antígeno al que se une la célula) estará determinada por la especificidad del TcR. En otras palabras, la selección de un TcR apropiado es necesaria para proporcionar una célula NK que tenga la especificidad deseada (es decir, especificidad hacia un antígeno específico en una célula diana). De este modo, la presente invención proporciona una célula NK modificada para expresar las cadenas CD3 CD3y, CD35, CD3e y CD3z, y un TcR, en las que el TcR tiene especificidad hacia un antígeno en una célula diana.

En una realización preferida, el TcR se une a un antígeno en la superficie de una célula diana con alta afinidad (es decir, el TcR es un TcR de alta afinidad). En dicha realización tan ventajosa, el TcR es capaz de unirse al complejo MHC-antígeno en la superficie de la célula diana con una afinidad lo suficientemente alta como para que la célula que expresa el TcR sea capaz de experimentar la activación en ausencia de los correceptores CD8/CD4 por lo general requeridos para la activación de un TcR en una célula T auxiliar o citotóxica, respectivamente. De este modo, en una realización, la presente invención proporciona una célula NK modificada para expresar las cadenas CD3 CD3y, CD35, CD3^ey CD3Z, y un TcR que tiene especificidad hacia un antígeno en una célula diana, en la que dicho TcR se une a dicha célula diana con alta afinidad y sufre activación en ausencia de los correceptores CD8 y/o CD4.

Expresado de forma alternativa, el TcR que se introduce en la célula NK según la presente invención es independiente del correceptor (o cofactor); es decir, no requiere un receptor o cofactor adicional para que se active la célula (es decir, para que se produzca la señalización en la célula inducida por la unión de TcR). Por lo tanto, el TcR puede unirse al antígeno (el complejo MHC-antígeno) con una kdesactivada dentro del intervalo fisiológico normal. En particular, es independiente de CD8 y/o CD4, por ejemplo, independiente de CD8, y más particularmente independiente de CD4 y CD8. Sin embargo, en una realización alternativa, la célula NK puede modificarse adicionalmente para expresar CD4 y/o CD8.

Un TcR reconoce y se une a un antígeno (un péptido) presentado en la superficie celular por una proteína de la familia MHC de clase I o II. De este modo, el reconocimiento del antígeno depende tanto del tipo de m Hc de la célula como del péptido (más específicamente, de la secuencia del péptido, es decir, del antígeno). En términos generales, se conoce el antígeno diana y el TcR se selecciona Por tanto su especificidad antigénica. En una realización preferida, puede conocerse la secuencia del antígeno peptídico presentado por una célula diana. Adicionalmente, también se puede conocer el tipo de MHC de una célula diana. De este modo, en una realización preferida, se puede seleccionar un TcR que sea capaz de unirse específicamente a un complejo antígeno-MHC en la superficie de una célula diana. De este modo, en una realización preferida, la presente invención proporciona una célula Nk modificada para expresar CD3 y modificada adicionalmente para expresar un TcR que tiene especificidad hacia un antígeno en una célula diana, en la que dicho TcR es capaz de unirse específicamente a un complejo antígeno-MHC en la superficie de una célula diana.

En una realización preferida de la invención, un TcR puede seleccionarse de una célula T citotóxica que se ha identificado como que muestra específicamente citotoxicidad hacia una célula diana, o una célula T auxiliar. Alternativamente, se puede seleccionar el dominio de reconocimiento de antígeno o la secuencia de dicho TcR, o un fragmento del mismo. Dicha célula T puede obtenerse de un paciente que será objeto de tratamiento, o puede obtenerse de un segundo sujeto (es decir, un donante de TcR). De este modo, un TcR puede seleccionarse de una célula T identificada como que tiene actividad "probada" contra una célula diana. En otras palabras, se puede seleccionar un TcR que haya demostrado ser eficaz contra la célula diana. A modo de ejemplo, las células T, por ejemplo, linfocitos infiltrantes de tumores, pueden aislarse de un paciente con cáncer. Por su naturaleza, estos serán, o incluirán, células T que son activas contra el cáncer del paciente. Los genes que codifican el TcR de tales células pueden identificarse y clonarse, y usarse para expresar el TcR, o el dominio o secuencia de reconocimiento de antígeno de dicho TcR, o un fragmento del mismo, en una célula NK según la invención. Las células T se pueden producir en el paciente o en un sujeto mediante vacunación, por ejemplo, mediante la administración de una vacuna que comprende un antígeno del cáncer. A continuación, pueden seleccionarse aquellas células T inducidas por la vacunación que son más activas contra un cáncer en el sujeto, o contra células cancerosas. De tal manera, se pueden seleccionar los TcR más potentes o efectivos, por ejemplo, TcR con la mayor afinidad o que son correceptores independientes. Puede llevarse a cabo la maduración por afinidad para obtener un TcR óptimo.

Ventajosamente, el perfil HLA o perfil MHC del sujeto del que se deriva el TcR (donante de TcR) será el mismo que el perfil HLA o MHC del sujeto que se va a tratar. Como se indicó anteriormente, se puede identificar y caracterizar un TcR en una célula T que tiene especificidad hacia una célula diana, y se puede obtener la secuencia de aminoácidos del TcR y la secuencia de ácido nucleico del gen que codifica el TcR. Dicho de otro modo, una célula T citotóxica o una célula T auxiliar que comprende un TcR que tiene especificidad por un antígeno particular en una célula diana puede identificarse en un sujeto, y la secuencia de aminoácidos del receptor y la secuencia de ADN del gen puede obtenerse la codificación del receptor. La secuencia de ADN o el gen se puede usar para preparar una molécula o construcción de ácido nucleico para la introducción en una célula NK para permitir que el TcR se exprese en la célula NK huésped (es decir, receptora).

En una realización alternativa de la invención, puede usarse un TcR artificial (es decir, un TcR no identificado de una célula T auxiliar o citotóxica). El TcR puede ser un TcR alorreactivo generado artificialmente. El dominio de unión de un TcR se puede generar mediante un método basado en combinatoria, tal como la expresión en fago o la expresión en ribosoma, y se puede obtener una proteína quimérica que comprende un dominio de unión artificial, específico para una combinación particular de antígeno y MHC (por ejemplo, HLA).

El TcR se puede proporcionar como una construcción, o fusión, que comprende otros dominios proteicos.

Como se indicó anteriormente, se puede desarrollar un panel de diferentes TcR, cada TcR en el panel tiene especificidad para (por ejemplo, afinidad específica hacia) un complejo antígeno-MHC particular. De este modo, se pueden reconocer diferentes antígenos diana y/o diferentes epítopos en un antígeno diana y/o los TcR pueden tener diferente afinidad y/o selectividad por un antígeno. Adicionalmente, para un antígeno diana dado, el panel puede comprender TcR de diferente especificidad de MHC (o tipo de MHC). De esta forma, un TcR particular que es capaz de unirse a un complejo antígeno-HLA específico puede seleccionarse del panel para su uso en los métodos de la invención, es decir, un TcR que coincide tanto con el antígeno diana como con el tipo de MHC de un sujeto. De este modo, en una realización particularmente preferida, un TcR específico puede seleccionarse en función de la naturaleza de los antígenos presentados por una célula diana particular y su tipo de MHC (por ejemplo, HLA). Se anticipa que dicho panel puede usarse para permitir la generación rápida de una célula NK que tenga actividad citotóxica específica hacia una célula diana. De acuerdo con lo anterior, un método para producir una célula NK que tenga especificidad por una célula diana puede comprender:

a) modificar una célula NK para expresar CD3;

b) determinar el perfil de MHC de dicha célula diana y la identidad de un antígeno presentado por dicha célula diana; y

c) modificar dicha célula NK para expresar un TcR, en la que dicho TcR se selecciona de un panel de TcR, cada uno de los cuales tiene especificidad por un antígeno y/o tipo de MHC diferente, y en la que dicho TcR tiene especificidad por el MHC y el antígeno presentado en dicha célula diana.

Los TcR se pueden proporcionar en el panel en forma de moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican los TcR. Convenientemente, las moléculas de ácido nucleico pueden estar comprendidas dentro de vectores o construcciones, particularmente vectores o construcciones apropiadas directamente para la introducción en una célula NK. La molécula de ácido nucleico puede ser ADN o ARN. Por ejemplo, los TcR se pueden proporcionar como ARNm o como vectores virales, por ejemplo, vectores retrovirales.

En una realización, una célula NK se modifica para expresar un TcR después de que la célula se modifique para expresar CD3. De este modo, como se indicó anteriormente, se puede preparar una célula NK universal modificando una célula NK no inmunogénica universal para expresar CD3. Tales células NK modificadas pueden cultivarse y mantenerse en cultivo, o almacenarse para su uso futuro. De acuerdo con lo anterior, en una realización se puede permitir que la célula se replique para producir una población de células NK que expresen CD3, antes de modificar las células para que expresen un TcR. Las células NK pueden crecer en cultivo o expandirse. En una realización alternativa, se contempla que la célula pueda modificarse para expresar CD3 y un TcR al mismo tiempo, o sustancialmente al mismo tiempo. En una realización, se puede usar un solo vector o construcción que comprende genes tanto para CD3 como para un TcR para modificar una célula para que exprese tanto CD3 como TcR, y en otras realizaciones también se pueden usar vectores separados. Como se discutió anteriormente, las proteínas de fusión que comprenden funcionalidades tanto de TcR como de CD3 en una única molécula polipeptídica también pueden expresarse en células NK y, de este modo, un vector o construcción que codifica dicha proteína de fusión puede usarse para modificar una célula. Se puede permitir que las células NK modificadas para expresar tanto CD3 como un TcR se repliquen, por ejemplo, puede cultivarse o expandirse antes de introducir las células en un sujeto. De este modo, se puede generar una población de células NK que expresan CD3, y se puede modificar una subpoblación de células NK:CD3 para expresar un TcR que tiene especificidad por un antígeno en la superficie de una célula diana.

Las células NK modificadas de la invención también pueden estar sujetas a modificación de otras formas, por ejemplo, para alterar o modificar otros aspectos de la función o el comportamiento celular, y/o para expresar otras proteínas. Por ejemplo, las células pueden modificarse para expresar un receptor de orientación, o receptor de localización, que actúa para dirigir o mejorar la localización de las células en un tejido o ubicación particular del cuerpo. Las células también pueden modificarse para expresar uno o más de los componentes de la ruta de señalización de las células T, con el fin de potenciar la respuesta citotóxica exhibida por las células NK. Cualquier modificación de este tipo puede tener lugar antes, después o simultáneamente con la modificación según la presente invención.

La célula de la invención puede modificarse para alterar su capacidad para replicarse in vivo y/o in vitro. En una realización, se puede mejorar la capacidad de replicación de la célula (la capacidad de una célula para replicarse, es decir, para proliferar). En una realización preferida, esto se puede lograr modificando las células para que tengan una expresión mejorada de una citoquina, tal como IL-2. Generalmente se requiere IL-2 para que las células NK crezcan y mantengan la función citolítica y, de este modo, las células que expresan IL-2 no requieren IL-2 adicional para complementarse en el medio de crecimiento y retienen la actividad citotóxica cuando se introducen en un sujeto. La expresión de una citoquina puede potenciarse introduciendo un vector o construcción heterólogo (no nativo) que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una citoquina en una célula o, alternativamente, puede potenciarse la expresión de un gen endógeno que codifica una citoquina. La expresión de una citoquina puede ser constitutiva (es decir, el promotor que controla la expresión del gen que codifica una citoquina puede ser constitutivamente activo, o estar "activado"), o puede ser inducible por un estímulo externo.

En una realización, la célula se puede modificar para que tenga una capacidad de replicación potenciada antes de que la célula se modifique para expresar CD3 y/o un TcR. En otra realización, la célula se puede modificar para que tenga una capacidad de replicación potenciada después de que la célula se modifique para expresar CD3 y/o un TcR. En una realización alternativa, la célula puede modificarse para que tenga una capacidad de replicación potenciada después de que la célula se modifique para expresar CD3, pero antes de que la célula se modifique para expresar un TcR (es decir, de este modo puede ser posible producir una gran población de células NK que expresen CD3, antes de modificar las células para expresar un TcR). Alternativamente, dos o más de las modificaciones anteriores pueden realizarse sustancialmente al mismo tiempo. En una realización, las tres modificaciones pueden realizarse sustancialmente al mismo tiempo.

La capacidad proliferativa y la viabilidad (supervivencia) de las células NK de la presente invención también pueden reducirse antes de que la célula se introduzca en un paciente. Como se indicó anteriormente, esto se puede hacer para hacer que la célula no sea inmunogénica. En una realización preferida, la capacidad de replicación y/o la viabilidad de la célula pueden reducirse mediante irradiación. La capacidad de una célula para replicarse y/o su viabilidad puede disminuir (es decir, la replicación puede tener lugar más lentamente) o eliminarse dependiendo de la dosis y la naturaleza de la irradiación suministrada a las células. La radiación puede provenir de cualquier fuente de radiación a, p o y, o puede ser radiación de rayos X o luz ultravioleta. Una dosis de radiación de 5-10 Gy puede ser suficiente para anular la proliferación; sin embargo, otras dosis de radiación apropiadas pueden ser 1-10, 2-10, 3-10, 4-10, 6-10, 7 10, 8-10 o 9-10 Gy, o dosis superiores tales como 11, 12, 13, 14, 15 o 20 Gy. Alternativamente, las células NK pueden modificarse para expresar un 'gen suicida', que permite que las células mueran de manera inducible o impidan que se repliquen en respuesta a un estímulo externo.

Una célula puede modificarse A) para que tenga una capacidad de replicación potenciada y B) para que tenga una capacidad de replicación y/o viabilidad reducidas. Las dos modificaciones se pueden realizar secuencialmente en cualquier orden (es decir, A luego B, o B luego A), o se pueden realizar esencialmente al mismo tiempo (A y B juntas). En dicha realización, la célula puede modificarse para expresar una citoquina (tal como IL-2) para potenciar el crecimiento de las células in vitro antes, al mismo tiempo o después de modificar la célula para expresar CD3 y/o un TcR y puede modificarse posteriormente para reducir su capacidad de replicación y/o viabilidad antes de introducir la célula en un sujeto.

Quedará claro de lo anterior que una célula de la invención puede modificarse para alterar el nivel de expresión de uno o más genes, o en particular para permitir la expresión de uno o más genes que normalmente no son expresados por la célula. Para permitir tal expresión génica heteróloga, se introduce en la célula una molécula de ácido nucleico correspondiente al gen en cuestión o que lo comprende. Convenientemente, la molécula de ácido nucleico puede introducirse en la célula en un vector o construcción recombinante. Los métodos de expresión génica heteróloga son conocidos en la técnica, tanto en términos de preparación de construcción/vector como en términos de introducción de la molécula de ácido nucleico (vector o construcción) en la célula. De este modo, los promotores y/u otras secuencias de control de la expresión apropiadas para usar con células de mamífero, en particular células linfoides o células NK, y vectores apropiados, etc. (por ejemplo, vectores virales) son bien conocidos en la técnica.

Los vectores o construcciones (moléculas de ácido nucleico) pueden introducirse en una célula de la invención por una variedad de medios, que incluyen agentes de transfección química (tales como fosfato de calcio, compuestos orgánicos ramificados, liposomas o polímeros catiónicos), electroporación, compresión de células, sonoporación, transfección óptica, suministro hidrodinámico o transducción viral. En una realización preferida, un vector o construcción se introduce por transducción viral. Las moléculas de ácido nucleico heterólogas introducidas en una célula pueden expresarse episomalmente o pueden integrarse en el genoma de la célula en un lugar apropiado.

Los métodos de cultivo celular y los reactivos apropiados para las células NK también son bien conocidos en la técnica. Se puede usar cualquier método deseado de cultivo celular, según la elección y la conveniencia, etc. Por ejemplo, se pueden usar bolsas de teflón para cultivos a gran escala o sistemas de cultivo celular automatizados.

La célula diana de la invención puede ser una célula cancerosa. El cáncer se define ampliamente en este documento para incluir cualquier estado neoplásico, ya sea maligno, premaligno o no maligno. Generalmente, sin embargo, puede ser una condición maligna. Se incluyen tanto tumores sólidos como no sólidos y el término “célula cancerosa” puede tomarse como sinónimo de “célula tumoral”.

Se abarca cualquier tipo de cáncer, incluidos los cánceres sólidos y hematopoyéticos. Los cánceres representativos incluyen leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), carcinoma adrenocortical, cáncer relacionado con el SIDA (por ejemplo, sarcoma de Kaposi y linfoma), cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitomas, tumor teratoideo/rabdoideo atípico, carcinoma de células basales, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga extrahepático, cáncer de hueso (por ejemplo, sarcoma de Ewing, osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno), glioma de tronco encefálico, cáncer de cerebro, cáncer de mama, tumores bronquiales, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, tumores cardíacos (corazón), cáncer del sistema nervioso central (incluyendo tumor teratoideo/rabdoideo atípico, tumores embrionarios, tumor de células germinales, linfoma), cáncer de cuello uterino, cordoma, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mielógena crónica (CML), trastorno mieloproliferativo crónico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, linfoma cutáneo de células T, cáncer de las vías biliares, carcinoma ductal extrahepático in situ (DCIS), tumores embrionarios, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, sarcoma de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer extrahepático de las vías biliares, cáncer ocular (incluidos el melanoma intraocular y el retinoblastoma), histiocitoma fibroso óseo, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumores del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales, enfermedad trofoblástica gestacional, glioma, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, cáncer hepatocelular (hígado), histiocitosis, células de Langerhans, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, melanoma intraocular, tumores de células de los islotes, tumores neuroendocrinos pancreáticos, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (incluido el tumor de células renales y de Wilms), histiocitosis de células de Langerhans, cáncer de laringe, leucemia (incluida la linfoblástica aguda (ALL), mieloide aguda (AML), linfocítica crónica (CLL), mielógeno crónico (CML), cáncer de labio y de cavidad oral, cáncer de hígado (primario), carcinoma lobulillar in situ (LCIS), cáncer de pulmón, linfoma, macroglobulinemia, Waldenstrom, melanoma, carcinoma de células de Merkel, Mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico con primario oculto, carcinoma del tracto de la línea media que implica el gen NUT, cáncer de boca, síndromes de neoplasia endocrina múltiple, infantil, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativas, mieloma múltiple, trastornos mieloproliferativos, cáncer de cavidad nasal y senos paranasales, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer oral, cáncer de cavidad oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, tumores neuroendocrinos pancreáticos (tumores de células de los islotes), papilomatosis, paraganglioma, cáncer de senos paranasales y de cavidad nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, tumor hipofisario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, cáncer de mama y embarazo, linfoma del sistema nervioso central (CNS) primario, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de células renales (riñón), pelvis renal y uréter, cáncer de células de transición, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma, síndrome de Sezary, cáncer de piel, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejido blando, carcinoma de células escamosas, cáncer de cuello escamoso con cáncer primario oculto, metastásico, cáncer de estómago (gástrico), linfoma de células T, cáncer de testículo, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de la pelvis renal y uréter, cáncer de uretra, cáncer de útero, endometrio, sarcoma de útero, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms

Como se indicó anteriormente, se han identificado un número de cánceres que expresan antígenos de cáncer particulares o específicos, o que se caracterizan por la expresión de un antígeno de cáncer particular o específico. De este modo, se puede usar un antígeno de cáncer conocido o reconocido. Como se sabe en la técnica, ciertos antígenos pueden aparecer en un número de tipos de cáncer diferentes, otros pueden ser específicos para un tipo de cáncer en particular. Sin embargo, en otros casos puede ser apropiado o necesario caracterizar el cáncer en un sujeto e identificar un antígeno de cáncer apropiado para su uso. De este modo, cualquier cáncer puede tratarse usando un TcR dirigido contra un antígeno universal del cáncer y tales TcR han sido identificados. Alternativamente, el cáncer puede ser cualquier cáncer que actualmente se trate, o se proponga para el tratamiento, mediante terapia de células T adoptivas, por ejemplo, cánceres comunes tales como melanoma, cánceres hematológicos, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal. Además, alternativamente, el cáncer puede ser un cáncer raro en el que actualmente hay pocas opciones de tratamiento disponibles (por ejemplo, con estado de fármaco huérfano), tal como por ejemplo, cáncer de páncreas o sarcoma.

En otras realizaciones, la célula diana puede ser una célula infectada y, en particular, una célula infectada con un virus. El virus puede ser cualquier virus, pero generalmente será un virus patógeno. A modo de ejemplo, el virus puede ser VIH, un virus de la hepatitis (por ejemplo, HBV o HCV), HPV, CMV o EBV, HHV-8, HTLV-1, Sv 40, enterovirus. Otros posibles agentes infecciosos o patógenos incluyen también bacterias, por ejemplo, Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, y parásitos por ejemplo, Schistosoma haematobium y trematodos hepáticos, Opisthorchis viverrini, Clonorchis sinensis y paludismo.

Las células pueden administrarse a un sujeto directamente por vía intravenosa. En una realización alternativa, las células pueden administrarse directamente en un tumor mediante inyección intratumoral.

La dosis de células administrada a un sujeto variará dependiendo de la naturaleza de la célula diana. En una realización preferida de la invención en la que la célula diana es una célula cancerosa, la dosis se puede calcular en base al tipo de cáncer al que se dirige. En una realización preferida, se puede administrar al sujeto una dosis de aproximadamente 109 células, sin embargo, esto puede variar dependiendo del tipo y la extensión del cáncer. Es posible que se pueda administrar una dosis de aproximadamente 106, 107 o 108 células. Alternativamente, se puede administrar una dosis mayor de aproximadamente 1010, 1011 o 1012 células. La dosis de células administrada también puede variar en función del tamaño corporal del paciente, pudiendo administrarse así una dosis de 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 o 1012 células por m2 de superficie corporal del paciente o por kg del peso del paciente.

También se anticipa que se pueden requerir múltiples infusiones para tratar a un sujeto de manera efectiva. Por ejemplo, se pueden administrar a un paciente 2, 3, 4, 5, 6 o más infusiones separadas, a intervalos de 24 o 48 horas, o cada 3, 4, 5, 6 o 7 días. Las infusiones también pueden espaciarse a intervalos semanales, quincenales o mensuales, o intervalos de 6 semanas o 2, 3, 4, 5 o 6 meses. También es posible que se puedan administrar infusiones anuales.

El sujeto que se va a tratar usando los métodos y células de la presente invención puede ser cualquier especie de mamífero. Por ejemplo, el sujeto puede ser cualquier especie de mascota doméstica, tal como un ratón, una rata, un jerbo, un conejo, una cobaya, un hámster, un gato o un perro, o ganado, tal como una cabra, una oveja, un cerdo, una vaca o un caballo. En una realización preferida adicional de la invención, el sujeto puede ser un primate, tal como un mono, un gibón, un gorila, un orangután, un chimpancé o un bonobo. Sin embargo, en una realización preferida de la invención, el sujeto es un ser humano.

Se contempla que las células NK para su uso en la presente invención pueden obtenerse de cualquier especie de mamífero, sin embargo, en una realización preferida, las células NK serán de la misma especie de mamífero que el sujeto que se va a tratar. Además, y como se indicó anteriormente, en una realización preferida, la célula se modificará usando genes que expresan proteínas de la misma especie de mamífero (por ejemplo, se usarán CD3 y TcR humanos para un sujeto humano). Sin embargo, es posible que también se puedan usar un CD3 y un TcR de diferentes especies, por ejemplo, se puede modificar una célula usando genes que expresan un CD3 de ratón y un TcR humano.

La presente invención puede entenderse más completamente a partir de los ejemplos siguientes y con referencia a los dibujos, en los que:

La figura 1 muestra que CD3 se puede expresar en células NK-92. Se transdujo una construcción retroviral CD3-IRES-GFP en células NK-92. Se controló la fluorescencia en el canal FITC. Las células GFP+ se indican en la región marcada. Negro: células no transfectadas, gris: células transfectadas.

La figura 2 muestra que se puede detectar CD3 en la superficie de las células NK-92 que expresan CD3-IRES-GFP, en presencia de un TcR. NK-92 clasificadas GFP+ (NK-92-CD3) se superinfectaron con cuatro TcR diferentes, a saber, Radio-1 (TGFbRII marco de lectura específico, MHC-I) y una variante de cisteína, Radio-1cys, DMF-5 (MART-1 específico, MHC-I), Radio-3 (hTERT específico, MHC-II) y como control se corrieron células no superinfectadas. Las células se tiñeron con anti-CD3 para detectar CD3 en la superficie celular y se midió la fluorescencia en los canales FITC (GFP) y APC (anti-CD3). Las células del cuadrante superior derecho expresan CD3 en la superficie celular.

La figura 3 muestra que los TcR de Radio-1 y DMF-5 se pueden detectar específicamente en la superficie de las células NK-92 que expresan CD3-GFP. Las células se transfectaron para expresar CD3 y dos TcR diferentes: Radio-1 (TGFbRII marco de lectura), DMF-5 (MART-1) y CD3 solo (Sin TcR). Las células se tiñeron con un anticuerpo específico V-beta que puede detectar la cadena V-beta de Radio-1 (no DMF5, fila superior) o un multímero MART-1 para detectar el DMF-5 TcR en la superficie celular (fila inferior). La fluorescencia se midió en los canales FITC (GFP) y APC (anti-Vb y M1-multímero).

La figura 4 muestra que las células NK-92 modificadas para expresar CD3 y Radio-1 TcR demuestran actividad citotóxica específica de antígeno. Las células NK-92 transfectadas con CD3-IRES-GFP (GFP+ -cuadro superior-CD3_IRES_GFP) y las células que no fueron transfectadas (GFP' -cuadro inferior- NTr) se separaron en dos poblaciones separadas. Las células NK se incubaron con células SupT 1 que expresan trímero de cadena sencilla con el péptido diana TGFbRII y el péptido irrelevante o solo. Las células SupT 1 se separaron de las células NK detectando la expresión del marcador de células NK CD56. La desgranulación se controló mediante la detección del marcador CD107 en células NK después de la incubación con las células SupT1 en las poblaciones GFP+ y GFP-, y se representaron juntas (histograma, gris: GFP-, discontinuo: GFP+).

La figura 5 muestra que una población pura de células NK-92 CD3 superinfectadas con DMF-5 o Radio-1 TcR y clasificadas se activa específicamente mediante células T2 cargadas con el péptido relevante. Arriba: estrategia de activación: la señal CD3 y GFP se usan para separar las dos líneas celulares. Luego se prueba la población de CD3+ para determinar la expresión de CD107a (desgranulación). Histogramas: los NK-92-CD3-TcR indicados se incubaron con células T2 cargadas durante la noche con 1 |iM de péptidos (sombreado gris: sin péptido, contorno gris oscuro: MART-1, contorno gris claro: TGFbRII).

La figura 6 muestra el cálculo de los valores EC50 para los TcR de Radio-1 y DMF-5.

La figura 7 muestra los resultados del análisis de citometría de flujo Fosfo de la activación de las células NK-92 (CD3/Radio-1) al ponerse en contacto con los anticuerpos a-CD3 y a-CD28. Los desplazamientos a la derecha de los espectros de citometría de flujo indican mayores niveles de fosforilación de la proteína relevante, lo que a su vez indica la activación del complejo TCR.

La figura 8 muestra la especificidad de la estimulación de las células NK-92 (CD3/Radio-1) y NK-92 (CD3/DMF-5). Las células NK-92 se incubaron con células presentadoras de antígeno, presentando ya sea el péptido afín específico para cada receptor (TGFbRII para células que expresan Radio-1, MART-1 para células que expresan DMF-5) o un péptido aleatorio. Se midió la estimulación de la señalización a través del complejo TCR en diversos puntos de tiempo según el nivel de fosforilación de diversas proteínas relacionadas con TcR/CD3. Estos niveles de fosforilación se midieron mediante citometría de flujo Fosfo. En cada gráfico, la línea continua define la activación de las células por el péptido afín específico; la línea de puntos define la activación de las células por el péptido aleatorio.

La figura 9 muestra la cinética de estimulación de células NK-92 (CD3) transducidas con ya sea Radio-5 o Radio-6 TcR. Ambos receptores se derivan de las células T CD4+ y se unen específicamente a un péptido de TGFbRII marco de lectura; Radio-5 lo une específicamente en el contexto de HLA-DR7, Radio-6 en el contexto de HLA-DR4. Los valores de EC⁵⁰para Radio-5 y Radio-6 se calculan usando tejido de pacientes donantes (pacientes H, S y B). El paciente H tiene el haplotipo HLA-DR7; los pacientes S y B tienen el haplotipo HLA-DR4.

Ejemplo 1.

Expresión de CD3 en células NK92.

Se usó un vector pMP71-CD3Z-CD3£-CD3Y-CD38-IRES-GFP (CD3-GFP) con codones optimizados (Ahmadi et al.

2011. Blood 118, 3528-3573) para transfectar células NK92 con CD3, y las células se transfectaron usando transducción retroviral. El retrovirus que contenía la construcción CD3-GFP se produjo en la línea celular de empaquetamiento (Hek-Phoenix) y las células NK se espinocularon (0.3 M de células incubadas con sobrenadante viral y se centrifugaron a 900xg durante 1 hora a 32 °C en placas recubiertas con retronectina (Tanaka Biotech)). Se usó GFP como marcador para la transducción exitosa.

La transducción satisfactoria de células NK-92 con CD3 (NK-92(CD3)) se confirmó mediante citometría de flujo usando un citómetro de flujo FACS Canto (BD Biosciences). Se controló la fluorescencia en los canales SSC y FITC, y se observó una transfección satisfactoria mediante el control de la fluorescencia en el canal GFP (véase la figura 1). Se obtuvo una eficiencia de transfección de aproximadamente el 50 %. Alternativamente, las células GFP+ se clasificaron para obtener una población pura.

Ejemplo 2.

Expresión de TcR en células NK-92 (CD3)

Se probó la capacidad de las células NK-92 (CD3) para coexpresar CD3 y un TcR. Tanto CD3 como TcR requieren la coexpresión del otro miembro del complejo TcR para ser dirigidos a la superficie celular. De este modo, fue posible usar la expresión de CD3 en la superficie de las células NK como marcador para la cotransfección exitosa de una célula con CD3 y un TcR.

Las células NK-92 (CD3) se sobreinfectaron con cuatro TcR diferentes usando sobrenadantes retrovirales (una variante de cisteína de Radio-1cys, específica de Radio-1 (TGFbRIl marco de lectura), DMF-5, específica de MART-1 (DMF-5 (Johnson, L. A. et al. 2006 J Immunol 177:6548-6559)) y Radio-3 (hTERT, MHC-II)) y se controló la expresión de CD3 en la superficie celular para cada TcR usando un multímero de anticuerpo anti-CD3 marcado con APC. La expresión de CD3 se detectó controlando las células para determinar la expresión de GFP. Se detectó fluorescencia en los canales FITC y APC. Las células que expresan GFP aparecen en la región de la derecha de los diagramas de puntos, y las células que expresan CD3 en su superficie celular aparecen en la región superior de los diagramas de puntos. Las células que coexpresan CD3 y TcR (es decir, células con el complejo CD3-TcR localizado en la superficie de las células) aparecen en la región superior derecha de los diagramas de puntos.

La expresión de CD3 en la superficie celular se detectó en células modificadas para expresar cada uno de los TcR (Figura 2 A-D) (células en el cuadrante superior derecho en cada gráfico de puntos). En particular, las células modificadas para expresar Radio-1 TcR mostraron expresión de CD3 en la superficie celular, figura 2B. La figura 2D también muestra un pequeño aumento en la fluorescencia en el canal APC para las células GFP+, lo que indica un bajo nivel de expresión de Radio-3 TcR. No se detecta expresión de CD3 en la superficie celular para las células que carecen de un TcR (Figura 2E).

La expresión de los TcR en la superficie celular también se detectó en células NK-92 (CD3) modificadas para expresar los TcR de Radio1 y DMF-5. La presencia del TcR en la superficie celular se controló usando ya sea un anticuerpo específico V-beta que puede detectar la cadena V-beta de Radio-1 o un multímero MART-1 para detectar el DMF-5 TcR en la superficie celular (fila inferior), etiquetado con APC. La fluorescencia se midió en los canales FITC (GFP) y APC (anti-Vb y M1-multímero). No se observó ningún aumento en la señal en el canal APC para las células NK-92 (CD3) no modificadas para expresar un TcR (Figura 3A). Las células modificadas para expresar Radio-1 TcR mostraron un aumento en la señal en el canal APC cuando se tiñeron con el anticuerpo ant-Vp pero no con el multímero MART-1. (Figura 3B). Las células modificadas para expresar el DMF-5 TcR mostraron un aumento en la señal en el canal APC cuando se tiñeron con el multímero MART-1 (Figura 3C).

Ejemplo 3.

Las NK-92 (CD3) que expresan un TcR son funcionales

Para validar la funcionalidad de nuestro TcR cuando se expresa en una célula NK, probamos si el TcR expresado en las células NK era capaz de reconocer específicamente las células diana.

Se incubaron células NK-92 (CD3) que expresan un TcR con células diana que expresan una molécula de trímero de cadena sencilla (SCT) que comprende el péptido diana correcto (TGFbRII) o un péptido no específico (irr) durante 5 horas, o en ausencia de células diana (sin APC), y se controló la expresión del marcador de desgranulación CD107 como marcador de la capacidad de las células NK para ser estimuladas por las células diana. (Los SCT representan una proteína MHC de clase I que muestra un antígeno y consisten en un péptido antigénico, p2-microglobulina y una cadena h expresada como una sola cadena polipeptídica, véanse los documentos US 2010/015954 y Yu, Y. Y. et al. (2002) J Inmunol 168: 3145-3149.

Las células NK-92 (CD3) se tiñeron inicialmente con anti-CD56 Tx Red (CD56 es un marcador para las células NK) y se controló la fluorescencia de TxRed y GFP (Figura 4A). Se observaron poblaciones separadas de células NK-92 en base a la expresión de GFP. Se detectaron células GFP+ (región superior) y células NK GFP-(región inferior). Se controló la expresión de CD107a para cada población de células, y se usaron células GFP- como control negativo (es decir, células que no expresan TcR).

Las células NK-92 (CD3) que expresan TcR específico de Radio1 se incubaron con SupT1 que expresa una molécula de trímero de cadena única (SCT) con un péptido no específico (Figura 4C) o el péptido diana de Radio-1 TGFbRII (Figura 4D). Las células incubadas en ausencia de una célula presentadora de antígeno también se controlaron (Figura 4B) la expresión de CD3, se controló para la línea celular NK-92 y las células se seleccionaron como se describe anteriormente. Las poblaciones GFP+ (línea punteada) y GFP-(línea continua) son visibles en cada histograma.

Solo las células NK-92 (CD3) que expresan el TcR específico de Radio-1 mostraron un aumento en la expresión de CD107 cuando se incubaron con células SupT1 que expresan el Radio-1 SCT (Figura 4D), como se indica por el desplazamiento hacia la derecha de la línea punteada en comparación con la línea continua (GFP-control negativo). No se observó aumento en la expresión de CD107 para estas células cuando se incubaron con células SupT1 que expresaban el péptido no específico (Figura 4C) o células incubadas en ausencia de células presentadoras de antígeno.

Juntos, estos datos indican que NK-92 (CD3) que expresan el TcR específico de Radio-1 pueden ser activados por células diana que expresan el péptido diana de Radio-1. Esto demuestra que el TcR expresado en las células NK-92 (CD3) es activo y funcional. De este modo, se muestra que las células NK-92 (CD3) que expresan un TcR tienen citotoxicidad específica de células diana.

Ejemplo 4.

Activación de células NK-92 (CD3) que expresan TcR por células T2 cargadas con el péptido relevante

Se modificaron células NK-92 (CD3) para expresar ya sea TcR de Radio-1 o DMF-5 y se detectó la expresión de CD3 en la superficie celular usando anti-CD3 marcado con APC. Las células CD3+ se seleccionaron para el análisis de desgranulación (Figura 5, panel superior) y se clasificaron.

Las células NK-92 (CD3) modificadas para expresar los TcR de Radio-1 o DMF-5 se incubaron con células T2 (Figura 5, paneles inferiores) cargadas con los péptidos ya sea TGFbRII (contorno gris claro) o MART1 (contorno gris oscuro), que son los antígenos diana para los TcR de Radio-1 y DMF-5, respectivamente. Se midió la expresión de CD107a por células NK-92 (CD3) que expresan los TcR de Radio-1 (Figura 5, panel inferior izquierdo) y DMF-5 (Figura 5, panel inferior derecho) incubados con células T2 en presencia de cualquiera de los péptidos. Las células NK-92(CD3) modificadas para expresar TcR de Radio-1 exhibieron activación en presencia del péptido TGFbRII, y las células que expresan TcR de DMF-5 exhibieron activación en presencia de MART-1. No se observó ninguna activación no específica.

También se realizó un experimento similar para determinar la EC⁵⁰para cada TcR. Las células NK-92 (CD3) modificadas para expresar los TcR de Radio-1 (círculos) y DMF-5 (cuadrados) se incubaron con células T2 en presencia de los péptidos TGFbRII o MART-1 respectivamente en un intervalo de diferentes concentraciones de péptido. La activación se midió detectando la expresión de CD107a como se describe anteriormente. Se midió la expresión de CD107a en cada concentración y se calculó la activación relativa (CD107a como porcentaje de la expresión máxima de CD107a). Se calcularon los valores de EC⁵⁰de 2 nM (Radio-1) y 7 nM (DMF-5) (Figura 6).

Ejemplo 5.

Señalización mediada por TcR/CD3 en células NK-92 (CD3)

Las células NK-92 (CD3) transfectadas con TcR de Radio-1 se analizaron usando citometría de flujo Fosfo para investigar su capacidad de señalización. Inicialmente, se analizó la capacidad de señalización general del complejo TCR estimulando las células con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, lo que simula la activación a través del TCR. Como se muestra en la figura 7, la agrupación de TcR y CD3 conduce a la activación de una cascada de señalización similar a la observada en las células T. Esto se muestra por los mayores niveles de fosforilación de varias proteínas relacionadas con TcR/CD3, incluidas ZAP-70, SLP-76 y CD3Z.

A continuación, se analizó la estimulación de las células por antígenos específicos, usando células presentadoras de antígenos y controlando la actividad de señalización de los complejos TCR en diferentes momentos mediante citometría de flujo Fosfo. Tanto NK-92(CD3)-Radio-1 como NK-92(CD3)-DMF-5 fueron estimulados con sus péptidos afines. Como se muestra en la figura 8, solo la estimulación específica condujo a la fosforilación de la molécula de señalización. Se pudieron distinguir señales tempranas y tardías, y el patrón fue similar al observado en las células T. En conjunto, estos datos demuestran que NK-92 (CD3-TCR) reacciona como las células T cuando entra en contacto con su sustrato.

Ejemplo 6.

Estimulación de células NK-92 (CD3) por TcR derivados de células T CD4+

Los TcR de Radio 5 y Radio 6 derivados de células T CD4+ se transdujeron en células NK-92 (CD3). Estos TcR fueron capaces de redirigir las células específicamente contra las dianas peptídicas del MHC de clase II. Tanto el Radio-5 como el Radio-6 se dirigen específicamente a un péptido mutante de TGFbRII marco de lectura (KSLVRLSSCVPVALMSAMT); Radio-5 se dirige a este péptido específicamente en el contexto de HLA-DR7, Radio-6 en el contexto de HLA-DR4. La cinética de la estimulación de las células NK-92(CD3)-Radio-5/6 se muestra en la Figura 9. La estimulación de las células NK-92(CD3) se mide como en el ejemplo 4 anterior. Se calcularon los valores de EC⁵⁰para ambos TcR, como se muestra en la figura 9. La EC⁵⁰de Radio-5 en una muestra de paciente con haplotipo HLA-DR7 se calculó como 19 pM; La EC⁵⁰de Radio-6 se calculó como 4 pM en una muestra de paciente y 0.4 |iM en una segunda. Ambas muestras de pacientes eran del haplotipo HLA-DR4.

Ejemplo 7.

Análisis de la expresión de la proteína NK-92 con y sin expresión de CD3/CD3-TcR

Los perfiles de expresión de proteínas de las células NK-92 se compararon con los de las células NK-92 (CD3/CD3-TcR). No se observaron cambios entre los dos grupos de células (salvo, por supuesto, la presencia de CD3 en las células NK-92 (CD3/CD3-TcR). La comparación se muestra en la siguiente tabla (PBMC = células mononucleares de sangre periférica).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula NK modificada para expresar las cadenas CD3 CD3y, CD38, CD3e y CD3Z, y un TcR,

en la que un complejo CD3-TcR funcional se localiza en la superficie de la célula NK.

2. La célula de la reivindicación 1, en la que dicho TcR es independiente de CD8 y/o CD4.

3. La célula de la reivindicación 1 o 2, en la que dicha célula es una célula NK-92.

4. La célula de la reivindicación 1 o 2, en la que dicha célula es una célula NK primaria.

5. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la célula se modifica para que sea no inmunogénica.

6. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha célula es:

i) humana y HLA negativa;

ii) modificada para interrumpir o prevenir la expresión de microglobulina p²; o

iii) irradiada.

7. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en terapia.

8. La célula para su uso según la reivindicación 7, en la que dicha terapia es una terapia de transferencia celular adoptiva.

9. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en el tratamiento del cáncer.

10. Una composición terapéutica que comprende una célula NK modificada como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y al menos un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. Un método de preparación de una célula NK modificada para su uso terapéutico, comprendiendo dicho método: (a) proporcionar una célula NK que exprese las cadenas CD3 CD3y, CD38, CD3e y CD3Z;

(b) determinar el tipo de MHC de un sujeto que se va a tratar;

(c) identificar un antígeno diana en el sujeto, cuyo antígeno es expresado o presentado por las células en el sujeto; (d) modificar la célula de la etapa (a) para expresar un TcR que tenga especificidad por el antígeno diana y coincida con el tipo de MHC del sujeto, de modo que se localice un complejo CD3-TcR funcional en la superficie de la célula; preferiblemente en el que el TcR es específico para un antígeno canceroso.

12. El método de la reivindicación 11, en el que la célula NK es una célula NK primaria.

13. Un kit para su uso en terapia de transferencia celular adoptiva, comprendiendo dicho kit:

(b) un panel de moléculas de ácido nucleico, cada una de las cuales codifica un TcR, en el que los TcR tienen una especificidad de antígeno diferente y/o una especificidad de MHC diferente, preferiblemente en el que dichas moléculas de ácido nucleico están contenidas en vectores, preferiblemente vectores virales.

14. El kit para su uso según la reivindicación 13, en el que dicha célula NK es:

i) humana y HLA negativa;

iii) irradiada.

15. El kit para su uso según la reivindicación 13 o 14, en el que la célula NK es una célula NK primaria.