JP6977969B2

JP6977969B2 - 免疫細胞提供システム

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Publication number: JP6977969B2
Application number: JP2019054249A
Authority: JP
Inventors: 結原田; 吉和米満; 和幸倉森
Original assignee: Gaia Biomedicine Inc
Current assignee: Gaia Biomedicine Inc
Priority date: 2019-03-22
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2021-12-08
Anticipated expiration: 2039-03-22
Also published as: EP3943932A1; JP2020153889A; WO2020196297A1; AU2020248768A1; KR20210148197A; EP3943932A4; CN113728231A; US20220184122A1

Description

本発明は、レシピエントに免疫細胞を迅速に提供するシステムに関する。

体内で生じたがん細胞は免疫により排除されるが、何らかの原因で排除しきれなかったがん細胞が増殖し、やがてがんを発症する。がんの治療方法としては、手術、抗がん剤（化学療法）、放射線治療が一般的であるが、最近では免疫療法が注目されている。免疫療法は、免疫の力を利用してがんを治療しようとする方法であり、様々な治療法を含んだ概念である。細胞療法（細胞免疫療法）は、免疫療法の一種であり、免疫細胞を体外で活性化し、あるいは増殖して、患者に移植する方法である。免疫で中心的な役割を果たすのは、血液中の単球、好中球、好酸球、好塩基球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラル・キラー・ティー（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞であり、これらを総称し、免疫細胞と呼ぶ。

これらのうち、細胞療法として最も検討が進んでいるのは、体外での増殖が比較的容易なＴ細胞を用いる療法に関してである。Ｔ細胞を用いる細胞療法の一つ、ＴＩＬ（Tumor Infiltrating Lymphocyte：腫瘍浸潤リンパ球）療法は、外科手術で切除した患者のがん組織中または患者から採取した胸腹水中から分離したリンパ球を体外で大量培養し、患者へ移植するものである。メラノーマで多くの患者に有効であったことが報告され、子宮頸がん、肺がん等への適用が期待されている。

Ｔ細胞は、特定の抗原を認識して攻撃する能力を有する。したがって、Ｔ細胞を用いる療法は、治療しようとする患者のがんに特異的に反応しうるＴ細胞を用いる。すなわち、Ｔ細胞療法は、個別化治療となり、汎用性に乏しい。

また、患者に細胞を移植しようとするときには、拒絶反応が起こらないように、患者自身から採取した細胞を用いることがまず検討される。しかし、患者の状態によっては治療に必要な量の細胞の採取が難しいことがある。また体外で活性化し、増殖できる程度には個人差があり、活性化や増殖が困難なケースが存在する。加えて、細胞の活性化・増殖には一定期間を要するため、直ちに治療が開始できないという問題がある。この点、拒絶反応の起きにくい他人のｉＰＳ細胞から分化・増殖させた免疫細胞を用いることも提案されているが、ｉＰＳ細胞に関しては、作成の際の外来遺伝子の導入、分化誘導後のがん化のリスク低減に対応する必要がある。

本発明者らは、上記の課題を解決するものとして、下記の発明を提案する。
［１］以下の工程を含む、ドナー（非レシピエント）からの免疫細胞をレシピエントに提供するシステム：
ドナーから採取した免疫細胞を投与に適した単位毎に製剤化する工程；
製剤の評価試験を行う工程；
製剤を冷蔵または冷凍し、ドナーの免疫型情報とともに、在庫化する工程；
ドナーの免疫型情報とレシピエントの免疫型情報とに基づき、評価試験済の在庫製剤からレシピエントに適した製剤を選択するかまたは一の選択した評価試験済の在庫製剤に適したレシピエントを特定する工程。
［２］製剤化する工程の前に、ドナーから採取した免疫細胞を増殖および／または活性化する工程を含む、１に記載のシステム。
［３］製剤化する工程が、一単位の免疫細胞を樹脂製のバッグに格納することにより実施される、１または２に記載の製造方法。
［４］一単位が、１．０ｘ１０⁷〜１．０ｘ１０¹⁰ｃｅｌｌｓである、１〜３のいずれか１項に記載のシステム。
［５］評価試験が、無菌試験を含む、１〜４のいずれか１項に記載のシステム。
［６］評価試験が、細胞の性能を評価する試験を含む、１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
［７］点滴静脈内注射に適した形態とする工程が、製剤を等張液で希釈することにより実施される、１〜６のいずれか１項に記載のシステム。
［８］免疫細胞がＮＫ細胞であり、レシピエントががん患者である、１〜７のいずれか１項に記載のシステム。
［９］ドナーが健常者である、１〜８のいずれか１項に記載のシステム。
［１０］増殖および／または活性化する工程が、複数のドナーから採取した免疫細胞を混合して、増殖および／または活性化するものである、２に記載のシステム。

血液に含まれる免疫細胞の種類血液からの免疫細胞の採取方法の例の概略図本発明のシステムの例の概略図。Ｄはドナー、Ｒはレシピエントを表す。

本発明は、以下の工程を含む、ドナー（非レシピエント）からの免疫細胞をレシピエントに提供するシステムを提供する。
ドナーから採取した免疫細胞を投与に適した単位毎に製剤化する工程；
製剤の評価試験を行う工程；
製剤を冷蔵または冷凍し、ドナーの免疫型情報とともに、在庫化する工程；
ドナーの免疫型情報とレシピエントの免疫型情報とに基づき、評価試験済の在庫製剤からレシピエントに適した製剤を選択するかまたは一の選択した評価試験済の在庫製剤に適したレシピエントを特定する工程；
選択した製剤を、点滴静脈内注射に適した形態とする工程。

［製剤化］
本発明では、ドナーから採取した免疫細胞は、投与に適した単位毎に製剤化される。
本発明は、免疫細胞が予めドナーから採取されており、免疫療法の対象となる患者本人から採取されるのではないことを特徴とする。すなわち、本発明では、ドナーは、レシピエントではない（非レシピエント）。ドナーは健常者であることが好ましく、レシピエントはがん患者であることがある。

また本発明は、ドナーから「採取した」細胞を用いることを特徴とする。「採取した」細胞とは、遺伝的な改変を伴わずに得た細胞をいい、遺伝子操作を経た細胞、例えばｉＰＳ細胞を除く趣旨である。

従来より免疫細胞療法での利用が検討されている細胞として、好中球、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞を挙げることができる（図１参照）が、本発明の好ましい態様においては、免疫細胞として、ＮＫ細胞が用いられる。ＮＫ細胞は、正常細胞と異常細胞を見分ける能力があり、がん細胞やウイルス感染細胞等の異常な細胞を攻撃できる。この点、抗原特異的に特定の細胞を認識するＴ細胞より、攻撃できる対象が広範にわたる。

免疫細胞は、末梢血、臍帯血、骨髄および／またはリンパ節から採取される血液細胞等から遠心分離または濾過分離により単核球を得て、得られた単核球から不要な細胞を除去することにより得ることができる。本発明の特に好ましい態様においては、単核球を得る原料は末梢血であり、末梢血はアフェレーシス法により採取されたものであってもよい。また末梢血は、新鮮なものであってもよく、凍結保存されたものであってもよい（図２参照）。

免疫細胞は、冷蔵または冷凍保存に適した液に懸濁され、製剤化される。一製剤中に含まれる免疫細胞の数は、投与に適した数とすることが好ましい。例えば、１回の細胞療法で投与される細胞数を一単位とし、その１／３倍量、１／２倍量、１倍量を、一製剤とすることができる。一単位は、例えば１．０ｘ１０⁷ｃｅｌｌｓ以上であり、５．０ｘ１０⁷ｃｅｌｌｓ以上としてもよく、１．０ｘ１０⁸ｃｅｌｌｓ以上としてもよい。上限値はいずれの場合であっても１．０ｘ１０¹⁰ｃｅｌｌｓ以下とすることができ、５．０ｘ１０⁹ｃｅｌｌｓ以下としてもよく、１．０ｘ１０⁹ｃｅｌｌｓ以下としてもよい。

免疫細胞を懸濁するための液（懸濁媒）は、等張液であってもよく、高張液であってもよい。製剤を冷凍保存する場合には、無機塩類、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、ポビドンヨード、またはトレハロース等の細胞保護剤を含む高張液を用いることが好ましい。等張液とは、浸透圧が血漿の浸透圧（285±5 mOsm/L）にほぼ等しい液をいう。高張液とは、浸透圧が、血漿の浸透圧より高い液をいう。細胞保護剤を含む高張液に細胞を懸濁した場合には、懸濁後１５分以内に凍結処理を開始することが好ましい。なお高張液を用いた場合、製剤の点滴静脈内投与（後述する）に際しては、浸透圧を下げるための希釈が行われる。

製剤化は、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則に適合した条件（good manufacturing practice、ＧＭＰ）及び再生医療等製品の製造管理及び品質管理の基準（Good Gene, Cellular, and Tissue-based Products Manufacturing Practice、ＧＣＴＰ）で実施されることが好ましい。

［増殖および／または活性化］
本発明の好ましい態様においては、製剤化工程の前に、免疫細胞を増殖および／または活性化する工程が実施される。特に好ましい態様においては、免疫細胞は増殖および活性化される。なお、「増殖および／または活性化する」とは、増殖と活性化のうち、少なくとも一方を実施することを指す。

免疫細胞の増殖および／または活性化は、例えば、適した培地を用い、３７℃、５％ＣＯ₂及び飽和水蒸気雰囲気下でインキュベートすることによる。増殖期間が長いほどより多くの免疫細胞が得られるので有利である。増殖期間は、特に限定されないが、例えば、７〜２８日間行うことができ、１０〜１８日間としてもよく、１２〜１６日間、例えば１４日としてもよい。

ＮＫ細胞に関し、増殖および活性化するために有効な条件は、ＮＫ細胞の増殖に適した培地を用いることを含む。そのような培地の例は、ＫＢＭ５０１培地（コージンバイオ株式会社）、ＣｅｌｌＧｒｏＳＣＧＭ培地（セルジェニックス、岩井化学薬品株式会社）、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地（ロンザ、タカラバイオ株式会社）、ＩＭＤＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０等を含むが、これらに限定されない。培地には、インターロイキン２（ＩＬ−２）が、本発明の目的を達成できる濃度で添加される場合がある。ＩＬ−２の濃度は、２０００ＩＵ／ｍＬを超える場合があり、２５００〜２８１３ＩＵ／ｍＬの場合がある。ＩＬ−２は、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えＤＮＡ技術で生産されることが好ましい。ＩＬ−２の濃度は、国内標準単位（ＪＲＵ）及び国際単位（ＩＵ）で示される場合がある。１ＩＵが約０．６２２ＪＲＵであるから、１７５０ＪＲＵ／ｍＬは約２８１３ＩＵ／ｍＬである。培地には、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社その他から入手可能なヒトＡＢ型血清や、日本赤十字社から入手可能な献血ヒト血清アルブミンが添加される場合がある。ヒトＡＢ型血清は１〜１０％の濃度で添加されることが好ましく、献血ヒト血清アルブミンは１〜１０％の濃度で添加されることが好ましい。また、培地には血清に替えて又は血清とともに、免疫細胞の増殖のために配合された組成物が添加される場合がある。このような組成物は市販されている。例えばUltraGroシリーズ（AventaCell社）、CTS Immune Cell SR（Thermo Fisher Scientific社）を本発明のためにも用いることができる。培地には、ＮＫ細胞の増殖効果を損なわないことを条件として、適切なタンパク質、サイトカイン、抗体、化合物その他の成分が含まれる場合がある。サイトカインは、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及び／又は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）の場合がある。ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＳＣＦ及びＦｌｔ３Ｌは、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えＤＮＡ技術で生産されることが好ましい。

ＮＫ細胞を増殖および／または活性化する際、複数のドナーから採取した細胞材料を混合してもよい。本発明者らの検討によると、ＮＫ細胞の場合、複数のドナーから採取したものを混合することにより、増殖がよくなることが分かっている。

免疫細胞を増殖および／または活性化するための容器は、商業的に入手可能なディッシュ、フラスコ、プレート、マルチウェルプレート、バッグを含むが、これらに限定されない。多くの細胞が増殖でき、取り扱いが容易である容器を用いることが好ましい。このような容器の例として、高いガス透過性を有した素材からなる細胞増殖用バッグが挙げられる。

バッグを用いる場合、増殖および／または活性化の期間中に上下を反転しながら用いることが好ましい。免疫細胞の一部には容器底面への接着がみられる。一般に、接着性の細胞の場合、容積当たりの細胞数とともに、容器内の細胞が接着可能な単位面積当たりの細胞数が、増殖効率に大きく影響する。免疫細胞の増殖および／または活性化の期間中にバッグを反転させることで、それまで上側であったために細胞の接着が比較的少なかった面も有効に利用され、増殖をより効率的に行うことができる。

［在庫化］
製剤化された免疫細胞は、冷蔵（例えば４℃）または冷凍（例えば約−１９６℃）され、ドナーの免疫型情報とともに在庫化される。冷蔵または冷凍のための設備は、血液製剤の冷蔵・冷凍のための設備等、似た目的に使用される従来の設備を利用することができる。

免疫型情報とは、ＡＢＯ式血液型、ＲＨ式血液型、ＨＬＡ型、ＫＩＲ型等の、免疫に関連した情報を指す。免疫型情報は、後述する在庫製剤の選択等のために利用される。あるドナーから得た免疫細胞を含む製剤と、同じドナーから得た免疫型情報が対応するように在庫化する。例えばドナーごとに固有の番号を付与し、製剤と免疫型情報との双方に、当該番号を付与することにより、対応づけられる。免疫型情報および当該番号は、文書化または電子化することができる。また、在庫化する製剤に付随させる情報には、後述する評価試験の結果を含めてもよい。

［評価試験］
本発明においては、製剤について、細胞製剤としての評価試験が行われる。評価試験は、在庫化のための処理と併行して行うことができる。

評価試験には、安全性試験と性能試験（細胞の性能を評価する試験）が含まれる。安全性試験には、無菌試験、エンドトキシン試験、マイコプラズマ否定試験、ウイルス否定試験が含まれる。評価試験のうち、医薬品としての品質保証上必須のものは、後述するレシピエントに適した製剤を選択するかまたは一の選択した評価試験済の在庫製剤に適したレシピエントを特定する工程の前に、終了しておくことが好ましい。特に、長い試験期間を要する無菌試験を終了させておくことが好ましい。これにより、レシピエントへの免疫細胞の迅速な提供が担保されるからである。

性能試験には、細胞傷害活性試験が含まれる。細胞傷害活性とは、特に記載した場合を除き、対象となる免疫細胞（エフェクター細胞、Ｅ）の標的細胞（Ｔ）に対する傷害能を指す。細胞傷害活性は、エフェクター細胞により死に至った標的細胞の百分率（％）で表すことができ、例えば次式により求められる。

（エフェクター細胞と共培養した場合の細胞死−自然細胞死(陰性コントロール)）／（最大細胞死(陽性コントロール)−自然細胞死(陰性コントロール)）×１００

細胞傷害活性の測定に際しては、一般的には、エフェクター細胞の細胞傷害活性の程度等に応じ、エフェクター細胞と標的細胞の混合比（Ｅ：Ｔ）、エフェクター細胞と標的細胞の共培養の時間は、用いる細胞の種類や活性の強さに応じて適宜とすることができる。ＮＫ細胞をエフェクター細胞とするとき、標的細胞は、Ｋ５６２細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞の場合があるが、これらに限定されない。

エフェクター細胞と標的細胞、生細胞と死細胞は、放射性物質、蛍光色素等で標識した抗体等の試薬により、区別し、また定量することができる。ＮＫ細胞をエフェクター細胞とするときの細胞傷害活性は、例えばＫ５６２細胞を標的細胞とし、Ｅ：Ｔ＝１：０．０５〜１０、好ましくは１：０．１〜５とし、インキュベート時間を０．５〜１８時間、好ましくは１〜１２時間の条件で測定することができる。

ＮＫ細胞の場合、標的細胞をＫ５６２細胞とし、Ｅ：Ｔ＝１：１で混合し、１〜３時間、より特定すると２時間、共培養した場合の細胞傷害活性が５０％以上であり、６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましい。

［在庫製剤の選択、等］
本発明においては、評価試験済在庫製剤の中から、ドナーの免疫型情報とレシピエントの免疫型情報とに基づき、レシピエントに適した製剤が選択される。あるいは、一の選択した評価試験済在庫製剤に適したレシピエントが特定される。

免疫型情報に基づく選択は、様々な事情を考慮して行うことができる。例えば、在庫製剤に付随するドナーのＨＬＡ型情報とレシピエントのＨＬＡ型情報を照合し、適合度（あらかじめ評価しておく）が高い在庫製剤を選択するか、または在庫製剤に対する適合度が高いドナーを特定することができる。

ＮＫ細胞の場合、ＫＩＲリガンドミスマッチに基づいた選択は、ＮＫ細胞の同種抗原反応性により、再発、ＧｖＨＤ（Graft-versus-Host Disease：移植片対宿主病）、予後に関してより良い結果をもたらす可能性がある。例えば、血液がんに対する骨髄移植時にはＫＩＲリガンドミスマッチが多い場合に予後が良好であることが知られる（Symons HJ, et al. Biol Blood Marrow Transplant. 2010）。対象が固形腫瘍であった場合にも同様の現象が報告されている（Leung W, et al. Br J Cancer. 2007）。日本人の８６％を占めるＨＬＡ−Ｃ１／Ｃ１に対して高い効果の期待できる免疫型の在庫を備えること、あるいはバリエーションに富んだ免疫型の在庫を揃えることで、迅速性のみならず、汎用性が高まると考えられる。

［点滴静脈内注射剤化］
本発明においては、選択した製剤は、レシピエントへの点滴静脈内注射に適した形態とすることができる。これは、通常、製剤を等張液等の経静脈内投与に適した液体で希釈することにより実施される。このような液は、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ラクトリンゲル液、Plasma-Lyte等を含む。医薬組成物又は溶液はまた、薬学的に許容される添加剤を含んでいてもよい。

注射剤化する際に、免疫細胞がＮＫ細胞である場合は、抗体を加えてもよい。抗体医薬品の多くは静脈内投与後、ＡＤＣＣ（Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity：抗体依存性細胞傷害）活性による抗腫瘍効果を示すとされる。その一方で、ＡＤＣＣ活性を発揮する際にはＮＫ細胞の他に単球／マクロファージや好中球も動員される。そしてＮＫ細胞以外のエフェクターは、正常細胞とがん細胞とを区別せずにＡＤＣＣ活性を示し、それは副作用の発現にもつながっていると考えられる。本発明においては、ＮＫ細胞と抗体とを、投与前に混合し、ＮＫ細胞に予め抗体を装備させてもよい。これによりエフェクターがＮＫ細胞に限定され、投与する抗体の量を減じることができ、また副作用の低減にも極めて有効であると考えられる。

［本発明のシステムの利点］
本発明のシステムの例の概略図を、図３に示した。本発明のシステムは、免疫細胞を在庫化することで、レシピエントに免疫細胞を迅速に提供することができる。本発明のシステムは汎用性も備える。本発明のシステムは、ＮＫ細胞を含む製剤の提供のために、特に適している。

従来のＴ細胞療法は、個別化治療となり、汎用性に乏しい。Ｔ細胞は、自己ＨＬＡ（Human Leukocyte Antigen：ヒト白血球抗原）上の特定の抗原を認識して攻撃する能力を有するため、従来のＴ細胞を用いる療法は、治療しようとする患者のがんに特異的に反応しうるＴ細胞を用いる。また、自己ＨＬＡ上の抗原ではなく細胞膜上の特定抗原を認識して攻撃する能力を有するＣＡＲ−Ｔ細胞を用いる場合には、ＧｖＨＤ抑止のために原則として自己のＴ細胞を用いる。この打開策として、ＣＡＲの導入に加えてＨＬＡやＴＣＲ（T Cell Receptor：Ｔ細胞受容体。Ｔ細胞は、ＴＣＲを介して抗原を認識する。）といった遺伝子を改変、あるいは除去する操作を加える手法が開発中であるが、いずれも実用化に至っていない。

本発明により提供されるシステムは、レシピエントに迅速に免疫細胞を提供することができるので、医療等の分野で利用可能性がある。免疫細胞を迅速に提供できることは、生命予後が不良であり比較的緊急性の高い悪性腫瘍患者に対して、極めて有用であると考えられる。

Claims

以下の工程を含む、ドナー（非レシピエント）からのＮＫ細胞を、細胞療法のために、レシピエントに提供する方法：
ドナーから採取したＮＫ細胞を増殖および活性化し、投与に適した単位毎に製剤化する工程；
製剤を冷蔵または冷凍し、ドナーの免疫型情報とともに、在庫化する工程であって、このとき一単位が、１．０ｘ１０⁷〜１．０ｘ１０¹⁰ｃｅｌｌｓである、工程；
在庫化する工程と並行して製剤について評価試験を行う工程であって、このとき評価試験が、無菌試験を含む、工程；
ドナーの免疫型情報とレシピエントの免疫型情報とに基づき、無菌試験済の在庫製剤からレシピエントに適した製剤を選択するかまたは一の選択した無菌試験済の在庫製剤に適したレシピエントを特定する工程。
製剤化する工程が、ドナーから採取したＮＫ細胞を増殖および活性化した細胞の一単位を樹脂製のバッグに格納することにより実施される、請求項１に記載の方法。
評価試験が、細胞の性能を評価する試験を含む、請求項１または２に記載の方法。
製剤を点滴静脈内注射に適した形態とする工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
レシピエントががん患者である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
ドナーが健常者である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
増殖および活性化する工程が、複数のドナーから採取したＮＫ細胞を混合して、増殖および活性化するものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。