JP6779616B2 - Ｎｋｔ細胞活性化医薬組成物、その製造方法、及び抗原提示細胞の保存方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＮＫＴ細胞活性化医薬組成物、その製造方法、及び抗原提示細胞の保存方法
に関する。

悪性腫瘍等の効果的な治療法として、対象体内のナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を活性化させる免疫療法が知られている。ＮＫＴ細胞は抗腫瘍活性を有する。ＮＫＴ細胞は、αガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）により増殖され、活性化されることが知られている。ＮＫＴ細胞を活性化する方法として、αＧａｌＣｅｒを提示した対象由来の樹状細胞（抗原提示細胞）を含む細胞製剤を対象に投与する方法が用いられている（非特許文献１）。

このような細胞製剤では、それに含まれる抗原提示細胞を保存できる期間が短い。一方で、対象の状態によっては、細胞製剤の使用の時期を遅らせることが望ましい場合もある。しかしながら、一度調製を始めてしまうと対象の様態によって投与する日を大きく変更することができない。また、保存期間が短いため搬送ができない。そのため、当該細胞製剤は、そこに含まれる抗原提示細胞が、生存率の高い状態で投与されることができるよう、対象への投与が行われる施設内で培養、調製された後、可及的速やかに対象に投与されている。

Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｅ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、１１７，２６５−２７３（２００５）

本発明は、改善された保存期間を有するＮＫＴ細胞活性化医薬組成物、その製造方法、及び抗原提示細胞の保存方法を提供することを目的とする。

実施形態に従うＮＫＴ細胞活性化医薬組成物は、その表面にＣＤ１ｄ分子を発現しており、前記ＣＤ１ｄ分子にαガラクトシルセラミドが結合している、活性成分としての樹状細胞、及び総体積に対して４０体積／体積％以上の濃度の血漿を生理的溶液中に含む。

本発明の実施形態によれば、ＮＫＴ細胞を活性化するための医薬組成物内の抗原提示細胞の保存期間を改善することが可能である。

実施形態の抗原提示細胞の一例を示す模式図である。 実施形態の医薬組成物の製造方法の例を示すフローチャートである。 実施形態の医薬組成物の製造方法の例を示すフローチャートである。 実施形態の抗原提示細胞の保存方法の例を示すフローチャートである。 実施形態の例１における結果を示す図である。 実施形態の例７の結果を示すグラフである。

以下、実施の形態について図面を参照して説明する。

１．ＮＫＴ細胞を活性化するための医薬組成物
実施形態に従う医薬組成物の一例は、活性成分として、その表面にＣＤ１ｄ分子を発現しており、前記ＣＤ１ｄ分子にαガラクトシルセラミド（以下「αＧａｌＣｅｒ」と記す）が結合している樹状細胞、及び総体積に対して４０体積／体積％以上の濃度の血漿を生理的溶液中に含む。表面にＣＤ１ｄ分子を発現しており、前記ＣＤ１ｄ分子にαＧａｌＣｅｒが結合している樹状細胞を以下抗原提示細胞と称する。

抗原提示細胞は、単核球由来の樹状細胞上に発現しているＣＤ１ｄ分子を介してαＧａｌＣｅｒを提示している。このような構造によって、抗原提示細胞は、それが投与された対象の体内に、αＧａｌＣｅｒをリガンドとして提示することによってＮＫＴ細胞を直接活性化する。ＮＫＴ細胞の受容体にαＧａｌＣｅｒが結合すると、ＮＫＴ細胞が活性化され、活性化したＮＫＴ細胞は直接的に腫瘍細胞を攻撃すると同時に、ＩＦＮ−γなどの産生を引き起こす。生じたＩＦＮ−γは、ＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞を共に活性化し、これらがそれぞれに悪性腫瘍細胞を間接的に攻撃する。また、αＧａｌＣｅｒを担持する樹状細胞が、活性化されたＮＫＴ細胞からのＣＤ４０Ｌの刺激により成熟し、その結果、ＣＤ８Ｔ細胞を活性化する。このような作用機序により、実施形態に従う医薬組成物は、悪性腫瘍の治療において効果を奏する。

悪性腫瘍の例は、皮膚癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌、食道癌、胆管癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、腎癌、膵癌、頭頸部癌、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、精巣腫瘍、小児がん、悪性リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、白血病、骨・軟部腫瘍、又はこれらの何れかの組み合わせなどであり得る。

対象は、例えば、マウス及びラット等の齧歯類、ウサギ、イヌ及びネコ等の伴侶動物、ウマ及びウシ等の家畜、サル及びヒト等の霊長類等の何れかの哺乳動物であり得る。

従来技術では、抗原提示細胞を、アルブミンを添加した生理食塩水に懸濁し、対象に投与する方法が一般的である。このような懸濁液中においては、３日以上に亘り、４５％以上の抗原提示細胞の生存率を確保することは非常に難しい。実施形態に従うＮＫＴ細胞活性化医薬組成物によれば、４５％以上の生存率を維持したままで、抗原提示細胞を従来よりも長い期間、例えば、製造後の約８日に亘り保存でき、そのうちの約２４時間までに当該医薬組成物の製造地から対象に投与される場所までの搬送にあてることも可能である。

２．ＮＫＴ細胞を活性化するための医薬組成物に含まれる成分
（１）抗原提示細胞
実施形態に従う医薬組成物は、ＮＫＴ細胞を活性化するための組成物であり、活性成分として抗原提示細胞を含む。図１に示されるように、抗原提示細胞１は、樹状細胞２の表面のＣＤ１ｄ分子３にαＧａｌＣｅｒ４が結合しているものをいう。

樹状細胞は、その表面にＣＤ１ｄ分子を発現している樹状細胞であり得る。それは、生体外で分化した樹状細胞であってもよいし、生体内で分化した樹状細胞であってもよい。生体外で分化した樹状細胞は、単核球起源の樹状細胞であり得る。単核球は、例えば末梢血単核球である。生体内で分化した樹状細胞は、例えば、対象から採取した骨髄系樹状細胞、組織由来樹状細胞、又はこれらの何れかの組み合わせなどであり得る。例えば、抗原提示細胞は、医薬組成物中に１．０×１０^７個／ｍＬ〜２．５×１０^７個／ｍＬの濃度で存在し得る。

（２）生理的溶液
ＮＫＴ細胞を活性化するための医薬組成物において、抗原提示細胞は、生理的溶液中に含まれる。生理的溶液は、当該医薬組成物に含まれる成分を維持し、且つそこに含まれる成分を生体に運び入れるための担体である。生理的溶液の例は、生理食塩水、生理的緩衝液、電解質液、糖質液などであり得る。生理的溶液は、ｐＨ値が３．５〜８．０であり、生体毒性及び刺激性のないものが好ましい。

生理的溶液には、活性成分としての抗原提示細胞と、この抗原提示細胞を保存するための成分として、総体積に対して４０体積／体積％以上の濃度の血漿を含み得る。血漿は、医薬組成物中の総体積に対して約４０体積／体積％以上、約４５体積／体積％以上で、例えば、４０体積／体積％〜６０体積／体積％、４５体積／体積％〜５５体積／体積％、又は４５体積／体積％〜６０体積／体積％で含まれ得る。血漿が生理的溶液にこのような濃度で含まれることにより、抗原提示細胞の生存率が高く維持され、保存期間が改善される。

従って、４０体積／体積％以上の濃度の血漿を含む生理的溶液は、当該医薬組成物に含まれる成分の担体であると同時に、当該抗原提示細胞を長期に亘って保存することを可能とする保存液の役割も担っている。以下、４０体積／体積％以上の濃度の血漿を含む生理的溶液を「保存液」と称する。

血漿は、自家血漿であっても他家血漿であってもよい。自家血漿は、当該医薬組成物を投与する対象由来の血漿である。他家血漿は、当該医薬組成物を投与する対象以外の哺乳類由来の血漿であり得る。

（３）保存のための他の成分
前記保存液は、抗原提示細胞を保存するための成分として、さらに、共通ガンマ鎖を含む受容体を介してシグナル伝達するサイトカイン（以下「サイトカイン」と称する）、及び／またはインスリンを含み得る。更に、医薬組成物は、保存液中のタンパク質を安定して保持する成分として、アルブミンを含み得る。

サイトカインは、その受容体が共通ガンマ鎖（Ｃｏｍｍｏｎ Ｇａｍｍａ Ｃｈａｉｎ、γｃ、ＣＤ１３２）を含むことを特徴とする。前記受容体は、ガンマ鎖の他にα鎖、又はβ鎖などを含み得る。前記受容体は、例えば、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１５受容体などであり得る。サイトカインは、抗原提示細胞の生存率を長時間高く維持することを可能とする。サイトカインは、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５などであり得る。これらは、単独で、または混合して用いられ得る。前記サイトカインの医薬組成物中の濃度は、例えば１ＪＲＵ／ｍＬ〜１０００ＪＲＵ／ｍＬであり得る。

インスリンは、成長因子の１種であり、抗原提示細胞の状態を安定させて維持することが可能な成長因子である。そのような特徴を有する成長因子であれば、インスリンに限らず他の種類の成分をインスリンに代えて、一部分に代えて、又はインスリンと混合して使用することが可能である。インスリンの医薬組成物中の濃度は、０．０１４２Ｕ／ｍＬ〜０．１４２Ｕ／ｍＬであり得る。

前記他の種類の成分は、例えば、抗原提示細胞の状態を安定化させて維持することが可能な範囲の変異を有するインスリン類似体などであり得る。

アルブミンは、当該医薬組成物がヒトに投与される場合ヒトアルブミンであり得る。当該医薬組成物がヒト以外の哺乳類に投与される場合、当該哺乳類の動物種に合せて選択され得る。アルブミンの当該医薬組成物中の濃度は、５％〜１０％であり得る。

（４）その他の成分
ＮＫＴ細胞を活性化するための医薬組成物は、（２）〜（４）で記載した成分の他に、各成分の活性に影響を及ぼさない溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、安定剤、無痛化剤、又はこれらの何れかの組み合わせを含み得る。

上記のように調製されたＮＫＴ細胞活性化医薬組成物は、対象に投与されて使用され得る。投与経路は、例えば、皮内、皮下、筋肉内、動脈内、静脈内、腫瘍内、粘膜内、粘膜下、腹腔内、又はこれらの何れかの組み合わせなどであり得る。投与形態は、例えば、注射、又は点滴であり得る。

ＮＫＴ細胞活性化医薬組成物は、その有効量を一度に対象に投与され得る。ここで有効量は、ＮＫＴ細胞活性化医薬組成物が投与される対象の年齢、身長、体重、性別、悪性腫瘍の進行度などによって選択され得る。

また、図４のように単核球を２分して培養し、第１及び第２のＮＫＴ細胞活性化医薬組成物を投与する場合、第１のＮＫＴ細胞活性化医薬組成物が対象に投与された後、３日〜７日後に、第２のＮＫＴ細胞活性化医薬組成物が前記対象に投与されることが好ましい。

３．ＮＫＴ細胞活性化医薬組成物の製造方法
実施形態に従うと、ＮＫＴ細胞を活性化するための医薬組成物の製造方法が提供される。製造方法は、図２に示すように次の（ａ）〜（ｃ）の工程を含み得る；
（ａ）単核球を分化させ、表面にＣＤ１ｄ分子を発現する樹状細胞を得ること、
（ｂ）（ａ）で得られた樹状細胞にαＧａｌＣｅｒを結合させて、抗原提示細胞を得ること、及び
（ｃ）（ｂ）で得られた抗原提示細胞を総体積に対して４０体積／体積％以上の濃度の前記血漿を含む保存液に含ませてＮＫＴ細胞活性化医薬組成物を得ること。

以下に、このようなＮＫＴ細胞活性化医薬組成物の製造方法について更に説明する。

（ａ）単核球の、表面にＣＤ１ｄ分子を発現する樹状細胞への分化
単核球の、表面にＣＤ１ｄ分子を発現する樹状細胞への分化は、例えば、単核球を単核球が樹状細胞へ分化する成分を含んだ培地で培養することにより行われ得る。前記培地は、例えば、前記サイトカイン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び血漿を含み得る。サイトカイン、ＧＭ−ＣＳＦ及び血漿は、例えば、それぞれ約１００ＪＲＵ／ｍＬ、約８００Ｕ／ｍＬ、及び約２．５％の濃度で培地に含まれ得る。

前記培地の基礎培地は、前述の部材を含み、細胞を培養できる液体培地であればよく、例えば、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、ＲＰＭＩ−１６４０であり得る。

前記培地は、市販の培地であってもよく、例えば、Ｘ−ＶＩＶＯ（登録商標）（ＬＯＮＺＡ社)、Ｈｕｍａｎｋｉｎｅ Ｇ４ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ヒューマンザイム社）、又は樹状細胞分化培地（タカラバイオ社）などであり得る。

上記のように培地で培養する場合、前記単核球中の、ＣＤ１ｄ分子を細胞表面に発現している細胞は、培養を開始してから約５日〜７日目に樹状細胞に分化し得る。前記分化は、前記単核球に含まれるＣＤ１１ｃ⁻ＣＤ３^＋Ｔ細胞によって誘導され得る。

（ｂ）抗原提示細胞の調製
抗原提示細胞は、例えば、前記単核球を前記培地で６日〜１３日間培養して得られた樹状細胞にαＧａｌＣｅｒを添加した後、さらに１日〜２日間培養することによって得られ得る。ここで、αＧａｌＣｅｒの添加は、培地中のαＧａｌＣｅｒの濃度が１００〜２００ｎｇ／ｍＬとなるように調製されたαＧａｌＣｅｒ溶液を培地に加えることであり得る。αＧａｌＣｅｒ溶液は、例えば、αＧａｌＣｅｒを蒸留水などの溶媒に溶解することによって調製され得る。αＧａｌＣｅｒは、例えば、ＫＲＮ７０００などであり得る。

更なる実施形態において、抗原提示細胞は図３に示す以下のような工程を含む方法において調製され得る。

前記単核球を２分し、第１の単核球を、第１の樹状細胞に分化させること、
第２の単核球を第１の単核球の培養に用いた培地と同様の培地で第１の末梢血細胞より長い期間、例えば、１０日間〜１４日間培養し、第２の樹状細胞に分化させること、及び
第１の樹状細胞及び第２の樹状細胞に、それぞれαＧａｌＣｅｒを添加して１日間〜２日間培養し、第１の抗原提示細胞及び第２の抗原提示細胞を得ること。

第１の単核球及び第２の単核球は、同等の時期にそれぞれ樹状細胞に分化し得、第２の樹状細胞は、樹状細胞として培養される期間が長くなり得る。前記第１の抗原提示細胞、及び前記第２の抗原提示細胞は、それぞれ所定の期間の培養を終えた時点で、後述する方法で同様に回収され、別々の保存液に懸濁され、別々の容器に収容され、保存され得る。

（ｃ）抗原提示細胞の保存液への混合、及びＮＫＴ細胞活性化医薬組成物の調製
上記のように調製された抗原提示細胞は、所定の期間の培養を終えた時点で回収され得る。回収は、例えば、抗原提示細胞を、ピペットで遠沈管に移し取った後、遠心することによって行われて得る。遠心は、１２００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで、５分間〜１０分間、室温で行われることが好ましい。回収された抗原提示細胞は、ヒトアルブミン添加生理食塩水を添加され、洗浄されてもよい。その後、回収された抗原提示細胞の数が計測され得る。細胞数は、約２×１０^９個〜約５×１０^９個であればよい。細胞数の計測は、公知のいずれかの方法により行われてよい。

保存液は、溶媒としての生理食塩水、生理的緩衝液、電解質液、又は糖質液などの生理的溶液、及び総体積に対して４０体積／体積％以上の濃度で含まれる血漿を含む。保存液は、濾過又は高圧蒸気滅菌などによって滅菌された生理的溶液に、体積比で４０％以上の血漿を加えて調製され得る。血漿は自家血漿であっても他家血漿であってもよい。

血漿は、医療機関などにおいて調製されたもの、又は市販のものを取得することによって用いられ得る。医療機関などにおいて、血漿は、例えば、以下のようにして採取され得る。まず、血漿を提供するドナーからの採血が行われ得る。血液は血漿を約１００ｍＬ〜３００ｍＬ含むことが好ましい。次に血液から単核球が取り除かれ得る。単核球を取り除いた血液に血漿が少なくとも８０ｍＬ〜２４０ｍＬ残っていることが好ましい。自家血漿は、当該医薬組成物を投与する対象から採取された血液由来であり得る。他家血漿は、当該医薬組成物を投与する対象以外の哺乳類から採取された血液であり得る。前記血漿は、単核球を採取する血液と同じ血液又は別に採取した血液から採取され得る。前記血漿は、工程（ａ）及び／又は（ｃ）で用いられ得る。

保存液には、前記血漿の他に前記サイトカイン、インスリン、アルブミン又はこれらの何れかの組み合わせを添加してもよい。サイトカインは、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５などであり得、ＩＬ−２は、例えば、Ｉｍｍｕｎａｃｅ（登録商標）（シオノギ製薬、日本）であり得る。インスリンは、例えば、ヒューマリン（登録商標）Ｒ注１００単位／ｍＬであり得る。アルブミンは、例えば、献血アルブミン（化血研）であり得る。

更なる実施形態において、他家血漿を用いて調製される保存液は、血液製剤を用いて調製され得る。例えば、保存液の４０体積／体積％以上の前記対象起源の血漿及びアルブミンの代わりに血液製剤を用いて調製してもよい。血液製剤は、白血球成分を除去した血液成分を血液保存液と混合したものであればよい。前記血液保存液は、例えば、ＡＣＤ−Ａ液などであり得る。血液製剤は、例えば、新鮮凍結血漿−ＬＲ「日赤」などであり得る。前記血液製剤は、ＮＫＴ細胞活性化医薬組成物を投与する対象のＡＢＯ血液型及びＤ（Ｒｈｏ）抗原の陰陽性に適合したものが用いられ得る。その場合、血漿が２．の（２）に記載した濃度になるように、血液製剤を生理的溶液で希釈することによって保存液が調製され得る。当該保存液にはサイトカイン及びインスリンを、２．の（３）に記載した濃度となるように添加してもよい。

上記のように調製した保存液に抗原提示細胞を含ませ、ＮＫＴ細胞活性化医薬組成物が得られる。

前記製造方法に用いられる単核球は、医療機関などにおいて調製されたもの、又は市販のものであり得る。医療機関などにおいて、単核球は、例えば、以下のようにして採取され得る。まず、末梢血細胞を提供するドナーからの採血が行われ得る。採取した血液には、単核球が約２×１０^９個〜１０×１０^９個含まれることが好ましい。次に採取した血液から単核球が採取され得る。それは、例えば、血液を生理食塩水で希釈し、遠心し、遠心した血液から単核球の存在する層を採取することによって行われ得る。前記単核球は、対象の自家単核球であることが好ましいが、対象以外の哺乳類から上記と同様の方法で得られた単核球であってもよい。（ａ）〜（ｃ）の工程は無菌的に行われ得る。

更なる実施形態において、ＮＫＴ細胞を活性化するための医薬組成物は以下の工程により製造され得る。

（ａ）単核球を、サイトカイン、ＧＭ−ＣＳＦ、及び前記血漿の一部を含む培地で培養し、樹状細胞に分化させること、
（ｂ）（ａ）で得られた樹状細胞にαＧａｌＣｅｒを結合させ、抗原提示細胞を得ること、
（ｃ）前記抗原提示細胞を回収すること、
（ｄ）サイトカイン、インスリン、及び体積比で４０％以上の前記血漿を含む保存液を調製すること、及び
（ｅ）（ｄ）で得られた抗原提示細胞を総体積に対して４０体積／体積％以上の濃度の前記血漿を含む保存液に含ませてＮＫＴ細胞活性化医薬組成物を得ること。

前記工程（ａ）〜工程（ｅ）は、前述の製造方法と同様であってよい。

４．ＮＫＴ細胞活性化医薬組成物の保存方法
上記のＮＫＴ細胞活性化医薬組成物を保存する方法を以下に記載する。実施形態に従うと、ＮＫＴ細胞を活性化するための医薬組成物の保存方法が提供される。保存方法は、図４に示すように次の（ａ）〜（ｄ）の工程を含み得る
（ａ）単核球を分化させ、ＣＤ１ｄ分子を発現する樹状細胞を得ること、
（ｂ）前記（ａ）で得られた樹状細胞にαＧａｌＣｅｒを結合させて抗原提示細胞を得ること、
（ｃ）前記（ｂ）で得られた抗原提示細胞を総体積に対して４０体積／体積％以上の濃度の血漿を含む保存液中に含ませてＮＫＴ細胞活性化医薬組成物を調製すること、及び
（ｄ）前記（ｃ）で得られたＮＫＴ細胞活性化医薬組成物を０℃＜Ｔ≦８℃の温度（Ｔ）で維持すること。

前記（ａ）〜（ｃ）のＮＫＴ細胞活性化医薬組成物を得るまでの工程は、前記の製造方法と同じであってよい。

（ａ）〜（ｃ）のように調製されたＮＫＴ細胞活性化医薬組成物は、保存及び運搬に適切な状態で容器に収容され得る。容器は、例えば点滴バック、アンプル、シリンジ、チューブ、又はパックなどであってもよい。収容は、無菌的に行われ、組成物の収容後に密閉され得る。その後、０℃＜Ｔ≦８℃の温度（Ｔ）に設定された保冷庫に持ち込み、維持する。保冷庫の温度は、２℃〜６℃であることがより好ましく、例えば、約４℃であってもよい。当該工程の維持することは、密封状態で行われ得る。それによって、ＮＫＴ細胞活性化医薬組成物内の抗原提示細胞は、ガス交換及び保存液の交換を行わずに保存され得る。

上記のようにＮＫＴ細胞活性化医薬組成物が製造され、保存されれば、約８日間抗原提示細胞の生存率が４５％以上で維持される。８日間の内２４時間以内の間であれば、搬送が可能である。搬送は、搬送の間、ＮＫＴ細胞活性化医薬組成物が０℃〜８℃に維持されていればよい。ＮＫＴ細胞活性化医薬組成物は遮光された環境下で搬送され得る。

更なる実施形態において、ＮＫＴ細胞を活性化するための医薬組成物中の抗原提示細胞は以下の工程により保存され得る。

（ａ）単核球を、サイトカイン、ＧＭ−ＣＳＦ、及び前記血漿の一部を含む培地で培養し、樹状細胞に分化させること、
（ｂ）（ａ）で得られた樹状細胞にαＧａｌＣｅｒを結合させ、抗原提示細胞を得ること、
（ｃ）前記抗原提示細胞を回収すること、
（ｄ）サイトカイン、インスリン、及び体積比で４０％以上の前記血漿を含む保存液を調製すること、
（ｅ）（ｄ）で得られた抗原提示細胞を総体積に対して４０体積／体積％以上の濃度の血漿を含む保存液に含ませてＮＫＴ細胞活性化医薬組成物を得ること、及び
（ｆ）（ｃ）で得られたＮＫＴ細胞活性化医薬組成物を、０℃＜Ｔ≦８℃の温度（Ｔ）の保冷庫に静置すること。

前記工程（ａ）〜工程（ｆ）は、前述の保存方法と同様であってよい。

＜例＞
以下に、実施形態に記載したＮＫＴ細胞活性化医薬組成物の製造方法、及び抗原提示細胞の保存方法の例を記載する。

例１．ＩＬ−２／ＧＭ−ＣＳＦ培養した末梢血単核球の特性評価
対象体ＨＶ１及びＨＶ２から採取した末梢血単核球をそれぞれ密度勾配遠心し、ＰＢＳで１回洗浄し、３％熱不活性化ＦＢＳを添加したＰＢＳ又はＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄した。洗浄した末梢血単核球を１００ＪＲＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２（イムネース（登録商標）、シオノギ製薬）及び８００ Ｕ／ｍＬのｒｈＧＭ−ＣＳＦ（ＮＣＰＣ ジーンテックバイオテクノロジーディベロプメント社）を含み、１０％のＦＢＳ、０．０１ｍのＭ２−ＭＥ、及び５０Ｕ／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０で７日間培養した。得られたＩＬ−２／ＧＭ−ＣＳＦ培養した末梢血単核球を、１００ＪＲＵ／ｍｌのＩＬ−２、及び８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養し、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）により細胞の大きさ並びにＣＤ１１ｃ及びＨＬＡ−ＤＲの発現解析を行った。培養前及び後のＩＬ−２／ＧＭ−ＣＳＦ培養末梢血単核球ＳＳＣ／ＦＳＣプロットを図５のＡの上段に示し、細胞のＨＬＡ−ＤＲ／ＣＤ１１ｃプロットを図５のＡの下段に示した。当該末梢血単核球は、１５％のＳＳＣ^ｈｉｇｈＦＳＣ^ｈｉｇｈ細胞を含み、その中に２３．８％の樹状細胞（ＨＬＡ−ＤＲ^＋ＣＤ１１ｃ^＋細胞）が含まれていた。また、抗ＣＤ１１ｃ−ＰＥ及び抗ＣＤ３−Ｃｙ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いたＦＣＭにより、当該末梢血単核球にＣＤ１１ｃ⁻ＣＤ３^＋細胞も含まれることが明らかとなった。

例２．ＩＬ−２、インスリン、及び自家血漿を含まない保存液で保存した抗原提示細胞の生存率評価
健常な３１歳男性のヒト及び健常な３４歳男性のヒト２人から採取した血液から末梢血単核球を採取し、１００ＪＲＵ／ｍＬのＩＬ−２及び８００Ｕ／ｍＬのｒｈＧＭ−ＣＳＦとともに６日間又は１３日間培養し、αＧａｌＣｅｒ（１００ｎｇ／ｍＬ、ＫＲＮ７０００）を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２条件で１日培養した。αＧａｌＣｅｒは、Ｋａｗａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７に記載の方法で調製した。このようにして、合計７日培養した抗原提示細胞（７日培養細胞）及び合計１４日培養した抗原提示細胞（１４日培養細胞）を調製した。各抗原提示細胞を一部回収し、トリパンブルー染色を行った後、細胞数を測定し、生細胞が９０％以上あることを確認した。残りの細胞を回収し、１．５×１０^６個／１００μＬとなるように、２５ｍｇ／ｍＬのアルブミンを含む生理食塩水を入れた９つのチューブに分注し懸濁した。各チューブを、４℃、１０℃、又は２２℃の条件下、２４時間、４８時間、又は７２時間静置する計９条件の条件で保存した後、細胞の生存率を算出した。３検体の平均値を算出した。

結果を表１に示した。７日培養細胞及び１４日培養細胞両方において、１０℃、２２℃条件では７２時間後も４５％以上の生存率が維持されたが、４℃条件下では維持されなかった。従って、ＩＬ−２、インスリン、及び自家血漿を含まない保存液では３日間以上安定的に保存できないことが明らかとなった。

例３．ＩＬ−２、インスリン、及び自家血漿を含まない保存液で搬送及び保存した抗原提示細胞の生存率評価
例２と同様の方法で健常な３５歳男性のヒト１人を起源とする７日培養細胞及び１４日培養細胞を調製した。各抗原提示細胞を回収し、それぞれ１．５×１０^８個／ｍＬとなるように、２５ｍｇ／ｍＬのアルブミンを含む生理食塩水に懸濁した。それらを半分に分け、１５ｍＬのコニカルチューブに入れた。それらの細胞を細胞生存率が９０％以上であることを確認した後、低温（２℃〜８℃）、室温（１５℃〜２５℃）のボックスに温度ロガーと共に梱包し、低温又は室温条件で１６時間搬送した。搬送は、搬送業者（株式会社セルート）により千葉大学（千葉県千葉市中央区亥鼻１−８−１）から化合物安全研究所（北海道札幌市清田区真栄３６３−２４）まで車両で行った。その後搬送した温度と同じ温度でそれぞれ保存し、４８時間又は７２時間後に生細胞数を測定した。搬送時の温度は、７日培養細胞で５．２℃〜５．８℃（低温）、１９．４℃〜２２．２℃（室温）、１４日培養細胞で４．４℃〜５．４℃（低温）、１９．６℃〜２１．９℃（室温）であった。

その結果、７日培養細胞の低温条件でのみ７２時間後まで生存率が４５％以上であった（表２）。よって、保存温度は２℃〜８℃が好ましいことが明らかとなった。

例４．実施形態の保存液で保存した抗原提示細胞の生存率評価
例２と同様の方法で健常な４７歳男性のヒト起源の７日培養細胞及び１４日培養細胞を調製した。各細胞を、アルブミンを２５ｍｇ／ｍＬ、ＩＬ−２を１００Ｕ／ｍＬ、インスリンを５μｇ／ｍＬ、及び自家血漿を１０、２０、３０、４０、又は５０％含むＩＬ−２及びインスリン濃度の高い条件５条件（高）、又はアルブミンを２５ｍｇ／ｍＬ、ＩＬ−２を１０Ｕ／ｍＬ、インスリンを０．５μｇ／ｍＬ、及び自家血漿を１０、２０、３０、４０又は５０％含むＩＬ−２及びインスリン濃度の低い条件５条件（低）の合計１０条件の保存液に懸濁した。アルブミンは、献血アルブミン２５％静注５ｇ／５０ｍＬ「ベネシス」（田辺三菱製薬株式会社）、ＩＬ−２は、イムネース（登録商標）注３５（シオノギ製薬）、インスリンは、ヒューマリン（登録商標）Ｒ（日本イーライリリー株式会社）を用いた。それらを４℃で保存し、９６時間、１４４時間、２４０時間及び３３６時間後に細胞の生存率を測定した。

結果を表３に示す。ＩＬ−２、インスリン、及び４０％以上の血漿を含む保存液で６日間細胞を４５％の生存率で保存できること明らかとなった。また、ＩＬ−２、インスリンの濃度が高い方が生細胞の割合は高いが、血漿濃度が４０％以上であれば６日間保存できることが明らかとなった。

例５．実施形態の保存液で保存した抗原提示細胞の生存率評価
例２と同様の方法で健常な４７歳男性のヒト起源の７日培養細胞、及び健常な３５歳男性のヒト起源の７日培養細胞及び１４日培養細胞を調製した。各抗原提示細胞を、アルブミンを２５ｍｇ／ｍＬ、ＩＬ−２を１００Ｕ／ｍＬ、インスリンを５μｇ／ｍＬ、及び自家血漿を５０％含むＩＬ−２及びインスリン濃度の高い条件（高）、又はアルブミンを２５ｍｇ／ｍＬ、ＩＬ−２を１０Ｕ／ｍＬ、インスリンを０．５μｇ／ｍＬ、及び自家血漿を４０、４５又は５０％含むＩＬ−２及びインスリン濃度の低い条件３条件（低）の合計４条件の保存液に懸濁した。アルブミン、ＩＬ−２、インスリンは例４と同様の製品を用いた。それらを４℃の条件で９６時間、１４４時間又は１９２時間保存した後、細胞の生存率をそれぞれ測定した。

４７歳男性のヒトにおける結果を表４に、３５歳男性のヒトにおける結果を表５に示した。７日培養細胞の実験条件では、４７歳男性のヒトの場合ＩＬ−２及びインスリン濃度が低く、血漿を４０％含む条件で８日間生存率が４５％以上に維持された。３５歳男性の場合、血漿を４５％以上含む条件で８日間生存率が４５％以上に維持された。１４日培養細胞はＩＬ−２及びインスリン濃度が高く５０％の血漿を含む条件で６日間維持された。よって、実施形態の保存液で、７日培養細胞を最大８日、１４日培養細胞を最大６日保存できることが明らかとなった。

例６．実施形態の保存液中で搬送した又はしない血液起源の抗原提示細胞の生存率評価
健常な３５歳男性のヒトから血液を採取し、千葉大学にて、例２と同様の方法でその血液の一部から７日培養細胞及び１４日培養細胞を調製した。当該血液の残りを富士ソフト株式会社再生医療研究部（東京都墨田区江東橋２−１９−７）に搬送し、７日及び１４日培養細胞を同様の方法で調製した。搬送は、血液をチューブに分注し１５℃〜２５℃のボックスに温度ロガーと共に梱包して行われた。搬送温度は１５℃〜２５℃であった。前記の各場所で、各抗原提示細胞を、アルブミンを２５ｍｇ／ｍＬ、ＩＬ−２を１００Ｕ／ｍＬ、インスリンを５μｇ／ｍＬ、及び自家血漿を５０％含むＩＬ−２及びインスリン濃度の高い条件（高）、又はアルブミンを２５ｍｇ／ｍＬ、ＩＬ−２を１０Ｕ／ｍＬ、インスリンを０．５μｇ／ｍＬ、及び自家血漿を４０、４５、又は５０％含むＩＬ−２及びインスリン濃度の低い条件３条件（低）の合計４条件の保存液に懸濁した。アルブミン、ＩＬ−２、インスリンは例４と同様の製品を用いた。それらを４℃で４日間保存した後、細胞を２℃〜８℃のボックスに温度ロガーと共に梱包し搬送した。搬送は、搬送業者（株式会社セルート）により千葉大学又は富士ソフト株式会社再生医療研究部から化合物安全研究所まで車両で行われた。搬送時間は約２４時間であった。搬送温度は２℃〜８℃であった。搬送後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に細胞数を測定した。

結果を表６に示した。搬送していない血液起源の１４日培養細胞をＩＬ−２及びインスリン濃度が高く血漿を５０％含む保存液で保存した条件以外の条件において、搬送の後７２時間４５％以上の生存率が維持された。よって、保存期間の中に２４時間搬送を行っても最大８日間細胞が保存されることが明らかとなった。

例７．実施形態の保存液で保存した抗原提示細胞のＮＫＴ細胞活性化効率試験
例６で調製した３５歳男性のヒト起源の７日培養細胞を例６の（高）又は例６の（低）と同様の保存液、あるいはアルブミン（２５ｍｇ／ｍＬ）のみを含む条件の合計５条件の保存液に懸濁した。コントロールとしての同じ対象起源の末梢血単核球にαＧａｌＣｅｒを添加せず７日間培養した細胞を上記（高）の保存液に懸濁した。これらを４日間４℃の条件で保存した後、放射線照射してＮＫＴ細胞を死滅させた。同じ対象から新たに末梢血単核球を採取し、ＦＡＣＳを用いてＶα２４及びＶβ１１を検出し活性化ＮＫＴ細胞の細胞数を測定した（図７「培養開始時」）。放射線照射した培養細胞と新たな末梢血単核球を７日間共培養し、活性化ＮＫＴ細胞の細胞数を測定した。

結果を図６に示す。いずれの条件においても、αＧａｌＣｅｒを添加した条件では、添加しない場合よりも活性化ＮＫＴ細胞の数が多かった。従って、実施形態の保存液で保存した細胞はＮＫＴ細胞を活性化することが明らかとなった。

例２〜例７より、実施形態の医薬組成物は、抗原提示細胞を４５％以上の生存率で最長８日保存できること、２４時間以内であれば搬送後も４５％以上の生存率が維持されること、及び当該医薬組成物は保存後もＮＫＴ細胞を活性化することが明らかとなった。
以下に、本出願の出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
その表面にＣＤ１ｄ分子を発現しており、前記ＣＤ１ｄ分子にαガラクトシルセラミドが結合している、活性成分としての樹状細胞、及び
総体積に対して４０体積／体積％以上の濃度の血漿
を生理的溶液中に含むことを特徴とする医薬組成物。
［２］
前記血漿の濃度が４０〜６０体積／体積％である［１］に記載の医薬組成物。
［３］
前記血漿の濃度が４５〜５５体積／体積％以上である［１］に記載の医薬組成物。
［４］
前記血漿の濃度が４５体積／体積％以上である［１］に記載の医薬組成物。
［５］
さらに、共通ガンマ鎖を含む受容体を介してシグナル伝達するサイトカインを含む［１〜４］の何れか１つに記載の医薬組成物。
［６］
さらに、インスリン又はインスリン類似体を含む［１］〜［５］の何れか１つに記載の医薬組成物。
［７］
さらに、アルブミンを含む［１］〜［６］の何れか１つに記載の医薬組成物。
［８］
前記血漿が自家血漿である［１］〜［７］の何れか１つに記載の医薬組成物。
［９］
前記血漿が他家血漿である［１］〜［８］の何れか１つに記載の医薬組成物。
［１０］
（ａ）単核球を分化させ、ＣＤ１ｄ分子を発現する樹状細胞を得ること、
（ｂ）前記（ａ）で得られた樹状細胞にαガラクトシルセラミドを結合させて抗原提示細胞を得ること、及び
（ｃ）前記（ｂ）で得られた抗原提示細胞を総体積に対して４０体積／体積％以上の濃度の血漿を含む保存液中に含ませてＮＫＴ細胞活性化医薬組成物を調製すること
を含むＮＫＴ細胞を活性化するための医薬組成物の製造方法。
［１１］
（ａ）単核球を分化させ、ＣＤ１ｄ分子を発現する樹状細胞を得ること、
（ｂ）前記（ａ）で得られた樹状細胞にαガラクトシルセラミドを結合させて抗原提示細胞を得ること、
（ｃ）前記（ｂ）で得られた抗原提示細胞を総体積に対して４０体積／体積％以上の濃度の血漿を含む保存液中に含ませてＮＫＴ細胞活性化医薬組成物を調製すること、及び
（ｄ）前記（ｃ）で得られたＮＫＴ細胞活性化医薬組成物を０℃＜Ｔ≦８℃の温度（Ｔ）で維持すること
を含む抗原提示細胞を保存する方法。
［１２］
前記（ｄ）における維持することが８日までの何れかの期間に亘り行われる［１１］に記載の方法。
［１３］
前記（ｄ）における維持されることが密封状態で行われる［１１］又は［１２］に記載の方法。

１…抗原提示細胞 ２…樹状細胞 ３…ＣＤ１ｄ分子 ４…αＧａｌＣｅｒ。

Claims (6)

1. 総体積に対して４０体積／体積％以上の濃度の血漿と、
   ＩＬ−２と、
   インスリンと
   を生理的溶液中に含む、
   表面にＣＤ１ｄ分子を発現しており、前記ＣＤ１ｄ分子にαガラクトシルセラミドが結合している樹状細胞を０℃以下にすることなく０℃を超える温度で保存するための保存液。
2. 請求項１に記載の保存液と、
   表面にＣＤ１ｄ分子を発現しており、前記ＣＤ１ｄ分子にαガラクトシルセラミドが結合している、活性成分としての樹状細胞とを含むことを特徴とする医薬組成物。
3. 請求項２に記載の医薬組成物の製造方法であって、
   （ａ）ＣＤ１ｄ分子を発現する樹状細胞を得ること、
   （ｂ）前記（ａ）で得られた樹状細胞にαガラクトシルセラミドを結合させて抗原提示細胞を得ること、及び
   （ｃ）前記（ｂ）で得られた抗原提示細胞を、総体積に対して４０体積／体積％以上の濃度の血漿と、ＩＬ−２と、インスリンとを生理的溶液中に含む保存液中に含ませてＮＫＴ細胞活性化医薬組成物を調製すること
   を含むＮＫＴ細胞を活性化するための医薬組成物の製造方法。
4. （ａ）ＣＤ１ｄ分子を発現する樹状細胞を得ること、
   （ｂ）前記（ａ）で得られた樹状細胞にαガラクトシルセラミドを結合させて抗原提示細胞を得ること、
   （ｃ）前記（ｂ）で得られた抗原提示細胞を、総体積に対して４０体積／体積％以上の濃度の血漿と、ＩＬ−２と、インスリンとを生理的溶液中に含む保存液中に含ませてＮＫＴ細胞活性化医薬組成物を調製すること、及び
   （ｄ）前記（ｃ）で得られたＮＫＴ細胞活性化医薬組成物を０℃以下にすることなく、
   ０℃＜Ｔ≦８℃の温度（Ｔ）で維持すること
   を含む抗原提示細胞を保存する方法。
5. 前記（ｄ）における維持することが８日までの何れかの期間に亘り行われる請求項４
   に記載の方法。
6. 前記（ｄ）における維持されることが密封状態で行われる請求項４又は５に記載の
   方法。

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