CN106591233B - 一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法。该方法包括：利用CD16抗体包被培养容器，得到包被后的培养容器；利用免疫细胞激活培养基基将单个核细胞置于包被后的培养容器中进行免疫细胞激活培养基，得到初步诱导扩增的免疫细胞；利用免疫细胞扩增培养基将初步诱导扩增的免疫细胞进行第二诱导扩增培养，得到分化的免疫细胞；利用免疫细胞规模化扩增培养将分化的免疫细胞进行第三诱导扩增培养，获得大规模的功能激活的免疫细胞；利用免疫细胞冻存液冻存大规模的功能激活的免疫细胞。该方法具有诱导效率高、扩增速度快、安全性高和成本低等优点。并且，冻存的大规模的免疫细胞，有效保存时间长，细胞回收率高。

Description

一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法。
背景技术
近年来，生物治疗己经成为继手术、放化疗及内分泌治疗之后的第五大治疗模式，并逐渐受到重视。过继性细胞免疫治疗法(ACI)是细胞生物治疗方法之一，它是指向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤肿瘤细胞或激发机体免疫反应来杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。目前在临床上应用过继性免疫细胞包括DC-CIK细胞、TIL细胞、LAK细胞及NK细胞，其中，CIK细胞、LAK细胞和A-NK细胞都是以自然杀伤细胞为主体的抗癌体系。
自然杀伤细胞(natural killer cells)也叫做NK细胞，主要来源于骨髓CD34+的淋巴细胞，分布在骨髓、外周血和脾脏，占外周血淋巴细胞的10％-20％。NK细胞在肿瘤免疫、清除非己细胞等方面发挥重要作用：它是天然免疫防御的主要组成，位于机体防御体系的第一道防线，NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，可无需抗原预先致敏即可识别并杀死肿瘤及病毒感染的细胞，通过穿孔素-颗粒酶途径和Fas-FasL通路直接对肿瘤细胞发挥细胞毒作用杀伤肿瘤细胞；同时它又能在发病早期分泌多种细胞因子和趋化因子如TNF-α、IFN-γ和IL-1等，这些细胞因子参与抗癌和调节获得性免疫应答，故NK细胞也是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁。虽然NK细胞的抗癌效果的安全性和疗效得到肯定，但由于它仅占外周血淋巴细胞的10％-20％，因而如何获得高纯度、高质量地NK细胞产品是NK治疗的关键。近几年发现通过体外的刺激培养可进行相对大规模的NK细胞制备，己知IL-2、IL-15、IL-18和IL-7等细胞因子在对NK细胞的体外扩增上发挥重要作用，它们体外扩增NK细胞的倍数在几倍至数十倍不等。IL-2是重要的诱导NK细胞增殖的细胞因子，它可以激活NK细胞、促进NK细胞增殖和细胞因子的产生。IL-15和IL-7的作用与IL-2相似，同时它们还可通过与NK细胞表面表达的复合受体γ链结合，促进造血干细胞定向分化为NK细胞，且对NK细胞的发育、分化和维持长期体外存活等方面发挥重要作用。IL-15与IL-2的协同作用也使两者联合作用于NK细胞的体外扩增，是目前NK细胞体外扩增最传统的细胞因子组合。据报道IL-18不但能诱导活化的THi细胞分泌产生大量的IFN-γ，更能通过促进Fas-FasL通路的开放，增强NK细胞的细胞毒性，且呈剂量依赖性。但目前市场上已有NK细胞治疗产品存在，但冻存复苏效果差、使用的培养体系繁杂、扩增倍数及杀瘤效果不佳，部分培养体系存在安全风险等问题。
由此，自然杀伤细胞的培养和冻存方法有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法，该方法诱导扩增免疫细胞，诱导效率高、扩增速度快、安全性高和成本低，并且诱导扩增获得的大规模的功能激活的免疫细胞长期保存后复苏依然保持良好的细胞特性。
因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
利用CD16抗体包被培养容器，以便得到包被后的培养容器；
利用免疫细胞激活培养基基将单个核细胞置于所述包被后的培养容器中进行免疫细胞激活培养基，以便得到初步诱导扩增的免疫细胞；
利用免疫细胞扩增培养基将所述初步诱导扩增的免疫细胞进行第二诱导扩增培养，以便得到分化的免疫细胞；
利用免疫细胞规模化扩增培养将所述分化的免疫细胞进行第三诱导扩增培养，以便获得大规模的功能激活的免疫细胞；以及
利用免疫细胞冻存液冻存所述大规模的功能激活的免疫细胞，
其中，
所述免疫细胞激活培养基基为添加了第一血浆、白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基；
所述免疫细胞扩增培养基为添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基；
所述免疫细胞规模化扩增培养为添加了白介素-2的无血清淋巴细胞培养基；
所述免疫细胞冻存液包含：2-10体积％的DMSO、2-15体积％的HSA、20-88体积％的第二血浆和余量冻存培养基。
白酒草系菊科白酒草属植物Conyza japonica(Thunb.)Less的全草，颜世伦等曾经报道从白酒草中分离得到化合物白酒草皂苷R，结构鉴定为3-O-β-D-glucopyranosylmedicagenic acid 28-O-β-D-apiofuranosyl-(1→3)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-[β-D-apiofuranosyl-(1→3)]-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl ester，其结构式为：
本发明人还惊讶地发现，微量白酒草皂苷R，血浆和HSA(人血清白蛋白，HumanSerum Albumin)与DMSO结合制备免疫细胞的冻存液，可以降低DMSO的使用量，这种冻存液对冻存细胞有较好的保护作用，冻存细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种免疫细胞冻存液，其包含0.2-0.8体积％的DMSO；2-15体积％的HSA；0.001g/ml的白酒草皂苷R，20-88体积％的血浆；以及余量培养基。发明人惊奇的发现，该冻存液能够有效用于冻存免疫细胞，细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，并且细胞回收率高。
发明人惊奇地发现，利用该方法对单个核细胞进行诱导扩增培养得到大规模的免疫细胞，具有诱导效率高、扩增速度快、安全性高和成本低等优点。并且，该方法冻存的大规模的免疫细胞，有效保存时间长，复苏后细胞依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高，从而满足临床治疗大量免疫细胞的需要。
另外，根据本发明上述实施例的免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，所述免疫细胞激活培养基基和所述免疫细胞扩增培养基中，所述沙培林的浓度均为0.007-0.013KE/ml，优选地，为0.01KE/ml。
根据本发明的实施例，所述免疫细胞激活培养基基、所述免疫细胞扩增培养基和所述免疫细胞规模化扩增培养中，所述白介素-2的浓度均为700-1300IU/ml，优选地，为1000IU/ml。
根据本发明的实施例，所述免疫细胞激活培养基基、所述免疫细胞扩增培养基和所述免疫细胞规模化扩增培养中，所述无血清淋巴细胞培养基为OpTmizerTMCTSTM无血清培养基或SuperCulture TM L500人淋巴细胞无血清培养基。
根据本发明的实施例，所述免疫细胞激活培养基基中，所述第一血浆的浓度为7-13体积％，优选地，为10体积％。
根据本发明的实施例，所述第一血浆和所述第二血浆均为自体血浆。
根据本发明的实施例，所述免疫细胞为自然杀伤细胞和树突状细胞。
根据本发明的实施例，所述免疫细胞冻存液中，所述DMSO的浓度为10体积％；所述HSA的浓度为5体积％；所述第二血浆的浓度为40体积％；所述冻存培养基为1640培养基或Stemspan培养基。
根据本发明的实施例，当所述初步诱导扩增的免疫细胞的CD56的表达超过70％时，进行所述第二诱导扩增培养。
根据本发明的实施例，当所述分化的免疫细胞的CD56的表达超过90％时，进行所述第三诱导扩增培养。
根据本发明的实施例，所述免疫细胞激活培养基过程中，每1天传代一次。
根据本发明的实施例，所述第二诱导扩增培养过程中，每2天传代一次。
根据本发明的实施例，所述第三诱导扩增培养过程中，每2天传代一次。
根据本发明的实施例，每106-109个所述大规模的功能激活的免疫细胞采用1ml所述免疫细胞冻存液。
根据本发明的实施例，所述冻存进一步包括：将含有所述免疫细胞的所述免疫细胞冻存液进行程序降温处理，所述程序降温处理的条件为：0-2分钟，所述免疫细胞的温度从4摄氏度下降到-1摄氏度；2-3分钟，所述免疫细胞的温度从-1摄氏度上升到0摄氏度；3-6分钟，所述免疫细胞的温度保持0摄氏度；6-11分钟，所述免疫细胞的温度从0摄氏度下降到-10摄氏度；11-16分钟，所述免疫细胞的温度保持-10摄氏度；16-50分钟，所述免疫细胞的温度从-10摄氏度下降到-45摄氏度；50-85分钟，所述免疫细胞的温度保持-45摄氏度；85-95分钟，所述免疫细胞的温度从-45摄氏度下降到-90摄氏度；95-100分钟，所述免疫细胞的温度保持-90摄氏度。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
本发明的有益之处在于：
本发明提出一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法，该方法诱导扩增免疫细胞，诱导效率高、扩增速度快、安全性高和成本低，并且诱导扩增获得的大规模的功能激活的免疫细胞长期保存后复苏依然保持良好的细胞特性。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的培养不同时间的外周血单个核细胞数和细胞活性的结果示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的培养14天前后的外周血单个核细胞中的淋巴细胞的比例结果示意图；
图3显示了根据本发明又一个实施例的培养不同时间的外周血单个核细胞数和细胞活性的结果示意图；
图4显示了根据本发明一个实施例的培养12天前后的外周血单个核细胞中的淋巴细胞比例的结果示意图；
图5显示了根据本发明一个实施例的裸鼠致瘤实验的结果示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：利用CD16抗体包被培养容器，得到包被后的培养容器；利用免疫细胞激活培养基基将单个核细胞置于所述包被后的培养容器中进行免疫细胞激活培养基，得到初步诱导扩增的免疫细胞；利用免疫细胞扩增培养基将初步诱导扩增的免疫细胞进行第二诱导扩增培养，得到分化的免疫细胞；利用免疫细胞规模化扩增培养将分化的免疫细胞进行第三诱导扩增培养，获得大规模的功能激活的免疫细胞；利用免疫细胞冻存液冻存所述大规模的功能激活的免疫细胞。
发明人惊奇地发现，利用该方法对单个核细胞进行诱导扩增培养得到大规模的免疫细胞，具有诱导效率高、扩增速度快、安全性高和成本低等优点。并且，该方法冻存的大规模的免疫细胞，有效保存时间长，复苏后细胞依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高，从而满足临床治疗大量免疫细胞的需要。
根据本发明的实施例，免疫细胞激活培养基基为添加了第一血浆、白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基；免疫细胞扩增培养基为添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基；免疫细胞规模化扩增培养为添加了白介素-2的无血清淋巴细胞培养基。利用该培养基组对单个核细胞进行诱导扩增培养得到大规模的免疫细胞，具有诱导效率高、扩增速度快、安全性高和成本低等优点，从而满足临床治疗大量免疫细胞的需要。
根据本发明的实施例，免疫细胞冻存液包含：2-10体积％的DMSO、2-15体积％的HSA、20-88体积％的第二血浆和余量冻存培养基。由此，该免疫细胞冻存液中添加了第二血浆，并且各组分的比例适宜，免疫细胞的有效保存时间长，复苏后细胞依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。
其中，需要说明的是，当所述DMSO、HSA和血浆的体积百分数之和小于1时，免疫细胞冻存液进一步包含剩余体积的培养基。例如，在免疫细胞冻存液中，当DMSO的浓度为10体积％、HSA的浓度为2％体积，血浆的浓度为88％体积时，该免疫细胞冻存液不包含培养基；当DMSO的浓度为5体积％、HSA的浓度为2％体积，血浆的浓度为88％体积时，该免疫细胞冻存液包含5％体积的培养基；当DMSO的浓度为10体积％、HSA的浓度为5％体积，血浆的浓度为40％体积时，该免疫细胞冻存液包含45％体积的培养基。
根据本发明的实施例，免疫细胞激活培养基和所述免疫细胞扩增培养基中，沙培林的浓度均为0.007-0.013KE/ml。由此，免疫细胞的诱导和增殖速度快，扩增效率高，获得的免疫细胞纯度高，具有更好的免疫功能，可用于抗感染、抗肿瘤和提高免疫力等临床治疗。
根据本发明的优选实施例，免疫细胞激活培养基和所述免疫细胞扩增培养基中，沙培林的浓度均为0.01KE/ml。由此，免疫细胞的诱导和增殖速度更快，扩增效率高，获得的免疫细胞纯度高，具有更好的免疫功能，可用于抗感染、抗肿瘤和提高免疫力等临床治疗。
根据本发明的实施例，免疫细胞激活培养基、免疫细胞扩增培养基和免疫细胞规模化扩增培养基中，白介素-2的浓度均为700-1300IU/ml。由此，免疫细胞的诱导和增殖速度快，扩增效率高，获得的免疫细胞纯度高，具有更好的免疫功能，可用于抗感染、抗肿瘤和提高免疫力等临床治疗。
根据本发明的优选实施例，免疫细胞激活培养基、免疫细胞扩增培养基和免疫细胞规模化扩增培养基中，白介素-2的浓度均为1000IU/ml。由此，免疫细胞的诱导和增殖速度更快，扩增效率高，获得的免疫细胞纯度高，具有更好的免疫功能，可用于抗感染、抗肿瘤和提高免疫力等临床治疗。
根据本发明的实施例，免疫细胞激活培养基、免疫细胞扩增培养基和免疫细胞规模化扩增培养基中，无血清淋巴细胞培养基均为：OpTmizerTMCTSTM无血清培养基或SuperCultureTM L500人淋巴细胞无血清培养基。由此，有利于免疫细胞的体外高效扩增培养，并且保持较高的功能活性。
根据本发明的实施例，免疫细胞激活培养基中，第一血浆的浓度为7-13体积％。由此，有利于免疫细胞的体外高效扩增培养，并且保持较高的功能活性。
根据本发明的优选实施例，免疫细胞激活培养基中，第一血浆的浓度为10体积％。由此，免疫细胞的诱导和增殖速度和效率显著提高，获得的免疫细胞纯度高，具有更好的免疫功能。
根据本发明的实施例，第一血浆和第二血浆均为自体血浆。由此，免疫细胞对血浆的排异作用小，免疫细胞的诱导和增殖速度和效率显著提高，获得的免疫细胞纯度高，具有更好的免疫功能。
其中，需要说明的是，在本文中所使用的术语“自体血浆”是指与待诱导扩增和冻存的细胞具有同一来源的血浆。换言之，即该血浆与待诱导扩增的单个核细胞取自同一个体。
根据本发明的实施例，DMSO的浓度为10体积％。由此，对细胞冻存效果突出。
根据本发明的一些具体示例，HSA的浓度为5体积％。由此，冷冻复苏过程中渗透压调节效果好，从而能够有效保护细胞，提高细胞存活率，并且合理控制冻存液的成本。
根据本发明的实施例，第二血浆的浓度为40体积％。由此，对细胞的保护作用突出，细胞复苏后依然保持良好的细胞活力。根据本发明的实施例，所述血浆为自体血浆。
根据本发明的实施例，培养基为1640培养基或Stemspan培养基。由此，细胞的冻存效果好。
根据本发明的实施例，当所述激活的免疫细胞的CD56的表达超过70％时，进行第二诱导扩增培养。由此，当大部分单个核细胞诱导分化形成免疫细胞时即可进行第二诱导扩增培养，使得免疫细胞纯度进一步提升，细胞数量得到明显提高，同时扩增过程中免疫细胞功能进一步增强。
根据本发明的实施例，当所述分化的免疫细胞的CD56的表达超过90％时，进行所述第三规模化诱导扩增培养。由此，当绝大部分单个核细胞诱导分化形成免疫细胞时即可进行第三诱导扩增培养，使得免疫细胞得到进一步规模化扩增，同时保持免疫功能，为可能的临床免疫治疗提供充足的细胞。
根据本发明的实施例，免疫细胞激活培养基过程中，每1天传代一次。由此，免疫细胞激活培养基过程中，免疫细胞得到明显激活，同时得到有效扩增，其他细胞比例明显降低。
根据本发明的实施例，第二诱导扩增培养过程中，每2天传代一次。由此，第二诱导扩增培养过程中，免疫细胞纯度得到进一步提高，同时其他细胞比例进一步降低，免疫细胞功能得到增强。
根据本发明的实施例，第三诱导扩增培养过程中，每2天传代一次。由此，第三诱导扩增培养过程中，免疫细胞在高纯度下实现规模化扩增，获得充足的功能激活的免疫细胞用于可能的临床免疫治疗。
根据本发明的实施例，免疫细胞为自然杀伤细胞和树突状细胞。由此，诱导扩增效率高。
根据本发明的实施例，每106-109个大规模的功能激活的免疫细胞采用1ml免疫细胞冻存液。由此，能够有效实现免疫细胞的冻存，并且冻存的细胞浓度高，适于大规模免疫细胞的冻存，冻存成本低，效果好。根据本发明的具体示例，每107-108个免疫细胞采用1ml所述免疫细胞冻存液。由此，冻存的细胞浓度高，适于大规模免疫细胞的冻存，冻存成本低，并且细胞冻存效果好。
根据本发明的实施例，该冻存进一步包括：将含有免疫细胞的所述免疫细胞冻存液进行程序降温处理，该程序降温处理的条件为：0-2分钟，免疫细胞的温度从4摄氏度下降到-1摄氏度；2-3分钟，免疫细胞的温度从-1摄氏度上升到0摄氏度；3-6分钟，免疫细胞的温度保持0摄氏度；6-11分钟，免疫细胞的温度从0摄氏度下降到-10摄氏度；11-16分钟，免疫细胞的温度保持-10摄氏度；16-50分钟，免疫细胞的温度从-10摄氏度下降到-45摄氏度；50-85分钟，免疫细胞的温度保持-45摄氏度；85-95分钟，免疫细胞的温度从-45摄氏度下降到-90摄氏度；95-100分钟，免疫细胞的温度保持-90摄氏度。由此，通过程序降温避免冷冻时细胞内冰晶的形成，保护细胞膜和细胞器免受损伤有利于细胞长期保持，对细胞的保护作用好。
根据本发明的实施例，免疫细胞冻存于液氮中。由此，有利于细胞长期保持，对细胞的保护作用好。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1：
利用本发明实施例的免疫细胞的诱导扩增方法，将分离的单个核细胞诱导扩增为免疫细胞，并检测免疫细胞的活性。
一、实验方法
1.准备抗人CD16包被的T75瓶
1.1在无菌培养瓶中加入经医用生理盐水溶解的2.5μg/mL抗人CD16单克隆抗体5mL，轻轻晃动培养瓶使抗体铺满培养面，4℃避光过夜。
1.2使用前回收抗体包被液，用5mL生理盐水洗涤培养瓶一次，再用5mL的T细胞扩增培养基(OpTmizerTMCTSTMT-cell expansion SFM)洗涤一次。
2.采集外周血，分离外周血血浆和单个核细胞
2.1用加入抗凝剂的无菌采血袋采集人外周血约100ml，预留1ml外周血做快检和血型鉴定，采血袋立即无菌封装，无菌4℃保存运输，准确记录采集信息。快检筛选合格后将外周血送入GMP实验室，若快检不合格，血样废弃处理。
2.2在GMP实验室中取出血袋，酒精消毒采血袋，观察无凝血和溶血后在超净台中打开血袋，将血液转移到至50ml无菌离心管中(≤40ml/管)，2500rpm离心15min。
2.3转移上层血浆到另一离无菌离心管中，3500rpm离心15min，收集上清血浆到新的无菌离心管中，用口膜密封离心管口，血细胞用于分离单个核细胞。
2.4将血浆放到56℃水浴锅中水浴30-50min灭活补体，3500rpm离心15min去除补体，10ml每支分装到15ml无菌离心管中，-20℃冻存备用；并留取7.5ml血浆进行慢检：病毒五项、支原体、内毒素和微生物，其中病毒由第三方检测为准。
2.5将步骤2中的血细胞沉淀用血浆等体积的生理盐水重悬后转移到250ml无菌玻璃瓶中，加入血液总体积1/3量的羟乙基淀粉，轻轻晃动盐水瓶使混合均匀，静置使红细胞沉降。
2.6待红细胞层沉降分层后，将上层乳白色悬液轻轻吸取到无菌离心管，1800rpm离心5min，弃去上清，沉淀用10ml生理盐水重悬。
2.7取无菌15ml离心管2支，各加入5ml常温人外周血淋巴细胞分离液，分别在上层轻轻加入各5ml细胞悬液。室温2000rpm慢升慢降离心25min。
2.8轻轻取出离心管，小心吸取界面中间云雾层白细胞至新的15ml离心管中，补加生理盐水洗涤2次。
2.9 1ml生理盐水重悬细胞，取5μl细胞加入到245μl生理盐水中稀释50倍，计数，并用台盼蓝染色计细胞存活率。实验结束的带血污物均经过配比过得新洁尔灭浸泡过夜才能丢弃。
2.10预留4.5x106个细胞进行流式抗体标记检测NK细胞的比例；剩余的单个核细胞细胞接种到加有20ml培养基的培养瓶中，培养基配比为：18mlOpTmizerTMCTSTMT-cellexpansion SFM培养基+2ml自体血浆(Autologousplasma)+终浓度1000IU/ml Pepro TechIL-2+终浓度0.01KE/ml沙培林(OK432)，37℃，5％CO2无菌培养，记为第0天。
2.11每日观察细胞，并进行适当传代扩增，培养基配比为培养基配比为：OpTmizerTMCTSTMT-cell expansion SFM培养基+10％自体血浆(Autologousplasma)+终浓度1000IU/ml Pepro Tech IL-2。当自体血浆已经用完时，不再补加血浆，即OpTmizerTMCTSTMT-cell expansion SFM培养基+终浓度1000IU/mlPeproTech IL-2。
2.12当培养体系已经达到2L时，更换培养体系，即SuperCulture TM L500人淋巴细胞无血清培养基+终浓度1000IU/ml国产IL-2，每日观察细胞，并进行适当传代。待14天时，进行细胞回收，留取10ml培养基上清进行Elisa分泌因子检测。
2.13将回收的细胞用200ml生理盐水重悬，并加入10ml人血清白蛋白，混匀；并从中取10ml细胞悬液待检，剩余的细胞注入回输袋中准备回输。从回输袋中抽取10ml细胞悬液进行检测：支原体、内毒素、微生物和病毒五项。
3.流式细胞仪检测细胞中淋巴细胞谱系
将取出的10ml细胞悬液，1800rpm离心回收细胞，进行流式抗体标记。设置同型对照、单标样品和染色管，每管样品细胞数约5×105个，然后加入对应抗体染色。4℃，30min放置，用生理盐水洗涤，然后上机检测分析淋巴细胞群中的NK细胞比例。
4.将剩余10ml细胞悬液上清，进行分装，用以检测病毒五项、内毒素、支原体、微生物。
5.裸鼠致瘤试验SPF级雌性BALB/c裸鼠，购于中国医学科学院实验动物研究所，4-6周龄，体重16-20g，于空气层流架中带盖鼠笼内饲养，饮用水、标准饲料及其它与动物接触品均经灭菌处理。取阳性对照Ragi细胞和K562细胞及待检测的体外诱导分化的第21天的NK细胞按3×107个/0.2ml接种裸鼠肋部皮下，用苦味酸标记，为期2个月观察成瘤情况。
6.将收细胞的培养基上清进行Elisa分泌因子检测，即IFN-γ、TNF-α和Perforin检测。
二、实验结果
1培养14天的实验结果
1.1培养14天后细胞可扩增150倍
所述取外周血淋巴细胞分离液分离后的6×107个外周血单个核细胞接种到20ml培养体系中，细胞很快进入对数生长阶段。培养14d后，培养体系扩大到4L，细胞数扩增到9×109，扩增倍数在最高达150倍，活细胞数在90％以上，培养不同时间的外周血单个核细胞数和细胞活性的结果详见图1。
1.2扩增后的外周血单个核细胞中的NK细胞比例明显升高
外周血单个核细胞经14天扩增后，淋巴细胞中的NK细胞比例(CD3-CD56+)由18.15％上升到95.27％，与此同时T淋巴细胞(CD3+)比例由72.15％下降到4.61％，辅助性T细胞(Th,CD3+CD4+)和细胞毒性T细胞(Tc,CD3+CD8a+)都有降低，B淋巴细胞(CD3-CD19+)基本消失，细胞均一性显著提高；结合图1中的细胞计数计算可知，培养14天后NK细胞扩增780倍，培养14天前后的外周血单个核细胞中的淋巴细胞比例的结果见图2，其中，NK细胞：CD3-CD56+；T细胞：CD3+；辅助性T细胞(Th)：CD3+CD4+；细胞毒性T细胞(Tc细胞)：CD3+CD8a+；B细胞：CD3-CD9+。
1.3培养扩增得到的细胞产品检测未发现病原体感染
我们将培养后的细胞和细胞悬液委托检测平台检测了乙肝表面抗原、饼干抗原、人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体特异性抗体、巨噬细胞病毒以及支原体、细菌和内毒素，检测结果均呈阴性，说明该批次产品是安全的，培养过程中没有造成污染，结果详见表1。
表1培养14天后的NK细胞临床安全性检测
2、培养12天的实验结果
2.1培养12天后细胞可扩增75倍
取外周血淋巴细胞分离液分离后的9×107个外周血单个核细胞接种到20ml培养体系中，细胞很快进入对数生长阶段。培养12d后，培养体系扩大到4L，细胞数扩增到6.76×109，扩增倍数在达75倍，活细胞数在90％以上，实验结果详见图3。
2.2扩增后的外周血单个核细胞中的NK细胞比例明显升高
外周血单个核细胞经12天扩增后，淋巴细胞中的NK细胞比例(CD3-CD56+)从第7天的32.87％上升到第12天的92.19％，与此同时T淋巴细胞(CD3+)比例下降到3.24％，辅助性T细胞(Th,CD3+CD4+)和细胞毒性T细胞(Tc,CD3+CD8a+)都有降低，B淋巴细胞(CD3-CD19+)基本消失，细胞均一性显著提高，培养12天前后的外周血单个核细胞中的淋巴细胞比例详见图4，其中，NK细胞：CD3-CD56+；T细胞：CD3+；辅助性T细胞(Th)：CD3+CD4+；细胞毒性T细胞(Tc细胞)：CD3+CD8a+；B细胞：CD3-CD9+。
2.3培养扩增得到的细胞产品检测未发现病原体感染
我们将培养后的细胞和细胞悬液委托检测平台检测了乙肝表面抗原、饼干抗原、人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体特异性抗体、巨噬细胞病毒以及支原体、细菌和内毒素，检测结果均呈阴性，说明该批次产品是安全的，培养过程中没有造成污染，结果详见表2。
表2培养12天后的NK细胞临床安全性检测
表3.培养基上清进行Elisa检测
实验1 实验2
IFN-γ 1.48x105pg/ml 1.435x105pg/ml
TNF-α 61.1pg/ml 48.75pg/ml
Perforin 19ng/ml 17.48ng/ml
所培养的细胞均有IFN-γ、TNF-α、Perforin的分泌。
3.培养扩增后的NK细胞不会在体内形成肿瘤
裸鼠致瘤实验结果如图5所示，其中，A生理盐水对照组(成瘤小鼠数/组内小鼠数，0/5)，B Raji细胞对照组(3/5)，C K562细胞对照组(4/5)，D NK细胞组(0/5)，即在2个月观察期内皮下注射0.2ml生理盐水组和3×107个/0.2ml培养21天的NK细胞组小鼠均未见肿瘤形成，注射形同体积的Raji细胞和K562细胞的小鼠分别有3/5和4/5只小鼠形成了可见的肿瘤。该结果说明即使培养到21天，NK细胞依然是安全有效的，不会导致肿瘤的形成。
实施例2
本实施例中，分别采用不含血浆的6种冻存液和含有血浆的6种冻存液，对实施例1体外诱导扩增的NK细胞进行冻存，比较冻存效果，以便观察血浆对NK细胞冻存保存的影响，以及降低DMSO浓度以减少细胞毒性的可能性。具体如下：
1、采用不含血浆的冻存液冻存NK细胞
1.1、NK细胞的冻存和复苏方法：
将实施例1体外诱导扩增第10天获得的NK细胞分别采用含HSA的六种冻存液进行冻存，其中六种冻存液的成份如下：
冻存液1：5体积％DMSO+10体积％HSA；
冻存液2：5体积％DMSO+15体积％HSA；
冻存液3：10体积％DMSO+10％体积HSA；
冻存液4：10体积％DMSO+15体积％HSA，
冻存液5：0.2体积％的DMSO+15体积％的HSA，配制完成后加入白酒草皂苷R至其终浓度为0.001g/ml；
冻存液6：0.4体积％的DMSO+10体积％的HSA，配制完成后加入白酒草皂苷R至其终浓度为0.001g/ml；
其中，冻存液1-6中剩余体积的均为1640或Stemspan培养基。
按照以下步骤冻存NK细胞：将冷冻保存液与细胞混匀后，速移入冻存管，并放入冻存盒中，-70℃程序降温过夜，次日转入液氮内。其中，每107个NK细胞采用1ml冻存液。
冷冻保存NK细胞30d，然后进行复苏。
检测冻存前后细胞的存活率，以及复苏后细胞回收率。具体地，冻存前以及冻存并复苏后的细胞存活率计算方法为：【活细胞数/(活细胞数+死细胞数)】×100％。复苏后细胞回收率的计算方法为：(复苏后活细胞数/冻存时活细胞数)×100％。
1.2、复苏NK细胞检查结果：
结果表明，复苏后细胞存活率均低于冻存前。具体地，冻存液3和4保存的细胞存活率明显优于冻存液1和2，且冻存液3和4之间未见差别，表明10体积％的DMSO对NK细胞具有较好的保护作用，且不同浓度的HSA对于NK细胞的保护作用无显著差别；冻存液3和4的细胞回收率也优于冻存液1和2。冻存液5和6的细胞回收率也优于冻存液1和2，尤其是冻存液5，细胞回收率高达99.3％。
各组冻存液的细胞回收率为：
冻存液1：62.5％；
冻存液2：61.3％；
冻存液3：73.3％；
冻存液4：75.1％，
冻存液5：99.3％；
冻存液6：77.1％；
2、采用含血浆的冻存液冻存NK细胞
2.1、分离获得脐带血单个核细胞，将单个核细胞细胞接种到加有20ml培养基的培养瓶中，培养基配比为：18ml OpTmizerTMCTSTMT-cell expansion SFM培养基+2ml自体血浆(Autologous plasma)+终浓度1000IU/ml Pepro Tech IL-2+终浓度0.01KE/ml沙培林(OK432)，37℃，5％CO2无菌培养，记为第0天。每日观察细胞，并进行适当传代扩增，培养基配比为培养基配比为：OpTmizerTMCTSTMT-cell expansion SFM培养基+10％自体血浆(Autologous plasma)+终浓度1000IU/ml Pepro Tech IL-2，诱导扩增得到NK细胞。
2.2、NK细胞的冻存和复苏方法：
分别采用含血浆的六种冷冻保存液，将上述体外诱导扩增10天获得的NK细胞进行冷冻保存，其中含血浆的六种冻存液的成份如下：
冻存液9：5体积％DMSO+40体积％血浆；
冻存液10：10体积％DMSO+40体积％血浆；
冻存液11：5体积％DMSO+5体积％HSA+40体积％血浆；
冻存液12：10体积％DMSO+5体积％HSA+40体积％血浆，
冻存液13：0.2体积％的DMSO+15体积％的HSA+40体积％血浆，配制完成后加入白酒草皂苷R至其终浓度为0.001g/ml；
冻存液14：0.4体积％的DMSO+10体积％的HSA+40体积％血浆，配制完成后加入白酒草皂苷R至其终浓度为0.001g/ml；
其中，在冻存液9-14中，血浆为自体血浆，剩余体积的均为1640或Stemspan培养基。
其中，按照以下步骤冻存NK细胞：将冷冻保存液与细胞混匀后，速移入冻存管，并放入冻存盒中，-70℃程序降温过夜，次日转入液氮内。其中，每107个NK细胞采用1ml冻存液。
冷冻保存NK细胞30d，然后进行复苏。
检测冻存前后细胞的存活率、增殖能力、细胞表面标志表达情况，以及复苏后细胞回收率。具体地，冻存前以及冻存并复苏后的细胞存活率计算方法为：【活细胞数/(活细胞数+死细胞数)】×100％。复苏后细胞回收率的计算方法为：(复苏后活细胞数/冻存时活细胞数)×100％。利用流式细胞仪检测NK细胞细胞表面标志CD3-CD56+的表达情况。
2.3、复苏NK细胞检查结果：
结果表明，六种保存液保存的免疫细胞存活率和细胞表面标志表达情况与冻存前相比无显著差别，细胞回收率高于“步骤1”中不含血浆的冻存液。并且，冷冻保存液5和6，9和10冻存的细胞复苏后均具有一定的增殖能力，13和14冻存液冻存的细胞具有旺盛的繁殖能力。由此，表明血浆以及白酒草皂苷R对细胞有很好的保护作用。
各组冻存液的细胞回收率为：
冻存液7：71.3％；
冻存液8：72.8％；
冻存液9：83.1％；
冻存液10：83.5％，
冻存液11：99.7％；
冻存液12：92.1％；
综上，发明人采用DMSO、HAS、白酒草皂苷R和血浆不同浓度配比，保存脐血单个核细胞诱导的免疫细胞，观察冻存液效果，结果表明，10体积％DMSO具有较好的细胞保护作用；而不同浓度的HSA对免疫细胞的保护作用无显著差别。而采用本发明实施例的自体血浆与HSA和DMSO联用或者进一步联用白酒草皂苷R的冻存液保存体外诱导的免疫细胞，复苏后细胞回收率高，细胞活性好，具有一定的增殖能力，而其余各组冷冻液保存的细胞回收率偏低。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (1)

1.一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法，其特征在于，包括：
利用CD16抗体包被培养容器，以便得到包被后的培养容器；
利用免疫细胞激活培养基将单个核细胞置于所述包被后的培养容器中进行免疫细胞激活培养基，以便得到初步诱导扩增的免疫细胞；
利用免疫细胞扩增培养基将所述初步诱导扩增的免疫细胞进行第二诱导扩增培养，以便得到分化的免疫细胞；
利用免疫细胞规模化扩增培养基将所述分化的免疫细胞进行第三诱导扩增培养，以便获得大规模的功能激活的免疫细胞；以及
利用免疫细胞冻存液冻存所述大规模的功能激活的免疫细胞，
其中，
所述免疫细胞激活培养基基为添加了第一血浆、白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基；
所述免疫细胞扩增培养基为添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基；
所述免疫细胞规模化扩增培养为添加了白介素-2的无血清淋巴细胞培养基；
所述免疫细胞激活培养基基和所述免疫细胞扩增培养基中，所述沙培林的浓度均为0.007-0.013KE/ml；
所述免疫细胞激活培养基基、所述免疫细胞扩增培养基和所述免疫细胞规模化扩增培养中，所述白介素-2的浓度均为700-1300IU/ml；
所述免疫细胞激活培养基基、所述免疫细胞扩增培养基和所述免疫细胞规模化扩增培养中，所述无血清淋巴细胞培养基均为OpTmizerTMCTSTM无血清培养基或SuperCultureTML500人淋巴细胞无血清培养基；
所述免疫细胞激活培养基基中，所述第一血浆的浓度为7-13体积％；
所述免疫细胞冻存液包含：
0.2-0.8体积％的DMSO；
2-15体积％的HSA；
20-88体积％的血浆；
0.001g/ml的白酒草皂苷R；
以及余量培养基；
所述培养基为1640培养基或Stemspan培养基。
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