CN104222069B - 红系祖细胞冻存液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了红系祖细胞冻存液及其应用，其中，该红系祖细胞冻存液包含：DMSO；HSA；以及血浆。该冻存液能够有效保存红系祖细胞，并且保存时间长，细胞复苏后增殖能力强，细胞回收率高。

Description

红系祖细胞冻存液及其应用

技术领域

本发明涉及细胞冻存领域，特别是干细胞冻存领域。具体地，涉及红系祖细胞冻存领域。更具体地，涉及红系祖细胞冻存液、用于冻存红系祖细胞的试剂盒以及冻存红系祖细胞的方法。

背景技术

近年来由于血液来源紧张以及输血相关疾病的发生使人们期望寻找更为安全、充足的血液来源。研究表明干细胞在体外能够诱导分化为红细胞可作为新的血液来源。除了成熟红细胞外，红系祖细胞也可以替代临床红细胞输注，发挥其造血支持治疗作用，而且红系祖细胞能够在体内继续增殖，对于很多需要反复输血治疗的患者，有望减少输血次数以及输血产生的副作用，从而，红系祖细胞为临床血液供应提供新的替代途径。

目前临床用的红细胞产品体外保存时间较短，而红系祖细胞作为有核细胞可以在体外进行长期冻存，如果能够对体外诱导分化的红系祖细胞长期的保存，并在复苏后保持其祖细胞特性，将更有利于临床输血应用。但是对于红系祖细胞这一特定的细胞类型尚缺乏冻存方面相关研究。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种用于红系祖细胞长期保存，并能够在复苏后保持其祖细胞特性的冻存液。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

DMSO是常用的细胞冷冻保存剂，单独使用保存红系祖细胞存活率仅为(51.20±10.13)％。因而，发明人致力于寻找能够促进冷冻保存下红系祖细胞存活率的成分，以便与DMSO联用，以便通过其与DMSO协同作用，达到能够长期保存红系祖细胞的效果。例如，发明人利用DMSO(二甲基亚砜，Dimethylsulfoxide)协同海藻糖对体外诱导10d的脐带血红系祖细胞进行冷冻保存，发现细胞存活率由冻存前的(93.27±1.79)％降至(48.37±9.14)％，冷冻保存作用并不理想。然而，人血清白蛋白在冷冻复苏过程中能够调节渗透压，而血浆中又含有多种营养成分，因而，发明人尝试将血浆和HSA(人血清白蛋白，HumanSerumAlbumin)与DMSO结合，制备红系祖细胞的冻存液，结果发现，这种冻存液对冻存细胞有较好的保护作用，冻存细胞复苏后增殖能力强，细胞回收率高。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种红系祖细胞冻存液。根据本发明的实施例，该冻存液包含DMSO；HSA；以及血浆。发明人惊奇的发现，该冻存液能够有效用于冻存红系祖细胞，细胞复苏后增殖能力强，细胞回收率高。

根据本发明的实施例，所述DMSO的浓度为2体积％-10体积％，优选10体积％。由此，对红系祖细胞的冻存效果好。

根据本发明的实施例，所述HSA的浓度为2体积％-5体积％。由此，有利于在冷冻复苏过程中调节渗透压，对细胞保护作用好，并且冻存液成本低。根据本发明的一些具体示例，所述HSA的浓度为2体积％。由此，冷冻复苏过程中渗透压调节效果好，从而能够有效保护细胞，提高细胞存活率，并且保证冻存液成本。

根据本发明的实施例，所述血浆的浓度为20体积％-88体积％。由此，有利于冻存细胞的保护，细胞复苏后增殖能力好。根据本发明具体示例，所述血浆的浓度为60体积％。由此，对细胞的保护作用突出，细胞复苏后增殖能力强。根据本发明的实施例，所述血浆为自体血浆。

根据本发明的实施例，当所述DMSO、HSA和血浆的体积百分数之和小于1时，所述红系祖细胞冻存液进一步包含剩余体积的IMDM或Stemspan培养基。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于冻存红系祖细胞的试剂盒，其包含前面所述的红系祖细胞冻存液。发明人惊奇的发现，该试剂盒能够有效用于冻存红系祖细胞，且细胞有效保存时间长，复苏后细胞增殖能力强，细胞回收率高。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种冻存红系祖细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法利用前面所述的红系祖细胞冻存液或者试剂盒，冻存所述红系祖细胞。发明人惊奇的发现，采用该方法冻存红系祖细胞，细胞有效保存时间长，复苏后细胞增殖能力强，细胞回收率高。

根据本发明的实施例，每10⁵-10⁷个红系祖细胞采用1ml所述红系祖细胞冻存液。由此，能够有效实现红系祖细胞的冻存。根据本发明的具体示例，每10⁶个红系祖细胞采用1ml所述红系祖细胞冻存液。由此，细胞冻存效果好。

根据本发明的实施例，于液氮中进行所述冻存。由此，有利于细胞长期保持，对细胞的保护作用好。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例，经冻存液1-4冻存并复苏后的红系祖细胞的细胞增殖曲线(n＝6，即每个样品的吸光度值均为重复测定6次后所取的平均值)；

图2显示了根据本发明一个实施例，经冻存液5-8冻存并复苏后的红系祖细胞的增殖曲线(n＝4，即每个样品的吸光度值均为重复测定4次后所取的平均值)。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种红系祖细胞冻存液。根据本发明实施例，该细胞冻存液冻存的细胞种类不受特别的限制，只要冻存液能用于长期保存细胞即可。根据本发明的实施例，该冻存液包含DMSO；HSA；以及血浆。发明人惊奇的发现，该冻存液能够有效用于保存红系祖细胞，并且冻存时间长(冻存时间可达几年甚至更长)，细胞复苏后增殖能力强，细胞回收率高。

根据本发明的实施例，所述DMSO的浓度为2体积％-10体积％。由此，对细胞冻存效果好。根据本发明具体示例，DMSO的浓度为10体积％。由此，对细胞冻存效果突出。

根据本发明的实施例，所述HSA的浓度为2体积％-5体积％。由此，有利于在冷冻复苏过程中调节渗透压，对细胞保护作用好，并且冻存液成本低。根据本发明的一些具体示例，所述HSA的浓度为2体积％。由此，冷冻复苏过程中渗透压调节效果好，从而能够有效保护细胞，提高细胞存活率，并且保证冻存液成本。

根据本发明的实施例，所述血浆的浓度为20体积％-88体积％。由此，有利于冻存细胞的保护，细胞复苏后增殖能力好。根据本发明具体示例，所述血浆的浓度为60体积％。由此，对细胞的保护作用突出，细胞复苏后增殖能力强。根据本发明的实施例，所述血浆为自体血浆。其中，需要说明的是，在本文中所使用的术语“自体血浆”是指与待冻存的红系祖细胞具有同一来源的血浆。换言之，即该血浆与要利用冻存液冻存的红系祖细胞取自同一个体。由此，对自体的红系祖细胞排异作用小，有利于冻存细胞的保护。

根据本发明的实施例，当所述DMSO、HSA和血浆的体积百分数之和小于1时，所述红系祖细胞冻存液进一步包含剩余体积的IMDM或stemspan培养基。例如，在所述红系祖细胞冻存液中，当所述DMSO的浓度为10体积％、所述HSA的浓度为2％体积，所述血浆的浓度为88％体积时，所述红系祖细胞冻存液不包含IMDM或stemspan培养基；当所述DMSO的浓度为5体积％、所述HSA的浓度为2％体积，所述血浆的浓度为88％体积时，所述红系祖细胞冻存液包含5％体积的IMDM或stemspan培养基；当所述DMSO的浓度为10体积％、所述HSA的浓度为2％体积，所述血浆的浓度为20％体积时，所述红系祖细胞冻存液包含68％体积的IMDM或stemspan培养基。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于冻存红系祖细胞的试剂盒，其包含前面所述的红系祖细胞冻存液。发明人惊奇的发现，该试剂盒能够有效用于冻存红系祖细胞，且细胞有效保存时间长，复苏后细胞增殖能力强，细胞回收率高。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种冻存红系祖细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法利用前面所述的红系祖细胞冻存液或者试剂盒，冻存所述红系祖细胞。发明人惊奇的发现，采用该方法冻存红系祖细胞，细胞有效保存时间长，复苏后细胞增殖能力强，细胞回收率高。

根据本发明的实施例，每10⁵-10⁷个红系祖细胞采用1ml所述红系祖细胞冻存液。由此，能够有效实现红系祖细胞的冻存。根据本发明的具体示例，每10⁶个红系祖细胞采用1ml所述红系祖细胞冻存液。由此，细胞冻存效果好。

根据本发明的实施例，所述红系祖细胞冻存于液氮中。由此，有利于细胞长期保持，对细胞的保护作用好。

根据本发明的一些实施例，本发明的冻存红系祖细胞的方法可以包括：将红系祖细胞与本发明的红系祖细胞冻存液混合后，于液氮中进行冻存。

根据本发明的一些具体示例，可以按照以下步骤冻存红系祖细胞：将本发明的红系祖细胞冻存液与待冻存的红系祖细胞混匀后，速移入冻存管，并放入冻存盒中，-70℃梯度降温过夜，次日转入液氮内保存。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

发明人分别采用不含血浆的4种冻存液和含有血浆的4种冻存液，对体外诱导扩增的红系祖细胞进行冻存，比较冻存效果，以便观察脐血浆对红系祖细胞冻存的影响，以及降低DMSO浓度以减少细胞毒性的可能性。具体如下：

1、采用不含血浆的冻存液冻存红系祖细胞

1.1、分离获得脐带血单个核细胞，并采用添加了SCF、IGF-1、EPO、转铁蛋白和地塞米松的Stemspan培养基(其中SCF的浓度为100ng/mL，IGF-1的浓度为40ng/mL，EPO的浓度为5U/mL，转铁蛋白的浓度为100μg/mL，地塞米松的浓度为1μM)，于T25细胞培养瓶中，在培养液体积为5ml，细胞密度为2x10⁶/ml，37摄氏度，5％CO₂培养箱的条件下诱导扩增红系祖细胞10天。

1.2、红系祖细胞的冻存和复苏方法：

将上述体外诱导扩增第10天获得的红系祖细胞分别采用含HSA的四种冻存液进行冻存，其中四种冻存液的成份如下：

冻存液1：5体积％DMSO+2体积％HSA；

冻存液2：5体积％DMSO+5体积％HSA；

冻存液3：10％体积DMSO+2％体积HSA；

冻存液4：10体积％DMSO+5体积％HSA，

其中，冻存液1-4中剩余体积的均为IMDM(或Stemspan)培养基。

按照以下步骤冻存红系祖细胞：将冷冻保存液与细胞混匀后，速移入冻存管，并放入冻存盒中，-70℃梯度降温过夜，次日转入液氮内。其中，每10⁶个红系祖细胞采用1ml冻存液。

冷冻保存红系祖细胞30d，然后进行复苏。

检测冻存前后细胞的存活率、增殖能力，以及复苏后细胞回收率。具体地，冻存前以及冻存并复苏后的细胞存活率计算方法为：【活细胞数/(活细胞数+死细胞数)】×100％。复苏后细胞回收率的计算方法为：(复苏后活细胞数/冻存时活细胞数)×100％，其中，利用CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所生产，货号CK04)测定细胞增殖能力。

1.3、复苏红系祖细胞检查结果：

结果表明，复苏后细胞存活率均低于冻存前。具体地，冻存液3和4保存的细胞存活率明显优于冻存液1和2，且冻存液3和4之间未见差别(P>0.05)，表明10体积％的DMSO对红系祖细胞具有较好的保护作用，且不同浓度的HSA对于红系祖细胞的保护作用无显著差别(见表1)；冻存液3和4的细胞回收率均达到90％以上，明显优于冻存液1和2(见表2)。

表1冻存前后的细胞存活率检测结果(n＝6)

注：^※：与冻存液1相比，差异显著(p＜0.050)；

^※※：与冻存液1相比，差异非常显著(p＜0.01)；

^##与冻存液2相比，差异非常显著(p＜0.01)。

表2不同冻存液保存细胞复苏后细胞回收率检测结果(n＝6)

细胞增殖能力检测结果见图1。由图1可知，冻存液3和4保存的细胞复苏后增殖能力明显优于冻存液1和2，表明10体积％的DMSO对红系祖细胞具有较好的保护作用，而2体积％HSA与5体积％HSA对于红系祖细胞的保护作用无显著差别。

2、采用含血浆的冻存液冻存红系祖细胞

2.1、分离获得脐带血单个核细胞，并采用添加了SCF、IGF-1、EPO、转铁蛋白和地塞米松的Stemspan培养基(其中SCF的浓度为100ng/mL，IGF-1的浓度为40ng/mL，EPO的浓度为5U/mL，转铁蛋白的浓度为100μg/mL，地塞米松的浓度为1μM)，于T25细胞培养瓶中，在培养液体积为5ml，细胞密度为2x10⁶/ml，37摄氏度，5％CO₂培养箱的条件下诱导扩增红系祖细胞14天。

2.2、红系祖细胞的冻存和复苏方法：

分别采用含血浆的四种冷冻保存液，将上述体外诱导扩增14天获得的红系祖细胞进行冷冻保存，其中含血浆的四种冻存液的成份如下：

冻存液5：10体积％DMSO+血浆；

冻存液6：5体积％DMSO+血浆；

冻存液7：10体积％DMSO+2体积％HSA+血浆；

冻存液8：5体积％DMSO+2体积％HSA+血浆，

其中，在冻存液5-8中，血浆为自体血浆，血浆的浓度均为60体积％，剩余体积的均为IMDM(或Stemspan)培养基。

其中，按照以下步骤冻存红系祖细胞：将冷冻保存液与细胞混匀后，速移入冻存管，并放入冻存盒中，-70℃梯度降温过夜，次日转入液氮内。其中，每10⁶个红系祖细胞采用1ml冻存液。

冷冻保存红系祖细胞30d，然后进行复苏。

检测冻存前后细胞的存活率、增殖能力、细胞表面标志表达情况，以及复苏后细胞回收率。具体地，冻存前以及冻存并复苏后的细胞存活率计算方法为：【活细胞数/(活细胞数+死细胞数)】×100％。复苏后细胞回收率的计算方法为：(复苏后活细胞数/冻存时活细胞数)×100％，其中，利用CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所生产，货号CK04)测定细胞增殖能力。利用流式细胞仪检测红系祖细胞细胞表面标志CD71⁺、CD235a⁺的表达情况。

2.3、复苏红系祖细胞检查结果：

结果表明，四种保存液保存的红系祖细胞存活率和细胞表面标志表达情况与冻存前相比无显著差别(表3)，细胞回收率均达到99％以上(表4)。细胞增殖曲线(见图2)显示，冷冻保存液7保存的细胞复苏后具有较好增殖能力。由此，表明血浆对细胞有很好的保护作用，冷冻保存液7(10体积％DMSO+2体积％HSA+血浆)保存的细胞复苏后细胞具有较好增殖能力。

表3冻存前后的细胞存活率和表面标志表达检测结果(n＝3)

表4不同冻存液保存细胞复苏后细胞回收率检测结果(n＝3)

检测指标	冻存液5	冻存液6	冻存液7	冻存液8
					细胞回收率(％)	100.00±1.50	99.18±2.66	100.00±5.86	99.75±3.99

其中，需要说明的是，在表1-4中，“n”均表示重复测定次数，“n＝6”表示表中各数值均为重复测定6次后所取的平均值，“n＝3”表示表中各数值均为重复测定3次后所取的平均值。

综上，发明人采用DMSO、HSA和血浆不同浓度配比，保存脐血单个核细胞诱导的红系祖细胞，观察冻存液效果，结果表明，10体积％DMSO具有较好的细胞保护作用；冻存液采用10体积％DMSO+2体积％HSA与10体积％DMSO+5体积％HSA对红系祖细胞的保护作用无显著差别。采用自体血浆与2体积％HSA+10体积％DMSO联用保存体外诱导的红系祖细胞，复苏后细胞增殖能力强，细胞回收率达100％，而其余各组冷冻液保存的细胞增值能力弱，可能与DMSO浓度偏低或无HSA保护作用有关。研究表明，血浆对脐血单个核细胞诱导分化的红系祖细胞有保护作用，与10体积％DMSO+2体积％HSA联用效果更佳，即冻存液7对红系祖细胞的冻存效果最佳。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种红系祖细胞冻存液，其特征在于，包含：

2体积％-10体积％DMSO；

2体积％-5体积％HSA；以及

60体积％-88体积％血浆。

2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述DMSO的浓度为10体积％。

3.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述HSA的浓度为2体积％。

4.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，当所述DMSO、HSA和血浆的体积百分数之和小于1时，所述红系祖细胞冻存液进一步包含剩余体积的IMDM或Stemspan培养基。

5.根据权利要求1所述冻存液，其特征在于，所述血浆为自体血浆。

6.一种用于冻存红系祖细胞的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-5任一项所述的红系祖细胞冻存液。

7.一种冻存红系祖细胞的方法，其特征在于，

利用权利要求1-5任一项所述的红系祖细胞冻存液或者权利要求6所述的试剂盒，冻存所述红系祖细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，每10⁵-10⁷个红系祖细胞采用1ml所述红系祖细胞冻存液。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，每10⁶个红系祖细胞采用1ml所述红系祖细胞冻存液。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，于液氮中进行所述冻存。