CN105613484A - 巨核祖细胞冻存液及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了巨核祖细胞冻存液及其应用。其中，该巨核祖细胞冻存液包括：DMSO和血浆。该冻存液能够有效用于冻存巨核祖细胞，细胞复苏后存活率和回收率高。

Description

巨核祖细胞冻存液及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体地，涉及巨核祖细胞冻存液及其应用，更具体地，涉及巨核祖细胞冻存液、用于冻存巨核祖细胞的试剂盒和冻存巨核祖细胞的方法。
背景技术
近年来肿瘤发病率呈上升趋势，肿瘤放化疗患者血液检查常出现血小板减少，临床上以输注机采血小板作为治疗手段。由于血源紧张且需要反复输注血小板，因此寻找新的血小板来源十分必要。脐血造血干/祖细胞能够分化为巨核祖细胞，并进一步发育成熟产生血小板，因此有望通过体外回输巨核祖细胞以提高血液中血小板的数量，缓解或替代血源紧张造成的血小板缺乏。
目前临床用的血小板产品体外保存时间较短，而巨核祖细胞作为有核细胞可以在体外进行长期冻存，如果能够对体外诱导分化的巨核祖细胞长期的保存，并在复苏后保持其祖细胞特性，将更有利于临床治疗应用。但是对于巨核祖细胞这一特定的细胞类型尚缺乏冻存方面相关研究。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种用于巨核祖细胞长期保存，并能够在复苏后保持其祖细胞特性的冻存液。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种巨核祖细胞冻存液。根据本发明的实施例，该巨核祖细胞冻存液包括：DMSO；和血浆。发明人惊奇的发现，该冻存液能够有效用于冻存巨核祖细胞，细胞复苏后存活率和回收率高。
另外，根据本发明上述实施例的巨核祖细胞冻存液还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，所述DMSO的浓度为(5-15)体积％，优选地，为10体积％。
根据本发明的实施例，所述血浆的浓度为(30-90)体积％，优选地，为80体积％。
根据本发明的实施例，该巨核祖细胞冻存液进一步包括泊洛沙姆。
根据本发明的实施例，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188(P188)或泊洛沙姆407(P407)。
根据本发明的实施例，所述泊洛沙姆188的浓度为0.2-1mg/ml，优选地，为0.5mg/ml。
根据本发明的实施例，所述泊洛沙姆407的浓度为0.2-1mg/ml，优选地，为0.5mg/ml。
根据本发明的实施例，当所述DMSO和血浆的体积百分数之和小于1时，所述巨核祖细胞冻存液进一步包含剩余体积的IMDM或Stemspan培养基。
根据本发明的实施例，所述血浆为自体血浆。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于冻存巨核祖细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含前述的巨核祖细胞冻存液。发明人惊奇的发现，该试剂盒能够有效用于冻存巨核祖细胞，细胞复苏后存活率和回收率高。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种冻存巨核祖细胞的方法。根据本发明的实施例，利用前述的巨核祖细胞冻存液或者前述的试剂盒，冻存所述巨核祖细胞。根据本发明实施例的冻存巨核祖细胞的方法，该方法能够有效用于冻存巨核祖细胞，细胞复苏后回收率高。
根据本发明的实施例，每105-107个巨核祖细胞采用1ml所述巨核祖细胞冻存液，优选地，每106个巨核祖细胞采用1ml所述巨核祖细胞冻存液。
根据本发明的实施例，于液氮中进行所述冻存。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种巨核祖细胞冻存液。根据本发明实施例，该细胞冻存液冻存的细胞种类不受特别的限制，只要冻存液能用于长期保存细胞即可，优选地，为巨核祖细胞。根据本发明的实施例，该巨核祖细胞冻存液包括：DMSO；和血浆。发明人惊奇的发现，该冻存液能够有效用于冻存巨核祖细胞，冻存的细胞复苏后，细胞的存活率和回收率高。
根据本发明的实施例，DMSO的浓度为(5-15)体积％。由此，细胞的冻存效果好。根据本发明的优选示例，DMSO的浓度为10体积％。由此，细胞的冻存效果突出。
根据本发明的实施例，血浆的浓度为(30-90)体积％。血浆中含有血清及多种营养成分，对细胞有良好的保护作用，当血浆的浓度为(30-90)体积％时，例如，血浆浓度为40体积％，50体积％、60体积％、70体积％、或80体积％，冻存液对细胞的保护作用好，细胞复苏后的存活率高。根据本发明的优选实施例，当血浆的浓度为80体积％时，对细胞的保护作用突出，细胞复苏后的存活率高。根据本发明的实施例，所述血浆为自体血浆。其中，需要说明的是，在本文中所使用的术语“自体血浆”是指与待冻存的巨核祖细胞具有同一来源的血浆。换言之，即该血浆与要利用冻存液冻存的巨核祖细胞取自同一个体。由此，对自体的巨核祖细胞排异作用小，有利于冻存细胞的保护。
根据本发明的实施例，该巨核祖细胞冻存液进一步包括泊洛沙姆。泊洛沙姆一种非离子型高分子表面活性剂，在药物制剂中主要用作乳化剂和增溶剂。发明人研究发现，泊洛沙姆能够促进造血干祖细胞增殖和/或巨核分化，当冻存液中添加泊洛沙姆后，细胞的回收率显著提高。根据本发明的实施例，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188或泊洛沙姆407。由此，对细胞的回收率的提高作用更佳。根据本发明的实施例，泊洛沙姆188的浓度为0.2-1mg/ml。由此，细胞复苏后回收率高。根据本发明的一些优选实施例，泊洛沙姆188的浓度为0.5mg/ml。由此，细胞复苏后回收率更高。根据本发明的实施例，泊洛沙姆407的浓度为0.2-1mg/ml。由此，细胞复苏后回收率高。根据本发明的一些优选实施例，泊洛沙姆407的浓度为0.5mg/ml。由此，细胞复苏回收率更高。
根据本发明的实施例，当所述DMSO和血浆的体积百分数之和小于1时，所述巨核祖细胞冻存液进一步包含剩余体积的IMDM或stemspan培养基。例如，在所述巨核祖细胞冻存液中，当所述DMSO的浓度为10体积％、所述血浆的浓度为90％体积时，所述巨核祖细胞冻存液不包含IMDM或stemspan培养基；当所述DMSO的浓度为10体积％，所述血浆的浓度为80％体积时，所述巨核祖细胞冻存液包含10％体积的IMDM或stemspan培养基；当所述DMSO的浓度为5体积％，所述血浆的浓度为70％体积时，所述巨核祖细胞冻存液包含25％体积的IMDM或stemspan培养基。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于冻存巨核祖细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含前述的巨核祖细胞冻存液。发明人惊奇的发现，该试剂盒能够有效用于冻存巨核祖细胞，细胞复苏后存活率和回收率高。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种冻存巨核祖细胞的方法。根据本发明的实施例，利用前述的巨核祖细胞冻存液或者前述的试剂盒，冻存所述巨核祖细胞。根据本发明实施例的冻存巨核祖细胞的方法，该方法能够有效用于冻存巨核祖细胞，细胞复苏后存活率和回收率高。
根据本发明的实施例，每105-107个巨核祖细胞采用1ml所述巨核祖细胞冻存液。由此，能够有效实现巨核祖细胞的冻存。根据本发明的优选实施例，每106个巨核祖细胞采用1ml所述巨核祖细胞冻存液。由此，细胞冻存效果好。
根据本发明的实施例，于液氮中进行所述冻存。由此，有利于细胞长期保持，对细胞的保护作用好。
根据本发明的一些实施例，本发明的冻存巨核祖细胞的方法可以包括：将巨核祖细胞与本发明的巨核祖细胞冻存液混合后，于液氮中进行冻存。
根据本发明的一些具体示例，可以按照以下步骤冻存巨核祖细胞：将本发明的巨核祖细胞冻存液与待冻存的巨核祖细胞混匀后，速移入冻存管，并放入冻存盒中，-70℃梯度降温过夜，次日转入液氮内保存。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
发明人分别采用仅含DMSO和培养基的冻存液、市售的07930冻存液，不含血浆而含有HSA的冻存液，以及本发明的含有血浆的冻存液共7种，分别对体外诱导扩增的巨核祖细胞进行冻存，比较冻存效果，以便观察脐血浆和泊洛沙姆对巨核祖细胞冻存保存的影响，具体如下：
1、实验方法
(1)分离获得脐带血单个核细胞，体外诱导扩增巨核祖细胞10天，获得扩增后的巨核祖细胞。
(2)将上述体外诱导扩增第10天获得的巨核祖细胞，分别采用七种冻存液进行冻存，其中，七种冻存液的成份见表1，冻存液的剩余体积的均为IMDM(或Stemspan)培养基。其中，冻存方法如下：将冷冻保存液与细胞混匀后，速移入冻存管，并放入冻存盒中，-70℃梯度降温过夜，次日转入液氮内。其中，每1ml冻存液，冻存细胞数为6×106。
(3)冷冻保存巨核祖细胞30天，然后进行复苏。
(4)检测冻存前后细胞的存活率、细胞数以及复苏后细胞回收率。具体地，冻存前以及冻存并复苏后的细胞存活率计算方法为：【活细胞数/(活细胞数+死细胞数)】×100％。细胞回收率计算方法：【冻存复苏后活细胞数/冻存前活细胞数】×100％。
2、实验结果
结果表明，第5组冻存液(10％DMSO+80％血浆+p188)和第6组冻存液(10％DMSO+80％血浆)保存细胞存活率高，而加入p188可回收更多的细胞。实验结果说明冻存液中含有血浆能够高效地提高细胞的存活率，并且回收的细胞数量多，而泊洛沙姆能进一步提高细胞的存活率和回收的细胞数量。
表1不同冻存液对体外诱导10天的巨核祖细胞冷冻保存效果的影响(n＝3)
实施例2
按照实施例1的方法对巨核祖细胞进行冻存，不同的是冻存的细胞是体外诱导14天的巨核祖细胞，以及部分冻存液的成份不同，冻存液的具体成份见表2。
表2不同冻存液对体外诱导14天的巨核祖细胞冷冻保存效果的影响(n＝3)
结果表明，血浆能够高效地提高冻存液的存活率，并且回收的细胞数量多，并且在一定范围内，随着血浆浓度的增加，细胞的存活率和回收的细胞数也增加。并且，P188和P407在一定程度上能进一步提高细胞的存活率和回收的细胞数量。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种巨核祖细胞冻存液，其特征在于，包括：
DMSO；和
血浆。
2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述DMSO的浓度为(5-15)体积％，优选地，为10体积％。
3.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述血浆的浓度为(30-90)体积％，优选地，为80体积％。
4.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，进一步包括泊洛沙姆，
任选地，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188或泊洛沙姆407，
任选地，所述泊洛沙姆188的浓度为0.2-1mg/ml，优选地，为0.5mg/ml，
任选地，所述泊洛沙姆407的浓度为0.2-1mg/ml，优选地，为0.5mg/ml。
5.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，当所述DMSO和所述血浆的体积百分数之和小于1时，所述巨核祖细胞冻存液进一步包含剩余体积的IMDM或Stemspan培养基。
6.根据权利要求1所述冻存液，其特征在于，所述血浆为自体血浆。
7.一种用于冻存巨核祖细胞的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-6任一项所述的巨核祖细胞冻存液。
8.一种冻存巨核祖细胞的方法，其特征在于，
利用权利要求1-6任一项所述的巨核祖细胞冻存液或者权利要求7所述的试剂盒，冻存所述巨核祖细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，每105-107个巨核祖细胞采用1ml所述巨核祖细胞冻存液，优选地，每106个巨核祖细胞采用1ml所述巨核祖细胞冻存液。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，于液氮中进行所述冻存。
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