CN104232582A - 泊洛沙姆在诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了泊洛沙姆在诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化中的用途。在造血干祖细胞增殖和/或巨核分化体系中添加泊洛沙姆，能够诱导、促进造血干祖细胞增殖和/或巨核分化，且增殖快，巨核分化效率高。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是造血干祖细胞增殖和巨核祖细胞增殖、诱导分化领域。具体地，本发明涉及泊洛沙姆在诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化中的用途、用于诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化的培养基、用于诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化的试剂盒以及促进造血干祖细胞增殖和/或巨核分化的方法。
背景技术
近年来肿瘤发病率呈上升趋势，肿瘤放化疗病人血液学检查常出现血小板减少，临床上往往通过输注机采血小板作为治疗手段，由于血源紧张且需要反复输注血小板，迫使发明人寻找新的血小板来源。造血干祖细胞是具有自我更新和多向分化潜能的造血前体细胞，目前已用于恶性及非恶性血液病、实体肿瘤等多种疾病的治疗。造血干祖细胞可来源于骨髓、外周血和脐带血等，其中脐带血造血干祖细胞具有增殖能力强、免疫原性低、易于获得等优点，已成为人们关注的焦点。脐血造血干祖细胞能够分化为巨核祖细胞，并进一步发育成熟产生血小板，因此有望通过体外回输巨核祖细胞以提高血液中血小板的数量，缓解或替代血源紧张造成的血小板缺乏。
然而，目前的造血干祖细胞和/或巨核祖细胞增殖以及巨核分化体系，还存在增殖、诱导分化效率低，细胞活性低，易污染，巨核祖细胞诱导表达水平低等问题，仍需改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种增殖、诱导分化效率高的诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化的方法。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
泊洛沙姆(poloxamer)为聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，根据聚合物中环氧乙烷和环氧丙烷的配比，泊洛沙姆具有一系列不同分子量和含聚氧丙烯、聚氧乙烯含量的品种。泊洛沙姆的聚氧乙烯链具有相对亲水性，聚氧丙烯链具有相对亲油性，因此是一种非离子型高分子表面活性剂，在药物制剂中主要用作乳化剂和增溶剂。泊洛沙姆188(poloxamer 188)的结构式为PEO76PPO29PEO76，其具有很高的安全性，且毒性低、无刺激性过敏、无抗原性、生物相容性好、化学性质稳定、乳化能力强。泊洛沙姆407(poloxamer 407)的结构式为PEO100PPO65PEO100，表面活性高和安全性好，其分子量较大，亲水性强，毒性最低，常用于药剂学中的消泡剂、增溶剂和药物控释辅料等。
然而，本发明的发明人采用脐带血造血干祖细胞作为种子细胞并进行巨核祖细胞诱导分化研究时，意外发现与仅加因子组合的培养基相比，含不同细胞因子组合的培养基辅助泊洛沙姆188或泊洛沙姆407体外诱导脐带血单个核细胞可获高表达的巨核祖细胞。即泊洛沙姆188和泊洛沙姆407均能够促进造血干祖细胞增殖和/或巨核分化。而该发现，目前尚未见相关报道。
因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了泊洛沙姆在诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化中的用途。由此，在造血干祖细胞增殖和/或巨核分化体系中添加泊洛沙姆，能够诱导、促进造血干祖细胞增殖和/或巨核分化，且增殖快，巨核分化效率高。
根据本发明实施例，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188或泊洛沙姆407。由此，在造血干祖细胞和/或巨核祖细胞增殖以及巨核分化体系中添加泊洛沙姆188或泊洛沙姆407，能够诱导、促进造血干祖细胞增殖和/或巨核分化，且增殖快，巨核分化效率高。
根据本发明的实施例，所述造血干祖细胞来源于选自骨髓、外周血、胎盘和脐带血的至少一种，或者由胚胎干细胞或诱导性多能干细胞体外分化获得。即所述造血干祖细胞的来源不受特别限制，可以通过胚胎干细胞或诱导性多能干细胞体外分化获得造血干祖细胞，也可以从骨髓、外周血、胎盘或脐带血中直接分离获得，例如直接从脐血中分离脐带血单个核细胞，作为造血干祖细胞来源。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化的培养基。根据本发明的实施例，该培养基包含：泊洛沙姆。发明人惊奇地发现，采用该用于诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化的培养基培养造血干祖细胞，能够有效诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化，并且增殖快、巨核分化效率高。
根据本发明实施例，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188或泊洛沙姆407。由此，造血干祖细胞增殖和/或巨核分化效率高。
另外，根据本发明上述实施例的用于诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化的培养基还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，所述泊洛沙姆188的浓度为0.2～2mg/mL，优选1mg/mL。由此，造血干祖细胞增殖和/或巨核分化效率高。
根据本发明的实施例，所述泊洛沙姆407的浓度为0.2～2mg/mL，优选1mg/mL。由此，造血干祖细胞增殖和/或巨核分化效率高。
根据本发明的实施例，所述培养基为添加了SCF、IL-3、IL-6和rhTPO的Stemspan培养基。由此，有利于诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化。
根据本发明实施例的，所述SCF的浓度为20～200ng/mL，优选50ng/mL；所述IL-3的浓度为5～100ng/mL，优选20ng/mL；所述IL-6的浓度为10～200ng/mL，优选50ng/mL；所述rhTPO的浓度为20～200ng/mL，优选50ng/mL。由此，利用该培养基培养造血干祖细胞，其增殖和/或巨核分化效率高，效果好。
根据本发明实施例，所述造血干祖细胞来源于选自骨髓、外周血、胎盘和脐带血的至少一种，或者由胚胎干细胞或诱导性多能干细胞体外分化获得。即所述造血干祖细胞的来源不受特别限制，可以通过胚胎干细胞或诱导性多能干细胞体外分化获得造血干祖细胞，也可以从骨髓、外周血、胎盘或脐带血中直接分离获得，例如直接从脐血中分离脐带血单个核细胞，作为造血干祖细胞来源。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种用于诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒中含有泊洛沙姆。发明人惊奇地发现，采用该用于诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化的试剂盒，培养造血干祖细胞，能够有效诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化，且分化效率高，增殖快。
根据本发明实施例，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188或泊洛沙姆407。由此，造血干祖细胞增殖和/或巨核分化效率高，效果好。
另外，根据本发明上述实施例的用于诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化的试剂盒还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包含SCF、IL-3、IL-6和rhTPO。
根据本发明的一些实施例，所述试剂盒进一步包含基础培养基，所述基础培养基为Stemspan培养基。
根据本发明的一些优选实施例，所述泊洛沙姆188、SCF、IL-3、IL-6和rhTPO的至少之一溶解于所述基础培养基中。进一步，根据本发明的一些具体示例，所述SCF的浓度为20～200ng/mL，优选50ng/mL。根据本发明的一些具体示例，所述IL-3的浓度为5～100ng/mL，优选20ng/mL。根据本发明的一些具体示例，所述IL-6的浓度为10～200ng/mL，优选50ng/mL。根据本发明的一些具体示例，所述rhTPO的浓度为20～200ng/mL，优选50ng/mL。根据本发明的一些具体示例，所述泊洛沙姆188的浓度为0.2～2mg/mL，优选1mg/mL。根据本发明的具体示例，所述泊洛沙姆407的浓度为0.2～2mg/mL，优选1mg/mL。由此，利用该试剂盒培养造血干祖细胞，其增殖和/或巨核分化效率高，效果好。
根据本发明的一些具体示例，所述造血干祖细胞来源于选自骨髓、外周血、胎盘和脐带血的至少一种，或者由胚胎干细胞或诱导性多能干细胞体外分化获得。
根据本发明的一些具体示例，所述试剂盒包含前面所述的用于诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化的培养基。由此，能够有效用于诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种促进造血干祖细胞增殖和/或巨核分化的方法。根据本发明的实施例，该方法利用含有泊洛沙姆的诱导分化培养体系培养所述造血干祖细胞。发明人惊奇地发现，采用该方法能够有效促进造血干祖细胞增殖和/或巨核分化，操作简单、成本低、增殖和/或诱导分化效率高，效果好。
根据本发明实施例，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188或泊洛沙姆407。由此，造血干祖细胞增殖和/或巨核分化效率高，效果好。
根据本发明的实施例，所述诱导分化培养体系中所述泊洛沙姆188的浓度为0.2～2mg/mL，优选1mg/mL。由此，有利于造血干祖细胞增殖和/或巨核分化。
根据本发明实施例，所述诱导分化培养体系中所述泊洛沙姆407的浓度为0.2～2mg/mL，优选1mg/mL。由此，有利于造血干祖细胞增殖和/或巨核分化。
根据本发明的实施例，所述含有泊洛沙姆的诱导分化培养体系为前面所述的用于诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化的培养基或试剂盒。由此，造血干祖细胞增殖和/或巨核分化效率高、效果好。
根据本发明的实施例，进行所述培养7-21天，优选14天。由此，有利于造血干祖细胞增殖和/或巨核分化。
根据本发明的一些实施例，以1×106～3×106/ml，优选2×106/ml的细胞密度为进行所述培养。由此，造血干祖细胞增殖和/或巨核分化效率高、效果好。
根据本发明的实施例，所述造血干祖细胞来源于骨髓、外周血、胎盘和脐带血的至少一种，或者由胚胎干细胞或诱导性多能干细胞体外分化获得。即所述造血干祖细胞的来源不受特别限制，可以通过胚胎干细胞或诱导性多能干细胞体外分化获得造血干祖细胞，也可以从骨髓、外周血、胎盘或脐带血中直接分离获得，例如直接从脐血中分离脐带血单个核细胞，作为造血干祖细胞来源。由此，造血干祖细胞增殖和/或巨核分化效率高、效果好，能够有效获得大量高质量的巨核系细胞。
其中需要说明的是，在本文中所采用的表达方式“诱导造血干祖细胞增殖”既包括造血干祖细胞增殖，也包括造血干祖细胞向巨核分化过程中的中间细胞的增殖，例如巨核祖细胞的增殖，即泊洛沙姆还能够诱导巨核祖细胞的增殖。同样地，泊洛沙姆能够“诱导造血干祖细胞向巨核分化”，即既能够诱导造血干祖细胞向巨核祖细胞分化，还能进一步诱导巨核祖细胞分化为巨核细胞。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例，经体外诱导培养14天后的细胞形态的图片，
其中，
图1A显示了采用未添加泊洛沙姆188的培养基，体外诱导培养14天后的细胞形态的图片，
图1B显示了采用添加泊洛沙姆188的培养基，体外诱导培养14天后的细胞形态的图片；
图2显示了根据本发明一个实施例，流式细胞仪检测经体外诱导14天的细胞的巨核系祖细胞表面标志表达情况；
图3显示了根据本发明一个实施例，经体外诱导培养10天后的细胞形态的图片，
其中，
图3A显示了采用未添加泊洛沙姆407的培养基，体外诱导培养10天后的细胞形态的图片，
图3B显示了采用添加泊洛沙姆407的培养基，体外诱导培养10天后的细胞形态的图片；
图4显示了根据本发明一个实施例，流式细胞仪检测体外诱导14天的细胞的巨核系祖细胞表面标志表达情况。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
1、材料：
脐带血(来源北京脐带血库，采集单位通州妇幼保健院)；
细胞培养瓶(美国，Corning)；
CO2细胞培养箱(美国，Thermo Scientific，Model 3111型)；
巨核祖细胞诱导培养基：添加了SCF、IL-3、IL-6、TPO的Stemspan培养(其中SCF的浓度为50ng/mL，IL-3的浓度为20ng/mL，IL-6的浓度为50ng/mL，rhTPO的浓度为50ng/mL)。
2、巨核祖细胞诱导
根据本发明的方法，对脐带血单个核细胞进行巨核祖细胞诱导，具体步骤如下：
分离获得脐带血单个核细胞后，分别采用添加了0.2mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL的泊洛沙姆188的巨核祖细胞诱导培养基(即实验分为四组)，利用T75细胞瓶，37摄氏度，5％CO2培养箱培养该脐带血单个核细胞，每个培养瓶的培养体积均为15ml，细胞密度为1.8×106/ml。其中，实验以不添加泊洛沙姆188的巨核祖细胞诱导培养基作为对照。
在体外诱导过程中，观察各阶段细胞的形态，并检测细胞存活率、细胞数和细胞表面标志。具体地：
(1)倒置显微镜观察细胞
利用倒置显微镜(Olympus 7S100型)操作，发明人观察到，各组细胞瓶中的脐带血单个核细胞在培养第4天时，均有贴壁细胞形成，在培养的第7天细胞数增多，细胞变大，贴壁细胞增多，在培养的第10天成团细胞增加，培养第14天细胞大，圆形，大小不一，且仍见成簇状细胞团。其中，以添加1mg/mL泊洛沙姆188的实验组为例，经体外诱导培养14天后细胞的形态如图1所示。
(2)细胞生物学检测
以添加1mg/mL泊洛沙姆188的实验组为例，进行细胞计数，存活率检测，以及利用流式细胞仪检测经体外诱导的细胞的巨核系祖细胞表面标志的表达情况。其中，体外诱导14天的细胞存活率和细胞数检测结果见下表1。细胞表面标志的表达检测实验：取诱导第14天的细胞离心收集，生理盐水洗涤后将其分成两管，分别加入抗人CD41-PE、CD61-FITC抗体和对照鼠IgG1k-PE、鼠IgG1k-APC抗体，4℃，30min，流式细胞仪检测经体外诱导的细胞的巨核系祖细胞表面标志表达情况见表2和图2。
表1 体外诱导细胞存活率和细胞数检测
注：*与不加泊洛沙姆188的培养基相比差别显著；**与不加泊洛沙姆188的培养基相比差别非常显著。
表2 体外诱导14天细胞表面标志检测
注：＊＊与不加泊洛沙姆188的培养基相比差别非常显著。
由表1、表2和图2可知，培养基中加入泊洛沙姆188，能够促进单个核细胞向巨核系祖细胞诱导分化。
实施例2
1、材料：
脐带血(来源北京脐带血库，采集单位通州妇幼保健院)；
细胞培养袋(宝日医生物技术(北京)有限公司)；
WIGGENS摇床(德国生产)；
CO2细胞培养箱(美国，Thermo Scientific，Model 3111型)；
巨核祖细胞诱导培养基：添加了SCF、IL-3、IL-6、TPO的Stemspan培养(其中SCF的浓度为50ng/mL、IL-3的浓度为20ng/mL、IL-6的浓度为50ng/mL，rhTPO的浓度为50ng/mL)。
2、巨核祖细胞诱导
根据本发明的方法，对脐带血单个核细胞进行巨核祖细胞诱导，具体步骤如下：
分离获得脐带血单个核细胞后，分别采用添加了0.2mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL的泊洛沙姆407的巨核祖细胞诱导培养基(即实验分为四组)，采用cultilife215细胞袋于WIGGENS摇床上，角度10度，转速10rpm，培养条件为37摄氏度，5％CO2培养箱培养该脐带血单个核细胞，每个培养袋的培养体积均为15ml，细胞密度为2x106/ml。其中，实验以不添加泊洛沙姆407的巨核祖细胞诱导培养基作为对照。
在体外诱导过程中，观察各阶段细胞的形态，并检测细胞存活率、细胞数和细胞表面标志。具体地：
(1)倒置显微镜观察细胞
利用倒置显微镜(Olympus 7S100型)，发明人观察到，各组细胞瓶中的脐带血单个核细胞在培养第4天时，均有贴壁细胞形成，在培养的第7天细胞数增多，细胞变大，贴壁细胞增多，在培养的第10天成团细胞增加，培养第14天细胞大，圆形，大小不一，且仍见成簇状细胞团。其中，以添加1mg/mL泊洛沙姆407的实验组为例，经体外诱导培养10天后细胞的形态如图3所示。
(2)细胞生物学检测
以添加1mg/mL泊洛沙姆407的实验组为例，进行细胞数、细胞存活率检测，以及利用流式细胞仪测定体外诱导的巨核系祖细胞标志的表达情况。其中，体外诱导细胞10天的细胞存活率和细胞数检测结果见下表3。细胞表面标志的表达检测实验：取诱导第14天的细胞离心收集，生理盐水洗涤后将其分成两管，分别加入抗人CD41-PE、CD61-APC抗体和同型对照鼠IgG1k-PE、鼠IgG1k-APC抗体，4℃，30min，流式细胞仪检测经体外诱导的细胞的巨核系祖细胞表面标志表达情况见表4和图4。
表3 体外诱导细胞存活率和细胞数检测
注：＊＊与不加泊洛沙姆407的培养基相比差别非常显著
表4 体外诱导细胞表面标志检测
注：＊＊与不加泊洛沙姆407的培养基相比差别非常显著
由表3、表4和图4可知，培养基中加入泊洛沙姆407，能够显著促进单个核细胞向巨核系祖细胞诱导分化。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.泊洛沙姆在诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188或泊洛沙姆407，
任选地，所述造血干祖细胞来源于选自骨髓、外周血、胎盘和脐带血的至少一种，或者由胚胎干细胞或诱导性多能干细胞体外分化获得。
3.一种用于诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化的培养基，其特征在于，包含：泊洛沙姆。
4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188或泊洛沙姆407，
任选地，所述泊洛沙姆188的浓度为0.2～2mg/mL，优选1mg/mL，
任选地，所述泊洛沙姆407的浓度为0.2～2mg/mL，优选1mg/mL。
5.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述培养基为添加了SCF、IL-3、IL-6和rhTPO的Stemspan培养基，
任选地，
所述SCF的浓度为20～200ng/mL，优选50ng/mL；
所述IL-3的浓度为5～100ng/mL，优选20ng/mL；
所述IL-6的浓度为10～200ng/mL，优选50ng/mL；
所述rhTPO的浓度为20～200ng/mL，优选50ng/mL，
任选地，所述造血干祖细胞来源于选自骨髓、外周血、胎盘和脐带血的至少一种，或者由胚胎干细胞或诱导性多能干细胞体外分化获得。
6.一种用于造血干祖细胞增殖和/或巨核分化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有泊洛沙姆。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188或泊洛沙姆407。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，进一步包含SCF、IL-3、IL-6和rhTPO，
任选地，进一步包含基础培养基，所述基础培养基为Stemspan培养基，
任选地，所述泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、SCF、IL-3、IL-6和rhTPO的至少之一溶解于所述基础培养基中，
任选地，所述SCF的浓度为20～200ng/mL，优选50ng/mL，
任选地，所述IL-3的浓度为5～100ng/mL，优选20ng/mL，
任选地，所述IL-6的浓度为10～200ng/mL，优选50ng/mL，
任选地，所述rhTPO的浓度为20～200ng/mL，优选50ng/mL，
任选地，所述泊洛沙姆188的浓度为0.2～2mg/mL，优选1mg/mL，
任选地，所述泊洛沙姆407的浓度为0.2～2mg/mL，优选1mg/mL，
任选地，所述造血干祖细胞来源于选自骨髓、外周血、胎盘和脐带血的至少一种，或者由胚胎干细胞或诱导性多能干细胞体外分化获得，
任选地，所述试剂盒包含权利要求3-5任一项所述的培养基。
9.一种促进造血干祖细胞增殖和/或巨核分化的方法，其特征在于，利用含有泊洛沙姆的诱导分化培养体系培养所述造血干祖细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188或泊洛沙姆407，
任选地，所述诱导分化培养体系中所述泊洛沙姆188的浓度为0.2～2mg/mL，优选1mg/mL，
任选地，所述诱导分化培养体系中所述泊洛沙姆407的浓度为0.2～2mg/mL，优选1mg/mL，
任选地，所述含有泊洛沙姆的诱导分化培养体系为权利要求3-5任一项所述的培养基，或权利要求6-8任一项所述的试剂盒，
任选地，进行所述培养7-21天，优选14天，
任选地，以1×106～3×106/ml，优选2×106/ml的细胞密度为进行所述培养，
任选地，所述造血干祖细胞来源于选自骨髓、外周血、胎盘和脐带血的至少一种，或者由胚胎干细胞或诱导性多能干细胞体外分化获得。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105002138A (zh) * | 2015-07-24 | 2015-10-28 | 军事医学科学院华南干细胞与再生医学研究中心 | 体外诱导巨核系祖细胞的三维细胞培养方法 |
| CN105062969A (zh) * | 2015-09-07 | 2015-11-18 | 广州市天河诺亚生物工程有限公司 | 一种提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法 |
| CN105412930A (zh) * | 2015-08-07 | 2016-03-23 | 军事医学科学院华南干细胞与再生医学研究中心 | 血小板生成素受体激动剂在促进造血干细胞归巢中的用途 |
| CN113025573A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-06-25 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 培养诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基及方法 |
| CN113046310A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-06-29 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 摇动培养促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基及方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20100081678A (ko) * | 2009-01-07 | 2010-07-15 | 연세대학교 산학협력단 | 임상―등급 적혈구의 인 비트로 대량 생산 방법 |
| CN101864396A (zh) * | 2010-05-17 | 2010-10-20 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法 |
| WO2011011055A2 (en) * | 2009-07-20 | 2011-01-27 | The General Hospital Corporation D/B/A Massachusetts General Hospital | Methods and compositions for improving the viability of cryopreserved cells |
| KR20110093619A (ko) * | 2010-02-12 | 2011-08-18 | (주)차바이오앤디오스텍 | 적혈구의 생체외 대량 생산 방법 |
-
2014
- 2014-08-27 CN CN201410429436.2A patent/CN104232582B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20100081678A (ko) * | 2009-01-07 | 2010-07-15 | 연세대학교 산학협력단 | 임상―등급 적혈구의 인 비트로 대량 생산 방법 |
| WO2011011055A2 (en) * | 2009-07-20 | 2011-01-27 | The General Hospital Corporation D/B/A Massachusetts General Hospital | Methods and compositions for improving the viability of cryopreserved cells |
| CN102625831A (zh) * | 2009-07-20 | 2012-08-01 | 通用医院公司以麻省总医院名义经营 | 提高低温保存细胞生活力的方法和组合物 |
| KR20110093619A (ko) * | 2010-02-12 | 2011-08-18 | (주)차바이오앤디오스텍 | 적혈구의 생체외 대량 생산 방법 |
| CN101864396A (zh) * | 2010-05-17 | 2010-10-20 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| A.DOGAN ET AL: ",Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers", 《INT J NANOMEDICINE》 * |
| 吴刚 等: "泊洛沙姆188的研究进展", 《中国现代医生》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105002138A (zh) * | 2015-07-24 | 2015-10-28 | 军事医学科学院华南干细胞与再生医学研究中心 | 体外诱导巨核系祖细胞的三维细胞培养方法 |
| CN105412930A (zh) * | 2015-08-07 | 2016-03-23 | 军事医学科学院华南干细胞与再生医学研究中心 | 血小板生成素受体激动剂在促进造血干细胞归巢中的用途 |
| CN105062969A (zh) * | 2015-09-07 | 2015-11-18 | 广州市天河诺亚生物工程有限公司 | 一种提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法 |
| CN105062969B (zh) * | 2015-09-07 | 2018-08-28 | 广州市天河诺亚生物工程有限公司 | 一种提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法 |
| CN113025573A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-06-25 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 培养诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基及方法 |
| CN113046310A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-06-29 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 摇动培养促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基及方法 |
| CN113046310B (zh) * | 2020-12-30 | 2023-08-18 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 摇动培养促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基及方法 |
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