CN105062969B - 一种提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法。本发明在脐带血总有核细胞中加入含有50μmol/L白藜芦醇的I型干细胞培养基培养72小时后，更换不含白藜芦醇的II型干细胞培养基继续培养，最后显著提高了巨核祖细胞的高分化效率。本发明揭示了先使用含50μmol/L白藜芦醇I型干细胞培养基培养处理后，再更换不含任何白藜芦醇成分II型干细胞培养基继续培养，通过这两种培养基的先后培养顺序组合能显著提高脐带血造血干细胞向巨核祖细胞定向分化的效率，可制备纯度更高的巨核祖细胞。该方法过程简单、可靠且重复性好，污染可能性低，兼顾了制备成本的经济性和操作安全性。

Description

一种提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法

技术领域

本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法。

背景技术

1989年世界上第一次进行脐带血造血干细胞移植并获得成功后，脐带血造血干细胞的临床应用便越来越广泛，经过20多年的发展，目前脐带血已经和骨髓、外周血一起成为造血干细胞的三大来源。

相对于骨髓，脐带血移植后血小板的恢复速度稍慢一些，目前普遍认为原因是脐带血中的巨核祖细胞数量不充裕且分化成熟迟缓。由于在造血干细胞移植前，受者通常要进行大剂量放疗/化疗以达到清髓效果，而放疗/化疗会使受者的造血系统严重受损，导致一段时间内血小板严重缺乏，容易出血甚至引起死亡，所以需要输注大量外源的血小板。而在造血干细胞移植后，血小板的恢复情况也是影响移植成败的重要原因。所以，对于脐带血移植而言，血小板的作用巨大。

造血干细胞具有自我更新能力并能最终分化为各种血液成分细胞。造血干细胞可分化为巨核祖细胞(Megakaryocytic progentitor cell,MKPC)，然后进一步分化为成熟的巨核细胞，最终释放出血小板。近年研究发现，将异体脐带血造血干细胞在体外定向扩增为巨核祖细胞，造血干细胞移植时在需要的时候输注到移植受者体内，是有可能解决放疗/化疗后血小板缺乏和脐带血移植后血小板恢复延迟的重要临床方法。

由于脐带血的造血干细胞的含量比例低于骨髓，而且脐带血中的巨核祖细胞数量较少成熟迟缓，所以如何提高脐带血造血干细胞向巨核祖细胞定向分化的效率具有实际的临床意义。当前，脐带血造血干细胞体外巨核祖细胞定向扩增普遍采用的细胞因子组合进行扩增，主要有IL-3，IL-6，SCF，TPO，FLT等。

白藜芦醇是一种天然的植物抗体，存在于葡萄科、百合科、豆科等70多种植物中，当植物遭遇到真菌感染、紫外线等不利条件时产生的酚类化合物，对植物起保护、防御作用。在医学上，白藜芦醇的抗心血管疾病作用因“法国悖论”而始被学者们认识，随着世界范围内的进一步研究，白藜芦醇在抗肿瘤、免疫调节、抗衰老等方面的生物学作用逐渐被发现。在造血干细胞的分化方面，白藜芦醇可加速红系祖细胞的成熟，在体外扩增时提高CFU-GM的集落生成数量。

随着分子生物学及信号通道的深入研究发现，白藜芦醇对MAPK或NF-kB信号通道有明显的作用效果，在癌细胞方面，如Hela细胞、MCF-7细胞等，通过较高浓度的白藜芦醇处理(60μmol/L)，可促使p38MAPK信号通道激活，从而致使癌细胞凋亡。p38MAPK信号通道还参与了多种细胞因子及其生理作用过程的信号传导，但不同类型细胞对于p38MAPK信号通道有不同的敏感程度，鉴于白藜芦醇对p38MAPK信号通道的作用，可以用白藜芦醇来歧化不同类型的细胞，从而达到优化培养的效果。

脐带血采集后去除血浆和红细胞，得到富含造血干细胞的总有核细胞(TNC)。总有核细胞含有大量各种类型的细胞，复杂的成分对造血干细胞体外扩增和分化的效率有不良影响。虽然通过磁珠分选可获得较纯的造血干细胞，优化体外扩增和分化的结果，但成本的大幅度增加对于大量扩增需要的情况有极大制约，同时更多的操作步骤也带来更大的污染风险。

发明内容

为了克服现有技术的不足与缺点，本发明首要目的在于提供一种提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法，该方法制备过程简单、可靠且重复性好，污染可能性低，兼顾了制备成本的经济性和操作安全性，为临床应用提供了更可靠的支持。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法，包含如下步骤：

以脐带血造血干细胞为标本细胞，使用I型干细胞培养基进行首阶段培养72小时，然后更换II型干细胞培养基继续培养，通过这两种不同成分的干细胞培养基的先后培养顺序组合，显著提高了脐带血造血干细胞向巨核祖细胞定向分化的效率；

所述的I型干细胞培养基为含有终浓度50μmol/L白黎芦醇的干细胞培养基；

所述的I型干细胞培养基优选为含有终浓度50μmol/L白黎芦醇、人白细胞介素-3(Interleukin-3，IL-3)、人白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、人干细胞生长因子(Stemcell factor，SCF)和促血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)的造血干细胞培养基；

所述的I型干细胞培养基中，IL-3、IL-6、SCF和TPO的终浓度分别优选为20ng/mL、50ng/mL、50ng/mL和50ng/mL；

所述的造血干细胞培养基优选为Stemspan培养基(STEMCELL公司)；

所述的II型干细胞培养基为不含任何白藜芦醇成分的干细胞培养基；

所述的II型干细胞培养基优选为不含任何白藜芦醇成分但含有人白细胞介素-3(Interleukin-3，IL-3)、人白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、人干细胞生长因子(Stemcell factor，SCF)和促血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)的造血干细胞培养基；

所述的II型干细胞培养基中，IL-3、IL-6、SCF和TPO的终浓度分别优选为20ng/mL、50ng/mL、50ng/mL和50ng/mL；

所述的造血干细胞培养基优选为Stemspan培养基(STEMCELL公司)；

所述的继续培养的时间优选为1～11天；

所述的提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法，优选包含如下具体步骤：

(1)配制培养基：将白藜芦醇溶于细胞保护剂中，得到白藜芦醇储存溶液；然后将白藜芦醇储存溶液添加到干细胞培养基中，得到I型干细胞培养基；

(2)诱导分化：将脐带血造血干细胞接种于步骤(1)制备得到的I型干细胞培养基，首阶段培养72小时；

(3)继续培养阶段：将步骤(2)中培养后的细胞离心去上清，接种于II型干细胞培养基中，继续培养；

步骤(1)中所述的白藜芦醇的纯度≥99％，GC；

步骤(1)中所述的白藜芦醇储存溶液浓度为10mmol/L，该浓度为储存浓度，工作浓度跟储存浓度一致，须放置于4℃遮光保存；

步骤(1)中所述的细胞保护液为含有体积百分比为55％二甲基亚砜(DMSO)和体积百分比为5％低分子右旋糖酐(Dextran)的注射用水溶液；

步骤(1)中所述的I型干细胞培养基为含有终浓度50μmol/L白黎芦醇的干细胞培养基；

步骤(1)中所述的I型干细胞培养基优选为含有终浓度50μmol/L白黎芦醇、人白细胞介素-3(Interleukin-3，IL-3)、人白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、人干细胞生长因子(Stem cell factor,SCF)和促血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)的造血干细胞培养基；

所述的I型干细胞培养基中，IL-3、IL-6、SCF和TPO的终浓度分别优选为20ng/mL、50ng/mL、50ng/mL和50ng/mL；

所述的造血干细胞培养基优选为Stemspan培养基(STEMCELL公司)；

步骤(3)中所述的II型干细胞培养基为不含任何白藜芦醇成分的干细胞培养基；

步骤(3)中所述的II型干细胞培养基优选为不含任何白藜芦醇成分但含有人白细胞介素-3(Interleukin-3，IL-3)、人白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、人干细胞生长因子(Stem cell factor,SCF)和促血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)的造血干细胞培养基；

所述的II型干细胞培养基中，IL-3、IL-6、SCF和TPO的终浓度分别优选为20ng/mL、50ng/mL、50ng/mL和50ng/mL；

所述的造血干细胞培养基优选为Stemspan培养基(STEMCELL公司)；

步骤(2)中所述的脐带血造血干细胞优选通过如下步骤分离：采集的新鲜人脐带血，在新鲜健康的人脐带血中获取富含CD34⁺造血干细胞的单个核细胞层，加入细胞保护液，程控降温，冷冻于液氮中保存；诱导分化前，取脐带血造血干细胞解冻，加生理盐水重悬洗涤再离心收集，得到脐带血造血干细胞；所述的细胞保护液为含有体积百分比为55％二甲基亚砜(DMSO)和体积百分比为5％低分子右旋糖酐(Dextran)的注射用水溶液；

步骤(2)中所述的首阶段培养的条件优选为温度为37℃，二氧化碳浓度为5％；

步骤(3)中所述的继续培养的时间优选为1～11天；

本发明的原理：根据广泛的研究结果，p38MAPK信号通道广泛参与了多种细胞因子及其生理作用过程，但是在造血干细胞向巨核祖细胞分化的过程中，p38MAPK信号通道的活性并未有明显变化，所以p38MAPK信号通道被抑制或激活时，对巨核祖细胞的影响很可能会远小于其他类型细胞。所以在高浓度的白藜芦醇作用下，p38MAPK信号通道活化程度上，巨核祖细胞相对于脐带血总有核细胞(TNC，total nuclear cell)中的其他成分，很可能具有更高的稳定性和耐受性，因此通过高浓度的白藜芦醇处理，有可能清除其他杂质细胞从而提高巨核祖细胞的相对比例，对提高造血干细胞向巨核祖细胞分化效率有明显的效果。本发明在脐带血造血干细胞向巨核祖细胞定向分化培养过程中，加入细胞因子的同时加入高浓度白黎芦醇，先通过高浓度白藜芦醇培养处理后，加入不含白藜芦醇的干细胞培养基继续培养，通过这两种培养基的先后培养顺序组合，达到了提高巨核祖细胞定向分化效率的结果，本发明的操作简便，成本低，得到的巨核祖细胞安全性高。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明有效提高了脐带血造血干细胞向巨核祖细胞定向分化的效率，最终获得纯度更高的巨核祖细胞，且成本低廉。

(2)本发明使用含不同成分的培养基组合：即含有高浓度白藜芦醇的I型干细胞培养基和不含白藜芦醇的II型干细胞培养基都是独有配置的特定培养基，这两种特定培养基的组合使用使巨核祖细胞定向分化操作更简便安全和高效。

(3)本发明配制的白藜芦醇储存溶液，是把白藜芦醇溶解于含有体积百分比为55％二甲基亚砜(DMSO)和体积百分比为5％低分子右旋糖酐(Dextran)的注射用水溶液的细胞保护剂中。二甲基亚砜是常用的有机溶剂，但对细胞有一定的毒性作用，低分子右旋糖酐对细胞有保护作用，该种方法配制的白藜芦醇储存液用于细胞培养，不但减少了二甲基亚砜对细胞的毒性作用，而且保证了白藜芦醇在细胞培养过程中药效的发挥，显著提高了脐带血造血干细胞向巨核祖细胞定向分化的效率。

附图说明

图1是实施例1中处理组和对照组脐带血造血干细胞样本在接种后第1、7、14天的细胞总数量的结果图。

图2是实施例1中处理组和对照组脐带血造血干细胞样本在接种后第1、7、14天的细胞数量增殖情况的结果图。

图3是实施例1中处理组和对照组脐带血造血干细胞样本在接种后第1、7、14天的CD41⁺表面抗原表达情况的结果图。

图4是实施例1中处理组和对照组样本在接种后第1、7、14天的CD41⁺细胞总数量变化的结果图。

图5是实施例1中处理组和对照组样本在接种后第1、7、14天的CD41⁺细胞数量增殖情况的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

细胞保护剂为含有体积百分比为55％DMSO和体积百分比为5％Dextran的注射用水溶液；

I型干细胞培养基：STEMCELL公司的Stemspan培养基，分别添加IL-3(终浓度20ng/mL)、IL-6(终浓度50ng/mL)、SCF(终浓度50ng/mL)和TPO(终浓度50ng/mL)细胞因子以及白黎芦醇(终浓度50μmol/L)(表1)；

II型干细胞培养基：STEMCELL公司的Stemspan培养基，分别添加IL-3(终浓度20ng/mL)、IL-6(终浓度50ng/mL)、SCF(终浓度50ng/mL)和TPO(终浓度50ng/mL)细胞因子，不含任何白藜芦醇成分(表1)。

表1 I型干细胞培养基和II型干细胞培养基的组分种类和含量

实施例1

脐带血采自健康产妇孕婴，经检测乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋、巨细胞病毒、支原体、衣原体、G-DPD和地贫均为阴性。标本自采集到运回血库的运输温度保持在4～8℃，24小时内运输到脐带血库。按以下方法进行巨核祖细胞定向分化操作：

(1)白藜芦醇溶液及特定培养基的配制

白藜芦醇(≥99％，GC)，溶解于细胞保护剂中，配制成浓度为10mmol/L白藜芦醇储存溶液；然后将白藜芦醇储存溶液添加到干细胞培养基中，得到含有白藜芦醇的I型干细胞培养基；白藜芦醇在干细胞培养基中的终浓度为50μmol/L；另设不含任何白藜芦醇成分的干细胞培养基(II型干细胞培养基)作为对照组(Control组)；

(2)脐带血造血干细胞的准备

从采集运输到库在24小时内的新鲜健康人脐带血中获取富含CD34⁺造血干细胞的单个核细胞层，程控降温，冷冻于液氮中保存；诱导分化前解冻复苏，然后接种于6孔板中，然后加入含有高浓度白藜芦醇的I型干细胞培养基，具体过程如下：

①采集新鲜的脐带血，24小时内运输回广东省脐带血库，经过离心后去除红细胞和脐血浆，采集富含单个核细胞的中间层，然后经程控降温仪降温并冷冻保存于液氮中。

②脐带血造血干细胞解冻复苏，转移至离心管，加入3倍左右体积生理盐水，洗涤1次，离心力200g，离心8分钟，收集细胞沉淀，即得脐带血造血干细胞；

(3)高浓度白藜芦醇共培养处理

将步骤(2)分离得到的脐带血造血干细胞接种在6孔培养板上，将细胞分为两组：处理组和对照组，其中，处理组加入含有白藜芦醇(终浓度为50μmol/L)的I型干细胞培养基，对照组加入不含有白藜芦醇的II型干细胞培养基；然后将处理组和对照组细胞在37℃，二氧化碳浓度为5％的条件下培养72小时；

(4)继续再培养

将步骤(3)培养后的处理组细胞取出，离心去上清，加入不含白藜芦醇的II型干细胞培养基，继续放置在37℃，二氧化碳浓度为5％的条件下培养；对照组执行完全同样的操作；

(5)巨核祖细胞的鉴定

巨核祖细胞的鉴定通过以下方法：

①巨核祖细胞的形态学分析及细胞计数：将培养的细胞在倒置显微镜观察细胞状态并拍照；

②流式细胞仪的表型测定：分别取培养后第7天，14天的细胞，进行CD41⁺和CD34⁺检测；

(6)干细胞鉴定结果及细胞活性分析

①倒置显微镜下观察接种后第1天的脐带血造血干细胞分化状况：倒置显微镜下观察接种后第1天的脐带血造血干细胞，细胞数量充足，呈分散状，形态比较单一，细胞胞体透亮且圆。细胞计数结果，Control组和处理组(50μmol/L白藜芦醇培养72小时)的造血干/祖细胞数量分别为：3.0×10⁶个/mL和2.58×10⁶个/mL(图1)；

②倒置显微镜下观察接种后第7天的脐带血造血干细胞分化状况：与第1天相比，细胞数量略有变化，形态开始出现分化，当中的大部分为散状的造血干/祖细胞，小部分开始分化，聚集成簇，胞膜不清晰，排列紧密呈团块状，略呈粉红色。细胞计数结果，Control组和处理组(50μmol/L白藜芦醇培养72小时)的造血干/祖细胞数量分别为：4.06×10⁶个/mL、1.86×10⁶个/mL(图1)，对比于第1天，细胞数量比值分别为：135％、-28％(图2)。

流式细胞仪检测结果：在CD41⁺细胞比例方面，Control组和处理组(50μmol/L白藜芦醇培养72小时)的数值分别为：4.83％、5.54％(图3)，CD41⁺细胞总数、CD41⁺细胞增殖倍数结果分析见图4、图5。

经过7天培养后，细胞计数结果显示：处理组(50μmol/L白藜芦醇培养3天)细胞的数量比第1天有较大幅度减少，细胞数量远低于Control组，但流式结果方面，处理组(50μmol/L白藜芦醇培养3天)比control组要高。

③倒置显微镜下观察接种后第14天的脐带血造血干细胞分化状况：与第7天相比，细胞数量增幅较为明显，形态也明显分化，分散状的造血干/祖细胞已≤50％，超过一半为已分化的巨核祖细胞，有明显的成簇聚集形态，并且排列紧密呈团块状，细胞呈紫红色。细胞计数结果：Control组和处理组的造血干/祖细胞数量分别为10.32×10⁶个/mL、11.10×10⁶个/mL(图1)，分别相当于第1天各样本原始细胞数量的：344％、430％(图2)。

流式细胞仪检测结果：在CD41⁺细胞比例方面，Control组和处理组(50μmol/L白藜芦醇培养72小时)的数值分别为：16.05％、34.73％(图3)，CD41⁺细胞总数、CD41⁺细胞增殖倍数结果分析见图4、图5。

经过14天培养后，细胞计数结果显示：处理组(50μmol/L白藜芦醇培养72小时)细胞数量比第7天时有明显上升，细胞总量跟Control组接近；在流式结果方面，处理组(50μmol/L白藜芦醇首阶段培养72小时)远高于Control组。

综上所述，加入50μmol/L白藜芦醇首阶段培养72小时的处理组，在脐带血造血干细胞向巨核祖细胞定向扩增过程中，在细胞数量与不低于control组情况下，CD41⁺细胞比例明显高于control组，极大地提高脐带血造血干细胞定向分化效率，从而增加了巨核祖细胞的生成量，而且操作过程简单、安全。

实施例2

参照实施例1的方法进行脐带血造血干细胞向巨核祖细胞定向扩增：

(1)接种后第1天：

Control组和处理组(50μmol/L白藜芦醇培养72小时)的起始细胞量(显微镜细胞计数)分别为：4.26×10⁶个/mL、4.28×10⁶个/mL。

(2)接种后第6天：

显微镜细胞计数结果：Control组和处理组(50μmol/L白藜芦醇培养72小时)的细胞量分别为：3.34×10⁶个/mL、2.61×10⁶个/mL；

流式细胞仪检测结果：在CD41⁺细胞比例方面，Control组和处理组(50μmol/L白藜芦醇培养72小时)的数值分别为：6.35％、10.38％。

(3)接种后第12天：

显微镜细胞计数结果：Control组和处理组(50μmol/L白藜芦醇培养72小时)的细胞量(显微镜细胞计数)分别为：15.57×10⁶个/mL、15.79×10⁶个/mL，对比于初始细胞数量，各样本增长比例分别为：365.6％、369％；

流式细胞仪检测结果：在CD41⁺细胞比例方面，Control组和处理组(50μmol/L白藜芦醇培养72小时)的数值分别为：31.78％、37.16％。

根据第12天的细胞计数和流式结果，在细胞增殖方面，Control组和处理组(50μmol/L白藜芦醇培养72小时)的细胞总数量相近，而CD41⁺细胞比例上，无论第6天还是第12天的流式检测结果，处理组均显著高于Control组。

综上所述，处理组(50μmol/L白藜芦醇培养72小时)在细胞总数量与control组接近情况下，CD41⁺细胞比例明显高于Control组，从而达到提高脐带血造血干细胞定向分化效率的目的，极大地增加了巨核祖细胞的生成量，结论与实施例1相同。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法，其特征在于包含如下步骤：

以脐带血造血干细胞为标本细胞，使用I型干细胞培养基进行首阶段培养72小时，然后更换II型干细胞培养基继续培养；

所述的I型干细胞培养基为含有终浓度50μmol/L白黎芦醇的干细胞培养基；

所述的II型干细胞培养基为不含任何白藜芦醇成分的干细胞培养基。

2.根据权利要求1所述的提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法，其特征在于：

所述的I型干细胞培养基为含有IL-3、IL-6、SCF、TPO和终浓度为50μmol/L白黎芦醇的造血干细胞培养基。

3.根据权利要求1所述的提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法，其特征在于：

所述的II型干细胞培养基为不含任何白藜芦醇成分但含有IL-3、IL-6、SCF和TPO的造血干细胞培养基。

4.根据权利要求2或3所述的提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法，其特征在于：

所述的IL-3、IL-6、SCF和TPO的终浓度分别为20ng/mL、50ng/mL、50ng/mL和50ng/mL。

5.根据权利要求2或3所述的提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法，其特征在于：

所述的造血干细胞培养基为Stemspan培养基。

6.根据权利要求1所述的提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法，其特征在于：

所述的继续培养的时间为1～11天。

7.根据权利要求1、2、3或6任一项所述的提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法，其特征在于包含如下具体步骤：

(1)配制培养基：将白藜芦醇溶于细胞保护剂中，得到白藜芦醇储存溶液；然后将白藜芦醇储存溶液添加到干细胞培养基中，得到I型干细胞培养基；

(2)诱导分化：将脐带血造血干细胞接种于步骤(1)制备得到的I型干细胞培养基，首阶段培养72小时；

(3)继续培养阶段：将步骤(2)中培养后的细胞离心去上清，接种于II型干细胞培养基中，继续培养。

8.根据权利要求7所述的提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的细胞保护液为体积百分比为55％二甲基亚砜和体积百分比为5％低分子右旋糖酐的注射用水溶液。

9.根据权利要求7所述的提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的脐带血造血干细胞通过如下步骤分离：采集的新鲜脐带血，在新鲜健康的人脐带血中获取富含CD34⁺造血干细胞的单个核细胞层，加入细胞保护液，程控降温，冷冻于液氮中保存；诱导分化前，取脐带血造血干细胞解冻，加生理盐水重悬洗涤再离心收集，得到脐带血造血干细胞。

10.根据权利要求7所述的提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的白藜芦醇储存溶液浓度为10mmol/L。