CN104911149A - 一种建立人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞分化模型的方法 - Google Patents
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Abstract
一种建立人胚胎干细胞向成熟嗜酸性粒细胞定向分化模型的方法，包括：hESCs H1细胞株维持未分化培养；mAGM-S3基质细胞的准备；H1细胞株与mAGM-S3共培养产生造血干/祖细胞；造血干/祖细胞的液体悬浮培养；共培养及悬浮培养得到的细胞进行流式细胞学表面分子检测；选取无基质细胞培养条件下的H1细胞株未分化集落与经13.3GrayX射线照射的小鼠基质细胞AGM-S3共培养，获得多能造血干/祖细胞，悬浮培养，定向诱导分化为成熟嗜酸性粒细胞。之后进行计数、甩片、May-Giemsa染色观察细胞形态、免疫荧光染色观察Eos细胞内颗粒蛋白的表达、流式细胞学检测细胞表面分子的表达和进行功能实验。利用本方法能显著提高嗜酸性粒细胞体外诱导分化的效率。
Description
技术领域
本发明涉及再生医学领域，特别涉及一种建立人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞分化模型的方法。
背景技术
嗜酸性粒细胞(Eosinophils，Eos)是一种颗粒性白细胞，起源于骨髓造血干细胞，在骨髓内分化成熟后进入外周血。虽然Eos仅占外周血白细胞的0.4％-8％，但却是极重要的炎症介质细胞，在介导过敏反应、寄生虫感染和调节免疫系统中具有重要功能，是多种临床疾病的重要研究点和突破口。因此，建立一种高效的嗜酸性粒细胞体外定向诱导分化模型可为研究其分化和成熟机理以及相关疾病的病理和治疗研究奠定基础。
但目前无论是对嗜酸性粒细胞发育分化的研究还是对其特异性疾病治疗的探究都很少。虽然早期有部分研究将人类脐带血造血干细胞、外周血和骨髓的CD34+细胞诱导出嗜酸性粒细胞，但由于嗜酸性粒细胞纯度不高，缺乏特异性表型分子的鉴定等，始终停留在方法学阶段。此外，前期研究的细胞来源于人体内，细胞资源有限，限制了临床的大规模研究和应用。J.Owen等(Differentiation in vitro of hybrideosinophil/basophil granulocytes:autocrine function of an eosinophildevelopmental intermediate.J Experimental Med,1995,182(1):49-57.)曾在体外用Matrigel覆盖的培养皿，添加适量的rhIL-3和rhIL-5成功将脐带血造血祖细胞培养出含有嗜酸性和嗜碱性粒细胞特征的前体细胞，再进一步的悬浮培养可得到嗜酸性粒细胞。H.Saito等(Gene expression accompanied by differentiation of cord blood-derivedCD34+cells to eosinophils.International Archives of Allergy andImmunol,2001,125(suppl 1):2-6.)将脐带血CD34+的细胞用SCF、IL-3、IL-5和GM-SCF培养3周获得嗜酸性粒细胞。以上研究均是从脐带血和外周血着手，研究的都是成体造血的范围，尚无从hESCs特异性定向分化诱导嗜酸性粒细胞来研究胚胎造血的相关工作报道。况且这些研究得到的嗜酸性粒细胞纯度不是很高，而且由于缺乏特异性表型分子的鉴定，无法确定嗜酸性粒细胞的发育途径。
近几年有研究发现Siglec-8是成熟嗜酸性粒细胞唯一特异性的表面抗原，能作为特异性的标记分子对成熟嗜酸性粒细胞进行筛选和鉴定(Floyd H,Ni J,Cornish AL,et al.Siglec-8A novel eosinophil-specificmember of the immunoglobulin superfamily.J Biolog Chem,2000,275(2):861-866.)。CD88是主要表达在嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的表面的特定谱系分子。CD34是胚胎造血干细胞特异性标志，CD45是髓系细胞特异性标志，CD43是髓系细胞发育标志，CD14主要分布在单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的细胞表面，c-Kit主要表达在肥大细胞表面，FcεR1主要表达在肥大和嗜碱性粒细胞表面。2D7主要在嗜碱性粒细胞表达。EPO是成熟嗜酸性粒细胞胞内特异性表达的颗粒蛋白，可作为功能特定分子用于鉴定成熟嗜酸性粒细胞。LPS(脂多糖)作为革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，能够被天然免疫细胞表面重要模式识别受体之一TLR4所识别，通过招募接头蛋白分子MyD88(或TRIF)，激活下游的NF-κB等信号通路，产生一系列的促炎因子或干扰素，从而启动天然免疫防御机制，保护宿主细胞免受病原微生物的侵入。因此，本实验采用LPS刺激试验来验证本体系得到的细胞是否具有免疫功能。综合以上表面分子标志和特异性颗粒蛋白以及功能实验来确证本体系从hESCs定向诱导分化出的细胞是否是成熟嗜酸性粒细胞。
人类胚胎干细胞具有无限增殖和多向分化的潜能，是体外研究的理想种子细胞，能克服细胞来源有限的缺点。体外诱导人类胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞的分化，能更好模拟体内嗜酸性粒细胞的发育途径，揭示嗜酸性粒细胞的早期发育过程和相关的分子调控机制。我们的研究有望利用hESCs培养出的大量高纯度的成熟嗜酸性粒细胞作为分子药物筛选的模型而应用于新药的开发并为组织再生医学工程和转化医学治疗提供良好的模型。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种建立人胚胎干细胞向成熟嗜酸性粒细胞高效定向诱导分化模型的方法。且利用本方法能显著提高嗜酸性粒细胞体外诱导分化的效率。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种建立人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞分化模型的方法，将未分化的hESCs(H1)细胞与经13.3Gray X射线辐照处理后的mAGM-S3细胞共培养一段时间后，加入造血诱导分化液经一定条件培养得到造血干/祖细胞，将造血干/祖细胞扩增后，利用细胞因子培养液使造血干/祖细胞进入嗜酸性粒细胞诱导分化阶段，持续培养后更换细胞因子培养液使嗜酸性粒细胞趋于成熟，之后检测确定成熟嗜酸性粒细胞纯度和功能。
进一步的，一种建立人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞分化模型的方法，包括如下步骤：
步骤一：hESCs维持未分化培养
hESCs(H1)维持未分化培养采用无基质细胞培养方法，将未分化hESCs克隆接种于包被有基质蛋白matrigel的培养皿上，用商品化的mTeSR1培养基进行培养，每天去除分化细胞，更换培养基，培养条件为37℃，5％CO2。每隔5—7天用浓度为0.5mM的EDTA在37℃，5％CO2条件下消化3—4min，以1:4—1:6的比例传代细胞；
步骤二：mAGM-S3基质细胞的准备
接种mAGM-S3细胞株于明胶包被的6孔板中，培养基为α-MEM、5％胎牛血清，每天更换培养基，培养条件为37℃，5％CO2。待mAGM-S3细胞融合度不低于90％时，采用13.3Gray X射线辐照处理后再换新鲜mAGM-S3细胞培养基备用，得到约2×105细胞/孔；
步骤三：hESCs与mAGM-S3共培养产生造血干/祖细胞
在显微镜下用200μL枪头枪尖将hESCs未分化集落划分成数个小集落，每个集落约0.5—1×103细胞，以50—70个集落/6孔板每孔，接种集落于准备好的mAGM-S3细胞上，加hESCs未分化细胞维持液2—3mL，轻柔摇匀，37℃，5％CO2培养3天，得到约2×105hESCs/孔，用造血诱导分化液再培养14天，产生大量造血干/祖细胞，收集细胞备用；培养过程中每天换液；第6天以后根据细胞培养情况可一天换液2次；
步骤四：液体悬浮培养
液体悬浮培养分为三个阶段进行，第一阶段主要是刺激造血干/祖细胞扩增，第二阶段主要是诱导嗜酸性粒细胞分化，第三阶段主要是诱导嗜酸性粒细胞成熟，三个阶段分别各7天，共21天；
1)将步骤三中共培养14天的细胞，PBS洗涤2遍，经0.25％Trypsin/EDTA37℃处理5—7min后，冰PBS或者含血清培养液终止胰酶作用，用1mL枪头反复吹打直至无大细胞团块凝集，收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，将细胞因子培养液Ⅰ分为A、B两组，重悬，培养于低粘6孔板中，记为悬浮培养第0天，进入造血干/祖细胞扩增阶段，细胞置于37℃，5％CO2孵育箱中孵育，根据细胞培养条件2—4天更换培养液，将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更换新鲜培养液重悬，转移至低粘6孔板或24孔板中继续培养；
2)7天以后，用1mL枪头轻柔吹散细胞团块，100μm滤膜过滤后收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，加入细胞因子培养液Ⅱ，培养于低粘24孔板中，记为悬浮培养第7天，进入嗜酸性粒细胞诱导分化阶段；细胞置于37℃，5％CO2孵育箱中孵育，根据细胞培养条件2—4天更换培养液，将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更换新鲜培养液；
3)7天以后，用1mL枪头轻柔将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，加入细胞因子培养液Ⅲ，培养于低粘24孔板中，记为悬浮培养第14天，进入嗜酸性粒细胞成熟阶段；细胞置于37℃，5％CO2孵育箱中孵育，根据细胞培养条件2—4天更换培养液，将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更换新鲜培养液。
进一步的，对所得细胞采用以下方法进行检测：
步骤一：共培养及悬浮培养细胞流式细胞学表面分子检测分别收集悬浮培养第0、7、14、21、28天的细胞到离心管中，计数板计数后，取约1×105细胞，1800rpm室温离心5min，弃上清，(2—5％)FBS/PBS重悬，加入普通兔血清5—10uL混匀，置于冰上封闭20分钟，阻断抗原非特异性结合，再用70μm滤膜过滤，加入特异性抗体(CD88-FITC、Siglec-8-PE、CD34-APC、CD45-FITC、CD43-FITC、CD14-PE、c-Kit-APC、FcεR1-PE、2D7-APC各5uL)，混匀，常温避光反应20-30min，(2—5％)FBS/PBS液1mL洗涤1—2次，1800rpm室温离心5min，弃上清，(2—5％)FBS/PBS液200uL重悬于流式上样管中，用BD CantoⅡ/Calibur流式细胞仪进行检测，实验数据使用Flowjo7.2.5软件进行分析。
步骤二：制备细胞甩片
分别收集悬浮培养第0、7、14、21、28天的细胞到离心管中，计数板计数后，分别取约1×104细胞，1500rpm室温离心5min，弃上清，100uLPBS重悬，加样到甩片离心机中，以550rpm室温离心5min，制备细胞甩片；
步骤三：麦格氏-姬姆萨(May-Giemsa)染色
将制备的细胞甩片置于染色台上，以麦格氏液固定10分钟，Giemsa B液染色3分钟，自来水冲洗后，Giemsa A液染色20分钟，自来水冲洗后，自然晾干，封片，显微镜下观察；
步骤四：间接免疫荧光染色
将制备的细胞片置于湿盒中，4％多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3次，0.1％Triton-100/5％脱脂奶粉/PBS破膜30min，添加一抗为1:100稀释的羊抗人EPO抗体，4℃孵育过夜，5％SM/PBS洗涤3次，添加二抗为1:100稀释的鼠抗羊IgG(H+L)-CyTM3，室温摇晃孵育30分钟，0.1％Tween-20/PBS洗涤后固定，PBS稀释的DAPI复染细胞核1—5min，PBS洗涤3次，湿润封片后在荧光显微镜下观察拍照；
步骤五：功能实验
用1mL枪头将悬浮培养第21天的细胞轻轻取出，1500rpm室温离心5min，弃上清，培养基RPMI-1640+20％FBS重悬于低粘六孔板中，密度1×107细胞/孔，细胞置于37℃，5％CO2孵育箱中培养50min，去除贴壁的巨噬细胞；轻取上清，PBS洗两遍，(2—5％)FBS/PBS液1.5mL/孔重悬于低粘24孔板中，密度1×106细胞/mL；每孔加入不同浓度的LPS刺激剂，浓度梯度为：10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL；6h后分别取样，1800rpm室温离心5min，弃上清，采用1mL Trizol/样本提取RNA，冻存于-80℃储存，实时荧光定量PCR方法检测Toll样受体4的表达；
GAPDH(管家基因，135bp)引物序列：
上游引物：AACGGATTTGGTCGTATTG
下游引物：ATGGGTGGAATCATATTGG
TLR4(160bp)引物序列：
上游引物：AATCCCCTGAGGCATTTAGG
下游引物：AACTCTGGATGGGGTTTCCT
逆转录20μL反应体系：
反应程序：25℃5min；42℃30min；85℃5min；持续4℃；cDNA标本放置-20℃储存；
步骤六：统计学分析
每次实验独立重复至少3次，所有实验数据描述为平均值±标准差(X±s)；两个样本均数的比较采用配对t检验，P<0.05认为有统计学意义，数据用SPSS13.0统计软件进行分析。
进一步的，所述步骤一中，未分化hESCs的培养条件为：mTeSR1培养基，37℃、5％CO2培养。
进一步的，所述步骤二中，mAGM-S3细胞的培养条件为：37℃、5％CO2。
进一步的，所述步骤三中，血细胞分化液具体为：
进一步的，所述步骤四中，细胞因子培养液具体为：
细胞因子培养液ⅠA组：
造血诱导分化液加细胞因子
细胞因子培养液ⅠB组：
造血诱导分化液加细胞因子
混匀，0.22μm滤器过滤，置于4℃冰箱备用，
细胞因子培养液Ⅱ：
造血诱导分化液加细胞因子
SCF 100ng/mL
IL-3 10ng/mL
GM-CSF 10ng/mL
细胞因子培养液Ⅲ：
造血诱导分化液补加细胞因子
IL-3 10ng/mL
IL-5 10ng/mL
混匀，0.22μm滤器过滤，置于4℃冰箱备用。
进一步的，所述步骤四中，为了使嗜酸性粒细胞更加成熟，在步骤3)后，再培养7天以后，用1mL枪头轻柔将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，记为悬浮培养第21天。弃上清，继续加入细胞因子培养液Ⅲ，培养于低粘24孔板中，继续诱导嗜酸性粒细胞成熟；细胞置于37℃，5％CO2孵育箱中孵育，根据细胞培养条件2—4天更换培养液，将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更好新鲜培养液；7天以后，用1mL枪头轻柔将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，记为悬浮培养第28天。
进一步的，所述步骤一中，特异性抗体选取CD88-FITC、Siglec-8-PE、CD34-APC、CD45-FITC、CD43-FITC、CD14-PE、c-Kit-APC、FcεR1-PE、2D7-APC，浓度为每1×106细胞加5uL。
分别收集悬浮培养第0、7、14、21、28天的细胞到离心管中，计数板计数后，取约1×104细胞，1500rpm室温离心5min，弃上清，100uL PBS重悬，加样到甩片离心机中，以550rpm室温离心5min，制备细胞甩片。将制备的细胞甩片置于湿盒中，4％多聚甲醛(PFA)固定30min，PBS洗涤3次，0.1％Triton-100/5％脱脂奶粉(skimmedmilk，SM)/PBS破膜30min，添加一抗为1:100稀释的羊抗人EPO抗体，4℃孵育过夜(8—20小时)，5％SM/PBS洗涤3次，添加二抗为1:100稀释的鼠抗羊IgG(H+L)-CyTM3，室温摇晃孵育30min，0.1％Tween-20/PBS洗涤后固定，PBS稀释的DAPI复染细胞核1—5min，PBS洗涤3次，湿润封片后在荧光显微镜下观察拍照。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明设计出最优化的体外高效定向诱导培养成熟嗜酸性粒细胞的实验方法，在体外条件下成功地从hESCs定向诱导分化出高纯度的功能成熟嗜酸性粒细胞,为研究人类嗜酸性粒细胞早期发生、发育、分化、成熟提供了有益的基础。我们将hESCs和mAGM-S3共培养细胞回收进行悬浮培养,并加入一系列促进造血和对嗜酸性粒细胞发育分化成熟起重要作用的细胞因子后能够有效产生大量高纯度功能成熟嗜酸性粒细胞。
本发明hESCs克隆与mAGM细胞共培养约10-14天后，早期造血干/祖细胞快速增殖。我们对液体悬浮培养第0、7、14、21天的细胞进行流式检测，发现造血干/祖细胞进入液体悬浮培养阶段后，CD88+Siglec-8+细胞表达水平从不足0.5％左右逐步增加到第21天的95％以上，CD34+细胞比例从14％左右下降到约0.05％；CD45+细胞从7％左右和CD43+细胞从14％左右扩增到几乎100％。仅有2％—3％左右细胞表达c-Kit、FcεR1和CD14，几乎不表达2D7。EPO+细胞比例从第0天的<1/1000增加到第21天的细胞的96.88％，第0、7、14、21天的EPO+细胞比例与CD88+Siglec-8+细胞比例吻合。May-Giemsa染色发现，悬浮培养第0、7、14、21天嗜酸性粒细胞的增长规律与流式检测和免疫染色结果的规律相同。镜下观察嗜酸性粒细胞与外周血嗜酸性粒细胞极其相似，胞体呈圆形或椭圆形，胞核多分叶或杆状,染色质凝聚，胞质淡染呈淡紫红色，胞质中均匀分布密集粗大且折光性强的桔红色颗粒，部分嗜酸性粒细胞破碎后颗粒常分散于细胞周围。
本实验中通过使用LPS刺激我们培养的hESCs来源的嗜酸性粒细胞，发现在工作浓度上升到1000ng/ml，作用6小时后，细胞表面TLR4基因表达水平较未刺激状态的细胞有明显升高，提示本实验方法培养出来的嗜酸性粒细胞具有天然免疫功能。
液体悬浮培养过程中，前两周细胞持续扩增，第二周达到峰值，总细胞量从悬浮培养第0天的1.218×106增殖到第14天的7.85×106，第三周呈现下降趋势，大量非嗜酸性粒细胞死亡。其中，嗜酸性粒细胞生长趋势与总细胞扩增趋势一致，在悬浮培养前两周迅速增殖，从CD34+CD45+造血干/祖细胞定向诱导分化为嗜酸性粒细胞扩增约500倍以上，第三周呈现下降趋势。嗜酸性粒细胞扩增趋势较总细胞量更为明显，而下降趋势则更趋于缓和，表明嗜酸性粒细胞的扩增比例明显高于培养基中的其他种类细胞，且后期死亡比例也更低。
我们也发现在悬浮培养的第一周阶段添加GM-CSF相比于不加GM-CSF的培养方法，前者得到的成熟嗜酸性粒细胞的绝对数量比后者明显多。即便在减少了其他细胞因子如SCF和IL-6的浓度的情况下，前者依然比后者高。由此，我们得到了一个嗜酸性粒细胞培养的最优方案。
我们开拓性地从hESCs定向诱导获得大量高纯度成熟Eos,首次将胚胎干细胞向Eos诱导成功。通过这一系统有助于深入了解嗜酸性粒细胞早期发生、发育、分化及成熟过程。未来将借助于更先进和优化的细胞分选仪器，对表达不同表面标记的细胞进行特异性分选及再培养，可描绘出嗜酸性粒细胞发育分化过程中表面分子表达的演变过程，摸索出嗜酸性粒细胞分化的路径。
附图说明
图1是hESCs与mAGM-S3共培养造血诱导过程各阶段细胞生长情况，A:hESCs未分化集落；B：mAGM-S3细胞；C：共培养Day4hESCs集落开始分化(4×)；D：共培养Day9分化集落和类血管结构(4×)；E：共培养Day14hESCs分化集落(4×)；F：共培养Day14“铺路石样”造血干/祖细胞(40×)。
图2是hESCs与mAGM-S3共培养获得的细胞进行悬浮培养流程。
图3a是悬浮培养第0—21天，流式方法检测细胞CD34、CD45、CD43的表达情况，表明本实验方法诱导hESCs向髓系诱导分化。
图3b是悬浮培养第0—21天，流式方法检测细胞CD14、c-Kit、2D7、FcεR1的表达情况，表明本实验方法诱导得到的细胞并非肥大和嗜碱性粒细胞。
图3c是悬浮培养第0—21天，流式方法检测细胞CD88、Siglec-8的表达情况，表明本实验方法诱导得到的细胞是嗜酸性粒细胞，而且早期加入细胞因子GM-CSF得到的嗜酸性粒细胞纯度比早期不加入细胞因子GM-CSF的高。
图4是hESCs/mAGM-S3共培养细胞悬浮培养阶段早期加入(A组)比不加入(B组)细胞因子GM-CSF的培养基组合Eos扩增量更明显。
图5是悬浮培养第0—21天，嗜酸性粒细胞染色观察。嗜酸性粒细胞胞内特异性颗粒蛋白EPO的表达情况，间接免疫荧光染色(A组)和麦格氏-姬姆萨(May-Giemsa)染色(B组)结果。
图6是嗜酸性粒细胞在不同浓度的LPS刺激之后，TLR4的表达水平情况。在1ug/ml的LPS浓度刺激下，TLR4的表达水平最高。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：
试验例1：
hESCs细胞系H1由中国医学科学院实验血液学国家重点实验室于2011年9月提供；mAGM-S3取自小鼠的AGM区，自1998年在本实验室维持并保持稳定高效的造血能力。
一.材料
1.主要仪器和试剂：
(1)主要仪器及耗材
超净工作台···················LABCONCO A2
CO2培养箱·················Thermo HERACSL SD
普通光学显微镜···················LEICA DM2500
普通倒置显微镜··················OLYMPUS CKX31
倒置相差显微镜及成像系统···········OLYMPUS CKX41
荧光显微镜及成像系统···············OLYMPUS DP73
流式细胞仪·············BD FACSCanto Ⅱ/Calibur
细胞离心甩片机··············Thermo cytospin-4
台式常温高速离心机···········Thermo LABOFUGE 400
生物辐照仪··················RADSOURE RS-2000
贴壁6孔板···················CORNING 3335
低粘6孔板····················CORNING 3471
低粘24孔板····················CORNING 3473
(2)主要试剂
BSA······················美国Sigma A9418
IMDM培养基················美国GIBCO 12440053
DMEM培养基·················美国Sigma D5796
F12培养液···············美国GIBCO 21700-075
KSR··················美国Gibco N10828-028
mTeSR1····················STEMCELL 05850
Y-27632(ROCK抑制剂)·············MERCK 688000
改良型α-MEM············美国Hyclone SH30265.01B
非必需氨基酸(NEAA)··············美国Gibco07796
2-ME(β-巯基乙醇)·················美国Sigma
0.05％Trypsin/EDTA···············WAKO 202-16931
0.25％Trypsin/EDTA················WAKO 202-16941
胎牛血清(FBS)·················Hyclone 0078
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)········WAKO 060-04543
血管内皮细胞生长因子(VEGF)·········WAKO 229-01313
L-谷氨酰胺·················美国Gibco 25030081
青霉素/链霉素···············美国Gibco 15070063
May-Giemsa染液··················德国MERCK
台盼蓝(Trypan Blue stain)············Gibco公司
抗坏血酸(Ascorbic acid)·············Sigma公司
转铁蛋白(Transferrin)··············Sigma公司
Matrigel······················BD公司
实时荧光定量PCR试剂盒·······罗氏FastStart UniversalSYBR Green Master(ROX)04913914001
逆转录试剂盒·······百乐iScript TM Cdna Synthesis Kit170-8891
(3)抗体：
(4)细胞因子
2.主要溶液的配制
(1)人源化ESC培养基配制
mTeSRTM1 Basal Medium 400mL
mTeSRTM1 5X Supplement 100mL
共500ml，混匀，置于4℃冰箱备用。
(2)AGM培养液配制
α-MEM 500mL
FBS(去补体化) 25mL
共525ml，混匀，0.22μm滤器过滤，置于4℃冰箱备用。
(3)hESC未分化细胞维持液配制
共630ml，混匀，0.22μm滤器过滤，置于4℃冰箱备用。
(4)造血诱导分化液配制
共590ml，混匀，0.22μm滤器过滤，置于4℃冰箱备用。
(5)嗜酸性粒细胞诱导培养因子液配制
细胞因子培养液ⅠA组：
造血诱导分化液添加细胞因子
细胞因子培养液ⅠB组：
造血诱导分化液添加细胞因子
混匀，0.22μm滤器过滤，置于4℃冰箱备用，
细胞因子培养液Ⅱ：
造血诱导分化液添加细胞因子
SCF 100ng/mL
IL-3 10ng/mL
GM-CSF 10ng/mL
细胞因子培养液Ⅲ：
造血诱导分化液添加细胞因子
IL-3 10ng/mL
IL-5白细胞介素5 10ng/mL
混匀，0.22μm滤器过滤，置于4℃冰箱备用。
二.实验方法
步骤一：hESC维持未分化培养
hESCs(H1)维持未分化培养采用无基质细胞培养方法，将未分化hESCs克隆接种于包被有基质蛋白matrigel的培养皿上，用商品化的mTeSR1培养基进行培养，每天去除分化细胞，更换培养基，培养条件为37℃，5％CO2。每隔5—7天用浓度为0.5mM的EDTA在37℃，5％CO2条件下消化3—4min，以1:4—1:6的比例传代细胞；
步骤二：mAGM-S3基质细胞的准备
接种mAGM-S3细胞株于明胶包被的6孔板中，培养基为α-MEM、5％胎牛血清，每天更换培养基，培养条件为37℃，5％CO2。待mAGM-S3细胞融合度不低于90％时，采用13.3Gray X射线辐照处理后再换新鲜mAGM-S3细胞培养基备用，得到约2×105细胞/孔；
步骤三：hESCs与mAGM-S3共培养产生造血干/祖细胞
在显微镜下用200μL枪头枪尖将培养5—7天的hESCs未分化集落划分成数个小集落，每个集落约0.5—1×103细胞，将集落以50—70个集落/6孔板每孔，接种于备好的mAGM-S3细胞上，加hESCs未分化细胞维持液2—3mL，轻柔隔空摇匀，37℃，5％CO2培养3天，得到约2×105hESCs细胞/孔，用造血诱导分化液再培养14天，产生大量造血干/祖细胞，收集细胞备用；培养过程中每天换液；第6天以后根据细胞培养情况可一天换液2次；培养结果如图1所示：其中A:hESCs未分化集落；B：mAGM-S3；C：共培养Day4hESCs集落开始分化(4×)；D：共培养Day9分化集落和类血管结构(4×)；E：共培养Day14hESCs分化集落(4×)；F：共培养Day14“铺路石样”造血干/祖细胞(40×)。
步骤四：液体悬浮培养
如图2所示，为是hESCs与mAGM-S3共培养获得的细胞进行悬浮培养流程图，液体悬浮培养分为三个阶段进行，第一阶段主要是刺激造血干/祖细胞扩增，第二阶段主要是诱导嗜酸性粒细胞分化，第三阶段主要是诱导嗜酸性粒细胞成熟，三个阶段分别各7天，共21天；
1)将步骤三中共培养14天的细胞，PBS洗涤2遍，经0.25％Trypsin/EDTA37℃处理5—7min后，冰PBS或者含血清培养液终止胰酶作用，用1mL枪头反复吹打直至无大细胞团块凝集，收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，将细胞因子培养液Ⅰ分为A B两组，重悬，培养于低粘6孔板或24孔板中，记为悬浮培养第0天，进入造血干/祖细胞扩增阶段，细胞置于37℃，5％CO2孵育箱中孵育，根据细胞培养条件2—4天更换培养液，将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更换新鲜培养液重悬，转移至低粘6孔板或24孔板中继续培养；
2)7天以后，用1mL枪头轻柔吹散细胞团块，100μm滤膜过滤后收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，加入细胞因子培养液Ⅱ，培养于低粘24孔板中，记为悬浮培养第7天，进入嗜酸性粒细胞诱导分化阶段；细胞置于37℃，5％CO2孵育箱中孵育，根据细胞培养条件2—4天更换培养液，将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更换新鲜培养液；
3)7天以后，用1mL枪头轻柔将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，加入细胞因子培养液Ⅲ，培养于低粘24孔板中，记为悬浮培养第14天，进入嗜酸性粒细胞成熟阶段；细胞置于37℃，5％CO2孵育箱中孵育，根据细胞培养条件2—4天更换培养液，将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更换新鲜培养液；
步骤五：共培养及悬浮培养细胞流式细胞学表面分子检测
分别收集悬浮培养第0、7、14、21、28天的细胞到离心管中，计数板计数后，取约1×105细胞，1800rpm室温离心5min，弃上清，(2—5％)FBS/PBS重悬，加入普通兔血清5—10uL混匀，置于冰上封闭20分钟，阻断抗原非特异性结合，再用70μm滤膜过滤，加入特异性抗体(CD88-FITC、Siglec-8-PE、CD34-APC、CD45-PE、CD43-FITC、CD14-PE、c-Kit-APC、FcεR1-PE、2D7-APC各5ul)，混匀，常温避光反应20—30分钟，(2—5％)FBS/PBS液1mL洗涤1—2次，1800rpm室温离心5min，弃上清，(2—5％)FBS/PBS液200uL重悬于流式上样管中，用BD CantoⅡ/Calibur流式细胞仪进行检测，实验数据使用Flowjo7.2.5软件进行分析。
步骤六：制备细胞甩片
分别收集悬浮培养第0、7、14、21、28天的细胞到离心管中，计数板计数后，取约1×104细胞，1500rpm室温离心5min，弃上清，PBS100uL重悬，加样到甩片离心机中，以550rpm室温离心5min，制备细胞甩片。
步骤七：麦格氏-姬姆萨(May-Giemsa)染色
将制备的细胞甩片置于染色台上，以麦格氏液固定10min，GiemsaB液染色3min，自来水冲洗后，Giemsa A液染色20min，自来水冲洗后，自然晾干，封片，显微镜下观察。
步骤八：间接免疫荧光染色
将制备的细胞甩片置于湿盒中，4％多聚甲醛(PFA)固定30min，PBS洗涤3次，0.1％Triton-100/5％脱脂奶粉(skimmed milk，SM)/PBS破膜30min，添加一抗为1:100稀释的羊抗人EPO抗体，4℃孵育过夜(8—20小时)，5％SM/PBS洗涤3次，添加二抗为1:100稀释的鼠抗羊IgG(H+L)-CyTM3，室温摇晃孵育30分钟，0.1％Tween-20/PBS洗涤后固定，PBS稀释的DAPI复染细胞核1—5min，PBS洗涤3次，湿润封片后在荧光显微镜下观察拍照。
如图5所示，是悬浮培养第0—21天，成熟嗜酸性粒细胞胞内特异性颗粒蛋白EPO的间接免疫荧光染色表达情况(A组)和麦格氏-姬姆萨(May-Giemsa)染色(B组)结果。
步骤九：功能实验
用1mL枪头将悬浮培养第21天的细胞轻轻取出，1500rpm室温离心5min，弃上清，培养基RPMI-1640+20％FBS重悬于低粘六孔板中，密度1×107细胞/孔，细胞置于37℃，5％CO2孵育箱中培养50min，去除贴壁的巨噬细胞。轻取上清，PBS洗两遍，(2—5％)FBS/PBS液1.5mL/孔重悬于低粘24孔板中，密度1×106细胞/mL；每孔加入不同浓度的LPS刺激剂，浓度梯度为：10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL；6h后分别取样，1800rpm室温离心5min，弃上清，采用1mL Trizol/样本提取RNA，冻存于-80℃储存，实时荧光定量PCR方法检测Toll样受体4的表达。
GAPDH(管家基因，135bp)引物序列：
上游引物：AACGGATTTGGTCGTATTG
下游引物：ATGGGTGGAATCATATTGG
TLR4(160bp)引物序列：
上游引物：AATCCCCTGAGGCATTTAGG
下游引物：AACTCTGGATGGGGTTTCCT
逆转录20μL反应体系：
| 成分 | 用量(μL) |
| Mix | 4 |
| Reverse transcriptase | 1 |
| Nuclease-free water | 15 |
| RNA template | 100fg到1μg总RNA |
反应程序：25℃5min；42℃30min；85℃5min；持续4℃。cDNA标本放置-20℃储存。
步骤十：统计学分析
每次实验独立重复至少3次，所有实验数据描述为平均值±标准差(X±s)。两个样本均数的比较采用配对t检验，P<0.05认为有统计学意义，数据用SPSS13.0统计软件进行分析。
试验例2：
材料及部分培养液同试验例1：
(4)嗜酸性粒细胞细胞因子培养液配制
细胞因子培养液ⅠA组：
造血诱导分化液添加细胞因子
细胞因子培养液ⅠB组：
造血诱导分化液添加细胞因子
混匀，0.22μm滤器过滤，置于4℃冰箱备用，
细胞因子培养液Ⅱ：
造血诱导分化液添加细胞因子
SCF 200ng/mL
IL-3 100ng/mL
GM-CSF 10ng/mL
细胞因子培养液Ⅲ：
造血诱导分化液添加细胞因子
IL-3 100ng/mL
IL-5 100ng/mL
混匀，0.22μm滤器过滤，置于4℃冰箱备用。
实验步骤同试验例1
如图4，试验例1与试验例2显示，hESCs/mAGM-S3共培养细胞悬浮培养阶段早期加入(A组)比不加入(B组)细胞因子GM-CSF的培养基组合Eos扩增量更明显。
如图4所示，本发明中，我们对液体悬浮培养第0、7、14、21天的细胞进行流式检测，发现造血干/祖细胞进入液体悬浮培养阶段后，CD88+Siglec-8+细胞表达水平从不足0.5％左右逐步增加到第21天的95％以上，如图3a所示，CD34+细胞比例从14％左右下降到约0.05％；CD45+细胞从7％左右和CD43+细胞从14％左右扩增到几乎100％。如图3b所示，仅有2％—3％左右细胞表达c-Kit、FcεR1和CD14，几乎不表达2D7。EPO是成熟嗜酸性粒细胞胞内特异性表达的颗粒蛋白，EPO+细胞比例从第0天的<1/1000增加到第21天的细胞的96.88％，如图3c所示，第0、7、14、21天的EPO+细胞比例与CD88+Siglec-8+细胞比例吻合。May-Giemsa染色发现，悬浮培养第0、7、14、21天嗜酸性粒细胞的增长规律与流式检测和免疫染色结果的规律相同。镜下观察嗜酸性粒细胞与外周血嗜酸性粒细胞极其相似，胞体呈圆形或椭圆形，胞核多分叶或杆状,染色质凝聚，胞质淡染呈淡紫红色，胞质中均匀分布密集粗大且折光性强的桔红色颗粒，部分嗜酸性粒细胞破碎后颗粒常分散于细胞周围。以上数据表明，本实验将hESCs向髓系诱导，再定向诱导为成熟嗜酸性粒细胞，而非其他谱系种类的细胞。
液体悬浮培养过程中，前两周细胞持续扩增，第二周达到峰值，总细胞量从悬浮培养第0天的1.218×106增殖到第14天的7.85×106，第三周呈现下降趋势，大量非嗜酸性粒细胞死亡。其中，嗜酸性粒细胞生长趋势与总细胞扩增趋势一致，在悬浮培养前两周迅速增殖，从CD34+CD45+造血干/祖细胞定向诱导分化为嗜酸性粒细胞扩增约500倍以上，第三周呈现下降趋势。嗜酸性粒细胞扩增趋势较总细胞量更为明显，而下降趋势则更趋于缓和，表明嗜酸性粒细胞的扩增比例明显高于培养基中的其他种类细胞，且后期死亡比例也更低。(图3c)。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种建立人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞定向分化模型的方法，其特征在于，将培养未分化的hESCs与经13.3Gray X射线辐照处理后的mAGM-S3细胞共培养3天后，加入造血诱导分化液经一定条件培养得到造血干/祖细胞，将造血干/祖细胞扩增后，利用细胞因子培养液使造血干/祖细胞进入嗜酸性粒细胞诱导分化阶段，持续培养后更换细胞因子培养液使嗜酸性粒细胞趋于成熟，之后检测确定成熟嗜酸性粒细胞纯度和功能。
2.根据权利要求1所述的建立人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞定向分化模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：hESCs维持未分化培养
采用无基质细胞作滋养层的培养方法，维持hESCs的未分化状态，将未分化hESCs克隆接种于包被有基质蛋白matrigel的6cm培养皿上，用mTeSR1培养基进行培养，每天去除分化细胞，更换培养基，培养条件为37℃，5％CO2，每隔5—7天用浓度为0.5mM的EDTA在37℃，5％CO2条件下消化3—4min，以1:4—1:6的比例传代细胞；
步骤二：mAGM-S3基质细胞的准备
取液氮中冻存的小鼠AGM区域基质细胞mAGM-S3，复苏到包被明胶的贴壁6孔板，培养基为α-MEM、5％胎牛血清，每天更换培养基，培养条件为37℃，5％CO2，待mAGM-S3细胞融合度不低于90％时，采用13.3Gray X射线辐照处理后再换新鲜mAGM-S3细胞培养基备用，得到2×105细胞/孔；
步骤三：hESCs与mAGM-S3共培养产生造血干/祖细胞
在显微镜下用200μL枪头枪尖将培养的hESCs未分化集落划分成数个小集落，之后将hESCs未分化的小集落接种于备好的mAGM-S3细胞上，加hESCs未分化细胞维持液2—3mL，马上补加2—3uL的Rho激酶抑制剂促使集落贴壁，轻柔摇匀，37℃，5％CO2静置培养3天，每天换液2—3mL，得到2×105/孔的贴壁hESCs，用造血诱导分化液再培养14天，产生大量造血干/祖细胞，收集细胞备用，培养过程中每天换液2—3mL/孔，第6天以后根据细胞培养情况可一天换液2次；
步骤四：液体悬浮培养
液体悬浮培养分为三个阶段进行，第一阶段主要是刺激造血干/祖细胞扩增，第二阶段主要是诱导嗜酸性粒细胞的分化，第三阶段主要是诱导嗜酸性粒细胞的成熟，三个阶段分别各7天，共21天；
1)将步骤三中共培养14天的细胞，用PBS洗涤2遍，经0.25％Trypsin/EDTA37℃处理5—7min后，冰PBS或者含血清培养液终止胰酶作用，用1mL枪头反复吹打直至无大细胞团块凝集，收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，将细胞因子培养液Ⅰ分为A/B两组，重悬，培养于低粘6孔板中，记为悬浮培养第0天，进入造血干/祖细胞扩增阶段，细胞置于37℃，5％CO2孵育箱中孵育，根据细胞培养条件2—4天更换培养液，将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更换新鲜培养液重悬，转移至低粘6孔板中继续培养；
2)7天以后，用1mL枪头轻柔吹散细胞团块，100μm滤膜过滤后收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，用细胞因子培养液Ⅱ，培养于低粘24孔板中，记为悬浮培养第7天，进入嗜酸性粒细胞诱导分化阶段；细胞置于37℃，5％CO2孵育箱中孵育，根据细胞培养条件2—4天更换培养液，将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更换新鲜培养液；
3)7天以后，用1mL枪头轻柔将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，用细胞因子培养液Ⅲ，培养于低粘24孔板中，记为悬浮培养第14天，进入嗜酸性粒细胞成熟阶段；细胞置于37℃，5％CO2孵育箱中孵育，根据细胞培养条件2—4天更换培养液，将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更换新鲜培养液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对所得细胞采用以下方法进行检测：
步骤一：共培养及悬浮培养细胞流式细胞学表面分子检测
分别收集悬浮培养第0、7、14、21、28天的细胞到离心管中，计数板计数后，取一定量细胞1500rpm室温下离心5min，弃上清，2—5％FBS/PBS重悬，加入普通兔血清5—10uL混匀，置于冰上封闭20分钟，阻断抗原非特异性结合，再用70μm滤膜过滤，加入特异性抗体CD88-FITC、Siglec-8-PE、CD34-APC、CD45-FITC、CD43-FITC、CD14-PE、c-Kit-APC、FcεR1-PE、2D7-APC各5uL，混匀，常温避光反应20—30分钟，(2—5％)FBS/PBS液1mL洗涤1—2次，1800rpm室温下离心5min，弃上清，(2—5％)FBS/PBS液200uL重悬于流式上样管中，用BD CantoⅡ/Calibur流式细胞仪进行检测，实验数据使用Flowjo7.2.5软件进行分析
步骤二：制备细胞甩片
分别收集悬浮培养第0、7、14、21、28天的细胞到离心管中，计数板计数后，分别取约1×104细胞，1500rpm室温离心5min，弃上清，100uLPBS重悬，加样到甩片离心机中，以550rpm室温离心5min，制备细胞甩片；
步骤三：麦格氏-姬姆萨(May-Giemsa)染色
将制备的细胞甩片置于染色台上，以麦格氏液固定10分钟，Giemsa B液染色3分钟，自来水冲洗后，Giemsa A液染色20分钟，自来水冲洗后，自然晾干，封片，显微镜下观察；
步骤四：间接免疫荧光染色
将制备的细胞片置于湿盒中，4％多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3次，0.1％Triton-100/5％脱脂奶粉/PBS破膜30min，添加一抗为1:100稀释的羊抗人EPO抗体，4℃孵育过夜，5％SM/PBS洗涤3次，添加二抗为1:100稀释的鼠抗羊IgG(H+L)-CyTM3，室温摇晃孵育30分钟，0.1％Tween-20/PBS洗涤后固定，PBS稀释的DAPI复染细胞核1—5min，PBS洗涤3次，湿润封片后在荧光显微镜下观察拍照；
步骤五：功能实验
用1mL枪头将悬浮培养第21天的细胞轻轻取出，1500rpm室温离心5min，弃上清，培养基RPMI-1640+20％FBS重悬于低粘六孔板中，密度1×107细胞/孔，细胞置于37℃，5％CO2孵育箱中培养50min，去除贴壁的巨噬细胞；轻取上清，PBS洗两遍，(2—5％)FBS/PBS液1.5mL/孔重悬于低粘24孔板中，密度1×106细胞/mL；每孔加入不同浓度的LPS刺激剂，浓度梯度为：10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL；6h后分别取样，1800rpm室温离心5min，弃上清，采用1mL Trizol/样本提取RNA，冻存于-80℃储存，实时荧光定量PCR方法检测Toll样受体4的表达；其结果如图6所示；
GAPDH(管家基因，135bp)引物序列：
上游引物：AACGGATTTGGTCGTATTG
下游引物：ATGGGTGGAATCATATTGG
TLR4(160bp)引物序列：
上游引物：AATCCCCTGAGGCATTTAGG
下游引物：AACTCTGGATGGGGTTTCCT
逆转录20μL反应体系：
反应程序：25℃5min；42℃30min；85℃5min；持续4℃；cDNA标本放置-20℃储存；
步骤六：统计学分析
每次实验独立重复至少3次，所有实验数据描述为平均值±标准差(X±s)；两个样本均数的比较采用配对t检验，P<0.05认为有统计学意义，数据用SPSS13.0统计软件进行分析。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，未分化hESC的培养条件为：mTeSR1培养基，37℃、5％CO2培养。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤三中，划分成的hESC每个小集落为0.5—1×103细胞，50—70个集落/6孔板每孔。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤三中，hESC未分化细胞维持液：
造血诱导分化液具体为：
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤四中，诱导培养因子液具体为：
细胞因子培养液ⅠA组：
造血诱导分化液添加细胞因子
细胞因子培养液ⅠB组：
造血诱导分化液添加细胞因子
混匀，0.22μm滤器过滤，置于4℃冰箱备用，
细胞因子培养液Ⅱ：
造血诱导分化液添加细胞因子
SCF 100—200ng/mL
IL-3 10—100ng/mL
GM-CSF 10—100ng/mL
细胞因子培养液Ⅲ：
造血诱导分化液添加细胞因子
IL-3 10—100ng/mL
IL-5 10—100ng/mL
混匀，0.22μm滤器过滤，置于4℃冰箱备用。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤四中，为了使嗜酸性粒细胞更加成熟，在步骤3)后，再培养7天以后，用1mL枪头轻柔将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，记为悬浮培养第21天。弃上清，加入细胞因子培养液Ⅲ，培养于低粘24孔板中，继续诱导嗜酸性粒细胞成熟；细胞置于37℃，5％CO2孵育箱中孵育，根据细胞培养条件2—4天更换培养液，将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，弃上清，更好新鲜培养液；7天以后，用1mL枪头轻柔将细胞收集到离心管中，1500rpm室温离心5min，记为悬浮培养第28天。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，计数板计数后，取1×105细胞，1800rpm室温离心5min。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，特异性抗体选取CD88-FITC、Siglec-8-PE、CD34-APC、CD45-FITC、CD43-FITC、CD14-PE、c-Kit-APC、FcεR1-PE、2D7-APC，浓度为每1×106细胞加5uL。
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| CN201510330014.4A CN104911149A (zh) | 2015-06-15 | 2015-06-15 | 一种建立人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞分化模型的方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105624114A (zh) * | 2016-02-04 | 2016-06-01 | 广东盈生力健康科技有限公司 | 一种干细胞分化培养基及其应用 |
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2015
- 2015-06-15 CN CN201510330014.4A patent/CN104911149A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN105624114A (zh) * | 2016-02-04 | 2016-06-01 | 广东盈生力健康科技有限公司 | 一种干细胞分化培养基及其应用 |
| CN105624114B (zh) * | 2016-02-04 | 2017-08-25 | 广东盈生力健康科技有限公司 | 一种干细胞分化培养基及其应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150916 |