CN104651302A

CN104651302A - 一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法

Info

Publication number: CN104651302A
Application number: CN201510063630.8A
Authority: CN
Inventors: 周龙; 何帆; 陈曦; 罗宗平; 杨惠林
Original assignee: First Affiliated Hospital of Suzhou University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Suzhou University
Priority date: 2015-02-09
Filing date: 2015-02-09
Publication date: 2015-05-27

Abstract

本发明属于细胞提取、分化鉴定领域，公开了一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，包括以下步骤：（A）无菌分离骨髓单核细胞，在20-100ng/mLM-CSF的完全培养基中培养，隔天换液，观察单核细胞的形态特征；（B）单核细胞密度为80-90%时，取出部分细胞行表面抗原鉴定；（C）其余细胞用于生长曲线的绘制及破骨细胞的分化诱导。本发明的骨髓单核细胞的提取及向破骨细胞分化的方法简便可靠、所需条件要求低、成本低、时间短，提取的单核细胞性状稳定，可为医学基础及临床研究、组织工程研究等提供来源可靠稳定的C57BL/6小鼠骨髓单核细胞。

Description

一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法

技术领域

本发明属于细胞提取、分化鉴定领域，涉及一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法。

背景技术

近几年人口老龄化的问题日益严重，老年性骨质疏松、骨质疏松性髋部骨折等老年相关性疾病发病率明显增高。人工关节置换术是治疗老年骨关节退行性疾病和老年股骨颈骨折的重要选择，假体周围骨溶解和假体松动是人工关节置换术后的主要远期并发症。如何预防或延迟它的发生是一个重要课题，它们从病理研究方面与破骨细胞有密切关系，成功获得破骨细胞将是进一步研究其功能的关键。

目前破骨细胞的获得主要有新生动物机械分离法、全骨髓诱导法、外周血/骨髓单核细胞诱导法和脾细胞诱导法。新生动物个体小，获得细胞数量少，且破骨细胞在机械分离过程中易受损伤、寿命短；全骨髓诱导法获得的破骨细胞纯度较低；骨髓单核细胞是一种未成熟的单核细胞，被认为是破骨细胞的前体细胞，较外周血单个核细胞诱导的破骨细胞得率高、全骨髓诱导法产生的破骨细胞数量多，纯度高，较脾细胞诱导法分化效率高。

骨髓单核细胞的分离提取国内外很少有文献报道，大多是利用RAW264.7细胞诱导分化为破骨细胞。文献中涉及到的骨髓单核细胞的分离方法可归结为：密度梯度离心法，药物贴壁筛选法，但均未对其纯化及鉴定的方法做具体的阐述。

C57BL/6小鼠因其易于大量繁殖，基因与人类相近，能够很容易的复制各种类似人类的疾病，因而在医学基础研究中地位十分重要。

因此，如何建立一种简易的、行之有效的体外分离、纯化和大量扩增骨髓单核细胞的方法，同时诱导其向破骨细胞分化在骨质疏松性疾病中的治疗研究等方面显得尤为重要。

发明内容

要解决的技术问题：骨髓单核细胞的常规提取分离、及向破骨细胞分化的方法报道较少，并且仅有的方法的纯化方法和鉴定方法也并不清晰；并且至今仍未有成熟的破骨细胞株，获取较困难，大多是采用小鼠的单核／巨噬细胞RAW264．7诱导分化获得，但由于RAW264．7是细胞系，用于具体的实验研究很多机理不是很明确；因此本发明的目的在于公开一种简易、有效的骨髓单核细胞的提取及向破骨细胞分化的方法。

技术方案：本发明的骨髓单核细胞的提取及向破骨细胞分化的方法通过以下技术方案予以实现：

一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，包括以下步骤：

（A）无菌分离骨髓单核细胞，在20-100ng/mL M-CSF的完全培养基中培养，隔天换液，观察单核细胞的形态特征；

（B）单核细胞密度为80-90%时，取出部分细胞行表面抗原鉴定；

（C）其余细胞用于生长曲线的绘制及破骨细胞的分化诱导。

进一步的，所述的一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，

步骤（A）中观察单核细胞的形态特征为采用倒置显微镜记录单核细胞第1,3,5天的形态特征变化；

步骤（B）中表面抗原鉴定为采用流式细胞术检测分析单核细胞表面抗原CD11b的阳性表达率；

步骤（C）中生长曲线的绘制为采用MTT法测定单核细胞第1-5天的增殖情况，绘制生长曲线，分析M-CSF对单核细胞增殖的影响；

步骤（C）中破骨细胞的分化诱导为采用M-CSF和核因子κB受体活化因子配基进行分化诱导并用TRAP染色、F-actin荧光染色鉴定破骨细胞。

进一步的，所述的一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，所述的骨髓单核细胞取自C57BL/6小鼠。

进一步的，所述的一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，所述的完全培养基组分为α-MEM 为80~90%体积比，胎牛血清10~20%体积比，抗生素10~200 U/mL。

进一步的，所述的一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，步骤（C）中分化诱导采用的M-CSF浓度为20-100ng/mL，RANKL为50-100ng/mL。

有益效果：与现有技术相比，本发明的特点为：

针对破骨细胞是一种终末细胞，至今仍未有成熟的破骨细胞株，获取较困难，大多是采用小鼠的单核／巨噬细胞RAW264．7诱导分化获得，但由于RAW264．7是细胞系，用于具体的实验研究很多机理不是很明确，骨髓单核细胞则是一种较RAW264.7更为前体的破骨前体细胞，将其分化为破骨细胞则更有说服力；采用来源广泛，基因与人类相近的C57BL/6小鼠骨髓分离提取单核细胞，对传统的贴壁筛选法加以改进，可同时分离出骨髓单核细胞和间充质干细胞，分离纯化获得的原代骨髓单核细胞可成功诱导分化为破骨细胞；本发明采用的药物贴壁筛选法是一种简便可靠、所需条件要求低、成本低、时间短的分离骨髓单核细胞的方法，提取的单核细胞性状稳定，可为医学基础及临床研究、组织工程研究等提供来源可靠稳定的C57BL/6小鼠骨髓单核细胞。

附图说明

图1为单核细胞第1,3,5天的形态特征变化（标尺：100um）；

图2为单核细胞表面抗原CD11b的阳性表达率；

图3为单核细胞在M-CSF刺激下的生长曲线；

图4为单核细胞分化为破骨细胞的TRAP及DAPI染色（放大倍数x100）；

图5为单核细胞分化为破骨细胞的F-actin荧光及DAPI染色（放大倍数x100）。

具体实施例

下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。

实施例1 骨髓单核细胞形态特征的观察，表面抗原的鉴定及生长曲线的绘制

无菌条件下取出C57BL/6小鼠双侧股骨和胫骨；超净台中剪开干骺端，用5mL无菌注射器，抽取无血清α-MEM培养液反复轻柔冲洗骨髓腔4次；100um细胞过滤器过滤后1200rpm离心5分钟，弃上清；加入10倍细胞体积（5ml）的无菌1X红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，在冰上裂解5分钟，1000rpm离心5分钟，弃红色上清以去除红细胞；用无血清α-MEM培养液重悬沉淀洗涤2次。用含胎牛血清10% 体积比，抗生素100 U/mL的α-MEM培养液5mL重悬骨髓细胞，接种于25cm² 塑料培养瓶中，于37℃、5%CO₂ 培育箱静置培养过夜（16小时）。收集上清，并用无血清α-MEM培养液清洗培养瓶3次，1200rpm离心5分钟，用含胎牛血清10% 体积比，抗生素100 U/mL，100ng/mL M-CSF的α-MEM培养液10ml 重悬单核细胞后接种于100mm培养皿中。培养2天后弃上清液，并用无血清α-MEM培养液清洗培养皿2次；加入含胎牛血清10% 体积比，抗生素100 U/mL，100ng/mL的 M-CSF的α-MEM培养液直至细胞增殖至密度为80%-90%。

A.单核细胞第1,3,5天的形态特征变化

在细胞培养过程中，分别于第1,3,5天用德国zeiss倒置显微镜记录单核细胞的形态特征变化。

结果如图1所示，第1d细胞呈小圆形，形态较规整。3d后细胞成椭圆形，两端伸出触角，5d后两端的触角更明显，细胞大小一致，形态均一，细胞密度达到90%。

B.单核细胞表面抗原CD11b的阳性表达率

将生长状态良好的原代骨髓单核细胞用细胞刮刮下，计数后调成同一密度收集在2个EP管中，离心后去除培养基。2管分别加入1%BSA（用1%NaN3溶解）100ul冰上封闭 30min，并标记1,2, 1管为阴性对照，2管加入0.5μL大鼠抗小鼠CD11b荧光抗体，冰上静置反应30min。离心后加入PBS清洗一次，每管加入600μL的1%的多聚甲醛，转移到流式管后尽快上机检测。

结果如图2所示，细胞CD11b 表达阳性率为97.7%，符合骨髓单核细胞表面标志的表达。

C.单核细胞在M-CSF刺激下的生长曲线

取对数生长期的原代骨髓单核细胞以1000/孔密度接种在96孔培养板中，分两组，一组加100ng/mL的M-CSF，另一组不加M-CSF，每6孔为一组，每孔100μL。分别在接种后的第1d、2d、3d、4d、5d、以MTT法测细胞活力，其中加入M-CSF组每天换一次液。吸掉原培养液后每孔加入含有10%MTT溶液（5g/L）的培养液100ul继续培养4h，终止培养，小心吸弃孔内上清液。每孔加入100μL DMSO溶液，振荡，镜下观察结晶物充分溶解后，在酶联免疫检测仪上测定各孔在570nm波长处的光吸收值，每组取6孔测定值的平均值。以天数为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。

结果如图3所示，M-csf能明显促进骨髓单核细胞的增值，生长曲线呈S型，没有加入M-CSF 的单核细胞生长基本停滞。

以上实验表明M-CSF是骨髓单核细胞增殖的必要因子，药物贴壁筛选法是一种简便可靠、所需条件要求低、成本低、时间短的分离骨髓单核细胞的方法，提取的单核细胞纯度高。

实施例2 骨髓单核细胞分化为破骨细胞的鉴定

细胞分离及培养方式同例1，取对数生长期的原代骨髓单核细胞用细胞刮刮下后以1×10⁴cm²密度传代于12孔培养板中培养，置于培养箱内(37 ℃、体积分数5%CO₂)培养4-6天，对照组和诱导组各3孔，其中对照组加入20ng/mL的M-CSF，诱导组加入20ng/mL的M-CSF和100ng/mL的RANKL，每2天换一次液。

1.破骨诱导培养4-6天，镜下观察到明显的多核融合的破骨细胞时行TARP染色，细胞用4%的多聚甲醛室温固定20分钟，在以萘酚AS-BI磷酸盐作为底物的孵育液中37℃孵育30min，去离子水清洗1次，DAPI染色液复染3 min，再用去离子水清洗3次，尽快Olympus IX71倒置显微镜下拍照。

结果如图4所示，M- CSF和RANKL诱导培养后逐渐形成TRAP染色阳性的多核破骨细胞，DAPI染色显示破骨细胞的细胞核可多达20-50个，而对照组未见，仍为单核细胞。

2. 破骨诱导培养4-6天，镜下观察到明显的多核融合的破骨细胞时行F-actin荧光染色，细胞4%多聚甲醛冰上固定10 min，PBS清洗细胞2次后，0.25%Triton（PBS稀释）室温孵育10min，PBS清洗2次，加入FITC-Phalloidin工作液(5 mg/L，1%的BSA稀释)室温避光孵育60min，PBS清洗3次，尽快Olympus IX71倒置显微镜下观察拍照。

结果如图5所示，M-csf和RANKL诱导形成的多核破骨细胞形成了纤维性肌动蛋白环，而对照组可见单核细胞聚集，未见融合。

综上实验表明提取的骨髓单核细胞性状稳定，可成功的诱导分化为破骨细胞，可为医学基础及临床研究、组织工程研究等提供来源可靠稳定的C57BL/6小鼠骨髓单核细胞。

Claims

1.一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（C）其余细胞用于生长曲线的绘制及破骨细胞的分化诱导。

2.根据权利要求1所述的一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，其特征在于：

3.根据权利要求1或2所述的一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，其特征在于，所述的骨髓单核细胞取自C57BL/6小鼠。

4. 根据权利要求1或2所述的一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，其特征在于，所述的完全培养基组分为α-MEM 为80~90%体积比，胎牛血清10~20%体积比，抗生素10~200 U/mL。

5.根据权利要求2所述的一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，其特征在于，步骤（C）中分化诱导采用的M-CSF浓度为20-100ng/mL，RANKL为50-100ng/mL。

6.根据权利要求1所述的一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）骨髓单核细胞形态特征的观察，表面抗原的鉴定及生长曲线的绘制

无菌条件下取出C57BL/6小鼠双侧股骨和胫骨；超净台中剪开干骺端，用5mL无菌注射器，抽取无血清α-MEM培养液反复轻柔冲洗骨髓腔4次；100um细胞过滤器过滤后1200rpm离心5分钟，弃上清；加入10倍细胞体积的无菌1X红细胞裂解液，吹打混匀，在冰上裂解5分钟，1000rpm离心5分钟，弃红色上清以去除红细胞；用无血清α-MEM培养液重悬沉淀洗涤2次；用含胎牛血清10% 体积比，抗生素100 U/mL的α-MEM培养液5mL重悬骨髓细胞，接种于25cm² 塑料培养瓶中，于37℃、5%CO₂ 培育箱静置培养过夜16小时；收集上清，并用无血清α-MEM培养液清洗培养瓶3次，1200rpm离心5分钟，用含胎牛血清10% 体积比，抗生素100 U/mL，100ng/mL M-CSF的α-MEM培养液10mL重悬单核细胞后接种于100mm培养皿中；培养2天后弃上清液，并用无血清α-MEM培养液清洗培养皿2次；加入含胎牛血清10% 体积比，抗生素100 U/mL，100ng/mL的 M-CSF的α-MEM培养液直至细胞增殖至密度为80%-90%；

A. 单核细胞第1,3,5天的形态特征变化

在细胞培养过程中，分别于第1,3,5天用德国zeiss倒置显微镜记录单核细胞的形态特征变化；

B.单核细胞表面抗原CD11b的阳性表达率

将生长状态良好的原代骨髓单核细胞用细胞刮刮下，计数后调成同一密度收集在2个EP管中，离心后去除培养基；2管分别加入1%BSA（用1%NaN3溶解）100uL冰上封闭30min，并标记1,2, 1管为阴性对照，2管加入0.5μL大鼠抗小鼠CD11b荧光抗体，冰上静置反应30min；离心后加入PBS清洗一次，每管加入600μL的1%的多聚甲醛，转移到流式管后上机检测；

C.单核细胞在M-CSF刺激下的生长曲线

取对数生长期的原代骨髓单核细胞以1000/孔密度接种在96孔培养板中，分两组，一组加100ng/mL的M-CSF，另一组不加M-CSF，每6孔为一组，每孔100μL；分别在接种后的第1d、2d、3d、4d、5d、以MTT法测细胞活力，其中加入M-CSF组每天换一次液；吸掉原培养液后每孔加入含有10%MTT溶液（5g/L）的培养液100uL继续培养4h，终止培养，小心吸弃孔内上清液；每孔加入100μL DMSO溶液，振荡，镜下观察结晶物充分溶解后，在酶联免疫检测仪上测定各孔在570nm波长处的光吸收值，每组取6孔测定值的平均值;以天数为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线；

（2）骨髓单核细胞分化为破骨细胞的鉴定

取对数生长期的原代骨髓单核细胞用细胞刮刮下后以1×10⁴cm²密度传代于12孔培养板中培养，置于培养箱内(37 ℃、体积分数5%CO₂)培养4-6天，对照组和诱导组各3孔，其中对照组加入20ng/mL的M-CSF，诱导组加入20ng/mL的M-CSF和100ng/mL的RANKL，每2天换一次液；

破骨诱导培养4-6天，镜下观察到明显的多核融合的破骨细胞时行TARP染色，细胞用4%的多聚甲醛室温固定20分钟，在以萘酚AS-BI磷酸盐作为底物的孵育液中37℃孵育30min，去离子水清洗1次，DAPI染色液复染3 min，再用去离子水清洗3次，Olympus IX71倒置显微镜下拍照；

破骨诱导培养4-6天，镜下观察到明显的多核融合的破骨细胞时行F-actin荧光染色，细胞4%多聚甲醛冰上固定10 min，PBS清洗细胞2次后，0.25%Triton（PBS稀释）室温孵育10min，PBS清洗2次，加入FITC-Phalloidin工作液(5 mg/L，1%的BSA稀释)室温避光孵育60min，PBS清洗3次，Olympus IX71倒置显微镜下观察拍照。