CN111534488A

CN111534488A - 一种化学修饰的破骨细胞、制备方法和应用

Info

Publication number: CN111534488A
Application number: CN202010258029.5A
Authority: CN
Inventors: 靳文静; 唐睿康
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2040-04-03
Also published as: CN111534488B

Abstract

本发明公开了一种化学修饰的破骨细胞、制备方法和应用。所述化学修饰的破骨细胞由破骨细胞经四环素或四环素盐修饰所得。制备方法包括以下步骤：(1)获得破骨细胞；(2)将四环素或四环素盐与破骨细胞混合，经酰胺化反应获得四环素修饰的破骨细胞。本发明通过四环素或四环素盐表面修饰增强其对于异位钙化组织的粘附力和靶向性，让破骨细胞去酸噬病理性的钙化。本项发明遵循通过化学修饰在单细胞水平上控制OC功能的HO的概念验证细胞疗法。功能材料在细胞上的这种化学掺入显示了针对各种疾病的药物试验的希望。

Description

一种化学修饰的破骨细胞、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种化学修饰的破骨细胞、制备方法和应用。

背景技术

病理性矿化是指矿化发生在不应形成矿化的部位，或者矿化过度或不足。例如异位骨化是在非正常骨组织形成异常的骨头，包括有局部和全身大量骨头。异位骨化一般分为两种情况：第一创伤性异位骨化，也是较为常见的一种骨化现象，经常在发生严重灼烧、损伤以及髋关节置换等手术之后。第二种遗传性异位骨化包括进行性肌肉骨化症和渐进性骨发育异常。遗传性疾病是研究异位骨化形成机制的良好实验模型。异位骨化现象是一种异常普遍且严重的健康问题。然而，目前临床上针对异位钙化仍然缺乏有效的治疗手段。

近些年来，随着科学研究的进展，不断有人探索异位骨化的形成机制以及可以达到几乎百分百的预防治疗，在2011年，有研究表明核视黄酸受体-γ激动剂可作为异位骨化的有效抑制剂，该文指出预防效果大约可以达到95％，尽管如此，一旦骨形成之后就几乎没有任何作用(K.Shimono et al.,Potent inhibition of heterotopic ossification bynuclear retinoic acid receptor-γagonists.Nat Med 17,454(2011).)。也有研究表明异位钙化组织的形成与Hif1α基因有关，当这个基因被敲除，可以有效抑制异位骨化的形成，该方法在三种常见的模型鼠中都得到的了验证(S.Agarwal et al.,Inhibition ofHif1αprevents both trauma-induced and genetic heterotopicossification.Proceedings of the National Academy of Sciences 113,E338-E347(2016).)。人们认为只有知道其形成机制，才能有效抑制其发生。因此异位骨化形成机制成为近些年来研究热点。

目前临床上针对异位骨化的治疗方法分为三种：物理治疗、药物治疗和手术治疗。物理治疗是基于超声的一种治疗手段，有些人效果较为明显，但是因人而异，效果存在争议，需要进一步加强研究；药物治疗的话主要针对某种钙化，目前没有特效药，治疗具有局限性。异位骨化目前最为有效的治疗方法是以手术为主，但仍存在后续问题，例如绝大多数的患者在治疗后都会有复发的现象，手术治疗的时期也非常关键同时一些敏感部位无法进行手术治疗。总而言之，目前三种治疗方式都不被认为是有效的治疗手段。

目前生物和材料交叉学科领域，在很多疾病治疗领域均有应用，例如癌症，疫苗等。通过对于生物体进行细胞表面改性从而赋予生物体本身不具有的性质，或者提高其某方面的特性，例如癌细胞表面矿化，能够达到治疗癌细胞的效果；病毒表面进行矿化可以增强其热稳定性，促使其在常温条件下稳定保存更长久的时间。因此，天然细胞具有人工不可复制的功能，经过与材料相结合，可以赋予其新的功能，让其适应在更多的领域中，发展更多的细胞疗法。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种化学修饰的破骨细胞、制备方法和应用。

一种化学修饰的破骨细胞，由破骨细胞(Osteoclastes，OCs)经四环素(Tetracycline，TC)修饰所得。四环素修饰后的破骨细胞用TC-OCs表示。

化学修饰时，四环素分子上的氨基基团与破骨细胞表面的羧基基团发生酰胺化反应，从而在破骨细胞表面修饰一层四环素或四环素盐分子。

本发明又提供了所述化学修饰的破骨细胞在制备用于治疗异位骨化的药物中的应用。

本发明又提供了一种用于治疗异位骨化的药物，有效成分为所述化学修饰的破骨细胞。优选的，剂型为肌肉注射剂。做成肌肉注射剂可以直接通过肌肉注射的方式使药物作用到病变位置。

本发明还提供了所述化学修饰的破骨细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)获得破骨细胞；

(2)将四环素与破骨细胞混合，经酰胺化反应获得四环素修饰的破骨细胞。

优选的，步骤(1)先获取骨髓单核细胞，骨髓单核细胞经体外诱导成熟获得破骨细胞。骨髓单核细胞体外诱导成熟获得破骨细胞时，使用诱导因子：10～25μg/l M-CSF和50～100μg/l RANKL。

优选的，步骤(2)中四环素由盐酸四环素溶解在水中获得。由于四环素本身溶解度稍差，所以优选使用盐酸四环素在水中溶解后获得四环素，盐酸四环素溶解性较好，且本身就是一种抗菌用的药物，临床应用相对比较安全，副作用等研究较为清楚。

四环素作为一种常用于钙矿物质靶向的有机小分子化合物，并且对于人体骨骼组织和其他病理性钙化的主要成分羟基磷灰石具有较高的亲和力。四环素作为修饰材料有以下优点：其一，与破骨细胞的细胞膜上羧基键合，其二，生物相容性较好，其三，自身荧光特性易于检测。

本发明通过四环素表面修饰增强其对于异位钙化组织的粘附力和靶向性，让破骨细胞去酸噬病理性的钙化。本项发明遵循通过化学修饰在单细胞水平上控制OC功能的HO的概念验证细胞疗法。功能材料在细胞上的这种化学掺入显示了针对各种疾病的药物试验的希望。总的来说，这项研究通过将生物学，化学和材料科学相结合来设计和制备化学细胞作为“生命材料或药物”，显示出对细胞工程对病理性矿化治疗提高潜在的应用价值。

本发明化学修饰后的破骨细胞能够有效去除约67％的钙化组织。因此本发明的“活材料”可用于可逆性治疗异位骨化疾病，实现病理性钙化可逆性去除的可能性。为破骨细胞的应用开辟了新的途径。为病理性钙化的治疗提供了一种新思路。

附图说明

图1为本发明基于四环素上的氨基与细胞膜表面的羧基酰胺化反应以及治疗异位骨化的原理。

图2为本发明为不同浓度诱导因子下破骨细胞的TRAP染色图，A.M-CSF为10μg/l，RANKL浓度为50μg/l；B.M-CSF为25μg/l，RANKL浓度为50μg/l；C.M-CSF为25μg/l，RANKL浓度为100μg/l；D.M-CSF为10μg/l，RANKL浓度为100μg/l；E.多核破骨细胞数量统计。

图3为本发明不同浓度下四环素的细胞毒性在12h中，CCK8法检测细胞存活率。

图4为本发明在160μg/ml四环素浓度下，合成工程化破骨细胞的红外数据分析结果，其中A：细胞膜表面反应的示意图；B：天然的破骨细胞以及四环素修饰的破骨细胞红外数据结果。

图5为本发明OCs，TC-OCs表面四环素分子的激光共聚焦观察结果。A.未包裹的天然破骨细胞；B.四环素修饰破骨细胞激光共聚焦图片；其中绿色为四环素，红色为细胞膜和蓝色为细胞核。

图6为本发明TC-OCs细胞流式数据分析结果。A-F.阳性细胞数在不同浓度(0μg/ml；20μg/ml；40μg/ml；80μg/ml；160μg/ml；320μg/ml)四环素修饰下细胞流式数据分析结果；G.不同浓度下阳性细胞百分率。

图7为本发明TC-OCs细胞膜上四环素的稳定性的激光共聚焦观察连续4天，四天后四环素依旧稳定存在。

图8为本发明破骨细胞膜上吸附四环素的定量分析结果，160μg/ml浓度下修饰得到的破骨细胞表面四环素的含量大约有10⁵分子。

图9为本发明OCs/TC-OCs对于异位钙化组织的粘附力。A.OCs的代表性显微镜图片，其探针附着在钙化组织上。标尺：100μm。B.TC-OCs的代表性显微镜图片。C.OCs/TC-OCs与钙化组织之间具有代表性的力曲线。D.定量分析OCs/TC-OCs细胞膜与附着在钙化组织上的探针之间的作用力。使用Sader Jarvis方法从频移差异曲线计算出力。E、F.代表性激光共聚焦图片OCs/TC-OCs作用后的探针。其中四环素(绿色)，核(Hoechst 33258，蓝色)。比例尺：20μm。(**P<0.0021，***P<0.0002，****P<0.0001)

图10为本发明OCs/TC-OCs与钙化组织之间的粘附力及靶向性。A.Transwell实验测定的示意图，用于检测OCs/TC-OCs向异位钙化组织迁移的趋向性。B.孵育12小时后迁移的OCs显微镜代表性图片。C.孵育12小时后迁移的TC-OCs显微镜代表性图片。标尺：300μm。D.使用Image-J手动计数的方法对迁移OCs/TC-OCs的定量分析。(n＝3张图像)

图11为本发明TC-OCs体内去除异位骨。A.连续注射材料的时间表。(B)用OC，TC-OC或0.9％NaCl(空白)(持续0、30或60天)治疗的模型大鼠的Mirco-CT扫描的三维重建。通过Mirco-CT在模型大鼠中可见大量矿化的HO块，并且在用TC-OCs治疗的大鼠中明显减少。比例尺：1mm。C.在第0、30和60天，通过micro-CT测量对照和未经OCs治疗的大鼠异位骨体积(BV)，从而评估TC-OCs对HO的抑制作用。D，E，F和G.用OCs，TC-OCs和0.9％NaCl处理的模型大鼠血清中ALP，BMP-2，IL-6和TNF-α的表达量。(*P<0.0332，**P<0.0021，***P<0.0002，****P<0.0001)

图12为本发明反弹效果分析。A、B、C.大鼠在第0天；30天；60天接受TC-OCs治疗Micro-CT三维图像。D、E.停止治疗后，并在稍后的时间点通过Micro-CT评估异位骨化。分别为2周；4周。F.异位相对骨体积的定量分析。

具体实施方式

实验中使用的α-MEM培养基和血清为商品化产品(Gibco公司，美国)。所用的四环素购自阿拉丁生物科技有限公司、抗体、荧光染料以及相关试剂均为分析纯以上试剂。

图1为四环素上的氨基与细胞膜表面的羧基酰胺化反应以及治疗异位骨化的原理。由于四环素本身水溶性稍差，本申请实施例中使用盐酸四环素加水溶解后获得四环素。

实施例1

一、破骨细胞体外诱导及鉴定

注射10％的戊巴比妥下进行深度麻醉，再进行断头处死6至8周大的雄性小鼠C57BL/6(购自上海斯萊科)。无菌的环境分离出股骨和胫骨，用α-MEM培养基冲洗骨髓，直到骨头发白为止，分离出骨髓细胞接种于培养板中。在5％浓度CO₂温度为37°条件下，将细胞在含有10ng/ml M-CSF(R&D公司)，10％FBS(Gibco公司，美国)，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的α-MEM培养基(Gibco公司，美国)中培养24小时。24小时之后用PBS缓慢冲洗三次，底部粘附细胞作为骨髓单核细胞前体细胞(BMMs)。用0.25％EDTA-胰蛋白酶(Gibco公司，美国)将BMMs消化5-10分钟，并在室温下以1000rpm离心10分钟收集细胞。将细胞重悬在含诱导因子10％FBSα-MEM培养基中，然后接种到96孔板(康宁公司，美国)(1×10⁴个/孔)或24孔板(4×10⁴个/孔)中，并将其培养在37℃和5％CO₂的条件下。每隔一天将培养基更换为新鲜诱导培养基。同样，也评估了不同浓度下M-CSF和RANKL(R&D公司)对OCs诱导分化的影响。分别为25μg/l M-CSF和100μg/l RANKL；10μg/l M-CSF和100μg/l RANKL；10μg/l M-CSF和50μg/l RANKL；25μg/l M-CSF和50μg/l RANKL。诱导到第六天出现大量成熟的破骨细胞。

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)为破骨细胞的特异性标志酶，应用偶氮偶联组化分析法酶活性部位显示红色反应。以萘酚二磷酸盐为底物，偶氮副品红为显色剂，TRAP在酒石酸钾钠存在条件下将萘酚AS-BI磷酸盐水解为萘酚AS-BI，与显色剂结合形成红色沉淀。一般TRAP染色用于评估OCs的诱导分化效果。将BMMs细胞以1×10⁴个/孔的密度接种到96孔板上，并在补充有诱导因子的α-MEM中培养6天。OCs用0.25％EDTA-胰蛋白酶消化3-5分钟后再次接种到96孔板中再进行TARP染色。

然后接种在补充有不同浓度刺激因子的α-MEM中的96孔板上24小时。在室温下，将细胞用4％甲醛固定至少15分钟，并使用TRAP染色溶液对细胞进行染色，加入染色液之后放入37℃恒温水浴中避光2h。3个核以上的TRAP阳性多核细胞被认定为破骨细胞。

如图2所示，实验结果表明在25μg/l M-CSF和50μg/l RANKL是体外诱导的最佳条件，在此浓度下，第六天可诱导出大量成熟的破骨细胞，TRAP染色的结果也证明了这一点。获得大量成熟的破骨细胞。

实施例2

一、四环素细胞毒性

将诱导分化成功的破骨细胞以1×10⁴个/孔的密度接种在96孔板中。在5％CO₂、37℃的潮湿培养箱中培养24小时后，当细胞进入对数生长期时，加入含有不同浓度TC(四环素)的新鲜100μl/孔10％FBSα-MEM(0μg/ml；10μg/ml；20μg/ml；40μg/ml；80μg/ml；160μg/ml；320μg/ml；640μg/ml)。继续将细胞在37℃、5％CO₂的潮湿培养箱中培养24小时，随后，弃去培养基，PBS洗涤2～3次；将未加入四环素的培养基作为对照实验。所有操作完成后，每孔添加10μl增强型CCK8试剂，并将细胞在37℃下再孵育1-2小时。之后用酶标仪在450nm下读取板的吸光值。

如图3所示，通过细胞存活率的计算结果显示，四环素在160μg/ml浓度下，培养24h，细胞存活率可以保持97％高存活率。因此160μg/ml为四环素修饰破骨细胞的最佳浓度。

实施例3

一、构建四环素包裹的破骨细胞

盐酸四环素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，T105494)用超纯水配置成1mg/ml的母液。将诱导成功的OCs用0.25％EDTA-胰蛋白酶消化3-5分钟，弃去胰酶，然后用10％FBSα-MEM冲掉细胞进行重悬，工程化的条件是1ml密度为2×10⁵个/ml细胞悬液中加入体积为160μl浓度为1mg/ml四环素溶液(最终浓度为160μg/ml)，并在摇床上缓慢摇动离心管持续1h，直到细胞与四环素充分结合后，以1000rpm速度离心10min，弃去培养基，并用PBS反复洗涤3次。再离心收集，最终可获得工程化的破骨细胞，即表面修饰四环素的破骨细胞(TC-OCs)。

实施例4

一、TC-OCs红外数据表征

为了研究TC分子与细胞膜之间的相互作用，在两个密封的KBr板之间准备了OCs/TC-OCs(50μl)细胞悬液进行测量。用IR Affinity^-1红外光谱仪(日本岛津公司)以2cm^-1的分辨率进行32次扫描，测量傅里叶变换红外(FTIR)光谱。使用空白的0.9％NaCl(50μl)测定背景。

如图4所示，红外数据结果显示，在大约1260cm^-1C-N伸缩震动信号峰强度有所增强，约1680cm^-1羰基的伸缩振动峰峰强也有明显增加，包括3000cm^-1左右的N-H伸缩振动也是有显著性差异，如图4。红外数据进一步说明四环素上的羧基与破骨细胞膜表面的氨基进行了酰胺反应，生成更多的酰胺键，实现了破骨细胞细胞膜表面的修饰。

二、激光共聚焦显微镜

四环素修饰的破骨细胞是通实施例3表述的修饰方法获得。之后，将细胞用普通细胞膜和细胞核标记的荧光试剂盒进行染色处理。将细胞用250nM PKH26红色荧光试剂盒(用于普通细胞膜标记)(美国Sigma-Aldrich)染色3分钟，再用5μM Hoechst33258(碧云天生物科技有限公司，C1022)染色3分钟，不进行TC处理作为对照组。然后，将细胞用PBS漂洗3次，将其接种于3.5cm玻璃皿中，并用激光共聚焦荧光显微镜观察(FV1000，Olympus)。使用图像分析软件(Olympus FluoView FV1000版本2.1b)捕获并分析所有图像。

如图5所示，激光共聚焦实验结果表明，天然破骨细胞为多核细胞，因四环素本身自带绿色荧光，经过四环素修饰的破骨细胞膜表面发现绿色荧光层，然而未修饰的破骨细胞细胞膜表面无绿色荧光，进一步证明四环素成功修饰到细胞膜的表面。

三、流式数据分析

利用流式细胞仪确定不同浓度下四环素对于破骨细胞工程的效率，根据上述表面工程方法，以不同浓度(10μg/ml；20μg/ml；40μg/ml；80μg/ml；160μg/ml；320μg/ml)封装成熟的OC，未四环素工程化修饰的破骨细胞作对照组，每组准备300μl细胞悬液，每组细胞悬液过筛使用。使用流式细胞仪分析细胞阳性表达率，并通过FlowJo软件测量荧光强度。

如图6所示，流式数据结果表明，随着四环素浓度的增加，四环素阳性表达百分率逐渐增加(图6A-G)，到160μg/ml阳性表达百分率维持稳定。在工作浓度160μg/ml下，流式数据表明大约有93％的破骨细胞显示TC的阳性结果(图6E)，然而没有被四环素修饰的破骨细胞无TC阳性表达，进一步验证了工程化的完成。

四、四环素外层稳定性和工程化效率

为了进一步探索本发明中破骨细胞外四环素层的稳定性。将接种于3.5cm玻璃皿中破骨细胞继续培养4天，并用激光共聚焦荧光显微镜持续性每天观察。如图7，在第4天，破骨细胞表面的绿色四环素层仍完整的保存着细胞膜上。

通过酶标仪的标准曲线法测出TC-OCs表面四环素的浓度，并估算出每个细胞膜上的四环素分子数量。配置TC标准溶液(10μg/ml；20μg/ml；40μg/ml；80μg/ml；160μg/ml)作为校准曲线，加入96孔板中，每孔100μl。实验组加入100μl密度为2×10⁵个/ml TC-OCs细胞悬液。利用酶标仪数值结果估算工程化之后细胞膜上的TC分子量。如图8结果所示，在160μg/ml工作浓度下，获得的TC-OCs经离心后，细胞膜表面修饰的四环素浓度约为20μg/ml。计算四环素表面大约有10⁵个四环素分子。

实施例5

一、原子力显微镜(AFM)检测TC-OCs对异位钙化组织粘附力

破骨细胞与异位钙化组织之间的力是原子力显微镜中的探针测定。为了准备AFM测量，将OCs/TC-OCs以1×10⁴个细胞/孔的密度接种到在48孔板中准备的12mm显微镜盖玻片(Fisher Scientific，12-545-80)中，测定之前，孵育24h。将一种钙化的组织粉末附着在无尖头悬臂上(CSG11/无尖头，NT-MDT，力常数为0.1N/m)。在成像之前，将细胞和悬臂在37℃下热平衡40-60分钟，以最小化移动。对于原位AFM实验，将带隔室的盖玻片置于AFM液池下方并进行调制。然后，将补充有刺激的不含酚红的α-MEM(Gibco，美国，10％FBS)注入液体池中。实验在原子力显微镜(Nanoscope IVa，Veeco)上进行。

正如预期的那样，由于仅0.05±0.01nN的较弱的粘附力，天然的OC不能牢固地粘附在探针上(图9A)。相比之下，由TC设计的OCs牢固地粘附在探针上而没有脱落(图9B)，因为对钙化组织探针的粘附力增加到对照实验的粘附力的三倍(0.14±0.19nN)(图9C，D)。共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)进一步证实，无尖悬臂上附着的细胞是多核OCs和TC-OCs(图9E，F)，表明TC-OCs对钙化软组织的有效靶向和粘附作用，其中，靶向性提高约77％，粘附力提高约64％，说明经过四环素包裹后的破骨细胞对于异位钙化组织的功能性都有所提高。

二、Transwell-TRAP染色检测TC-OCs对异位钙化组织靶向性

如图10A所示，利用传统Transwell实验对于破骨细胞的迁移能力设计实验进行验证。OCs/TC-OCs用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化，并以1000rpm离心10分钟。吸出上清液，并将沉淀用PBS洗涤两次，并重悬于100μl的1％FBS培养基中。将大约3×10⁴个细胞添加到Transwell(12μm，Corning)的上腔室中，将其置于培养板的孔中，并与600μl含10％的α-MEM培养基直接接触，下腔室中放有心脏瓣膜钙化组织样本。将孔板在含有5％CO₂的培养箱中于37℃孵育12小时。然后，将插入物取出，用PBS洗涤两次，然后用蘸有PBS的棉签轻轻擦拭。除去上腔室中的细胞，并将下腔室中的细胞用4％多聚甲醛固定30分钟，用PBS洗涤两次，并用TRAP染色1小时。最终PBS洗涤后，在10倍放大倍率下观察膜上随机选择的区域，并使用Image-J软件对细胞数进行定量。

12小时后，通过对于膜上随机区域图片观察，TC-OCs组的细胞密度远大于天然OCs(图10B，C)。进一步对于随机区域中的细胞数量进行统计得出，TC-OCs迁移到下腔室中的细胞数量与天然OCs相比增加了77％以上(数量：OCs：83±22；TC-OCs：350±22)(图10D)。实验证明，随着TC浓度的增加，细胞迁移能力提高。这种迁移能力的改善是由于细胞膜表面的TC对异位钙化位点的靶向作用得以实现。

实施例6

一、大鼠跟腱骨化模型构建及药物注射

所有动物均在浙江大学医学院附属邵逸夫医院骨外科的动物设施中饲养。实验方案由浙江大学医学院附属邵逸夫医院骨外科进行了审查和批准。简而言之，将30只8周龄大的Sprague-Dawley雄性大鼠(体重290-330g)随机分为三组：空白组(0.9％NaCl)，OCs和TC-OCs。然后，进行跟腱切断法诱导的大鼠跟腱异位骨化模型。所有大鼠均空腹6h后，通过腹腔注射用50mg/kg戊巴比妥钠麻醉，然后将它们固定在俯卧位。在无菌条件下，采用左，右小腿的后外侧入，在跟腱的中点完全切开。在跟腱断裂的两端，用血管钳将其反复钳夹10次，造成一定的创伤，并缝合皮肤切口。经过常规喂养8周后，通过X射线(装置型号Faxitron MX-20，美国)观察大鼠跟腱钙化情况。

药物注射的时间线示意图如图11A，实验分为三组空白组(0.9％NaCl)，OCs和TC-OCs，每只老鼠每条腿注射100μl材料，其中细胞的浓度为10⁶个/ml/500g。注射时间参考体外实验数据结果(图7)每隔4天注射一次药物，每隔28天M icro-CT活体检测一次异位骨体积变化情况。

二、Micro-CT原位观察跟腱异位钙化情况

每30天用Hiscan XM Micro CT(苏州海信信息技术有限公司)测量活体大鼠的跟腱钙化情况。X射线参数设置为60kV和133μA。以9μm的分辨率获取图像，并在360°角度范围内旋转0.50步，每步曝光50ms。扫描分辨率为25μm。使用Hiscan Reconstruct软件(1.0版，苏州海信信息技术有限公司)重建图像，并使用Hiscan Analyzer软件(1.0版，苏州海信信息技术有限公司)进行分析。通过将骨体积BV除以对照组平均BV来计算归一化的相对骨体积，并用于确定实验组和对照组之间的差异评估治疗异位骨体积的效果。

治疗30天后，control组，大鼠跟腱组织结构破坏，增生处大量炎性细胞；OCs组大鼠跟腱组织细胞不规则，结构破坏，炎症增生，较多的软骨细胞，骨组织仍部分存在(图11B)；TC-OCs组大鼠跟腱组织细胞排列较为规则，较少的软骨细胞，少量骨组织残留。通过异位骨的相对骨体积计算表明，治疗30天后，骨体积减少大约33.7％。治疗60天后，骨体积减少大约67.0％(图11C)。持续性观察一个月，观察到，异位骨体积并未出现复发现象。因而，TC-OCs可作为一种可逆性治疗异位骨化的有效治疗手段。

三、TC-OCs体内安全性

在蛋白质水平上，向HO成骨细胞系分化的关键因素是骨形态发生蛋白(BMP)和炎症因子。为了进一步验证钙材料的注入是否会引起细胞中促进异位骨化的蛋白释放，我们对于大鼠的血清进行生化分析。通过眼球从每只大鼠收集约2ml全血用于收集血清。然后，将血样在室温下静置3小时后以8000rpm离心15分钟，从上清液中收集血清，使用ELISA试剂盒测定BMP-2(RA20063，Bioswamp)，ALP(RA20082，Bioswamp)，TNF-α(ab46070，Abcam)和IL-6(ab21390，Abcam)的血清水平。

基于血液的检测结果显示，TC-OCs组中碱性磷酸酶(ALP)，人骨形态发生蛋白2(BMP-2)，白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)没有明显变化。与对照组(0.9％NaCl)相比，表明该“活材料”处理没有明显的副作用(图11D，E，F和G)。证实了TC-OCs在HO治疗中的生物相容性。

在体内实验中，停止药物治疗后，继续通过原位的活体CT检测异位骨体积变化情况。通过不同时间段跟腱部位原位三立体图像分析(图12A，B，C，D，E)以及异位骨相对体积统计结果(图12F)证实异位骨体积经过四环素修饰的破骨细胞的治疗能够有效减少其复发性，其中这也是对于异位骨化治疗有效性的重要评估条件之一。

研究证明，该“活药物”经过原位肌肉注射浓度为10⁶个/ml，每隔4天注射一次，每隔28天进行活体CT检测，经过30天的实验周期可以有效异位钙化体积降低29％，经过60天的实验周期可以有效异位钙化体积降低67％。研究表面该“活药物”能够有效地实现异位骨化的逆转。研究表明四环素包裹的破骨细胞具有良好的生物安全性，不会对正常骨组织骨密度等有影响。

Claims

1.一种化学修饰的破骨细胞，其特征在于，由破骨细胞经四环素修饰所得。

2.如权利要求1所述化学修饰的破骨细胞，其特征在于，四环素分子上的氨基基团与破骨细胞表面的羧基基团发生酰胺化反应。

3.如权利要求1或2所述化学修饰的破骨细胞在制备用于治疗异位骨化的药物中的应用。

4.一种用于治疗异位骨化的药物，其特征在于，有效成分为如权利要求1或2所述化学修饰的破骨细胞。

5.如权利要求4所述的药物，其特征在于，剂型为肌肉注射剂。

6.如权利要求1或2所述化学修饰的破骨细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获得破骨细胞；

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)先获取骨髓单核细胞，骨髓单核细胞经体外诱导成熟获得破骨细胞。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，骨髓单核细胞体外诱导成熟获得破骨细胞时，使用诱导因子：10～25μg/l M-CSF和50～100μg/l RANKL。

9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中四环素由盐酸四环素溶解在水中获得。