JP6430595B2 - 修飾自己組織化ペプチド - Google Patents
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Description
本出願は、35 U. S. C. 119(e)に基づき、2006年9月26日出願の米国仮出願U. S. S.N. 60/847,303による優先権を主張するものであり、当該出願内容は引用により本明細書に組み込まれる。
細胞外マトリックス(ECM)はタンパク質および多糖類の両方を含む巨大分子の多様なセットよりなり、これらは細胞が生体内において存在する3次元の環境を形成し、細胞間の空隙充填物を構成している。ECMはまた組織化されて基底層または基底膜として知られるシート様の層となる。身体の多くの領域において、基底膜は上皮細胞の層または管の下部に位置(例えば内脾細胞ライニング血管)するか、または、筋肉細胞のような種々の型の個々の細胞を包囲して細胞層を相互から、または隣接する結合組織から隔たらせている場合が多い。
ECMは主に、局所的に分泌されて組立られ細胞層および組織の物理的構造を安定化させ支持している骨格となる分子よりなる。しかしながら、単に細胞の結合のための不活性な物質であるであるよりはむしろ、ECMは生物学的情報に富んだ環境を構成する。ECMおよびそれに関連する(例えば局所的に分泌されるか、または何らかの別の場所から特定の部位に輸送される)種々の生体分子が細胞の挙動および表現型の多くの特徴に大きく影響することにより、遊走および増殖のような過程を調節し、細胞の発生および分化に影響し、そして細胞の形状および機能に作用していることがわかっている。ECMの構造もその内部にある細胞により影響を受ける。即ち、細胞−ECM相互作用は生命にとって重要であることは明らかである。
有用な生物学的情報の大量のものがガラスまたはプラスチックのような伝統的な組織培養基体の上での細胞の成育に対して実施された実験から収集されているが、生来の細胞の環境をより正確に反映している培養系および材料を開発することに対する関心が増大している。このような材料は、細胞培養のためのみならず、組織修復および組織工学のため、例えば細胞、組織および/または人工臓器の生育のため、または、生体分子の製造のための細胞系バイオリアクター中における使用のためにも用途を有している。
ECMにより提供される環境を模倣する材料の開発の別の方法は、組み換えDNA手法により種々のECM成分を生成することである。例えば、ECMタンパク質をコードする発言構築物は、原核細胞または真核細胞に導入することができ、分泌タンパク質の場合、興味あるタンパク質は細胞または培地より精製することができる。タンパク質はインビトロにて所望の比率で組み合わせることができる。疾病伝播の可能性の減少が起こり得るため、この取り組みもまた、いくつかの不利点を抱える。例えば純粋に合成の過程ではなく生物学的にタンパク質を製造する場合は、培養系由来の未確認の成分が高度に精製された調製品中にも存在する可能性が残存する。さらに、精製は時間と費用を要し、タンパク質の分解または変性をもたらす場合がある。
生来のECMは大部分がタンパク質およびプロテオグリカンよりなるが、種々の合成の非アミノ酸系の重合体に基づいた細胞培養および組織工学の材料の開発に多大な研究が投じられている。例えば脂肪族炭化水素は種々の組織工学用途に広範に使用されている。一般的に使用されている完全に合成の材料には、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ(乳酸コグリコール酸)(PLGA)、ポリ(エチレングリコール)、(PEG)、ポリ(プロピレングリコール)およびこれらのものや他のものの種々の共重合体が包含される。しかしながら、これらの材料も多くの不都合な点を有している。例えばこれらは数十ミクロンのオーダーの直径を有する繊維を形成し、これは生来のECM中に存在する繊維の直系よりはるかに大きい。さらにまた、このような材料から形成されたマトリックス内に細胞を導入するために必要とされる方法は細胞の生存性のための生理学的要件と容易には合致しない。
即ち、天然原料から誘導された産物に伴っている不都合な点を有さない生来の細胞環境の重要な特徴を模倣する細胞環境の創生を可能にする細胞培養および組織工学の目的のための合成の組成物および材料がなお必要とされている。例えば生来のECM成分により与えられるものに近似した生物学的に関連する刺激を細胞に提供する材料を開発することが望ましい。身体への移植を行う用途のためには、免疫または炎症応答の惹起が全く無いか最小限である組成物および材料および身体内で分解される組成物および材料の特別な必要性が存続している。さらにまた、所望な態様において細胞の特性および機能に影響する組成物および材料の必要性が当該分野で存続している。
発明の要旨
本発明は特にこのような必要性を意図している。本発明は自己組織化ではない別のドメインを取り込むことにより自己組織化ペプチドを修飾することができるがなお自己組織化部分の組立を可能できるという発見を包含する。別のドメインは得られるペプチドに対して種々の特性を付与できる。好ましくは得られるペプチドは自己組織化してナノ繊維を形成し、そして好ましくは巨視的構造を形成する。ペプチドの自己組織化により形成される物質は特に細胞培養、組織工学および組織修復の分野において広範な用途を有する。
1つの特徴において、本発明は(a)自己組織化を媒介する第1のアミノ酸ドメイン、ここでドメインは、相補的であり構造的に適合性があり、そして未修飾形態で存在する場合には自己組織化して巨視的構造となる交互する疎水性および親水性のアミノ酸を含むもの;および、(b)単離された形態で自己組織化しない第2のアミノ酸;を含む自己組織化ペプチドを提供する。本発明の特定の実施形態においては、第2のアミノ酸ドメインは生物学的に活性なペプチドモチーフ、例えば天然に存在するタンパク質中に存在するペプチドモチーフ、または生体分子との相互作用のための標的部位を含む。本発明の特定の実施形態においては、天然に存在するタンパク質は細胞外マトリックスの成分、例えば基底膜の成分である。
本発明はさらに、自己組織化ペプチドを含む骨格、細胞培養、組織工学および組織修復等のために骨格を使用する方法、および、アミノ酸ドメインを選択する方法を提供する。
本出願は種々の特許および出版物を参考にしている。これらの内容は引用により本明細書に組み込まれる。
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以下の定義が、発明を理解するのに用いられる。
抗体:一般的に「抗体」という用語は免疫グロブリンを指し、これは本発明の種々の実施形態において天然であるか、または、完全または部分的に合成により製造されていてよい。抗体は天然の原料(例えばげっ歯類、ウサギ、ニワトリ(または卵)から、抗原または抗原をコードするコンストラクトで免疫化されている動物から精製したもの)から部分的に誘導されるか、または、完全に合成により製造されてよい。抗体は多くの免疫グロブリンのクラス、例えばヒトのクラス:IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEの何れかであってよい。抗体はFab’、F(ab’)2、scFv(1鎖可変)のフラグメントまたは抗原構築部位を保有している他のフラグメント、または組み換え製造されたscFvフラグメント、例えば組み換え製造フラグメントであってよい。例えばAllen,T.,Nature Reviews Cancer,Vol.2,750−765,2002およびその参考文献を参照できる。好ましい抗体、抗体フラグメント、および/または抗原結合部位を含むタンパク質ドメインは例えばファージディスプレイ(Winter G.et al.,1994,Annu.Rev.Immunol.12:433−455,1994)、リボソームディスプレイ(Hanes,J.,andPluckthun,A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94:4937−4942,1997)等のような手法を用いてインビトロで発生および/または選択してよい。本発明の種々の実施形態において、抗体は例えばげっ歯類起源の可変ドメインをヒト起源の定常ドメインに融合させることによりげっ歯類抗体の特異性を温存させた「ヒト化」抗体である。ヒト起源のドメインはこれが人間内で最初に合成されるという意味においてヒトを直接の起源とする必要は無い。むしろ、「ヒト」ドメインは自身のゲノムがヒトの免疫グロブリン遺伝子を取り込んでいるげっ歯類において発生させてよい。例えばVaughan et al.,Nature Biotechnology,16:535−539を参照できる。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであってよい。
約:本明細書においては、「約」という用語は測定値または数が示された数字の10%まで何れかの方向に偏っていてよいことを意味する。
生物学的に活性なペプチドモチーフ:「生物学的に活性なペプチドモチーフ」とは適切な細胞型において細胞がペプチドと接触している場合に表現型の応答または変化を誘導するペプチドである。ペプチドは単離された形態またはより大型のポリペプチドまたは他の分子の部分として存在してよい。ペプチドが応答を示す能力は例えばペプチドの非存在下(例えばより大型のポリペプチド内に通常通り存在する場合にペプチドを突然変異または除去することによる)における関連のパラメーターを比較することにより測定してよい。本発明の種々の実施形態において、好ましい表現型の応答または変化は例えば細胞の展開、結合、接着、増殖、ECM分子の分泌の増強、または、特定の分化した細胞型に特徴的な表現型の発現を包含する。
生体分子:本明細書においては、「生体分子」とは生命体中に存在する分子に典型的な特徴を有するタンパク質、ペプチド、プロテオグリカン、脂質、炭水化物または核酸のような分子を指す。生体分子は天然に存在するか、または、人工(自然界に存在せず、自然界に存在する分子と同一ではない)であってよい。例えば人間の精神的過程から生じ、自然界に存在しない配列または修飾を有するタンパク質は人工生体分子とみなされる。
相補的:「相補的」とは巨視的骨格の繊維における隣接するペプチドから生じる親水性の残基の間のイオンまたは水素結合の相互作用を形成する能力を有することを意味する。ペプチド中の各親水性残基は隣接するペプチド上の親水性の残基と、水素結合するか、またはイオン対形成するか、または、溶媒に曝露される。対形成はまたファンデルワールス力が関与するものであってよい。
内皮細胞:「内皮細胞」という用語は当該分野で通常受け入れられている意味を与えられるものであり、即ち心臓、血管(毛細管を含む)およびリンパ管の空洞の内張りとなる細胞の最内層である。「内皮」および「血管内皮」という用語も本明細書においては互換的に使用する。
マーカー:「マーカー」とは特定の細胞型、組織型、発生学的起源、分化状態または生理学的または代謝的な状態を示すか、または、特定の罹患または生理学的状態(例えば癌、清浄、形成不全)を示すか発見する、何れかの遺伝子または遺伝子産物(例えばタンパク質、ペプチド、mRNA)であってよい。マーカー遺伝子の発現水準または無発現は、検査対象である細胞または組織が特定の細胞型または組織型のものであるか、または特定の発生学的起源、分化状態、生理学的状態または代謝状態を有することを示すものであってよい。マーカー遺伝子の発現水準または無発現は、患者、臓器、組織または細胞の特定の生理学的または罹患状態を示すものであってよい。好ましくは発現または無発現はノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、RT−PCR、配列決定、免疫化学、イムノブロッティング、オリゴヌクレオチドまたはcDNAマイクロアレイまたはメンブレンアレイ、タンパク質マイクロアレイ分析、質量分析等のような標準的な手法を用いて測定してよい。本発明の特定の実施形態においては、マーカー遺伝子の発現水準は定量可能である。種々のマーカーの発現はまた機能的試験により測定できる。例えばチトクロームP450遺伝子の発現(例えば肝細胞中)はP450タンパク質の存在に特徴的な反応を行う(例えば特定の基質を代謝する)細胞または細胞溶解物の能力を測定することにより評価できる。特定の細胞型を示すか識別する他のマーカーもまた使用してよい。例えば、特定の化合物の生産または取り込みをマーカーとして使用してよい。例えばLDLの取り込みまたは酸化窒素の生産は内皮細胞のために有用なマーカーである。マーカーについては後にさらに考察する。
ナノスケール:本明細書においては、「ナノスケール」という用語は一般的にナノスケール単位で表示されることが最も好都合である寸法を有する構造を指す。例えば「ナノスケール構造」または「ナノスケール骨格」という用語は約1μm以下、例えば約500nm以下、100nm以下、約50nm以下、約20〜50nm、約10〜20nm、約5〜10nm、または1〜5nm、約1nm、または0.1〜1nmの寸法を有する構造を指す。範囲は両端を含む。該当する寸法は、例えば長さ、幅、深さ、広さ、高さ、半径、直径、円周であってよく、或は球、円筒、立方体等のような規則的な2または3次元の形状を有さない構造の場合は上記した何れかの近似値であってよい。構造の形状に応じて構造がナノスケール構造であるかどうかを決定するために他の該当する寸法を使用してもよい。当業者の知る通り、ナノスケール構造の寸法の1つ以上はナノメーター範囲に無くてもよい。例えばこのような構造の長さはミクロンの範囲以上に至ってもよい。しかしながら、一般的には大部分の寸法がナノメートルの範囲内にある。
最小の生物学的に活性のある配列:本明細書中で、「最小の生物学的に活性のある配列」とは、特定の生物学的な機能を持ちために最小な長さのペプチドの配列のことである。第1の例として、-SEIKLLIS-はラミニンの生物学的に活性のある配列であるが、-IKLLI-は細胞接着のみの機能を持つ配列である。従って、この場合-IKLLI-は「最小の生物学的に活性のある配列」である。第1の例として、-DGRGDSVAYG-は-RGD-を配列として持っている。-RGD-は細胞接着機能を持つ。しかし、-DGRGDSVAYG-は骨芽細胞分化の機能を持つ。従って、この場合、- DGRGDSVAYG- と-RGD-の両方とも「最小の生物学的に活性のある配列」と考えられる。本発明で理解されるように、修飾されたペプチドの2番目のアミノ酸ドメインは少なくとも一つの最小の生物学的に活性のある配列を有する。最小の生物学的に活性のある配列は元のたんぱく質配列の内、どのような長さにもなりうる。更に、最小の生物学的に活性のある配列のアミノ酸以外の2番目のアミノ酸ドメインは、親水性や総電荷の調整のために変更・追加可能である。特定の実施形態においては、最小の生物学的に活性のある配列は表2aに示されるどの配列でも良い。
天然に存在する:本明細書においては、、「天然に存在する」とは自然界に存在することを意味する。ナノ繊維生体分子は、一般的に、自然界に存在する生物により合成され、そして、人間の作業により修飾されないか、または、そのような分子の分解産物である。人間の作業が関与する工程(例えば生命体が関与しない化学合成を介するか、または、人間の作業により操作された生命体またはそのような生命体の子孫が関与する工程を介する)により合成されるが、自然界に存在する生物により合成され、人間の作業により修飾されていない分子と同一である分子もまた天然に存在する分子とみなされる。
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質:本発明によれば、「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」はペプチド結合により相互に連結されたアミノ酸少なくとも2つの糸状物を含む。ペプチドは一般的に約2〜200アミノ酸、より典型的には約6〜64アミノ酸の糸状物となる。典型的には自己組織化ペプチドの自己組織化部分は約8〜24、多くの場合約12〜20または16〜20アミノ酸である。ペプチドは個々のペプチドまたはペプチドの集合体を指す。本発明のペプチドは典型的にはわずか1つの天然のアミノ酸を含有するが、当該分野で知られている非天然のアミノ酸(即ち自然界には存在しないがポリペプチド鎖内に取り込まれることができる化合物;例えばURLがwww.cco.caltech.edu/〜dadgrp/Unnatstruct.gifであるウエブサイトを参照でき、これは機能的イオンチャンネル内に良好に取りこまれた非天然のアミノ酸の構造を表示している)および/またはアミノ酸類縁体も代替としてよい。特に、Dアミノ酸を使用してよい。さらにまた、本発明の種々の実施形態において、本発明のペプチド中のアミノ酸の1つ以上は例えばアシル基、炭水化物基、炭水化物鎖、ホスフェート基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーションまたは官能性付与のためのリンカー等のような化学的実体を付加することにより改変または誘導体化してよい。本発明の特定の実施形態においては、ペプチドは分枝鎖であり、その場合、各々がペプチド結合により連結されたアミノ酸少なくとも3個よりなるアミノ酸重合体少なくとも2つを含むが、2アミノ酸重合体そのものはペプチド結合によって連結されていない。
増殖剤および有糸分裂促進剤は本明細書においては互換的に使用し、細胞の増殖を増強する物質の能力を指す。 プロテアーゼは本明細書においては、ペプチドおよびタンパク質のフラグメントを発生する等にタンパク質分子中のアミノ酸を連結しているペプチド結合を切断するタンパク質切断酵素である。プロテアーゼおよびプロテアーゼファミリーの大きな収集物が発見されており、これらのプロテアーゼが標的タンパク質を切断する特異的な部位も当該分野で知られている。一部の例示されるプロテアーゼはセリンプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、酸プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ(例えばマトリメタロプロテアーゼ)、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、システインプロテアーゼ等を包含する。
再生:一般的に本発明の種々の実施形態において、組織の再生は、新しい組織(これは細胞または細胞の部分の何れかを意味する)の生成を含む傷害または変性または分解の過程よりも前の組織の状態の解剖学的または機能的な復元の何れかの特徴を含む。本発明の特定の実施形態においては新しい組織の生成は既存の細胞の成長も含む。例えば、内皮細胞の場合は、再生は新しい血管の形成または既存の血管の伸長または成長を包含する。ニューロンの場合は、再生は軸索または他のニューロン突起の成長を包含する。このような突起は細胞体から直接生じたものであってよく、或は、傷害により切断または損傷を受けた突起の伸長であってよい。新しい組織は以前に存在していた組織を置き換えてよい。本発明の特定の実施形態においては、新しい組織の生成は既存の細胞の分裂を包含する。
修復:一般的に本発明の種々の実施態様において、組織修復は損傷または変性の前の組織の状態の解剖学的または機能的な復元の何れかの特徴を含む。例えばこれは傷害により分離された組織の部分の間の物理的連続性の復元を包含する。好ましくは、物理的連続性のこのような復元は、傷害の前には存在しなかった型の組織、例えば瘢痕組織の明らかな分離を行わない組織の部分の再付加または再連結を包含する。即ち修復は、組織の欠陥の充足を包含し、これは瘢痕組織の形成によるのではなく例えば欠陥により分離された組織の部分の再付加による、および/または、損傷または変性に付された型の新しい組織の生育によるものである。修復は例えば新しい組織の生育または発生を包含するが必須ではない。即ち、再生は修復の1つの特徴とみなしてよいが、修復は新しい組織の生育の証拠を伴うことなく起こりえる。
低分子:本明細書においては、「低分子」という用語は比較的小さい分子量を有し、そしてタンパク質、ポリペプチドまたは核酸ではない天然に存在する、または人工的に創生(例えば化学合成による)された有機の化合物を指す。典型的には、低分子は約1500g/モル未満の分子量を有する。さらにまた、低分子は典型的には複数の炭素−炭素結合を有する。
構造的に適合性がある:「構造的に適合性がある」とは構造の形成を可能にする十分一定のペプチド内距離を維持することができることを意味する。本発明の特定の実施形態においては、ペプチド内距離は4,3、2または1オングストローム未満である。ペプチド内距離のより大きい変動は十分な安定化力が存在すれば構造の形成を妨げない。この距離は分子モデリングに基づくか、または、以前に報告されている単純化された操作法(米国特許5,670,483)に基づいて計算してよい。この方法においては、ペプチド内距離は対の各アミノ酸の側鎖上の未分枝鎖の原子の数の合計を考慮して計算される。例えばリジン−グルタミン酸のイオン対のペプチド内距離は5+4=9原子であり、そして、グルタミン−グルタミンの水素結合対の距離は4+4=8原子である。原子当たり3オングストロームの変換ファクターを用いれば、リジン−グルタミン酸対およびグルタミン−グルタミン対(例えば9vs8原子)を有するペプチドのペプチド内距離の変動は3オングストロームである。
被験体:被験体という用語は本明細書においては、例えば実験、診断および/または治療目的のために薬剤を送達するべき個体を指す。好ましい被験体は哺乳類、特に家畜哺乳類(例えばイヌ、ネコ等)、霊長類またはヒトである。
治療用の分子、化合物または薬剤:「治療用の分子、化合物または薬剤」とは、それを必要とする被験体に投与した場合に、疾患または望ましくない臨床状態の1つ以上を緩解し、疾患または臨床状態の重症度を低減し、疾患または望ましくない臨床状態の発生を防止するかその可能性を低減するか、または、被験体への単なる一般的栄養支援とは異なる態様において組織修復または再生を促進するような何れかの型の分子または分子の組み合わせである。治療用の分子は一般的には有効量、即ち臨床的に意味のある結果を達成するために十分な量で投与する。治療分子は低分子、生体分子等であることができる。例えばGoodman and GlimanのThe Pharmacological Basis of Therapeutics,10th Ed.,およびKatzung,Basic and Clinical Pharmacologyを参照できる。
三次元の配置:「三次元の配置」とは三次元に存在することを意味する。三次元の配置を有する細胞は同じ単層内の全部分ではない。本明細書においては、単層はカプセル化された細胞の平均直径に等しい厚みを有糸、そしてカプセル化された細胞少なくとも1つを含むペプチド骨格を横断する断面である。細胞の平均直径は細胞体の平均直径を測定することにより決定してよい。カプセル化された細胞は細胞の容量の少なくとも51%が単層内に含有される場合に単層の部分とみなされる。好ましくは骨格形成直後は、単層少なくとも1つはカプセル化された細胞75、50、25、20、15、10、5または1%(好適度の順)未満を含有する。より好ましくは、骨格形成直後はカプセル化細胞の75、50、25、20、15、10、5または1%(好適度の順)未満が同じ単層の部分である。
I. 概要
新しい生物学的材料、特に細胞の成育、分化および生物学的機能に関する許容性物質として機能する生物学的に適合性のある材料の開発は、医療技術の進歩のため、および、細胞の生物学的特性を理解するために、広範な意味を有する。本発明は完全に合成の物質に典型的に備わっている利点を保有し、なおかつ天然原料に由来する物質の特定の望ましい特徴も保有している組成物を製造することが可能であるという認識を包含する。組成物は例えば細胞培養または組織工学、組織再生および/または修復を含む目的のため;および/または治療薬のような生物学的に活性な分子のための送達剤として、インビトロまたはインビボの何れかで使用できる。
イオン性または極性の自己相補性のペプチドの自己組織化を介して作成される生物学的に意味のある物質のクラスは以前に報告されている(例えばZhang,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90,3334−3338,1993;Zhang,S.,et al.,Biomaterials,16,1385−1393,1995;米国特許5,955,343および5,670,483参照)。ペプチドは相補的であり構造上適合性を有する。それらは荷電された残基が交互する正電荷および負電荷を含むことができる交互する親水性および疎水性のアミノ酸の反復単位を含む。一般的に、これらのペプチドは十分な濃度のイオン(例えば1価のカチオン)への曝露により自己組織化して種々の巨視的構造となり、これにより安定な巨視的多孔性マトリックスを形成する。マトリックスは種々の物理的形態、例えばリボン、テープ様構造、2次元または3次元の骨格等を形成できると推測される。好ましいマトリックスは典型的には直径10〜20nmまたは10〜30nmの規則正しく相互に織り込まれたフィラメントよりなり、直径(または他の該当する大きさ)50〜100nmのオーダーの孔径を有する。物質は典型的には約99%以上の水分含有量を有するヒドロゲルである。ペプチドの特定のものは自己組織化を起こして極めて高度に水和したナノ繊維を形成する(例えば99.5〜99.9%(1〜5mg/ml)水)。ヒドロゲルはこのように極めて高い水分含有量を有するため、細胞はマトリックスの上または内部において培養された場合に自由に遊走でき、細胞相互の接触が生じる。このような環境はまたタンパク質およびシグナリング分子を含む低分子の拡散を可能にする。さらにまた、ヒドロゲルの特定のものは低い弾性率を有する。特に理論に制約されないが、低い弾性率は細胞−細胞の連絡を促進する。ヒドロゲルの性質は細胞培養および/または組織工学または修復のために研究さている多くの合成材料のものとは対照的であることが示唆されている。例えば、これらの材料の多くはマイクロファイバーを含み、そしてはるかに大きい孔径を有し、細胞およびその自然の環境との比較によれば適切な縮尺にはない環境を呈している。さらにまた、ヒドロゲルはゲル形成過程において細胞を播種および/または包埋する予備形成された構造ではなく、細胞をカプセル化するように形成される。
さらにまた、細胞はペプチドヒドロゲル内部にカプセル化され、これにより細胞はペプチド骨格内の三次元の配置内におかれること、および、細胞はそのようにカプセル化されると生存性および機能を維持することが明らかになった(係争中の2001年2月6日出願の「組織細胞のペプチド骨格カプセル化およびその使用」と題された米国特許出願USSN09/778,200、「ペプチドヒドロゲル内の肝細胞リプログラミングおよびその使用」と題されたUSSN10/196,942参照)。さらにまたKLD12(AcN−KLDLKLDLKLDL−CONH2)(配列番号47)の自己組織化により形成されるヒドロゲル構造内にカプセル化された軟骨細胞はその形態を保持しており、プロテオグリカンおよびII型コラーゲンに富んだ軟骨様の機械的に着旺盛のECMを発生し、安定した軟骨細胞の表現型を示していた(Kisiday,etal.,2002)。RAD16−Iの自己組織化により作成されたペプチド骨格内にカプセル化された肝先祖細胞は肝細胞の表現型を示すマーカーを発現した(Semino et al.,2003)。このような結果は、自己組織化ペプチドゲルにより与えられるナノスケールの環境が細胞型の多様なセットの機能的活性を増強し、細胞の指令および分化した細胞の表現型の発現を可能にすることを示している。
細胞、組織工学等のための適当な環境を得るための研究においてこれまで使用されていた多くの天然および人工の材料とは異なり、本発明の材料はマイクロスケールではなくナノスケールで細胞と相互作用する。材料は種々の他の材料に典型的なマイクロファイバーではなくナノ繊維により形成される。特に理論に制約されないが、繊維のサイズが小さいことおよび/または材料の開放織込み構造が、細胞の成育のための独特の利点を与える態様において細胞の突起の伸長を促進し、栄養物質、老廃物等の拡散を可能にすると考えられる。材料を含むナノ繊維は弱い相互作用の分子の力により相補的な状態で自己組織化の間に秩序付けられる。しかしながら、それらは特定の用途のためには好ましい無秩序の状態であってもよい。換言すれば、繊維は秩序のある内部構造を有していてよいが、それらは相互に対する方向性または整列性を欠いていてもよい。例えば、繊維は相互に実質的に平行でなくてもよい。
以下のセクションは本発明に従って修飾できる自己組織化ペプチドおよび自己組織化の過程および/または組み立てられた構造の特徴を制御する方法を記載する。その後のセクションは本発明の方法および組成物、本発明の修飾された自己組織化ペプチドから形成された特徴を特性化する方法、細胞の表現型を評価するため、および、修飾のために使用されるアミノ酸ドメインを選択するための方法等を、詳述する。
II.自己組織化ペプチド、それより作成した構造、および使用方法
A.ペプチド配列および巨視的構造
以前に記載された未修飾の自己組織化ペプチドは、相補的であり構造的に適合性がある分子のファミリーを含んでいる。ペプチドおよびその特性は米国特許5,955、343および5,670,483、「組織細胞のペプチド骨格カプセル化およびその使用」と題された2001年2月6日出願の同時係争中の米国特許出願09/778200およびその他の文献に記載されている。これらの物質は種々の交互するパターンにおける親水性および疎水性のアミノ酸の反復単位よりなる。
このクラスの第1の分子、EAK16−II(AEAEAKAKAKAEAEAKAK、A、アラニン、E、グルタミン、および、K、リジン、配列番号18)、即ち16アミノ酸ペプチドは、左利きZ−DNAへの結合により最初に特徴付けられたコウボタンパク質ズオチン(zuotin)内のセグメントとして発見された(Zhang et al.,1992)。このペプチドに基づいて、アミノ酸配列を変化させ、周期的パターンに従うことにより、多数の自己組織化イオン性自己相補ペプチドが系統的に設計されている。好ましいペプチドは溶液(例えば水溶液)中で規則的な二次構造、例えばβシート構造であると推測される。これはペプチドが2つの異なる表面、即ち1つは親水性であり、もう1つは疎水性であるものを含み、そして親水性の表面上に規則的な反復を有する相補イオン結合を形成するためと考えられている(Zhang,et al.,1999)。ペプチドの側鎖は2面、即ち荷電されたイオン側鎖を有する極性面および例えばアラニンまたは他の疎水性基を有する非極性の面に分配される。これらのイオン側鎖は正荷電および負荷電のアミノ酸残基が相補イオン対を形成できるという点において相互に自己相補である。従ってこれらのペプチドはイオン性の自己相補ペプチドと称される。
多くの基準IおよびIIの自己相補ペプチド、例えばEAKA16−I(配列番号6)、RADA16−I(配列番号1)、RAEA16−I(配列番号8)およびKADA16−I(配列番号10)は以前に分析されている(表1)。これらのペプチドはまたRAD16−I、RAE16−I、KAD16−I等とも称されている(即ち4アミノ酸モジュールの最後のアミノ酸は略記においては省略されえる)。16アミノ酸を含有する基準IVイオン性自己相補ペプチド、例えばEAK16−IV、KAE16−IV、DAR16−IVおよびRAD16−IVもまた検討されている。これらの自己組織化ペプチドにおける荷電された残基が上記した全体的パターンを変化させること無く適切に置換されれば(例えば正荷電のリジンが正荷電のアルギニンと置き換えられ、そして、負荷電のグルタメートが負荷電のアスパルテートと置き換えられる)、自己組織化の過程に対して本質的に影響はない。しかしながら、正荷電された残基であるリジンおよびアルギニンが負荷電の残基、例えばアスパルテートおよびグルタメートと置き換えられれば、ペプチドはもはや自己組織化して巨視的構造を形成できなくなるが、それらはなお塩の存在下にβ−シート構造を形成できる。
水素結合を形成するアスパラギンおよびグルタミンのような他の親水性残基を荷電された残基の代替として、またはこれに追加してペプチド内に取り込んでよい。ペプチド内のアラニンがより疎水性の残基、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンまたはチロシンに変更されれば、これらのペプチドは自己組織化して増強された強度を有するペプチドマトリックスを形成する傾向が大きくなる。上記したペプチドと同様の組成および長さを有する一部のペプチドはβ−シートではなくアルファヘリックスおよびランダムコイルを形成する。このようなペプチドは典型的には巨視的構造を形成しないが、構造形成が絶対的に排除されるわけではない。即ち、自己相補製に加えて、他の要因、例えばペプチドの長さ、分子間の相互作用の程度およびスタッガードアレイを形成する能力が巨視的構造の形成にとって重要であると考えれられる。
本発明の特定の実施形態においてはアシル基(RCO−、式中Rは有機性の基)、例えばアセチル基(CH3CO−)のような基または残基をペプチドのN末端に存在させることにより、さもなくば存在するかもしれない超過の正電荷中和する(例えばN末端アミノ酸の側鎖から生じるのではない電荷)を中和する。同様に、アミン基(NH2)のような基を用いることにより、さもなくばC末端に存在するかもしれない超過の正電荷(例えばC末端アミノ酸の側鎖から生じるのではない電荷)を中和してよく、即ち、C末端をアミド(−CONH2)に変換する。特に理論に制約されないが、末端のNおよびCの分子上の電荷の中和は自己組織化を促進する場合がある。他の適当な基は当業者が選択できる。
或は、自己組織化は、イオンを含有する溶液、例えば標準的なリン酸塩緩衝食塩水(PBS)、組織培養培地、または生理学的な液体、例えば血液、脳脊髄液(CSF)等にペプチドを導入することにより開始してよい。即ちペプチドはインビボの位置において自己組織化できる。好ましいイオンは1価のカチオン、例えばLi+、Na+、K+およびCs+である。好ましくはイオンの濃度は実質的に加速された自己組織化を誘導するためには少なくとも5、10、20または50mMである。特定のペプチド配列および/または濃度および望ましい組立速度に基づいて、当業者は好ましいイオン濃度を選択できる。一般的に、得られる構造の強度はイオンの非存在下またはより低いイオン濃度における強度と比較してイオンの存在下で上昇する(ただしイオン濃度の上昇が強度上昇をもたらさないプラトーに達する場合がある)。
ペプチド、例えば交差結合されることのできるペプチドおよび本発明の修飾された自己組織化ペプチドは標準的なf−moc化学を用いて合成してよく、そして高速液体クロマトグラフィーを用いて精製してよい。ペプチド骨格の形成は本明細書に記載する通り、イオンまたはその塩の添加により開始してよい。芳香族側鎖を有する疎水性残基はUV照射への曝露により交差結合してよい。交差結合の程度はUV光への曝露の所定の時間および所定のペプチド濃度により厳密に制御してよい。交差結合の程度は光分散、ゲル濾過または走査電子顕微鏡により、標準的な方法を用いて測定してよい。さらにまた、交差結合の程度はまたプロテアーゼによる消化の後の構造のHPLCまたは質量スペクトル分析により調べてもよい。材料の強度は交差結合の前後に測定してよい。
細胞はまたヒドロゲル内にカプセル化できる。ペプチド構造内に細胞をカプセル化する場合、ペプチドおよび生細胞を、ペプチドが実質的に自己組織化しない条件下、細胞の生存性を支援する適切な濃度で等浸透圧の溶質を有する水溶液中でインキュベートしてよい。本発明の特定の実施形態においては、溶液は10、5、1または0.1mM未満の1価カチオン濃度を含有するか、または1価カチオンを実質的に非含有である。溶液はまた他のイオン種、例えば他のカチオンまたはアニオンを10、5、1または0.1mM未満含有するか、または実質的に非含有である。十分なイオン(例えば1価のカチオン)を溶液に添加することによりペプチドから巨視的構造、好ましくはβシート巨視的構造への自己組織化を開始することにより、細胞は巨視的構造の形成によりカプセル化される。カプセル化された細胞は好ましくは三次元配置における巨視的構造内に存在する。溶液は所望の体積または形状の巨視的構造を確立するための寸法を有する所定の形状を有する成型金型内に入れてよい。
細胞は所望の細胞数および密度、細胞の増殖速度および所望の細胞のリプログラミングが起こるために必要な時間に応じて、何れかの適切な時間、ペプチド構造の上または内部で培養してよい。これらのパラメーターは本発明を使用する特定の細胞および目的に応じて変動する。当業者はこれらのパラメーターを変更でき、そしてそうすることの作用を観察することにより、構造の上または内部の培養物中に細胞を維持するための旨適時間を決定できる。本発明の特定の実施形態においては細胞は約3日間、7日間、14日間、21日間、28日間、56日間または90日間培養する。本発明の特定の実施形態においては細胞は1〜3日間、4〜7日間、8〜14日間、15〜21日間、22〜28日間、29〜56日間、または57〜90日間培養する。より長期または短期の培養期間も使用してよい。
細胞を単離する方法は当該分野で知られている。個体から採取された細胞は培地中での増殖期間を設けるか、設けることなく使用してよい。或は、細胞は安定な細胞系統として培地中で増殖させてある細胞を使用してよい。本発明の特定の実施形態においては、例えば特定の治療用途(後述参照)においては、細胞は自系であるが、本発明の別の実施形態においては細胞は同種異系または異種である。非自系の細胞を使用する場合は、細胞を種々の方法で処理した後に身体内に導入することにより被験体による免疫系の応答の可能性を低減するか、または、その範囲を低減する。このような処理は例えばPCT/US00/20129に記載されているように細胞の表面上の抗原を修飾、マスキングまたは排除することを包含する。
本発明の特定の実施形態においては、細胞を被験体、例えば患者から採取し、そしてクローン細胞系統をこれらの細胞の1つ以上から誘導する。クローン系統は限界希釈によるプレーティングまたは単細胞ソーティングにより得てよい。クローン細胞系統を得るための方法は当該分野でよく知られており、例えばPuck、T.T.およびMarcus,P.I.,J.(1956)Experimental Medicine 103,653;Nias,A.H.W.and Lajtha,L.G.(1965)「Clonesize distribution in the study of inhomogeneity of growth rates in tissue culture」,Cell Culture,C.V.Ramakrishnan,ed.(Dr.W.JunkPulishers,Netherlands)およびLeong,P.−M.,Thilly,W.G.,and Morgenthaler,S.(1985)「Variance estimation in single−cell mutation assays:comparison to experimental Observation in human lymphoblasts at 4 gene loci」,Mutat.Res.,Jun−Jul;150(1−2):403−10に記載されている。細胞系統から得た細胞を本発明の実施において使用する。特定の患者の治療を意図する場合は、マッチしたドナーから得た細胞を好都合に使用してよい。個体から単離され細胞系統として維持されている細胞は本発明の実施において使用する前に標準的な細胞培養手法を含む何れかの適切な手法に従って培養してよい。
細胞を遺伝子的に改変した後に本発明において使用することが望ましい場合がある。外因性の遺伝子物質を細胞に導入するための多くの方法が当該分野で知られている(例えばPCT/US00/20129参照)。このような方法は典型的には、核酸分子(例えばDNA)のような遺伝子物質を細胞内に導入することを包含し、ここでその核酸分子は細胞により発現されるべき産物をコードするものである。産物は例えば成長因子、他の遺伝子産物の発現を誘導する転写因子等のようなリプログラミング剤であることができる。本発明の特定の実施形態においては、細胞に選択可能なマーカーを導入することが望ましい。本発明の特定の実施形態においては、選択可能なマーカー(例えば薬剤耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子)または検出可能なマーカー(例えばGFP)をコードする遺伝子を組織特異的プロモーターの制御下に導入することが望ましい。次に検出可能なマーカーは、細胞またはその子孫がその組織に特徴的な特定の細胞の直系の経路に沿って分化、脱分化または相互分化したかどうかを調べる手段として使用してよい。マーカーはまた、免疫学的な方法、FACS等、または当該分野でよく知られた別の方法を用いて、特定の経路に沿って分化、脱分化または相互分化した細胞を単離する手段として使用してよい。多くの選択可能および検出可能なマーカーが当該分野で知られている。さらに組織特異的、臓器特異的および直系特異的なプロモーターが知られている。遺伝子は当該分野で多くが知られている構成または誘導プロモーターの何れかの制御下に導入してよい。
C.アミノ酸ドメインの付加による自己組織化ペプチドの修飾
本発明者等は自己組織化ペプチドが、前記したペプチド(表1で示されたような)が自己組織化する条件化(例えばイオン強度、ペプチド濃度、pH、温度)で単離された形態で存在する場合には自己組織化しないアミノ酸ドメインの付加により自己組織化ペプチドが修飾できるという予測できない柔軟性を発見した。さらにまた、本発明の好ましい実施形態においては、非自己組織化アミノ酸ドメインの付加は修飾されたペプチドが自己組織化して例えばナノ繊維、巨視的構造または両方の形成することを妨げない。好ましくは、修飾されたペプチドは自己組織化してナノ繊維よりなる巨視的構造を形成する。得られる構造は未修飾のペプチドの自己組織化から得られる構造よりも強度および/または安定性が小さいが、実施例に示すとおり目視による観察および/またはレオロジー実験によれば、ゲルの形成が起こることが確認される
即ち修飾されたペプチドを本明細書に記載した種々の目的のために使用してよい。本発明の目的のためには、上記したセクションに記載した構造的側面を有し、そのような特徴を欠いた部分を含まない自己組織化ペプチドは、未修飾の自己組織化ペプチドと称する。(未修飾の自己組織化ペプチドはペプチドへのアミノ酸の付加を包含しない上記した多くの方法のいずれかにおいて改変してよい。このように改変された自己組織化ペプチドは本明細書における用語の意味内では「修飾された」とは称さず、むしろ「改変された」または「誘導体化された」と称する。)本発明の修飾された自己組織化ペプチドは天然に存在する分子とは異なり、即ちそれらは天然には存在しないが、本発明のペプチドのアミノ酸ドメインの1つ以上は天然に存在する分子内に存在してよい。従ってこれらは「単離された」または「合成された」ものとみなされ、ペプチドの全体的配列が人間の介入無く天然に存在することはないことを意味する。
未修飾の自己組織化ペプチドを含むアミノ酸ドメインおよび未修飾の自己組織化ペプチドの構造的側面の1つ以上を欠いており、そのため未修飾の自己組織化ペプチドの自己組織化をもたらすような条件下で自己組織化してナノ繊維を形成したり、または巨視的構造を形成することのない第2のアミノ酸ドメインを包含するペプチドは、それが未修飾の自己組織化ペプチドの自己組織化をもたらすような条件下で自己組織化(例えばナノ繊維、巨視的構造または好ましくは両方を形成)することが可能であれば、「修飾された自己組織化ペプチド」と称する。一般的に修飾された自己組織化ペプチドは第2のアミノ酸ドメインを含まないが同じ自己組織化部分を有する特定の未修飾の自己組織化ペプチドに相当することになる。本発明の特定の実施形態においては、修飾された自己組織化ペプチドの自己組織化が起こる条件は、相当する未修飾の自己組織化ペプチドが組み立てられる条件と同様である。本発明の別の実施形態においては、修飾された自己組織化ペプチドの自己組織化が起こる条件は相当する未修飾の自己組織化ペプチドが組み立てられる条件とは異なる。この場合、修飾された自己組織化ペプチドのの自己組織化のための条件は異なる(非相当の)未修飾の自己組織化ペプチドが自己組織化する条件と同様である。
即ち本発明の修飾された自己組織化ペプチドは(a)自己組織化を媒介する第1のアミノ酸ドメイン、ここでドメインは、相補的であり構造的に適合性があり、そして自己組織化して巨視的構造となる交互する疎水性および親水性のアミノ酸を含むもの;および(b)単離された形態(即ち上記した未修飾の自己組織化ペプチドの組立をもたらす条件下において溶液中で唯一のペプチドとして存在する場合)で自己組織化しない第2のアミノ酸を含む。
ペプチドの自己組織化および非自己組織化部分のアミノ酸の特定の比率を維持することが望ましい場合がある。例えば本発明の特定の実施形態においては非自己組織化ドメインはペプチドのアミノ酸の総数の50%以下を構成することが望ましい場合がある。 自己組織化部分は長さが12アミノ酸以上、例えば16アミノ酸以上であることが望ましい場合がある。特に非自己組織化ドメインが2つの自己組織化ドメインの間に存在する場合、非自己組織化ドメインにフランキングする自己組織化ドメインの各々は長さが8アミノ酸超、例えば12アミノ酸、16アミノ酸等であることが望ましい場合がある。
図1Dは本発明による修飾された自己組織化ペプチドの可能な配置の種々のものを示している。ドメインAは自己組織化アミノ酸ドメインである。ドメインBは非自己組織化アミノ酸ドメイン(修飾ドメイン)を示す。図に示す通り、修飾ドメインは自己組織化ドメインのNおよび/またはC末端に存在してよく、或は、2つの自己組織化ドメインの間に存在してよい。
交差結合法の例はαアミノ基およびεアミノ基を介して主にカップリングする基たるアルデヒド法、マレイミド−スルフィドリルカップリング化学(例えばマレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)法)および過ヨウ素酸酸化法を包含する。さらに多くの交差結合剤が知られている。例示される交差結合剤は例えばカルボジイミド、N−ヒドロキシスクシンイミジル−4−アジドサリチル酸(NHS−ASA)、2塩酸ジメチルピメリミデート(DMP)、ジメチルズベリミデート(DMS)、3,3’−ジチオビスプロピオンイミデート(DTBP)等を包含する。コンジュゲーション法および交差結合剤に関する別の情報は一般的にはAmerican ChemicalSociety,Columbus OH,POBox3337,Columbus,OH,43210の雑誌Bioconjugate Chemistryを参照できる。またURLがwww.pirecent.comを有するウエブサイトで入手可能であり、本来は1994〜95のPierce Catalogにおいて公開された「Cross−Linking」,Pierce Chemical Technical Libraryおよびそこで引用される参考文献、およびWong SS,Chemistry ofProtein Conjgation and Crosslinking、CRC Press Publishers,Boca Raton,1991も参照できる。
D.ペプチド混合物
本発明は種々の比において本発明の修飾された自己組織化ペプチド1つ以上に未修飾の自己組織化ペプチド1つ以上を混合することができること、および、未修飾および修飾された自己組織化ペプチドの両方を含む巨視的構造がこのような混合物から形成できることの認識を包含している。得られる構造は均質な自己組織化ペプチド(即ち100%単一のペプチド)の自己組織化により形成される構造と比較して特定の好都合な側面を有している。例えば上記したとおり、修飾された自己組織化ペプチドは相当する未修飾のペプチドから形成される構造よりも弱い巨視的構造をもたらす場合があり、即ち、それらはゲル性の低い特徴を有する場合がある。
或は、各ペプチドを溶解し、そして得られた溶液を混合してもよい。本発明はまた種々の修飾された自己組織化ペプチドの所望の側面を組み合わせた巨視的構造が作成されるように未修飾の自己組織化ペプチドの添加を行うか行うことなく、複数の修飾された自己組織化ペプチドを混合することも包含する。種々の修飾された自己組織化ペプチドは、同じ天然に存在するタンパク質に由来するか、または、異なるタンパク質に由来する異なるアミノ酸ドメイン、または完全に人工のアミノ酸ドメイン等を含有してよい。
本発明の特定の実施形態においては修飾された自己組織化ペプチドは相当する未修飾ペプチドの組立をもたらすような条件下において溶液中の唯一のペプチドとして存在する場合には自己組織化しないが、未修飾の自己組織化ペプチドと組み合わせて存在する場合にはそのようなペプチドと共に自己組織化する。自己組織化により未修飾ペプチドと修飾ペプチドの両方の混合物、例えば主に未修飾のペプチドを含有する、好ましくは巨視的構造を形成するナノ繊維よりなる組成物が得られる。或は、組成物は何れの修飾ペプチドも含有しない一部のナノ繊維を含有するが、他のナノ繊維はそのようなペプチドを含有していてよい。
一般的に広範な種類の異なるアミノ酸ドメインの何れも未修飾の自己組織化ペプチドに付加してよいが、ただし、追加されたドメインの存在が自己組織化(ナノ繊維、巨視的構造、または好ましくは両方の形成)を妨げてはならない。追加のドメインは得られるペプチドに対して多くの望ましい特性の何れかを付与してよい。例えば追加のドメインは生物学的な活性を媒介してよく、例えばペプチドの自己組織化により形成される骨格に接触した細胞の挙動に影響してよい。追加のドメインは天然に存在するまたは人工の生体分子、例えばECMタンパク質、細胞表面の分子、抗体等のいずれかに結合してよい。追加のドメインは金属、イオン等のような無機の物質に結合してよい。追加ドメインの存在は、ペプチドの自己組織化により生成される巨視的構造の材料特性(例えば強度、弾性等)を、未修飾の自己組織化により生成される巨視的構造の特性と比較して、改変する場合がある。即ち、非自己組織化ドメインを含むように自己組織化ペプチドを修飾することにより、巨視的構造の材料特性をユーザーの必要性に応じて調節することができる。例えば、身体内に移植するためには、移植の部位および/または移植片が交換すべき組織(例えば骨、結合組織、軟組織、例えば筋肉、眼の組織、固形臓器組織等)に応じて、異なる材料特性を有する材料を使用することが望ましい場合がある。以下のセクションは未修飾の自己組織化ペプチドに付加することができる例示的アミノ酸ドメインおよびその選択方法の非限定的な説明である。
既に発見された自己組織化ペプチドを修飾するという試みは、細胞の基底膜により与えられる微小環境の重要な側面を再生する完全に合成の物質を生成したいという要望により部分的には惹起されている。細胞の基底膜はラミニン、コラーゲンおよびプロテオグリカンにより主に構成される三次元のネットワークである。基底膜は上皮細胞のシートおよびチューブに伏在し、そして筋肉細胞、脂肪細胞およびシュワン細胞のような種々の型の個々の細胞を包囲している。特定の位置(例えば肺、腎臓の糸球体)においては、基底膜は細胞のシートを分離し、フィルターとして機能する。電子顕微鏡可視化の下においては、基底膜は2つの異なる層、即ち基底膜上に静置した細胞の基底原形質膜に隣接する電子透過性の層、および、その下部の電子緻密層を含むように観察できる。基底膜はまたより下部の層を伏在する結合組織に結合させる第3の層を含む場合がある。
構造成分としての重要性、細胞の連結の支援、および、種々の細胞、組織および臓器を分離する障壁として機能することのほかに、細胞に対してそれと相互作用する指示的な微小環境を与え、その機能をモジュレートする。細胞の極性、代謝、分化および遊走は基底膜によりモジュレートされる細胞機能の特徴の一部である。さらに、基底膜の分子は原形質膜および細胞内分子の構造的組織化に寄与することができる。基底膜分子はまた相互に相互作用する。
細胞機能のモジュレーションにおけるECMの役割は、血管および心室が下部の筋肉層から内皮細胞を分離する基底膜の最上部に位置する内側の内皮細胞を含んでいる血管系の範囲において特に興味深いものである。基底膜は血管形成のような過程において重要な役割を果たすと考えられており、そしてその一体性は適切な血管の機能を維持するために重要である。内皮細胞の層および/または伏在する基底膜の損傷または変化はアテローム性動脈硬化症のような種々の疾患の過程において中心的役割を果たしていると考えられる。
基底膜のタンパク質内に存在する短ペプチドは細胞の連結、増殖、分化および遊走を含む重要な生物学的機能の種々に関与するものとして発見されている(Iwamoto et al,1987、Kleiman et al.,1989,Koliakos etal.,1989,Skubitz et al.,1990,Tsilibary etal.,1990,Sakamoto et al.,1991)。身体内の異なるECM分子の間の結合またはECM分子と非ECM分子との間の結合を媒介するペプチド配列もまた発見されている。以下のセクションはこのようなペプチドモチーフを含有および/または相互作用する種々の基底膜分子の特徴を説明するものであり、そして血管系、内皮細胞および内皮基底膜の該当する特徴をさらに詳述するものである。
(i)ラミニン−1
ラミニンはα、βおよびγ鎖を含有するヘテロ3量体のタンパク質ファミリーを示す。ラミニンは主に基底膜に位置するが、間葉コンパートメントにも存在する。ラミニニンは支質マトリックスおよび上皮、内皮、筋肉および神経細胞の間の物理的結合を創生する。現在まで、少なくとも11種のラミニンのアイソフォーム(α、βおよびγ鎖の種々の組み合わせ)が発見されている。これら全てに共通なものは、ヘテロ3量体の組み立てにおいて中心的役割を果たすコイルドコイルドメインである。ラミニン−1が胚盤胞期よりも前のマウスの発生において生産される最早期のラミニンであり、臓器形成の間の上皮組織に寄与している(Dziadek&Timpl,1985;Klein et al.,1990)。ラミニン−1(Mr=900,000)はα1、β1およびγ1サブユニットから形成され、これらが組み立てられて十字架様の構造になる(Engel et al.,1981)。これはニドジェンと複合体を形成し、準6角形のパターンおよび3次元の構造を有するネットワークをもたらす。複合体の形成はカルシウム、温度および濃度の態様において起こる(Yurchenco&Cheng,1993)。
(H)コラーゲンIV
コラーゲン性のタンパク質はその主要機能としての構造的役割を有する細胞外マトリックスタンパク質のスーパーファミリーを構成している。全てのコラーゲンは三重螺旋のコンホーメーションを有するドメインを有する。このようなドメインは各々が(Gly−X−Y)nの反復配列モチーフを含有する3サブユニット(α鎖)から形成される。
(iv)プロテオグリカン
プロテオグリカンは細胞の表面を含む種々の位置、細胞内嚢胞の内部に存在するタンパク質のセットであり、細胞外マトリックスに取り込まれる。それらは共通の翻訳後の修飾、多糖類の特殊な型、グリコサミノグリカンのファミリーの存在により定義されて分類される。プロテオグリカンは1〜数100個のグリコサミノグリカン鎖を担持した小型または大型のポリペプチド鎖(10〜400kDa)よりなることができるコアタンパク質を含む巨大分子の多様なセットである。プロテオグリカンは多くの知られた活性を有している。中でも、他の細胞外マトリックスタンパク質と結合することにより細胞−細胞および細胞−マトリックスの相互作用を調節することがわかっている。細胞外マトリックスの組立および構造を調節し、そして保存および放出のコンパートメントとしての細胞外マトリックス内に拡散性分子を固定化する(Kreis&Vale,1999)。
別の基底膜成分。上記したタンパク質のほかに、多くの他のタンパク質が基底膜中に存在し、意味のある役割を果たしている。それらにはパーレカン、アグリン、B−40/SPARC、フィビュリン−1、フィビュリン−2が包含される(Timpl 1996,およびその参考文献)。これらに関連する多くのタンパク質も発見されている。
血管系およびECM。血管内皮細胞は全身循環と軟組織との間の界面を与え、そして炎症、凝固および脂血を含む重要な過程に関与している。血管内皮細胞もまたアテローム性動脈硬化症〜糖尿病性腎症に渡る多様なセットの病的状態において役割を果たしている。既存の血管の伸長および/または既存の血管からの新血管の形成(血管形成)は組織の修復および再生並びに胚の発生において本質的な役割を果たしている。一般的に、これらの過程には栄養および酸素を供給し老廃物を細胞から除去する三次元の血管ネットワークの形成が含まれる。血管形成は過去20年に渡り集中的な研究の対象となっている(Carmeliet,2000,Han&Liu,1999)。
血管の一般的構造は、薄膜である細胞外マトリックスの基底膜により伏在する平滑筋細胞から分離された細胞の単層を形成するコブルストーン形態を有する平板化された内皮細胞の内張りを含む(図8)。内皮細胞は血小板の接着に反発する負の外部電荷を有し、アンチトロンビンIIIに結合するグリコサミノグリカン並びに内皮細胞の抗凝固および線溶活性を促進する組織プラスミノーゲン活性化物質を生産する。殆どの他の基底膜に共通して、血管の基底膜は主にラミニン−1、IV型コラーゲン、ニドジェンおよびプロテオグリカンよりなる。内皮細胞の挙動は基底膜との相互作用により影響されることは十分明らかにされている(Tsilibary et al.,1988,Tashiro etal.,1989,Grant et al.,1989,Skubitz et al.,1990,Sakamoto et al.,1991,Kanemoto et al.,1990,Grant et al.,1990,Nomizu et al.,1997,Ponce et al.,1999,Malina et al.,1999)。
(v)ヘパリン
ヘパリンとヘパラン硫酸(HS)は、コンドロイチン硫酸、ダーマタン硫酸、ケラタン硫酸などの炭水化物を含む複雑な糖類のグループであるグリコサミノグリカンの一種である。HSは細胞表面および細胞外マトリクスに遍在している。ヘパリンとヘパラン硫酸(HS)は、ヘパリン結合成長因子、細胞外マトリクス因子、セレクチン、プロテアーゼインヒビター、脂質タンパク質リパーゼのような様々なたんぱく質と相互作用し、それによって細胞増殖、分化、接着、遊走、発生の際の形態制御などの様々な動的な細胞の振る舞いに影響している。
(vi)増殖因子
増殖因子は、細胞増殖・分化・成熟を促進する天然のたんぱく質である。多くの増殖因子が知られている。繊維芽細胞増殖因子 (酸性FGF(FGFl) 、塩基性 FGF(FGF2)),血管内皮増殖因子(VEGF), 骨形成たんぱく質 (bone morphogenic protein), 形質転換成長因子β(TGF-β), 神経成長因子 (NGF), 血小板由来増殖因子(PDGF), 上皮細胞増殖因子(EGF), 肝細胞増殖因子(HGF)。増殖因子は、インビトロの細胞培養に用いるだけでなく、治療用途にも用いられる。EGFとFGFは創傷治癒に用いられている。VEGFとHGFは、虚血疾患において血管新生の促進のために用いられている。BMPは骨再生の加速のために用いられている。増殖因子が組織再生の領域で用いられているにも関わらず、インビボ(生体内)でいつも成功するわけではない。その理由は急激な拡散と、、生物学的な活性をインビボ(生体内)で維持するための増殖因子の半減期が短いためである。増殖因子の制御徐放と保持の様々な手法が研究されている (Ishihara et.al, J Biomed Mater Res 64A: 551-559, 2003)。
内皮細胞の単層は、特に非血栓形成性の表面を与えることによる血流の促進、代謝産物に対する透過性障壁および輸送界面となること、炎症応答をモジュレートすること、血管平滑筋および心筋の収縮性をモジュレートすること、および、血管の張力および止血を調節することを含む複数の機能を有している(Boeynaems&Pirroton,1994,Cines et al.,1998)。
内皮細胞は継続的に自身の基底膜を生成、分泌およびリモデリングし、そしてまた血管の張力および止血に寄与する血管作用性のオータコイド(Greek autos−self and akos−remedyより)も合成する。酸化窒素(NO)は最も知られた血管拡張剤の1つである。生物学的な系においては、NOはもう1つの反応生成物L−シトルリンがあれば酸化窒素シンターゼの作用によりL−アルギニンから合成される。別の強力な血管拡張剤および血小板凝集抑制剤はプロスタサイクリン(プロスタグランジンI2、PGI2とも称する)である。PGI2はエイコサノイドのファミリーに属し、プロスタサイクリン合成酵素によりプロスタグランジンH2(PGH2)を介してアラキドン酸から形成される。21アミノ酸ペプチドであるエンドセリン−1(ET−1)は血管収縮を促進することがわかっている。これらの3物質は(そして恐らくは他のものも)共に血管張力調節物質として機能する。
健常な内皮の欠如は血栓のような主要な血管の病態に寄与することがわかっている。例えば平滑筋内皮細胞の単層の破壊はアテローム性動脈硬化症のプラーク中に存在する脂質および他の物質の付着により起こる場合があり、そして/またはアテローム性動脈硬化症の患部の発生に寄与している(Cines et al.,1998)。内皮細胞のコンフルエントの単層の存在は血栓耐性を改善する場合がある。これはまた擬似内膜過形成のような他の疾患を、例えば平滑筋の収集および/または増殖に寄与する可能性がある生物活性因子を放出する血小板の接着を防止することにより、防止すると考えられる。さらにまた平滑筋内皮細胞単層を形成する能力は血管形成術、カテーテル挿入等のような侵襲性の処置の後の内皮の一体性を回復するために有用である。従って、かなりの作業が現在、インビトロおよびインビボの両方における内皮細胞形成の研究に向けられている。
多くの研究者等は血管形成における細胞外マトリックスの役割を研究している。このような研究の多くではマトリゲル、Engelbreth−Holm−Swarmマウス腫瘍から得られた基底膜誘導材料またはコラーゲンのような細胞外マトリックス誘導材料に対するECの挙動の観察を行っている(Grant et al.,1989,Daviset al.,2000,Bell et al.,2001,Davis et al.,2002)。管形成のような血管形成の過程は2Dおよび3Dのシステムの両方において研究されている(Davis et al.,2000,Bell et al.,2001,Davis et al.,2002)。数種の合成ペプチドとのECの相互作用(Grant et al.,1989,Grant et al.,1992,Ponce etal.,1999,Nomizu et al.,2001)も検討されている。
G.生物学的活性に関する試験
本セクションは候補ペプチドが生物学的に活性なペプチドモチーフを含むかそれよりなることを調べるために使用できる種々の試験を説明する。以下に記載する試験は例示を目的とするのみであり、そして当業者は目的の細胞型および細胞の挙動に応じて、種々の別の試験および本明細書に記載した試験の変法を選択して使用できる。これらの試験のいずれにおいても、可溶性ペプチドを対照として使用できる。ある範囲のペプチド濃度(基板結合、修飾された自己組織化ペプチドの部分としての存在の両方、または可溶性形態)を使用してよい。
さらにまた、細胞の表現型、細胞の生存性または増殖、細胞の表現型および/または細胞の機能的状態または種々の細胞の挙動の種々の指標の何れかを評価および/またはモニタリングすることが望ましい場合がある。当該分野で知られている通り、細胞の生存性、増殖を評価するため、および、細胞の挙動および表現方の種々の特徴を評価するための多くの方法がある。一般的に何れかの適切な方法を使用して本明細書に記載した条件下に細胞を培養することの作用を検査および評価してよい。さらにまた、細胞/ヒドロゲル組立て物の全体的組成および特性に対する細胞の作用をモニタリングしてよい。タンパク質含有量、強度等の側面を調べることができる。
(i) 細胞の生存性および増殖。
(U)細胞の連結。
細胞の展開には細胞型により異なる多くの形態学的側面が関与している。例えば、ヒト包皮線維芽細胞は典型的には展開時には伸長された多角形の細胞の形状をとり(Hernand Hubbell,1998)、そして組織化されたFアクチン張線維ネットワークをディスプレイする(後述参照)。細胞の形態特徴は光学顕微鏡で評価でき、そして修飾vs未修飾の骨格上および/または競合する可溶性ペプチドの存在下または非存在下に展開する細胞に特徴的な形態をとる細胞の数を調べることができる。
(iv) 細胞骨格の組織化
特定のペプチドは細胞の形状および遊走に影響する細胞骨格の組織化に作用する。細胞内部のFアクチン張線維の組織化はローダミンコンジュゲートファロイジン染色により調べることができる(Hern and Hubbel,1998)。例えばペプチド骨格上に培養した細胞を4%ホルムアルデヒド溶液中に固定し、透過性とし(例えばPBS中0.1%トリトンX−100)、ローダミンコンジュゲートファロジンとともにインキュベートし、再度固定する。次にそれらを例えばエピ蛍光顕微鏡を用いて顕微鏡的に可視化することができる。
本発明の修飾された自己組織化ペプチドを含む骨格を包含する種々の基板の上またはこれを通過する細胞の遊走を定量するための多くの試験法が使用可能である。例えば、遊走は細胞を基板上、例えば修飾された自己組織化ペプチドを含む骨格上で、障壁の存在下に培養するフェンススタイル試験を用いて評価できる。障壁の位置を記録する。次に障壁を除去し、細胞を所定時間維持する。所定時間内に障壁を通過する細胞の数を細胞遊走の測定値とする。数値は基板により異なる細胞の増殖を考慮して補正する。上記した方法の変法においては、後に除去する障壁により容器の領域を分離することにより異なる表面2つ以上を含む基板を作成できる。種々の表面への示差的遊走を評価できる。遊走はまた、平滑筋細胞(Mann 2002)およびヒト微小血管内皮細胞(HMVEC)(Sagnella 2004)について記載されている通り放射状テフロン(登録商標)フェンス遊走試験を用いて定量することもできる。
(vi) 細胞の分化、脱分化および相互分化。
マーカーの種類は膨大であり、新しいマーカーが日常的に発見されている。例えばネスチンは神経上皮ニューロン前駆体幹細胞中で発現される中間フィラメントタンパク質であり、その発現はニューロンの成熟と共に低減される(Lendahl 1990)。ネスチンは未成熟ニューロンのマーカーと考えられ、そしてネスチン陽性細胞はニューロンまたはグリアのいずれかに分化できる。NeuNは有糸分裂後の細胞中で発現されるニューロン特異的マーカーである(Sarnat 1998)。グリアフィブリルアレイ酸性タンパク質(GFAP)は伝統的なグリア星状細胞マーカーである。ベータIIIチュブリンは別のニューロン特異的タンパク質である。CYP450タンパク質の発現は肝細胞に特徴的である。
機能的試験はまた細胞の表現型または状態を評価するためにも使用できる。例えば、細胞が特定の細胞型に特徴的な特定の分子の取り込み、生産または分泌を行える、または特定の細胞型に特徴的な酵素的反応を行える能力を評価できる。実施例に記載する通り、低密度リポタンパク質(LDL)およびNOの放出は内皮細胞に特徴的である。
ECM成分の生産に対する種々の候補となる生物学的に活性なペプチドモチーフ、活性な生体分子、環境パラメーター、例えば機械的力の適用等の影響を評価すること、および/または、そのような成分の生産を経時的にモニタリングすることは特に有利である。このための種々の方法が使用できる。実施例3に記載する通り、ウエスタンブロット(または他の免疫学的方法)を用いてECMタンパク質の生産を定量できる。組織学的分析のためには、プロテオグリカン成分であるグリコサミノグリカン(GAG)のトルイジンブルー染色を標準的操作法に従って実施できる。コラーゲンの付着は知られた手法を用いて測定できる(Ioannidis et al.,Cell Tissue Res.297:141−147,1999;Domm et al.,Orthopade 29:91−99,2000)。細胞外タンパク質の生産は[3H]−プロリンの培地への添加により測定できる。放射標識プロリンは細胞により取り込まれ、そして新しく合成されるタンパク質中に取り込まれる。放射標識培地中で一定時間(例えば16〜24時間)の後、遊離の[3H]−プロリンを洗浄により除去する。細胞外タンパク質は例えば約60℃で一夜プロテイナーゼK溶液中でインキュベートすることにより消化し、消化タンパク質中に存在する放射能をシンチレーション計数により定量する。プロテオグリカンの生産は[3H]−プロリンの変わりに[35S]−スルフェートを培地に添加する以外は同様に測定できる。GAGの総蓄積は結合したDMMB染料の量の蛍光分析に基づいて測定できる(Chandrasekhar et al.,Analytical Biochemistry 161(1):103−108,1987)。
神経系の組織(例えば神経、グリア細胞)のインビトロの培養、神経系の組織の修復および再生のために有用な材料を開発することは大変興味深いことである。神経組織の機能の指標となる種々のパラメーターを測定できる。例えばニューライトの派生はペプチド骨格の上面上で培養した単離細胞、例えばPC12細胞の顕微鏡観察(および場合によりデジタル画像処理)により評価できる(Holmes,et al.,2000)。このような細胞もまたカプセル化できる。別の方法は、ニワトリのような動物から摘出した脊髄神経節をカプセル化し、種々の時点において神経節から伸長するニューライトの平均の長さを測定することである(Schense and Hubbell,1999;Schense JC,Bloch J.,Aebischer P.,and Hubbell JA(2000) Nature Biotechnology,18:415−419)。シナプス形成は例えばHolmes,2000に記載の通り評価することができる。神経伝達物質および神経伝達物質の合成に関与することがわかっている酵素の生産は神経組織の機能的活性を評価する別の手段を与える。
(ix) 内皮細胞の新芽形成
大動脈輪をラットのような動物から単離し、一定期間ペプチド骨格上で培養して新芽形成させ、その後固定して顕微鏡検査する大動脈輪試験を用いて候補の生物学的に活性なペプチドが血管形成の重要な特徴である内皮細胞新芽形成を誘導する能力を定量することができる(Malinda,1999)。
ペプチド骨格の表面上または内部にカプセル化してECを培養した後の細胞の組織化およびキャピラリー様の構造の形成は種々の時点において、例えば播種後2時間、8時間、12時間、24時間、3日、1週間および2週間の時点で、WO2003096972に記載の通り相関長を測定することにより定量できる。ヘマトキシリンおよびエオシン染色、Massone3色、並びにアクチンに関する免疫染色により内皮細胞のクラスターの形成、新芽形成、キャピラリー様構造の形成を目視で評価できるようになる。キャピラリー様構造中の管腔の存在は目視により、および三次元画像化システムを含む自動画像化システムを用いることにより評価することができる。管形成の評価方法は当該分野で知られている(例えばDavis et al.,2000,Bell et al.,2001,Davis et al.,2002)。
H. 目的のアミノ酸ドメインの発見
本発明のペプチドの非自己組織化部分として使用してよい別のアミノ酸ドメインを発見するための1つの方法は細胞との相互作用、特定の分子への結合等が考えられる天然に存在するタンパク質の配列から誘導した合成ペプチドを系統的にスクリーニングすることである。この方法は上記したとおり多くの生物学的に活性なペプチドを発見するために使用されている。一般的に、一緒になって配列の全部分または大部分を包含している、場合により重複しているペプチドのセットを、インビトロで合成する。次に細胞または潜在的な結合分子を個々のペプチドと接触させ、そして細胞の応答、結合の程度等を評価する。ペプチドは検出を容易にするために標識することができる。
一般的に、例えば上記した特定のタンパク質を含む何れかの天然に存在するタンパク質の配列から得られるペプチドをスクリーニングすることができ、生物学的に活性なペプチドモチーフYIGSR(配列番号33)およびRYVVLPR(配列番号 35)を含むラミニン−1および生物学的に活性なペプチドモチーフTAGSCLRKFSTM(配列番号37)を有するIV型コラーゲンを例示できる。これらのタンパク質、関連するタンパク質、他の目的のタンパク質(例えば他のECMタンパク質)、タンパク質をコードする遺伝子等の完全な配列は、National Center for Biotechnology Information(URL:www.ncbi.nlm.nih.govを有するウエブサイト参照)から入手可能なもののような公的データベースにおいて、例えばEntrez検索エンジンを用いながら、当業者は容易に特定することができる。データベースは遺伝子またはタンパク質の名称により、ヌクレオチド配列(例えばGenBankを検索することにより)またはタンパク質配列によるなどして検索できる。例えばIV型コラーゲンをコードする遺伝子は「コラーゲン」の用語を用いてGeneデータベースを検索することにより発見することができる。検索結果の代表的で非限定的な部分的セットを付録Aに示す。結果には目的の候補アミノ酸ドメインを選択するもととなるタンパク質配列へのリンクが含まれる(リンクは除去されている)。付録Bは配列番号33、配列番号35および配列番号37の配列を用いてタンパク質配列のデータベースを検索することにより得られた検索結果の非限定的なセットを示し、これらの配列に含まれるタンパク質を識別するアクセッション番号も含まれる。同様であるが同一ではない配列を含むタンパク質が容易に発見できる。
上記したとおり、目的の他のタンパク質は別のECMタンパク質、例えば別の基底膜タンパク質を含む。異なる細胞型に対して特に適するペプチド骨格は、細胞型が典型的に担持または包含されるECM中に存在することがわかっているタンパク質をスクリーニングすることにより作成してよい。例えば異なる細胞型が共通して含まれる基底膜はラミニン、コラーゲン等の異なるアイソフォームを含有する場合がある。アミノ酸ドメインは目的の何れかの細胞型の細胞外環境に存在するタンパク質から選択できる。理論に制約されないが、これらのタンパク質はその細胞型の培養のため、および/または、その型の細胞を含有することがわかっているかその型の細胞を移植または誘引することが望まれる部位において身体内に導入するために好ましいものである。
即ち、本発明は目的の細胞型に対するペプチド骨格の形成のための自己組織化ペプチドを設計するための方法を提供し、これは、その細胞型の細胞外環境(例えば細胞型が天然に担持または包含されるECMまたは基底膜中)に存在する天然に存在するタンパク質に存在するアミノ酸ドメインを発見すること、ペプチドが細胞上に対する生物学的作用を示すかどうか調べるためにこれをスクリーニングすること(ペプチド骨格内に存在するか上記した別の態様で細胞の環境中に存在する場合)、修飾された自己組織化ペプチドの第2のアミノ酸ドメインとしてアミノ酸ドメインを利用すること、および、修飾された自己組織化ペプチドを含む骨格が細胞の成育のために良好かどうか、改変された細胞の表面型をもたらすかどうか等を調べるためにこれを試験すること、を包含する。スクリーニング段階は省略することができ、即ち、候補ペプチドは、所望により、生物学的作用についてそれをまず試験することなく、修飾された自己組織化ペプチドの部分として直接取り込むことができる。
別の方法は、ファージディスプレイ、細胞表面ディスプレイまたはリボソームディスプレイのようなペプチドライブラリを使用するディスプレイ手法を用いることである(Sarikaya 2004およびその参考文献を参照)。ファージディスプレイおよび細胞表面ディスプレイはファージまたは細胞の表面上に天然に存在するキメラタンパク質を使用する。キメラタンパク質は一般的には天然に存在するファージまたは細胞の表面のタンパク質の全てまたは部分、および、ファージまたは細胞により発現される核酸によりコードされるランダムなペプチド配列を含有する第2のドメインを含有する。核酸の部分は典型的には種々の分子生物学の手法のいずれかによりランダム化された後にファージまたは細胞(またはその前駆体)の内部に導入されるか、後に突然変異により改変されることができる。自身の表面上にキメラタンパク質の異なるバージョンを各々が発現しているファージまたは細胞のライブラリを標的(例えばリガンド(固定化されていてよい)または細胞の集団)に接触させる。接触段階の後、キメラタンパク質を発現する弱く結合した細胞またはファージを洗浄除去し、強力に結合しているものを残存させる。工程を反復することにより堅固に結合しているものをリッチ化する(バイオパニング)。指向性の進化を実施する種々の方法も用いることができる。
/. 自己組織化ペプチドおよびそれを含む組成物の特性化
本発明の未修飾の自己組織化ペプチドまたは修飾された自己組織化ペプチドまたはその組成物の何れかにより形成される構造(例えばナノ繊維、巨視的構造、ヒドロゲル)は種々の生物物理学的および工学的な手法を用いて特性化してよい。適当な手法は目視検査、円偏光二色性(CD)、動的光散乱、フーリエ変換赤外スペクトル分析(FTIR)、レオロージ試験、例えば振動レオメーター観察、原子力顕微鏡観察(ATM)、走査電子顕微鏡観察(SEM)および透過型電子顕微鏡観察(TEM)を包含する。例えば生物物理学的方法を用いてペプチド骨格内のβ−シートの二次構造の程度を測定してよい。さらに、フィラメントおよび孔径、繊維の直径、長さ、弾性および容量区分を走査および透過型電子顕微鏡観察の定量的画像分析を用いて測定してよい。
レオロジー測定はペプチド骨格の粘弾性を試験するために実施できる。例えば試料を振動応力または振動歪に付す振動レオメトリーは、例えば周波数の範囲内で制御された歪において試料を剪断する制御された歪レオメーターを用いて実施できる。使用できる種々のレオメーターは市販されている。レオメトリーの原理およびゲルへのその適用は例えばClark,1987およびKavanagh&Ross Murphy,1998に記載されている。
振動レオメトリーにおいて、粘稠な溶液の場合、複合基準の粘性成分、損失弾性率(G’’)は典型的には振動周波数が低減するに従って、そして貯蔵弾性率G’が低値であれば低下する。ゲルについては、G’およびG’’は振動周波数に対して比較的一定である。例えば本発明の好ましい実施形態においては、動的周波数掃引試験により測定した場合、直線領域の周波数範囲にわたってはdG’/dwおよびdG’’/dwの大きさは2未満、より好ましくは1未満であり、ここでG’およびG’’はパスカル(Pa)で測定し、wはrad/sの周波数を示す。周波数の範囲は例えば0.1〜1rad/s、1〜10rad/s等であることができる。本発明の別の好ましい実施形態においては、動的周波数掃引試験により測定した場合、直線領域の周波数範囲にわたってはdG’/dwおよびdG’’/dwの大きさは0.5未満、0.2未満、または0.1未満であり、ここでG’およびG’’はPaで測定し、wはrad/sの周波数を示す。
ゲルの場合、G’は典型的にはゼロより高値である。本発明の好ましい実施形態においては、本発明の修飾された自己組織化ペプチドの自己組織化により形成された組成物のG’は0.5Pa以上である。本発明の他の好ましい実施形態においては、本発明の修飾された自己組織化ペプチドの自己組織化により形成された組成物のG‘は動的周波数掃引試験を用いて直線領域において測定した場合、1.0Pa以上、5Pa以上、10Pa以上、10〜100Paまたは100Pa超である。直線領域は得具0.1〜1rad/s、1〜10rad/s、または10〜100rad/sであってよい。このような測定を行う場合、動的歪掃引をまず材料に対して実施することにより試験の直線的な粘弾性の領域を設定して動的周波数掃引試験のための固定された歪を選択してよい。この直線的な粘弾性の範囲は一般的には一定の基準G’およびG’’により定義される。この範囲内の歪を選択することは信頼性のある結果を得るために重要である(Schramm,1994)。例えば実施例1で試験したペプチド骨格の場合は、選択された歪は0.01(無次元)であり、全ての試験に適用した。
上記した説明は本発明を限定する意図はなく、単にその特定の実施形態に関するものである。実際、ゲルは「溶液中の是非に関わらず交差結合の相互作用(共有結合または非共有結合)を生じてネットワークを形成する何れかの物質」として定義されており、物質は低応力下において材料の変形の点においてある程度の弾性特性を保持していると理解される(Scaling Concepts in Polymer Physics,Pierre−Gilles de Gennes,Cornell University Press(1979))。ヒドロゲルの場合、ネットワークはかなりの量の水を保持している。
(H) 原子間力顕微鏡
原子間力顕微鏡観察(AFM)は試料の表面および試料をスキャンするために使用される顕微鏡の鋭利な先端の相互作用を測定することによりナノメーターの尺度まで表面構造の分解を可能にする技術である。AFMは小さい一定の力を維持しながら試料表面を通過して可撓性のカンチレバーの末端上の鋭利な先端を走査することを包含する。走査の動作は試料に対してラスタパターンで先端を走査する(または先端に対して試料を走査する)圧電気管スキャナにより実施する。先端−試料の相互作用は典型的にはスプリット光ダイオード検出器内のカンチレバーの背部にレーザーを反射させることによりモニタリングされる。光検出器の出力電圧の差を検出することによりカンチレバーの偏向または振動振幅の変化を測定できる。
最も一般的に使用されている操作様式は2種類、即ち接触モードAFMおよびTappingModeTMAFMであり、これは空気中または液体の環境において実施される。接触様式AFMは先端と試料の間の反発力を測定することにより操作される(Binning et al.,1986)。機器は先端に僅かに接触する。TappingModeTMAFMにおいては、画像は吸引力の測定から誘導され、先端は試料に接触しない。自身の共鳴振動数において振動し、走査の間に表面上を僅かに「タッピング」する。TappingModeTMAFMは、軟質で壊れやすく接着性の表面において、接触モードのAFMの欠点である損傷を与えることなく測定を可能にすることから、本発明のペプチド骨格におけるナノ繊維の形成を評価するために特に適している。
J. 治療用途
本発明の修飾された自己組織化ペプチドの自己組織化によるか、または、本明細書に記載した修飾または未就職の自己組織化ペプチドの組み合わせの自己組織化により作成されたペプチド構造は種々の組織の欠陥および疾患を治療するために使用してよい。ペプチドヒドロゲル構造は表面上に生育するか内部にカプセル化されている細胞の有無に関わらず、例えば手術により、または、何れか他の適当な処置を用いて身体内に移植してよい。他の経路、例えば経口、経皮、筋肉内、静脈内および皮下の経路を使用してよい。当業者は適切な送達手法を選択できる。
一般的に本発明の方法および組成物は組織の傷害または損傷が関与する何れかの状況において有用である。このような傷害は手術、外傷、腫瘍、変性疾患または他の疾患または状態の結果として生じる。必ずしもではないが、傷害は細胞の死を伴う。方法および組成物は組織の構造的および/または機能的な一体性を回復するため、すなわち傷害の前に存在していた機能的または構造的な状態に組織を回復させるために有用である。特定の傷害は組織の再生または修復を妨害する物理的障壁を与える場合がある。このような障壁は壊死、空洞化または瘢痕組織の形成の領域を含む。本発明の特定の実施形態においては、傷害の部位において本明細書に記載した材料を導入することは、傷害または障壁の部位に近接する位置から傷害または障壁の部位から隔たった位置までの細胞または組織の成育を可能にする。
本発明の特定の組成物および方法は臓器の疾患または変性の作用を緩解するため、臓器または他の身体構造への損傷を修復するため、または、臓器または他の身体構造を形成するために使用してよい。このような臓器または身体構造は、例えば、血管組織、脳、神経組織、食道、ファローピウス管、心臓、腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、膀胱、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿道、尿管、子宮および皮膚を包含する。
一般的に種々の装置を用いて傷害の部位に骨格材料を導入してよい。シリンジを用いた送達は1つの好都合な手法である。ペプチドはまた手術部位においてカテーテルによるか直接導入することもできる。本発明の特定の実施形態においては、ペプチドが未組立であるか、最小限にしか組立てられていないペプチド溶液(即ちゲルを形成していない溶液)を身体内に導入する。本発明の別の実施形態においては骨格の形成はインビトロで可能であり、そして組立てられた骨格を身体内に導入する。
細胞をカプセル化したペプチド骨格は種々の治療目的のために使用してよい。未組立のペプチドおよび細胞をインビトロで混合し、次に、投与後に構造を自己組織化させ、細胞をインビボでカプセル化してよい。上記したとおり、本発明の特定の実施形態においては、投与した溶液は10、5、1.0または0.1mM未満のイオン(例えばカチオン)を含有するか、実質的にイオン(例えばカチオン)含有であり、そして等浸透圧溶質の濃度は少なくとも5、150または300mMである。1つの実施形態においては、等浸透圧溶質の濃度は以下の範囲、即ち、200〜250mM、250〜270mM、270〜300mM、300〜400mM、400〜500mM、500〜600mM、600〜700mM、700〜800mMまたは800〜900mMの1つに含まれる。適当な等浸透圧溶質は例えば炭水化物、例えばスクロースである。
本発明の種々の実施形態において、自己組織化の前または後に、別の物質1つ以上をペプチド骨格に添加する。物質は多くの目的、例えば後述するものの何れかに対応するものである。骨格を身体内に移植する場合、生育中の細胞の突起または組織はそれらがペプチド骨格に占有されている区域内に伸長または生育するに従って物質と接触する。本発明の特定の実施形態においては物質は例えば拡散により、またはそれが経時的に分解するのに従って骨格から放出されることにより、骨格から放出される。特定のペプチド配列および/またはペプチド濃度およびパラメーター、例えば交差結合度を選択することにより物質の分解および放出の所望の速度を得てよい。物質は移植の部位またはその近傍において細胞および組織と接触および/または血流中に進入してより遠位まで移動してよい。添加できる物質は、例えば、感染症を治療するか危険性を低下させるための抗生物質または抗カビ剤、腫瘍を治療するための化学療法剤等を包含する。即ち、巨視的構造の原料となったペプチド溶液は治療活性化合物または化学誘引剤を含んでよい。このような化合物の例は、天然または合成の低分子;核酸分子、例えばRNA干渉(RNAi)を媒介する核酸分子(Dorsett and Tuschi 2004,およびその参考文献)、例えば短干渉RNA(siRNA)または短ヘアピンRNA(shRNA)、リボザイムまたはプラスミド;ペプチドまたはタンパク質、例えばインテグリンまたは細胞接着分子;タンパク質、例えば抗体等を包含する。
本発明の特定の実施形態においては、ペプチド溶液またはそれから形成された巨視的構造は分化、脱分化または相互分化を増強または誘発する薬剤、例えば成長因子、例えば欠陥内皮成長因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、アンジオポエチン1または2、表皮成長因子、神経成長因子、トランスフォーミング増殖因子−α、トランスフォーミング増殖因子−β、腫瘍壊死因子α、血小板誘導成長因子、インスリン様成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、肝細胞成長因子、脳誘導神経親和性因子、ケラチノサイト成長因子、骨形態形成タンパク質または軟骨誘導因子を取り込む。成長因子および/または治療薬または化学誘引物質の組み合わせも使用してよい。ペプチドホルモンも使用してよい。天然に存在するペプチドまたは修飾されたバージョン、例えば心房性ナトリウム利尿ペプチドのようなペプチドも使用してよい。
成長因子は典型的には約1fg/ml〜1mg/mlの間の濃度において使用される。多くの場合、成長因子は低ナノモル範囲、例えば1〜10nMの濃度で使用する。本発明の特定の実施形態においては、成長因子は従来技術において典型的に使用されていない、または、正常な条件下ではインビボで典型的には観察されない濃度において使用される。例えば、成長因子は作用をもたらすために典型的に必要な濃度よりも、または、インビボで典型的に存在する濃度よりも、5倍高値、10倍高値、20倍高値、100倍高値等の濃度おいて使用してよい。特定の所望の作用に応じて、特定の薬剤、例えば成長因子の旨適濃度を決定するために滴定実験を実施することができる。因子は精製された形態で、または、血清のような複合的生物学的混合物の成分として添加してよい。
所望の分子の合成のための鋳型を含む核酸を提供するベクターまたはビヒクルをペプチド骨格に取り込ませ、これから、傷害の部位または近傍において細胞によりそれらを取り込ませてよい。好ましくは、核酸は目的の細胞内で発現されるべき遺伝子のコーディング配列を包含し、そしてまた、適切な発現シグナル、例えばプロモーター、ターミネーター等を含むことにより、適切な発現を確保する。本発明の特定の実施形態においては、遺伝子が特定の細胞型の細胞内でのみ発現されるように発現シグナルは細胞型特異的である。
一般的に、ウィルス性または非ウィルス性のベクターを使用してよい。本発明の特定の実施形態においては、ベクターはニューロンに感染できるウィルスベクターである。例えばヘルペスウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、レトロウィルスまたはレンチウィルスを使用してよい。細胞への鋳型の送達において未損傷のウィルスを使用することは回避することが好ましい。即ち、DNAベクターまたは線状DNA分子を送達することが好ましい。これらのベクターは必須ではないが長末端反復等のウィルス配列を含んでよい。トランスフェクションに有用な広範な種類の薬剤のいずれかを用いて細胞による核酸の取り込みを増強してよい。このような薬剤は広範なカチオン性重合体および修飾されたカチオン性重合体、脂質等を含む。細胞型特異的なターゲティングリガンド、例えば目的の細胞型の上で発現される分子に特異的に結合するリガンドまたは抗体を遺伝子療法送達剤に結合させることによりその薬剤が特定の細胞型のみに導入されるようにしてよい。一般的に核酸および何れかの適切な遺伝子療法送達剤(例えばカチオン性重合体)を本明細書に記載した方法のいずれかにおいて骨格内に取り込んでよい。
本発明の特定の実施形態においては、治療上望ましい遺伝子の修飾を行ってよい。例えば固体が特定の遺伝子において突然変異を保有している場合、遺伝子療法目的のために先祖細胞内に遺伝子の野生型コピーを導入することが望ましい場合がある。本発明の特定の実施形態においては、特定の受容体、例えば成長因子受容体をコードする遺伝子を導入することにより特定の分化、脱分化または相互分化の能力を付与または増強することが望ましい場合があり、これは成長因子に細胞を応答させることにより行う。
治療目的のために投与されるべき細胞の数、異なる表現型の細胞の相対的比率、および/またはペプチド構造中の細胞の濃度は治療すべき特定の状態または傷害に対して適宜改変することができる。
本発明の特定の実施形態においては、例えばペプチド構造の上または内部において増殖および/または分化している血管内皮細胞および/またはその先祖細胞は構造から除去または抽出される。除去または抽出は適当な手段、例えば吸引ピペットを用いた除去、骨格の機械的破壊、インビトロでの構造の酵素的分解等により達成してよい。本発明の特定の実施形態においては、選択された方法は細胞の約10%、細胞の10%〜25%、細胞の25%〜50%、細胞の50%〜75%、または細胞の75%〜100%の除去または抽出をもたらす。何れかの好都合な範囲をもたらす方法を選択してよい。選択された方法は細胞を使用する目的、必要な細胞の数等に応じたものである。本発明の特定の実施形態においては、除去または抽出された細胞の生存性は細胞の約10%、細胞の10%〜25%、細胞の25%〜50%、細胞の50%〜75%、または細胞の75%〜100%である。何れかの好都合な範囲をもたらす方法を選択してよい。選択された方法は細胞を使用する目的、必要な細胞の数等に応じたものである。
抽出された細胞はさらにペプチドヒドロゲル構造の上または内部において、または何れかの他の培養容器中、インビトロで培養してよい。抽出された細胞は適切な経路、例えば静脈内、皮下、経口、経皮、筋肉内または外科的に被験体に投与してよい。投与された細胞は組織、臓器または身体構造、例えば血管組織の不全を有する組織、臓器または身体構造に補給するために使用してよい。投与された細胞はタンパク質、例えば個体が欠損している酵素を供給してよい。投与された細胞を遺伝子的に修飾し、遺伝子療法を送達する手段として使用してよい。
本発明の自己組織化ペプチドは、例えば血管形成術のような処置の後に、傷害の部位において血管の内皮の層の形成を促進するために使用してよい。それらはまた、内皮化を促進するために例えば血管移植片またはステントのような装置のためのコーティング物質として使用してよい。別の方法においては、ペプチドは人工血管のような人工の導管の内面上に層を形成する。内皮細胞は一定期間ペプチドの自己組織化により形成された層の上で培養する。細胞はEMC成分を分泌する。次に細胞を除去すると、細胞により合成されたECM分子を含有する未損傷の基底膜層が残る。次に人工の導管を宿主内に移植する。別の方法においては、導管は内皮細胞を除去することなく宿主に委嘱する。
本発明の自己組織化修飾ペプチドおよびそれを含有する構造は例えば末梢神経系における軸索および神経の再生を促進するために神経ガイドとして、またはその内部において使用できる。
本発明は細胞を培養するため、および/または、被験体の身体内に導入できるペプチド骨格を形成するために使用してよいキットを提供する。キットは乾燥または凍結乾燥形態、溶液、または組立または部分的組立の状態で提供してよい本発明の自己組織化ペプチド1つ以上を含む。キットはさらに、以下の要素、即ち、細胞の集団、細胞または組織の培養基、所定量の成長因子、所定量のイオンまたはその塩、細胞培養用の自己組織化ペプチドの調製のための取扱説明書、ペプチドヒドロゲル構造の上または内部において細胞を培養するため(例えば細胞をカプセル化するため)の取扱説明書、被験体に自己組織化ペプチドを導入するための取扱説明書、細胞培養を実施する容器、ペプチドを溶解できる液体、シリンジ、ペプチドの自己組織化を開始するためのイオンまたはその塩、成長因子または分化因子の1つ以上、組織培養用の培地、細胞(例えば血管内皮細胞)、対照ペプチド等の1つ以上を含んでよい。別の要素も含んでよい。
上に一般的に記載および考察したように、本発明は以下を含む修飾自己組織化ペプチドを提供する:
(a) 交互の疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を含み、非修飾の状態で、相補的で、構造的に適合し、自己組織化し、巨視的な構造を取る、自己組織化を引き起こす第一のアミノ酸ドメインと、
(b)単体では自己組織化せず、少なくとも一つの最小の生物学的に活性のある配列を含む第2のアミノ酸ドメイン。
ある実施形態では、第2のアミノ酸ドメインが、細胞接着たんぱく質のヘパリン結合ドメイン由来である。ある実施形態では、細胞接着たんぱく質が、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、VEGF, FGFs, PDGF, HGF, TGF-β、 BMPのグループから選ばれている、
他の実施形態では、ヘパリン結合ドメインが、式(I)または(II)で示される: (I)- XBBXBX-(II) XBBBXXBX-, Xは非荷電または疎水性のアミノ酸 (F, I, L, P, M, W, Y, V, A, C,Q)、Bは正電荷のペプチド (R, H ,K)から選択される
ある実施形態では、修飾自己組織化ペプチドは正または負の総電荷を有する。ある実施形態では、電荷は水溶液が約5-9のpH の範囲で現れる。他の実施形態では、自己組織化ペプチドが8以上の等電位点を有する。更に他の実施形態では、溶液のpHが約6-8の範囲である時に、自己組織化ペプチドの総電荷が約2以上である。
(U) 医薬組成物
本発明は、本明細書に記載された、修飾自己組織化ペプチドを含む医薬組成物も提供する。
ある実施形態では、保存されたペプチド溶液は酸性のpHである。ある実施形態では、保存されたペプチド溶液は投与前に近中性のpHに調整される。ある実施形態では、保存されたペプチド溶液は投与前に近中性のpHに調整され、滅菌されたシリンジや容器に保存される。ある実施形態では、pHは近中性のpHに調整液(例えばNaOHのような塩基性溶液)で調整される。
上述の通り、本発明は自己組織化ペプチドを含む本発明のマトリクスも提供する。ある実施形態では、マトリクスはゲルかハイドロゲルである。他の実施形態では、マトリクスが3次元である(例えば特定の形状を持つ)
ある実施形態では、マトリクスが更に追加の生物学的分子を有する。ある実施形態では、追加の生物学的分子が正または負の総電荷を有する。他の実施形態では、追加の生物学的分子がたんぱく質またはペプチドである。さらに他の実施形態では、追加の生物学的分子が成長因子か、自己組織化ペプチドである
ある実施形態では、追加の生物学的分子が、自己組織化ペプチドである。ある実施形態では、追加の生物学的分子が、修飾自己組織化ペプチド(表2aに示されたような)である。更に他の実施例では、追加の生物学的分子が、非修飾自己組織化ペプチド(表1に示されたような)である。
他の実施形態では、固体物がブロック状、円柱状、板状、顆粒状である。
本明細書で示されるとおり、本発明は本発明のマトリクスの製造法も提供する。例えば、ある実施形態では、(i)自己組織化ペプチドを水溶液に溶解する, (ii) pHを調整する工程を含むマトリクスの製造法を提供する。ある実施形態では、更に(iii)ゲル化剤を加える工程を含む。
本明細書中に記載されるように、本発明は、本発明の修飾自己組織化ペプチド、および/または自己組織化ペプチド、および/またはその医薬組成物、および/またはそれからなる骨および/または組織の欠損補填材として作られたマトリクスを用いた方法を提供する。「組織」は、何れかの外部または内部の体の組織を含む。組織には、脳、皮膚、肝臓、膵臓、胃、腎臓、消化器、食道、心臓、筋肉、結合組織、軟骨、神経、脂肪、骨髄が例示されるが、これに限定されるものではない。
本明細書中に記載されたように、本発明は、本発明の自己組織化ペプチド、その医薬組成物またはそれから作られるマトリクスを含むキットを提供する。キットは、通常適切な容器(フォイル、プラスチック、段ボール箱等)に提供される。ある実施形態では、本発明のキットは、本明細書に記載されて様な、一つかそれ以上の薬剤の賦形剤、薬剤の添加剤を含む。ある実施形態では、本発明のキットは、この本発明のマトリクス内に細胞を培養するために適切な投与を行なうための、目盛り付きのカップ、シリンジ、ニードル、洗浄補助具、などを含む。ある実施形態では、本発明のキットは、適切な投与や培養や、および/または適切な投与や培養のための準備の説明書を含む。
下記の実施例は、発明を説明する目的であって、発明の範囲を限定する意図ではなく、また解釈されるべきではない。実際、本明細書中に記載したものに加えて、様々な改変やさらなる実施例が、実施例や引用された科学・特許文献を含むこの文書の全体から、この分野の専門家にとっては自明である。下記の実施例は、様々な実施形態および同等物においてこの発明の実施に適応できる、重要な追加情報、例証、手引きを含んでいる。
近年高齢化のため、骨の老化および骨折は、患者のQOL(生活の質)および医療費の双方に重要な課題となっている。骨折は、主に骨粗鬆症に由来するが、同時に骨再生の低下によるものである。従って、バイオマテリアルの移植および組織工学的なアプローチによる骨再生の加速は興味をもたれている。また本骨芽細胞の石灰化の活動の促進および前駆骨芽細胞の分化の促進にも関心がもたれている。
アルカリフォスファターゼ(ALP)活性:機能化ペプチドのALP活性は、コントロール(RAD16-1単体、1型コラーゲン)に比較して同様又はそれ以上に高かった(図4)。この結果は、アルカリフォスファターゼ染色(図5A-5I)によって確認された。図5A-5Iの暗い(青っぽい)範囲が高いALP活性を示している。
自己組織化配列ペプチド(例 1%RAD16-1ペプチド溶液)と自己組織化配列(RADA)と機能化モチーフ(RGD)を有する機能化ペプチド(配列番号7)の混合比の影響を評価した(表8−9)。配列番号7は、N-末端に配列番号4と比較して疎水性を増すための追加のグリシンを持っている。配列番号4 と 配列番号7は同様の効果を持つと考えられる。
前述の自己組織化ペプチドハイドロゲルは、細胞に対し、コラーゲンと同様の3次元的な生育のための人工的な細胞外マトリクス環境(ECM)を提供する。細胞を3次元的に播種する場合、粘性溶液の状態を維持するために、自己組織化ペプチド溶液は、低いpH (通常2−3)で保存する必要がある。しかし、生きている細胞を低いpH溶液に長い間混合することは、細胞の生存に大きな影響を与える(多くのヒト細胞はpH2-3の環境では数分しか生きられない)。そこで、低いpH にある自己組織化ペプチド溶液と細胞を混合する場合、(1)細胞を播種したら、(2)直ちにpH を近中性(pH5-8)または塩基性にする。
前述のヘパリン結合モチーフを有する自己組織化ペプチドは、組織工学あるいは他の治療目的に対し、成長因子および、あるいはまた治療に用いられるたんぱく質の維持および、あるいはデリバリーに有用である。VEGF、FGF類、 PDGF、 HGF、 TGF-βおよびBMPはヘパリンおよびヘパラン硫酸に吸着されることが知られている。ヘパリンまたはヘパラン硫酸とヘパリン結合ペプチド溶液と成長因子が混合された時、ペプチドはヘパリンまたはヘパラン硫酸に結合し、ヘパリンまたはヘパラン硫酸は成長因子と結合する。このようにして、成長因子はペプチドマトリクス中で長期間保持され、細胞を継続的に刺激し、ペプチドマトリクスの分解と共にゆっくりと放出される。例えば、ペプチドマトリクスが生体に移植され、生体に存在するヘパリンと成長因子が、移植されたマトリクスに供給されうる。
機能化ペプチドマトリクスの骨新生に対する効果の予備的なIn vivoの評価実験をラットで行なった。6週令の押すラットを評価に用いた(各条件につき、2つずつの試料を用意した)。
骨新生量の評価:各グループのラットは、2週間後および4週間後に、X線像を撮像後、頭骸骨を回収・固定した。脱灰、パラフィン包埋後、HE染色を行ない、獣病理医に欠損部内の組織の病理学的形態によって評価を依頼した。骨再生の程度は、1:80%以上、2:50%以上、3:X線上で再生弱 とスコア化した。
血管新生と脈管化を促進することは、心筋梗塞、末梢血管障害、脳梗塞などの虚血障害の治療に莫大な可能性を持っている。血管新生と脈管化は、創傷治癒や骨再生といった組織再生においても重要な役割を担っている。また、皮膚、肝臓、膵臓、骨、筋肉などの3次元的な組織の構築にも重要である。血管構造を構成する、血管内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、繊維芽細胞などに適切な微小環境を提供することで、血管新生と脈管化を促進するマトリクスを開発することは重要である。
結果を表20と図25に要約する。表19のハイドロゲルの内、選択されたものについて、3日培養後のウエル内のDNA量が評価された。DNA量は細胞数と比例している。図25は、コラーゲン、PRGmx と KLTmxゲルがRADに対し、統計的に高いDNA量が得られている。これらの結果は、元の自己組織化配列に結合された機能モチーフに依存して、機能化ペプチドマトリクスは非機能化ペプチドマトリクスよりも優位な血管内皮細胞接着性を有し、コラーゲンやマトリゲルといった天然由来のマトリクスと細胞形態において類似の機能を有することを示している。
血管新生のインビボ(生体内)の実験を絨毛尿膜(CAM)を用いて行なった。有精卵の8日の孵卵後、直径10mm厚み1mmのハイドロゲルを鶏卵の絨毛尿膜に移植した。ハイドロゲルは表19から選択され、ゲルは移植前に作成された。12日目に、CAMは病理分析のために回収された。ハイドロゲル内部およびハイドロゲル下部の血管新生が病理断層像により評価された。
前述の実施例ではRAD16-1 ((RADA)4)が、自己組織化の基本構成ブロックとして用いられていた。基本となる自己組織化配列の変更により、ハイドロゲルの特性が制御できる。(IEIK)2は8つのアミノ酸からなる短い配列であるが、(RADA)4に比較して硬いゲルを生成する。それは、イソロイシン(I)がアラニン(A)よりもフレキシブルでないためである。更に硬いゲルが、自己組織化配列の繰り返しを(IEIK)3, (IEIK)4と伸ばすことによって得られる。
現在、骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)、脂肪由来幹細胞(ADSC)などが細胞治療のために臨床研究が進んでいる。幹細胞治療において、細胞が移植組織の微小環境に定着するまで、細胞およびそのバイアビリティを維持することが第一に重要である。幹細胞治療においては細胞のバイアビリティを維持するのみならず、幹細胞の性質を維持することも重要である。例えば、骨再生や軟骨再生では、骨芽細胞や軟骨細胞への分化能を維持する必要がある。
前述は、本発明の特定の好ましいが限定されない実施形態の記述である。下記の請求項で定義されるとおり、本発明の精神と範囲を超えない範囲で、この分野の通常のスキルのものであれば、さまざまな変更を加えることができることが理解できる。
本願の出願当初の請求項を実施の態様として以下に付記する。
[1] (a) 交互の疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を含み、非修飾の状態で、相補的で、構造的に適合し、自己組織化し、巨視的な構造を取る、自己組織化を引き起こす第一のアミノ酸ドメインと、
(b)単体では自己組織化せず、少なくとも一つの最小の生物学的に活性のある配列を含む第2のアミノ酸ドメインとを含む自己組織化ペプチド。
[2] 第2のアミノ酸ドメインが少なくとも2つの最小の生物学的に活性のある配列を含む[1]に記載のペプチド。
[3] 前記最小の生物学的に活性のある配列が、-PRGDSGYRGD-; -DGRGDSVAYG-; -ALKRQGRTLYGF-; -PFSSTKT-; -FLGFPT-; -KLTWQELYQLKYKGI-; -SKPPGTSS-; -STFTKSP-; -IKVAV-; -FHRRIKA-; -IKLLI-; -RGD-; -REDV-; -LKKTETQ-.からなる群より選択される[1]に記載のペプチド。
[4] 少なくとも一つの前記最小の生物学的に活性のある配列が、-RGD-.を含む[1]に記載のペプチド。
[5] 第2のアミノ酸ドメインが単体で生物学的に活性を有する[1]に記載のペプチド。
[6] 第2のアミノ酸ドメインが第一のアミノ酸ドメインのC末端と共有結合または非共有結合で接続されている[1]に記載のペプチド。
[7] 第2のアミノ酸ドメインが第一のアミノ酸ドメインのC末端と共有結合ペプチド結合またはアミノ酸リンカー基により共有結合性に接続されている[6]に記載のペプチド。
[8] 当該アミノ酸リンカー基が少なくとも一つのグリシンを含む[6]に記載のペプチド。
[9] 第一のアミノ酸ドメインの最後のアミノ酸と、第2のアミノ酸ドメインの最小の生物学的に活性のある配列の最初のアミノ酸との距離が少なくとも2アミノ酸長(6.9オングストローム)である[1]に記載のペプチド。
[10] 第一のアミノ酸ドメインの最後のアミノ酸と、第2のアミノ酸ドメインの最小の生物学的に活性のある配列の最初のアミノ酸との距離が少なくとも2アミノ酸長(13. 8オングストローム)である[1]に記載のペプチド。
[11] 第一のアミノ酸ドメインが、アミノ酸配列: -RADA-; -IEIK-; または -FKFQ-の何れか1を少なくとも2回含む[1]に記載のペプチド。
[12] 第一のアミノ酸ドメインが、以下のアミノ酸配列の何れか一つを含む[1]に記載のペプチド;配列番号21 n-RADARADARADARADA-c; 配列番号22 n- RADARGDARADARGDA-c; 配列番号23 n-RADARADA-c; 配列番号24 n- RARADADARARADADA-c; 配列番号25 n-RARADADA-c; 配列番号26 n-AEAKAEAKAEAKAEAK-c; 配列番号27 n-AEAKAEAK-c; 配列番号28 n-RAEARAEARAEARAEA-c; 配列番号29 n-RAEARAEA-c; 配列番号30 n-KADAKADAKADAKADA-c; 配列番号31 n-KADAKADA-c; 配列番号32 n-AEAEAHAHAEAEAHAH-c; 配列番号33 n-AEAEAHAH-c; 配列番号34 n-FEFEFKFKFEFEFKFK-c; 配列番号35 n-FEFKFEFK-c; 配列番号36 n-LELELKLKLELELKLK-c; 配列番号37 n-LELELKLK-c; 配列番号38 n-AEAEAKAKAEAEAKAK-c; 配列番号39 n-AEAEAEAEAKAK-c; 配列番号40 n-AEAEAKAK-c; 配列番号41 n-KAKAKAKAEAEAEAEA-c; 配列番号42 n-AEAEAEAEAKAKAKAK-c; 配列番号43 n-RARARARADADADADA-c; 配列番号44 n-ADADADADARARARAR-c; 配列番号45 n-DADADADARARARARA-c; 配列番号46 n-(ADADADADARARARAR)-c; 配列番号47 n-HEHEHKHKHEHEHKHK-c; 配列番号48 n-HEHEHKHK-c; 配列番号49 n-VEVEVEVEVEVEVEVEVEVE- c; 配列番号50 n-RFRFRFRFRFRFRFRFRFRF-c; 配列番号51 n-FKFQFKFQFKFQ-c;配列番号52 n-IEIKIEIK-c; 配列番号53 n-KLDLKLDLKLDL-c。
[13] 第一のアミノ酸ドメインが、以下のアミノ酸配列の何れか一つを含む[12]に記載のペプチド:配列番号21 -RAD ARAD ARADARAD A-; 配列番号51 -FKFQFKFQFKFQ-; 配列番号52 -IEIKIEIK-; 配列番号53 -KLDLKLDLKLDL-。
[14] 第2のアミノ酸ドメインが、細胞接着たんぱく質のヘパリン結合ドメイン由来である[1]に記載のペプチド。
[15] 前記細胞接着たんぱく質が、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、VEGF、 FGFs、 PDGF、 HGF、 TGF-βおよびBMPからなる群より選択される[14]に記載のペプチド。
[16] 前記ヘパリン結合ドメインが、式(I)または(II): -XBBXBX- または -XBBBXXBX- (I) (H)で示される[14]に記載のペプチド:ここで、XはF, I, L, P, M, W, Y, V, A, CおよびQからなる群より選択される疎水性のアミノ酸を表し、BはR, HおよびKからなる群より選択される正電荷のアミノ酸を表す。
[17] 当該自己組織化ペプチドが、以下からなる群より選択される[1]に記載のペプチド;配列番号1 AC(RADA)4GGPFSSTKT-CONH2; 配列番号2 Ac(RADA)4GGFLGFPT-CONH2; 配列番号3 AC(RADA)4GGALKRQGRTLYGF-CONH2; 配列番号4 AC(RADA)4GPRGDSGYRGDS-CONH2; 配列番号5 AC(RADA)4GGDGRGDSVAYG-CONH2; 配列番号6 Ac(RADA)4GGFHRRIKA-CONH2; 配列番号7 AC(RADA)4GPRGDSGYRGDSG-CONH2; 配列番号8 Ac(RADA)4GGRGDSCONH2;配列番号9 Ac(RADA)4GGGGRGDSCONH2; 配列番号10 Ac(RADA)4GGGGREDV-CONH2; 配列番号1 1 Ac(RADA)4GGGGKLTWQELYQLKYKGI- CONH2; 配列番号12 Ac(RAD A)4GGSKPPGTSS-CONH2; 配列番号13 ACIEIKIEIKIGGPRGSYRGDS-CONH2; 配列番号14 ACIEIKIEIKIGGPFSSTKT-CONH2; 配列番号15 ACIEIKIEIKIGGSKPPGTS-CONH2; 配列番号16 AcFKFQFKFQFKFQGPRGDSGYRGDS-CONH2; 配列番号17 ACFKFQFKFQFKFQGGFHRRIKA-CONH2; 配列番号18 Ac(RAD A)4GGSTFTKSP-CONH2; 配列番号19 Ac(RADA)4GGSIKVAVS-CONH2; および配列番号20 Ac(RADA)4GGSEIKLLIS-CONH2。
[18] 当該自己組織化ペプチドが約5-9(5と9も含む)のpH の水性溶液中で正または負の総電荷を持つ[1]に記載のペプチド。
[19] 第一のアミノ酸ドメインが近中性であるか、または正電荷若しくは負電荷を有する[18]に記載のペプチド。
[20] 第2のアミノ酸ドメインが正電荷または負電荷を有する[18]に記載のペプチド。
[21] 前記溶液のpHが約6-8(6と8も含む)であるときに、第一のアミノ酸ドメインの電荷が−1から1である[19]に記載のペプチド。
[22] 前記水溶液のpHが約6-8(6と8を含む)であるときに、第2のアミノ酸ドメインの電荷が−2かそれ以下である[20]に記載のペプチド。
[23] 第一のアミノ酸ドメインが5−9(5と9を含む)の等電位点を有する[18]に記載のペプチド。
[24] 当該自己組織化ペプチドが8または8以上の等電位点を有する[18]に記載のペプチド。
[25] 当該溶液のpHが約6-8(6と8を含む)であるときに、当該自己組織化ペプチドの総電荷が約2または2以上である[18]に記載のペプチド。
[26] 単体で存在する場合、第2のアミノ酸ドメインは自己組織化せず、当該ペプチドが集合して巨視的な構造を形成するように、第一のアミノ酸ドメインの自己組織化を可能にする[1]に記載の自己組織化ペプチド。
[27] 当該巨視的な構造がナノファイバーおよび/またはβシートを含む[27]に記載の自己組織化ペプチド。
[28] 水溶液中で単独のペプチドとして存在するときに、当該ペプチドが自己組織化する[1]に記載の自己組織化ペプチド。
[29] 水溶液中に単独のペプチドとして存在するときには自己組織化せず、水溶液中に非修飾の自己組織化ペプチドと共に存在するときには自己組織化する[1]に記載の自己組織化ペプチド。
[30] さらに、第3のアミノ酸ドメインを含む[1]に記載の自己組織化ペプチド;ここで、当該第3のアミノ酸ドメインは、(a) 疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸が交互に設けられたドメインを含み、相補的で、構造的に適合し、自己組織化し、巨視的な構造を取る、自己組織化を引き起こす第一のアミノ酸ドメインと、(b) 単独では自己組織化しないが、第1のアミノ酸ドメインの集合により、巨視的な構造の形成を可能にする第2のアミノ酸ドメイン、のいずれかを含む。
[31] 疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸が交互に設けられたドメインを含み、相補的で、構造的に適合し、自己組織化し、巨視的な構造を取る、自己組織化を介在する2つのアミノ酸ドメインの間に、生物学的に活性のあるペプチドモチーフまたは生分子との相互作用のための標的部位を含むアミノ酸ドメインの直鎖のペプチド鎖を含む[30]に記載の自己組織化ペプチド。
[32] 当該巨視的な構造がナノファイバーおよび/またはβシートを含む[31]に記載の自己組織化ペプチド。
[33] [1]に記載の自己組織化ペプチドを含む溶液。
[34] [1]に記載の自己組織化ペプチドを含む医薬組成物。
[35] ゲル化剤を実質的に含まず、生体内で自己組織化して巨視的な構造を形成する[34]に記載の医薬組成物。
[36] 当該巨視的な構造がナノファイバーおよび/またはβシートを含む[35]に記載の医薬組成物。
[37] 疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸が交互に設けられたドメインを含み、相補的で、構造的に適合し、βシートに自己組織化し、巨視的な構造を取る、追加の自己組織化ペプチドを更に含み、当該追加の自己組織化ペプチドが細胞接着または細胞生存の適合性を低下させるアミノ酸を含まない[34]に記載の医薬組成物。
[38] [1]に記載の自己組織化ペプチドと当該追加の自己組織化ペプチドが約1:1の比率で存在する[37]に記載の医薬組成物。
[39] [1]に記載の自己組織化ペプチドと当該追加の自己組織化ペプチドが約5:1の比率で存在する[37]に記載の医薬組成物。
[40] [1]に記載の自己組織化ペプチドと当該追加の自己組織化ペプチドが約9:1の比率で存在する[37]に記載の医薬組成物。
[41] [1]に記載の自己組織化ペプチドと当該追加の自己組織化ペプチドが約99:1の比率で存在する[37]に記載の医薬組成物。
[42] [1]に記載の自己組織化ペプチドを含むマトリクス。
[43] 当該マトリクスがゲルまたはハイドロゲルである[42]に記載のマトリクス。
[44] 当該マトリクスが更に追加の生物学的分子を含む[42]に記載のマトリクス。
[45] 前記追加の生物学的分子が正または負の総電荷を有する[44]に記載のマトリクス。
[46] 当該追加の生物学的分子がたんぱく質またはペプチドである[44]に記載のマトリクス。
[47] 当該たんぱく質またはペプチドが成長因子または自己組織化ペプチドである[46]に記載のマトリクス。
[48] 当該自己組織化ペプチドが以下からなる群より選択される[47]に記載のマトリクス:配列番号21 n-RADARADARADARADA-c; 配列番号22 n- RADARGDARADARGDA-c;配列番号23 n-RADARADA-c; 配列番号24 n- RARADADARARADADA-c; 配列番号25 n-RARADADA-c; 配列番号26 n-AEAKAEAKAEAKAEAK-c; 配列番号27 n-AEAKAEAK-c; 配列番号28 n-RAEARAEARAEARAEA-c; 配列番号29 n-RAEARAEA-c; 配列番号30 n-KADAKADAKADAKADA-c; 配列番号31 n-KADAKADA-c; 配列番号32 n-AEAEAHAHAEAEAHAH-c; 配列番号33 n-AEAEAHAH-c; 配列番号34 n-FEFEFKFKFEFEFKFK-c; 配列番号35 n-FEFKFEFK-c; 配列番号36 n-LELELKLKLELELKLK-c;配列番号37 n-LELELKLK-c; 配列番号38 n-AEAEAKAKAEAEAKAK-c; 配列番号39 n-AEAEAEAEAKAK-c; 配列番号40 n-AEAEAKAK-c; 配列番号41 n-KAKAKAKAEAEAEAEA-c; 配列番号42 n-AEAEAEAEAKAKAKAK-c; 配列番号43 n-RARARARADADADADA-c; 配列番号44 n-ADADADADARARARAR-c; 配列番号45 n-DADADADARARARARA-c; 配列番号46 n-(ADADADADARARARAR)-c; 配列番号47 n-HEHEHKHKHEHEHKHK-c; 配列番号48 n-HEHEHKHK-c; 配列番号49 n-VEVEVEVEVEVEVEVEVEVE- c; 配列番号50 n-RFRFRFRFRFRFRFRFRFRF-c; 配列番号51 n-FKFQFKFQFKFQ-c; 配列番号52 n-IEIKIEIK-c; および配列番号53 n-KLDLKLDLKLDL-c。
[49] 当該増殖因子がヘパリン結合増殖因子である[47]に記載のマトリクス。
[50] 当該ヘパリン結合増殖因子が、VEGF, FGFs, PDGF, HGF, TGF-βおよび BMPからなる群より選択される[49]に記載のマトリクス。
[51] 当該追加の生物学的分子がグリコサミノグリカンである[44]に記載のマトリクス。
[52] 当該グリコサミノグリカンがヘパリンまたはヘパラン硫酸である[51]に記載のマトリクス。
[53] 当該マトリクスの表面に接着またはマトリクス内部に封入されている複数の細胞を更に含む[42]に記載のマトリクス。
[54] 当該細胞が実質的に均質に当該マトリクス内部に分散している[53]に記載のマトリクス。
[55] 当該細胞が、骨芽細胞、軟骨細胞、骨髄細胞、骨細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、繊維芽細胞、間葉細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来細胞、脂肪由来幹細胞、神経細胞、海馬細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、角質細胞、基底細胞、棘突起細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、子宮頸部細胞、肝細胞、包皮細胞、好中球、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞およびそれらの前駆細胞からなる群より選択される[53]に記載のマトリクス。
[56] 当該マトリクスが3次元である[42]に記載のマトリクス。
[57] 当該マトリクスが更に固体物を含む[42]に記載のマトリクス。
[58] 当該固体物が無機塩である[57]に記載のマトリクス。
[59] 当該無機塩がカルシウムおよび/またはリン酸である[58]に記載のマトリクス。
[60] 当該無機塩が、リン酸カルシウム、三リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイトおよび炭酸カルシウムからなる群より選択される[59]に記載のマトリクス。
[61] 当該固体物が約100−500ミクロン(100と500を含む)の範囲の孔径を有する[57]に記載のマトリクス。
[62] 当該固体物がブロック状、円柱状、板状または顆粒状である[57]に記載のマトリクス。
[63] (i)当該自己組織化ペプチドを水溶液に溶解する工程と, (ii) pHを調整する工程とを含む[42]に記載のマトリクスを製造する方法。
[64] (iii)ゲル化剤を加える工程を更に含む[63]に記載のマトリクスを製造する方法。
[65] (i)当該自己組織化ペプチドを水溶液に溶解する工程と, (ii)ゲル化剤を加える工程とを含む[42]に記載のマトリクスを製造する方法。
[66] (iii) pHを調整する工程を更に含む[65]に記載のマトリクスを製造する方法。
[67] 当該ゲル化剤が電解質である[64]または65に記載の方法。
[68] 当該ゲル化剤が食塩、食塩水、PBS、細胞培養液または生物学的流体である[67]に記載の方法。
[69] 当該生物学的流体が血液またはリンパ液である[67]に記載の方法。
[70] pHが約5−9(5と9を含む)に調整されている[63]または66に記載の方法。
[71] pHが約6−8(6と8を含む)に調整されている[70]に記載の方法。
[72] pHが約5−7(5と7を含む)に調整されている[71]に記載の方法。
[73] pHが約5.7-5.8(5.7と5.8を含む)に調整されている[72]に記載の方法。
[74] 骨又は組織の欠損補填材としての[42]に記載のマトリクスの使用方法。
[75] 当該組織が、脳、皮膚、肝臓、膵臓、胃、腎臓、消化器、食道、心臓、筋肉、結合組織、軟骨、神経、脂肪または骨髄である[74]に記載の方法。
[76] 当該補填材が水溶液中の自己組織化ペプチドを含む[74]に記載の方法。
[77] 当該補填材が当該自己組織化ペプチドのハイドロゲルを含む[74]に記載の方法。
[78] 当該ハイドロゲルが、当該自己組織化ペプチドの水溶液とゲル化剤との混合により形成される[77]に記載の方法。
[79] 当該ゲル化剤が生物学的流体である[78]に記載の方法。
[80] 当該生物学的流体が血液またはリンパ液である[79]に記載の方法。
[81] 当該ハイドロゲルが、当該自己組織化ペプチドの水溶液のpHを調整することによる形成される[77]に記載の方法。
[82] 更に固体物を含む[74]に記載の方法。
[83] 当該固体物が無機塩である[82]に記載の方法。
[84] 当該無機塩がカルシウムおよび/またはリン酸である[83]に記載の方法。
[85] 当該無機塩が、リン酸カルシウム、三リン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイトおよび炭酸カルシウムからなる群より選択される[84]に記載の方法。
[86] 前記固体物が、約100−500ミクロン(100と500を含む)の孔径を有する[82]に記載の方法。
[87] 当該固体物がブロック状、円柱状、板状または顆粒状である[82]に記載の方法。
[88] 当該欠損が、損傷した組織、損傷した整形領域、骨欠損、骨隣接部、異所性の骨形成、虚血領域、心筋梗塞領域、末梢血管領域、脳梗塞領域または皮膚欠損である[74]に記載の方法。
[89] [1]に記載の自己組織化ペプチド、[34]に記載の医薬組成物または[42]に記載のマトリクスをそれを必要とする対象に対して投与することを含む細胞の分化または機能活性を増強する方法。
[90] [1]に記載の自己組織化ペプチド、[34]に記載の医薬組成物または[42]に記載のマトリクスを対象の体の部位または体内に導入することを含む対象を治療する方法。
[91] 当該部位が、整形領域、骨欠損部、骨隣接部、異所性の骨形成部、虚血領域、心筋梗塞領域、末梢血管領域、脳梗塞領域または皮膚欠損部である[90]に記載の方法。
[92] (a)(i)[1]の自己組織化ペプチド、(ii)[34]の医薬組成物、または(iii)[42]のマトリクス;(b) 当該ペプチドの巨視的な構造への自己組織化を開始するための説明書;並びに(c) 細胞群、細胞または組織培養培地、あらかじめ定めた量の増殖因子、予め定めた量のイオンまたはその塩、当該自己組織化ペプチドを細胞培養のために準備するための説明書、ペプチドハイドロゲル構造の上または中で細胞を培養するための説明書、当該自己組織化ペプチドを対象に導入するための説明書、細胞培養を実施する容器、当該ペプチドを溶解する液体、注射器、ペプチドの自己組織化を開始するためのイオンまたはその塩、および1または1以上の増殖因子または分化因子からなる群より選択される少なくとも1の成分;を含む培養キット。
[93] 細胞を、[1]の自己組織化ペプチド、[34]の医薬組成物、または[42]のマトリクスと接触させることと、当該マトリクスを細胞培養に適した条件下で細胞培養に適した時間に亘り維持することとを含む細胞を培養する方法。
[94] 当該細胞が、当該マトリクスの表面上で培養される、および/または当該マトリクス内に封入されて培養される[92]に記載の方法。
Claims (33)
- 以下を含む、移植のための自己組織化ペプチド骨欠損補填組成物:
RAD16−Iを含む第1のアミノ酸ドメインであって、対象の骨欠損部への移植に際して自己組織化してより大きな構造となるドメイン;および、前記自己組織化組成物が、さらに、
単離された形態では自己組織化しない第2のアミノ酸ドメインであって、前記第2のアミノ酸ドメインが繰り返しRGD配列を含む。 - 前記第1のアミノ酸ドメインと、前記繰り返しRGD配列中に存在する前記RGDモチーフの間の距離が6.9オングストローム以上である、請求項1に記載の組成物。
- 前記第1のアミノ酸ドメインと、前記RGDモチーフの間の距離が13.8オングストローム以上である、請求項2に記載の組成物。
- 前記第2のアミノ酸ドメインが:
AC(RADA) 4 GPRGDSGYRGDS-CONH 2 (配列番号4);
AC(RADA) 4 GPRGDSGYRGDSG-CONH 2 (配列番号7);および
AcFKFQFKFQFKFQGPRGDSGYRGDS-CONH 2 (配列番号16);
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。 - ゲルまたはハイドロゲルを含む請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物がマトリクスに自己組織化する溶液として処方される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記マトリクスが骨細胞の内方成長を刺激して固体物を形成する、請求項6に記載の組成物。
- 前記固体物が無機塩を含む、請求項7に記載の組成物。
- 前記無機塩がカルシウムおよび/またはリン酸を含む、請求項8に記載の組成物。
- 前記マトリクスが、自己組織化によってのみ形成するナノファイバーまたはβシートを含む、請求項6に記載の組成物。
- 前記マトリクスが約10〜20nmの直径を有する織り込まれた繊維を含む、請求項10に記載の組成物。
- 前記マトリクスが約100〜500ミクロンの範囲の孔径を有する多孔性マトリクスである、請求項6に記載の組成物。
- 前記第2のアミノ酸ドメインが、8〜64アミノ酸、または8〜46アミノ酸、または8〜36アミノ酸、または8〜26アミノ酸、または8〜16アミノ酸を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第2のアミノ酸ドメインが、前記第1のアミノ酸ドメインの自己組織化配列のC末端に位置している、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第1のアミノ酸ドメインと前記第2のアミノ酸ドメインが、リンカー基を介して接続されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記リンカー基が1つ以上のグリシンまたはアラニン部分を含む、請求項15に記載の組成物。
- 任意にDGRモチーフ(配列番号5)を含む、第3のアミノ酸ドメインをさらに含んでいる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 治療活性化合物、ゲル化剤、組織の修復および再生を促進する薬剤、または細胞の分化、脱分化、または相互分化を増強または促進する薬剤をさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- コラーゲンまたは骨形態形成タンパク質(BMP)をさらに含む、請求項18に記載の組成物。
- 人工骨材料をさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 骨芽細胞またはヒト胚性幹細胞ではない複数の幹細胞をさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 幹細胞が骨髄由来間葉系幹細胞を含む、請求項12に記載の組成物。
- 請求項1〜22のいずれか1項に記載の組成物を含む、自己組織化ペプチド骨補填移植片。
- 骨細胞の内方成長を可能とするナノファイバーを含む、請求項23に記載の移植片。
- 骨細胞のマトリクスへの遊走に適合している、請求項23に記載の移植片。
- 1.0Pa以上の貯蔵弾性率を有する、請求項23〜25のいずれか1項に記載の移植片。
- 5Pa以上の貯蔵弾性率を有する、請求項26に記載の移植片。
- 0.5Pa未満の損失弾性率を有する、請求項23〜27のいずれか1項に記載の移植片。
- 再生骨のための、請求項1〜22のいずれか1項に記載の組成物または請求項23〜28のいずれか1項に記載の移植片。
- 骨欠損を外科的に治療するための請求項1〜22のいずれか1項に記載の組成物または請求項23〜28のいずれか1項に記載の移植片であって、骨欠損が損傷した整形領域、骨隣接部または異所性の骨形成である組成物または移植片。
- 前記組成物または前記移植片が、針またはチューブにより対象に導入される、請求項1〜22のいずれか1項に記載の組成物または請求項23〜28のいずれか1項に記載の移植片。
- 移植片の組成物を対象に導入するように機能し、請求項1〜22のいずれか1項に記載の組成物または請求項23〜28のいずれか1項に記載の移植片を含む装置。
- シリンジまたはカテーテルを含む、請求項32に記載の装置。
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