WO2020171161A1 - 自己組織化ペプチド - Google Patents

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WO2020171161A1
WO2020171161A1 PCT/JP2020/006745 JP2020006745W WO2020171161A1 WO 2020171161 A1 WO2020171161 A1 WO 2020171161A1 JP 2020006745 W JP2020006745 W JP 2020006745W WO 2020171161 A1 WO2020171161 A1 WO 2020171161A1
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WO
WIPO (PCT)
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sol
peptide
gel
rada
self
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/006745
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
貴博 村岡
石田　敦也
逸樹 味岡
渡辺　豪
Original Assignee
国立大学法人東京農工大学
国立大学法人東京医科歯科大学
学校法人北里研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人東京農工大学, 国立大学法人東京医科歯科大学, 学校法人北里研究所 filed Critical 国立大学法人東京農工大学
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Publication of WO2020171161A1 publication Critical patent/WO2020171161A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins

Definitions

  • the present invention relates to a self-assembling peptide, a sol-gel transfer agent, a sol-gel transfer composition containing a sol-gel transfer agent as an active ingredient, and a sol-gel transfer method thereof.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Some peptides that form intermolecular interactions form supramolecular fibers in water to give hydrogels.
  • This hydrogel is being applied as a biomaterial due to the advantages of general peptide such as biocompatibility and biodegradability.
  • Examples of applications of the hydrogel include cell scaffold materials (Non-Patent Document 3) and transportation materials such as formulations (Non-Patent Document 4).
  • Animal-derived gelling agents such as collagen and Matrigel are typically used for the hydrogel.
  • quality differences between production lots are observed in the molecular weight distribution and the component ratio.
  • contamination from various organisms can significantly affect biological samples such as cells. Therefore, there is an unavoidable risk of causing allergies and unknown infectious diseases, and there is a problem in terms of clinical application (Non-Patent Documents 5 to 9).
  • Synthetic low-molecular-weight peptide gelling agents originated from EAK16 and RADA16 found by Shuuguang Zhang et al. in 1993, and research and development have been conducted to date (Non-patent documents 10 to 12). These have the advantage that the peptide consisting of a specific amino acid sequence is synthesized with high purity by solution synthesis or solid phase synthesis method, so that the quality of each production lot is stable and the contamination is extremely small.
  • Typical examples of low molecular weight peptide gelling agents are (A) amphipathic peptides in which 1 or 2 amino acids are linked to an aromatic moiety (cinnamoyl group, Fmoc group, etc.), (B) ⁇ sheet formation An amphipathic peptide in which a long alkyl chain (palmitoyl group or the like) is linked to one end of a peptide, (C) an amphipathic peptide in which hydrophilic amino acids and hydrophobic amino acids are alternately linked, and the like are known (Non-patent document) References 1-2). Regarding the above (A) and (B), the fact that the non-natural skeleton is included may be a problem for biological application or clinical application. On the other hand, (C) is considered to be superior to (A) and (B) because it is made only from natural amino acids.
  • Stimulus responsiveness is also an important factor in expanding the applicability of peptide gels.
  • Materials that exhibit gel-to-sol or sol-to-gel transition in response to external stimuli such as pH and temperature enable switching of cell scaffolding properties in vivo and controlled release of substances contained in the gel. , The added value of the material can be increased.
  • Many examples of imparting stimulus responsiveness using a non-natural skeleton have been reported so far (Non-Patent Documents 13 to 14).
  • Non-Patent Documents 13 to 14 There are very few examples showing stimuli-responsiveness in a peptide gel composed of only natural amino acids. For example, Shuguang Zhang et al.
  • Non-Patent Document 15 reported that, in RADA16 analogs, DAR16-IV consisting of an alanine residue, an aspartic acid residue, and an arginine residue changed from ⁇ sheet to ⁇ helix with increasing temperature. And shows structural transition.
  • RAD16-IV which has a sequence similar to that, does not show structural transition due to temperature change (Non-Patent Documents 10 to 12).
  • a highly general design method capable of imparting stimulus responsiveness to a peptide gelling agent consisting of only natural amino acids has not yet been found.
  • An object of the present invention is to develop and provide a self-assembling peptide that has biocompatibility and can control the temperature of the sol-gel transition that enables switching of cell scaffolding properties and release of substances contained in the gel. In addition, it is to provide a method for causing the self-assembling peptide to undergo a sol-gel transition at a desired temperature.
  • (Arg-Ala-Asp-Ala) 4 peptide (SEQ ID NO: 1) known as a gelled peptide composed of natural amino acids (JP 2011-46741A). I paid attention.
  • the “(Arg-Ala-Asp-Ala) 4 peptide” is a polypeptide in which 4 peptide units consisting of 4 amino acids Arg-Ala-Asp-Ala (SEQ ID NO: 2) are linked by a peptide bond. In this specification, amino acid residues are often represented by one letter.
  • Arg-Ala-Asp-Ala is often referred to as "RADA”. The same applies to other peptides.
  • the fusion peptide according to (3) wherein the functional peptide is any one functional peptide selected from laminin, VEGF, and N-cadherin.
  • a sol-gel transfer agent comprising the self-assembling peptide according to (1) or (2) or the fusion peptide according to (3) or (4).
  • the sol-gel transition composition according to (6) which contains two or more sol-gel transition agents.
  • the sol-gel transition composition according to (6) or (7) which comprises: (9) A cell scaffolding material composed of the sol-gel transfer agent according to (5) in a gel state and/or the sol-gel transfer composition according to any of (6) to (8). (10) The sol-gel transfer method according to (5) or the sol-gel transfer composition according to any one of (6) to (8), which is in a sol state or a gel state.
  • a temperature treatment step of treating the sol-gel transition composition at a temperature above the solization temperature or below the gelation temperature (11) The method according to (10), wherein the concentration of the sol-gel transition agent and/or the sol-gel transition composition is 0.4% by weight or more and 10% by weight or less. (12) The method according to (10) or (11), wherein the sol-gel transfer agent or the sol-gel transfer composition in a sol state or a gel state has a pH of 1 to 9. (13) The method according to any one of (10) to (12), wherein the solization temperature or gelation temperature is in the range of 20 to 80°C.
  • the present specification includes the disclosure content of Japanese Patent Application No. 2019-028845 which is the basis of priority of the present application.
  • a peptide having biocompatibility and capable of controlling the temperature of sol-gel transition can be provided.
  • the self-assembling peptide can undergo sol-gel transition at a desired temperature.
  • FIG. 3 is a view showing a circular dichroism spectrum change of A:(RADA) 4 peptide.
  • B Diagram showing circular dichroism spectrum change of (RADA) 3 -RADG peptide.
  • the first aspect of the invention is self-assembling peptides and fusion peptides.
  • the self-assembling peptide of this embodiment is a peptide in which one or more RADA units and one or more RXDA or RADX units are arranged in any order.
  • X represents glycine (G/Gly) or proline (P/Pro).
  • the self-assembling peptide of this embodiment can cause a sol-gel transition at a temperature lower than that of the known self-assembling peptide (RADA) 4 peptide.
  • the fusion peptide of this embodiment is a peptide obtained by linking the self-assembling peptide of this embodiment to a functional peptide.
  • Self-organization means that small molecules spontaneously aggregate in a dispersion medium due to intermolecular interactions and form a three-dimensional structure.
  • sugars polysaccharides such as starch and glucomannan
  • the above-mentioned collagen superabsorbent polymers (sodium polyacrylate), etc.
  • a gel state having a three-dimensional structure is formed by forming a one-dimensional structure and further intertwining them.
  • a substance that gels by self-assembly is often referred to herein as a "gelling agent".
  • the self-assembling peptide of the present invention is a kind of gelling agent.
  • the “sol” refers to a liquid state in which colloidal particles are dispersed in a dispersion medium and have fluidity.
  • a colloid composed of a gelling agent is fluidized in a dispersion medium by heating the gel is applicable.
  • Colloid refers to a state in which molecules and ions are aggregated into fine particles and dispersed in a medium. The fine particles that form a colloid are called “colloid particles”.
  • the “sol state” refers to a liquid state in which colloidal particles are dispersed in a dispersion medium and have fluidity. Generally, a state in which the gel is fluidized by raising the temperature corresponds to it.
  • Solification refers to a change from a gel state to a sol state.
  • gel refers to a substance in which colloidal particles self-assemble in a dispersion medium, lose fluidity and solidify to become a solid state.
  • the "gel state” refers to a state in which colloidal particles self-assemble in a dispersion medium, lose fluidity, and solidify. Generally, a state in which the sol is solidified by lowering the temperature is applicable. “Gelification” refers to a change from a sol state to a gel state.
  • sol-gel transition means a reversible phase transition phenomenon between sol and gel.
  • the sol-gel transition is generally temperature dependent under isobaric conditions.
  • the sol-gel transition in the present specification means one or both of a sol-to-gel transition (gelation) and a gel-to-sol transition (solation).
  • the “fusion peptide” refers to the self-assembling peptide of the present embodiment to which a functional peptide is linked by a covalent bond or a supramolecular interaction.
  • the covalent bond includes a peptide bond, a disulfide bond and the like.
  • the supramolecular interaction includes hydrogen bond, hydrophobic interaction, electrostatic interaction, coordination bond and the like.
  • the functional peptide is preferably linked to the N-terminal and/or C-terminal of the self-assembling peptide, and the bond is preferably covalent bond.
  • a more preferred covalent bond is a peptide bond.
  • the “gelling temperature” means the temperature at which the gelling agent (sol gel transition agent or sol gel transition composition in the present invention) undergoes a phase transition from a sol state to a gel state.
  • the “solization temperature” refers to a temperature at which the gelling agent (the sol-gel transition agent or the sol-gel transition composition of the present invention) undergoes a phase transition from a gel state to a sol state.
  • the gelation temperature and the solization temperature may be the same or different. Usually, the same temperature or different temperatures usually depends on the type of gelling agent.
  • the gelation temperature and the solization temperature are combined and often referred to as “sol-gel transition temperature”.
  • peptide refers to a peptide having a specific biological function in a living body or a cell.
  • the term "specific biological function” refers to a function capable of affecting cells, tissues or individuals, a function of labeling proteins, cells, tissues and individuals, or another function having a specific biological function. It refers to a linking function for linking a peptide, a nucleic acid, a low molecular compound, or a metal ion.
  • the “function capable of affecting cells, tissues or individuals” includes, for example, cell adhesion function, signal transduction function, binding function, and metabolic function.
  • the “specific function of labeling proteins, cells, tissues and individuals” includes, for example, fluorescent labeling and epitope labeling.
  • the particular biological function may be a natural function or a non-natural function.
  • linking function for linking another peptide, nucleic acid, low molecular weight compound, or metal ion having a specific biological function includes, for example, a function of mediating antigen-antibody binding or receptor-ligand interaction, RNA and/or Alternatively, it includes a function of binding DNA, a function of binding nickel ion, copper ion and the like.
  • biocompatibility refers to a property that can be introduced into a living body. In particular, it refers to the property that a certain material has no toxicity or side effect on the living body, or is extremely slight even if it has it, and/or the property that a foreign substance is not recognized and eliminated in the living body.
  • the phrase “the peptide has biocompatibility” means, for example, without limitation, that there is no risk of causing allergies or unknown infectious diseases to the human body due to the absence of biological contamination, or Refers to very few peptides. Specific examples include chemically synthesized peptides and the like.
  • living body refers to cells (including cultured cells), tissues, organs, or individuals. Although not limited, human-derived cells, tissues or organs composed of human-derived cells, or human individuals are preferable.
  • the constitution of the self-assembling peptide of this embodiment will be specifically described below.
  • the self-assembling peptide of this embodiment is composed of a polypeptide in which a plurality of peptide units are linked to each other by peptide bonds.
  • the “peptide unit” is a constitutional unit of the self-assembling peptide in the present invention.
  • One peptide unit consists of an oligopeptide in which at least three kinds of amino acids are peptide-bonded with four peptides.
  • the peptide unit constituting the self-assembling peptide of this embodiment contains three types of amino acids consisting of arginine (Arg/R), alanine (Ala/A), and aspartic acid (Asp/D) as essential constituent amino acids, and May also contain hydrophobic amino acids other than Ala.
  • Hydrophobic amino acids other than Ala include glycine (Gly/G), proline (Pro/P), valine (Val/V), leucine (Leu/L), isoleucine (Ile/I), methionine (Met/M).
  • Cysteine (Cis/C), phenylalanine (Phe/F), tyrosine (Tyr/Y) and tryptophan (Trp/W), but any hydrophobic amino acid may be used.
  • Preferred is glycine or proline.
  • Amino acids other than glycine can be used regardless of their optical isomers. That is, either the D form or the L form may be used.
  • the peptide unit constituting the self-assembling peptide of this embodiment is either RADA, RXDA, or RADX.
  • X represents a hydrophobic amino acid other than Ala.
  • the self-assembling peptide of this embodiment is composed of m RADAs and n RXDAs or RADXs linked by peptide bonds.
  • m is an integer of 3 or more and 6 or less
  • n is 1 or 2.
  • the combination of (m, n) is substantially (3, 1), (4, 1), (5, 1), (6, 1), (5, It is selected from either 2) or (6, 2).
  • the peptide units are linked in any order.
  • the C-terminal peptide unit is either RXDA or RADX, or the N-terminal peptide unit is RXDA.
  • the self-assembling peptide of this embodiment is specifically RXDA-(RADA) 3 (SEQ ID NO: 5), (RADA) 3 -RXDA (SEQ ID NO: 6), (RADA) 3 -RADX (SEQ ID NO: 7).
  • RXDA-(RADA) 4 (SEQ ID NO: 8), (RADA) 4 -RXDA (SEQ ID NO: 9), (RADA) 4 -RADX (SEQ ID NO: 10), RXDA-(RADA) 5 (SEQ ID NO: 11), (RADA) 5 -RXDA (SEQ ID NO: 12), (RADA) 5 -RADX (SEQ ID NO: 13), RXDA-(RADA) 6 (SEQ ID NO: 14), (RADA) 6 -RXDA (SEQ ID NO: 15), (RADA ) 6 -RADX (SEQ ID NO: 16), (RXDA) 2 -(RADA) 5 (SEQ ID NO: 17), RXDA-RADA-RXDA-(RADA) 4 (SEQ ID NO: 18), RXDA-(RADA) 2 -RXDA- (RADA) 3 (SEQ ID NO: 19), RXDA-(RADA) 3 -RXDA-(RADA) 2 (SEQ ID
  • the self-assembling peptide of this embodiment includes two or more Xs
  • the two or more Xs may be the same amino acid or different amino acids.
  • the self-assembling peptide of this embodiment can be chemically synthesized.
  • the solization temperature and/or gelation temperature of the self-assembling peptide can be controlled by adjusting the composition and/or arrangement of peptide units constituting the self-assembling peptide. .. Specifically, the larger the number m of RADA units, the higher the solization temperature and/or gelation temperature, and the larger the number n of RXDA and RADX, the lower the solization temperature and/or gelation temperature. Therefore, the self-assembling peptide of this embodiment can control its solization temperature and/or gelation temperature by adjusting the numerical values of m and n.
  • the solization temperature and gelation temperature of the self-assembling peptide of this embodiment are, for example, under the condition of 1 atm, 20 to 80° C., 20 to 70° C., 20 to 60° C., and 30. Within the range of -50°C or within the range of 30-40°C.
  • the self-assembling peptide of this embodiment has biocompatibility and can be introduced into a living body.
  • the fusion peptide of this embodiment is a peptide obtained by linking the self-assembling peptide of this embodiment with a functional peptide by covalent bond or supramolecular interaction.
  • the fusion peptide of this embodiment is, for example, without limitation, a peptide obtained by linking the self-assembling peptide of this embodiment to the N-terminus and/or C-terminus of a functional peptide with a peptide bond.
  • the self-assembling peptide of the present aspect is “ligated to the N-terminal and/or C-terminus of the functional peptide by a peptide bond” means that the self-assembling peptide of the present aspect is linked only to the N-terminal of the functional peptide. In this case, it includes both the case of being linked only to the C-terminus and the case of being linked to both the N-terminus and the C-terminus.
  • the functional peptide constituting the fusion peptide of this embodiment is a peptide having a specific biological function in a living body or a cell, as described above. Its function includes, but is not limited to, a cell adhesion function, a signal transduction function, a binding function, a labeling function, or a metabolic function.
  • the functional peptide constituting the fusion peptide of the present embodiment is a fusion peptide for the purpose of use, cell culture, cell adhesion, proliferation, control of differentiation, etc., culture or formation of tissue or organ, regeneration, or vascular induction. It can be selected according to the purpose.
  • the functional peptide in the present invention is not limited, and examples thereof include cell adhesion molecules, extracellular matrix molecules, secretory proteins, binding proteins, enzymes, marker proteins, artificial peptides, and peptide fragments thereof.
  • cell adhesion molecule as used herein is a molecule involved in adhesion between cells on the surface of cells or between cells and extracellular matrix. Examples include, but are not limited to, cadherins such as N-cadherin, integrins, selectins, and the like.
  • extracellular matrix molecule is a molecule that constitutes the extracellular matrix. Examples include, but are not limited to, laminin, collagen, fibronectin and the like.
  • a “secreted protein” is a protein produced inside a cell and secreted outside the cell. Examples include, but are not limited to, vascular endothelial growth factor (VEGF), fibroblast growth factor (FGF), platelet-derived growth factor (PDGF), cytokines, and the like.
  • a "binding protein” is a protein that specifically binds to a particular molecule. Without limitation, for example, an antibody or antigen that mediates antigen-antibody binding, (strept)avidin, maltose binding protein (MBP), a receptor or ligand that mediates receptor-ligand interaction, a DNA binding protein, an RNA binding protein, etc. Is mentioned.
  • the functional peptide when the functional peptide is a DNA-binding protein or an RNA-binding protein, the nucleic acid molecule to which the functional peptide binds can bind to one or more other nucleic acid molecules by forming a multiple helix structure or the like.
  • the “marker protein” is a protein that can serve as a label when detecting cells, proteins and the like. Usually, a polypeptide that can determine the presence or absence of the expression or presence of a target protein based on its activity is applicable.
  • Examples include, but are not limited to, fluorescent proteins such as GFP, luminescent proteins such as luciferin or aequorin, enzymes such as horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP), and the like.
  • the "artificial peptide” is also called a tag peptide, and is an artificially synthesized oligopeptide consisting of several to tens of amino acids. Examples include epitope tags such as FLAG tag, histidine tag, HA tag, DAP tag, and His tag.
  • the solization temperature and gelation temperature of the fusion peptide of this embodiment are affected by the functional peptide, but are basically based on the solization temperature and gelation temperature of the self-assembling peptide included. Therefore, under 1 atmospheric pressure, for example, within the range of 20 to 80°C, within the range of 20 to 70°C, within the range of 20 to 60°C, within the range of 30 to 50°C, or within the range of 30 to 40°C. It undergoes a sol-gel transition.
  • the fusion peptide of this embodiment has biocompatibility and can be introduced into a living body.
  • the self-assembling peptide contained in the fusion peptide of this embodiment has a small molecular weight. Therefore, it is possible to connect a relatively large functional peptide with a peptide bond and synthesize it as a single peptide chain.
  • the yield decreases as the molecular weight of the protein increases.
  • the fusion peptide of this embodiment has a high yield when expressed using a gene expression system.
  • the “gene expression system” means an expression system capable of expressing a foreign gene in a host cell or a cell-free gene expression system.
  • Specific examples include an expression vector capable of autonomous replication such as a plasmid or bacmid.
  • the expression vector can also be a shuttle vector that can replicate in multiple types of host cells.
  • the host is not particularly limited, and examples thereof include Escherichia coli, insect cells, and cultured cells.
  • the self-assembling peptide or the fusion peptide of this embodiment has a property of forming a sol at a lower temperature than the (RADA) 4 peptide.
  • the second aspect of the present invention is a sol-gel transfer agent.
  • the sol-gel transfer agent of this aspect comprises the self-assembling peptide or fusion peptide of the first aspect. According to the sol-gel transfer agent of the present embodiment, it is possible to cause a sol-gel transition from a sol state to a gel state or from a gel state to a sol state by temperature control by temperature change.
  • the “sol-gel transfer agent” is a gelling agent which is composed of the self-assembling peptide or the fusion peptide of the first aspect and is capable of sol-gel transition at a desired temperature based on the difference in the amino acid sequence thereof. .. Therefore, the basic constitution of the sol-gel transfer agent in the present aspect is substantially the same as the content described in “1-3. Configuration” in the self-assembling peptide of the first aspect or the fusion peptide of the first aspect. Therefore, a detailed description thereof will be omitted here.
  • the pH of the sol-gel transfer agent in this embodiment is not limited.
  • pH 1 to pH 11 pH 1 to pH 9, pH 3 to pH 9, pH 4 to pH 8, pH 5 to pH 7, or pH 6 to pH 7.
  • the pH is preferably 8.0 or less, pH 7.5 or less, pH 7 or less, and pH 6.5 or less.
  • a third aspect of the invention is a sol-gel transition composition.
  • the sol-gel transition composition of the present aspect comprises the sol-gel transition agent described in the second aspect as an essential active ingredient, and further contains a carrier and the like.
  • the sol-gel transition composition of the present embodiment can undergo sol-gel transition of a sol-gel transition agent at a desired temperature by temperature treatment.
  • the "temperature treatment” means a treatment for changing the temperature.
  • the sol-gel transition agent or sol-gel transition composition of the present invention in the sol state or gel state may be heated (heated) or cooled (cooled).
  • sol-gel transition by changing temperature refers to sol-gel transition of a sol-gel transition agent or sol-gel transition composition by temperature treatment under an arbitrary pressure condition.
  • it refers to a sol-gel transition by a temperature change within the range of 20 to 80° C. under the condition of 1 atmospheric pressure.
  • the sol-gel transition composition of the present invention comprises an active ingredient and other ingredients.
  • the components other than the active ingredient are not particularly limited, and examples thereof include carriers. Hereinafter, each component will be specifically described.
  • the sol-gel transition composition of this embodiment contains one kind or two or more kinds of the sol-gel transfer agent described in the second embodiment as an essential active ingredient. That is, it includes the self-assembling peptide and/or the fusion peptide of the first aspect.
  • the sol-gel transfer agent described in the second aspect as an active ingredient may be one kind or a combination of two or more different kinds.
  • the sol-gel transition composition of this embodiment has, as another active ingredient, a self-assembling peptide consisting of (RADA) p (p is an integer of 1 to 6) and/or a functional peptide covalently bound to the self-assembling peptide. Alternatively, it may further include a fusion peptide linked by supramolecular interaction.
  • These self-assembling peptides have a high sol-gel transition temperature as compared with the sol-gel transfer agent of the present invention, and remain in a gel state at, for example, 20 to 80°C.
  • the temperature of the sol-gel transition in the sol-gel transfer composition is up-regulated, that is, the temperature is set higher than that when the sol-gel transfer agent is used alone. You can This enables temperature control of the sol-gel transition in the sol-gel transition composition.
  • the sol-gel transition composition of this aspect may include a drug or the like as another active ingredient.
  • the “drug” is a concept including a low molecular compound, a peptide (including an enzyme and an antibody), or a nucleic acid (including an RNAi molecule such as miRNA, siRNA, shRNA, an antisense nucleic acid, an aptamer, etc.) .
  • Drugs include, but are not limited to, therapeutic drugs for the purpose of treating diseases and reducing symptoms, test drugs for detecting and diagnosing diseases, pesticides, pesticides for the purpose of repelling or exterminating pests, and virucidal agents. Or, it includes various kinds of agents such as disinfectants for the purpose of sterilization.
  • the agents contained in the sol-gel transition composition of the present embodiment may be not only one type but also two or more types.
  • the amount (content) of the sol-gel transfer agent described in the second aspect, which is blended in the sol-gel transfer composition is not particularly limited. It may be appropriately determined in consideration of the condition of the sol-gel transition temperature.
  • the type and/or effective amount of the sol-gel transition agent included in the sol-gel transition composition subject information, sol-gel transition composition It may be appropriately determined depending on the dosage form and the type of carrier or additive described later.
  • the concentration of the sol-gel transfer agent described in the second embodiment in the sol-gel transfer composition is not limited, but is, for example, 0.4% by weight or more and 10% by weight or less, 1.0% by weight or more and 10% by weight or less, 1.5% by weight.
  • the amount is 10% by weight or more and 10% by weight or less.
  • the "effective amount” is an amount necessary for the sol-gel transfer agent in the sol-gel transfer composition to exert its function as an active ingredient, and has no adverse side effect on the living body to which it is applied. It refers to the amount that is applied little or not at all. This effective amount can vary depending on various conditions such as the subject's information, the route of administration, and the frequency of administration.
  • the “subject” refers to a living body to which the pharmaceutical composition is applied.
  • humans for example, humans, livestock (cattle, horses, sheep, goats, pigs, chickens, ostriches, etc.), race horses, pet animals (dogs, cats, rabbits, etc.), laboratory animals (mouse, rat, guinea pig, monkeys, marmosets, etc.) Etc. are applicable. It is preferably human (in this case, particularly referred to as "subject").
  • the “subject information” is various individual information of the living body to which the sol-gel transition composition is applied, and for example, in the case of a subject, general health condition, disease/disease is affected.
  • the degree of progress and severity, age, weight, sex, diet, drug sensitivity, the presence or absence of concomitant drugs, resistance to treatment and the like are included.
  • the final effective amount of the sol-gel transfer agent, and the applied amount calculated based on it are finally determined by the judgment of a doctor, dentist, veterinarian, etc. according to the information of individual subjects. It
  • the sol-gel transition composition of this embodiment may contain a pharmaceutically acceptable carrier, if necessary.
  • a pharmaceutically acceptable carrier refers to an additive that is commonly used in the technical field of formulation. Examples thereof include solvents, excipients, fillers, emulsifiers, fluid addition regulators, lubricants, human serum albumin and the like.
  • the solvent may be, for example, water or any other pharmaceutically acceptable aqueous solution, or a pharmaceutically acceptable organic solvent.
  • aqueous solution include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents, phosphate buffer solution, and sodium acetate buffer solution.
  • auxiliary agent include D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, and other low-concentration nonionic surfactants, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, and the like.
  • Excipients include, for example, sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides, metal salts, citric acid, tartaric acid, glycine, polyethylene glycol, pluronic, kaolin, silicic acid, or combinations thereof.
  • sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides, metal salts, citric acid, tartaric acid, glycine, polyethylene glycol, pluronic, kaolin, silicic acid, or combinations thereof.
  • Examples of the filler include petrolatum, the sugar and/or calcium phosphate.
  • Examples of the emulsifier include sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, and propylene glycol fatty acid ester.
  • fluid addition modifiers and lubricants examples include silicates, talc, stearates or polyethylene glycols.
  • solubilizers in addition to the above, if necessary, solubilizers, suspensions, diluents, dispersants, surfactants, soothing agents, stabilizers, absorption promoters, bulking agents, moisturizers that are usually used in medicine.
  • Moisturizers wetting agents, adsorbents, flavoring agents, disintegration inhibitors, coating agents, coloring agents, preservatives, preservatives, antioxidants, fragrances, flavoring agents, sweetening agents, buffering agents, isotonic agents, etc. Can be included as appropriate.
  • Such a carrier is used mainly for facilitating the formation of the dosage form, maintaining the dosage form and the drug effect, and making the sol-gel transfer agent, which is the active ingredient, less susceptible to decomposition by enzymes in the body. Therefore, they may be used as needed.
  • the pH of the sol-gel transition composition of this embodiment is not limited. For example, it may be in the range of pH 1 to pH 11, pH 1 to pH 9, pH 3 to pH 9, pH 4 to pH 8, pH 5 to pH 7, and pH 6 to pH 7. It is preferably pH 8.0 or less, pH 7.5 or less, pH 7 or less, and pH 6.5 or less.
  • the sol-gel transition composition of this embodiment can also undergo a sol-gel transition by temperature treatment under a predetermined pressure condition.
  • the sol-gel transition temperature is also basically based on that of the self-assembling peptide or the fusion peptide constituting the sol-gel transition agent which is the active ingredient. Therefore, the sol-gel transition composition according to the present embodiment is, for example, under a pressure of 1 atm, at a temperature within the range of 20 to 80°C, 20 to 70°C, 20 to 60°C, 30 to 50°C, or 30 to 40°C. It can undergo a sol-gel transition.
  • the sol-gel transition composition of the present embodiment undergoes a sol-gel transition at a temperature higher than the body temperature of the subject, for example, under 1 atmospheric pressure condition.
  • the sol-gel transition composition of the present embodiment can be adjusted based on the sol-gel transition temperature of the sol-gel transition agent including the sol-gel transition temperature.
  • the sol-gel transition composition of the present embodiment is desired to undergo sol-gel transition at a temperature higher than the normal body temperature of a subject (for example, 37° C.) under 1 atm pressure. If so, a sol-gel transition agent having a sol-gel transition temperature higher than normal body temperature may be selected.
  • sol-gel transfer agent having a sol-gel transition temperature obviously higher than normal body temperature for example, 40°C or higher, 45°C or higher, 47°C or higher, or 50°C or higher
  • a sol-gel transition agent having a sol-gel transition temperature eg, 35° C. or lower, 32° C. or lower, 30° C. or lower, or 28° C. or lower
  • a sol-gel transition temperature eg, 35° C. or lower, 32° C. or lower, 30° C. or lower, or 28° C. or lower
  • sol-gel transition composition of the present aspect administration to a subject in a sol state to cause gelation in vivo, or conversely, administration in a gel state in vivo, and then sol at a desired time Can be converted.
  • the sol-gel transition composition of this aspect contains a fusion peptide
  • it is based on the biological function of the functional peptide constituting the fusion peptide after the sol-gel transition composition of this aspect gels in the body of the subject.
  • the function is demonstrated.
  • the sol-gel transition composition gelled in the body can induce angiogenesis in the gel.
  • the sol-gel transition composition can be sol again by temperature treatment and removed from the administration site.
  • the sol-gel transition composition of this embodiment can be used as a cell scaffolding material in vivo. Also in this case, after the sol-gel transition composition of this embodiment gels in the body of the subject, the function based on the biological function of the functional peptide constituting the fusion peptide is exerted.
  • the functional peptide for example, extracellular matrix molecules such as laminin and N-cadherin can be used.
  • the sol-gel transition composition gelated in the body enables control of cell adhesion, proliferation, differentiation, etc. in the gel and formation or regeneration of tissues or organs.
  • the sol-gel transition composition in a gel state at the administration site has sufficiently achieved control of cell adhesion, proliferation, differentiation, etc., and formation or regeneration of tissues or organs
  • the sol-gel transition composition is treated again with temperature. It can be solized and removed from the site of administration.
  • the sol-gel transition composition of this embodiment contains a fusion peptide or contains a drug
  • the effect may not be exerted in a gel state, but may be controlled so as to be exerted after sol formation.
  • the sol-gel transition composition of this embodiment is administered in a sol state to a site in the body different from the site of action of the functional peptide to cause gelation at the administration site, and then maintained in the gel state until a necessary time. Thereafter, the administration site is subjected to temperature treatment at a required time to form a sol, the fusion peptide contained therein is released, and the fusion peptide can be delivered to the site of action of the functional peptide contained in the fusion peptide.
  • the sol-gel transition composition of this aspect can be introduced into a subject in a gel state.
  • the step of administering in a sol state and causing gelation in the body of the subject may be omitted, and instead, the gel state may be transplanted into the living body by a surgical method or the like.
  • the sol-gel transition composition of this aspect introduced into a subject can be removed from the introduction site without being sol again by temperature treatment.
  • it can be surgically removed from the site of introduction while remaining in a gel state from the body of the subject.
  • the dosage form of the sol-gel transition composition of this embodiment is not particularly limited. Any form can be used as long as it can be delivered to a target site without deactivating the properties of the active ingredient in the subject.
  • a liquid agent that can be directly administered to the target site is mentioned.
  • An injection is mentioned as an example of a liquid agent.
  • the injection can be formulated by appropriately combining with the above-mentioned excipient, stabilizer, pH adjusting agent and the like. Since an injection is generally a liquid, the sol-gel transition composition as an injection is in a sol state.
  • the dosage form of the sol-gel transition composition of this embodiment may be a solid agent that can be introduced into a target site.
  • the sol-gel transition composition as the solid agent is usually in a gel state.
  • the application method of the sol-gel transition composition of the present embodiment is not particularly limited, but parenteral administration is preferable, and topical administration is more preferable.
  • Local administration includes, for example, intramuscular administration, subcutaneous administration, tissue administration, and organ administration.
  • the sol-gel transition composition of the present aspect in a sol state can be directly administered to the target site by injection or the like, and gelated at the target site after administration.
  • the sol-gel transition composition of this aspect may be introduced into the target site in a gel state.
  • the target site can be surgically incised and transplanted in a gel state.
  • the dose may be an amount effective for the active ingredient to respond effectively. The effective amount is appropriately selected according to the subject information.
  • the sol-gel transition composition of the present embodiment can be removed from the administration site by gelation at the administration site and, if necessary, sol again by temperature treatment.
  • the sol-gel transition composition of this aspect may be removed from the target site in a gel state.
  • the administration site can be surgically incised and surgically removed in a gel state.
  • the timing of sol-forming the sol-gel transition composition of this embodiment and removing it from the administration site can be appropriately determined as necessary.
  • a fourth aspect of the present invention is a cell scaffold.
  • the cell scaffolding material of this embodiment is composed of the sol-gel transfer agent described in the second embodiment or the sol-gel transfer composition described in the third embodiment.
  • the cell scaffold of this embodiment can be used either in vitro or in vivo.
  • the shape of the cell scaffold of this embodiment can be processed by temperature treatment.
  • the "cell scaffolding material” is a scaffolding material for cell culture or tissue regeneration, cell adhesion, proliferation, control of differentiation, etc., transplanted cells, culture, formation, regeneration of transplanted tissues or organs.
  • a material that enables the The cell scaffold may be used in vitro or in vivo.
  • control of cell adhesion, proliferation, differentiation, etc. refers to promotion and/or inhibition of cell adhesion, proliferation, differentiation.
  • the cell scaffolding material of this embodiment is composed of the sol-gel transfer agent described in the second embodiment or the sol-gel transfer composition described in the third embodiment. Therefore, the basic configuration in this aspect is substantially the same as the configuration of the sol-gel transition agent of the second aspect or the sol-gel transition composition of the third aspect.
  • the cell scaffold of this embodiment is, in principle, a gel-state sol-gel transfer agent. This is because to function as a scaffold for cells, it is necessary for the cells to have a certain rigidity for sticking, and a liquid sol cannot usually achieve the purpose.
  • the functional peptide constituting the fusion peptide controls, for example, molecules that control cell adhesion, proliferation, differentiation, etc., or control the formation or regeneration of tissues or organs. It is a molecule.
  • cell adhesion molecules extracellular matrix molecules, secretory proteins, binding proteins, enzymes, marker proteins and artificial peptides, and peptide fragments thereof.
  • the functional peptide constituting the fusion peptide that can be contained in the cell scaffold of the present embodiment is preferably a cell adhesion molecule or an extracellular matrix molecule, for example, laminin or N-cadherin.
  • the cell scaffolding material of this aspect enables control of cell adhesion, proliferation, differentiation, etc. in vitro or in vivo, or enables formation or regeneration of tissues or organs.
  • the usage of the cell scaffold of this embodiment in vivo is described in "3-2. Constitution” of "3. Sol-gel transition composition", and a detailed description thereof is omitted here.
  • the shape of the cell scaffolding material can be processed according to the target shape of the target cell, tissue or organ.
  • the cell scaffolding material of the present invention can be molded by pouring it into a mold in a sol state and causing it to gel.
  • the cell scaffolding material of the present invention can be partially heat-treated into a sol to form it into a desired shape.
  • the "temperature treatment step” is a step of elevating the temperature from a temperature lower than the solization temperature of the sol-gel transition agent or the sol-gel transition composition of the present invention to a temperature above the temperature, or a temperature higher than the gelation temperature to the temperature. The step of lowering the temperature to the following. Through this step, the sol-gel transition agent or sol-gel transition composition of the present invention can undergo a phase transition from a sol state to a gel state or from a gel state to a sol state.
  • the treatment temperature in this step varies depending on the type of sol-gel transition agent or sol-gel transition composition used, so it may be appropriately determined according to the type. For example, in the range of 10 to 90°C, in the temperature range of 20 to 80°C, in the range of 20 to 70°C, in the range of 20 to 60°C, in the range of 30 to 50°C, in the range of 30 to 40°C In the temperature raising step or the temperature lowering step.
  • the heating method or cooling method used in the temperature treatment step in the sol-gel transition method of the present invention is not particularly limited. Any known method may be used. For example, as a heating method, a method of directly or indirectly contacting a sol-gel transfer agent or a sol-gel transfer composition with a heat source (open flame, boiling water, heater irradiation, etc.), or a method of irradiating a microwave or an ultrasonic wave is used. Can be mentioned. Further, as the cooling method, a method of arranging the sol-gel transfer agent or the sol-gel transfer composition in a freezer or a refrigerator can be mentioned. This step can be performed either in vitro or in vivo.
  • Example 1 Identification of self-assembling peptide that undergoes sol-gel transition in the temperature range of 20 to 80°C> (Purpose) We develop self-assembling peptides that undergo sol-gel transition in the temperature range of 20-80°C.
  • Fmoc-NH-SA resin (Watanabe Chemical Co., Ltd.) in a solid-phase synthesis tube (Hypep Laboratory Co., Ltd., solid-phase synthesis tube polypropylene LibraTube body tube 5 mL, solid-phase synthesis cap polypropylene LibraTube upper cap) ) (250 mg, 0.10 mmol) was immersed in N,N′-dimethylformamide (DMF) (Kishida Chemical Co., Ltd.) overnight to be expanded. Piperidine (Kishida Chemical Co., Ltd.) (20% in DMF, 2 mL) was added, and the mixture was vortexed for 1 minute, and then the reaction solution was removed.
  • DMF N,N′-dimethylformamide
  • Condensing agent cocktail (700 ⁇ L), N,N-diisopropylethylamine (DIEA) (Nacalai Tesque, Inc.) and N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) (Kishida Chemical Co., Ltd.) were added to the N-terminal amino acid (0.30 mmol).
  • DIEA N,N-diisopropylethylamine
  • NMP N-methyl-2-pyrrolidone
  • the condensing agent cocktail used was prepared by previously mixing 3.05 g of HBTU (Watanabe Chemical Co., Ltd.), 1.25 g of HOBt.H 2 O (Watanabe Chemical Co., Ltd.), and 16 mL of DMF. Shake for 15 minutes at room temperature, then remove the reaction solution. The solvent was removed by washing 5 times with DMF (2 mL). A small amount of the resin was taken out, and it was confirmed that the resin did not develop color using TNBS Test Kit (Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.). The solvent was removed by washing with methylene chloride (2 mL) and DMF (2 mL) three times each.
  • the deprotection cocktail was added to the resin dried in a desiccator, and the mixture was gently shaken every 30 minutes at room temperature and left to stand for 90 minutes.
  • the deprotection cocktail used was prepared by mixing 2375 ⁇ L of trifluoroacetic acid (TFA) (Kishida Chemical Co., Ltd.), 62.5 ⁇ L of triisopropylsilane (TIS) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), and 62.5 ⁇ L of water in advance.
  • TFA 500 ⁇ L was added to the synthetic tube, and the filtrate was collected in the centrifuge tube.
  • FIG. 2 shows the h/h 0 value of each peptide sample at 20°C.
  • FIG. 3 shows h/h 0 of each peptide sample at 80°C.
  • the (RADA) 4 peptide and the (RADA) 4 -G peptide were determined to be in a gel state, and the others were determined to be in a sol state.
  • RGDA-(RADA) 3 peptide, (RADA) 3 -RGDA peptide, and (RADA) 3 -RADG peptide showed gel-to-sol phase transition between 20°C and 80°C. showed that.
  • the (RADA) 4 peptide and the (RADA) 4 -G peptide remained gel at both 20°C and 80°C.
  • RADG-(RADA) 3 peptide, (RADA) 2 -RGDA-RADA peptide, and (RADA) 2 -RADG-RADA peptide were sols at both 20°C and 80°C.
  • Example 2 Measurement of circular dichroism spectrum of self-assembling peptide in the temperature range of 20 to 80°C> (Purpose) The conformational change of the self-assembling peptide is verified by measuring the circular dichroism spectrum.
  • “Circular dichroism spectral change” is a spectral change of circular dichroism accompanying a change in the three-dimensional structure of a protein.
  • “Circular dichroism” refers to a phenomenon in which when proteins absorb circularly polarized light, a difference in absorbance occurs between left circularly polarized light and right circularly polarized light. Circular dichroism spectral changes occur when the three-dimensional structure of a protein changes.
  • a circular dichroism spectrum change is observed when the self-assembling peptide of the present invention undergoes a sol-gel transition, and a circular dichroism spectrum considered to be derived from the collapse of the ⁇ sheet structure at the time of transition from gel to sol. Changes are observed.
  • the purpose of this example is to evaluate the change in the ratio of ⁇ -sheet structure formation required for gel formation of self-assembling peptides by measuring the change in circular dichroism spectrum.
  • the measurement range was 190-400 nm, the data acquisition interval was 0.2 nm, the scanning speed was 200 nm/min, and the sample concentration was 0.50 wt %.
  • the temperature control during the circular dichroism spectrum measurement was performed using the JASCO temperature control unit and the water-cooled Peltier cell holder PTC-514.
  • the (RADA) 4 peptide showed no spectral change even when the temperature was raised from 20°C to 80°C (Fig. 4A). That is, it was shown that the strength of the negative Cotton effect around 220 nm derived from the ⁇ -sheet structure was not decreased by the temperature rise, and the ⁇ -sheet structure did not collapse. This was consistent with the fact that the (RADA) 4 peptide did not become a sol even when heated. On the other hand, in the (RADA) 3 -RADG peptide, the intensity of the negative Cotton effect at around 220 nm derived from the ⁇ -sheet structure was decreased by increasing the temperature, and the ⁇ -sheet structure was disrupted (FIG. 4B).

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Abstract

生体適合性を有し、ゾルゲル転移の温度制御が可能な自己組織化ペプチドを開発し、提供すると共に、当該自己組織化ペプチドを所望の温度によってゾルゲル転移させる方法を提供することである。　m個のRADA、及びn個のRXDA又はRADXを任意の順序で並べてなるいずれか１の自己組織化ペプチドであって、XがGly又はProであり、3≦m≦6であり、1≦n≦2かつ2n＜mであり、前記自己組織化ペプチドのC末端がRXDA若しくはRXDAであるか、又は前記自己組織化ペプチドのN末端がRXDAである、自己組織化ペプチドを提供する。

Description

自己組織化ペプチド
　本発明は自己組織化ペプチド、ゾルゲル転移剤、ゾルゲル転移剤を有効成分として含むゾルゲル転移組成物、及びそれらのゾルゲル転移方法に関する。
　分子間相互作用を形成するペプチドの中には、水中で超分子ファイバーを形成し、ヒドロゲルを与えるものがある（非特許文献１～２）。このヒドロゲルは、ペプチド一般が有する生体適合性や生分解性等の利点により、バイオマテリアルとしての応用が進められている。当該ヒドロゲルの応用例として、細胞足場材料（非特許文献３）や製剤等の輸送材料（非特許文献４）が挙げられる。ヒドロゲルにはコラーゲンやマトリゲル等の動物由来のゲル化剤が代表的に用いられる。しかし、動物由来であるゲル化剤では、分子量分布や成分割合に製造ロットごとの品質差が見られる。また、様々な生物由来のコンタミネーションが細胞等の生物試料に著しい影響を及ぼし得る。そのため、アレルギーや未知の感染症を生じるリスクが避けられず、臨床応用の面で問題があった（非特許文献５～９）。
　そうした問題点を克服する材料として、近年、合成化学的に作られる低分子ペプチドゲル化剤が注目を集めている。合成低分子ペプチドゲル化剤は、1993年にShuguang Zhangらによって見出されたEAK16、RADA16に端を発し、今日まで研究開発が行われている（非特許文献１０～１２）。これらは、溶液合成や固相合成法によって、特定のアミノ酸配列からなるペプチドを高純度に合成するため、製造ロットごとの品質は安定しており、コンタミネーションも極めて少ないという利点がある。
　低分子ペプチドゲル化剤の代表的なものとして、（Ａ）1個又は2個のアミノ酸と芳香族性部位（シンナモイル基やFmoc基等）を連結した両親媒性ペプチド、（Ｂ）βシート形成ペプチドの片末端に長鎖アルキル鎖（パルミトイル基等）を連結した両親媒性ペプチド、（Ｃ）親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸を交互連結した両親媒性ペプチド、等が知られている（非特許文献１～２）。前記（Ａ）や（Ｂ）は、非天然骨格を含む点が生物応用上の、又は臨床応用上の問題となり得る。一方、前記（Ｃ）は、天然アミノ酸のみから作製されるため、（Ａ）や（Ｂ）よりも優位性を有すると考えられている。
　ペプチドゲルの応用可能性を広げる上では、刺激応答性も重要な要素である。pHや温度等の外部刺激に応答して、ゲルからゾル、又はゾルからゲルの転移を示す材料は、生体内における細胞足場特性のスイッチングや、ゲル内に含有する物質の放出制御等を可能にし、材料としての付加価値を高めることができる。これまでにも非天然骨格を用いた刺激応答性の付与に関する例は数多く報告されている（非特許文献１３～１４）。一方、天然アミノ酸のみから構成されるペプチドゲルにおける刺激応答性を示す例は非常に少ない。例えば、Shuguang Zhangら（非特許文献１５）は、RADA16類縁体の中で、アラニン残基、アスパラギン酸残基、及びアルギニン残基からなるDAR16-IVが温度上昇に伴いβシートからαへリックスへと構造転移を示すことを報告している。一方、それに類似した配列であるRAD16-IVは温度変化による構造転移を示さないことが知られている（非特許文献１０～１２）。しかしながら、天然アミノ酸のみから成るペプチドゲル化剤において、刺激応答性を付与することのできる一般性の高い設計方法は、未だ見出されていない。
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　本発明の目的は、生体適合性を有し、細胞足場特性のスイッチや、ゲル内に含有する物質の放出等を可能にするゾルゲル転移の温度制御が可能な自己組織化ペプチドを開発し、提供すると共に、当該自己組織化ペプチドを所望の温度によってゾルゲル転移させる方法を提供することである。
　上記課題を解決するために、本発明者らは、天然アミノ酸で構成されるゲル化ペプチドとして知られる(Arg-Ala-Asp-Ala)4ペプチド（配列番号１）（特開2011-46741）に着目した。「(Arg-Ala-Asp-Ala)4ペプチド」とは、4つのアミノ酸Arg-Ala-Asp-Ala（配列番号２）からなるペプチドユニットがペプチド結合で4ユニット連結したポリペプチドである。なお、本明細書では、しばしばアミノ酸残基を一文字で表記する。例えば、Arg（アルギニン）残基であればRで、Ala（アラニン）残基であればAで、Asp（アスパラギン酸）残基であればDで、Gly（グリシン）残基であればGで、そしてPro（プロリン）残基であればPで、それぞれ表す。したがって、「Arg-Ala-Asp-Ala」は、しばしば「RADA」と表記する。他のペプチドについても同様とする。
　本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、(RADA)4ペプチドのC末端側ユニットにおける2つのアラニン残基のうちいずれかをグリシン残基で置換した両親媒性変異ゲル化ペプチド、及び(RADA)4ペプチドのN末端側ユニットにおける2つのアラニン残基のうちN末端側のアラニン残基をグリシン残基で置換した両親媒性変異ゲル化ペプチドが、(RADA)4ペプチドよりも低い温度でゾル化する性質を有することを見出した。本発明は上記新たな知見に基づくもので、以下を提供する。
（１）m個のRADA、及びn個のRXDA（配列番号３）又はRADX（配列番号４）を任意の順序で並べてなるいずれか１の自己組織化ペプチドであって、XがG又はPであり、3≦m≦6であり、1≦n≦2かつ2n＜mであり、前記自己組織化ペプチドのC末端がRXDA若しくはRADX、又はN末端がRXDAである、前記自己組織化ペプチド。
（２）XがGである、（１）に記載の自己組織化ペプチド。
（３）（１）又は（２）に記載の自己組織化ペプチドに機能性ペプチドを共有結合又は超分子相互作用で連結してなる融合ペプチド。
（４）機能性ペプチドが、ラミニン、VEGF、N-カドヘリンから選択されるいずれか１の機能性ペプチドである、（３）に記載の融合ペプチド。
（５）（１）若しくは（２）に記載の自己組織化ペプチド、又は（３）若しくは（４）に記載の融合ペプチドからなるゾルゲル転移剤。
（６）（５）に記載のゾルゲル転移剤を有効成分として含む、ゾルゲル転移組成物。
（７）ゾルゲル転移剤を２種以上含む、（６）に記載のゾルゲル転移組成物。
（８）(RADA)P（pは1～6の整数）からなる自己組織化ペプチド、並びに／又は前記ペプチドに前記機能性ペプチドを共有結合又は超分子相互作用で連結してなる融合ペプチドをさらに含む、（６）又は（７）に記載のゾルゲル転移組成物。
（９）ゲル状態の（５）に記載のゾルゲル転移剤、及び／又は（６）～（８）のいずれかに記載のゾルゲル転移組成物で構成される細胞足場材。
（１０）ゾル状態又はゲル状態にある、（５）に記載のゾルゲル転移剤又は（６）～（８）のいずれかに記載のゾルゲル転移組成物のゾルゲル転移方法であって、前記ゾルゲル転移剤、又は前記ゾルゲル転移組成物を、そのゾル化温度以上の温度、又はゲル化温度以下の温度で処理する温度処理工程を含む、前記方法。
（１１）前記ゾルゲル転移剤及び／又は前記ゾルゲル転移組成物の濃度が0.4重量％以上10重量％以下である、（１０）に記載の方法。
（１２）ゾル状態又はゲル状態にある前記ゾルゲル転移剤又は前記ゾルゲル転移組成物がpH 1～9である、（１０）又は（１１）に記載の方法。
（１３）前記ゾル化温度又はゲル化温度が20～80℃の範囲内にある、（１０）～（１２）のいずれかに記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-028845号の開示内容を包含する。
　本発明の自己組織化ペプチドによれば、生体適合性を有し、ゾルゲル転移の温度制御が可能なペプチドを提供することができる。
　本発明のゾルゲル転移方法によれば、所望の温度によって自己組織化ペプチドをゾルゲル転移させることができる。
自己組織化ペプチドのゾル化定量方法を示す図である。垂直に立てた2 mLガラススクリューバイアルの底部で各種ペプチドゲルを作製した時の容器底面からゲル状サンプルの上端までの距離を基準距離h0とした。続いて、所定の温度下にて、前記バイアルを90度、すなわち水平方向に傾けた時に容器底面からゾル化によって移動したサンプル右端までの距離を移動距離hとした。各ペプチドサンプルのゾル・ゲル状態の判定については、h/h0値が1.3以上であればゾル状態、h/h0値が1.3未満であればゲル状態とした。 各ペプチドサンプルの20℃におけるh/h0値を示す図である。破線は、ゾルゲル状態を判定するカットオフ値（h/h0=1.3）を示す。 各ペプチドサンプルの80℃におけるh/h0値を示す図である。破線は、ゾルゲル状態を判定するカットオフ値（h/h0=1.3）を示す。 Ａ：(RADA)4ペプチドの円偏光二色性スペクトル変化を示す図である。Ｂ：(RADA)3-RADGペプチドの円偏光二色性スペクトル変化を示す図である。
１．自己組織化ペプチド及び融合ペプチド
１－１．概要
　本発明の第１の態様は、自己組織化ペプチド及び融合ペプチドである。
　本態様の自己組織化ペプチドは、１以上のRADAユニット、及び１以上のRXDA又はRADXユニットを任意の順序で並べてなるペプチドである。ここでXはグリシン（G/Gly）又はプロリン（P/Pro）を示す。本態様の自己組織化ペプチドは、既知の自己組織化ペプチドである(RADA)4ペプチドよりも低い温度でゾルゲル転移をさせることができる。
　また、本態様の融合ペプチドは、本態様の自己組織化ペプチドを機能性ペプチドに連結してなるペプチドである。
１－２．用語の定義
　本明細書で頻用する以下の用語について定義する。
　本明細書において「自己組織化ペプチド」とは、水又は水溶液に溶解したゾル状態から、固有の温度及び圧力条件下で固化し、ゲル状態になりうるペプチドをいう。例えば、コラーゲン（膠、ゼラチン、ゼリーを含む）等が該当する。
　「自己組織化」とは、小分子が分散媒中で分子間相互作用等により自発的に集合し、３次元立体構造を形成することをいう。例えば、糖（デンプン、グルコマンナン等の多糖類）、前述のコラーゲン、高吸収性高分子（ポリアクリル酸ナトリウム）等は、固有の条件下で水又は水溶液中において、自己組織化によってファイバー状の１次元構造を形成し、さらにそれらが絡み合うことで３次元立体構造を有したゲル状態になる。自己組織化によりゲル化する物質を、本明細書では、しばしば「ゲル化剤」と表記する。本発明の自己組織化ペプチドは、ゲル化剤の一種である。
　「ゾル」とは、コロイド粒子が分散媒中に分散して、流動性を有する液体状態となったものをいう。例えば、ゲルを昇温することによってゲル化剤からなるコロイドが分散媒中で流動化したものが該当する。「コロイド」とは、分子やイオンが凝集して微粒子となり、媒質中に分散している状態をいう。コロイドを形成する微粒子を「コロイド粒子」と呼ぶ。
　「ゾル状態」とは、コロイド粒子が分散媒中に分散し、流動性を有した液体状態をいう。一般的には、ゲルを昇温させることによって流動化した状態が該当する。
　「ゾル化」とは、ゲル状態からゾル状態への変化をいう。
　「ゲル」とは、コロイド粒子が分散媒中で自己組織化し、流動性を失って固化し、固体状となったものをいう。
　「ゲル状態」とは、コロイド粒子が分散媒中で自己組織化し、流動性を失って固化した状態をいう。一般的には、ゾルを降温させることによって固化した状態が該当する。
　「ゲル化」とは、ゾル状態からゲル状態への変化をいう。
　「ゾルゲル転移」とは、ゾル及びゲルの間の可逆的な相転移現象をいう。一般的にゾルゲル転移は、等圧条件下で温度に依存する。本明細書におけるゾルゲル転移は、特に断りのない限り、ゾルからゲルへの転移（ゲル化）、及びゲルからゾルへの転移（ゾル化）のいずれか一方、又は両方を意味するものとする。
　本明細書において「融合ペプチド」とは、本態様の自己組織化ペプチドに機能性ペプチドを共有結合又は超分子相互作用によって連結したものをいう。共有結合には、ペプチド結合、ジスルフィド結合等が含まれる。また超分子相互作用には、水素結合、疎水性相互作用、静電相互作用、配位結合等が含まれる。限定はしないが、機能性ペプチドは、自己組織化ペプチドのN末端及び／又はC末端に連結することが好ましく、さらに結合は、共有結合であることが好ましい。より好ましい共有結合は、ペプチド結合である。
　本明細書において「ゲル化温度」とは、ゲル化剤（本発明ではゾルゲル転移剤又はゾルゲル転移組成物）が、ゾル状態からゲル状態に相転移する温度をいう。また、本明細書において「ゾル化温度」とは、ゲル化剤（本発明のゾルゲル転移剤又はゾルゲル転移組成物）が、ゲル状態からゾル状態に相転移する温度をいう。一のゲル化剤において、ゲル化温度とゾル化温度は、同一であってもよく、異なっていてもよい。通常は、同一温度であるか、異なる温度であるかは、通常、ゲル化剤の種類に基づく。なお、本明細書では、ゲル化温度とゾル化温度を合わせて、しばしば「ゾルゲル転移温度」と表記する。
　本明細書において「機能性ペプチド」とは、生体内又は細胞内において、特定の生物学的機能を有するペプチドをいう。
　本明細書において「特定の生物学的機能」とは、細胞、組織又は個体に影響を与え得る機能、タンパク質、細胞、組織及び個体を標識する機能、又は特定の生物学的機能を有する他のペプチド、核酸、低分子化合物、又は金属イオンを連結させる連結機能をいう。「細胞、組織又は個体に影響を与え得る機能」には、例えば、細胞接着機能、シグナル伝達機能、結合機能、及び代謝機能が含まれる。「タンパク質、細胞、組織及び個体を標識する特定の機能」には、例えば、蛍光標識やエピトープ標識等が含まれる。特定の生物学的機能は、天然の機能、及び非天然の機能のいずれであってもよい。「特定の生物学的機能を有する他のペプチド、核酸、低分子化合物、又は金属イオンを連結させる連結機能」には、例えば、抗原抗体結合又は受容体リガンド相互作用を媒介する機能、RNA及び／又はDNAを結合する機能、ニッケルイオン、銅イオン等を結合する機能等が含まれる。
　本明細書において「生体適合性」とは、生体への導入が可能である性質をいう。特に、ある材料が生体に対する毒性や副作用を有しないか、有していても極めて軽微である性質、及び／又は生体内において異物認識されず、排除されることがない性質をいう。本明細書において、「ペプチドが生体適合性を有する」とは、例えば、限定はしないが、生物由来のコンタミネーションがないため人体に対してアレルギーや未知の感染症を生じるリスクがないか、非常に少ないペプチドをいう。具体的には、化学的に合成されたペプチド等が挙げられる。
　本明細書において「生体」とは、細胞（培養細胞を含む）、組織、器官、又は個体をいう。限定はしないが、好ましくは、ヒト由来の細胞、ヒト由来の細胞からなる組織若しくは器官、又はヒト個体である。
１－３．構成
１－３－１．自己組織化ペプチド
　本態様の自己組織化ペプチドにおける構成について、以下で具体的に説明をする。
　本態様の自己組織化ペプチドは、複数のペプチドユニットが互いにペプチド結合で連結したポリペプチドによって構成されている。
　本明細書で「ペプチドユニット」とは、本発明における自己組織化ペプチドの構成単位である。一つのペプチドユニットは、少なくとも3種類のアミノ酸が4個ペプチド結合したオリゴペプチドからなる。
　本態様の自己組織化ペプチドを構成するペプチドユニットは、アルギニン（Arg/R）、アラニン（Ala/A)、及びアスパラギン酸（Asp/D）からなる3種類のアミノ酸を必須構成アミノ酸として含み、他にもAla以外の疎水性アミノ酸を含み得る。Ala以外の疎水性アミノ酸には、グリシン（Gly/G）、プロリン（Pro/P)、バリン（Val/V）、ロイシン（Leu/L）、イソロイシン（Ile/I）、メチオニン（Met/M）、システイン（Cis/C）、フェニルアラニン（Phe/F）、チロシン（Tyr/Y）及びトリプトファン（Trp/W）が挙げられるが、いずれの疎水性アミノ酸であってもよい。好ましくはグリシン又はプロリンである。上記のグリシン以外のアミノ酸は、光学異性体を問わず使用することができる。すなわち、D体又はL体のいずれを使用してもよい。
　本態様の自己組織化ペプチドを構成するペプチドユニットは、具体的にはRADA、RXDA、又はRADXのいずれかである。ここでXはAla以外の疎水性アミノ酸を表す。
　本態様の自己組織化ペプチドは、具体的には、m個のRADA、及びn個のRXDA又はRADXがペプチド結合によって連結し、構成されている。ここで、mは3以上6以下の整数であり、またnは1又は2である。また、mとnとの間には2n＜mの関係を有する。したがって、本態様の自己組織化ペプチドにおいて、(m, n)の組み合わせは、実質的に(3, 1)、(4, 1)、(5, 1)、(6, 1)、(5, 2)、又は(6, 2)のいずれかから選択される。
　本態様の自己組織化ペプチドにおいて、各ペプチドユニットは任意の順序で連結される。ただし、本発明の自己組織化ペプチドは、C末端のペプチドユニットがRXDA若しくはRADXのいずれかであるか、又はN末端のペプチドユニットがRXDAである。
　したがって、本態様の自己組織化ペプチドは、具体的には、RXDA-(RADA)3（配列番号５）、(RADA)3-RXDA（配列番号６）、(RADA)3-RADX（配列番号７）、RXDA-(RADA)4（配列番号８）、(RADA)4-RXDA（配列番号９）、(RADA)4-RADX（配列番号１０）、RXDA-(RADA)5（配列番号１１）、(RADA)5-RXDA（配列番号１２）、(RADA)5-RADX（配列番号１３）、RXDA-(RADA)6（配列番号１４）、(RADA)6-RXDA（配列番号１５）、(RADA)6-RADX（配列番号１６）、(RXDA)2-(RADA)5（配列番号１７）、RXDA-RADA-RXDA-(RADA)4（配列番号１８）、RXDA-(RADA)2-RXDA-(RADA)3（配列番号１９）、RXDA-(RADA)3-RXDA-(RADA)2（配列番号２０）、RXDA-(RADA)4-RXDA-RADA（配列番号２１）、RXDA-(RADA)5-RXDA（配列番号２２）、RXDA-RADX-(RADA)5（配列番号２３）、RXDA-RADA-RADX-(RADA)4（配列番号２４）、RXDA-(RADA)2-RADX-(RADA)3（配列番号２５）、RXDA-(RADA)3-RADX-(RADA)2（配列番号２６）、RXDA-(RADA)4-RADX-RADA（配列番号２７）、RXDA-(RADA)5-RADX（配列番号２８）、RADA-RXDA-(RADA)4-RXDA（配列番号２９）、(RADA)2-RXDA-(RADA)3-RXDA（配列番号３０）、(RADA)3-RXDA-(RADA)2-RXDA（配列番号３１）、(RADA)4-RXDA-RADA-RXDA（配列番号３２）、(RADA)5-(RXDA)2（配列番号３３）、RADX-(RADA)5-RXDA（配列番号３４）、RADA-RADX-(RADA)4-RXDA（配列番号３５）、(RADA)2-RADX-(RADA)3-RXDA（配列番号３６）、(RADA)3-RADX-(RADA)2-RXDA（配列番号３７）、(RADA)4-RADX-RADA-RXDA（配列番号３８）、(RADA)5-RADX-RXDA（配列番号３９）、RADA-RXDA-(RADA)4-RADX（配列番号４０）、(RADA)2-RXDA-(RADA)3-RADX（配列番号４１）、(RADA)3-RXDA-(RADA)2-RADX（配列番号４２）、(RADA)4-RXDA-RADA-RADX（配列番号４３）、(RADA)5-RXDA-RADX（配列番号４４）、RADX-(RADA)5-RADX（配列番号４５）、RADA-RADX-(RADA)4-RADX（配列番号４６）、(RADA)2-RADX-(RADA)3-RADX（配列番号４７）、(RADA)3-RADX-(RADA)2-RADX（配列番号４８）、(RADA)4-RADX-RADA-RADX（配列番号４９）、(RADA)5-(RADX)2（配列番号５０）、(RXDA)2-(RADA)6（配列番号５１）、RXDA-RADA-RXDA-(RADA)5（配列番号５２）、RXDA-(RADA)2-RXDA-(RADA)4（配列番号５３）、RXDA-(RADA)3-RXDA-(RADA)3（配列番号５４）、RXDA-(RADA)4-RXDA-(RADA)2（配列番号５５）、RXDA-(RADA)5-RXDA-RADA（配列番号５６）、RXDA-(RADA)6-RXDA（配列番号５７）、RXDA-RADX-(RADA)6（配列番号５８）、RXDA-RADA-RADX-(RADA)5（配列番号５９）、RXDA-(RADA)2-RADX-(RADA)4（配列番号６０）、RXDA-(RADA)3-RADX-(RADA)3（配列番号６１）、RXDA-(RADA)4-RADX-(RADA)2（配列番号６２）、RXDA-(RADA)5-RADX-RADA（配列番号６３）、RXDA-(RADA)6-RADX（配列番号６４）、RADA-RXDA-(RADA)5-RXDA（配列番号６５）、(RADA)2-RXDA-(RADA)4-RXDA（配列番号６６）、(RADA)3-RXDA-(RADA)3-RXDA（配列番号６７）、(RADA)4-RXDA-(RADA)2-RXDA（配列番号６８）、(RADA)5-RXDA-RADA-RXDA（配列番号６９）、(RADA)6-(RXDA)2（配列番号７０）、RADX-(RADA)6-RXDA（配列番号７１）、RADA-RADX-(RADA)5-RXDA（配列番号７２）、(RADA)2-RADX-(RADA)4-RXDA（配列番号７３）、(RADA)3-RADX-(RADA)3-RXDA（配列番号７４）、(RADA)4-RADX-(RADA)2-RXDA（配列番号７５）、(RADA)5-RADX-RADA-RXDA（配列番号７６）、(RADA)6-RADX-RXDA（配列番号７７）、RADA-RXDA-(RADA)5-RADX（配列番号７８）、(RADA)2-RXDA-(RADA)4-RADX（配列番号７９）、(RADA)3-RXDA-(RADA)3-RADX（配列番号８０）、(RADA)4-RXDA-(RADA)2-RADX（配列番号８１）、(RADA)5-RXDA-RADA-RADX（配列番号８２）、(RADA)6-RXDA-RADX（配列番号８３）、RADX-(RADA)6-RADX（配列番号８４）、RADA-RADX-(RADA)5-RADX（配列番号８５）、(RADA)2-RADX-(RADA)4-RADX（配列番号８６）、(RADA)3-RADX-(RADA)3-RADX（配列番号８７）、(RADA)4-RADX-(RADA)2-RADX（配列番号８８）、(RADA)5-RADX-RADA-RADX（配列番号８９）、(RADA)6-(RADX)2（配列番号９０）からなる群から選択されるいずれかのペプチドである。
　本態様の自己組織化ペプチドが2以上のXを含む場合、2以上のXは同一のアミノ酸であってもよく、又は異なるアミノ酸であってもよい。
　本態様の自己組織化ペプチドは、化学的に合成可能である。
　本態様の自己組織化ペプチドは、自己組織化ペプチドを構成するペプチドユニットの組成及び／又は並び方を調整することにより、自己組織化ペプチドのゾル化温度及び／又はゲル化温度を制御することができる。具体的には、RADAユニットの個数mが大きいほどゾル化温度及び／又はゲル化温度は高くなり、RXDA及びRADXの個数nが大きいほど、ゾル化温度及び／又はゲル化温度は低くなる。したがって、本態様の自己組織化ペプチドは、mとnの数値を調整することによって、そのゾル化温度及び／又はゲル化温度を制御することができる。
　本態様の自己組織化ペプチドのゾル化温度、ゲル化温度は、例えば、1気圧条件下において、20～80℃の範囲内、20～70℃の範囲内、20～60℃の範囲内、30～50℃の範囲内又は30～40℃の範囲内である。
　本態様の自己組織化ペプチドは、生体適合性を有し、生体への導入が可能である。
１－３－２．融合ペプチド
　本態様の融合ペプチドは、本態様の自己組織化ペプチドに機能性ペプチドを共有結合又は超分子相互作用で連結して得られるペプチドである。
　本態様の融合ペプチドは、限定はしないが、例えば、本態様の自己組織化ペプチドを機能性ペプチドのN末端及び／又はC末端にペプチド結合で連結して得られるペプチドである。本態様の自己組織化ペプチドが「機能性ペプチドのN末端及び／又はC末端にペプチド結合で連結」されるとは、本態様の自己組織化ペプチドが機能性ペプチドのN末端にのみ連結される場合、C末端にのみ連結される場合、並びにN末端及びC末端の両方に連結される場合のいずれをも包含するものとする。
　本態様の融合ペプチドを構成する機能性ペプチドは、前述のように、生体内又は細胞内において、特定の生物学的機能を有するペプチドである。その機能は、限定はしないが、例えば、細胞接着機能、シグナル伝達機能、結合機能、標識機能、又は代謝機能が挙げられる。
　また、本態様の融合ペプチドを構成する機能性ペプチドは、使用目的、細胞培養、細胞の接着、増殖、分化等の制御、組織又は器官の培養、形成、再生、又は血管誘導等の融合ペプチドの目的に応じて選択することができる。
　本発明における機能性ペプチドは限定しないが、例えば、細胞接着分子、細胞外マトリックス分子、分泌タンパク質、結合タンパク質、酵素、マーカータンパク質、及び人工ペプチド、並びにそれらのペプチド断片が挙げられる。ここでいう「細胞接着分子」とは、細胞の表面で細胞間、又は細胞と細胞外マトリックス間の接着に関わる分子である。限定はしないが、例えば、N-カドヘリン等のカドヘリン、インテグリン、セレクチン等が挙げられる。「細胞外マトリックス分子」とは、細胞外マトリックスを構成する分子である。限定はしないが、例えば、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン等が挙げられる。「分泌タンパク質」とは、細胞内で作られ、細胞外に分泌されるタンパク質である。限定はしないが、例えば、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、サイトカイン等が挙げられる。「結合タンパク質」とは、特定の分子と特異的に結合するタンパク質である。限定はしないが、例えば、抗原抗体結合を媒介する抗体又は抗原、（ストレプト）アビジン、マルトース結合タンパク質（MBP）、受容体リガンド相互作用を媒介する受容体又はリガンド、DNA結合タンパク質、RNA結合タンパク質等が挙げられる。特に、機能性ペプチドがDNA結合タンパク質又はRNA結合タンパク質である場合、機能性ペプチドが結合する核酸分子は他の1つ又は複数の核酸分子と多重らせん構造の形成等によって結合することができる。「マーカータンパク質」とは、細胞やタンパク質等を検出する際に標識となりうるタンパク質である。通常は、その活性に基づいて目的とするタンパク質の発現や存在の有無を判別できるポリペプチドが該当する。限定はしないが、例えば、GFP等の蛍光タンパク質、ルシフェリン、又はイクオリン等の発光タンパク質、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、又はアルカリホスファターゼ（AP）等の酵素が挙げられる。「人工ペプチド」とは、タグペプチドとも呼ばれ、人工的に合成された数～十数アミノ酸からなるオリゴペプチドである。例えば、FLAGタグ、ヒスチジンタグ、HAタグ、DAPタグ等のエピトープタグ、及びHisタグ等が挙げられる。
　本態様の融合ペプチドのゾル化温度、ゲル化温度は、機能性ペプチドの影響を受けるものの、原則的には包含する自己組織化ペプチドのゾル化温度、ゲル化温度に基づく。したがって、1気圧条件下では、例えば、20～80℃の範囲内、20～70℃の範囲内、20～60℃の範囲内、30～50℃の範囲内又は30～40℃の範囲内でゾルゲル転移する。
　本態様の融合ペプチドは、生体適合性を有し、生体への導入が可能である。
　本態様の融合ペプチドに含まれる自己組織化ペプチドは分子量が小さい。それ故、比較的大きな機能性ペプチドとペプチド結合によって連結し、単一のペプチド鎖として合成することが可能である。一般に遺伝子発現系を用いて細胞内でペプチド合成を行う場合、タンパク質の分子量が大きくなるほど収率が低くなる。本態様の融合ペプチドは、遺伝子発現系を用いて発現させた場合の収率が高い。
　本明細書において「遺伝子発現系」とは、宿主細胞内で外来の遺伝子を発現できる発現系、又は無細胞遺伝子発現系をいう。具体的には、例えば、プラスミド若しくはバクミド（Bacmid）のような自律複製可能な発現ベクターが挙げられる。発現ベクターは、複数種の宿主細胞内で複製可能なシャトルベクターとすることもできる。宿主は、特に限定されないが、例えば、大腸菌、昆虫細胞、培養細胞が挙げられる。
１－４．効果
　本態様の自己組織化ペプチド又は融合ペプチドは、(RADA)4ペプチドよりも低い温度でゾル化する性質を有する。
２．ゾルゲル転移剤
２－１．概要
　本発明の第２の態様は、ゾルゲル転移剤である。本態様のゾルゲル転移剤は、第１態様の自己組織化ペプチド又は融合ペプチドからなる。本態様のゾルゲル転移剤によれば、温度変化によって、ゾル状態からゲル状態へ、又はゲル状態からゾル状態へ、温度制御によりゾルゲル転移させることが可能である。
２－２．構成
　本態様において「ゾルゲル転移剤」とは、第１態様の自己組織化ペプチド又は融合ペプチドで構成され、そのアミノ酸配列の違いに基づき、所望の温度でゾルゲル転移させることができるゲル化剤である。
　したがって、本態様におけるゾルゲル転移剤の基本構成は、第１態様の自己組織化ペプチド又は第１態様の融合ペプチドにおける「１－３．構成」に記載の内容と実質的に同一である。それ故、ここでは、その具体的な説明は省略する。
　なお、本態様におけるゾルゲル転移剤のpHは、限定はしない。例えばpH 1～pH 11、pH 1～pH 9、pH 3～pH 9、pH 4～pH 8、pH 5～pH 7、又はpH 6～pH 7の範囲にあればよい。好ましくはpH 8.0以下、pH 7.5以下、pH 7以下、pH 6.5以下である。
３．ゾルゲル転移組成物
３－１．概要
　本発明の第３の態様はゾルゲル転移組成物である。本態様のゾルゲル転移組成物は、第２態様に記載のゾルゲル転移剤を必須の有効成分とし、他に担体等を包含して成る。本態様のゾルゲル転移組成物は、温度処理によって所望の温度でゾルゲル転移剤をゾルゲル転移させることができる。
　本明細書において「温度処理」とは、温度を変化させる処理をいう。例えば、ゾル状態又はゲル状態にある本発明のゾルゲル転移剤又はゾルゲル転移組成物に対して、昇温させる処理（加熱処理）、又は降温させる処理（冷却処理）が挙げられる。
　本明細書において「温度変化によってゾルゲル転移させる」とは、任意の圧力条件下における温度処理によりゾルゲル転移剤又はゾルゲル転移組成物をゾルゲル転移させることをいう。例えば、1気圧条件下における20～80℃の範囲内の温度変化によって、ゾルゲル転移させることをいう。
３－２．構成
３－２－１．構成成分
　本発明のゾルゲル転移組成物は、有効成分及びそれ以外の成分によって構成されている。有効成分以外の成分は特に限定はしないが、例えば、担体等が挙げられる。以下、各構成成分について具体的に説明をする。
（１）有効成分
　本態様のゾルゲル転移組成物は、必須の有効成分として1種類、又は2種類以上の第２態様に記載のゾルゲル転移剤を含む。すなわち、第１態様の自己組織化ペプチド及び／又は融合ペプチドを包含している。有効成分としての第２態様に記載のゾルゲル転移剤は、1種類であっても、又は異なる2種類以上の組み合わせであってもよい。
　本態様のゾルゲル転移組成物は、他の有効成分として、(RADA)p（pは1～6の整数）からなる自己組織化ペプチド、及び／又は当該自己組織化ペプチドに機能性ペプチドを共有結合又は超分子相互作用で連結してなる融合型ペプチドをさらに含んでもよい。これらの自己組織化ペプチドは、本発明のゾルゲル転移剤と比較してゾルゲル転移の温度が高く、例えば、20～80℃ではゲル状態のままである。そこで、これらの自己組織化ペプチドを本発明のゾルゲル転移剤と混合することによって、ゾルゲル転移組成物におけるゾルゲル転移の温度を上方制御、すなわち、ゾルゲル転移剤単独のときよりも高い温度に設定することができる。それにより、ゾルゲル転移組成物におけるゾルゲル転移の温度制御が可能となる。さらに、本態様のゾルゲル転移組成物は、他の有効成分として、薬剤等を包含することもできる。本明細書において「薬剤」とは、低分子化合物、ペプチド（酵素及び抗体を含む）、又は核酸（miRNA、siRNA、shRNA等のRNAi分子、アンチセンス核酸、アプタマー等を含む）を含む概念である。薬剤は、限定はしないが、疾患等の治療や症状軽減を目的とする治療医薬、疾患等を検出、診断するための検査医薬、害虫、害獣の忌避や駆除を目的とする農薬、殺ウイルス又は殺菌を目的とする消毒薬等、様々な種類の薬剤を包含する。本態様のゾルゲル転移組成物に包含される薬剤は、1種だけでなく、2種以上であってもよい。
　ゾルゲル転移組成物に配合される第２態様に記載のゾルゲル転移剤の量（含有量）は、特に限定はされない。ゾルゲル転移温度の条件を勘案して適宜定めればよい。また、本発明のゾルゲル転移組成物を生体内に投与する場合には、そのゾルゲル転移組成物に包含されるゾルゲル転移剤の種類及び／又はその有効量、被験体の情報、ゾルゲル転移組成物の剤形、並びに後述する担体又は添加物の種類に応じて適宜定めればよい。具体的には、ゾルゲル転移組成物に第２態様に記載のゾルゲル転移剤の濃度は、限定はしないが、例えば0.4重量％以上10重量％以下、1.0重量％以上10重量％以下、1.5重量％以上10重量％以下であればよい。本明細書において「有効量」とは、ゾルゲル転移組成物においてゾルゲル転移剤が有効成分としての機能を発揮する上で必要な量であって、かつそれを適用する生体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。この有効量は、被験体の情報、投与経路、及び投与回数等の様々な条件によって変化し得る。ここで「被験体」とは、医薬組成物の適用対象となる生体をいう。例えば、ヒト、家畜（ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、ダチョウ等）、競走馬、愛玩動物（イヌ、ネコ、ウサギ等）、実験動物（マウス、ラット、モルモット、サル、マーモセット等）等が該当する。好ましくはヒトである（この場合、特に「被験者」という）。また、「被験体の情報」とは、ゾルゲル転移組成物を適用する生体の様々な個体情報であって、例えば、被験者の場合であれば、全身の健康状態、疾患・病害に罹患している場合にはその進行度や重症度、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性、併用薬物の有無及び治療に対する耐性等を含む。ゾルゲル転移剤の最終的な有効量、及びそれに基づいて算出される適用量は、個々の被験体の情報等に応じて、最終的には医師、歯科医師、又は獣医師等の判断によって決定される。
（２）担体
　本態様のゾルゲル転移組成物は、必要に応じて薬学的に許容可能な担体を含むことができる。
　本明細書において「薬学的に許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、溶媒、賦形剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤、ヒト血清アルブミン等が挙げられる。
　溶媒には、例えば、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液、又は薬学的に許容される有機溶剤のいずれであってもよい。水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。補助剤としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。
　賦形剤には、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖、金属塩、クエン酸、酒石酸、グリシン、ポリエチレングリコール、プルロニック、カオリン、ケイ酸、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
　充填剤としては、ワセリン、前記糖及び／又はリン酸カルシウムが例として挙げられる。
　乳化剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが例として挙げられる。
　流動添加調節剤及び滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。
　上記の他にも、必要であれば医薬において通常用いられる可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、分散剤、界面活性剤、無痛化剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤、湿潤剤、吸着剤、矯味矯臭剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、防腐剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤、等張化剤等を適宜含むこともできる。
　このような担体は、主として剤形形成を容易にし、また剤形及び薬剤効果を維持する他、有効成分であるゾルゲル転移剤が生体内の酵素等によって分解を受け難くするために用いられるものであって、必要に応じて適宜使用すればよい。
３－２－２．ゾルゲル転移組成物の性質
　本態様のゾルゲル転移組成物のpHは、限定はしない。例えばpH 1～pH 11、pH 1～pH 9、pH 3～pH 9、pH 4～pH 8、pH 5～pH 7、及びpH 6～pH 7の範囲であればよい。好ましくは、pH 8.0以下、pH 7.5以下、pH 7以下、pH 6.5以下である。
　本態様のゾルゲル転移組成物も所定の圧力条件下における温度処理によってゾルゲル転移し得る。そのゾルゲル転移温度も、原則的には有効成分であるゾルゲル転移剤を構成する自己組織化ペプチド又は融合ペプチドのそれに基づく。したがって、本態様のゾルゲル転移組成物は、例えば、1気圧条件下において、20～80℃、20～70℃、20～60℃、30～50℃、又は30～40℃の範囲内の温度によってゾルゲル転移することができる。本態様のゾルゲル転移組成物は、例えば、1気圧条件下において、被験体の体温よりも高い温度でゾルゲル転移する。したがって、本態様のゾルゲル転移組成物は、ゾルゲル転移温度を包含するゾルゲル転移剤のゾルゲル転移温度に基づいて調整することができる。例えば、本態様のゾルゲル転移組成物を、1気圧条件下において、被験体の通常体温（例えば、37℃）よりも高い温度でゾルゲル転移させたい場合、有効成分であるゾルゲル転移剤が1種類であれば、通常体温よりも高いゾルゲル転移温度を有するゾルゲル転移剤を選択すればよい。有効成分であるゾルゲル転移剤が2種類であれば、通常体温よりも明らかに高いゾルゲル転移温度（例えば、40℃以上、45℃以上、47℃以上、又は50℃以上）を有するゾルゲル転移剤と、通常体温よりも明らかに低いゾルゲル転移温度（例えば、35℃以下、32℃以下、30℃以下、又は28℃以下）を有するゾルゲル転移剤とを組み合わせることで得ることができる。
　したがって、本態様のゾルゲル転移組成物の一実施形態として、被験体にゾル状態で投与し、生体内でゲル化させることや、逆に生体内にゲル状態で投与した後、所望の時期にゾル化することができる。
　本態様のゾルゲル転移組成物が融合ペプチドを含む場合には、本態様のゾルゲル転移組成物が被験体の体内でゲル化した後、当該融合ペプチドを構成する機能性ペプチドの生物学的機能に基づく機能が発揮される。例えば、機能性ペプチドとしてVEGFを用いる場合、体内でゲル化したゾルゲル転移組成物は、当該ゲルにおける血管形成を誘導することができる。さらに、投与部位においてゲル状態のゾルゲル転移組成物によって血管形成が十分に誘導された後、ゾルゲル転移組成物を温度処理によって再度ゾル化し、投与部位から除去することができる。
　また、本態様のゾルゲル転移組成物は、生体内において細胞足場材として使用することもできる。この場合も、本態様のゾルゲル転移組成物が被験体の体内でゲル化した後、当該融合ペプチドを構成する機能性ペプチドの生物学的機能に基づく機能が発揮される。機能性ペプチドとして、例えば、ラミニンやN-カドヘリン等の細胞外マトリックス分子を用いることができる。細胞足場材として使用する場合、体内でゲル化したゾルゲル転移組成物は、当該ゲルにおいて細胞の接着、増殖、分化等の制御、及び組織又は器官の形成、再生等を可能とする。さらに、投与部位においてゲル状態のゾルゲル転移組成物によって細胞の接着、増殖、分化等の制御、及び組織又は器官の形成、再生等が十分に達成された後、ゾルゲル転移組成物を温度処理によって再度ゾル化し、投与部位から除去することができる。
　本態様のゾルゲル転移組成物が融合ペプチドを含む場合、又は薬剤を含む場合、その効果は、ゲル状態では発揮されず、ゾル化後に発揮されるように制御してもよい。例えば、本態様のゾルゲル転移組成物を、機能性ペプチドの作用部位とは異なる体内部位にゾル状態で投与して当該投与部位においてゲル化させた後、必要な時期までゲル状態で維持する。その後、必要な時期に投与部位に温度処理を行ってゾル化させ、包含する融合ペプチドを放出させて、融合ペプチドに含まれる機能性ペプチドの作用部位へ、融合ペプチドを送達させることができる。
　また、本態様のゾルゲル転移組成物は、被験体にゲル状態のまま導入することもできる。例えば、上記の使用態様から、ゾル状態で投与して被験体の体内でゲル化させるステップを省略し、代わりに外科的方法等によりゲル状態のまま生体内に移植してもよい。
　被験体に導入された本態様のゾルゲル転移組成物は、温度処理によって再度ゾル化せずに導入部位から除去することもできる。例えば、被験体の体内からゲル状態のまま、導入部位から外科的に除去することができる。
３－２－３．剤形
　本態様のゾルゲル転移組成物の剤形は、特に限定しない。被験体の体内で有効成分の性質を失活させることなく目的の部位にまで送達できる形態であればよい。例えば、対象部位への直接投与が可能な液剤が挙げられる。液剤の例としては、注射剤が挙げられる。注射剤は、前記賦形剤、安定剤、pH調節剤等と適宜組み合わせて製剤化することができる。注射剤は、一般に液体であることから、注射剤としてのゾルゲル転移組成物はゾル状態である。
　一方、本態様のゾルゲル転移組成物の剤形は、対象部位への導入が可能な固形剤であってもよい。固形剤の場合、その形状は問わない。粉剤、散剤、顆粒剤、錠剤等の一般的な固形剤剤形の他、移植用部材としての形状であってもよい。固形剤は固体であることから、固形剤としてのゾルゲル転移組成物は、通常ゲル状態である。
３－２－４．適用方法
　本態様のゾルゲル転移組成物の適用方法は、特に限定しないが、好ましくは非経口投与であり、さらに好ましくは局所投与である。局所投与には、例えば、筋肉内投与、皮下投与、組織投与、及び器官投与が該当する。本態様のゾルゲル転移組成物を局所投与する場合には、ゾル状態の本態様のゾルゲル転移組成物は注射等で対象部位に直接投与され、投与後に対象部位でゲル化することができる。或いは、本態様のゾルゲル転移組成物をゲル状態のまま当該対象部位に導入してもよい。例えば、対象部位を外科手術により切開して、ゲル状態のまま移植することができる。投与量は、有効成分が奏効する上で有効な量であればよい。有効量は、被験体情報に応じて適宜選択される。
３－２－５．除去方法
　本態様のゾルゲル転移組成物は、投与部位においてゲル化した後、必要に応じて、温度処理によって再度ゾル化し、投与部位から除去することができる。
　或いは、本態様のゾルゲル転移組成物をゲル状態のまま対象部位から除去してもよい。例えば、外科手術により投与部位を切開して、ゲル状態のまま外科的に除去することができる。
　本態様のゾルゲル転移組成物をゾル化して投与部位から除去する時期は、必要に応じて適宜決定することができる。
４．細胞足場材
４－１．概要
　本発明の第４の態様は細胞足場材である。本態様の細胞足場材は、第２態様に記載のゾルゲル転移剤、又は第３態様に記載のゾルゲル転移組成物で構成される。本態様の細胞足場材は、生体外又は生体内のいずれでも使用することができる。本態様の細胞足場材は、温度処理によってその形状を加工することができる。
４－２．構成
　本明細書において「細胞足場材」とは、細胞培養又は組織再生用の足場材料であり、細胞の接着、増殖、分化等の制御、移植細胞、移植組織又は移植器官の培養、形成、再生等を可能とする材料をいう。細胞足場材は、生体外で使用してもよく、生体内で使用してもよい。
　本明細書において「細胞の接着、増殖、分化等の制御」とは、細胞の接着、増殖、分化の促進及び／又は抑制をいう。
　本態様の細胞足場材は、第２態様に記載のゾルゲル転移剤、又は第３態様に記載のゾルゲル転移組成物で構成される。したがって、本態様における基本構成は、第２態様のゾルゲル転移剤、又は第３態様に記載のゾルゲル転移組成物の構成と実質的に同一である。
　本態様の細胞足場材は、原則としてゲル状態のゾルゲル転移剤である。これは、細胞の足場として機能するには、細胞が固着するための一定の剛性が必要であり、液体状のゾルでは、通常、その目的を達成し得ないためである。
　本態様の細胞足場材が融合ペプチドを含む場合、当該融合ペプチドを構成する機能性ペプチドは、例えば細胞の接着、増殖、分化等を制御する分子、又は組織若しくは器官の形成、再生等を制御する分子である。例えば、細胞接着分子、細胞外マトリックス分子、分泌タンパク質、結合タンパク質、酵素、マーカータンパク質及び人工ペプチド、並びにそれらのペプチド断片である。本態様の細胞足場材に含まれ得る融合ペプチドを構成する機能性ペプチドは、好ましくは細胞接着分子、細胞外マトリックス分子であり、例えばラミニン、N-カドヘリンである。
４－３．効果
　本態様の細胞足場材は、生体外又は生体内において、細胞の接着、増殖、分化等の制御を可能にし、又は組織若しくは器官の形成、再生等を可能にする。
　本態様の細胞足場材を生体内で用いる使用態様は、「３．ゾルゲル転移組成物」の「３－２．構成」に記載されており、ここではその具体的な説明は省略する。
　本態様の細胞足場材を用いる場合には、対象とする細胞、組織又は器官の目的とする形状に合わせて細胞足場材の形状を加工することができる。例えば、本発明の細胞足場材は、ゾル状態にて鋳型に流し込み、ゲル化させることで成形することができる。或いは、本発明の細胞足場材は、局所的な加熱処理により、ゲルの一部をゾル化し、目的の形状に成形することが可能である。
５．ゾルゲル転移方法
５－１．概要
　本発明の第５の態様は、ゾル状態又はゲル状態にある、本発明のゾルゲル転移剤又はゾルゲル転移組成物のゾルゲル転移方法である。
　本発明のゾルゲル転移方法は、温度処理工程を必須の工程として含む。
５－２．方法
５－２－１．温度処理工程
　「温度処理工程」は、本発明のゾルゲル転移剤又はゾルゲル転移組成物のゾル化温度よりも低い温度から当該温度以上へ昇温する工程、又はゲル化温度よりも高い温度から当該温度以下へ降温する工程をいう。本工程により、本発明のゾルゲル転移剤又はゾルゲル転移組成物は、ゾル状態からゲル状態へ、又はゲル状態からゾル状態へと相転移することができる。
　本工程における処理温度は、使用するゾルゲル転移剤又はゾルゲル転移組成物の種類によって異なるので、その種類に応じて適宜定めればよい。例えば、10～90℃の範囲内、20～80℃の温度範囲内、20～70℃の範囲内、20～60℃の範囲内、30～50℃の範囲内、30～40℃の範囲内における昇温工程又は降温工程である。
　本発明のゾルゲル転移方法における温度処理工程で用いる加熱方法又は冷却方法は特に限定しない。いずれも公知の方法を用いればよい。例えば、加熱方法であれば、ゾルゲル転移剤又はゾルゲル転移組成物を熱源に直接的に又は間接的に接触させる方法（直火、湯煎、ヒーター照射等）、マイクロ波や超音波を照射する方法が挙げられる。また、冷却方法であれば、ゾルゲル転移剤又はゾルゲル転移組成物をフリーザーや冷蔵庫内に配置する方法等が挙げられる。
　本工程は、生体外又は生体内のいずれにおいても実施することができる。
＜実施例１：20～80℃の温度範囲でゾルゲル転移する自己組織化ペプチドの同定＞
（目的）
　20～80℃の温度範囲でゾルゲル転移する自己組織化ペプチドを開発する。
（方法）
（１）自己組織化ペプチドの合成
　計8種類のペプチド：(RADA)4ペプチド、RGDA-(RADA)3ペプチド、RADG-(RADA)3ペプチド、(RADA)2-RGDA-RADAペプチド、(RADA)2-RADG-RADAペプチド、(RADA)3-RGDAペプチド、(RADA)3-RADGペプチド、及び(RADA)4-Gペプチドを、ポリスチレンレジンを用いるFmocペプチド固相合成法によって、以下の方法によりそれぞれ0.10mmolスケールで合成した。
　固相合成用チューブ（株式会社ハイペップ研究所、固相合成用チューブポリプロピレン製LibraTube本体チューブ5 mL、固相合成用キャップポリプロピレン製LibraTube上部キャップ）中で、Fmoc-NH-SAレジン(渡辺化学株式会社)(250 mg, 0.10 mmol)をN,N’-ジメチルホルムアミド(DMF)（キシダ化学株式会社）中で1晩浸漬し、膨張させた。ピぺリジン（キシダ化学株式会社）(20% in DMF, 2 mL)を加え、１分間ボルテックスで攪拌し、その後反応溶液を除去した。ピペリジン(20% in DMF, 2 mL)を加え、室温で10分間振盪し、その後反応溶液を除去した。DMF (2 mL)で5回洗浄し、溶媒を除去した。レジンを少量取り出し、TNBS Test Kit（東京化成工業株式会社）を用いてレジンが呈色することを確認した。塩化メチレン（株式会社ゴードー）(2 mL)、DMF (2 mL)でそれぞれ3回ずつ洗浄し、溶媒を除去した。N末端のアミノ酸(0.30 mmol)に縮合剤カクテル(700 μL)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)（ナカライテスク株式会社）とN-メチル-2-ピロリドン(NMP)（キシダ化学株式会社）の混合液(DIEA/NMP = 2.75/14.25 (v/v), 700 μL)を加えて溶解させ、レジンに添加した。縮合剤カクテルは、HBTU（渡辺化学株式会社）3.05 g、HOBt・H2O（渡辺化学株式会社）1.25 g、DMF 16mLを予め混合し調製したものを使用した。室温で15分間振盪し、その後反応溶液を除去した。DMF (2 mL)で5回洗浄し、溶媒を除去した。レジンを少量取り出し、TNBS Test Kit（東京化成工業株式会社）を用いてレジンが呈色しないことを確認した。塩化メチレン(2 mL)、DMF (2 mL)でそれぞれ3回ずつ洗浄し、溶媒を除去した。以降、アミノ酸配列に従って上記の操作を繰り返し、ペプチド鎖を伸長した。ペプチド鎖の伸長には、Fmoc-Ala-OH・H2O、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH及びFmoc-Gly-OH（渡辺化学株式会社）を使用した。
　ペプチドを伸長後、溶媒を除去し、無水酢酸(関東化学株式会社)(25%塩化メチレン溶液, 2 mL)を加え、室温で5分間振盪し、その後反応溶液を除去した。DMF (2 mL)で5回洗浄し、溶媒を除去した。レジンを少量取り出し、TNBS Test Kitを用いてレジンが呈色しないことを確認した。塩化メチレン(2 mL)、DMF (2 mL)でそれぞれ3回ずつ洗浄し、溶媒を除去した。
　次に以下の手順でペプチドをレジンから切り出し、凍結乾燥した。デシケーター内で乾燥させたレジンに脱保護カクテルを加え、室温で30分ごとに軽く振盪し、90分間静置させた。脱保護カクテルは、トリフルオロ酢酸（TFA）（キシダ化学株式会社）2375 μL、トリイソプロピルシラン（TIS）（東京化成工業株式会社）62.5 μL、水62.5 μLを予め混合し調製したものを使用した。濾液を15 mL遠沈管に回収した。合成チューブにTFA (500 μL)を加え、濾液を先ほどの遠沈管に回収した。この操作を3回繰り返した。濾液を回収した遠沈管にジエチルエーテル（キシダ化学株式会社）(40 mL)を加え、十分に攪拌した。遠心分離 (4℃, 3500×g, 5分)し、上澄みを除去した。この操作を3回繰り返した。10分間ドラフト内で静置し、乾燥させた後、デシケーターで２時間以上乾燥させた。乾燥後のサンプルをイオン交換水に分散させ、凍結乾燥した。
（２）自己組織化ペプチドを含むゲルの作製
　2 mLのガラススクリューバイアル（AS ONE、ラボランスクリュー管瓶）において、（１）で凍結乾燥した各ペプチド粉末（1.0 mg）に2.2%トリフルオロ酢酸水溶液（200 μL）を加え、水浴型超音波装置（AS12GTU、35 kHz、60 W）を用いて、25℃にて5分間超音波を照射してサンプルをゾル化した。ペプチド濃度は0.50重量％であった。その後、バイアルを垂直に立て、20℃の恒温槽（三菱電機エンジニアリング、クールインキュベーターCN-40A）内で一晩静置して自己組織化ペプチドをゲル化した。バイアルは、各ペプチドについて2本以上作製した。図１に示すように、このときの、容器底面からゲル状サンプルの上端までの距離を基準距離h0として計測した。その結果、いずれのペプチドサンプルもh0＝6mmであった。
（３）ゾルゲル転移のアッセイ
　各ペプチドサンプルについて、（２）で調整したバイアルを、20℃にて90度、すなわち水平方向に傾けた。1分後の容器底面からゾル化によって移動したサンプル端までの距離を移動距離hとして計測した。次に、各ペプチドサンプルについて、（２）で調整した別のバイアルを80℃まで昇温し（温度変化速度=5℃/分）、80℃で5分間インキュベートした後、20℃のときと同様に、水平方向に傾けた時の移動距離を計測した。それぞれの温度における各ペプチドサンプルの状態を判定した。判定基準には、h/h0値を用い、h/h0＝1.3をゾル・ゲル状態のカットオフ値とした。すなわち、ペプチドサンプルのh/h0の値が1.3以上であればゾル状態、1.3未満であればゲル状態とした。
（結果）
　図２に20℃における各ペプチドサンプルのh/h0値を示す。(RADA)4ペプチド、RGDA-(RADA)3ペプチド、(RADA)3-RGDAペプチド、(RADA)3-RADGペプチド、及び(RADA)4-Gペプチドはゲル状態、それ以外のペプチドはゾル状態であった。
　図３に80℃における各ペプチドサンプルのh/h0を示す。(RADA)4ペプチド、及び(RADA)4-Gペプチドはゲル状態、それ以外はゾル状態と判定した。
　20℃及び80℃の結果から、RGDA-(RADA)3ペプチド、(RADA)3-RGDAペプチド、及び(RADA)3-RADGペプチドは、20℃と80℃の間でゲルからゾルへの相転移を示した。一方、(RADA)4ペプチド及び(RADA)4-Gペプチドは、20℃と80℃のいずれにおいてもゲルのままであった。また、RADG-(RADA)3ペプチド、(RADA)2-RGDA-RADAペプチド、及び(RADA)2-RADG-RADAペプチドは、20℃と80℃のいずれにおいてもゾルであった。
＜実施例２：自己組織化ペプチドの20～80℃の温度範囲における円偏光二色性スペクトルの測定＞
（目的）
　自己組織化ペプチドの立体構造の変化を、円偏光二色性スペクトルの測定によって検証する。
　「円偏光二色性スペクトル変化」とは、タンパク質の立体構造変化に伴う円偏光二色性のスペクトル変化である。「円偏光二色性」とは、タンパク質が円偏光を吸収する際に左円偏光と右円偏光に対して吸光度に差が生じる現象のことをいう。タンパク質の立体構造が変化する際には、円偏光二色性スペクトル変化が生じる。例えば、本発明の自己組織化ペプチドがゾルゲル転移する際には円偏光二色性スペクトル変化が観測され、ゲルからゾルへの転移時にはβシート構造の崩壊に由来すると考えられる円偏光二色性スペクトル変化が観測される。本実施例では、円偏光二色性スペクトル変化を測定することで自己組織化ペプチドのゲル形成に必要なβシート構造の形成割合の変化を評価することを目的とする。
（方法）
　2.2％TFA水溶液を溶媒とする0.50重量％濃度の(RADA)4ペプチド、及び(RADA)3-RADGペプチドについて、20℃から40℃、60℃、80℃に昇温した際の円偏光二色性スペクトルを測定した。さらに、再度20℃に降温した際の自己組織化ペプチドの円偏光二色性スペクトルを測定した。
　ペプチドサンプルは実施例１と同様に合成した。
　円偏光二色性スペクトルは、JASCO J-1100 CD Spectrometerを使用して、組立セル（GL Science、AB20-UV-0.1、セル長0.1mm）を用いて測定した。測定範囲は190-400nm、データ取込間隔は0.2nm、走査速度は200nm/分、試料濃度は0.50重量％であった。円偏光二色性スペクトル測定時における温度制御は、JASCO 温調ユニット及び水冷ペルチェセルホルダ PTC-514を用いて行った。
（結果）
　(RADA)4ペプチドは20℃から80℃まで昇温してもスペクトル変化を示さなかった（図４Ａ）。すなわち、βシート構造に由来する220nm付近の負のコットン効果の強度は昇温によって減少せず、βシート構造が崩壊しないことが示された。このことは(RADA)4ペプチドが昇温してもゾル化しないことと一致した。
　一方、(RADA)3-RADGペプチドでは、βシート構造に由来する220nm付近の負のコットン効果の強度が昇温により減少し、βシート構造の崩壊が示された（図４Ｂ）。このことは(RADA)3-RADGペプチドが昇温するとゾル化することと一致した。さらに、再度20℃に降温すると、220nm付近の負のコットン効果の強度が回復し、βシート構造の再形成を示した。したがって、(RADA)3-RADGペプチドでは、ゾルゲル転移が可逆的であることが示された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (13)

  1. 　m個の(Arg-Ala-Asp-Ala)、及び
    n個の(Arg-X-Asp-Ala)又は(Arg-Ala-Asp-X)
    を任意の順序で並べてなるいずれか１の自己組織化ペプチドであって、
    　XがGly又はProであり、
    　3≦m≦6であり、
    　1≦n≦2かつ2n＜mであり、
    　前記自己組織化ペプチドのC末端が(Arg-X-Asp-Ala)若しくは(Arg-Ala-Asp-X)、又はN末端が(Arg-X-Asp-Ala)である、
    前記自己組織化ペプチド。
  2. 　XがGlyである、請求項１に記載の自己組織化ペプチド。
  3. 　請求項１又は２に記載の自己組織化ペプチドに機能性ペプチドを共有結合又は超分子相互作用で連結してなる融合ペプチド。
  4. 　機能性ペプチドが、ラミニン、VEGF、N-カドヘリンから選択されるいずれか１の機能性ペプチドである、請求項３に記載の融合ペプチド。
  5. 　請求項１若しくは２に記載の自己組織化ペプチド、又は請求項３若しくは４に記載の融合ペプチドからなるゾルゲル転移剤。
  6. 　請求項５に記載のゾルゲル転移剤を有効成分として含む、ゾルゲル転移組成物。
  7. 　ゾルゲル転移剤を２種以上含む、請求項６に記載のゾルゲル転移組成物。
  8. 　(Arg-Ala-Asp-Ala)p（pは1～6の整数）からなる自己組織化ペプチド、並びに／又は前記ペプチドに前記機能性ペプチドを共有結合又は超分子相互作用で連結してなる融合ペプチドをさらに含む、請求項６又は７に記載のゾルゲル転移組成物。
  9. 　ゲル状態の請求項５に記載のゾルゲル転移剤、及び／又は請求項６～８のいずれか一項に記載のゾルゲル転移組成物で構成される細胞足場材。
  10. 　ゾル状態又はゲル状態にある、請求項５に記載のゾルゲル転移剤又は請求項６～８のいずれか一項に記載のゾルゲル転移組成物のゾルゲル転移方法であって、
    　前記ゾルゲル転移剤、又は前記ゾルゲル転移組成物を、そのゾル化温度以上の温度、又はゲル化温度以下の温度で処理する温度処理工程を含む、前記方法。
  11. 　前記ゾルゲル転移剤及び／又は前記ゾルゲル転移組成物の濃度が0.4重量％以上10重量％以下である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　ゾル状態又はゲル状態にある前記ゾルゲル転移剤又は前記ゾルゲル転移組成物がpH 1～9である、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 　前記ゾル化温度又はゲル化温度が20～80℃の範囲内にある、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
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