WO2023195332A1 - 細胞培養又は増殖基材 - Google Patents

細胞培養又は増殖基材 Download PDF

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WO2023195332A1
WO2023195332A1 PCT/JP2023/010893 JP2023010893W WO2023195332A1 WO 2023195332 A1 WO2023195332 A1 WO 2023195332A1 JP 2023010893 W JP2023010893 W JP 2023010893W WO 2023195332 A1 WO2023195332 A1 WO 2023195332A1
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WO
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gel
sequence
cells
composition
block
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PCT/JP2023/010893
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Inventor
彩絵 鳴瀧
主税 大槻
仁 中村
知則 林
Original Assignee
国立大学法人東海国立大学機構
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to cell culture or proliferation substrates, etc.
  • Three-dimensional cell culture is a method of culturing cells in an artificially created three-dimensional environment.
  • three-dimensional cell culture three-dimensional cell arrangement and interaction can be expected, and compared to two-dimensional cell culture, it is possible to imitate an environment closer to that in the living body. Therefore, three-dimensional cell culture is attracting particular attention in a wide range of fields such as regenerative medicine, tumor biology, and drug discovery research as a method for reproducing the high functionality of living tissues.
  • cell sheets produced by two-dimensional cell culture have been used for regenerative medicine.
  • an extracellular matrix gel such as collagen is used as a cell culture or growth substrate.
  • enzymatic digestion or the like is required to separate the cells from the substrate after culturing.
  • enzymatic digestion or the like is required when separating cells from a substrate after culture.
  • Elastin is an important functional protein that provides elasticity and stretchability to living tissues, but its use as a material has been significantly delayed due to the difficulty of handling it due to its high hydrophobicity.
  • the present inventor has developed a doubly hydrophobic elastin-like polypeptide (GPG) that forms self-assembled nanofibers in water (Non-Patent Document 1). The resulting fibers can form physical gels and are expected to be applied to biomaterials.
  • An object of the present invention is to provide a cell culture or proliferation substrate that allows cells to be separated more easily and without using drugs.
  • Item 1 (SEQ ID NO . 1: X 1 GGX 2 G) G sequence block consisting of n (wherein X 1 is the same or different and represents V or L, ) and (SEQ ID NO: 2: VPGX 3 G) m (where X 3 is the same or different and represents any amino acid, and m represents an integer of 5 or more.)
  • a cell culture or growth substrate comprising a gel or gel-forming sol composition containing a polypeptide comprising an elastin-like block peptide sequence, or a dried product of the composition.
  • Section 2 The sequence structure of the elastin-like block peptide sequence is, from the N-terminal side, G sequence block - P sequence block - G sequence block, G sequence block - P sequence block - P sequence block - G sequence block, P sequence block - G sequence.
  • Item 2 The cell culture or proliferation substrate according to item 1, which is a block, or a G sequence block-P sequence block.
  • Section 3 The cell culture or proliferation substrate according to item 1 or 2, for use in three-dimensional culture or proliferation of cells.
  • Section 4 The cell culture or proliferation substrate according to item 1 or 2, for use in two-dimensional culture or two-dimensional proliferation of cells.
  • Section 5 The cell culture or proliferation substrate according to any one of Items 1 to 4, wherein the composition retains cells.
  • Item 6 The cell culture or proliferation substrate according to any one of Items 1 to 5, wherein the polypeptide concentration in the composition is 0.2 w/v% or more.
  • Item 7 The cell culture or growth substrate according to any one of Items 1 to 6, wherein the polypeptide concentration in the composition is 0.2 to 3 w/v%.
  • Section 8. The cell culture or proliferation substrate according to any one of Items 1 to 7, for use by converting the gel-like composition into a sol and/or by converting the sol-like composition into a gel.
  • Section 9 A cell culture or proliferation method comprising culturing or proliferating cells in the cell culture or proliferation substrate according to any one of Items 1 to 8.
  • Section 10 A cell population obtainable by the cell culture or proliferation method according to item 9.
  • a TEM observation image of the GPG1 gel obtained in Test Example 2 is shown.
  • a photographic image of the tube containing the gel is shown in the upper right corner of the image.
  • the rheology measurement results of Test Example 3 are shown.
  • the vertical axis shows the storage modulus (G') and the loss modulus (G").
  • the horizontal axis shows the elapsed time of the test (unit: s (seconds)).
  • the rheology measurement results at the time of initial gelation in Test Example 4 are shown.
  • C Frequency-dispersive measurement (constant distortion of 1%).
  • Test Example 5 The rheology measurement results during regelation (no cells) in Test Example 5 are shown.
  • C Frequency-dispersive measurement (constant distortion of 1%).
  • the rheology measurement results during regelation (with cells) in Test Example 6 are shown.
  • B Dispersion measurement (constant frequency of 1 Hz)
  • C Frequency-dispersive measurement (constant distortion of 1%).
  • a microscopic observation image of Test Example 7 is shown.
  • In gel shows an image of cells in a gel
  • Recovery shows an image of cells dispersed in PBS after solization.
  • a phase contrast microscope image 7 days after the start of differentiation induction in Test Example 9 is shown.
  • An immunostaining image of the gel 7 days after the start of differentiation induction in Test Example 9 is shown.
  • A shows an ⁇ -actinin staining image
  • B shows a cell nucleus staining image
  • C shows a merged image of A and B.
  • amino acid residues in an amino acid sequence may be simply referred to as amino acids or specific amino acid names (valine, leucine), etc.
  • amino acid residues in an amino acid sequence may be indicated by a single letter amino acid code.
  • the present invention provides a G sequence block consisting of ( SEQ ID NO : 1 : V or L, n is an integer of 4 or more) and (SEQ ID NO: 2: VPGX 3 G) m (wherein, X 3 is the same or different and represents any amino acid, m represents an integer of 5 or more) (herein sometimes referred to as "polypeptide of the present invention”) (herein sometimes referred to as “the composition of the present invention”), or a cell culture or proliferation substrate containing a dried product of the composition (herein referred to as “the composition of the present invention”) (Sometimes referred to as "base material.”) This will be explained below.
  • the G sequence block is not particularly limited as long as it is a block consisting of the repeat sequence (X 1 GGX 2 G) n of the amino acid sequence (X 1 GGX 2 G) shown in SEQ ID NO: 1.
  • the G sequence block is usually a block that can have a ⁇ -sheet structure.
  • the G sequence block can provide the polypeptide with the ability to form fibers through self-assembly.
  • X 1 are the same or different and represent V or L
  • X 2 are the same or different and represent V or L.
  • X 1 and X 2 are preferably V.
  • n indicates an integer of 4 or more.
  • the polypeptide of the present invention can form a fibrous self-assembly.
  • n is preferably 4 to 20, more preferably 4 to 12, even more preferably 4 to 8, even more preferably 4 to 6.
  • the P sequence block is not particularly limited as long as it is a block consisting of the repeat sequence (VPGX 3 G) m of the amino acid sequence (VPGX 3 G) shown in SEQ ID NO: 2.
  • the P sequence block is usually a block that can take a ⁇ -turn structure.
  • the P sequence block allows the polypeptide to have a lower critical solubility temperature (LCST), which allows it to self-assemble and phase separate from aqueous solution above the LCST.
  • LCST critical solubility temperature
  • the LCST of the polypeptide of the present invention (solvent: water, concentration: 0.03 wt%) is, for example, 10 to 30°C, preferably 15 to 25°C.
  • X 3 is the same or different and represents any amino acid.
  • the amino acid represented by X 3 include amino acids with basic side chains such as lysine, arginine, and histidine; amino acids with acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid; glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, Amino acids with uncharged polar side chains such as cysteine; Amino acids with non-polar side chains such as alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan; ⁇ -branched side chains such as threonine, valine, isoleucine Amino acids; Examples include amino acids having aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, and histidine.
  • the amino acid represented by X 3 is preferably an amino acid other than proline.
  • the amino acid represented by X 3 allows the LCST to be adjusted.
  • the amino acid represented by X 3 is a hydrophilic amino acid
  • the LCST becomes too high, which is not preferable.
  • some of the amino acids indicated by X 3 in the P sequence block are non-aromatic, such as valine and leucine.
  • the amino acid is preferably a hydrophobic amino acid (preferably valine), and other amino acids are preferably aromatic hydrophobic amino acids (preferably phenylalanine) such as phenylalanine and tryptophan.
  • the ratio of the number of non-aromatic hydrophobic amino acids represented by X 3 to the total number of X 3 in the P sequence block is, for example, 60 to 95%, preferably 70 to 80%, more preferably 75 to 85%. %, and the ratio of the number of aromatic hydrophobic amino acids represented by X 3 to the total number of X 3 in the P sequence block is, for example, 5 to 40%, preferably 20 to 30%, more preferably 15 to 25 %.
  • m indicates an integer of 5 or more. m is preferably 10 to 100, more preferably 10 to 50, even more preferably 15 to 35, particularly preferably 20 to 30.
  • the elastin-like block peptide sequence is not particularly limited as long as it contains a G sequence block and a P sequence block.
  • the number of G sequence blocks in the elastin-like block peptide sequence is not particularly limited, but is, for example, 1 to 5, preferably 2 to 5, more preferably 2 to 4, even more preferably 2 to 3, particularly preferably 2.
  • the number of P sequence blocks in the elastin-like block peptide sequence is not particularly limited, but is, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and still more preferably 1 to 2.
  • Blocks (between G array block and P array block, between G array block and G array block, between P array block and P array block) may be directly connected, or linker arrays may be used. There may be an intervention. Preferably, a linker sequence is interposed between the blocks.
  • the linker sequence is not particularly limited as long as it does not significantly reduce the fiber-forming ability due to self-assembly of the elastin-like block peptide sequence, and usually any amino acid or amino acid sequence can be employed without major restrictions.
  • the amino acid length of the linker sequence is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, even more preferably 1 to 8, even more preferably 2 to 8.
  • linker sequences include the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7: LWLGSG, the amino acid sequence shown by KL, etc., and one or more linker sequences (for example, 1 to 5, preferably is an amino acid obtained by mutating (e.g., substitution, deletion, insertion, addition, preferably substitution, more preferably conservative substitution) 1 to 3, more preferably 1 to 2, even more preferably 1) amino acids.
  • An array can be used.
  • conservative substitution means that an amino acid is replaced with an amino acid having a similar side chain.
  • conservative substitutions include amino acids having basic side chains such as lysine, arginine, and histidine.
  • Other amino acids with acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid; amino acids with uncharged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, and cysteine; alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine,
  • substitutions with amino acids with nonpolar side chains such as methionine and tryptophan; amino acids with ⁇ -branched side chains such as threonine, valine, and isoleucine; and amino acids with aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, and histidine are also possible. , which is a conservative substitution.
  • the sequence structure of the elastin-like block peptide sequence is, from the N-terminal side, from the N-terminal side: G sequence block - P sequence block - G sequence block, G sequence block - P sequence block - P sequence block - G.
  • it is a sequence block, a P sequence block-G sequence block, or a G sequence block-P sequence block.
  • the array structure is particularly preferably G array block-P array block-G array block or G array block-P array block-P array block-P array block-G array block.
  • "-" indicates a direct linkage (between blocks) or other arrangement (eg, linker arrangement, etc.).
  • the polypeptide of the present invention can have a cell adhesive sequence at the end.
  • the cell adhesion sequence is not particularly limited, and various sequences can be employed.
  • the cell adhesion sequence may be one without cell selection, such as RGDS (SEQ ID NO: 8), or one with cell selectivity (for example, REDV (SEQ ID NO: 20)). .
  • Sequences with cell selectivity include, for example, HHH, VVV, TTT, TGA, NNN, KKK, AAA, RRR, YYY, TTT, GAT, GGG, PGH, GQA, QGD, GIG, EKG, KGK, QGF, GMK, GLS, CAG, CNG, KGT, PLG, NRG, CSG, LGL, AVG, GHP, GLI, GVG, GPS, SPG, GPP, GIS, GYL, GEK, QGE, CNY, FPG, GAP, APG, GEC, LPG, GPR, PCG, GDV, IGG, CDG, AVA, FLM, GFD, GTP, GPY, VSG, DGR, GIT, GFL, ASG, GCP, NQG, SGL, GGA, PDG, QAL, GLK, GSP, GEP, GNS, AKG, DGY, TGP, VGP, SLW, AAG, AGA, ARG
  • the cell adhesion sequence is located at the terminus (N-terminus and/or C-terminus) of the polypeptide of the present invention, preferably at the C-terminus.
  • the cell adhesion sequence may be located only at either the N-terminus or the C-terminus, or at both. In one preferred embodiment of the invention, the cell adhesion sequence is located at one end only.
  • the elastin-like block peptide sequence and the cell adhesion sequence may be directly linked, or there may be other amino acid sequences (for example, 3-30, 7 ⁇ 25, 10 to 20 amino acid long sequences) may be present.
  • Other amino acid sequences are preferably hydrophilic amino acid-rich sequences from the viewpoint of cell adhesion. In other words, it is preferable that the hydrophilic amino acid-rich sequence is placed on the side opposite to the terminal side of the cell adhesion sequence.
  • a hydrophilic amino acid-rich sequence is not particularly limited as long as the sequence has a high proportion of hydrophilic amino acids, for example, a sequence containing hydrophilic amino acids in a proportion of 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more. Examples include amino acid sequences of 3 to 15 or 5 to 10 amino acids in length.
  • a continuous histidine sequence His tag sequence
  • Other amino acid sequences preferably include amino acids having functional groups that can be used for crosslinking reactions (eg, lysine, cysteine, etc.).
  • the polypeptide of the present invention may be chemically modified as long as the property of forming a thixotropic gel is not significantly impaired.
  • the presence or absence of the property of forming a gel having thixotropic properties can be evaluated according to Test Example 2 and Test Example 3 described below.
  • the polypeptide of the present invention may have a carboxyl group (-COOH), a carboxylate (-COO - ), an amide (-CONH 2 ), or an ester (-COOR) at the C-terminus.
  • R in the ester is, for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl; for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl or cyclohexyl; for example, phenyl , C 6-12 aryl groups such as ⁇ -naphthyl; phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl, phenethyl; C 7- such as ⁇ -naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as ⁇ -naphthylmethyl; 14Aralkyl group; pivaloyloxymethyl group, etc. are used.
  • a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl
  • a C 3-8 cycloalkyl group such as cycl
  • carboxyl groups (or carboxylates) other than the C-terminus may be amidated or esterified.
  • ester in this case, for example, the C-terminal ester mentioned above is used.
  • the amino group of the N-terminal amino acid residue is protected with a protecting group (for example, a C 1-6 acyl group such as a C 1-6 alkanoyl such as a formyl group or an acetyl group).
  • a protecting group for example, a C 1-6 acyl group such as a C 1-6 alkanoyl such as a formyl group or an acetyl group.
  • N-terminal glutamine residues that can be cleaved and generated in vivo are oxidized with pyroglutamine, substituents on the side chains of amino acids within the molecule (e.g.
  • -OH, -SH, amino groups, imidazole groups) , indole group, guanidino group, etc. is protected with an appropriate protecting group (for example, formyl group, C 1-6 acyl group such as C 1-6 alkanoyl group, such as acetyl group, etc.), or the sugar chain is Also included are complex proteins such as bound so-called glycoproteins.
  • the polypeptide of the present invention may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt with an acid or base.
  • the salt is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt, and both acidic salts and basic salts can be employed.
  • acidic salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, phosphate; acetate, propionate, tartrate, fumarate, maleate, apple
  • organic acid salts such as acid salts, citrates, methanesulfonates, and paratoluenesulfonates; amino acid salts such as aspartates and glutamates.
  • Examples of basic salts include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts.
  • the polypeptide of the present invention may be in the form of a solvate.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include water, ethanol, glycerol, acetic acid, and the like.
  • the polypeptide of the present invention can be easily produced according to known genetic engineering techniques. For example, it can be produced using PCR, restriction enzyme cleavage, DNA ligation technology, in vitro transcription/translation technology, recombinant protein production technology, etc.
  • composition of the present invention contains the polypeptide of the present invention and is in the form of a gel or a gel-forming sol.
  • a gel containing the polypeptide of the present invention can be prepared by heating it to 30-40°C and leaving it to stand for a certain period of time (for example, 1-300 hours, preferably 8-120 hours, more preferably 12-80 hours).
  • a composition can be obtained. Water is used as the solvent, but a mixed solvent of water and an organic solvent can also be used.
  • the concentration of the polypeptide of the present invention in the composition of the present invention is, for example, 0.2 w/v% or more, preferably 0.3 w/v% or more, more preferably 0.35 w/v% or more, from the viewpoint of gel-forming property. .
  • the concentration is, for example, 3.0 w/v% or less, preferably 2.0 w/v%, from the viewpoint of easy penetration of other components (e.g., components necessary or suitable for cell culture) into the gel composition of the present invention.
  • the content is more preferably 1.5 w/v% or less, further preferably 1.0 w/v% or less, even more preferably 0.8 w/v% or less.
  • the gel-forming sol composition containing the polypeptide of the present invention is a sol composition having gel-forming ability. Since the gel composition of the present invention exhibits thixotropic properties, by applying mechanical strain (for example, pipetting, vortexing, etc.) to the gel composition of the present invention, it is possible to form a sol composition (sol composition 1). ) can be obtained.
  • the sol-like composition 1 gels when the mechanical strain is no longer applied or is weakened, so it can be said that it has gel-forming ability.
  • a sol-like composition (sol-like composition 2) can be obtained by dissolving the polypeptide of the present invention in a solvent at a low concentration that does not form a gel.
  • the sol-like composition 2 gels when the concentration of the polypeptide of the present invention increases due to evaporation of the solvent, and therefore can be said to have gel-forming ability. Furthermore, a sol-like composition (sol-like composition 3) can be obtained by dissolving the polypeptide of the present invention in a low-temperature solvent (temperature below LCST) that does not form a gel. The sol composition 3 can be said to have gel-forming ability because it gels when heated to a gel-forming temperature (LCST or higher) and allowed to stand for a certain period of time.
  • LCST gel-forming temperature
  • the composition of the present invention preferably retains cells. By retaining cells, the elastic modulus in gel form can be significantly improved. Although the mode of retention is not particularly limited, it is preferable that it be suspended in the composition of the present invention.
  • the biological species from which the cells are derived is not particularly limited, and includes, for example, bacteria such as Enterobacteriaceae, fungi such as yeast, animals, and plants.
  • animals include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, rabbits, pigs, horses, cows, sheep, goats, and deer, as well as non-mammal vertebrates and invertebrates. Can be mentioned.
  • the biological species from which the target cells are derived include mammals, Escherichia coli, yeast, Bacillus subtilis, zebrafish, medaka, insects, and the like.
  • the types of cells are not particularly limited, and may be derived from various tissues or have various properties, such as blood cells, hematopoietic stem cells/progenitor cells, gametes (sperm, eggs), fibroblasts, epithelial cells, and vascular endothelial cells. , nerve cells, hepatocytes, keratinocytes, muscle cells, epidermal cells, endocrine cells, ES cells, iPS cells, tissue stem cells, cancer cells, etc.
  • the cell concentration is preferably 1.0 ⁇ 10 5 cells/mL or more, more preferably 2.0 ⁇ It is 10 5 cells/mL or more, more preferably 5.0 ⁇ 10 5 cells/mL or more, even more preferably 1.0 ⁇ 10 6 cells/mL or more.
  • the upper limit of the cell concentration can be, for example, 1.0 ⁇ 10 8 cells/mL, 1.0 ⁇ 10 7 cells/mL, or 5.0 ⁇ 10 6 cells/mL.
  • the method for retaining cells in the composition of the present invention is not particularly limited. By suspending cells in the sol-like composition of the present invention, cells can be easily retained in the composition of the present invention. By gelling the obtained sol composition, cells can be cultured three-dimensionally.
  • composition of the present invention can contain other components than those mentioned above.
  • Other components include, but are not particularly limited to, components necessary or suitable for culturing cells.
  • Other components include, for example, standard inorganic salts such as magnesium, calcium, potassium, zinc, and iron, buffers, sugars, vitamins, essential amino acids, non-essential amino acids, and the like.
  • standard inorganic salts such as magnesium, calcium, potassium, zinc, and iron
  • buffers such as magnesium, calcium, potassium, zinc, and iron
  • sugars such as g., glycerin, fetal, and the like
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • MEM Minimal essential Medium
  • BME Basal Medium Eagle
  • RPMI1640 F-10, F-12
  • ⁇ Minimal essential Medium ⁇ Minimal essential Medium
  • Glasgow's Minimal essential Medium (GMEM) Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), etc.
  • other components include serum, serum replacement components
  • the content of other components is, for example, 50 parts by weight or less, preferably 30 parts by weight or less, more preferably 20 parts by weight or less, still more preferably 10 parts by weight or less, and more preferably 100 parts by weight of the polypeptide of the present invention. More preferably, the amount may be 5 parts by weight or less.
  • composition of the present invention is in the form of a gel
  • its shape is not particularly limited as long as it is suitable as a substrate for cell culture or proliferation.
  • the shape can be, for example, a cube, a rectangular parallelepiped, a pyramid, a column, or a composite shape consisting of two or more shapes.
  • the dried product of the composition of the present invention is the composition of the present invention with reduced water content, and is not particularly limited within this range.
  • the dry product of the composition of the present invention may have a moisture content of, for example, 50% by weight or less, 30% by weight or less, 20% by weight or less, 10% by weight or less, or 5% by weight or less.
  • the dried product of the composition of the present invention can be used as a base material for cell culture or proliferation by adding water to increase the moisture content, if necessary.
  • the base material of the present invention may be made of only the composition of the present invention, or may be a composite of the composition of the present invention and other substances.
  • the other material may be a structure that may form part of a cell culture container, for example.
  • Materials for the structure include, for example, glass, resins (polystyrene, polyethylene, polypropylene, poly(acrylic ester), poly(methacrylic ester), polyacrylamide, polyacrylonitrile, polyethylene terephthalate, poly(L-lactic acid), (glycolic acid), poly( ⁇ -caprolactone), poly(ethylene glycol), and copolymers thereof), polypeptides (e.g.
  • collagen collagen, gelatin, casein, fibroin, keratin, laminin, integrin, fibronectin, vitronectin, etc.)
  • polysaccharides cellulose, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, starch, chitin, chitosan, etc.
  • silica silicon, metals (gold, silver, copper, iron, zinc, aluminum, nickel, and their alloys or oxides), etc. It will be done.
  • the substrate of the present invention is for use in culturing or proliferating cells.
  • the substrate of the present invention is used to retain cells in the composition of the present invention, or to place cells on the surface of the composition of the present invention and to culture or proliferate the cells.
  • the present invention in one aspect thereof, relates to a cell culture or propagation method comprising culturing or propagating cells on the substrate of the present invention.
  • the base material of the present invention can also be suitably used as a bioink.
  • culturing or proliferation includes not only cell division and proliferation, cell differentiation, etc., but also everything in which cells are maintained in a viable state.
  • cell refers not only to cells in a separated state, but also to cells in cell populations such as tissues, cell clusters, spheroids, and organoids. From this point of view, the present invention, in one aspect, relates to a cell population obtainable by the cell culture or proliferation method described above.
  • Components necessary or suitable for culturing or propagating cells can be supplied to the cells by pre-containing them in the composition of the present invention, or they can be supplied to the cells by holding them or disposing them on the surface.
  • the composition of the present invention can also be supplied to cells by immersing it in a culture medium. Since the composition of the present invention can maintain a gel state even when the polypeptide of the present invention is at a low concentration, even if the latter method is used, the nutritional components can penetrate into the composition of the present invention.
  • the substrate of the present invention can be used for three-dimensional culture or three-dimensional proliferation of cells.
  • three-dimensional culture or three-dimensional proliferation cells are dispersed, for example, in the gel-like composition of the present invention, and then cultured or propagated.
  • components necessary for culture or proliferation can be supplied to the cells by bringing a solution (culture solution) containing the media components into contact with the gel-like composition of the present invention, or can be supplied to cells by using the gel-like composition of the present invention containing the following. Thereby, for example, spheroids can be formed.
  • spheroids when forming spheroids, can be obtained by culturing or proliferating for 3 days or more, preferably 3 to 10 days. After culture or proliferation, mechanical strain is applied to the gel-like composition of the present invention to cause sol-gel transition, and cells in the sol can be collected.
  • the substrate of the present invention can be used for two-dimensional culture or two-dimensional proliferation of cells.
  • two-dimensional culture or two-dimensional growth cells are placed on the surface of, for example, a gel-like composition of the present invention, and cultured or grown. Thereby, for example, a cell sheet can be formed.
  • the cells or cell sheets can be peeled off by leaving them at a relatively low temperature (for example, 25°C or lower, preferably 22°C or lower).
  • the gel-like composition of the present invention can undergo sol-gel transition by applying mechanical strain, and the cells or cell sheets can be peeled off.
  • the base material of the present invention can also be suitably used as a bioink for cell 3D bioprinting.
  • a bioink for cell 3D bioprinting For example, by suspending cells in the composition of the present invention in the form of a sol and arranging the cells spatially, a desired three-dimensional tissue structure can be obtained by sol-gel transition.
  • the substrate of the present invention can be used not only as a cell culture substrate, but also as a cell proliferation substrate for forming artificial blood vessels, a cell proliferation substrate for wound treatment, etc.
  • Test example 1 Synthesis of polypeptides The following two polypeptides (GPG1 and GPG3): ( GPG1 ) A G sequence block consisting of 5 (SEQ ID NO: 3: VGGVG) from the N-terminal side, a P sequence block consisting of 25 (SEQ ID NO: 4: VPGXG) (wherein X is the same or different and represents V or F.
  • SEQ ID NO: 3 VGGVG
  • SEQ ID NO: 5 A polypeptide containing an elastin-like block peptide sequence (SEQ ID NO: 5 ), in which each block is connected via a linker sequence in the order of G sequence blocks consisting of 5 (SEQ ID NO: 3: VGGVG), and ( GPG3 )
  • SEQ ID NO: 6 A polypeptide (SEQ ID NO: 6) consisting of a cell adhesion sequence placed on the C-terminal side of GPG1 was synthesized.
  • GPG1 and GPG3 are polypeptides consisting of previously reported amino acid sequences.
  • E. coli BLR (DE3) strain was transformed using plasmid DNA encoding these polypeptides, and the polypeptides were expressed.
  • the polypeptide was purified by metal ion affinity chromatography using His-tag. It was confirmed by SDS-PAGE and MALDI-TOF-MS that the target polypeptide was obtained.
  • the recovered peptide solution was placed in Spectra/Por (registered trademark) 1 Dialysis Membrane MWCO: 6-8,000 (Spectrum Laboratories) and dialyzed in 2 L of ultrapure water at 4°C. The ultrapure water was exchanged at least twice every hour, then twice every two hours, and once every 1.5 hours, for a total of five dialysis sessions.
  • the peptide solution was filtered by attaching a Minisart (registered trademark) Syringe Filter 0.2 ⁇ m (Sartorius Stedim Biotech) to the syringe to remove insolubilized peptide, and then frozen at -80°C overnight. Thereafter, it was freeze-dried using a freeze dryer FDU-1200 (TOKYO RIKAKIKAI) to obtain powders of two types of peptides, GPG1 and GPG3.
  • a freeze dryer FDU-1200 TOKYO RIKAKIKAI
  • Test example 2 Gelation of polypeptide solution GPG1 was dissolved in a 10 w/v% sucrose aqueous solution to a final concentration of 0.5% by weight. The resulting GPG1 solution was heated and maintained at 37°C and left to stand. After one day, the GPG1 solution had turned into a transparent gel. TEM observation of the resulting gel confirmed the formation of nanofibers with a diameter of 10 nm or less ( Figure 1).
  • Test example 3 Thixotropic properties of gel
  • the GPG1 gel obtained in Test Example 2 was subjected to rheology measurements at a constant frequency of 1 Hz, alternating between a state of 100% shear strain and a state of 0.5% shear strain.
  • Rheological measurements were performed using a Modular Compact Rheometer MCR302 (Anton Paar) with a 1° cone plate (25 mm diameter) with a gap of 0.048 mm.
  • professional wipes impregnated with ultrapure water were placed around the measurement stand and covered with a solvent trap cover to prevent the sample from drying out.
  • the temperature was maintained at 37°C using a Peltier system with a built-in rheometer.
  • An appropriate amount of each prepared sample was placed on the measurement table using a spatula, and the jig was lowered to the target gap.
  • the storage modulus (G') and loss modulus (G") were measured.
  • the results are shown in Figure 2.
  • the GPG1 gel was found to be thixotropic (self-healing), i.e., the gel can undergo repeated reversible disruption under mechanical strain and recovery under static conditions.
  • Test example 4 Rheology during initial gelation GPG1 was dissolved in a 10 w/v% sucrose aqueous solution to a final concentration of 0.4 w/v%, and the resulting GPG1 solution was used as a sample.
  • the method of rheology measurement is the same as Test Example 3.
  • a sample in a solution state at 4°C was set in a rheometer MCR302 adjusted to 37°C, and dynamic viscoelasticity was measured.
  • the measured dynamic viscoelasticity consists of three items: time dispersion, frequency dispersion, and strain dispersion, and the storage modulus (G') and loss modulus (G") were measured for each.
  • the time dispersion was measured for one sample.
  • Dispersion measurements were taken at a constant distortion of 1% and a constant frequency of 1 Hz, one point every 30 seconds, for a total of 120 points for a total of 60 minutes.Following frequency dispersion measurements were made at a constant distortion of 1% at a constant frequency of 100-0.1 rad.
  • strain dispersion measurements were performed at a constant frequency of 1 Hz, with shear strains in the range of 0.1-100%.Strain dispersion measurements for all samples We observe that 1% strain is in the linear region.
  • G had an increasing trend from 0.1% strain to about 0.5% strain, and although it started to decrease after 0.5% strain, the slope was more gradual than that of G'. From a strain of 0.1% to approximately 7%, G' exhibited elastic behavior that exceeded G'', while after approximately 7% strain, G'' exceeded G' and exhibited viscous behavior.
  • Test example 5 Rheology during regelation (without cells) GPG1 was dissolved in a 10 w/v% sucrose aqueous solution to a final concentration of 0.8 w/v%, and the resulting GPG1 solution was allowed to stand at 45°C for 1 day for initial gelation. This was shaken for 5 seconds using a vortex (Scientific Industries) to turn the gel into a sol. An equal amount of a 10 w/v% sucrose aqueous solution was added to this to make a sol with a peptide concentration of 0.4 w/v%.
  • re-gelling the process of gelling the sol by raising the temperature again will be referred to as "re-gelling”.
  • the method of rheology measurement is the same as in Test Example 3.
  • GPG1 sol (peptide concentration 0.4 w/v%) was set in a rheometer MCR302 adjusted to 37°C immediately after being taken out of the 45°C incubator, and dynamic viscoelasticity measurements were performed in the same manner
  • Test example 6 Rheology during regelation (with cells) GPG1 was dissolved in a 10 w/v% sucrose aqueous solution to a final concentration of 0.8 w/v%, and the resulting GPG1 solution was allowed to stand at 45°C for 1 day for initial gelation. Each gel was turned into a sol by shaking it for 5 seconds using a vortex (Scientific Industries). To this, an equal volume of a cell suspension made by suspending Panc-1 cells in a 10 w/v% sucrose aqueous solution was added to make a sol with a peptide concentration of 0.4 w/v% and a cell concentration of 2.0 ⁇ 10 6 cells/mL. . Measurement was carried out in the same manner as in Test Example 5 using the sol.
  • Test example 7 Three-dimensional cell culture using the thixotropic properties of gel. Drop 50 ⁇ L of the cell suspension sol obtained in the same manner as Example 6 into a 96-well plate (Corning, Inc., USA) and place it in an incubator at 37°C. The mixture was allowed to stand for 10 minutes to form a gel, and a Cell Layer was prepared. 100 ⁇ L of cell culture medium (DMEM) was dropped from above, and cultured for each period in an incubator at 37° C. with a CO 2 concentration of 5%. The time of Cell Layer production was set as day 0, and on the 1st, 3rd, and 5th day, 50 ⁇ L of the supernatant cell culture medium was removed and 50 ⁇ L of new cell culture medium was dropped to replace the cell culture medium. On days 0, 2, 4, and 7, the gel was solized by pipetting with a micropipette and dispersed in PBS.
  • DMEM cell culture medium
  • spheroids were formed when three-dimensional culture was similarly performed using collagen gel, they could not be recovered by pipetting, but could be recovered after enzymatic treatment with collagenase.
  • Test example 8 Two-dimensional cell culture Culture NIH/3T3 cells were two-dimensionally cultured on GPG1 gel at 37°C. After culturing, the cells were left at room temperature (approximately 15°C) for about 10 minutes, and the cells began to peel off in sheets. Since GPG exhibits temperature responsiveness, it became hydrophilic at room temperature, which was thought to be the reason for the cell detachment. From the above, it was found that cell sheets can be easily recovered by two-dimensionally culturing cells on GPG gel.
  • Test example 9 Three-dimensional cell culture using thixotropic properties of gel (myoblast C2C12) GPG3 was dissolved in 10 w/v% sucrose to a final concentration of 0.8 w/v%, and the resulting GPG3 solution was allowed to stand at 45°C for 2 days for initial gelation. This was vortexed for 5 seconds to turn the gel into a sol. Drop 50 ⁇ L of sol into the cell culture container using a micropipette, then disperse 4 ⁇ 10 6 cells/mL of mouse-derived myoblast cell line C2C12 (RIKEN CELL BANK) in 10 w/v% sucrose. 50 ⁇ L of the suspension was mixed and re-gelled.
  • mouse-derived myoblast cell line C2C12 RIKEN CELL BANK
  • a GPG3 gel with a final concentration of GPG3 of 0.4 w/v% and a cell concentration of 2 ⁇ 10 6 cells/mL was prepared.
  • 1 mL of DMEM medium containing 10 v/v% fetal bovine serum (FBS) was placed on top of this, and culture was started at 37° C. and 5% CO 2 concentration. 300 ⁇ L of the medium was replaced every day, and on the third day, the medium was switched to a differentiation-inducing medium (DMEM medium containing 2 v/v% horse serum). After differentiation induction, culture was performed for 7 days. Four hours and three days after the start of culture, cell number was evaluated using Cell Counting Kit-8 (CCK-8, DOJINDO).
  • FBS v/v% fetal bovine serum
  • the culture medium was sucked out with a micropipette, and the remaining gel was solified by pipetting and collected into a microtube.
  • Cells were precipitated using a tabletop centrifuge at 1000 rpm, 100 ⁇ L of the supernatant was collected as a background in a 96-well plate, and the remaining supernatant was removed.
  • the precipitated cells were dispersed in 150 ⁇ L of DMEM medium, and 100 ⁇ L of them was transferred to a 96-well plate. 10 ⁇ L of CCK solution was added to each well containing the background and sample, and after standing in an incubator at 37°C for 3 hours, absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader (EPOCH2; BioTek).
  • EPOCH2 microplate reader
  • the procedure for immunostaining is as follows.
  • the medium was aspirated using an aspirator, and the gel was washed twice with 300 ⁇ L of phosphate buffered saline (PBS).
  • 400 ⁇ L of 4% paraformaldehyde phosphate buffer was added, and the mixture was allowed to stand at 4°C for 30 minutes, and then washed twice with 300 ⁇ L of PBS.
  • polyoxyethylene (10) octylphenyl ether was diluted with PBS to prepare a solution with a concentration of 0.5%, and this was used as a Triton X-100 solution.
  • bovine serum-derived Cohn fraction V was diluted with PBS to prepare a solution with a concentration of 1.0%, and this was used as a BSA solution. 400 ⁇ L of BSA solution was added onto the gel, left to stand at room temperature for 1 hour, and washed twice with 300 ⁇ L of PBS.

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Abstract

細胞をより簡便に且つ薬剤を用いずに分離することが可能な細胞培養又は増殖基材を提供すること。 （配列番号1：X1GGX2G）nからなるG配列ブロック（式中、X1は同一又は異なってV又はLを示し、X2は同一又は異なってV又はLを示し、nは4以上の整数を示す。）と（配列番号2：VPGX3G）mからなるP配列ブロック（式中、X3は同一又は異なって任意のアミノ酸を示し、mは5以上の整数を示す。）を含むエラスチン様ブロックペプチド配列を含むポリペプチドを含有するゲル状又はゲル形成性ゾル状の組成物、又は前記組成物の乾燥物を含む、細胞培養又は増殖基材。

Description

細胞培養又は増殖基材
　本発明は、細胞培養又は増殖基材等に関する。
　三次元細胞培養は、人工的に作製した三次元的な環境の中で細胞を培養する手法である。三次元細胞培養では、立体的な細胞の配置や、相互作用が期待でき、二次元細胞培養に対して、より生体内に近い環境を模倣することが出来る。従って三次元細胞培養は生体組織が有する高い機能を再現するための方法として、再生医療、腫瘍生物学、創薬研究などの幅広い分野で特に注目を集めている。また、近年、二次元細胞培養より作製された細胞シートを、再生医療に利用することが行われている。
　三次元細胞培養においては、細胞培養又は増殖基材として、コラーゲン等の細胞外マトリックスのゲルが使用される。しかし、培養後に細胞を基材から分離する際には酵素消化等を要する。また、二次元細胞培養においても、培養後に細胞を基材から分離する際には酵素消化等を要する。
　エラスチンは生体組織に弾性・伸縮性を付与する重要な機能性タンパク質であるが、その高い疎水性に由来するハンドリングの難しさから、材料利用が大幅に遅れている。本発明者は、水中で自己集合性ナノファイバーを形成する二重疎水性エラスチン類似ポリペプチド（GPG）を開発している（非特許文献１）。得られるファイバーは物理ゲルを形成することができ、生体材料への応用が期待できる。
D.H.T. Le, R. Hanamura, D.-H. Pham, M. Kato, D.A. Tirrell, T. Okubo, A. Sugawara-Narutaki, Self-Assembly of Elastin-Mimetic Double Hydrophobic Polypeptides, Biomacromolecules. 14 (2013) 1028-1034. https://doi.org/10.1021/bm301887m.
　本発明は、細胞をより簡便に且つ薬剤を用いずに分離することが可能な細胞培養又は増殖基材を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、（配列番号1：X1GGX2G）nからなるG配列ブロック（式中、X1は同一又は異なってV又はLを示し、X2は同一又は異なってV又はLを示し、nは4以上の整数を示す。）と（配列番号2：VPGX3G）mからなるP配列ブロック（式中、X3は同一又は異なって任意のアミノ酸を示し、mは5以上の整数を示す。）を含むエラスチン様ブロックペプチド配列を含むポリペプチドを含有するゲル状又はゲル形成性ゾル状の組成物、又は前記組成物の乾燥物を含む、細胞培養又は増殖基材、であれば、上記課題を解決できることを見出した。本発明者はこの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　（配列番号1：X1GGX2G）nからなるG配列ブロック（式中、X1は同一又は異なってV又はLを示し、X2は同一又は異なってV又はLを示し、nは4以上の整数を示す。）と（配列番号2：VPGX3G）mからなるP配列ブロック（式中、X3は同一又は異なって任意のアミノ酸を示し、mは5以上の整数を示す。）を含むエラスチン様ブロックペプチド配列を含むポリペプチドを含有するゲル状又はゲル形成性ゾル状の組成物、又は前記組成物の乾燥物を含む、細胞培養又は増殖基材。
　項２．　前記エラスチン様ブロックペプチド配列の配列構造が、N末端側から、G配列ブロック－P配列ブロック－G配列ブロック、G配列ブロック－P配列ブロック－P配列ブロック－G配列ブロック、P配列ブロック－G配列ブロック、又はG配列ブロック－P配列ブロックである、項１に記載の細胞培養又は増殖基材。
　項３．　細胞の三次元培養又は三次元増殖に用いるための、項１又は２に記載の細胞培養又は増殖基材。
　項４．　細胞の二次元培養又は二次元増殖に用いるための、項１又は２に記載の細胞培養又は増殖基材。
　項５．　前記組成物が細胞を保持する、項１～４のいずれかに記載の細胞培養又は増殖基材。
　項６．　前記組成物における前記ポリペプチド濃度が0.2w/v％以上である、項１～５のいずれかに記載の細胞培養又は増殖基材。
　項７．　前記組成物における前記ポリペプチド濃度が0.2～3w/v％である、項１～６のいずれかに記載の細胞培養又は増殖基材。
　項８．　ゲル状の前記組成物をゾル化させて用いるため、且つ／或いはゾル状の前記組成物をゲル化させて用いるための、項１～７のいずれかに記載の細胞培養又は増殖基材。
　項９．　項１～８のいずれかに記載の細胞培養又は増殖基材で細胞を培養する又は増殖させることを含む、細胞培養又は増殖方法。
　項１０．　項９に記載の細胞培養又は増殖方法によって得られ得る、細胞集団。
　本発明によれば、細胞をより簡便に且つ薬剤を用いずに分離することが可能な細胞培養又は増殖基材を提供することができる。
試験例2で得られたGPG1ゲルのTEM観察画像を示す。画像右上に当該ゲルの入ったチューブの写真像を示す。 試験例3のレオロジー測定結果を示す。縦軸は貯蔵弾性率 (G') 及び損失弾性率 (G")を示す。横軸は、試験の経過時間（単位：s（秒））を示す。 試験例4の初回ゲル化時のレオロジー測定結果を示す。A : 時間分散測定 (1 Hzの一定周波数、1%の一定歪み)、B : 歪み分散測定 (1 Hzの一定周波数) 、C : 周波数分散測定 (1%の一定歪み)。 試験例5の再ゲル化時（細胞無し）のレオロジー測定結果を示す。A : 時間分散測定 (1 Hzの一定周波数、1%の一定歪み)、B : 歪み分散測定 (1 Hzの一定周波数) 、C : 周波数分散測定 (1%の一定歪み)。 試験例6の再ゲル化時（細胞有り）のレオロジー測定結果を示す。A : 時間分散測定 (1 Hzの一定周波数、1%の一定歪み)、B : 歪み分散測定 (1 Hzの一定周波数) 、C : 周波数分散測定 (1%の一定歪み)。 試験例7の顕微鏡観察像を示す。In gelはゲル中の細胞像を示し、Recoveryはゾル化後にPBSに分散させた状態の細胞像を示す。 試験例9の分化誘導開始から7日後の位相差顕微鏡画像を示す。 試験例9の分化誘導開始から7日後のゲルの免疫染色画像を示す。Aは、α-actininの染色画像を示し、Bは細胞核の染色画像を示し、CはAとBとのMerge画像を示す。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　本明細書中において、アミノ酸配列中のアミノ酸残基を、単にアミノ酸または具体的なアミノ酸名称（バリン、ロイシン）等を示すこともある。また、アミノ酸配列中のアミノ酸残基をアミノ酸の一文字表記で示すこともある。
　本発明は、その一態様において、（配列番号1：X1GGX2G）nからなるG配列ブロック（式中、X1は同一又は異なってV又はLを示し、X2は同一又は異なってV又はLを示し、nは4以上の整数を示す。）と（配列番号2：VPGX3G）mからなるP配列ブロック（式中、X3は同一又は異なって任意のアミノ酸を示し、mは5以上の整数を示す。）を含むエラスチン様ブロックペプチド配列を含むポリペプチド（本明細書において、「本発明のポリペプチド」と示すこともある。）を含有するゲル状又はゲル形成性ゾル状の組成物（本明細書において、「本発明の組成物」と示すこともある。）、又は前記組成物の乾燥物を含む、細胞培養又は増殖基材（本明細書において、「本発明の基材」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
　G配列ブロックは、配列番号1に示されるアミノ酸配列（X1GGX2G）のリピート配列（X1GGX2G）nからなるブロックである限り、特に制限されない。G配列ブロックは、通常、β-シート構造をとり得るブロックである。G配列ブロックにより、ポリペプチドに自己集合による繊維形成能を付与することができる。
　X1は同一又は異なってV又はLを示し、X2は同一又は異なってV又はLを示す。X1及びX2は好ましくはVである。
　nは4以上の整数を示す。nを4以上とすることにより、本発明のポリペプチドは、繊維状自己集合体を形成することができる。nは、好ましくは4～20、より好ましくは4～12、さらに好ましくは4～8、よりさらに好ましくは4～6である。
　P配列ブロックは、配列番号2に示されるアミノ酸配列（VPGX3G）のリピート配列（VPGX3G）mからなるブロックである限り、特に制限されない。P配列ブロックは、通常、β-ターン構造をとり得るブロックである。P配列ブロックにより、ポリペプチドが下限臨界共溶温度（LCST）を持つようになり、LCST以上で自己集合して水溶液から相分離するようになる。
　本発明のポリペプチドのLCST（溶媒：水、濃度：0.03 wt%の場合）は、例えば10～30℃、好ましくは15～25℃である。
　X3は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す。X3で示されるアミノ酸としては、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性側鎖を有するアミノ酸；　アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸；　グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸；　アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸；　スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸；　チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸等が挙げられる。X3で示されるアミノ酸は、プロリン以外のアミノ酸であることが好ましい。
　X3で示されるアミノ酸により、LCSTを調整することができる。X3で示されるアミノ酸が親水性アミノ酸である場合、LCSTが高くなりすぎるので、好ましくない。LCSTを適切な（生理的に許容可能な）温度（例えば30～40℃）に調整し易いという観点から、P配列ブロック中のX3で示されるアミノ酸の一部はバリン、ロイシン等の非芳香族性疎水性アミノ酸（好ましくはバリン）であり、他のアミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン等の芳香族性疎水性アミノ酸（好ましくはフェニルアラニン）であることが好ましい。この場合、P配列ブロック中のX3の総数に対するX3で示される非芳香族性疎水性アミノ酸の数の割合は、例えば60～95％、好ましくは70～80％、より好ましくは75～85％であり、P配列ブロック中のX3の総数に対するX3で示される芳香族性疎水性アミノ酸の数の割合は、例えば5～40％、好ましくは20～30％、より好ましくは15～25％である。さらに、この場合、P配列ブロック中、X3で示される芳香族性疎水性アミノ酸はできるだけ分散して出現することが好ましく、例えば1～7つ、好ましくは1～5つ、より好ましくは2～4つ、さらに好ましくは3つのリピート単位（VPGX3G）の繰返しに対して1つの割合で、X3が芳香族性疎水性アミノ酸であるリピート単位が出現することが好ましい。
　mは5以上の整数を示す。mは、好ましくは10～100、より好ましくは10～50、さらに好ましくは15～35、特に好ましくは20～30である。
　エラスチン様ブロックペプチド配列は、G配列ブロック及びP配列ブロックを含むものである限り、特に制限されない。エラスチン様ブロックペプチド配列中のG配列ブロックの数は、特に制限されないが、例えば1～5、好ましくは2～5、より好ましくは2～4、さらに好ましくは2～3、特に好ましくは2である。エラスチン様ブロックペプチド配列中のP配列ブロックの数は、特に制限されないが、例えば1～5、好ましくは1～4、より好ましくは1～3、さらに好ましくは1～2である。
　ブロック間（G配列ブロックとP配列ブロックとの間、G配列ブロックとG配列ブロックとの間、P配列ブロックとP配列ブロックとの間）は、直接連結されていてもよいし、リンカー配列が介在していてもよい。好ましくは、ブロック間には、リンカー配列が介在する。
　リンカー配列としては、エラスチン様ブロックペプチド配列の自己集合性による繊維形成能を著しく低減させない限りにおいて特に制限されず、通常は、大きな制限なく任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を採用することができる。リンカー配列のアミノ酸長は、例えば1～20、好ましくは1～15、より好ましくは1～10、さらに好ましくは1～8、よりさらに好ましくは2～8である。リンカー配列の具体例としては、配列番号7：LWLGSGで示されるアミノ酸配列、KLで示されるアミノ酸配列等が挙げられ、さらにこれらのアミノ酸配列に対して1または複数個（例えば1～5個、好ましくは1～3個、より好ましくは1～2個、さらに好ましくは1個）のアミノ酸が変異（例えば置換、欠失、挿入、付加、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換）されてなるアミノ酸配列を採用することができる。
　本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸が類似の側鎖を有するアミノ酸に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
　エラスチン様ブロックペプチド配列の配列構造は、自己集合による繊維形成能の観点から、N末端側から、G配列ブロック－P配列ブロック－G配列ブロック、G配列ブロック－P配列ブロック－P配列ブロック－G配列ブロック、P配列ブロック－G配列ブロック、又はG配列ブロック－P配列ブロックであることが好ましい。該配列構造は、特に、G配列ブロック－P配列ブロック－G配列ブロック、又はG配列ブロック－P配列ブロック－P配列ブロック－G配列ブロックであることが好ましい。これらの構造中、「－」は（ブロック間の）直接連結又は他の配列（例えばリンカー配列等）を示す。
　本発明のポリペプチドは、末端に細胞接着性配列を有することができる。細胞接着性配列としては、特に制限されず、各種配列を採用することができる。細胞接着性配列としては、RGDS（配列番号8）等の細胞選択制を有しないものであることもでき、また細胞選択性を有するもの（例えば、REDV（配列番号20））であることができる。細胞選択性を有する配列としては、例えばHHH、VVV、TTT、TGA、NNN、KKK、AAA、RRR、YYY、TTT、GAT、GGG、PGH、GQA、QGD、GIG、EKG、KGK、QGF、GMK、GLS、CAG、CNG、KGT、PLG、NRG、CSG、LGL、AVG、GHP、GLI、GVG、GPS、SPG、GPP、GIS、GYL、GEK、QGE、CNY、FPG、GAP、APG、GEC、LPG、GPR、PCG、GDV、IGG、CDG、AVA、FLM、GFD、GTP、GPY、VSG、DGR、GIT、GFL、ASG、GCP、NQG、SGL、GGA、PDG、QAL、GLK、GSP、GEP、GNS、AKG、DGY、TGP、VGP、SLW、AAG、AGA、ARG、GRD、EGF、GSC、PGQ、HSQ、EAP、RGP、PGD、CNI、GFG、GPT、GDQ、KGE、PFI、QGP、SYW、LPGFPGLK（配列番号9）、LPGFPGTP（配列番号10）、GPPGLSGPP（配列番号11）、FPGPPGPP（配列番号12）、LPGLPGPP（配列番号13）、FPGLPGPP（配列番号14）、GPPGPPGSPG（配列番号15）、LPGPPGPP（配列番号16）、FPGSPGFPG（配列番号17）、GSPGLPGTP（配列番号18）及びIGLSGEKG（配列番号19）等が挙げられる。
　本発明のポリペプチドが細胞接着性配列を含む場合、細胞接着配列は、本発明のポリペプチドの末端（N末端及び／又はC末端）に配置され、好ましくはC末端に配置される。細胞接着配列は、N末端及びC末端のどちらか一方にのみ配置されていてもよいし、両方に配置されていてもよい。本発明の好ましい一態様においては、細胞接着配列は、一方の末端にのみ配置される。
　本発明のポリペプチドが細胞接着性配列を含む場合、エラスチン様ブロックペプチド配列と細胞接着配列とは、直接連結されていてもよいし、両者の間に他のアミノ酸配列（例えば3～30、7～25、10～20アミノ酸長の配列）が介在していてもよい。この他のアミノ酸配列としては、細胞接着性の観点から、親水性アミノ酸リッチ配列が好ましい。換言すれば、細胞接着配列の末端側とは反対側に親水性アミノ酸リッチ配列が配置されていることが好ましい。親水性アミノ酸リッチ配列は、親水性アミノ酸の割合が高い配列限り特に制限されず、例えば50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上の割合で親水性アミノ酸を含む、例えば3～15、5～10アミノ酸長のアミノ酸配列が挙げられる。親水性アミノ酸リッチ配列としては、本発明のポリペプチドの精製を容易にできるという観点から、ヒスチジン連続配列（Hisタグ配列）が好ましい。他のアミノ酸配列内には、架橋反応に使用できる官能基を有するアミノ酸（例えばリシン、システイン等）が含まれることが好ましい。
　本発明のポリペプチドはチクソトロピー性を有するゲルを形成する性質が著しく損なわれない限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。チクソトロピー性を有するゲルを形成する性質の有無は、後述の試験例2及び試験例3に従って評価することができる。
　本発明のポリペプチドは、C末端がカルボキシル基（－COOH）、カルボキシレート（－COO－）、アミド（－CONH2）またはエステル（－COOR）の何れであってもよい。
　ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n－プロピル、イソプロピル、n－ブチルなどのC1－6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3－8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチルなどのC6－12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－C1－2アルキル基；α－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－C1－2アルキル基などのC7－14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
　本発明のポリペプチドは、C末端以外のカルボキシル基（またはカルボキシレート）が、アミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
　さらに、本発明のポリペプチドには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイルなどのC1－6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば－OH、－SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイル基などのC1－6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども包含される。
　本発明のポリペプチドは、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；　酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；　アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；　カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
　本発明のポリペプチドは、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
　本発明のポリペプチドは、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に製造することができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術、in vitro転写・翻訳技術、リコンビナントタンパク質作製技術等を利用して製造することができる。
　本発明の組成物は、本発明のポリペプチドを含有し、且つゲル状、又はゲル形成性のゾル状の組成物である。
　本発明のポリペプチドをLCST未満の温度（例えば0～15℃、2～10℃）で溶媒中に溶解させた後、得られた溶液をLCST以上（例えば30～50℃、30～45℃、30～40℃）に加温して一定時間（例えば1～300時間、好ましくは8～120時間、より好ましくは12～80時間）静置することにより、本発明のポリペプチドを含有するゲル状組成物を得ることができる。溶媒としては水が使用されるが、水と有機溶媒の混合溶媒も使用することができる。
　本発明の組成物における本発明のポリペプチドの濃度は、ゲル形成性の観点から、例えば0.2 w/v％以上、好ましくは0.3 w/v％以上、より好ましくは0.35 w/v％以上である。当該濃度は、本発明のゲル状組成物への他の成分（例えば細胞培養に必要又は好適な成分）を浸透させやすいという観点から、例えば3.0 w/v％以下、好ましくは2.0 w/v％以下、より好ましくは1.5 w/v％以下、さらに好ましくは1.0 w/v％以下、よりさらに好ましくは0.8 w/v％以下である。
　本発明のポリペプチドを含有するゲル形成性のゾル状組成物は、換言すれば、ゲル形成能を有するゾル状組成物である。本発明のゲル状組成物はチクソトロピー性を示すので、本発明のゲル状組成物に、機械的歪みを付与することによって（例えばピペッティング、ボルテックス等）、ゾル状組成物（ゾル状組成物1）を得ることができる。当該ゾル状組成物1は、機械的歪みの付与が無くなる又は弱くなるとゲル化するので、ゲル形成能を有するといえる。また、本発明のポリペプチドを、ゲルを形成しない程度の低濃度で溶媒に溶解させてゾル状組成物（ゾル状組成物2）を得ることができる。当該ゾル状組成物2は、溶媒の蒸発などにより本発明のポリペプチド濃度が高まるとゲル化するので、ゲル形成能を有するといえる。また、本発明のポリペプチドを、ゲルを形成しない程度の低温（LCST未満の温度）の溶媒に溶解させてゾル状組成物（ゾル状組成物3）を得ることができる。当該ゾル状組成物3は、ゲル形成温度（LCST以上）に加温して一定期間静置することによりにゲル化するので、ゲル形成能を有するといえる。
　本発明の組成物は、細胞を保持することが好ましい。細胞を保持することにより、ゲル状の際の弾性率を大幅に向上させることができる。保持の態様が特に制限されないが、本発明の組成物に懸濁していることが好ましい。
　細胞の由来生物種としては、特に制限されず、例えば腸内細菌科細菌等の細菌、酵母等の真菌、動物、植物が挙げられる。動物としては、特にヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ等の種々の哺乳類動物以外にも、非哺乳類脊椎動物、無脊椎動物等も挙げられる。本発明の好ましい一態様において、対象細胞の由来生物種としては、哺乳類、大腸菌、酵母、枯草菌、ゼブラフィッシュ、メダカ、昆虫等が挙げられる。また、細胞の種類としても、特に制限されず、各種組織由来又は各種性質の細胞、例えば血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子（精子、卵子）、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、がん細胞等が挙げられる。
　本発明の組成物が細胞を保持する場合、細胞濃度は、ゲル状の際の弾性率をより向上させることができるという観点から、好ましくは1.0×105　cells/mL以上、より好ましくは2.0×105 cells/mL以上、さらに好ましくは5.0×105 cells/mL以上、よりさらに好ましくは1.0×106 cells/mL以上である。当該細胞濃度の上限は、例えば1.0×108 cells/mL、1.0×107 cells/mL、又は5.0×106 cells/mLであることができる。
　本発明の組成物に細胞を保持させる方法は、特に制限されない。ゾル状の本発明の組成物に細胞を懸濁させることにより、容易に本発明の組成物に細胞を保持させることができる。得られたゾル状組成物をゲル化することにより、細胞を三次元培養することができる。
　本発明の組成物は、上記以外の他の成分を含むことができる。他の成分としては、特に制限されないが、細胞の培養に必要な又は好適な成分が挙げられる。他の成分としては、例えば、マグネシウム、カルシウム、カリウム、亜鉛、鉄等の標準無機塩、緩衝剤、糖、ビタミン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸等を含有する。具体的には、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM）、Minimal essential Medium（MEM）、Basal Medium Eagle（BME）、RPMI1640、F-10、F-12、αMinimal essential Medium（αMEM）、Glasgow’s Minimal essential Medium（GMEM）、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium（IMDM）等が挙げられる。また、上記以外にも、他の成分として、血清、血清代替成分、細胞外マトリックス、その他のタンパク質成分、多糖類等が挙げられる。
　他の成分の含有量は、本発明のポリペプチド100重量部に対して、例えば50重量部以下、好ましくは30重量部以下、より好ましくは20重量部以下、さらに好ましくは10重量部以下、よりさらに好ましくは5重量部以下であることができる。
　本発明の組成物がゲル状である場合、その形状は、細胞培養又は増殖の基材として適した形状である限り、特に制限されない。当該形状は、例えば立方体、直方体、錐体、柱体等、或いは2種以上の形状からなる複合形状であることができる。
　本発明の組成物の乾燥物は、本発明の組成物から水分が低減した物であり、この限りにおいて特に制限されない。本発明の組成物の乾燥物は、含水率が、例えば50重量％以下、30重量％以下、20重量％以下、10重量％以下、又は5重量％以下であることができる。本発明の組成物の乾燥物は、必要に応じて水を添加して含水率を高めることにより、細胞培養又は増殖の基材として利用することができる。
　本発明の基材は、本発明の組成物のみからなるものであってもよいし、本発明の組成物と他の物質とが複合化した物であってもよい。他の物質としては、例えば細胞培養容器の一部を構成し得る構造体であることができる。当該構造体の素材としては、例えばガラス、樹脂（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンテレフタレート、ポリ（L-乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ε-カプロ ラクトン）、ポリ（エチレングリコール）、およびこれらの共重合体など）、ポリペプチド（例えばコラーゲン、ゼラチン、カゼイン、フィブロイン、ケラチン、ラミニン、インテグリン、フィブロネクチン、ビトロネクチンなど）、多糖（セルロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、でんぷん、キチン、キトサンなど）、シリカ、シリコン、金属（金、銀、銅、鉄、亜鉛、アルミニウム、ニッケルおよびこれらの合金または酸化物）等が挙げられる。
　本発明の基材は、細胞の培養又は増殖に用いるためのものである。具体的には、本発明の基材は、本発明の組成物に細胞を保持させ、或いは本発明の組成物の表面に細胞を配置し、細胞を培養又は増殖させることに用いられる。この観点から、本発明は、その一態様において、本発明の基材で細胞を培養する又は増殖させることを含む、細胞培養又は増殖方法、に関する。また、本発明の基材は、バイオインクとして好適に利用することも可能である。
　ここで、「培養又は増殖」とは、細胞が分裂して増殖すること、細胞が分化すること等のみならず、細胞が生存状態で維持される全てを包含する。また、細胞とは、1つ1つの細胞が分離した状態の細胞のみならず、組織、細胞塊、スフェロイド、オルガノイド等の細胞集団中の細胞も意味する。この観点から、本発明は、その一態様において、上記した細胞培養又は増殖方法によって得られ得る、細胞集団、に関する。
　細胞の培養又は増殖に必要な又は好適な成分については、本発明の組成物中に予め含ませておくことにより細胞に供給することもできるし、或いは細胞を保持する又は表面に細胞が配置された本発明の組成物を培養液に浸すことによって細胞に供給することもできる。本発明の組成物は、本発明のポリペプチドが低濃度でもゲル状態を保つことができるので、後者の方法であっても本発明の組成物内部にまで栄養成分を浸透させることができる。
　本発明の基材は、好ましい一態様において、細胞の三次元培養又は三次元増殖に用いることができる。三次元培養又は三次元増殖においては、例えばゲル状の本発明の組成物中に細胞を分散させ、培養又は増殖させる。この際、培養又は増殖に必要な成分（培地成分）は、培地成分を含む溶液（培養液）をゲル状の本発明の組成物に接触させることにより細胞に供給することができ、或いは培地成分を含有する本発明のゲル状の組成物を用いることにより細胞に供給することができる。これにより、例えばスフェロイドを形成させることができる。なお、スフェロイド形成させる場合には、例えば3日間以上、好ましくは3～10日間培養又は増殖させることによりスフェロイドを得ることができる。培養又は増殖後は、ゲル状の本発明の組成物に機械的歪みを付与することによりゾルゲル転移させ、ゾル中の細胞を回収することができる。
　本発明の基材は、好ましい一態様において、細胞の二次元培養又は二次元増殖に用いることができる。二次元培養又は二次元増殖においては、例えばゲル状の本発明の組成物の表面に細胞を配置し、培養又は増殖させる。これにより、例えば細胞シートを形成させることができる。培養又は増殖後は、比較的低温（例えば25℃以下、好ましくは22℃以下）で放置することにより、細胞又は細胞シートを剥がすことができる。或いは、培養又は増殖後は、ゲル状の本発明の組成物に機械的歪みを付与することによりゾルゲル転移させ、細胞又は細胞シートを剥がすことができる。
　本発明の基材は、細胞3Dバイオプリントのバイオインクとして好適に利用することもできる。例えばゾル状の本発明の組成物に細胞を懸濁させ、細胞を空間的に配置させると、ゾルゲル転移により目的とする三次元組織構造体を得ることができる。
　本発明の基材は、細胞培養基材としてのみならず、人工血管を形成するための細胞増殖基材、創傷治療における細胞増殖基材等として、利用することも可能である。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　試験例1．ポリペプチドの合成
　下記2つのポリペプチド（GPG1、及びGPG3）：
　（GPG1）N末端側から（配列番号3：VGGVG）5からなるG配列ブロック、（配列番号4：VPGXG）25からなるP配列ブロック（式中、Xは同一又は異なってV又はFを示す。）、（配列番号3：VGGVG）5からなるG配列ブロックの順に、各ブロックがリンカー配列を介在して連結してなるエラスチン様ブロックペプチド配列を含むポリペプチド（配列番号5）、及び　（GPG3）GPG1のC末端側に細胞接着配列が配置されてなるポリペプチド（配列番号6）を合成した。GPG1及びGPG3は既報のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
　具体的には、これらのポリペプチドをコードするプラスミドDNAを用いてE.coli BLR(DE3)株を形質転換し、ポリペプチドを発現させた。His-tagを用いた金属イオンアフィニティークロマトグラフィーで精製して、ポリペプチドを得た。SDS-PAGE及びMALDI-TOF-MSにより、目的のポリペプチドが得られていることを確認した。
　Spectra/Por（登録商標） 1 Dialysis Membrane MWCO : 6-8,000 (Spectrum Laboratories) 中に回収したペプチド溶液を入れ、4℃の超純水2 L中で透析した。超純水は最短で1時間ごとに2回交換した後、2時間ごとに2回交換し、1.5時間で1回交換の、計5回に分けて透析を行った。透析後、シリンジにMinisart（登録商標） Syringe Filter 0.2 μm (SartoriusStedim Biotech) を取り付けてペプチド溶液を濾過し、不溶化したペプチドを除去した後、-80℃で一晩凍結した。その後、凍結乾燥機FDU-1200 (TOKYO RIKAKIKAI) を用いて凍結乾燥し、GPG1及びGPG3の2種類のペプチドの粉末をそれぞれ得た。
　試験例2．ポリペプチド溶液のゲル化
　GPG1を終濃度0.5重量％になるように、10w/v%スクロース水溶液に溶解させた。得られたGPG1溶液を加温して37℃に維持し、放置した。1日経過後、GPG1溶液は透明ゲル化していた。得られたゲルをTEM観察したところ、直径10nm以下のナノファイバーの形成が確認できた（図１）。
　また、GPG3についても同様の試験を行い、GPG1と同様の結果が得られた。
　試験例3．ゲルのチクソトロピー性
　試験例2で得られたGPG1ゲルについて、1 Hzの一定周波数で、せん断ん歪み100％の状態、0.5％の状態を交互に繰り返し、レオロジー測定を行った。レオロジー測定には Modular Compact Rheometer MCR302 (Anton Paar) と1°のコーンプレート (直径25 mm) を使用し、0.048 mmのギャップで行った。全ての測定中、試料の乾燥を防ぐためプロワイプに超純水を染み込ませたものを測定台の周囲に配置し溶媒トラップカバーで覆った。さらにレオメーター内蔵のペルチェシステムを用いて温度を37℃に保った。作製した各試料はスパチュラで測定台に適量乗せ、治具を目的ギャップまで下げた。貯蔵弾性率 (G') と損失弾性率 (G") を計測した。
　結果を図２に示す。GPG1ゲルは、機械的歪み下でのゲルの可逆的破壊と静的条件での回復を繰り返すことができる、すなわちチクソトロピー性（自己修復性）を示すことが分かった。
　また、GPG3ゲルについても同様の試験を行い、GPG1ゲルと同様の結果が得られた。
　試験例4．初回ゲル化時のレオロジー
　GPG1を終濃度0.4w/v％になるように、10w/v%スクロース水溶液に溶解させ、得られたGPG1溶液をサンプルとした。
　レオロジー測定の方法は試験例3と同様である。4℃の溶液状態のサンプルを、37℃に調整したレオメーターMCR302にセットし、動的粘弾性測定を行った。測定した動的粘弾性は時間分散、周波数分散、歪み分散の3項目で、それぞれについて貯蔵弾性率 (G') と損失弾性率 (G") を計測した。一つのサンプルに対して初めは時間分散測定を行い、1 %の一定歪み、1 Hzの一定周波数で30秒毎に1ポイント、120ポイント分の計60分間測定した。続く周波数分散測定は1 %の一定歪みで、100-0.1 rad/sの角周波数の範囲で行った。最後に歪み分散測定を行い、1 Hzの一定周波数で、せん断ん歪みは0.1-100 %の範囲で行った。いずれのサンプルでも、歪み分散の測定結果から1 %歪みが線形領域にあることを観察している。
　結果を図３に示す。図3Aの時間分散測定から、測定開始直後1ポイント目 (30秒経過) では、G'が28 Pa、G"が56 PaとなりG'を G"が上回った。時間経過に伴ってG'は緩やかに増大、G"は緩やかに減少し、300秒経過時点でG'が G"を上回った。G'はさらに増大し続け、約1000秒経過し1000 Pa付近からその増加幅は緩やかになり測定終了時には約6000 Paとなった。G"もG'と類似した挙動を示し、最終的に約2000 Paとなった。図3Bの歪み分散測定においてG'は歪み0.1%から約1.46%歪みまでは緩やかに減少し、歪み1.46%以降は急激に減少した。一方でG"は歪み0.1%から約0.5%まで増加傾向にあり、歪み0.5%以降は減少に転じたものの傾きはG'よりも緩やかであった。歪み0.1%から約7%まではG'が G"を上回る弾性的な挙動を示した一方で、歪み約7%以降はG"がG'を上回り粘性的な挙動を示した。図3Cに示す周波数分散測定では、測定した0.1-100 rad/sの全周波数範囲においてG'が G"を上回る弾性的挙動を示した。G'と G"はいずれも103 Paのスケールで遷移し、低周波数領域から高周波数領域にかけて各値は緩やかに増加した。さらにtanδ (=G"/ G') で定義される損失正接tanδは0.330～0.390となった。
　また、GPG3ゲルについても同様の試験を行い、GPG1ゲルと同様の結果が得られた。
　試験例5．再ゲル化時のレオロジー（細胞無し）
　GPG1を終濃度0.8w/v％になるように、10w/v%スクロース水溶液に溶解させ、得られたGPG1溶液を45℃で1日静置することで初回ゲル化させた。これをボルテックス (Scientific Industries) で5秒間振とうすることでゲルをゾル化させた。ここに10w/v%スクロース水溶液を等量加え、ペプチド濃度0.4w/v％のゾルとした。これらゾルを再び昇温することでゲル化させることを以下、「再ゲル化」とする。　レオロジー測定の方法は試験例3と同様である。GPG1ゾル (ペプチド濃度0.4w/v％)を45℃インキュベーターから取り出した直後の状態から37℃に調整したレオメーターMCR302にセットし、試験例4と同様に動的粘弾性測定を行った。
　結果を図４に示す。図4Aに示す時間分散測定では、測定開始直後から測定終了時まで常にG'が G"を上回る様子が観察された。1ポイント目 (30秒経過) でのG'は233 Pa、G"は28 Paであった。G'およびG"は測定中常に類似した挙動で減少し続け、測定終了時にはG'が105 Pa、G"が13 Paとなった。図4Bに示す歪み分散測定では、17%歪みまでG'および G"の値が概ね一定の値を取る線形範囲にあることを観察した。さらに歪みをかけるとG'は増加し、41%歪みを超えて急激にその値が減少した。G"は線形範囲が41%歪みまで続き、以降は緩やかに減少した。G'とG"の支配の入れ替わりは観察されなかった。図4Cに示す周波数分散測定では、測定した0.1-100 rad/sの全周波数範囲においてG'がG"を上回る弾性的挙動を示した。低周波数領域から高周波数領域にかけてG'およびG"が緩やかに増加する様子が観察され、G'は101～102スケール、G"は100～101スケールで遷移し、tanδ (=G"/ G')は0.116～0.295となった。
　また、GPG3ゲルについても同様の試験を行い、GPG1ゲルと同様の結果が得られた。
　試験例6．再ゲル化時のレオロジー（細胞有り）
　GPG1を終濃度0.8w/v％になるように、10w/v%スクロース水溶液に溶解させ、得られたGPG1溶液を45℃で1日静置することで初回ゲル化させた。これをボルテックス (Scientific Industries) で5秒間振とうすることで各ゲルをゾル化させた。ここに、Panc-1細胞を10w/v%スクロース水溶液に懸濁させてなる細胞懸濁液を等量加え、ペプチド濃度0.4w/v％且つ細胞濃度2.0 × 106 cells/mLのゾルとした。当該ゾルを用いて、試験例5と同様にして測定した。
　結果を図５に示す。図5Aに示す時間分散測定では、測定開始直後から測定終了時まで常にG'が G"を上回る様子が観察された。1ポイント目 (30秒経過) でのG'は10578 Pa、G"は2913 Paであった。測定開始直後からG'は平衡状態にあり、緩やかな増加を続けた。G"も類似した挙動を示し、測定終了時にはG'は23487 Pa、G"は4742 Paとなった。図5Bに示す歪み分散測定では約2.84％歪みまではG'およびG"は概ね一定の値をとる線形範囲にあることを観察した。さらに歪みをかけるとG'は急激に減少し、G"は緩やかに減少した結果、41%歪み付近でG'とG"の支配が入れ替わる様子が観察された。図5Cに示す周波数分散測定では、測定した0.1-100 rad/sの全周波数範囲においてG'がG"を上回る弾性的挙動を示した。低周波数領域から高周波数領域にかけてG'およびG"が緩やかに増加する様子が観察され、G'は104スケールで、G"は103スケールで遷移し、tanδ (=G"/ G')は0.155～0.326となった。
　細胞無しの試験例5の結果を合わせると、GPGゾル／ゲルに細胞を懸濁させることにより、ゲルの弾性率が大幅に向上することが分かった。
　また、GPG3ゲルについても同様の試験を行い、GPG1ゲルと同様の結果が得られた。　なお、細胞懸濁によるゲル弾性率の向上は、コラーゲンゲルの場合には見られなかった。
　試験例7．ゲルのチクソトロピー性を利用した三次元細胞培養
　試験例6と同様にして得られた細胞懸濁ゾルを96ウェルプレート (Corning, Inc., U.S.A.) に50 μLずつ滴下し、37℃のインキュベーター内で10分間静置することでゲル化させ、Cell Layer を作製した。100 μLの細胞培地 (DMEM) を上から滴下し、CO2濃度5 %、37℃のインキュベーター内で各期間培養した。Cell Layer作製時を0日として、1日、3日、5日で上澄みの細胞培地を50 μL除去し、新しい細胞培地を50 μL滴下することで細胞培地を交換した。0日、2日、4日、及び7日に、マイクロピペットでピペッティングすることでゲルをゾル化させてPBSに分散させた。
　0日、2日、4日、及び7日におけるゲル中の細胞、及びゾル化後にPBSに分散させた状態の細胞について、位相差顕微鏡で観察した。観察像を図６に示す。GPGゲルを用いて培養することにより、スフェロイドが形成されることが分かった。また、GPGゲルのチクソトロピー性を使用することにより、細胞を簡便に回収でき、またスフェロイドを壊さずに回収できることが分かった。
　なお、コラーゲンゲルを用いて同様に三次元培養を行った場合にもスフェロイドが形成されたが、ピペッティングでは回収できず、コラゲナーゼによる酵素処理後に回収できた。
　試験例8．二次元細胞培養培養
　NIH/3T3細胞をGPG1ゲル上で37℃で二次元培養した。培養後に常温（15℃程度）で10分間程度放置したところ、細胞がシート状に剥がれてきた。GPGは温度応答性を示すので、常温で親水性を示すようになり、このため細胞が剥がれたと考えられた。以上より、GPGゲル上で細胞を二次元培養することにより、細胞シートを容易に回収できることが分かった。
　試験例9．ゲルのチクソトロピー性を利用した三次元細胞培養（筋芽細胞C2C12）
　GPG3を終濃度0.8 w/v%となるように10 w/v%スクロースに溶解させ、得られたGPG3溶液を45℃で2日静置することで初回ゲル化させた。これをボルテックスで5秒間振とうすることでゲルをゾル化させた。マイクロピペットを用いて50 μLのゾルを細胞培養容器に滴下し、続いて、マウス由来筋芽細胞株C2C12（理化学研究所CELL BANK）4×106 cells/mLを10 w/v%スクロースに分散させた懸濁液を50 μL混合して再ゲル化させた。これにより、GPG3の終濃度が0.4 w/v%、細胞濃度が2×106 cells/mLのGPG3ゲルを作製した。ここに10 v/v%の牛胎児血清 (FBS) を含むDMEM培地1 mLを上層し、37℃、5% CO2濃度で培養を開始した。1日ごとに300 μLの培地交換を行い、3日目に培地を分化誘導培地（ウマ血清2 v/v%を含むDMEM培地）に切り替えた。分化誘導後、7日間の培養を行った。
　培養開始から4時間後および3日後に、Cell Counting Kit-8 (CCK-8, DOJINDO) を用いて細胞数の評価を行った。手順として、まず培地をマイクロピペットで吸い取り、残ったゲルをピペッテイングによりゾル化してマイクロチューブに回収した。卓上遠心機を用い1000 rpmで細胞を沈殿させ、上澄み液 100 μLをバックグラウンドとして96穴プレートに回収した後、残りの上澄み液を取り除いた。沈殿した細胞をDMEM培地150 μLに分散し、そのうち100 μLを96穴プレートに移動した。バックグラウンドおよびサンプルを含むウェルのそれぞれにCCK溶液を10 μLずつ加え、37℃のインキュベーターで3時間静置した後、マイクロプレートリーダー（EPOCH2; BioTek）を用い450 nmの吸光度を測定した。サンプルとバックグラウンドの吸光度の差が、生細胞数に比例するとして細胞増殖率を見積もった（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　分化誘導開始から7日後には、位相差顕微鏡（BZ-X700, KEYENCE）によりゲル内で筋状の細胞が観察された（図７）。またゲル全体が骨格筋特異的な発現マーカー α-actininで免疫染色されたことから（図８）、GPG3ゲル内における筋芽細胞の培養と、骨格筋細胞への分化が可能であることが示唆された。
　免疫染色の手順は以下のとおりである。培地をアスピレーターにより吸引し、ゲルをリン酸緩衝整理食塩水 (PBS) 300 μLで2回洗浄した。4 %パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液を400 μL加え、4℃で30分間静置した後、PBS 300 μLで2回洗浄した。また、ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテルをPBSで希釈して濃度0.5%の溶液を作製し、これをTriton X-100溶液とした。これをゲル上に400 μL加え、4℃で25分間静置した後、PBS 300 μLで2回洗浄した。一方、PBSでウシ血清由来コーンフラクションVを希釈して濃度1.0%の溶液を作製し、これをBSA溶液とした。BSA溶液をゲル上に400 μL加え、室温で1時間静置し、PBS 300 μLで2回洗浄した。ここにBSA溶液で200倍に希釈した Sarcomeric alpha Actinin Monoclonal Antibody (EA-53, Thermo Fisher Scientific) を一次抗体として400 μL加え、4℃で16時間静置し、PBS 300 μLで2回洗浄した。さらにBSA溶液に濃度0.1%となるようにGoat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa FluorTM Plus 488 (Thermo Fisher Scientific) を加えて二次抗体とし、これを400 μLゲル上に添加し、室温・遮光状態で1時間静置し、PBS 300 μLで2回洗浄した。また、PBS 2 mLにNucBlueTM Fixed Cell ReadyProbesTM reagent (Thermo Fisher Scientific) を4滴加えて核染色溶液とした。この核染色溶液をゲル上に400 μL加え、室温・遮光状態で5分間静置した。PBS 300 μLで１回洗浄し、蛍光顕微鏡（BZ-X700, KEYENCE）を用いて観察した。

Claims (10)

  1. （配列番号1：X1GGX2G）nからなるG配列ブロック（式中、X1は同一又は異なってV又はLを示し、X2は同一又は異なってV又はLを示し、nは4以上の整数を示す。）と（配列番号2：VPGX3G）mからなるP配列ブロック（式中、X3は同一又は異なって任意のアミノ酸を示し、mは5以上の整数を示す。）を含むエラスチン様ブロックペプチド配列を含むポリペプチドを含有するゲル状又はゲル形成性ゾル状の組成物、又は前記組成物の乾燥物を含む、細胞培養又は増殖基材。
  2. 前記エラスチン様ブロックペプチド配列の配列構造が、N末端側から、G配列ブロック－P配列ブロック－G配列ブロック、G配列ブロック－P配列ブロック－P配列ブロック－G配列ブロック、P配列ブロック－G配列ブロック、又はG配列ブロック－P配列ブロックである、請求項１に記載の細胞培養又は増殖基材。
  3. 細胞の三次元培養又は三次元増殖に用いるための、請求項１に記載の細胞培養又は増殖基材。
  4. 細胞の二次元培養又は二次元増殖に用いるための、請求項１に記載の細胞培養又は増殖基材。
  5. 前記組成物が細胞を保持する、請求項１～４のいずれかに記載の細胞培養又は増殖基材。
  6. 前記組成物における前記ポリペプチド濃度が0.2w/v％以上である、請求項１～４のいずれかに記載の細胞培養又は増殖基材。
  7. 前記組成物における前記ポリペプチド濃度が0.2～3w/v％である、請求項１～４のいずれかに記載の細胞培養又は増殖基材。
  8. ゲル状の前記組成物をゾル化させて用いるため、且つ／或いはゾル状の前記組成物をゲル化させて用いるための、請求項１～４のいずれかに記載の細胞培養又は増殖基材。
  9. 請求項１～４のいずれかに記載の細胞培養又は増殖基材で細胞を培養する又は増殖させることを含む、細胞培養又は増殖方法。
  10. 請求項９に記載の細胞培養又は増殖方法によって得られ得る、細胞集団。 
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