CN116603103A

CN116603103A - 骨形成促进材料

Info

Publication number: CN116603103A
Application number: CN202310424217.4A
Authority: CN
Inventors: 安藤圭; 石黑直树; 今釜史郎; 伊藤全哉; 横山康弘; 横井秀典; 永井祐介
Original assignee: Nagoya University NUC; Menicon Co Ltd
Current assignee: Nagoya University NUC; Menicon Co Ltd
Priority date: 2014-06-30
Filing date: 2015-06-29
Publication date: 2023-08-18
Also published as: CN106573019A; EP3162374A1; US20170119825A1; JP6042038B2; WO2016002717A1; JPWO2016002717A1; EP3162374A4; US10821136B2

Abstract

本申请涉及骨形成促进材料。本发明提供一种生物体安全性高、可促进骨形成的骨形成促进材料。本发明的骨形成促进材料含有在中性pH的水溶液中可形成β片层结构的自组装肽和骨片。构成该自组装肽的氨基酸残基在pH7.0时的电荷的总和不为0。

Description

骨形成促进材料

本申请是申请日为2015年6月29日、申请号为“201580036020.7”、发明名称为“骨形成促进材料”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/JP2015/068683的中国国家阶段申请。

技术领域

本发明涉及一种骨形成促进材料。更详细而言，涉及一种含有自组装肽和骨片的骨形成促进材料。

背景技术

脊椎不仅具有支撑身体重力的作用，而且也具有保护作为中枢神经的脊髓的作用。在整形外科、特别是脊椎相关的领域中，压迫脊髓等神经的疾病(例如脊髓型颈椎病)或脊椎的骨折成为很大的问题。对于脊髓压迫，不得不采取将压迫脊髓的骨切除的应对方法。通常，对因切除而变得不稳定的脊椎实施由自身采取的骨的移植、或进行使用金属螺栓或板等金属的固定术。

另外，骨折治疗的基本方法为复位和固定，一般采用使用金属进行固定而使骨癒合的方法。但是，在四肢骨折的情况下，需要2～3个月的长期的癒合期间，脊椎骨折需要半年至1年以上的长期的癒合期间。其中，在高龄者的情况下，由于骨自身变弱，因此有可能在骨癒合之前再次骨折，或者用于固定的金属有可能发生偏离。另外，股骨颈骨折或脊椎骨折有时需要安静卧床，因此，还有可能发生废用综合征并需要护理。

近年来，开发有各种手术方法或固定材料，骨折的治癒率提高。但是，依然产生延迟治癒(骨癒合延迟)或假关节(骨癒合停止)这样的后遗症。另外，在脊椎手术中，在用于脊椎再建的脊椎固定术中，正在开发更有效的移植或手术技术。但是，当用于骨再生功能降低的高龄者的情况下，骨癒合有可能不能适当地进行。

近年来，作为促进骨再生的方法，尝试了将成骨细胞等培养细胞移植至患部的方法、或对患部放置细胞支架等。作为该细胞支架，例如可使用以明胶和骨胶原为代表的细胞外基质，但明胶和骨胶原存在根据作为材料供给源的动物等而用途受限的缺点。与之相对，有报告在将完全合成的自组装肽单独投与或与骨分化诱导因子混合投与时，促进骨再生(专利文献1、专利文献2、专利文献3、非专利文献1)。但是，含有迄今为止报告的促进骨再生的自组装肽的骨形成促进材料在接近于生物体内环境的中性条件下，难以确保充分的强度。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2012-82180号公报

专利文献2：日本特表2010-504972号公报

专利文献3：国际公开第2007/000979号

非专利文献

非专利文献1：Cell Transplantation，Vol.15，p903-910，2006

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供一种生物体安全性高、可促进骨形成的骨形成促进材料。

用于解决课题的技术方案

本发明的骨形成促进材料含有在中性pH的水溶液中可形成β片层结构的自组装肽和骨片。构成该自组装肽的氨基酸残基在pH7.0时的电荷的总和不为0。

在一个实施方式中，上述自组装肽为包含下述氨基酸序列的自组装肽。

氨基酸序列：a₁b₁c₁b₂a₂b₃db₄a₃b₅c₂b₆a₄

(该氨基酸序列中，a₁～a4为碱性氨基酸残基；b₁～b₆为不带电荷极性氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基，且其中的至少5个为疏水性氨基酸残基；c₁和c₂为酸性氨基酸残基；d为疏水性氨基酸残基。)

在一个实施方式中，上述骨形成促进材料还含有血液和/或源自血液的成分。

在一个实施方式中，上述骨形成促进材料还含有骨形成因子。

在一个实施方式中，上述骨形成促进材料与骨形成促进材料用保持器具组合使用。

在本发明的其它方面，提供一种骨形成促进材料用保持器具。本发明的骨形成促进材料用保持器具与上述骨形成促进材料一起使用。

在一个实施方式中，上述骨形成促进材料用保持器具由碳系材料、工程树脂或者超级工程树脂构成。

发明的效果

根据本发明，能够提供一种生物体安全性高、可促进骨形成的骨形成促进材料。本发明的骨形成促进材料含有在中性pH的水溶液中可形成β片层结构的自组装肽和骨片。由此，形成许多骨形成的起点，可以很好地促进骨形成。因此，在骨自身的强度和骨再生能力降低的高龄者中也能够提高骨形成。另外，本发明的骨形成促进材料能够不使用直接参与骨形成的细胞等而诱导骨新生。进而，本发明中使用的自组装肽在中性pH的水溶液中形成β片层结构，构成上述自组装肽的氨基酸残基在pH7.0时的电荷的总和不为0。因此，本发明的骨形成促进材料在接近于生物体环境的中性pH下能够发挥充分的强度。进而，使用本发明的骨形成促进材料用保持器具等适当的保持器具，能够将骨形成促进材料固定于所期望的位置。

附图说明

图1A是培养0天后的MC3T3-El细胞的照片和培养1天后的MC3T3-E1细胞的照片及进行了ALP染色的照片。

图1B是培养7天后的MC3T3-E1细胞的照片及进行了ALP染色的照片。

图1C是培养14天后的MC3T3-E1细胞的照片及进行了ALP染色的照片。

图1D是培养28天后的MC3T3-E1细胞的照片及进行了ALP染色的照片。

图2是表示培养1天后、7天后、14天后和28天后的各细胞中的骨形成标记物的表达量的图表。

图3是实施例1～3的骨形成促进材料和比较例1的骨形成促进材料在培养14天后和28天后的照片及进行了ALP染色的照片。

图4是用于股骨缺损模型制作的外固定器的照片。

图5是用于股骨缺损模型制作的护架(cage)的照片。

图6是进行了外固定的小鼠的股骨的照片。

图7是外固定经过56天后的小鼠股骨的X射线图像。

图8是外固定经过56天后的小鼠股骨的CT图像。

图9(a)是实施例5的骨片(born chip)添加前的凝胶的照片，图9(b)是实施例6的骨片添加前的凝胶的照片，图9(c)是比较例2的骨片添加前的凝胶的照片。

图10(a)是实施例5的骨片添加后的凝胶(骨形成促进材料)的照片，图10(b)是实施例6的骨片添加后的凝胶(骨形成促进材料)的照片，图10(c)是比较例2的骨片添加后的凝胶(骨形成促进材料)的照片。

具体实施方式

[A.骨形成促进材料]

本发明的骨形成促进材料含有在中性pH的水溶液中可形成β片层结构的自组装肽和骨片。构成该自组装肽的氨基酸残基在pH7.0时的电荷的总和不为0。在一个实施方式中，本发明的骨形成促进材料还含有血液和/或源自血液的成分。另外，在其它实施方式中，本发明的骨形成促进材料还含有骨形成因子。

本发明的骨形成促进材料使用旋转式流变仪测定动态粘弹性，在37℃的储存弹性模量(G’)例如为1Pa～5000Pa，优选为1Pa～4000Pa，更优选为1Pa～3000Pa。如果储存弹性模量在该范围内，则可以与后述的本发明的骨形成促进材料用保持器具并用，很好地促进骨形成。此外，本说明书中所说的储存弹性模量是指进行频率变化测定时的角振动数为1弧度/秒时的值。

[A-1.自组装肽]

作为自组装肽，可使用在水溶液中通过肽分子彼此的相互作用而自发聚集并可形成凝胶的任意适当的肽。本发明中使用的自组装肽在中性pH时可形成β片层结构。更具体而言，可以优选使用在水溶液中通过肽分子彼此的相互作用而自发聚集并形成纤维状分子集合体、通过该分子集合体间的相互作用使三维网眼结构发展而可形成凝胶的肽。作为肽分子彼此的相互作用，可列举例如：氢键、离子间相互作用、范德华力等静电相互作用和疏水性相互作用。其中，本说明书中，“中性pH(中性区域)”是指：pH5.0～8.0、优选pH5.5～7.5、更优选pH6.0～7.0、进一步优选pH7.0的区域。

构成自组装肽的氨基酸可以为L-氨基酸，也可以为D-氨基酸。优选为L-氨基酸。另外，可以为天然氨基酸，也可以为非天然氨基酸。从可以低价格获得、肽合成容易的方面考虑，优选为天然氨基酸。

构成自组装肽的氨基酸残基在pH7.0时的电荷的总和不为0。该电荷的总和优选为-3～-1或+1～+3，更优选为-3、-2、+2或+3。这是因为，这样的话，在中性区域中源自自组装肽中所含的氨基酸残基的侧链的正电荷和负电荷不相抵，从而保持适于凝胶形成的静电引力与斥力的平衡，作为其结果，在中性区域可形成透明且稳定的凝胶。

各pH中的上述自组装肽的电荷可以在PROTEIN CALCULATOR v3.4的网站(http：//protcalc.source forge.net/)上通过可利用的程序来进行。

作为本发明中可优选使用的自组装肽的具体例，可列举包含下述式(I)的氨基酸序列的肽。

a₁b₁c₁b₂a₂b₃db₄a₃b_sc₂b₆a₄ (I)

(该氨基酸序列中，a₁～a₄为碱性氨基酸残基；b₁～b₆为不带电荷极性氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基，且其中的至少5个为疏水性氨基酸残基；c₁和c₂为酸性氨基酸残基；d为疏水性氨基酸残基。)

上述氨基酸序列中，a₁～a₄为碱性氨基酸残基。碱性氨基酸优选为精氨酸、赖氨酸或组氨酸，更优选为精氨酸或赖氨酸。这是因为这些氨基酸的碱性强。a₁～a₄可以为相同的氨基酸残基，也可以为不同的氨基酸残基。

上述氨基酸序列中，b₁～b₆为不带电荷极性氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基，其中的至少5个为疏水性氨基酸残基。疏水性氨基酸优选为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甘氨酸或脯氨酸。不带电荷极性氨基酸优选为酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或半胱氨酸。这是因为这些氨基酸容易获得。

优选b₃和b₄分别独立地为任意适当的疏水性氨基酸残基，进一步优选为亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基或异亮氨酸残基，特别优选为亮氨酸残基或丙氨酸残基。

优选b₁～b₆全部为疏水性氨基酸残基。这是因为自组装肽很好地形成β片层结构，可以进行自组装。更优选b₁～b₆分别独立地为亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基或异亮氨酸残基，进一步优选为亮氨酸残基或丙氨酸残基。在优选的实施方式中，b₁～b₆中的4个以上为亮氨酸残基，更优选其中的5个以上为亮氨酸残基，进一步优选全部为亮氨酸残基。

上述氨基酸序列中，c₁和c₂为酸性氨基酸残基。酸性氨基酸优选为天冬氨酸或甘氨酸。这是因为这些氨基酸容易获得。c₁和c₂可以为相同的氨基酸残基，也可以为不同的氨基酸残基。

上述氨基酸序列中，d为疏水性氨基酸残基。d优选为丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基或异亮氨酸残基。

在一个优选的实施方式中，b₃、d、b₄的连续的3个氨基酸残基中的2个为亮氨酸残基，剩余为丙氨酸残基。该情况下，b₃、d、b₄的任一种可以为丙氨酸残基。另外，在其它的优选的实施方式中，b₃、d、b₄的连续的3个氨基酸残基全部为亮氨酸残基。

以下例示式(I)的氨基酸序列的优选的具体例。

n-RLDLRLALRLDLR-c(序列号1)

n-RLDLRLLLRLDLR-c(序列号2)

n-RADLRLALRLDLR-c(序列号3)

n-RLDLRLALRLDAR-c(序列号4)

n-RADLRLLLRLDLR-c(序列号5)

n-RADLRLLLRLDAR-c(序列号6)

n-RLDLRALLRLDLR-c(序列号7)

n-RLDLRLLARLDLR-c(序列号8)

作为本发明中可优选使用的其它的自组装肽，可列举WO2007/000979中记载的肽，即，一种具有极性氨基酸残基和非极性氨基酸残基(疏水性氨基酸残基)的自组装肽，其中，作为该极性氨基酸残基含有酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基，在中性区域中，该酸性氨基酸残基的电荷与该碱性氨基酸残基的电荷的总和为除0之外的数，在水溶液中进行自组装时可形成该非极性氨基酸残基仅在一面配置的β-片材结构。

在上述自组装肽中，作为极性氨基酸，优选含有酸性氨基酸残基、碱性氨基酸残基和不带电荷极性氨基酸的肽。以下例示所述的自组装肽的优选的具体例。

n-RASARADARASARADA-c(序列号9)

n-RANARADARANARADA-c(序列号10)

n-RAAARADARAAARADA-c(序列号11)

n-RASARADARADARASA-c(序列号12)

n-RADARASARASARADA-c(序列号13)

n-RASARASARASARADA-c(序列号14)

n-RASARADARASA-c(序列号15)

n-KASAKAEAKASAKAEA-c(序列号16)

n-SAEAKAEASAEAKAEA-c(序列号17)

n-KLSLKLDLKLSL-c(序列号18)

n-KLALKLDLKLAL-c(序列号19)

上述自组装肽可通过任意适当的制造方法而制造。可列举例如：Fmoc法等固相法或液相法等化学合成方法、基因重组表达等分子生物学的方法。

上述自组装肽可以根据目的等而实施任意适当的修饰。进行修饰的部位没有特别限定，可列举例如：自组装肽的N末端氨基、C末端羧基、或其两者。

作为上述修饰，在修饰后的肽具有自组装能力的范围内可选择任意适当的修饰。可列举例如：N末端氨基的乙酰化、C末端羧基的酰胺化等保护基的导入；烷基化、酯化或卤化等官能团的导入；氢化；单糖、二糖、寡糖或多糖等糖化合物的导入；脂肪酸、磷脂或糖脂等脂质化合物的导入；氨基酸或蛋白质的导入；DNA的导入；其它具有生理活性的化合物等的导入。就修饰而言，可以进行仅1种，也可以组合而进行2种以上。例如，可以将在上述自组装肽的C末端导入有所期望的氨基酸的附加肽的N末端进行乙酰化，将C末端进行酰胺化。

在导入氨基酸或蛋白质的情况下，被导入的氨基酸的数量优选为1～180，更优选为1～50，进一步优选为1～30，特别优选为1～10，最优选为1～5。导入的氨基酸残基数量超过180时，有时损害自组装能力。

本发明的骨形成促进材料可以含有仅1种自组装肽，也可以含有2种以上的自组装肽。

本发明的骨形成促进材料中的自组装肽的浓度可根据组成、用途等而适当设定。自组装肽的浓度优选为0.1重量％～5.0重量％、更优选0.1重量％～3.0重量％、进一步优选0.1重量％～2.0重量％。如果为上述范围的浓度，则能够很好地获得本发明的效果。

[A-2.骨片]

本发明中使用的骨片可以是使用本发明的骨形成促进材料进行治疗的患者自身的骨，也可以是其他人的骨。另外，可以是从要应用骨形成促进材料的部位采取的骨，也可以是从其它部位采取的骨。作为用作骨片的骨，例如可以使用为了除压而切除的骨片等。

上述骨片可以直接使用采取的骨片，也可以在实施任意适当的前处理之后进行使用。作为前处理，可列举例如通过用磷酸缓冲生理盐水(PBS)进行灌流的清洗、干燥等。

上述骨片的大小没有特别限制，根据应用骨形成促进材料的部位可以为任意适当的大小。例如可以直接使用采取的骨片，也可以制成所期望的厚度的切片，也可以加工成任意适当的大小(例如粉末状)而使用。在直接应用采取的骨片的情况下，骨片的大小例如为0.5mm～5.0mm，优选为1.0mm～4.0mm。另外，在加工成任意适当的大小(例如粉末状)而使用的情况下，骨片的大小例如为0.01mm～0.5mm，优选为0.02mm～0.4mm。骨片的大小优选为0.03mm～0.3mm，更优选为0.04mm～0.2mm。通过骨片的大小为上述的范围内，能够更好地促进骨形成。本说明书中，骨片的大小是指在一个骨片中最大尺寸的部分的大小。

上述骨片可以通过任意适当的手段加工成所期望的大小。可列举例如粉碎磨机等。

本发明的骨形成促进材料中的骨片的含量优选相对于自组装肽凝胶100重量份为1重量份～100重量份，更优选为1重量份～90重量份。通过骨片的含量为上述的范围内，能够更好地促进骨形成。此外，本说明书中，作为基准的自组装肽凝胶是指仅由自组装肽和水构成的凝胶。

[A-3.血液和源自血液的成分]

本发明的骨形成促进材料优选还含有血液和/或源自血液的成分。通过还含有血液和/或源自血液的成分，可以得到软骨形成的诱导促进的效果。作为源自血液的成分，可列举例如：红细胞、白细胞、血小板、血浆等。这些源自血液的成分可以单独使用，也可以组合使用2种以上。

上述血液和/或源自血液的成分可以从患者中采取，也可以从其他人采取。另外，可以使用全血制剂、红细胞制剂、血浆制剂、血小板制剂等血液制剂。

本发明的骨形成促进材料中的血液和/或源自血液的成分的浓度优选为0.001ppm～1000ppm，更优选为0.01ppm～1000ppm。通过血液和/或源自血液的成分的浓度为上述的范围内，能够更好地促进骨形成。

[A-4.骨形成因子]

本发明的骨形成促进材料优选还含有骨形成因子(Bone MorphogeneticProtein，BMP)。通过还含有骨形成因子，本发明的骨形成促进材料能够进一步促进骨形成。作为骨形成因子的具体例，可列举：BMP2、BMP4等BMP2/4系BMP；BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b等OP-1系BMP；BMP9、BMP10等BMP9系BMP；GDF5、GDF6、GDF7等GDF5系的BMP等。作为上述骨形成因子，从能够很好地促进骨形成的方面考虑，优选BMP-2。此外，在与上述骨形成因子具有同等骨形成促进作用的范围内，可以对骨形成因子适当修饰。另外，可以使用人重组骨形成因子(rhBMP)作为骨形成因子。骨形成因子可以单独使用，也可以组合使用2种以上。由于这些人BMP已经被克隆，因此，可以基于其碱序列通过基因工程的方法得到。

本发明的骨形成促进材料中的骨形成因子的浓度通常为0.001ppm～1000ppm，优选为0.01ppm～1000ppm。

如果为该浓度范围，则能够很好地发挥生理活性物质的作用，促进骨形成。

[A-5.其它生理活性物质]

本发明的骨形成促进材料可以还含有上述骨形成因子以外的生理活性物质。作为本发明的骨形成促进材料可以含有的生理活性物质，可列举：诱导或促进骨或软骨的分化的分化控制因子(例如TGF-β)；生长激素；EGF、FGF等细胞功能控制因子；干扰素、白细胞介素等免疫或炎症相关因子；等。

本发明的骨形成促进材料中的生理活性物质的浓度通常为0.001ppm～1000ppm，优选为0.01ppm～1000ppm。如果为该浓度范围，则能够很好地发挥生理活性物质的作用并促进骨形成。

[A-6.其它添加物]

本发明的骨形成促进材料根据需要还可以含有任意适当的添加物。作为添加物的具体例，可列举：pH调整剂；缓冲剂；张度剂；盐类；氨基酸类；维生素类；醇类；蛋白质；药物等。这些添加物可以单独使用，也可以组合使用2种以上。

作为pH调整剂，可列举：盐酸、柠檬酸、醋酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钠等。

作为缓冲剂，可列举：磷酸、磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等磷酸盐；硼酸、硼砂、硼酸钠、硼酸钾等硼酸盐；柠檬酸钠、柠檬酸二钠等柠檬酸盐；醋酸钠、醋酸钾等醋酸盐、Tris、HEPES等。

作为张度剂，可列举：氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁等氯化物；葡萄糖、果糖、半乳糖等单糖；蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖等二糖；甘露糖醇、山梨糖醇等糖醇；等。

作为盐类，可使用上述中例示的添加物以外的任意适当的盐。可列举例如硫酸钠、硫酸镁等。

上述添加物的添加量可根据其目的等设定为任意适当的值。

[B.制备方法]

本发明的骨形成促进材料可以通过任意适当的方法而制备。例如，通过将自组装肽、水和其它任意成分混合之后静置而制备自组装肽凝胶，将该凝胶和骨片混合而制备。本发明中使用的自组装肽在溶液中通过肽分子彼此的相互作用自发聚集而形成纤维状的分子集合体，进一步继续静置，由此，通过该分子集合体间的相互作用而使三维网眼结构发展，成为凝胶的形态。静置时间和静置温度可根据投与对象、自组装肽的浓度和种类等适当地设定。作为上述水，可优选使用离子交换水、蒸馏水等被精制的水。

作为骨片，在使用尺寸小的骨片(例如粉末状的骨片)的情况下，从可以均匀地分散的方面考虑，优选将自组装肽凝胶与骨片混合。另外，在使用尺寸大的骨片(例如3mm左右的骨片)作为骨片的情况下，可以将自组装肽凝胶与骨片混合，也可以不将该凝胶与骨片混合(可以仅在凝胶内添加骨片)。作为混合方法，没有特别限制，只要使用任意适当的手段混合即可。

本发明的骨形成促进材料的制备方法可以还含有：过滤等精制；高压蒸气灭菌、放射线灭菌、干热灭菌等灭菌；向包装容器分注；等任意的工序。

[C.骨形成促进材料用保持器具]

在一个实施方式中，本发明的骨形成促进材料与骨形成促进材料用保持器具一起使用。上述骨形成促进材料在接近于生物体内环境的中性pH下具有充分的强度。通过将该骨形成促进材料用本发明的保持器具固定，可以将骨形成促进材料保持在投与对象部位。由此，能够在目标投与对象部位中促进骨形成，例如能够促进骨癒合。

骨形成促进材料用保持器具优选为网、或具有网眼状的结构的器具。通过为这样的形态，本发明的保持器具可以不对投与对象部位施加过度的负荷而保持骨形成的促进。因此，例如即使在骨自身的强度降低的高龄者中，也能够不对骨施加负担而适合地使用。另外，在骨折的情况下，在形状复杂的部位进行固定是很困难的。但是，由于本发明的骨形成促进材料用保持器具可以使用网，因此也可以追随于复杂形状的部位，从而能够良好地保持骨形成促进材料。作为具有网眼状的结构的器具，可列举例如支架。

从生物体安全性优异的方面考虑，本发明的骨形成促进材料用保持器具优选由碳系材料构成。作为碳系材料，可以使用任意适当的材料。作为碳系材料，可列举例如碳系纤维、碳纳米管等。作为碳系材料，优选碳系纤维、碳纳米管。

另外，作为骨形成促进材料用保持器具，可以使用任意适当的整形移植制品。具体而言，可列举护架(cage)、螺钉(screw)、棒(rod)等。

整形移植制品可由任意适当的材料构成。可列举例如：纯钛、钛合金、钛镍合金、钴铬等金属、聚碳酸酯树脂；聚缩醛树脂；聚乙烯对苯二甲酸酯、聚丁烯对苯二甲酸酯、聚环亚己基二甲基对苯二甲酸酯等聚酯树脂；聚苯醚树脂；聚苯醚；尼龙6、尼龙66、芳香族聚酰胺等聚酰胺树脂；间规聚苯乙烯；超高分子量聚乙烯等工程树脂、和聚苯硫醚树脂、聚砜树脂、聚醚砜树脂、聚醚醚酮树脂、聚芳酯树脂、液晶聚合物、芳香族聚酯树脂、聚酰亚胺树脂、聚酰胺酰亚胺树脂、聚醚酰亚胺树脂、芳族聚酰胺树脂等超级工程树脂等。从高耐热性、机械强度、耐药品性和耐磨耗性优异的方面考虑，优选使用工程树脂或超级工程树脂制的整形移植制品。另外，工程树脂或超级工程树脂可以含有碳纤维等强化材料。

[D.骨形成促进材料的使用方法]

本发明的骨形成促进材料在一个实施方式中以凝胶的形态投与，可以优选使用尺寸小的骨片(例如粉末状的骨片)。因此，可以用注射器等容易地投与，也可以填充于复杂或狭小的投与对象部位(例如骨裂缝的缝隙)。

在其它的实施方式中，本发明的骨形成促进材料通过将骨形成促进材料凝胶化之后，投与(注入)于投与对象部位而使用。通过将骨形成促进材料凝胶化，可以在骨形成促进材料中维持骨片良好分散的状态。因此，能够很好地发挥本发明的骨形成促进材料的骨形成促进效果。

向骨形成促进材料的投与对象部位的注入可以使用注射器、管、吸液管等任意适当的手段而进行。

本发明的骨形成促进材料中所含的自组装肽的生物体分解性优异。另外，本发明的骨形成促进材料中所含的骨片使骨形成进行，有助于新骨形成。此外，本发明的骨形成促进材料中所含的骨片在自组装肽分解后也残存于投与对象部位，可成为癒合骨的一部分。

进而，在其它的实施方式中，本发明的骨形成促进材料与上述骨形成促进材料用保持器具一起使用。例如，在投与对象部位投与凝胶状的骨形成促进材料之后，使用网形态的骨形成促进材料用保持器具包覆投与对象部位和骨形成促进材料，由此可以保持骨形成促进材料。进而，可以在骨形成促进材料用保持器具(例如护架)内填充骨形成促进材料之后，将该保持器具安装于投与对象部位。另外，可以在预先将骨形成促进材料用保持器具(例如支架)应用于投与对象部位的状态下，在投与对象部位投与例如凝胶形态的骨形成促进材料而使用。在该实施方式中，骨形成促进材料和保持器具可进行一体化。但是，本发明的骨形成促进材料中所含的自组装肽由于生物体分解性优异，因此随着时间而被吸收、分解，骨片可成为癒合骨的一部分。因此，在骨形成结束之后，根据需要可以仅除去骨形成促进材料用保持器具。

本发明的骨形成促进材料可以根据需要并用任意适当的固定方法。例如，由于脊椎是不断被施加很大负荷的部位，因此需要更稳定地固定。因此，例如在将本发明的骨形成促进材料应用于脊椎骨折的情况下，通过与作为现有的固定方法的板或螺钉一起使用本发明的骨形成促进材料，在稳定地固定的状态下促进骨形成，可以在更适当的状态下促进骨癒合。

本发明的骨形成促进材料例如可用于骨组织、牙周组织等中的缺损部位的修复等。另外，本发明的骨形成促进材料能够在减轻对骨的负荷的同时促进骨形成。因此，也能够很好地应用于担心骨强度降低或骨再生功能降低的高龄者。

实施例

以下，通过实施例具体地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。

[试验例1：细胞培养试验]

将自组装肽凝胶1(株式会社Menicon制，商品名：Panacea Gel SPG-178-208(含有N末端被乙酰化、C末端被酰胺化的序列号1的肽(SPG-178)(构成自组装肽的氨基酸残基的中性区域(pH7.0)中的电荷的总和：+2)的肽凝胶，肽浓度：0.8w/w％)6μl在4℃下静置1.5小时。接着，添加培养基(在MEMα中添加了10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素链霉素(PenStrep)溶液的培养基)500μl，在37℃下静置1小时后，更换培养基，添加于24孔板。在添加的24孔板上以50,000细胞/孔的方式接种MC3T3-E1细胞，在室温下培养24小时后，将培养基更换为分化诱导培养基(在上述培养基上进一步添加了1％抗坏血酸、0.2％氢化可的松、2％β-甘油磷酸盐的培养基)，在室温下进行细胞培养。另外，作为比较，使用自组装肽凝胶C1(3Dmatrix公司制，制品名“Puramatrix^TM”，Ac-RADARADARADARADA-CONH₂的肽浓度1重量％的凝胶)取代自组装肽凝胶1，除此以外同样地进行，进行细胞培养。此外，不添加自组装肽凝胶，也同样地进行仅细胞的培养。在从培养开始1天后、7天后、14天后、28天后，进行细胞的ALP染色和RNA提取。RNA表达量通过RT-PCR进行测定。关于碱性磷酸酶(ALP)染色，用以下的方法进行。

(ALP染色)

使用Histofine SAB-PO(R)试剂盒(Nichirei Biosciences公司制)进行染色处理。从各孔中吸取培养基，用磷酸缓冲生理盐水(PBS)清洗3次。接着，用4％多聚甲醛(PFA)固定，静置10分钟后，用PBS清洗3次。其后，在0.2％Triton X(注册商标)-PBS溶液中进行透化处理，静置10分钟，用PBS清洗3次。添加封闭试剂I(3％过氧化氢加甲醇)之后，静置10分钟～15分钟，用PBS清洗3次。其后，添加封闭试剂II(10％山羊正常血清)之后，静置10分钟，添加第一抗体(ALP抗体：abcam Anti-Alkaline Phosphatase，Tissue Non-Specific[EPR4477]antibody ab 108337)并静置2小时后，用PBS清洗3次。接着，添加第二抗体(生物素标记抗兔IgG抗体)并静置10分钟，用PBS清洗3次。接着，添加酶试剂(过氧化物酶标记抗生蛋白链菌素)并静置5分钟后，用PBS清洗3次。接着，将底物溶液(DAB底物试剂盒：显色底物(试剂A)2滴(约40μl)和底物缓冲液(试剂B)2滴(约40μl)加入于精制水1ml，以不起泡的方式混合，加入显色试剂(试剂C)1滴(约40μl)以不起泡的方式混合成的溶液)，静置5分钟～20分钟，用精制水清洗3次。接着，进行对比染色(苏木素)，静置2分钟，用水进行显色，静置10分钟，用显微镜进行观察。

<结果>

将培养0天后、1天后、7天后、14天后、28天后的细胞的显微镜照片和进行了ALP染色的照片示于图1A～图1D。通过ALP染色，作为骨形成标记物的ALP被染色。在使用了自组装肽凝胶1的情况下，被ALP染色的成骨细胞凝集，可以认为能够充分地诱导骨形成(图1)。另一方面，在仅将细胞进行培养的情况下，不进行细胞分化，因此，被ALP染色的表现很少。在使用自组装肽凝胶C1的情况下，也能够确认被ALP染色的范围(图1)。

将表示培养1天后、7天后、14天后、28天后的各细胞中的骨形成标记物(ALP、BMP-2、骨唾液酸蛋白(BSP)、骨钙素(Osteocalcin)、Osterix(锌指结构转录因子)、骨桥蛋白(OSP))的表达量的图表示于图2。在培养第28天(骨形成成熟时期)，对于ALP、BMP-2、OPN、BSP、Osterix而言，在使用自组装肽凝胶1(图2中的SPG)的情况下，与使用自组装肽凝胶C1(图2中的PM)进行培养的情况相比，表达量显著地上升。ALP通常为在骨形成的初期表达量上升的标记物。由于ALP与其它骨形成标记物同样地表达量高，因此认为通过使用自组装肽凝胶1能够持续地诱导各骨形成标记物。

[实施例1]

通过将小鼠的股骨使用粉碎机粉碎，得到骨片(1mm～2mm)。在得到的骨片中载置自组装肽凝胶2(株式会社Menicon制，商品名：Panacea Gel SPG-178-204，肽浓度：0.4w/w％)并进行静置，由此得到凝胶状的骨形成促进材料1。将自组装肽凝胶2的组成示于表1。使用培养基MEMα、10m％FBS和1％Anti-Anti将得到的骨形成促进材料进行培养。将培养14天后和28天后的骨形成促进材料的照片和对该骨形成促进材料进行了ALP染色的照片示于图3。

[表1]

[实施例2]

除了使用自组装肽凝胶1取代自组装肽凝胶2以外，与实施例1同样地进行，得到骨形成促进材料2。将得到的骨形成促进材料2与实施例1同样地进行培养。将培养14天后和28天后的骨形成促进材料的照片和对该骨形成促进材料进行了ALP染色的照片示于图3。

[实施例3]

除了使用自组装肽凝胶3取代自组装肽凝胶2以外，与实施例1同样地进行，得到骨形成促进材料3。将自组装肽凝胶3的组成示于表1。将得到的骨形成促进材料3与实施例1同样地进行培养。将培养14天后和28天后的骨形成促进材料的照片和对该骨形成促进材料进行了ALP染色的照片示于图3。

(比较例1)

除了使用自组装肽凝胶C1(3D matrix公司制，制品名“Puramatrix^TM”，Ac-RADARADARADARADA-CONH₂的肽浓度1重量％的凝胶)取代自组装肽凝胶2以外，与实施例1同样地进行，得到骨形成促进材料C1。自组装肽凝胶C1的组成示于表1。除了使用得到的骨形成促进材料C1以外，与实施例1同样地进行培养。将培养14天后和28天后的骨形成促进材料的照片和对该骨形成促进材料进行了ALP染色的照片示于图3。

(结果)

在骨形成促进材料1～3中，可确认被ALP染色的成骨细胞。另一方面，在骨形成促进材料C1中，骨片发生死骨化，不能确认成骨细胞。

[实施例4]

在小鼠股骨上使用钻孔机制作1mm×3mm的骨缺损部，得到股骨缺损小鼠。将实施例1中得到的骨形成促进材料1移植至得到的股骨缺损小鼠的股骨缺损部分。将移植2天后、7天后、9天后、14天后、21天后的小鼠的股骨部分切开，观察骨形成的情形。在移植有骨形成促进材料1的小鼠中，进行缺损部分的骨癒合。与通常的骨癒合的进行相比，本发明的骨形成促进材料1显著地促进骨形成。

[试验例2]股骨再生试验

使用股骨缺损小鼠，通过以下的步骤进行股骨再生试验。外固定后，对经过56天后的股骨缺损部进行X射线拍摄和CT拍摄，评价股骨的再生性能。X射线拍摄和CT拍摄的条件示于以下。另外，由CT拍摄的结果算出骨再生量。其中，每种骨形成促进材料使用4只小鼠进行试验。

(1)股骨缺损模型的制作

在10周龄的雌性大鼠(从中部科学资材获得)的腹腔内注射戊巴比妥(共立制药(株)社制)0.1ml～0.15ml而实施麻碎后，切开大腿部，在股骨上安装外固定器(图4)。接着，用高速微型气磨钻(airtome)将安装有外固定器的部分的中间的股骨削去，制作了约5mm的骨缺损部。

(2)骨片(born chip)的制作

用高速微型气磨钻(airtome)将从上述大鼠采取的股骨削去，采取骨片(bornchip)。采取的骨片在使用之前在-80℃下保存。

(3)骨形成促进材料的制备

在自组装肽凝胶1(株式会社Menicon制，商品名：Panacea Gel SPG-178-208，肽浓度：0.8w/w％)80μL中将上述骨片0.05g进行混合，得到骨形成促进材料。除了使用自组装肽凝胶C1(3D matrix公司制，制品名“Puramatrix^TM”)或生理盐水取代自组装肽凝胶1以外，同样地进行，得到骨形成促进材料。

(4)对股骨缺损部的外固定

将上述(3)中制备的各骨形成促进材料注入PEEK制的护架(Yasojima ProceedCo.，Ltd.制，长度：5mm，外径：5mm，内径：3mm，图5)。接着，在股骨缺损小鼠的股骨缺损部插入注入有骨形成促进材料的护架，如图6所示进行外固定。

<X射线拍摄>

X射线拍摄装置：SOFTEX/CMB-2(Softex(株)制)

(拍摄条件)

电压：50KVp

电流：10mA

时间：15秒

拍摄距离：60cm

胶片：FUJIFILM

<CT拍摄>

CT拍摄装置：高分辨率体内微X射线CT扫描仪(SKYSCAN 1176)

(拍摄条件)

滤波器：Cu+AL

电源电压：80KV

电源电流：313μA

行数量：1336

列数量：2000

影像像素尺寸：17.6μm

(重构条件)

重构程序：NRecon

像素尺寸：17.60223μm

CS影像转换最小值：0.002

CS影像转换最大值：0.03

<骨再生量算出方法>

使用SKYSCAN公司制的数值分析软件“CTAn”进行骨形态分析，进行骨再生量的定量化。

(结果)

将使用各骨形成促进材料进行了外固定的股骨缺损部的X射线照片示于图7，将CT照片示于图8。对于将实施例1中得到的骨形成促进材料1应用于股骨缺损部的小鼠而言，在整个缺损部可确认骨再生(图7和图8中的SPG-178)。另外，在全部的小鼠中骨再生量为50％以上(骨再生量的平均值：66.68％，p＝0.01)。另一方面，对于应用了骨形成促进材料C1的小鼠而言，仅从股骨的两端确认骨再生(图7和图8中的PuraMatrix)。另外，与使用了骨形成促进材料1的小鼠相比，骨再生量很小(骨再生量的平均值：31.54％，p＝0.01)。进而，与使用了生理盐水作为对照的小鼠相比，骨再生量很小(骨再生量的平均值：44.18％，p＝0.01)。另外，使用了骨形成促进材料1的小鼠中的骨再生量与使用了骨形成促进材料C1的小鼠相比，为显著高的值。

[实施例5]

将自组装肽凝胶3用Milli-Q水稀释，得到1.0w/w％的水溶液。将得到的水溶液滴加于24孔板上，用立体显微镜(倍数100倍)观察凝胶的性状。另外，用pH试纸测定凝胶的pH。

在试管中放入上述试验例2中得到的骨片(大鼠股骨)5mg之后，滴加所得到的水溶液5μL。接着，用涡旋混合器搅拌之后，利用离心分离机除去气泡，得到骨形成促进材料5。用立体显微镜(倍数100倍)观察所得到的骨形成促进材料5的性状。另外，用pH试纸测定所得到的骨形成促进材料的pH。

[实施例6]

除了使用自组装肽凝胶4以外，与实施例5同样地进行，得到骨形成促进材料6。将自组装肽凝胶4的组成示于表1。与实施例5同样地评价骨片添加前的凝胶的性状和pH、以及骨形成促进材料6的性状和pH。

(比较例2)

除了使用自组装肽凝胶C1以外，与实施例5同样地进行，得到骨形成促进材料C2。与实施例5同样地评价骨片添加前的凝胶的性状和pH、以及骨形成促进材料C2的性状和pH。

[评价]

分别将实施例5～6和比较例2的骨片添加前的凝胶的照片示于图9，将骨片添加后的凝胶(骨形成促进材料)的照片示于图10。如图9所示，骨片添加前的凝胶均为均匀的凝胶(均质的)。用立体显微镜观察实施例5和6的骨形成促进材料，结果，均为均匀地分散有骨片的均质状态(图10(a)和(b))。另一方面，比较例2的骨形成促进材料中可确认凝胶状的析出物，为不均匀的状态(非均质)(图10(c))。

另外，在实施例5和6中，在骨片添加前后的任一时刻，pH均为中性(pH6～8左右)。另一方面，在比较例2中，骨片添加前的凝胶的pH为酸性(pH4左右)，但在骨片的添加后，pH成为中性(pH6～8左右)。

在实施例5和6中，在骨片添加前后可维持凝胶的pH，因此，所得到的骨形成促进材料维持均匀的性状。在这些实施例中，骨片均匀地分散，因此，可以认为将骨形成促进材料作为支架，提高骨形成率。另一方面，在比较例2中，骨片的添加导致pH变化，由此使得凝胶成为非均质的状态，因此，认为不能充分地促进骨形成。

产业上的可利用性

本发明的骨形成促进材料可以在研究开发和医疗的领域中很好地利用。

本申请还涉及以下实施方案：

1、一种骨形成促进材料，其特征在于：

其含有在中性pH的水溶液中可形成β片层结构的自组装肽和骨片，构成该自组装肽的氨基酸残基在pH7.0时的电荷的总和不为0。

2、如实施方案1所述的骨形成促进材料，其特征在于：

所述自组装肽为包含下述氨基酸序列的自组装肽，

氨基酸序列：a₁b₁c₁b₂a₂b₃db₄a₃b₅c₂b₆a₄

该氨基酸序列中，a₁～a₄为碱性氨基酸残基；b₁～b₆为不带电荷极性氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基，且其中的至少5个为疏水性氨基酸残基；c₁和c₂为酸性氨基酸残基；d为疏水性氨基酸残基。

3、如实施方案1或2所述的骨形成促进材料，其特征在于：

还含有血液和/或源自血液的成分。

4、如实施方案1～3中任一项所述的骨形成促进材料，其特征在于：还含有骨形成因子。

5、如实施方案1～4中任一项所述的骨形成促进材料，其特征在于：其与骨形成促进材料用保持器具一起使用。

6、一种实施方案1～5中任一项所述的骨形成促进材料用的保持器具。

7、如实施方案6所述的骨形成促进材料用保持器具，其特征在于：

其由碳系材料、工程树脂或者超级工程树脂构成。

Claims

1.一种骨形成促进材料，其特征在于：

2.如权利要求1所述的骨形成促进材料，其特征在于：

所述自组装肽为包含下述氨基酸序列的自组装肽，

氨基酸序列：a₁b₁c₁b₂a2b₃db₄a₃b₅c₂b₆a₄

3.如权利要求1或2所述的骨形成促进材料，其特征在于：

还含有血液和/或源自血液的成分。

4.如权利要求1～3中任一项所述的骨形成促进材料，其特征在于：还含有骨形成因子。

5.如权利要求1～4中任一项所述的骨形成促进材料，其特征在于：其与骨形成促进材料用保持器具一起使用。