JPWO2014133027A1 - ハイドロゲル - Google Patents
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Abstract
本発明は、キトサンとＰＥＧとを混合すること、及び得られた混合物に自己組織化ペプチドを添加することを含む、ハイドロゲルの製造方法及びこの方法によって得られたハイドロゲルに関する。
Description
本発明は、キトサン、ＰＥＧ及び自己組織化ペプチドを含むハイドロゲル、その製造方法及び細胞機能向上のための培養方法に関する。
高い含水率と様々な物理特性をデザイン可能なハイドロゲルは、インプラントやバイオセンサー、薬物担持担体など、バイオマテリアルとしての応用が期待されている。細胞親和性に優れたゲルの作製には、細胞の接着・増殖・分化を補助するだけでなく、積極的に補強した三次元環境の提供が必要となる。細胞外マトリックスを模倣した繊維構造は、これらの要求を満たす構造設計として広く研究されている。中でも自己組織化ペプチドを用いたゲルは、ペプチドが形成する繊維構造が細胞足場となりうること、アミノ酸配列によって様々な機能付与が可能であることから広く研究されている。しかしながら、ペプチドゲルは一般に分子の自己組織化による物理ゲルであるため、力学強度に乏しく、材料成形性に大きな問題があった（非特許文献１）。
Stevens, M. M. and George J.H., "Exploring and Engineering the Cell Surface Interface" Science. 2005, 310, 1135-8
本発明は、上記の課題を解決したハイドロゲルを提供する。
本研究では、自己組織化ペプチドの繊維状網目を共有結合性ゲルの網目で補強した、生体適合性インジェクタブルゲルの新規な創製法の確立を目指す。架橋の駆動力、ゲル化のタイムラグを精密に制御するというこれまでにないアプローチにより、ワンポット合成で三次元的なペプチド繊維構造を保持した、生体適合性インジェクタブルゲルを作製した。
すなわち、本発明は、下記：
［１］
下記工程：
キトサンとＰＥＧとを混合すること、及び
得られた混合物に自己組織化ペプチドを添加すること
を含む、ハイドロゲルの製造方法、
［２］
自己組織化ペプチドが、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に結合し、アミノ酸残基１２〜２００を有する両親媒性のペプチドであり、一価のイオンの存在下、水溶液中で安定なβシート構造を示す、請求項１に記載の製造方法、
［３］
自己組織化ペプチドが、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸及びアラニンの繰り返し配列を有する、上記［２］に記載の製造方法、
［４］
自己組織化ペプチドが、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドである、上記［３］に記載の製造方法。
［５］
上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法によって得られたハイドロゲル、
［６］
軟骨再生用である、上記［５］に記載のハイドロゲル、
［７］
軟骨細胞を上記［６］に記載のハイドロゲル中で培養することを含む、再生軟骨の製造方法、
［８］
上記［７］に記載の方法によって得られた再生軟骨、
［９］
さらに、血液成分及び/又は生理活性物質を含有する、上記［５］又は［６］に記載のハイドロゲル。
［１０］
前記、血液成分が、血清、血漿、血小板、多血小板血漿（ＰＲＰ)、フィブリン、フィブリノーゲン、プロトロンビン、トロンビン、トロンボプラスチン、プラスミノゲン、アルブミン及びコレステロールからなる群から選択され、生理活性物質が、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、ハイドロコーチゾン、ウロガストロン、血小板由来創傷治癒因子（ＰＤＷＨＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血小板因子ＩＶ（ＰＦ ＩＶ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ)及び成長分化因子（ＧＤＦ)からなる群から選択される上記［９］記載のハイドロゲル
である。
［１］
下記工程：
キトサンとＰＥＧとを混合すること、及び
得られた混合物に自己組織化ペプチドを添加すること
を含む、ハイドロゲルの製造方法、
［２］
自己組織化ペプチドが、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に結合し、アミノ酸残基１２〜２００を有する両親媒性のペプチドであり、一価のイオンの存在下、水溶液中で安定なβシート構造を示す、請求項１に記載の製造方法、
［３］
自己組織化ペプチドが、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸及びアラニンの繰り返し配列を有する、上記［２］に記載の製造方法、
［４］
自己組織化ペプチドが、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドである、上記［３］に記載の製造方法。
［５］
上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法によって得られたハイドロゲル、
［６］
軟骨再生用である、上記［５］に記載のハイドロゲル、
［７］
軟骨細胞を上記［６］に記載のハイドロゲル中で培養することを含む、再生軟骨の製造方法、
［８］
上記［７］に記載の方法によって得られた再生軟骨、
［９］
さらに、血液成分及び/又は生理活性物質を含有する、上記［５］又は［６］に記載のハイドロゲル。
［１０］
前記、血液成分が、血清、血漿、血小板、多血小板血漿（ＰＲＰ)、フィブリン、フィブリノーゲン、プロトロンビン、トロンビン、トロンボプラスチン、プラスミノゲン、アルブミン及びコレステロールからなる群から選択され、生理活性物質が、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、ハイドロコーチゾン、ウロガストロン、血小板由来創傷治癒因子（ＰＤＷＨＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血小板因子ＩＶ（ＰＦ ＩＶ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ)及び成長分化因子（ＧＤＦ)からなる群から選択される上記［９］記載のハイドロゲル
である。
キトサンとは、キチン（β−１，４−ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン）の脱アセチル化物であり、β−１，４−ポリグルコサミン構造を主とする多糖類である。本発明のキトサンには、従来公知の誘導体、たとえば、カルボキシメチルキトサン（ＣＭキトサン）を含む。
キトサンは、当該分野で公知の任意の方法により調製され得る。たとえば、キトサンは、カニ、エビ、オキアミなどの甲殻類の甲皮や、カブトムシ、バッタなどの昆虫類の甲皮などの原材料を脱カルシウム処理し、除タンパク処理をして得られるキチンを、アルカリ処理（例えば、苛性ソーダ処理）で脱アセチル化することなどによって得ることができる。また、キトサンの原材料としては、上述の甲皮等に代えて、キノコ類、微生物、イカの中骨等を用いてもよい。
キトサンとしては、種々の分子量のものが知られている。本発明の水性組成物において、キトサンの分子量は特に限定されるものではないが、重量平均分子量が１０００〜２０００００の範囲にあることが好ましく、１００００〜１０００００の範囲にあることがより好ましい。重量平均分子量は、「重量平均絶対分子量」と言い換えてもよい。
キトサンの重量平均分子量は、当該分野で公知の任意の方法で測定することができる。例えば、重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー−多角度レーザー光散乱分析法（ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法）、蒸気圧式絶対分子量測定、メンブレン式絶対分子量測定などの方法によって測定可能である。キトサンの重量平均分子量は、少なくとも、いずれかの測定方法及び測定条件において前記数値範囲内に含まれればよく、全ての測定方法及び測定条件下で前記数値範囲内に含まれる必要はない。
本発明の水性組成物に含まれるキトサンにおいて、キチンからの脱アセチル化の程度は、好ましくは６０％以上である。
本発明のポリエチレングリコールは、従来公知の誘導体、たとえばマルチアームポリエチレングリコール、末端にヒドロキシスクシンイミドエステル又はニトロベンゼンスルホネートエステル構造のような、アミノ基反応性の構造を有する誘導体を含む。ポリエチレングリコールの分子量は、好ましくは、１０００〜１００００、より好ましくは、１０００〜３０００である。
本発明の自己組織化ペプチドは、たとえば、電荷を有する親水性アミノ酸と、中性の疎水性アミノ酸とが交互に並び、正電荷と負電荷が交互に分布するような構造を有し、生理的条件のｐＨと塩濃度により、低濃度でβシート構造をとり、太さ１０ｎｍ〜２０ｎｍ程の極細繊維が、網目上に集合し、ゲル化する。この網目構造は、ファイバーサイズおよびポアサイズなどが天然の細胞間マトリックス（ＥＣＭ）と非常に似ており、細胞培養の足場としての利用することができる。このペプチドハイドロゲルは、生分解性であり、分解産物が組織に悪影響を与えず、生体吸収性が高いことや、細胞の正着や増殖に適していることに加え、化学合成品であり動物由来の感染症などの心配がないため、近年狂牛病など、動物からのウイルスやそのほか未知の感染症への懸念が高まったことから、コラーゲンなどの代替品として、さらに注目されるようになった（特表２００７−１１７２７５号公報、再生歯誌、２００５年、第３巻、第１号、ｐ１−１１参照）。
本発明の自己組織化ペプチドは、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に結合し、アミノ酸残基１２〜２００を有する両親媒性のペプチドであり、一価のイオンの存在下、水溶液中で安定なβシート構造を示す。
ここで、親水性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸から選択される酸性アミノ酸およびアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチンから選択される塩基性アミノ酸を使用することができる。疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニンまたはグリシンを使用することができる。
自己組織化ペプチドの具体例としては、Ａｃ−（ＲＡＤＡ）４−ＣＯＮＨ２（配列番号１）を有するペプチドＲＡＤＡ１６を挙げることができ、その１％水溶液が、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）として株式会社スリー・ディー・マトリックスから市販されている。ＲＡＤＡ１６は、繊維状網目構造を有する疑似細胞外マトリックスに用いることができ、細胞足場を提供する。また、ＲＡＤＡ１６にフィブロネクチンにみられるＲＧＤ接着モチーフを付与した、Ａｃ−（ＲＡＤＡ）４−ＧＰＲＧＤＳＧＹＲＧＤＳ−ＣＯＮＨ２（配列番号２）を有するペプチドＰＲＧなどの誘導体も挙げることができる。
本発明のハイドロゲルは、キトサンとＰＥＧとを混合し、次いで、自己組織化ペプチドを加えることによって、調製することができる。溶媒は、従来公知の任意のものを用いることができるが、好ましくは、たとえば、水、生理食塩水、ＰＢＳを用いることができる。
本発明のハイドロゲルは、軟骨再生用に用いることができる。軟骨細胞を本発明のハイドロゲル中で培養することによって、再生軟骨を得ることができる。
本発明のハイドロゲルは、さらに、血液成分及び/又は生理活性物質を含有することができる。
血液成分は、たとえば、血清、血漿、血小板、多血小板血漿（ＰＲＰ)、フィブリン、フィブリノーゲン、プロトロンビン、トロンビン、トロンボプラスチン、プラスミノゲン、アルブミン及びコレステロールからなる群から選択することができる。
生理活性物質は、たとえば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、ハイドロコーチゾン、ウロガストロン、血小板由来創傷治癒因子（ＰＤＷＨＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血小板因子ＩＶ（ＰＦ ＩＶ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ)及び成長分化因子（ＧＤＦ)からなる群から選択することができる。
［実施例］
インジェクタブルゲルの作製には、カルボキシメチルキトサン（キトサン，Ｍｗ＝８０，０００−１００，０００；脱アセチル化キチン ６３．３％；置換度 ０．６１）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド末端化−２−アームポリ（エチレングリコール）（ＮＨＳ−ＰＥＧ，Ｍw＝２，０００，＞９９％ ＮＨＳ置換）、およびＲＡＤＡ１６（Ｐｕｒａ Ｍａｔｒｉｘ）ペプチドを用いた。ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）を用いて所定濃度に調整した溶液を、目的の終濃度になるようにサンプル管中で混合することによりゲルを作製した。キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルは、キトサン、ＮＨＳ−ＰＥＧを混和した後、得られた混合物にＲＡＤＡ１６を添加することで作製した。混合溶液を１時間静置した後、溶液の流動性を観察することでゲル化条件を検討した。
インジェクタブルゲルの作製には、カルボキシメチルキトサン（キトサン，Ｍｗ＝８０，０００−１００，０００；脱アセチル化キチン ６３．３％；置換度 ０．６１）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド末端化−２−アームポリ（エチレングリコール）（ＮＨＳ−ＰＥＧ，Ｍw＝２，０００，＞９９％ ＮＨＳ置換）、およびＲＡＤＡ１６（Ｐｕｒａ Ｍａｔｒｉｘ）ペプチドを用いた。ＰＢＳバッファー（ｐＨ ７．４）を用いて所定濃度に調整した溶液を、目的の終濃度になるようにサンプル管中で混合することによりゲルを作製した。キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルは、キトサン、ＮＨＳ−ＰＥＧを混和した後、得られた混合物にＲＡＤＡ１６を添加することで作製した。混合溶液を１時間静置した後、溶液の流動性を観察することでゲル化条件を検討した。
キトサン、ＰＥＧ、およびＲＡＤＡ１６溶液の混和によるゲル化挙動は、レオメーターを用いた時間依存的な粘弾性変化により観察した。（ａ）キトサン／ＰＥＧ（１．０／１．０ｗｔ％）、（ｂ）ＲＡＤＡ１６（０．２５ｗｔ％）、および（ｃ）キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６混合溶液（１．０／１．０／０．２５ｗｔ％）それぞれ３００μＬを装置台座にキャストした後、即座に測定を開始した。測定は、１％ひずみ、周波数は１Ｈｚの条件で行い、時間経過に伴う貯蔵弾性率（Ｇ’）と損失弾性率（Ｇ”）の値を観測した。
結果と考察
キトサン／ＰＥＧハイドロゲル
ゲル化は、キトサン及びＮＨＳ−ＰＥＧのそれぞれの混合終濃度が１．０ｗｔ％以上において観察された。また、ゲルの力学強度は、ゲル中に含まれる分子濃度の増加とともに上昇した。一方で、ＰＥＧ鎖末端が水酸基（ＯＨ−ＰＥＧ）であった場合、いかなる濃度においてもゲル化は観察されなかった。これらの結果から、キトサン／ＰＥＧゲルは、キトサンに含まれるアミノ基とＮＨＳ−ＰＥＧとのアミド結合形成を駆動力とした化学架橋により形成されることが示唆された。
キトサン／ＰＥＧハイドロゲル
ゲル化は、キトサン及びＮＨＳ−ＰＥＧのそれぞれの混合終濃度が１．０ｗｔ％以上において観察された。また、ゲルの力学強度は、ゲル中に含まれる分子濃度の増加とともに上昇した。一方で、ＰＥＧ鎖末端が水酸基（ＯＨ−ＰＥＧ）であった場合、いかなる濃度においてもゲル化は観察されなかった。これらの結果から、キトサン／ＰＥＧゲルは、キトサンに含まれるアミノ基とＮＨＳ−ＰＥＧとのアミド結合形成を駆動力とした化学架橋により形成されることが示唆された。
キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡハイドロゲル
図１には、２０℃におけるキトサン／ＰＥＧ（１．０／１．０ ｗｔ％）、ＲＡＤＡ１６（０．２５ ｗｔ％）、およびキトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６（１．０／１．０／０．２５ ｗｔ％）溶液の経時的な粘弾性変化を示す。キトサン／ＰＥＧにおいて（図１ａ）、所定時間経過後にＧ’の値は急激に増加し、明確なゲル化点（Ｇ’＞Ｇ”）が観察された。これは、アミド結合による分子鎖間架橋の動的過程を示していると考えられる。実際、ゲル化点は外部温度に依存して変化したことから、動的な粘弾性の変化は、キトサン／ＰＥＧの化学結合に基づく分子鎖間架橋に伴うゾル−ゲル転移を反映すると示唆された。
図１には、２０℃におけるキトサン／ＰＥＧ（１．０／１．０ ｗｔ％）、ＲＡＤＡ１６（０．２５ ｗｔ％）、およびキトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６（１．０／１．０／０．２５ ｗｔ％）溶液の経時的な粘弾性変化を示す。キトサン／ＰＥＧにおいて（図１ａ）、所定時間経過後にＧ’の値は急激に増加し、明確なゲル化点（Ｇ’＞Ｇ”）が観察された。これは、アミド結合による分子鎖間架橋の動的過程を示していると考えられる。実際、ゲル化点は外部温度に依存して変化したことから、動的な粘弾性の変化は、キトサン／ＰＥＧの化学結合に基づく分子鎖間架橋に伴うゾル−ゲル転移を反映すると示唆された。
一方で、ＲＡＤＡ１６ペプチドゲルの場合、測定開始時のＧ’の値はＧ”のそれより高く、ＰＢＳ中で即座にゲル化することが観察された（図１ｂ）。つまり、ＲＡＤＡ１６の分子組織化（β−シート構造形成）に基づくゲル化は、キトサン／ＰＥＧゲル化に比べて極めて早く起こることがわかった。
図１ｃには、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６（１．０／１．０／０．２５ ｗｔ％）の粘弾性変化を示す。Ｇ’，Ｇ”の変化は、ＲＡＤＡ１６ペプチドゲルと同様の挙動を示した。興味深いことに、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルのＧ’の値は、それぞれ単独の場合と比べて増大した。キトサン／ＰＥＧゲルとＲＡＤＡ１６ペプチドゲルの架橋様式、ゲル化時間の相違を考慮すると、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルはそれぞれのネットワークが独立した内部構造を形成していると考えられる。つまり、混合初期において、ＲＡＤＡ１６の組織化は迅速に起こり、引き続きＲＡＤＡ１６繊維網目の間でキトサン／ＰＥＧの架橋が形成される。キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルのＧ’の飛躍的な増大は、これらのゲル化タイムラグに由来する相互侵入網目（ＩＰＮ：Interpenetrating polymer network）様の構造に起因すると考えられる。実際、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルの円二色分光スペクトル測定の結果、ＲＡＤＡ１６ペプチドゲルのみの場合と比べて遜色ないβ−シート構造に起因するコットン効果が確認でき、ゲル内部でもＲＡＤＡ１６の組織構造が保持されていることが示唆された（図２Ｄ）。
混合ハイドロゲルを用いた再生軟骨のマウス移植実験
混合ハイドロゲルの軟骨再生能を検討した。低細胞密度による移植により、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ−２の効果を明確にした。
混合ハイドロゲルの軟骨再生能を検討した。低細胞密度による移植により、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ−２の効果を明確にした。
材料
ハイドロゲル：０．２ｍＭ ＣＭキトサン＋５ｍＭ ＰＥＧ＋０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ：ＲＡＤＡ＝１：１）
比較対象ゲル：１ ％アテロコラーゲン（株）高研
ハイドロゲル：０．２ｍＭ ＣＭキトサン＋５ｍＭ ＰＥＧ＋０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ：ＲＡＤＡ＝１：１）
比較対象ゲル：１ ％アテロコラーゲン（株）高研
方法
培養ヒト軟骨細胞とゲルを混和し、多孔体（ＰＬＬＡ ５ｍｍｘ５ｍｍｘ３ｍｍ）に投与する。ゲル化を確認後、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（６週齢、雄）の皮下に移植した。
約１０００倍増に増殖させたヒト耳介軟骨細胞を０．２ｍＭ ＣＭキトサン溶液で混和した後、５ｍＭ ＰＥＧおよび ０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ：ＲＡＤＡ＝１：１）をさらに混合し、５ｘ５ｘ３ｍｍサイズのＰＬＬＡ（ＭＷ，約１２０，０００、気孔率８７％）に投与しゲル化させ、再生軟骨とすした。ゲルの比率としては、キトサン２：ＰＥＧ１：ＰＭ１：細胞懸濁液１の割合であり、溶媒はＰＢＳを用いた。液性因子はＩＧＦ−１（ソマゾン、アステラス製薬株式会社）もしくはＦＧＦ−２（フィブラストスプレー、科研製薬株式会社）を用いた。どちらも最終濃度１００μｇ／ｍＬもしくは５００μｇ／ｍＬで使用し、細胞懸濁液で使用するＰＢＳで溶解させた。ゲル化を確認後、Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ（６週齢、雄）の背部皮下に移植した。８週間後に回収し、組織学的、生化学的評価を行った。
移植細胞：培養ヒト耳介軟骨細胞（ｎ＝３）
細胞濃度：１０４、１０５、１０６、１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
条件：
（１）１％アテロコラーゲン＋細胞
（２）０．２ｍＭ ＣＭキトサン＋５ｍＭ ＰＥＧ＋０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ）＋細胞
（３）０．２ｍＭ ＣＭキトサン＋５ｍＭ ＰＥＧ＋０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ）＋ＩＧＦ−１（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）＋細胞
（４）０．２ｍＭ ＣＭキトサン＋５ｍＭ ＰＥＧ＋０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ）＋ＩＧＦ−１（最終濃度５００μｇ／ｍＬ）＋細胞
（５）０．２ｍＭ ＣＭキトサン＋５ｍＭ ＰＥＧ＋０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ）＋ＦＧＦ−２（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）＋細胞
（６）０．２ｍＭ ＣＭキトサン＋５ｍＭ ＰＥＧ＋０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ）＋ＦＧＦ−２（最終濃度５００μｇ／ｍＬ）＋細胞
動物： Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ(６週齢、雄)６匹、２つの移植片を１匹の背部皮下左右に移植した。
移植期間：８週間
評価：肉眼所見
組織学的検討（ＴＢ，ＨＥ）
生化学的検討（ＧＡＧ）
培養ヒト軟骨細胞とゲルを混和し、多孔体（ＰＬＬＡ ５ｍｍｘ５ｍｍｘ３ｍｍ）に投与する。ゲル化を確認後、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（６週齢、雄）の皮下に移植した。
約１０００倍増に増殖させたヒト耳介軟骨細胞を０．２ｍＭ ＣＭキトサン溶液で混和した後、５ｍＭ ＰＥＧおよび ０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ：ＲＡＤＡ＝１：１）をさらに混合し、５ｘ５ｘ３ｍｍサイズのＰＬＬＡ（ＭＷ，約１２０，０００、気孔率８７％）に投与しゲル化させ、再生軟骨とすした。ゲルの比率としては、キトサン２：ＰＥＧ１：ＰＭ１：細胞懸濁液１の割合であり、溶媒はＰＢＳを用いた。液性因子はＩＧＦ−１（ソマゾン、アステラス製薬株式会社）もしくはＦＧＦ−２（フィブラストスプレー、科研製薬株式会社）を用いた。どちらも最終濃度１００μｇ／ｍＬもしくは５００μｇ／ｍＬで使用し、細胞懸濁液で使用するＰＢＳで溶解させた。ゲル化を確認後、Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ（６週齢、雄）の背部皮下に移植した。８週間後に回収し、組織学的、生化学的評価を行った。
移植細胞：培養ヒト耳介軟骨細胞（ｎ＝３）
細胞濃度：１０４、１０５、１０６、１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
条件：
（１）１％アテロコラーゲン＋細胞
（２）０．２ｍＭ ＣＭキトサン＋５ｍＭ ＰＥＧ＋０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ）＋細胞
（３）０．２ｍＭ ＣＭキトサン＋５ｍＭ ＰＥＧ＋０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ）＋ＩＧＦ−１（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）＋細胞
（４）０．２ｍＭ ＣＭキトサン＋５ｍＭ ＰＥＧ＋０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ）＋ＩＧＦ−１（最終濃度５００μｇ／ｍＬ）＋細胞
（５）０．２ｍＭ ＣＭキトサン＋５ｍＭ ＰＥＧ＋０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ）＋ＦＧＦ−２（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）＋細胞
（６）０．２ｍＭ ＣＭキトサン＋５ｍＭ ＰＥＧ＋０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ）＋ＦＧＦ−２（最終濃度５００μｇ／ｍＬ）＋細胞
動物： Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ(６週齢、雄)６匹、２つの移植片を１匹の背部皮下左右に移植した。
移植期間：８週間
評価：肉眼所見
組織学的検討（ＴＢ，ＨＥ）
生化学的検討（ＧＡＧ）
結果
混合ハイドロゲルを用いた再生軟骨試験では、高い細胞支持性能と軟骨基質の保持性能を示し、アテロコラーゲンと比較して良好な軟骨再生を示した。混合ハイドロゲルを用いた再生軟骨は、アテロコラーゲンに比べ、同等な軟骨細胞播種密度では軟骨基質の再生が良好であった。さらに、混合ハイドロゲルを用いた再生軟骨は、より低い細胞密度でも軟骨再生を生じる傾向が見られた（図３Ａ及びＢ）。
混合ハイドロゲルを用いた再生軟骨試験では、高い細胞支持性能と軟骨基質の保持性能を示し、アテロコラーゲンと比較して良好な軟骨再生を示した。混合ハイドロゲルを用いた再生軟骨は、アテロコラーゲンに比べ、同等な軟骨細胞播種密度では軟骨基質の再生が良好であった。さらに、混合ハイドロゲルを用いた再生軟骨は、より低い細胞密度でも軟骨再生を生じる傾向が見られた（図３Ａ及びＢ）。
さらに、混合ハイドロゲルはＩＧＦ−１、ＦＧＦ−２などの成長因子と混合して再生軟骨を作製すると、さらに軟骨再生が改善し、成長因子などを担持する機能も有することが示された（図４）。この結果からは、ＧＡＧ産生量の絶対量が、ハイドロゲルの方がアテロコラーゲンに比べて大きいこと（細胞密度が高いほど、差が大きい。）、そして、ＩＧＦ、ＦＧＦの添加により、さらにＧＡＧ産生量が増え、軟骨細胞が再生していることが示された。
ペプチド混合ゲルにおける細胞機能（ＧＡＧ産生量、ミトコンドリア活性及び細胞増殖）への影響を評価した。
細胞内包ゲルの作製
ゲル組成
（１）キトサン／ＰＥＧ ２．０／１．０ｗｔ％
（２）キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ ２．０／１．０／０．２５ｗｔ％
ゲル体積；１００μｌ
細胞種；軟骨細胞（継代数：４）
細胞密度；１．０×１０７細胞／ｍＬ
培地；ＤＭＥＭ
細胞内包ゲルの作製
ゲル組成
（１）キトサン／ＰＥＧ ２．０／１．０ｗｔ％
（２）キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ ２．０／１．０／０．２５ｗｔ％
ゲル体積；１００μｌ
細胞種；軟骨細胞（継代数：４）
細胞密度；１．０×１０７細胞／ｍＬ
培地；ＤＭＥＭ
細胞内包ゲルを３７℃、５％ＣＯ２で培養した。第０〜６０日まで培地及びゲルサンプルを回収し、ＧＡＧ産生量、ミトコンドリア活性及び細胞増殖を評価した。
軟骨細胞の分化機能活性の指標であるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）産生量をＤＭＭＢアッセイによって定量した。ゲル内細胞増殖活性を、ＭＴＴアッセイ及びヘキスト３３２５６を用いたＤＮＡ定量によって評価した。結果を図５に示した。
キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡゲルでは、培地中へのＧＡＧ放出量の増加が見られ、第６０日における積算量は、約１．５倍となった。また、細胞数の増加が見られた。特に、第１８日以降ＧＡＧ産生量が増加した。
ゲル内細胞の活性は、キトサン／ＰＥＧゲルでは、培養初期に活性が低下した。その後、活性の上昇は見られたものの、播種時における活性を超えることはなかった。一方、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡゲルにおいては、培養初期での細胞活性の低下が抑制されていた。さらに、その後の培養日数の経過に伴い、細胞活性は大きく上昇し、第６０日においても高い活性を維持していた。
ＤＮＡ定量の結果、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡゲルにおいては、培養日数の経過に対するＤＮＡ量の増加が見られ、ゲル内部での細胞が増加傾向にあることを確認した。
以上から、ペプチドによる微小網目構造の形成による足場の寄与により、軟骨細胞の分化機能・細胞活性を向上させることが示唆された。
軟骨細胞の分化機能活性の指標であるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）産生量をＤＭＭＢアッセイによって定量した。ゲル内細胞増殖活性を、ＭＴＴアッセイ及びヘキスト３３２５６を用いたＤＮＡ定量によって評価した。結果を図５に示した。
キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡゲルでは、培地中へのＧＡＧ放出量の増加が見られ、第６０日における積算量は、約１．５倍となった。また、細胞数の増加が見られた。特に、第１８日以降ＧＡＧ産生量が増加した。
ゲル内細胞の活性は、キトサン／ＰＥＧゲルでは、培養初期に活性が低下した。その後、活性の上昇は見られたものの、播種時における活性を超えることはなかった。一方、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡゲルにおいては、培養初期での細胞活性の低下が抑制されていた。さらに、その後の培養日数の経過に伴い、細胞活性は大きく上昇し、第６０日においても高い活性を維持していた。
ＤＮＡ定量の結果、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡゲルにおいては、培養日数の経過に対するＤＮＡ量の増加が見られ、ゲル内部での細胞が増加傾向にあることを確認した。
以上から、ペプチドによる微小網目構造の形成による足場の寄与により、軟骨細胞の分化機能・細胞活性を向上させることが示唆された。
ＲＡＤＡ存在下において、ＩＧＦ−１添加によるＧＡＧ産生量の著しい増加がみられた。さらに、細胞活性、細胞増殖においても、ＩＧＦ−１による機能向上が、本発明のハイドロゲルにおいて、顕著に認められた。
培養日数の経過に伴い、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡゲルでは、ＩＧＦ−１添加による機能向上が見られなくなっていき、培養後期においてはＩＧＦ−１未添加であるペプチド混合ゲルでの機能活性と同程度となった。
以上から、成長因子による効率的な機能向上に寄与する足場材料となる可能性が視された。
培養日数の経過に伴い、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡゲルでは、ＩＧＦ−１添加による機能向上が見られなくなっていき、培養後期においてはＩＧＦ−１未添加であるペプチド混合ゲルでの機能活性と同程度となった。
以上から、成長因子による効率的な機能向上に寄与する足場材料となる可能性が視された。
以下の方法によって、ＰＥＧ／キトサンと、自己組織化ペプチド／ＰＥＧ／キトサンとの間で、ＩＧＦの経時的な放出量を比較した。
３００μｇ／ｍｌのＩＧＦ−１を内包したキトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲル（ＣＭキトサン２．０ｗｔ％／ＮＨＳ−ＰＥＧ（Ｍｗ＝２，０００）１．０ｗｔ％／ＲＡＤＡ１６ ０．２５ｗｔ％／ＩＧＦ−１３００μｇ／ｍｌ（終濃度））ゲル（９０μｌ）を作製し、９００μｌのＰＢＳ（−）を上澄みとして加え、インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。毎日、上澄みを全量回収し、ＥＬＩＳＡ法にてＰＢＳ（−）中に放出されたＩＧＦ−１濃度を定量した。
３００μｇ／ｍｌのＩＧＦ−１を内包したキトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲル（ＣＭキトサン２．０ｗｔ％／ＮＨＳ−ＰＥＧ（Ｍｗ＝２，０００）１．０ｗｔ％／ＲＡＤＡ１６ ０．２５ｗｔ％／ＩＧＦ−１３００μｇ／ｍｌ（終濃度））ゲル（９０μｌ）を作製し、９００μｌのＰＢＳ（−）を上澄みとして加え、インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。毎日、上澄みを全量回収し、ＥＬＩＳＡ法にてＰＢＳ（−）中に放出されたＩＧＦ−１濃度を定量した。
その結果、ＰＥＧ／キトサンのみと比べて、自己組織化ペプチド／ＰＥＧ／キトサンでは、より長期間ＩＧＦ−１を放出することができた（図７）。
Claims (10)
- 下記工程：
キトサンとＰＥＧとを混合すること、及び
得られた混合物に自己組織化ペプチドを添加すること
を含む、ハイドロゲルの製造方法。 - 自己組織化ペプチドが、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に結合し、アミノ酸残基１２〜２００を有する両親媒性のペプチドであり、一価のイオンの存在下、水溶液中で安定なβシート構造を示す、請求項１に記載の製造方法。
- 自己組織化ペプチドが、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸及びアラニンの繰り返し配列を有する、請求項２に記載の製造方法。
- 自己組織化ペプチドが、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項３に記載の製造方法。
- 請求項１〜４のいずれか1項記載の方法によって得られたハイドロゲル。
- 軟骨再生用である、請求項５に記載のハイドロゲル。
- 軟骨細胞を請求項６に記載のハイドロゲル中で培養することを含む、再生軟骨の製造方法。
- 請求項７に記載の方法によって得られた再生軟骨。
- さらに、血液成分及び/又は生理活性物質を含有する、請求項５又は６に記載のハイドロゲル。
- 前記、血液成分が、血清、血漿、血小板、多血小板血漿（ＰＲＰ)、フィブリン、フィブリノーゲン、プロトロンビン、トロンビン、トロンボプラスチン、プラスミノゲン、アルブミン及びコレステロールからなる群から選択され、生理活性物質が、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、ハイドロコーチゾン、ウロガストロン、血小板由来創傷治癒因子（ＰＤＷＨＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血小板因子ＩＶ（ＰＦ ＩＶ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ)及び成長分化因子（ＧＤＦ)からなる群から選択される請求項９記載のハイドロゲル。
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