CN108264565A - 壳聚糖修饰的Hrps静电自组装三聚肽及其制备方法 - Google Patents

壳聚糖修饰的Hrps静电自组装三聚肽及其制备方法 Download PDF

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CN108264565A CN201611255407.4A CN201611255407A CN108264565A CN 108264565 A CN108264565 A CN 108264565A CN 201611255407 A CN201611255407 A CN 201611255407A CN 108264565 A CN108264565 A CN 108264565A
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Abstract

本发明公开了一种壳聚糖修饰的Hrps静电自组装三聚肽及其制备方法，它由三种Hrps多肽和壳聚糖通过静电自组装构成三聚肽，其结构通式为：(3Hrps)n‑(C8H13NO5)n，所述三种Hrps多肽为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中的任意三种。制备的静电自组装三聚肽产品的乳化稳定性、均一性和结构稳定性更高、时效更长，功能更多，作用更强，应用范围更广，该技术及其制备相关产物可以广泛应用于农业领域的蛋白多肽类农肥、农药、生长调节剂产品生产，应用于医药领域的蛋白多肽类外用药、内服药、肌肉注射药和静脉注射药产品的生产，以及食品业的有关蛋白多肽产品的生产加工。

Description

壳聚糖修饰的Hrps静电自组装三聚肽及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，主要涉及壳聚糖修饰几个Hrps功能多肽组合片段的技术方法，在优选控制条件下，通过该技术方法，壳聚糖与几个Hrps功能多肽片段在静电作用、疏水作用、氢键以及范德华力相互作用下自组装，静电作用是实现它们自组装的主要驱动力，生成完全和部分不完全静电自组装三聚肽，以及静电自组装三聚肽产物多领域的应用。
背景技术
蛋白质和多糖是生物体内的两类重要的生物大分子,在生命体系中自然、有序的结合以保持细胞生命活动的完整性,它们之间的相互识别和相互作用在生物化学过程中具有重要的作用。同时,多糖和蛋白质来源丰富、环境友好、可生物降解、生物相容性好、无毒,多糖的存在会改变蛋白质分子间的组装行为，静电作用、疏水作用以及氢键等弱相互作用是它们实现自组装的驱动力。多糖与蛋白质的静电作用是一个基本的医学-化学现象，与许多已知生物学过程有关，也是它们实现自组装的主要驱动力。糖蛋白是参与许多生物过程的基本物质,这些过程包括细胞生长、细胞与细胞的粘着、免疫应答、受精、凝血块的降解、病毒增殖、寄生虫感染和炎症反应等。随着蛋白质组技术的不断发展,糖基化蛋白质组的研究将越来越受到广泛的重视。
植物在长期进化中，在同周围各种生存和生长环境条件(包括生物的和非生物的)相互作用中，形成了一种共同的适应能力，这就是进化中形成的共同防御系统和生长系统，这是植物共有的一类防御机制和生长机制，并由多条信号通路和代谢途径来实现。
研究表明，Hrp蛋白类作为植物的上游信号物质，与植物细胞壁中广泛存在的受体Hrp结合蛋白(Harpin-binding proteins)结合并激活植物中的多条信号通路，这些信号通路的激活，将实现对植物固有的细胞防御和生长多条代谢途径和机制的启动和调控，这就是Hrp蛋白类作为植物生长调节剂和生物农药的作用机制。目前，称为超敏蛋白的Hrp蛋白类产品已被广泛研究、开发和应用，具有广阔的前景。
随着基因工程技术的发展，越来越多的多肽、酶、信号分子、细胞因子等蛋白类制品被研究开发，这些蛋白类制品具有专一性强、时效高、应用广泛、安全性好等优点，但同时也发现了几个显著的不足之处，比如(1)可溶性和均一度较差；(2)抗原性及免疫原性；(3)容易从循环系统中被快速清除；(4)不稳定，容易被体内外的酶降解；(5)外用时，容易被外界环境的微生物快速降解和光降解。
对于Hrps类蛋白来说，由于植物种类繁多，不同物种间、品种间生物学特性差异较大，内外环境也不同以及基因间互作的差异，不同来源和条件下获得的Hrps类蛋白及其制剂的性质在使用条件和效果上存在明显的选择性差异，单一种类的Hrps蛋白在功效上已经明显表现出不足；Hrps类蛋白作为应用于植物的一类上游功能性信号蛋白质，其可溶性和稳定性较差，同时，在自然条件下使用(叶面喷施和根施时)，很容易被外界环境的微生物快速降解和光降解，从而影响它们的时效和功效。
鉴于以上原因，需要对Hrps类蛋白进行结构改造和化学修饰。
结构改造和化学修饰法是指在分子水平上对蛋白质进行局部改造和修饰，即在体外将蛋白质的侧链基团通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的分子基团和大分子进行共价连接，形成完全和部分不完全的共价复合物，从而部分改变蛋白质的性质和结构，并显示出比各自独立存在时更优越的性能，该技术和方法已经在医药卫生和食品业的蛋白质产品的应用上引起越来越广泛的重视。
需要强调指出的是，对不同来源的Hrps类蛋白多肽进行组合、结构改造和化学修饰形成共价多聚肽或非共价静电自组装多聚肽，国内外目前均未见报道。
常见用于蛋白质修饰的分子基团和大分子很多，主要有聚乙二醇类(包括PEG和mPEG等)、多糖类，以及同源蛋白质及人工合成的多肽类、聚氨基酸等。对蛋白质的结构改造和化学修饰技术近几年来发展很快，针对不同的酶、多肽或蛋白质的化学修饰形成了多种技术和方法，但是，都有其适用范围和局限性，至今还没有普适的通用技术和方法可供选择和利用，随着蛋白质修饰技术研究的深入和发展，必将进一步促成能提高对各种不同蛋白质的修饰特异性好、修饰率高、操作简便、产物稳定性和功效性好的新技术和新方法的产生。
发明内容
本发明目的是提供一种壳聚糖修饰的Hrps静电自组装三聚肽及其制备方法，使Hrps多肽乳化稳定性、均一性和结构稳定性更高、时效更长，功能更多，应用范围更广。
本发明的技术方案为：壳聚糖修饰的Hrps静电自组装三聚肽，它由三种Hrps多肽和壳聚糖通过静电自组装构成三聚肽，其结构通式为：(3Hrps)n-(C8H13NO5)n，所述三种Hrps多肽为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中的任意三种。
进一步地，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4的质量比为3:2:3:2。
进一步地，三种Hrps多肽与壳聚糖的质量配比为10:1-1:5。
进一步地，三种Hrps多肽与壳聚糖的质量配比为5:1。
进一步地，所述壳聚糖选用脱乙酰度40-98％，分子质量50-2000kDa的壳聚糖。
进一步地，所述壳聚糖选用脱乙酰度95％，分子质量10-40kDa的壳聚糖。
壳聚糖修饰的Hrps静电自组装三聚肽的制备方法，制备方法如下：
(1)从SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的四种Hrps多肽中任意选择三种Hrps多肽；
(2)向步骤(1)选择的三种Hrps多肽中加入壳聚糖，三种Hrps多肽与壳聚糖的质量配比为：10:1至1:5；加入磷酸缓冲液，使体系pH值为2-7；在温度为15-80℃、搅拌速度为30-300r/min条件下反应1-10小时；
(3)反应完成后，低温真空连续干燥，收集产物即得静电自组装三聚肽，(3Hrps)n-(C8H13NO5)n。
进一步地，步骤(2)中，磷酸缓冲液的浓度为10-200mmol/L，磷酸缓冲液加入量为三种Hrps多肽和壳聚糖总质量的10-500倍，使体系pH值为5.5。
优选地，制备方法如下：
(1)从SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的四种Hrps多肽中任意选择三种Hrps多肽；其中，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4四种Hrps多肽的质量配比为3:2:3:2。
(2)向步骤(1)选择的三种Hrps多肽中加入壳聚糖，壳聚糖选用脱乙酰度95％，分子质量10-40kDa的壳聚糖；三种Hrps多肽与壳聚糖的质量配比为：5:1；加入浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液加入量为三种Hrps多肽和壳聚糖总质量的250倍，使体系pH值为5.5；在温度为26℃、搅拌速度为80r/min条件下反应2小时；
(3)反应完成后，低温真空连续干燥，收集产物即得共价三聚肽，(3Hrps)n-(C8H13NO5)n。
四个Hrps功能多肽片段分别是:
SEQ NO ID:1所示的Hrps多肽片段来源于由356个氨基酸组成的HrpsNEccs基因编码蛋白所含的Harpin家族蛋白质高度保守区域片段，由200个氨基酸组成，位于蛋白的C-端(氨基酸157-356)。
SEQ NO ID:2所示的Hrps多肽片段来源于由370个氨基酸组成的HrpsZpst基因编码蛋白所含的Harpin家族蛋白质高度保守区域片段，由312个氨基酸组成，位于蛋白的N-端及C-端(氨基酸1-270和329-370)。
SEQ NO ID:3所示的Hrps多肽片段来源于由370个氨基酸组成的HrpsNEcb基因编码蛋白所含的Harpin家族蛋白质高度保守区域片段，由200个氨基酸组成，位于蛋白的C-端(氨基酸171-370)。
SEQ NO ID:4所示的Hrps多肽片段来源于由339个氨基酸组成的HrpsNEch基因编码蛋白所含的Harpin家族蛋白质高度保守区域片段，由326个氨基酸组成，位于蛋白的中段(氨基酸9-334)。
这些功能多肽片段都是专利发明人自主完成的基因及其表达产物研究成果，已由专利发明人在GenBank注册，它们注册号分别是：AY999002.1,AY999004,DQ355519.1及AY999001；按照这些功能多肽片段的大小、在保守区域位置和序列差异，以及Hrp蛋白基因来源细菌的特征，互补性地选择了这些片段，配置了四个组合，每种组合含有3个不同的多肽片段，将要进行的修饰多肽的四个片段组合分别是，I:1号、2号、3号,II:1号、2号、4号,III:1号、3号、4号和IV:2号、3号、4号，它们的表达通式是(3Hrps)n，四个片段组合的表达式分别为(3Hrps)n(I)、(3Hrps)n(II)、(3Hrps)n(III)和(3Hrps)n(IV)。
对以上4个Hrps功能多肽片段作进一步的说明：
1、几个Hrps功能多肽来源的源头基因编码的Harpin蛋白，它们的大小和氨基酸序列组成都差异较大。1号HrpNEccs蛋白由356个氨基酸组成；2号HrpZpst蛋白由370个氨基酸组成；3号HrpNEcb蛋白由370个氨基酸组成；而4号HrpNEch蛋白只有339个氨基酸。
2、四个基因编码的Harpin蛋白都含Harpin家族蛋白质高度保守区域(DOMAIN)。Harpin家族蛋白质高度保守区域是Harpin类蛋白的主要功能区域，其卓越的生物功效主要由所含Harpin家族蛋白质高度保守区域的序列，以及这些保守区域的多肽高级结构所决定。
3，四个Harpin蛋白及其所含之Harpin家族蛋白质高度保守区域间的氨基酸序列无论从序列大小、位置以及氨基酸组成，它们间的差异都极大。1号蛋白的Harpin家族蛋白质高度保守区域由200个氨基酸组成，位于蛋白的C-端(氨基酸157-356)；2号蛋白的Harpin家族蛋白质高度保守区域由312个氨基酸组成，位于蛋白的N-端及C-端(氨基酸1-270和329-370)；3号蛋白的Harpin家族蛋白质高度保守区域由200个氨基酸组成，位于蛋白的C-端(氨基酸171-370)；4号蛋白的Harpin家族蛋白质高度保守区域由326个氨基酸组成，位于蛋白的中段(氨基酸9-334)。这4个Harpin家族蛋白质高度保守区域的多肽片段氨基酸序列以及保守区域的多肽高级结构决定了它们具有的卓越的生物功效。
壳聚糖是一类天然多糖，化学分子式是(C8H13NO5)n，脱乙酰度40-98％、一般分子质量50-2000kDa、超低分子质量10-40kDa,具有无毒、与体液不反应、良好的生物相容性、对细胞有亲合性、可降解性等特点。
壳聚糖是一种重要的生命物质，是迄今发现的自然界中唯一的碱性多糖，在自然界中，其含量仅次于纤维素。被誉为自然界的“第六生命元素”，壳聚糖(Chitosan,CS)是一种天然多糖，是甲壳素的脱乙酰产物，具有无毒、与体液不反应、良好的生物相容性、对细胞有亲合性、可降解性等特点。壳聚糖能够在生物体中酶解成易被活体吸收、无毒副作用的小分子物质，不会残留在活体内，是一类生物降解吸收型高分子材料。壳聚糖骨架具有疏水性，其侧链的氨基在溶液中由于电离而带正电，是典型的阳离子聚电解质。壳聚糖与生物大分子DNA和蛋白质通过静电作用等非共价键可以形成稳定的复合物，可以作为输送和保护DNA、蛋白质以及多肽等大分子的载体。由于甲壳素具有这种独特功能，它被欧美科学家誉为和蛋白质、脂肪、糖类、维生素、矿物质同等重要的人体第六生命要素。
本发明所涉及的Hrps功能蛋白多肽片段，它们是只有一、二、三级结构而无四级结构的非酶蛋白质，是典型的两性聚电解质,在溶液中发生电离而表面存在大量的电荷；壳聚糖是典型的聚阳离子电解质,在稀酸溶液中被电离而形成表面带正电荷的刚性链。对于这两种聚电解质而言，表面电荷密度与带电性质除了与其自身的结构因素有关外,溶液pH值是主要影响因素。与其它多糖和蛋白质的混合溶液一样,在它们的混合溶液中,壳聚糖与Hrps功能蛋白多肽片段间存在静电作用、疏水作用、氢键以及范德华力非共价键相互作用,从而引起它们之间的自组装,静电作用是实现它们自组装的主要驱动力。
事实上，糖蛋白是一类以多种形式连接的复合物。应用蛋白质组合、结构改造和化学修饰技术，在优选的控制条件下，使壳聚糖和几个Hrps多肽发生静电自组装作用，生成完全和部分不完全静电自组装三聚肽。该静电自组装三聚肽使原来Hrps多肽的功能性质得到较大的改善，无毒，且具有较强的乳化稳定性和较大的抵抗外界环境变化的能力，作用更强，并扩大了新生成物的功能和应用范围。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
采用壳聚糖修饰三种Hrps功能多肽组合片段，通过该技术方法，在壳聚糖和三种Hrps多肽片段两种聚电解质的混合溶液中,壳聚糖与三种Hrps功能多肽片段在静电作用、疏水作用、氢键以及范德华力非共价键相互作用下，引起它们之间的不同程度自组装，静电作用是实现它们自组装的主要驱动力，生成完全和部分不完全静电自组装三聚肽，即(3Hrps)n-(C8H13NO5)n静电自组装三聚肽，使新制备的静电自组装三聚肽产品的乳化稳定性、均一性和结构稳定性更高、时效更长，功能更多，作用更强，应用范围更广，该技术及其制备相关产物可以广泛应用于农业领域的蛋白多肽类农肥、农药、生长调节剂产品生产，应用于医药领域的蛋白多肽类外用药、内服药、肌肉注射药和静脉注射药产品的生产，以及食品业的有关蛋白多肽产品的生产加工。
具体实施方式
技术实施过程和条件包含：
(1)所选Hrps功能多肽1-4号片段在组合中的质量(以mM计量)配比：通常是以相同至不同mM质量组成组合；(2)壳聚糖的选择：分子式：(C8H13NO5)n，脱乙酰度(40-98％)、分子质量(50-2000kDa)；(3)多肽片段四个组合中的3个Hrps功能多肽片段和壳聚糖的质量配比：10:1至1:5之间；(4)反应浓度：3个Hrps多肽片段和壳聚糖混合,10-200mM磷酸缓冲液稀释为混合物质量的10至500倍；(5)反应pH：10-200mM磷酸缓冲液pH 2-7；(6)反应温度和时间：反应温度为15℃-80℃，反应时间1-10小时，反应时，反应混合液需要搅拌，搅拌速度为每分钟30-300转；(7)制备Hrps功能多肽组合片段-壳聚糖静电自组装三聚肽的最佳条件以反应溶液浑浊度从降低、稳定、到开始升高和诱发凤仙花叶片发生过敏反应的时间以及燕麦胚轴生长速度为最终筛选依据(生物学效应)；(8)反应完成后，低温真空连续干燥，最后收集的产物是：(3Hrps多肽)n-(C8H13NO5)n静电自组装三聚肽，简化通式为：(3Hrps)n-(C8H13NO5)n。(9)生成物检测：采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)，结果表明,(3Hrps)n-(C8H13NO5)n静电自组装三聚肽形成大分子，在分离胶和浓缩胶界面处出现大分子量的新谱带,3个Hrps多肽片段的电泳谱带随着制备反应的进行逐渐减弱，证实Hrps多肽组合片段与壳聚糖之间发生静电交联,生成了静电自组装三聚肽。对比试验表明，Hrps多肽组合片段经壳聚糖修饰后,(3Hrps)n-(C8H13NO5)n静电自组装三聚肽的反应溶液浑浊度从降低、稳定、到开始升高；zeta电位发生明显变化,等电点下降1个pH单位以上。
Hrps蛋白多肽片段四个组合的(3Hrps)n-(C8H13NO5)n静电自组装三聚肽的制备，均采用相同方法同时并列进行，取得一致的结果。
实施例1
Hrps功能多肽组合片段-壳聚糖静电自组装三聚肽的制备:
(1)所选Hrps功能多肽1-4号片段在组合中的质量(以mM计量)配比：通常是以相同至不同mM质量组成组合；
(2)壳聚糖的选择：分子式(C8H13NO5)n，脱乙酰度40-98％、分子质量50-2000kDa；
(3)多肽片段四个组合中的3个Hrps功能多肽片段和壳聚糖的质量配比：10:1至1:5之间；
(4)反应浓度：3个Hrps多肽片段和壳聚糖混合,10-200mM磷酸缓冲液稀释为混合物质量的10至500倍；
(5)反应pH：10-200mM磷酸缓冲液pH 2-7；
(6)反应温度和时间：反应温度为15℃-80℃，反应时间1-10小时，反应时，反应混合液需要搅拌，搅拌速度为每分钟30-300转；
(7)制备Hrps功能多肽组合片段-壳聚糖静电自组装三聚肽的最佳条件以反应溶液浑浊度从降低、稳定、到开始升高和诱发凤仙花叶片发生过敏反应的时间以及燕麦胚轴生长速度为最终筛选依据(生物学效应)；
(8)反应完成后，低温真空连续干燥，最后收集的产物是：(3Hrps多肽)n-(C8H13NO5)n静电自组装三聚肽，简化通式为：(3Hrps)n-(C8H13NO5)n。
(9)生成物检测：采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)，结果表明,(3Hrps)n-(C8H13NO5)n静电自组装三聚肽形成大分子，在分离胶和浓缩胶界面处出现大分子量的新谱带,3个Hrps多肽片段的电泳谱带随着制备反应的进行逐渐减弱，证实Hrps多肽组合片段与壳聚糖之间发生静电交联,生成了静电自组装三聚肽。对比试验表明，Hrps多肽组合片段经壳聚糖修饰后,(3Hrps)n-(C8H13NO5)n静电自组装三聚肽的反应溶液浑浊度从降低、稳定、到开始升高；zeta电位发生明显变化,等电点下降1个pH单位以上。
Hrps蛋白多肽片段四个组合的(3Hrps)n-(C8H13NO5)n静电自组装三聚肽制备，均采用同样方法同时并列进行，取得一致的结果。
制备Hrps多肽功能组合片段-壳聚糖静电自组装三聚肽的最佳条件以最终筛选依据(生物学效应)为响应值时，经多次对制备条件进行试验和筛选，获得优选的控制条件是，(1)Hrps功能多肽1-4号片段在组合中的质量(以mM计量)配比：通常是以相同至不同mM质量组成组合，优选为1、2、3、4号片段均为相同mM质量，更优选为1号1mM、2号2mM、3号1mM和4号2mM，进一步优选为1号2mM、2号3mM、3号2mM和4号3mM，最优选为1号3mM、2号2mM、3号3mM和4号2mM组成组合；(2)壳聚糖的选择：分子式(C8H13NO5)n，脱乙酰度40-98％，分子质量50-2000kDa；脱乙酰度，优选为50％，更优选为60％，进一步优选为80％，最优选约为95％；分子质量，优选为50kDa，更优选为100kDa，进一步优选为80kDa，最优选择超低分子质量10-40kDa；(3)Hrps多肽功能片段和壳聚糖的质量配比：通常为10:1到1:5，优选为8:1，更优选为1:5，进一步优选为6:1，再优选为1:1，最优选为5:1；(4)反应浓度：Hrps多肽组合片段和壳聚糖混合,20mM磷酸缓冲液稀释为混合物质量的为10-500倍，优选约为400倍，更优选约为50倍，进一步优选为300倍，再优选为150倍，最优选为250倍；(5)反应pH：10-200mM磷酸缓冲液pH 2-7，磷酸缓冲液,优选为10mM，更优选为150mM，进一步优选为80mM，再优选为50mM，最优选为20mM；反应pH,优选pH 4，更优选为pH 8，进一步优选为pH 6，最优选为pH 5.5；(6)反应温度和时间：反应温度通常为15℃-80℃，优选为40℃，更优选为50℃，进一步优选为30℃，再优选为20℃，最优选为26℃，特别要指出的是，对于Hrps功能多肽而言，不要把温度提高到80℃，以免影响Hrps功能多肽的生物学效应；反应时间通常为1-10小时，优选为7小时，更优选约为1小时，进一步优选为4小时，最优选为2小时；反应时，反应混合液需要搅拌，搅拌速度通常为每分钟30-300转，优选为150转，更优选为100转，进一步优选为50转，最优选为80转；(7)制备Hrps功能多肽组合片段-壳聚糖静电自组装三聚肽最佳条件的最终筛选依据(生物学效应)是：反应溶液浑浊度从降低、稳定、到开始升高，诱发凤仙花叶片发生过敏反应的时间不得超过4小时，以及燕麦胚轴生长速度不得低于0.03cm/h；(8)反应完成后，低温真空连续干燥，最后收集的产物是：(3Hrps多肽)n-(C8H13NO5)n静电自组装三聚肽，简化通式为：(3Hrps)n-(C8H13NO5)n。
Hrps蛋白多肽片段的四个组合的(3Hrps)n-(C8H13NO5)n静电自组装三聚肽制备的优选控制条件试验，均采用同样方法同时并列进行，取得一致的结果，分别表示为，(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I)、(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(II)、(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(III)和(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(IV)。完成最终生成物(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽的制备以及产物检测。
进一步采用同样制备技术和条件，优选控制条件，以壳聚糖修饰更多Hrps类蛋白(HarpinEccs、HarpinEcc、HarpinEa、HarpinEch、Harpinpst、Harpinpsg、Harpinpss等，以及通过基因重组方式获得的融合蛋白HarpinEccs+HarpinEcc、HarpinEccs+HarpinEa、HarpinEccs+HarpinEch、HarpinEcc+HarpinEca、HarpinEcc+HarpinEch、HarpinEa+HarpinEch等)，制备多类型的静电自组装异源二聚肽、静电自组装异源三聚肽、静电自组装异源四聚肽以及静电自组装异源多聚肽。
实施例2
壳聚糖修饰Hrps蛋白多肽片段制备的四个组合的(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽剂型设计:
(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽在制备、储存和应用中的设计剂型有：原药，包括固体即原粉和液体即原液；储存和应用的产品剂型包括颗粒剂、可湿性粉剂、水剂、缓释剂以及与其他肥料、或杀菌剂、杀虫剂或植物生长调节剂调制的混合制剂等。另外，(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽的相关辅料和助剂，包括食品级的可溶性大量营养成分及少量营养成分。由于这类功能多肽静电自组装聚合体(三聚肽)及其制剂无毒、无公害，使用时无需特殊的防护。
实施例3
壳聚糖修饰Hrps蛋白多肽片段制备的四个组合的(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽的使用方法和要求:
应用这类功能多肽静电自组装聚合体时：(1)处理植物的适宜方法包括浸种、拌种、种子包衣、蘸根、叶面喷雾、根施、注射、花果喷涂等；(2)处理植物的适宜条件包括选择适宜的用药时间和用药时的环境气象条件；颗粒剂、可湿性粉剂或水剂应用无氯的河水、井水、地下水或自来水配成要求的使用浓度，切忌与酸、碱混合，药品应保存在阴凉干燥处；(3)处理植物的具体要求包括整个生长季节均适于用药，一季作物可施药3-6次，每次间隔10-20天，施用时间和次数视使用目的确定，使用时已配制好的药液建议在24小时内用完。
实施例4
壳聚糖修饰Hrps功能多肽片段制备的四个组合的(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽的稳定性检测:
我们按实施例1方法制备的(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽与对应的Hrps多肽组合的混合片段，在几种条件下的稳定性进行了比较，结果如下：
在室温下，均配制成含量3％的水溶液，Hrps多肽组合的混合片段水溶液静置20分钟后，出现明显的分层，1小时后，形成絮状沉淀；(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽水溶液静置6小时后，溶液仍均匀，未出现分层。
裸露在自然条件下，均配制成含量3％的水溶液，分别在培养皿注入一薄层配制的水溶液，Hrps多肽组合的混合片段水溶液3天后，取样电泳时Hrp蛋白谱带已经很弱了，5天后，Hrps蛋白谱带已经消失，表明Hrps多肽基本解体；(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽水溶液7天后，电泳时它们的谱带还清晰可见。
在100℃条件下，均配制成含量3％的水溶液，Hrps多肽组合混合片段水溶液加热25分钟后，注射不再引起烟草叶片过敏反应，Hrps多肽基本丧失活性；(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽水溶液加热30分钟后，注射引起烟草叶片过敏反应，共价三聚肽仍有活性，50分钟后还有较弱的活性保持。
暴露在30000Lux强光照条件下，均配制成含量3％的水溶液，分别在培养皿注入一薄层配制的水溶液，Hrps多肽组合混合片段水溶液强光照60分钟后，注射不再引起烟草叶片过敏反应，Hrps多肽丧失活性；(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽强光照120分钟后，注射引起烟草叶片过敏反应，仍有活性，150分钟后不再引起烟草叶片过敏反应，才丧失活性。
Hrps蛋白多肽片段的四个组合的(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽的稳定性试验，同样方法同时并列进行，获得类似的结果。
实施例5
壳聚糖修饰Hrps功能多肽片段制备的四个组合的(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽的更多的功能
用于浸种、拌种，使种子出芽早，发芽率高，出芽整齐，芽苗茁壮，防病抗逆，根系发达；用于幼苗叶面喷施、根施，植株健壮，生长势好，防病抗逆，根系发达；用于成苗叶面喷施、根施，提高作物的光合效率，枝叶繁茂，分枝分蘖多，植株造型好，提高孕花孕果率，具有增强作物对病虫害和多类不良环境(低温、高热，干旱、水涝等)危害的更强的诱抗能力，大幅度减轻危害，并具强大的修复能力；用于花前叶面喷施、根施，提高作物的光合效率，花枝花穗多，提前开花挂果，果枝果穗多，防止落花落果，具有增强作物对病虫害和多类不良环境(低温、高热，干旱、水涝等)危害的更强的诱抗能力，大幅度减轻危害，并具强大的修复能力；用于开花结果叶面喷施、根施，提高作物的光合效率，提高坐果率、结实率和成熟度，果实大小均匀，显著提高产量和质量，提升农产品商品品质，减轻收获后病害危害，延长农产品货架保鲜期，增产增收；
实施例6
壳聚糖修饰Hrps功能多肽片段制备四个组合的(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽的更广的使用范围
进行(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽与单一HrpEcb蛋白和对应的Hrps多肽组合的混合片段三种蛋白制剂生物学活性—过敏反应的比较试验，对36种植物叶片进行过敏反应试验，24小时后，观察统计发生典型特征性过敏反应的植物种类数，过敏反应是植物诱导抗逆性的外在表现，因而通过植物是否发生过敏反应或过敏反应的强弱，就可以比较相应诱抗蛋白的生物学活性和诱导植物抗性的能力，(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽能诱导36种供试植物产生过敏反应，它们是烟草、辣椒、茄子、西红柿、土豆、草莓、黄瓜、空心菜、鸡冠花、玻璃海棠、九月菊、三色堇、胭脂花、矮牵牛、葡萄、月季、槐树、豌豆、桃树、一串红、丝瓜、四季豆、花椰菜、菠菜、油菜、薯蓣、豇豆、蚕豆、玉米、水稻、大豆、仙客来、桑树、南瓜、椿树、枇杷，过敏反应斑较大，组织坏死程度(过敏反应强度)较高；单一HrpEcb蛋白能诱导16种供试植物产生过敏反应，它们是烟草、辣椒、茄子、西红柿、土豆、草莓、黄瓜、空心菜、鸡冠花、玻璃海棠、九月菊、三色堇、胭脂花、矮牵牛、葡萄、月季,过敏反应斑或组织坏死程度(过敏反应强度)一般或较弱；对应的Hrps多肽组合的混合片段能诱导26种供试植物产生过敏反应，它们是烟草、辣椒、茄子、西红柿、土豆、草莓、黄瓜、空心菜、鸡冠花、玻璃海棠、九月菊、三色堇、胭脂花、矮牵牛、葡萄、月季、槐树、豌豆、桃树、一串红、丝瓜、四季豆、花椰菜、菠菜、油菜、薯蓣，过敏反应斑或组织坏死程度(过敏反应强度)一般或较弱。结果表明，(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽、单一HrpEcb蛋白和对应的Hrps多肽组合的混合片段都具有诱导供试植物抗性的能力和生物学活性，在诱导过敏反应的植物种类范围以及诱导抗性的能力和生物学活性上，(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽最优、最强，其次是对应的Hrps多肽组合的混合片段，再其次是单一HrpEcb蛋白，显然，(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽具有更广的使用范围和更强的诱抗能力。
实施例7
壳聚糖修饰Hrps功能多肽片段制备四个组合的(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽更强大的增效动力
作为添加中间补体，应用于肥料产品中，是一类独特而功能强大的增效动力，可以显著强化和提升肥料使用效果和效率，可以节省30％以上的肥料使用量，具有更强的诱抗能力，并实现增产、增收、安全的效果。
作为添加中间补体，应用于农药产品中，是一类独特而功能强大的增效动力，可以显著强化和提升农药使用效果和效率，特别是对细菌和病毒病害的防治具有更强的诱抗能力，可以节省80％的农药使用量，并实现增产、增收、安全的效果。
作为添加中间补体，应用于植物生长调节剂产品中，是一类独特而功能强大的增效动力，可以显著强化和提升植物生长调节剂使用效果和效率，可以节省80％的植物生长调节剂使用量，具有更强的诱抗能力，并实现增产、增收、安全的效果。
实施例8,壳聚糖修饰Hrps功能多肽片段制备的四个组合的(3Hrps)n-(C8H13NO5)n(I-IV)静电自组装三聚肽在多种供试作物上的使用效果
(1)四川省德阳市2个市县的5个镇村进行了20余批次大田的静电自组装三聚肽试验和示范，实施面积总量360余亩，主要供试作物为土豆、黄瓜、玉米、辣椒、西红柿、晒烟、红油菜、花椰菜、水稻、桑树、油桃等，增产幅度为8％至36％，对病虫害和逆境的更强的诱抗能力，提高了产品品质和商品性，并延长了产品的保存期。
(2)四川省成都市5个区县的7个村进行了三个生长季节10余批次大田的静电自组装三聚肽试验和示范，实施面积总量280余亩，主要供试作物为土豆、黄瓜、辣椒、茄子、芹菜、白菜、茶叶(白茶)、草莓、果桑、葡萄、枇杷，薯蓣以及紫金花、仙客来、蝴蝶兰、三色堇、一品红、矮牵牛、非洲凤仙花、菊花、倒挂金钟、金鱼草、玻璃海棠等二十余种花卉，蔬菜和水果类增产幅度为12％至32％，表现出对病虫害和逆境的显著诱抗作用，提高了产品品质和商品性，并延长了产品的保存期；花卉表现出对病虫害和逆境的更强的诱抗能力，塑型作用较强，提高了产品商品性，并延长了花期，增加了花数和色彩更为鲜艳；茶叶提高了品质，并可以多采摘1次，经济效益显著。
(3)四川省泸州市2个区县的静电自组装三聚肽效果试验示范，主要作物为树莓、莲花白和高粱，总面积60余亩，树莓和莲花白的产量提高30％以上，高粱产量提高24％，表现出对病虫害和逆境的更强的诱抗能力，提高了产品品质和商品性。
(4)云南省2个村的云烟种植基地静电自组装三聚肽效果试验示范，共种植120余亩烟草，烟叶收获后，烟叶等级普遍提高一个级别，产量增加24％，每亩烟田烟农提高收入380余元(增收达30％)。
(5)云南省1个县的花卉基地，60余亩多种花卉栽培种植中，示范使用静电自组装三聚肽产品，结果表明，对病虫害和逆境具有显著驱避和更强的诱抗能力，，对花的株形，塑型作用较强，提高了产品商品性，并延长了花期，增加了花数和色彩更为鲜艳。
(6)云南省玉溪市的2个村镇的蔬菜种植基地，在50余亩玉米、辣椒、茄子、西芹的种植中，示范使用了静电自组装三聚肽产品，结果表明，收获时，除对病虫害和逆境具有显著驱避和更强的诱抗能力外，产量提高15％至38％，并提高了产品的商品性。
(7)云南省1个县的普洱茶基地，在60余亩普洱茶种植地示范使用静电自组装三聚肽产品，提前了收获期，产量提高30％以上，熟化加工过程更快了，大幅度提升口感和茶香味。
(8)山西省榆次的农科试验基地，在黄瓜、生菜、芹菜种植地示范使用和验证静电自组装三聚肽产品的功效，经严格测产，黄瓜增产25％，每亩增产黄瓜900余公斤，芹菜增产10.8％，生菜增产7.6％，取得了良好的经济效益。
(9)山西省运城1个县的棉花种植，第一年8亩，第二年60亩，在棉花种植地示范使用和验证静电自组装三聚肽产品的功效，经有关部门专家亲自严格测产，棉花增产幅度达31.46％以上。
(10)山西省运城2个县市的黄瓜、油白菜、芹菜使用静电自组装三聚肽产品的试验示范，经严格测产验收，黄瓜增产50％以上，油白菜、芹菜增产20％以上，给农户带来显著地经济效益。
(11)山西省1个县的1个村镇的小麦、玉米、西瓜、甜瓜、西红柿、杏、苹果、梨、大枣等使用静电自组装三聚肽产品的试验示范，进行了3年的试验，总面积280余亩，结果表明，除对病虫害和逆境具有显著驱避和更强的诱抗能力外，小麦产量提高8.7％-13％，玉米提高22.6％以上，特别是小麦度过了倒春寒，玉米抗过了严重的春旱，西红柿提高28％，西瓜提高28％，甜瓜提高32％，杏提高30％，苹果、梨、大枣的产量提高25％，提高了产品的商品性和延长了储存期。
(12)青海省三江源和牧区的草原植被保护和牧区的人工种植牧草，在30000亩草场上大面积示范使用静电自组装三聚肽产品，结果表明，用不同方式使用静电自组装三聚肽产品，牧草的产量提高了27％至33％。
(13)青海省1个县2个村镇的多种蔬菜和粮食作物使用静电自组装三聚肽产品的试验示范，在青稞、小麦、大葱、西红柿等作物的试验表明，除对病虫害和逆境具有显著驱避和更强的诱抗能力外，青稞产量提高11.47％，小麦提高15％，大葱提高19％，西红柿提高13％，并大大提高了产品的商品性。
(14)甘肃河西走廊地区的特种药材种植基地和土豆种植基地的静电自组装三聚肽有关试验和示范，种植面积300余亩，结果表明，特种药材有效成分的产量和品质大幅度提升，加工品质尤为突出，土豆增产21％以上，大大提高了经济效益。
(15)新疆建设兵团2个农场的棉花使用静电自组装三聚肽产品的试验和示范，两个农场实施了120亩的试验和示范，结果表明，棉花植株明显驱避棉铃虫，具有更强的诱抗能力，并抗黄萎病，产量提高19％-20％，经济效益显著。
(16)新疆南疆1个县的大枣使用静电自组装三聚肽产品的试验和示范，实施面积180亩，结果表明，使用静电自组装三聚肽产品后，裂果率减少了80％，商品率大幅度提高，产量提高10％-25％，经济效益显著。
(17)该技术及其制备相关产物可以广泛应用于农业领域的蛋白多肽类农肥、农药、生长调节剂产品生产，应用于医药领域的蛋白多肽类外用药、内服药、肌肉注射药和静脉注射药产品生产，以及食品业的有关蛋白多肽产品的生产加工。
Hrps蛋白之间及功能多肽片段(DOMAIN)之间的比对
Alignment of 1,9,10(whole proteins)
Domain alignment of 1,9,10:
Alignment of 1,10,12:
Alignment of Domains of 1,10,12:
Alignment of 9,10,12:
Alignment of Domains of 9,10,12:
SEQUENCE LISTING
<110> 四川本原作物科技有限公司
<120> 壳聚糖修饰的Hrps静电自组装三聚肽及其制备方法
<160> 4
<170> PatentIn Version 2.1
<210> 1
<211> 356
<212> PRT
<213> 胡萝卜软腐欧文氏菌白菜亚种（Erwiniacarotovorum subsp. Carotovorumstrain CSSY002 ）
<220>
<221> DOMAIN
<222> (157)-(357)
<400> 1
Met Leu Asn Ser Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Gln Ile Thr Ile Lys
1 5 10 15
Ala Gly Gly Asn Gly Gly Leu Phe Pro Ser Gln Ser Ser Gln Asn Gly
20 25 30
Gly Ser Pro Ser Gln Ser Ala Phe Gly Gly Gln Arg Ser Asn Ile Ala
35 40 45
Glu Gln Leu Ser Asp Ile Met Thr Thr Met Met Phe Met Gly Ser Met
50 55 60
Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu
85 90 95
Gly Ser Ser Leu Gly Ser Gly Leu Gly Ser Ala Leu Gly Gly Gly Leu
100 105 110
Gly Gly Val Leu Gly Ala Gly Met Asn Ala Met Asn Pro Ser Ala Met
115 120 125
Met Gly Ser Leu Leu Phe Ser Ala Leu Glu Asp Leu Leu Gly Gly Gly
130 135 140
Met Ser Gln Gln Gln Gly Gly Leu Phe Gly Asn Lys Gln Pro Ser Ser
145 150 155 160
Pro Glu Ile Ser Ala Tyr Thr Gln Gly Val Asn Asp Ala Leu Ser Ala
165 170 175
Ile Leu Gly Asn Gly Leu Ser Gln Thr Lys Gly Gln Thr Ser Pro Leu
180 185 190
Gln Leu Gly Asn Asn Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe
195 200 205
Asn Gln Leu Gly Ser Thr Leu Gly Met Ser Val Gly Gln Lys Ala Gly
210 215 220
Leu Gln Glu Leu Asn Asn Ile Ser Thr His Asn Asp Ser Pro Thr Arg
225 230 235 240
Tyr Phe Val Asp Lys Glu Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln
245 250 255
Phe Met Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Ala Glu Tyr Gln Lys
260 265 270
Asp Asn Trp Gln Thr Ala Lys Gln Glu Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala
275 280 285
Leu Ser Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Lys Gly Ser Met Asp Lys
290 295 300
Phe Met Lys Ala Val Gly Met Ile Lys Ser Ala Ile Ala Gly Asp Thr
305 310 315 320
Gly Asn Thr Asn Leu Ser Ala Arg Gly Asn Gly Gly Ala Ser Leu Gly
325 330 335
Ile Asp Ala Ala Met Ile Gly Asp Arg Ile Val Asn Met Gly Leu Lys
340 345 350
Lys Leu Ser Ser
355
<210> 2
<211> 370
<212> PRT
<213>西红柿叶斑菌（Pseudomonas syringae pv. tomato strain CSCS008）
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)-(270)，(329)-(370)
<400> 2
Met Gln Ala Leu Asn Ser Ile Ser Ser Leu Gln Thr Ser Ala Ser Leu
1 5 10 15
Phe Pro Val Ser Leu Asn Ser Asp Val Ser Ala Asn Thr Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Lys Glu Leu Lys Ala Val Ile Asp Gln Leu Val Gln Ala Leu Thr
35 40 45
Gln Ser Gly Gln Leu Asp Glu Thr Ser Pro Leu Gly Lys Met Leu Ala
50 55 60
Lys Ala Met Ala Ala Asp Gly Lys Ser Ala Asn Ser Ile Asp Asp Ile
65 70 75 80
Thr Ala Ser Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn Phe
85 90 95
Gly Ala Ser Ala Gly Ile Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Gly
100 105 110
Gly Ala Gly Ser Gly Ser Gly Val Gly Gly Gly Leu Ser Ser Asp Ala
115 120 125
Gly Ala Gly Gln Ser Asp Leu Met Ser Gln Val Leu Asn Gly Leu Gly
130 135 140
Lys Ala Val Leu Asp Asp Leu Leu Thr Pro Ser Gly Glu Gly Gly Thr
145 150 155 160
Thr Phe Ser Ser Asp Asp Met Pro Thr Leu Glu Lys Val Ala Gln Phe
165 170 175
Met Asp Asp Asn Lys Ala Gln Phe Pro Thr Arg Asp Gly Gly Ser Trp
180 185 190
Met Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Gly Leu Asp Ala Gln Glu Thr Ala
195 200 205
Gln Phe Arg Ser Ala Leu Asp Val Ile Gly Gln Gln Leu Gly Gln Gln
210 215 220
Gln Gly Asp Ala Ser Gly Val Thr Ser Gly Gly Gly Leu Gly Ser Pro
225 230 235 240
Val Ser Asp Ser Ser Leu Gly Asn Pro Ala Ile Asp Ala Asn Thr Gly
245 250 255
Pro Ala Ala Asn Gly Asn Ala Ser Val Asp Val Gly Gln Leu Ile Gly
260 265 270
Gln Leu Ile Asp Arg Gly Leu Gln Ser Val Ser Ser Gly Gly Gly Leu
275 280 285
Gly Thr Pro Val Asp Asn Ser Thr Gln Pro Thr Gly Gly Thr Pro Ala
290 295 300
Ala Asn Pro Thr Gly Asn Val Ser Asn Gln Asp Leu Gly Gln Leu Leu
305 310 315 320
Ser Gly Leu Leu Gln Arg Gly Leu Glu Ala Thr Leu Gln Asp Ala Gly
325 330 335
Asn Thr Gly Ala Asp Leu Gln Ser Ser Ala Ala Gln Val Ala Ala Gln
340 345 350
Leu Ile Asn Ala Leu Leu Gln Gly Thr Asn Asn Gln Thr Asn Gln Ala
355 360 365
Val Ala
370
<210> 3
<211> 370
<212> PRT
<213> 胡萝卜软腐欧文氏菌甜菜亚种（Pectobacteriumbetavasculorum strainEcbCSL101）
<220>
<221> DOMAIN
<222> (171)-(370)
<400> 3
Met Leu Asn Ser Leu Gly Gly Gly Thr Ser Leu Gln Ile Thr Ile Lys
1 5 10 15
Ala Gly Gly Asn Gly Asp Leu Phe Gln Ser Gln Ser Ser Gln Asn Gly
20 25 30
Gly Ala Pro Ser Gln Leu Gly Leu Gly Gly Gln Arg Ser Asn Ile Ala
35 40 45
Glu Gln Leu Ser Asp Ile Met Thr Thr Met Met Phe Met Gly Ser Met
50 55 60
Met Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Met Gly Gly Gly Leu Gly
65 70 75 80
Gly Ala Leu Gly Gly Leu Gly Ser Ser Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly
85 90 95
Leu Leu Gly Gln Gly Leu Gly Gly Gly Leu Ala Gly Gly Leu Gly Ser
100 105 110
Ser Leu Gly Ser Gly Leu Gly Gly Ala Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly
115 120 125
Ala Leu Gly Ala Gly Met Asn Ala Met Asn Pro Ser Ala Met Met Gly
130 135 140
Ser Leu Leu Phe Ser Ala Leu Glu Asp Leu Leu Gly Gly Gly Met Ser
145 150 155 160
Gln Gln Gln Gly Gly Leu Phe Gly Asn Lys Gln Pro Ala Ser Pro Glu
165 170 175
Ile Ser Ala Tyr Thr Gln Gly Val Asn Asp Thr Leu Ser Ala Ile Leu
180 185 190
Gly Asn Gly Leu Ser Gln Ala Lys Gly Gln His Ser Pro Leu Gln Leu
195 200 205
Gly Asn Asn Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gln
210 215 220
Leu Gly Ser Thr Leu Gly Met Gly Val Gly Gln Lys Ala Gly Leu Gln
225 230 235 240
Glu Leu Asn Asn Ile Ser Thr His Asn Gly Ser Pro Thr Arg Tyr Phe
245 250 255
Val Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met
260 265 270
Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Asn
275 280 285
Trp Gln Thr Ala Lys Gln Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser
290 295 300
Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Lys Gly Ser Met Asp Lys Phe Met
305 310 315 320
Lys Ala Val Gly Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Gly Asn
325 330 335
Thr Asn Leu Asn Ala Arg Gly Asn Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ile Asp
340 345 350
Ala Ala Met Ile Gly Asp Arg Ile Val Asn Met Gly Leu Gln Lys Leu
355 360 365
Ser Ser
370
<210> 4
<211> 339
<212> PRT
<213> 菊花软腐欧文氏菌（Erwinia chrysanthemi strain CSCL006）
<220>
<221> DOMAIN
<222> (9)-(334)
<400> 4
Met Gln Ile Thr Ile Lys Ala His Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser
1 5 10 15
Gly Leu Gly Leu Gly Ala Gln Gly Leu Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala
20 25 30
Ser Ser Leu Gly Ser Ser Val Asp Lys Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lys
35 40 45
Leu Thr Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phe Gly Gly Ala Leu Ala Gln
50 55 60
Gly Leu Gly Ala Ser Ser Lys Gly Leu Gly Met Ser Asn Gln Leu Gly
65 70 75 80
Gln Ser Phe Gly Asn Gly Ala Gln Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser Val
85 90 95
Pro Lys Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys Met Phe Asp Lys Ala Leu
100 105 110
Asp Asp Leu Leu Gly His Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr Asn Gln Ser
115 120 125
Asn Gln Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Gln Met Thr Gln Gly
130 135 140
Asn Met Asn Ala Phe Gly Ser Gly Val Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile
145 150 155 160
Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gln Ser Met Ser Gly Phe Ser Gln Pro Ser
165 170 175
Leu Gly Ala Gly Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn
180 185 190
Gln Leu Gly Asn Ala Ile Gly Met Gly Val Gly Gln Asn Ala Ala Leu
195 200 205
Ser Ala Leu Ser Asn Val Ser Thr His Val Asp Gly Asn Asn Arg His
210 215 220
Phe Val Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe
225 230 235 240
Met Asp Gln Tyr Pro Glu Ile Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp
245 250 255
Gly Trp Ser Ser Pro Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu
260 265 270
Ser Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lys Phe
275 280 285
Arg Gln Ala Met Gly Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Gly
290 295 300
Asn Thr Asn Leu Asn Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ile
305 310 315 320
Asp Ala Ala Val Val Gly Asp Lys Ile Ala Asn Met Ser Leu Val Ala
325 330 335
Ala Asn Ala

Claims (9)

1.壳聚糖修饰的Hrps静电自组装三聚肽，其特征在于，它由三种Hrps多肽和壳聚糖通过静电自组装构成三聚肽，其结构通式为：(3Hrps)n-(C8H13NO5)n，所述三种Hrps多肽为SEQID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中的任意三种。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖修饰的Hrps静电自组装三聚肽，其特征在于，SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4的质量比为3:2:3:2。
3.根据权利要求1所述的壳聚糖修饰的Hrps静电自组装三聚肽，其特征在于，三种Hrps多肽与壳聚糖的质量配比为10:1-1:5。
4.根据权利要求1所述的壳聚糖修饰的Hrps静电自组装三聚肽，其特征在于，三种Hrps多肽与壳聚糖的质量配比为5:1。
5.根据权利要求1所述的壳聚糖修饰的Hrps静电自组装三聚肽，其特征在于，所述壳聚糖选用脱乙酰度40-98％，分子质量50-2000kDa的壳聚糖。
6.根据权利要求1所述的壳聚糖修饰的Hrps静电自组装三聚肽，其特征在于，所述壳聚糖选用脱乙酰度95％，分子质量10-40kDa的壳聚糖。
7.根据权利要求1-6任一项所述的壳聚糖修饰的Hrps静电自组装三聚肽的制备方法，其特征在于，制备方法如下：
(1)从SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的四种Hrps多肽中任意选择三种Hrps多肽；
(2)向步骤(1)选择的三种Hrps多肽中加入壳聚糖，三种Hrps多肽与壳聚糖的质量配比为：10:1至1:5；加入磷酸缓冲液，使体系pH值为2-7；在温度为15-80℃、搅拌速度为30-300r/min条件下反应1-10小时；
(3)反应完成后，低温真空连续干燥，收集产物即得静电自组装三聚肽，(3Hrps)n-(C8H13NO5)n。
8.根据权利要求7所述的壳聚糖修饰的Hrps静电自组装三聚肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，磷酸缓冲液的浓度为10-200mmol/L，磷酸缓冲液加入量为三种Hrps多肽和壳聚糖总质量的10-500倍，使体系pH值为5.5。
9.根据权利要求7所述的壳聚糖修饰的Hrps静电自组装三聚肽的制备方法，其特征在于，制备方法如下：
(1)从SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的四种Hrps多肽中任意选择三种Hrps多肽；其中，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4四种Hrps多肽的质量配比为3:2:3:2；
(2)向步骤(1)选择的三种Hrps多肽中加入壳聚糖，壳聚糖选用脱乙酰度95％，分子质量10-40kDa的壳聚糖；三种Hrps多肽与壳聚糖的质量配比为：5:1；加入浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液加入量为三种Hrps多肽和壳聚糖总质量的250倍，使体系pH值为5.5；在温度为26℃、搅拌速度为80r/min条件下反应2小时；
(3)反应完成后，低温真空连续干燥，收集产物即得共价三聚肽，(3Hrps)n-(C8H13NO5)n。
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