WO2014133027A1 - ハイドロゲル - Google Patents

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和人 星
大塚　英典
範昭 松田
毅 高戸
大輔 松隈
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株式会社スリー・ディー・マトリックス
国立大学法人東京大学
学校法人東京理科大学
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    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/72—Chitin, chitosan

Definitions

  • the present invention relates to a hydrogel containing chitosan, PEG and a self-assembling peptide, a method for producing the hydrogel, and a culture method for improving cell function.
  • Hydrogels that can be designed with high water content and various physical properties are expected to be applied as biomaterials such as implants, biosensors, and drug carriers.
  • biomaterials such as implants, biosensors, and drug carriers.
  • it is necessary not only to assist cell adhesion, proliferation and differentiation, but also to provide a positively reinforced three-dimensional environment.
  • Fiber structures that mimic the extracellular matrix have been widely studied as structural designs that meet these requirements.
  • gels using self-assembled peptides have been widely studied because the fiber structure formed by the peptides can serve as a cell scaffold, and various functions can be imparted depending on the amino acid sequence.
  • a peptide gel is generally a physical gel by molecular self-assembly, it has poor mechanical strength and has a large problem in material moldability (Non-patent Document 1).
  • the present invention provides a hydrogel that solves the above problems.
  • biocompatible injectable gels in which the fibrous network of self-assembling peptides is reinforced with a network of covalently bonded gels.
  • a biocompatible injectable gel retaining a three-dimensional peptide fiber structure by one-pot synthesis was prepared by an unprecedented approach of precisely controlling the driving force of crosslinking and the time lag of gelation.
  • the present invention provides the following: [1] The following process: A method for producing a hydrogel, comprising mixing chitosan and PEG, and adding a self-assembling peptide to the resulting mixture, [2] A self-assembling peptide is an amphiphilic peptide in which hydrophilic amino acids and hydrophobic amino acids are alternately bonded and has amino acid residues 12 to 200, and is stable in aqueous solution in the presence of monovalent ions.
  • [5] A hydrogel obtained by the method according to any one of [1] to [4] above, [6]
  • the hydrogel according to the above [5], which is for cartilage regeneration, [7] A method for producing regenerated cartilage, comprising culturing chondrocytes in the hydrogel according to [6] above, [8] Regenerated cartilage obtained by the method according to [7] above, [9]
  • the hydrogel according to [5] or [6] above further comprising a blood component and / or a physiologically active substance.
  • the blood component is selected from the group consisting of serum, plasma, platelets, platelet-rich plasma (PRP), fibrin, fibrinogen, prothrombin, thrombin, thromboplastin, plasminogen, albumin and cholesterol, and the physiologically active substance is platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), insulin-like growth factor-1 (IGF-1), colony stimulating factor (CSF), interleukin- 8 (IL-8), keratinocyte growth factor (KGF), fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (EGF), insulin, hydrocortisone, urogastron, platelet-derived wound healing factor (PDWHF), vascular endothelial cell Growth factor (VEGF), nerve Long factor (NGF), insulin-like growth factor (IGF), hepatocyte growth factor (HGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), platelet factor IV (PF IV), bone morphogenetic protein (B
  • Chitosan is a deacetylated product of chitin ( ⁇ -1,4-poly-N-acetylglucosamine) and is a polysaccharide mainly having a ⁇ -1,4-polyglucosamine structure.
  • the chitosan of the present invention includes a conventionally known derivative such as carboxymethyl chitosan (CM chitosan).
  • Chitosan can be prepared by any method known in the art.
  • chitosan is made by decalcifying chitin obtained from crustacean crusts such as crabs, shrimp and krill, and insect crusts such as beetles and grasshoppers, and deproteinizing chitin. It can be obtained by deacetylation by treatment (for example, caustic soda treatment).
  • deacetylation by treatment for example, caustic soda treatment
  • mushrooms, microorganisms, squid bones and the like may be used in place of the above-described crust and the like.
  • the molecular weight of chitosan is not particularly limited, but the weight average molecular weight is preferably in the range of 1,000 to 200,000, and more preferably in the range of 10,000 to 100,000.
  • the weight average molecular weight may be rephrased as “weight average absolute molecular weight”.
  • the weight average molecular weight of chitosan can be measured by any method known in the art.
  • the weight average molecular weight can be measured by a method such as gel permeation chromatography-multi-angle laser light scattering analysis (GPC-MALS method), vapor pressure absolute molecular weight measurement, membrane absolute molecular weight measurement.
  • GPC-MALS method gel permeation chromatography-multi-angle laser light scattering analysis
  • vapor pressure absolute molecular weight measurement membrane absolute molecular weight measurement.
  • the weight average molecular weight of chitosan should just be contained in the said numerical range at least in any measuring method and measurement conditions, and does not need to be contained in the said numerical range under all the measuring methods and measuring conditions.
  • the degree of deacetylation from chitin is preferably 60% or more.
  • the polyethylene glycol of the present invention includes a conventionally known derivative such as a multi-arm polyethylene glycol and a derivative having an amino group-reactive structure such as a hydroxysuccinimide ester or nitrobenzenesulfonate ester structure at the terminal.
  • the molecular weight of polyethylene glycol is preferably 1000 to 10,000, more preferably 1000 to 3000.
  • the self-assembling peptide of the present invention has a structure in which, for example, a charged hydrophilic amino acid and a neutral hydrophobic amino acid are alternately arranged, and a positive charge and a negative charge are alternately distributed.
  • a very thin fiber having a ⁇ sheet structure at a low concentration and having a thickness of about 10 nm to 20 nm gathers on the network and gels.
  • This network structure is very similar to natural intercellular matrix (ECM) in fiber size and pore size, and can be used as a scaffold for cell culture.
  • ECM intercellular matrix
  • This peptide hydrogel is biodegradable, its degradation products do not adversely affect tissues, is highly bioabsorbable, and is suitable for cell colonization and proliferation.
  • the self-assembling peptide of the present invention is an amphipathic peptide having amino acid residues 12 to 200 in which hydrophilic amino acids and hydrophobic amino acids are alternately bonded, and in an aqueous solution in the presence of monovalent ions.
  • a stable ⁇ sheet structure is shown.
  • hydrophilic amino acid an acidic amino acid selected from aspartic acid and glutamic acid and a basic amino acid selected from arginine, lysine, histidine and ornithine can be used.
  • hydrophobic amino acid alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, serine, threonine or glycine can be used.
  • the self-assembling peptide examples include peptide RADA16 having Ac- (RADA) 4 -CONH 2 (SEQ ID NO: 1).
  • a 1% aqueous solution of the peptide RADA16 is named as PuraMatrix (registered trademark) Commercially available from Dee Matrix.
  • RADA16 can be used in a pseudo-extracellular matrix having a fibrous network structure and provides a cell scaffold.
  • a derivative such as peptide PRG having Ac- (RADA) 4 -GPRGDSGYRGDS-CONH 2 (SEQ ID NO: 2), in which RDA16 has an RGD adhesion motif found in fibronectin, can also be mentioned.
  • the hydrogel of the present invention can be prepared by mixing chitosan and PEG and then adding a self-assembling peptide.
  • the solvent any conventionally known solvent can be used, but preferably, for example, water, physiological saline, or PBS can be used.
  • the hydrogel of the present invention can be used for cartilage regeneration.
  • Regenerated cartilage can be obtained by culturing chondrocytes in the hydrogel of the present invention.
  • the hydrogel of the present invention can further contain blood components and / or physiologically active substances.
  • the blood component can be selected from the group consisting of serum, plasma, platelets, platelet-rich plasma (PRP), fibrin, fibrinogen, prothrombin, thrombin, thromboplastin, plasminogen, albumin and cholesterol, for example.
  • PRP platelet-rich plasma
  • physiologically active substance examples include platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), and insulin-like growth factor-1 (IGF-1). , Colony stimulating factor (CSF), interleukin-8 (IL-8), keratinocyte growth factor (KGF), fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (EGF), insulin, hydrocortisone, urogastron, platelets Wound healing factor (PDWHF), vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), insulin-like growth factor (IGF), hepatocyte growth factor (HGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), platelet It consists of factor IV (PF IV), bone morphogenetic protein (BMP) and growth differentiation factor (GDF). Can be selected.
  • CSF Colony stimulating factor
  • IL-8 interleukin-8
  • KGF keratinocyte growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF epi
  • FIG. 1 shows (a) chitosan / PEG (1.0 / 1.0 wt%), (b) RADA16 (0.25 wt%) and (c) chitosan / PEG / RADA16 (1.0 / 1.0). /0.25 wt%) is a change with time of change of G ′ (solid line) and G ′′ (dashed line) during gelation of the mixture.
  • FIG. 2A shows the structure of carboxymethyl chitosan and poly (ethylene glycol) for the creation of biocompatible injectable gel in which the fiber structure of self-assembling peptide is positively reinforced with covalent gel and its application to cartilage regeneration. Show. These are biocompatible, improve gel mechanical strength, and trap cells from being charged to a positive charge.
  • FIG. 1 shows (a) chitosan / PEG (1.0 / 1.0 wt%), (b) RADA16 (0.25 wt%) and (c) chitosan / PEG / RADA16 (1.0
  • FIG. 2B shows the creation of a biocompatible injectable gel in which the fiber structure of the self-assembled peptide is positively corrected with a covalent gel and its application to cartilage regeneration, and chitosan / PEG / RADA gel and cells (chondrocytes).
  • An interpenetrating network-like injectable hydrogel comprising FIG. 2C shows the precision of the driving force of cross-linking and the tamlag of gelation regarding the creation of biocompatible injectable gel in which the fiber structure of self-assembling peptide is positively corrected with covalent gel and its application to cartilage regeneration. Indicates control.
  • FIG. 2C shows the precision of the driving force of cross-linking and the tamlag of gelation regarding the creation of biocompatible injectable gel in which the fiber structure of self-assembling peptide is positively corrected with covalent gel and its application to cartilage regeneration. Indicates control.
  • FIG. 2D shows the results of circular dichroism spectrum measurement of various gels concerning the creation of biocompatible injectable gel in which the fiber structure of self-assembling peptide was positively corrected with covalent gel and application to cartilage regeneration. Show. The dashed line indicates the difference of (chitosan / PEG / RADA) ⁇ (chitosan / PEG).
  • FIG. 3A shows the result of cartilage regeneration (TB staining) at each hydrogel composition and each cell concentration.
  • FIG. 3B shows the results (visual observation) of cartilage regeneration at each hydrogel composition and each cell concentration.
  • FIG. 4 shows the GAG production results.
  • FIG. 5A shows the amount of GAG released in the medium.
  • FIG. 5B shows the results of the MTT assay. Long-term activity maintenance and improvement can be seen.
  • FIG. 5C shows the results of DNA quantification. A tendency of cell proliferation was confirmed.
  • FIG. 5D shows the amount of GAG accumulation in the gel. The amount of GAG accumulation increases in the later stage of culture.
  • FIG. 6A shows the amount of GAG released in the medium.
  • FIG. 6B shows the results of the MTT assay. The definition of each group is the same as in FIG. 6A.
  • FIG. 6C shows the results of DNA quantification. The definition of each group is the same as in FIG. 6A.
  • FIG. 7 shows the IGF-1 release results. A circle indicates a case where the RADA 16 is not included, and a circle indicates a case where the RADA 16 is included.
  • the unit of the vertical axis is ⁇ g and represents the integrated amount of released IGF-1.
  • a gel was prepared by mixing a solution adjusted to a predetermined concentration using PBS buffer (pH 7.4) in a sample tube so as to obtain a final concentration of interest.
  • a chitosan / PEG / RADA16 gel was prepared by adding RADA16 to the resulting mixture after mixing chitosan and NHS-PEG. After allowing the mixed solution to stand for 1 hour, gelation conditions were examined by observing the fluidity of the solution.
  • FIG. 1 shows chitosan / PEG (1.0 / 1.0 wt%), RADA 16 (0.25 wt%), and chitosan / PEG / RADA 16 (1.0 / 1.0 / 0.25 wt%) shows the change in viscoelasticity of the solution over time.
  • chitosan / PEG FIG. 1a
  • the value of G ′ increased rapidly after a predetermined time, and a clear gel point (G ′> G ′′) was observed.
  • the gel point changed depending on the external temperature, the dynamic change in viscoelasticity was caused by cross-linking between molecular chains based on chitosan / PEG chemical bonds. It was suggested to reflect the sol-gel transition associated with.
  • FIG. 1c shows the viscoelastic change of chitosan / PEG / RADA16 (1.0 / 1.0 / 0.25 wt%).
  • the changes in G ′, G ′′ behaved similarly to the RADA16 peptide gel.
  • the value of G ′ for the chitosan / PEG / RADA16 gel was increased compared to the case of each alone.
  • Chitosan / PEG Considering the difference in the crosslinking mode and gelation time between the gel and the RADA16 peptide gel, the chitosan / PEG / RADA16 gel is considered to have an independent internal structure in each network.
  • the gel ratio was chitosan 2: PEG1: PM1: cell suspension 1 and PBS was used as the solvent.
  • IGF-1 Somazon, Astellas Pharma Inc.
  • FGF-2 Fiblast Spray, Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Both were used at a final concentration of 100 ⁇ g / mL or 500 ⁇ g / mL and lysed with PBS used in the cell suspension.
  • the regenerated cartilage test using the mixed hydrogel showed high cell support performance and cartilage matrix retention performance, and better cartilage regeneration compared to atelocollagen.
  • the regenerated cartilage using the mixed hydrogel showed better regeneration of the cartilage matrix at the same chondrocyte seeding density as compared to atelocollagen.
  • the regenerated cartilage using the mixed hydrogel tended to cause cartilage regeneration even at a lower cell density (FIGS. 3A and B).
  • the cell-containing gel was cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 . Media and gel samples were collected from day 0 to 60 to assess GAG production, mitochondrial activity and cell proliferation. Glycosaminoglycan (GAG) production, which is an index of chondrocyte differentiation function activity, was quantified by DMMB assay. In-gel cell proliferation activity was assessed by MTT assay and DNA quantification using Hoechst 33256. The results are shown in FIG. In chitosan / PEG / RADA gel, an increase in the amount of GAG released into the medium was observed, and the cumulative amount on day 60 was about 1.5 times. In addition, an increase in the number of cells was observed. In particular, GAG production increased after day 18.
  • the activity of cells in the gel decreased in the early stage of culture in the chitosan / PEG gel. Thereafter, although an increase in activity was observed, the activity at the time of sowing was not exceeded.
  • the chitosan / PEG / RADA gel a decrease in cell activity at the initial stage of culture was suppressed. Furthermore, with the passage of the subsequent culture days, the cell activity greatly increased, and high activity was maintained even on the 60th day.
  • DNA quantification in the chitosan / PEG / RADA gel, an increase in the amount of DNA was observed with the passage of the number of days of culture, and it was confirmed that the number of cells in the gel tended to increase. From the above, it was suggested that the differentiation function and cell activity of chondrocytes are improved by the contribution of the scaffold by the formation of the micro-network structure by the peptide.
  • the chitosan / PEG / RADA gel does not show any improvement in function due to the addition of IGF-1, and is similar to the functional activity in the peptide mixed gel to which IGF-1 has not been added in the later stage of culturing. It became. From the above, the possibility of becoming a scaffold material that contributes to efficient functional improvement by growth factors was seen.
  • the amount of IGF released over time was compared between PEG / chitosan and self-assembled peptide / PEG / chitosan by the following method.
  • a gel (90 ⁇ l) was prepared and 900 ⁇ l PBS ( ⁇ ) was added as a supernatant and incubated (37 ° C., 5% CO 2 ). Every day, a total amount of the supernatant was collected, and the concentration of IGF-1 released in PBS ( ⁇ ) was quantified by ELISA.

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Abstract

　本発明は、キトサンとＰＥＧとを混合すること、及び得られた混合物に自己組織化ペプチドを添加することを含む、ハイドロゲルの製造方法及びこの方法によって得られたハイドロゲルに関する。

Description

ハイドロゲル
　本発明は、キトサン、ＰＥＧ及び自己組織化ペプチドを含むハイドロゲル、その製造方法及び細胞機能向上のための培養方法に関する。
　高い含水率と様々な物理特性をデザイン可能なハイドロゲルは、インプラントやバイオセンサー、薬物担持担体など、バイオマテリアルとしての応用が期待されている。細胞親和性に優れたゲルの作製には、細胞の接着・増殖・分化を補助するだけでなく、積極的に補強した三次元環境の提供が必要となる。細胞外マトリックスを模倣した繊維構造は、これらの要求を満たす構造設計として広く研究されている。中でも自己組織化ペプチドを用いたゲルは、ペプチドが形成する繊維構造が細胞足場となりうること、アミノ酸配列によって様々な機能付与が可能であることから広く研究されている。しかしながら、ペプチドゲルは一般に分子の自己組織化による物理ゲルであるため、力学強度に乏しく、材料成形性に大きな問題があった（非特許文献１）。
Stevens, M. M. and George J.H., "Exploring and Engineering the Cell Surface Interface" Science. 2005, 310, 1135-8
　本発明は、上記の課題を解決したハイドロゲルを提供する。
　本研究では、自己組織化ペプチドの繊維状網目を共有結合性ゲルの網目で補強した、生体適合性インジェクタブルゲルの新規な創製法の確立を目指す。架橋の駆動力、ゲル化のタイムラグを精密に制御するというこれまでにないアプローチにより、ワンポット合成で三次元的なペプチド繊維構造を保持した、生体適合性インジェクタブルゲルを作製した。
　すなわち、本発明は、下記：
［１］
　下記工程：
キトサンとＰＥＧとを混合すること、及び
得られた混合物に自己組織化ペプチドを添加すること
を含む、ハイドロゲルの製造方法、
［２］
　自己組織化ペプチドが、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に結合し、アミノ酸残基１２～２００を有する両親媒性のペプチドであり、一価のイオンの存在下、水溶液中で安定なβシート構造を示す、請求項１に記載の製造方法、
［３］
　自己組織化ペプチドが、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸及びアラニンの繰り返し配列を有する、上記［２］に記載の製造方法、
［４］
　自己組織化ペプチドが、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドである、上記［３］に記載の製造方法。
［５］
　上記［１］～［４］のいずれかに記載の方法によって得られたハイドロゲル、
［６］
　軟骨再生用である、上記［５］に記載のハイドロゲル、
［７］
　軟骨細胞を上記［６］に記載のハイドロゲル中で培養することを含む、再生軟骨の製造方法、
［８］
　上記［７］に記載の方法によって得られた再生軟骨、
［９］
　さらに、血液成分及び/又は生理活性物質を含有する、上記［５］又は［６］に記載のハイドロゲル。
［１０］
　前記、血液成分が、血清、血漿、血小板、多血小板血漿（ＰＲＰ)、フィブリン、フィブリノーゲン、プロトロンビン、トロンビン、トロンボプラスチン、プラスミノゲン、アルブミン及びコレステロールからなる群から選択され、生理活性物質が、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子－α（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、ハイドロコーチゾン、ウロガストロン、血小板由来創傷治癒因子（ＰＤＷＨＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血小板因子ＩＶ（ＰＦ　ＩＶ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ)及び成長分化因子（ＧＤＦ)からなる群から選択される上記［９］記載のハイドロゲル
である。
　キトサンとは、キチン（β－１，４－ポリ－Ｎ－アセチルグルコサミン）の脱アセチル化物であり、β－１，４－ポリグルコサミン構造を主とする多糖類である。本発明のキトサンには、従来公知の誘導体、たとえば、カルボキシメチルキトサン（ＣＭキトサン）を含む。
　キトサンは、当該分野で公知の任意の方法により調製され得る。たとえば、キトサンは、カニ、エビ、オキアミなどの甲殻類の甲皮や、カブトムシ、バッタなどの昆虫類の甲皮などの原材料を脱カルシウム処理し、除タンパク処理をして得られるキチンを、アルカリ処理（例えば、苛性ソーダ処理）で脱アセチル化することなどによって得ることができる。また、キトサンの原材料としては、上述の甲皮等に代えて、キノコ類、微生物、イカの中骨等を用いてもよい。
　キトサンとしては、種々の分子量のものが知られている。本発明の水性組成物において、キトサンの分子量は特に限定されるものではないが、重量平均分子量が１０００～２０００００の範囲にあることが好ましく、１００００～１０００００の範囲にあることがより好ましい。重量平均分子量は、「重量平均絶対分子量」と言い換えてもよい。
　キトサンの重量平均分子量は、当該分野で公知の任意の方法で測定することができる。例えば、重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー－多角度レーザー光散乱分析法（ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法）、蒸気圧式絶対分子量測定、メンブレン式絶対分子量測定などの方法によって測定可能である。キトサンの重量平均分子量は、少なくとも、いずれかの測定方法及び測定条件において前記数値範囲内に含まれればよく、全ての測定方法及び測定条件下で前記数値範囲内に含まれる必要はない。
　本発明の水性組成物に含まれるキトサンにおいて、キチンからの脱アセチル化の程度は、好ましくは６０％以上である。
　本発明のポリエチレングリコールは、従来公知の誘導体、たとえばマルチアームポリエチレングリコール、末端にヒドロキシスクシンイミドエステル又はニトロベンゼンスルホネートエステル構造のような、アミノ基反応性の構造を有する誘導体を含む。ポリエチレングリコールの分子量は、好ましくは、１０００～１００００、より好ましくは、１０００～３０００である。
　本発明の自己組織化ペプチドは、たとえば、電荷を有する親水性アミノ酸と、中性の疎水性アミノ酸とが交互に並び、正電荷と負電荷が交互に分布するような構造を有し、生理的条件のｐＨと塩濃度により、低濃度でβシート構造をとり、太さ１０ｎｍ～２０ｎｍ程の極細繊維が、網目上に集合し、ゲル化する。この網目構造は、ファイバーサイズおよびポアサイズなどが天然の細胞間マトリックス（ＥＣＭ）と非常に似ており、細胞培養の足場としての利用することができる。このペプチドハイドロゲルは、生分解性であり、分解産物が組織に悪影響を与えず、生体吸収性が高いことや、細胞の正着や増殖に適していることに加え、化学合成品であり動物由来の感染症などの心配がないため、近年狂牛病など、動物からのウイルスやそのほか未知の感染症への懸念が高まったことから、コラーゲンなどの代替品として、さらに注目されるようになった（特表２００７－１１７２７５号公報、再生歯誌、２００５年、第３巻、第１号、ｐ１－１１参照）。
　本発明の自己組織化ペプチドは、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に結合し、アミノ酸残基１２～２００を有する両親媒性のペプチドであり、一価のイオンの存在下、水溶液中で安定なβシート構造を示す。
　ここで、親水性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸から選択される酸性アミノ酸およびアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチンから選択される塩基性アミノ酸を使用することができる。疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニンまたはグリシンを使用することができる。
　自己組織化ペプチドの具体例としては、Ａｃ－（ＲＡＤＡ）４－ＣＯＮＨ２（配列番号１）を有するペプチドＲＡＤＡ１６を挙げることができ、その１％水溶液が、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）として株式会社スリー・ディー・マトリックスから市販されている。ＲＡＤＡ１６は、繊維状網目構造を有する疑似細胞外マトリックスに用いることができ、細胞足場を提供する。また、ＲＡＤＡ１６にフィブロネクチンにみられるＲＧＤ接着モチーフを付与した、Ａｃ－（ＲＡＤＡ）４－ＧＰＲＧＤＳＧＹＲＧＤＳ－ＣＯＮＨ２（配列番号２）を有するペプチドＰＲＧなどの誘導体も挙げることができる。
　本発明のハイドロゲルは、キトサンとＰＥＧとを混合し、次いで、自己組織化ペプチドを加えることによって、調製することができる。溶媒は、従来公知の任意のものを用いることができるが、好ましくは、たとえば、水、生理食塩水、ＰＢＳを用いることができる。
　本発明のハイドロゲルは、軟骨再生用に用いることができる。軟骨細胞を本発明のハイドロゲル中で培養することによって、再生軟骨を得ることができる。
　本発明のハイドロゲルは、さらに、血液成分及び/又は生理活性物質を含有することができる。
　血液成分は、たとえば、血清、血漿、血小板、多血小板血漿（ＰＲＰ)、フィブリン、フィブリノーゲン、プロトロンビン、トロンビン、トロンボプラスチン、プラスミノゲン、アルブミン及びコレステロールからなる群から選択することができる。
　生理活性物質は、たとえば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子－α（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、ハイドロコーチゾン、ウロガストロン、血小板由来創傷治癒因子（ＰＤＷＨＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血小板因子ＩＶ（ＰＦ　ＩＶ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ)及び成長分化因子（ＧＤＦ)からなる群から選択することができる。
図１は、（ａ）キトサン／ＰＥＧ（１．０／１．０　ｗｔ％）、（ｂ）ＲＡＤＡ１６（０．２５　ｗｔ％）及び（ｃ）キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６（１．０／１．０／０．２５　ｗｔ％）混合物のゲル化中のＧ’（実線）及びＧ”（破線）の変化の経時変化である。 図２Ａは、自己組織化ペプチドの繊維構造を共有結合性ゲルで積極的に補強した生体適合性インジェクタブルゲルの創製と軟骨再生への応用に関し、カルボキシメチルキトサンとポリ（エチレングリコール）の構造を示す。これらは、生体適合性であり、ゲル力学強度を向上させ、正電荷にチャージしていることから細胞をトラップする。 図２Ｂは、自己組織化ペプチドの繊維構造を共有結合性ゲルで積極的に補正した生体適合性インジェクタブルゲルの創製と軟骨再生への応用に関し、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡゲルと細胞（軟骨細胞）を含む、相互侵入網目様インジェクタブルハイドロゲルを示す。 図２Ｃは、自己組織化ペプチドの繊維構造を共有結合性ゲルで積極的に補正した生体適合性インジェクタブルゲルの創製と軟骨再生への応用に関し、架橋の駆動力とゲル化のタムラグの精密な制御を示す。 図２Ｄは、自己組織化ペプチドの繊維構造を共有結合性ゲルで積極的に補正した生体適合性インジェクタブルゲルの創製と軟骨再生への応用に関し、各種ゲルの円二色分光スペクトル測定の結果を示す。破線は、（キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ）－（キトサン／ＰＥＧ）の差を示す。 図３Ａは、ハイドロゲルの各組成および各細胞濃度における軟骨再生の結果（ＴＢ染色）である。 図３Ｂは、ハイドロゲルの各組成および各細胞濃度における軟骨再生の結果（肉眼所見）である。 図４は、ＧＡＧ産生結果を示す。 図５Ａは、培地中ＧＡＧ放出量を示す。 図５Ｂは、ＭＴＴアッセイの結果を示す。長期における活性維持及び向上が見られる。 図５Ｃは、ＤＮＡ定量の結果を示す。細胞増殖傾向が確認された。 図５Ｄは、ゲル内ＧＡＧ蓄積量を示す。培養後期にてＧＡＧ蓄積量が増加している。 図６Ａは、培地中ＧＡＧ放出量を示す。 図６Ｂは、ＭＴＴアッセイの結果を示す。各群の規定は、図６Ａと同様である。 図６Ｃは、ＤＮＡ定量の結果を示す。各群の規定は、図６Ａと同様である。 図７は、ＩＧＦ－１放出結果を示す。○は、ＲＡＤＡ１６を含まない場合であり、●は、ＲＡＤＡ１６を含む場合である。縦軸の単位は、μｇであり、放出されたＩＧＦ－１の積算量を示した。
［実施例］
　インジェクタブルゲルの作製には、カルボキシメチルキトサン（キトサン，Ｍｗ＝８０，０００－１００，０００；脱アセチル化キチン　６３．３％；置換度　０．６１）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド末端化－２－アームポリ（エチレングリコール）（ＮＨＳ－ＰＥＧ，Ｍw＝２，０００，＞９９％　ＮＨＳ置換）、およびＲＡＤＡ１６（Ｐｕｒａ　Ｍａｔｒｉｘ）ペプチドを用いた。ＰＢＳバッファー（ｐＨ　７．４）を用いて所定濃度に調整した溶液を、目的の終濃度になるようにサンプル管中で混合することによりゲルを作製した。キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルは、キトサン、ＮＨＳ－ＰＥＧを混和した後、得られた混合物にＲＡＤＡ１６を添加することで作製した。混合溶液を１時間静置した後、溶液の流動性を観察することでゲル化条件を検討した。
　キトサン、ＰＥＧ、およびＲＡＤＡ１６溶液の混和によるゲル化挙動は、レオメーターを用いた時間依存的な粘弾性変化により観察した。（ａ）キトサン／ＰＥＧ（１．０／１．０ｗｔ％）、（ｂ）ＲＡＤＡ１６（０．２５ｗｔ％）、および（ｃ）キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６混合溶液（１．０／１．０／０．２５ｗｔ％）それぞれ３００μＬを装置台座にキャストした後、即座に測定を開始した。測定は、１％ひずみ、周波数は１Ｈｚの条件で行い、時間経過に伴う貯蔵弾性率（Ｇ’）と損失弾性率（Ｇ”）の値を観測した。
　結果と考察
キトサン／ＰＥＧハイドロゲル
　ゲル化は、キトサン及びＮＨＳ－ＰＥＧのそれぞれの混合終濃度が１．０ｗｔ％以上において観察された。また、ゲルの力学強度は、ゲル中に含まれる分子濃度の増加とともに上昇した。一方で、ＰＥＧ鎖末端が水酸基（ＯＨ－ＰＥＧ）であった場合、いかなる濃度においてもゲル化は観察されなかった。これらの結果から、キトサン／ＰＥＧゲルは、キトサンに含まれるアミノ基とＮＨＳ－ＰＥＧとのアミド結合形成を駆動力とした化学架橋により形成されることが示唆された。
キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡハイドロゲル
　図１には、２０℃におけるキトサン／ＰＥＧ（１．０／１．０　ｗｔ％）、ＲＡＤＡ１６（０．２５　ｗｔ％）、およびキトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６（１．０／１．０／０．２５　ｗｔ％）溶液の経時的な粘弾性変化を示す。キトサン／ＰＥＧにおいて（図１ａ）、所定時間経過後にＧ’の値は急激に増加し、明確なゲル化点（Ｇ’＞Ｇ”）が観察された。これは、アミド結合による分子鎖間架橋の動的過程を示していると考えられる。実際、ゲル化点は外部温度に依存して変化したことから、動的な粘弾性の変化は、キトサン／ＰＥＧの化学結合に基づく分子鎖間架橋に伴うゾル－ゲル転移を反映すると示唆された。
　一方で、ＲＡＤＡ１６ペプチドゲルの場合、測定開始時のＧ’の値はＧ”のそれより高く、ＰＢＳ中で即座にゲル化することが観察された（図１ｂ）。つまり、ＲＡＤＡ１６の分子組織化（β－シート構造形成）に基づくゲル化は、キトサン／ＰＥＧゲル化に比べて極めて早く起こることがわかった。
　図１ｃには、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６（１．０／１．０／０．２５　ｗｔ％）の粘弾性変化を示す。Ｇ’，Ｇ”の変化は、ＲＡＤＡ１６ペプチドゲルと同様の挙動を示した。興味深いことに、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルのＧ’の値は、それぞれ単独の場合と比べて増大した。キトサン／ＰＥＧゲルとＲＡＤＡ１６ペプチドゲルの架橋様式、ゲル化時間の相違を考慮すると、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルはそれぞれのネットワークが独立した内部構造を形成していると考えられる。つまり、混合初期において、ＲＡＤＡ１６の組織化は迅速に起こり、引き続きＲＡＤＡ１６繊維網目の間でキトサン／ＰＥＧの架橋が形成される。キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルのＧ’の飛躍的な増大は、これらのゲル化タイムラグに由来する相互侵入網目（ＩＰＮ：Interpenetrating polymer network）様の構造に起因すると考えられる。実際、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲルの円二色分光スペクトル測定の結果、ＲＡＤＡ１６ペプチドゲルのみの場合と比べて遜色ないβ－シート構造に起因するコットン効果が確認でき、ゲル内部でもＲＡＤＡ１６の組織構造が保持されていることが示唆された（図２Ｄ）。
　混合ハイドロゲルを用いた再生軟骨のマウス移植実験
　混合ハイドロゲルの軟骨再生能を検討した。低細胞密度による移植により、ＩＧＦ－１、ＦＧＦ－２の効果を明確にした。
　材料
　ハイドロゲル：０．２ｍＭ　ＣＭキトサン＋５ｍＭ　ＰＥＧ＋０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ：ＲＡＤＡ＝１：１）
比較対象ゲル：１　％アテロコラーゲン（株）高研
　方法
　培養ヒト軟骨細胞とゲルを混和し、多孔体（ＰＬＬＡ　５ｍｍｘ５ｍｍｘ３ｍｍ）に投与する。ゲル化を確認後、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（６週齢、雄）の皮下に移植した。
　約１０００倍増に増殖させたヒト耳介軟骨細胞を０．２ｍＭ　ＣＭキトサン溶液で混和した後、５ｍＭ　ＰＥＧおよび　０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ：ＲＡＤＡ＝１：１）をさらに混合し、５ｘ５ｘ３ｍｍサイズのＰＬＬＡ（ＭＷ，約１２０，０００、気孔率８７％）に投与しゲル化させ、再生軟骨とすした。ゲルの比率としては、キトサン２：ＰＥＧ１：ＰＭ１：細胞懸濁液１の割合であり、溶媒はＰＢＳを用いた。液性因子はＩＧＦ－１（ソマゾン、アステラス製薬株式会社）もしくはＦＧＦ－２（フィブラストスプレー、科研製薬株式会社）を用いた。どちらも最終濃度１００μｇ／ｍＬもしくは５００μｇ／ｍＬで使用し、細胞懸濁液で使用するＰＢＳで溶解させた。ゲル化を確認後、Ｂａｌｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕ（６週齢、雄）の背部皮下に移植した。８週間後に回収し、組織学的、生化学的評価を行った。
移植細胞：培養ヒト耳介軟骨細胞（ｎ＝３）
細胞濃度：１０４、１０５、１０６、１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
条件：
（１）１％アテロコラーゲン＋細胞
（２）０．２ｍＭ　ＣＭキトサン＋５ｍＭ　ＰＥＧ＋０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ）＋細胞
（３）０．２ｍＭ　ＣＭキトサン＋５ｍＭ　ＰＥＧ＋０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ）＋ＩＧＦ－１（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）＋細胞
（４）０．２ｍＭ　ＣＭキトサン＋５ｍＭ　ＰＥＧ＋０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ）＋ＩＧＦ－１（最終濃度５００μｇ／ｍＬ）＋細胞
（５）０．２ｍＭ　ＣＭキトサン＋５ｍＭ　ＰＥＧ＋０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ）＋ＦＧＦ－２（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）＋細胞
（６）０．２ｍＭ　ＣＭキトサン＋５ｍＭ　ＰＥＧ＋０．２５％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＰＲＧ）＋ＦＧＦ－２（最終濃度５００μｇ／ｍＬ）＋細胞
動物：　Ｂａｌｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕ(６週齢、雄)６匹、２つの移植片を１匹の背部皮下左右に移植した。
移植期間：８週間
評価：肉眼所見
　　　　組織学的検討（ＴＢ，ＨＥ）
　　　　生化学的検討（ＧＡＧ）
　結果
　混合ハイドロゲルを用いた再生軟骨試験では、高い細胞支持性能と軟骨基質の保持性能を示し、アテロコラーゲンと比較して良好な軟骨再生を示した。混合ハイドロゲルを用いた再生軟骨は、アテロコラーゲンに比べ、同等な軟骨細胞播種密度では軟骨基質の再生が良好であった。さらに、混合ハイドロゲルを用いた再生軟骨は、より低い細胞密度でも軟骨再生を生じる傾向が見られた（図３Ａ及びＢ）。
　さらに、混合ハイドロゲルはＩＧＦ－１、ＦＧＦ－２などの成長因子と混合して再生軟骨を作製すると、さらに軟骨再生が改善し、成長因子などを担持する機能も有することが示された（図４）。この結果からは、ＧＡＧ産生量の絶対量が、ハイドロゲルの方がアテロコラーゲンに比べて大きいこと（細胞密度が高いほど、差が大きい。）、そして、ＩＧＦ、ＦＧＦの添加により、さらにＧＡＧ産生量が増え、軟骨細胞が再生していることが示された。
　ペプチド混合ゲルにおける細胞機能（ＧＡＧ産生量、ミトコンドリア活性及び細胞増殖）への影響を評価した。
細胞内包ゲルの作製
　ゲル組成
（１）キトサン／ＰＥＧ　２．０／１．０ｗｔ％
（２）キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ　２．０／１．０／０．２５ｗｔ％
　ゲル体積；１００μｌ
　細胞種；軟骨細胞（継代数：４）
　細胞密度；１．０×１０７細胞／ｍＬ
　培地；ＤＭＥＭ
　細胞内包ゲルを３７℃、５％ＣＯ２で培養した。第０～６０日まで培地及びゲルサンプルを回収し、ＧＡＧ産生量、ミトコンドリア活性及び細胞増殖を評価した。
　軟骨細胞の分化機能活性の指標であるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）産生量をＤＭＭＢアッセイによって定量した。ゲル内細胞増殖活性を、ＭＴＴアッセイ及びヘキスト３３２５６を用いたＤＮＡ定量によって評価した。結果を図５に示した。
　キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡゲルでは、培地中へのＧＡＧ放出量の増加が見られ、第６０日における積算量は、約１．５倍となった。また、細胞数の増加が見られた。特に、第１８日以降ＧＡＧ産生量が増加した。
　ゲル内細胞の活性は、キトサン／ＰＥＧゲルでは、培養初期に活性が低下した。その後、活性の上昇は見られたものの、播種時における活性を超えることはなかった。一方、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡゲルにおいては、培養初期での細胞活性の低下が抑制されていた。さらに、その後の培養日数の経過に伴い、細胞活性は大きく上昇し、第６０日においても高い活性を維持していた。
　ＤＮＡ定量の結果、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡゲルにおいては、培養日数の経過に対するＤＮＡ量の増加が見られ、ゲル内部での細胞が増加傾向にあることを確認した。
　以上から、ペプチドによる微小網目構造の形成による足場の寄与により、軟骨細胞の分化機能・細胞活性を向上させることが示唆された。
　ＲＡＤＡ存在下において、ＩＧＦ－１添加によるＧＡＧ産生量の著しい増加がみられた。さらに、細胞活性、細胞増殖においても、ＩＧＦ－１による機能向上が、本発明のハイドロゲルにおいて、顕著に認められた。
　培養日数の経過に伴い、キトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡゲルでは、ＩＧＦ－１添加による機能向上が見られなくなっていき、培養後期においてはＩＧＦ－１未添加であるペプチド混合ゲルでの機能活性と同程度となった。
　以上から、成長因子による効率的な機能向上に寄与する足場材料となる可能性が視された。
　以下の方法によって、ＰＥＧ／キトサンと、自己組織化ペプチド／ＰＥＧ／キトサンとの間で、ＩＧＦの経時的な放出量を比較した。
　３００μｇ／ｍｌのＩＧＦ－１を内包したキトサン／ＰＥＧ／ＲＡＤＡ１６ゲル（ＣＭキトサン２．０ｗｔ％／ＮＨＳ－ＰＥＧ（Ｍｗ＝２，０００）１．０ｗｔ％／ＲＡＤＡ１６　０．２５ｗｔ％／ＩＧＦ－１３００μｇ／ｍｌ（終濃度））ゲル（９０μｌ）を作製し、９００μｌのＰＢＳ（－）を上澄みとして加え、インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。毎日、上澄みを全量回収し、ＥＬＩＳＡ法にてＰＢＳ（－）中に放出されたＩＧＦ－１濃度を定量した。
　その結果、ＰＥＧ／キトサンのみと比べて、自己組織化ペプチド／ＰＥＧ／キトサンでは、より長期間ＩＧＦ－１を放出することができた（図７）。

Claims (10)

  1. 　下記工程：
    キトサンとＰＥＧとを混合すること、及び
    得られた混合物に自己組織化ペプチドを添加すること
    を含む、ハイドロゲルの製造方法。
  2. 　自己組織化ペプチドが、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に結合し、アミノ酸残基１２～２００を有する両親媒性のペプチドであり、一価のイオンの存在下、水溶液中で安定なβシート構造を示す、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　自己組織化ペプチドが、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸及びアラニンの繰り返し配列を有する、請求項２に記載の製造方法。
  4. 　自己組織化ペプチドが、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項３に記載の製造方法。
  5. 　請求項１～４のいずれか1項記載の方法によって得られたハイドロゲル。
  6. 　軟骨再生用である、請求項５に記載のハイドロゲル。
  7. 　軟骨細胞を請求項６に記載のハイドロゲル中で培養することを含む、再生軟骨の製造方法。
  8. 　請求項７に記載の方法によって得られた再生軟骨。
  9. 　さらに、血液成分及び/又は生理活性物質を含有する、請求項５又は６に記載のハイドロゲル。
  10. 　前記、血液成分が、血清、血漿、血小板、多血小板血漿（ＰＲＰ)、フィブリン、フィブリノーゲン、プロトロンビン、トロンビン、トロンボプラスチン、プラスミノゲン、アルブミン及びコレステロールからなる群から選択され、生理活性物質が、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子－α（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、ハイドロコーチゾン、ウロガストロン、血小板由来創傷治癒因子（ＰＤＷＨＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血小板因子ＩＶ（ＰＦ　ＩＶ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ)及び成長分化因子（ＧＤＦ)からなる群から選択される請求項９記載のハイドロゲル。
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