WO2016002717A1 - 骨形成促進材 - Google Patents

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WO2016002717A1
WO2016002717A1 PCT/JP2015/068683 JP2015068683W WO2016002717A1 WO 2016002717 A1 WO2016002717 A1 WO 2016002717A1 JP 2015068683 W JP2015068683 W JP 2015068683W WO 2016002717 A1 WO2016002717 A1 WO 2016002717A1
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promoting material
bone
bone formation
amino acid
self
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PCT/JP2015/068683
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English (en)
French (fr)
Inventor
圭 安藤
石黒　直樹
史郎 今釜
全哉 伊藤
康弘 横山
秀典 横井
永井　祐介
Original Assignee
国立大学法人名古屋大学
株式会社メニコン
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/14—Peptides being immobilised on, or in, an inorganic carrier
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Definitions

  • the present invention relates to a bone formation promoting material. More specifically, the present invention relates to a bone formation promoting material including a self-assembling peptide and bone fragments.
  • the spine has not only the role of supporting the body from gravity but also the role of protecting the spinal cord, which is the central nervous system.
  • diseases that compress nerves such as the spinal cord (for example, cervical spondylotic myelopathy) and fractures of the spine are major problems.
  • spinal cord compression the bone that compresses the spinal cord must be excised.
  • the spine that has become unstable after excision is transplanted with bone collected from the subject and fixed using a metal such as a metal bolt or plate.
  • the basics of fracture treatment are reduction and fixation, and generally, a method of fixing with a metal and bone healing is taken.
  • a long fusion period of 2 to 3 months is required for limb fractures and half a year to 1 year or more for vertebral fractures.
  • the bone itself is weakened, so there are cases where the bone is fractured again before bone fusion is obtained, or the metal used for fixation is displaced.
  • a femoral neck fracture or vertebral fracture may require a bed rest, which may lead to disuse syndrome and require care.
  • An object of the present invention is to provide a bone formation promoting material that has high biological safety and can promote bone formation.
  • the osteogenesis promoting material of the present invention includes a self-assembling peptide capable of forming a ⁇ -sheet structure in an aqueous solution having a neutral pH, and a bone fragment.
  • the total charge at pH 7.0 of amino acid residues constituting this self-assembling peptide is not zero.
  • the self-assembling peptide is a self-assembling peptide consisting of the following amino acid sequence.
  • the osteogenesis promoter further comprises blood and / or blood-derived components.
  • the osteogenesis promoting material further includes an osteogenesis factor.
  • the osteogenesis promoting material is used in combination with a holding device for osteogenesis promoting material.
  • a holding device for osteogenesis promoting material is provided.
  • the holding device for osteogenesis promoting material of the present invention is used together with the osteogenesis promoting material.
  • the bone formation promoting material holder is made of a carbon-based material, an engineering resin, or a super engineering resin.
  • the osteogenesis promoting material of the present invention includes a self-assembling peptide and bone fragments capable of forming a ⁇ sheet structure in an aqueous solution having a neutral pH. Thereby, many starting points of bone formation are formed, and bone formation can be favorably promoted. Therefore, bone formation can be improved even in an elderly person whose strength and bone regeneration ability of the bone itself are reduced. Moreover, the osteogenesis promoting material of the present invention can induce osteogenesis without using cells or the like directly involved in osteogenesis.
  • the self-assembling peptide used in the present invention forms a ⁇ -sheet structure in an aqueous solution having a neutral pH, and the total charge at pH 7.0 of amino acid residues constituting the self-assembling peptide is not zero. Therefore, the bone formation promoting material of the present invention can exhibit sufficient strength at a neutral pH close to the biological environment. Furthermore, the bone formation promoting material can be fixed at a desired position by using an appropriate holding device such as the bone formation promoting material holding device of the present invention.
  • FIG. 4 shows photographs of the osteogenesis promoting material of Examples 1 to 3 and the osteogenesis promoting material of Comparative Example 1 after 14 days and 28 days of culture and ALP staining. It is the photograph of the external fixator used for preparation of a femur defect model. It is the photograph of the cage used for preparation of a femur defect model. It is the photograph of the femur of the mouse
  • FIG. 9 (a) is a photograph of the gel before adding the born chip of Example 5
  • FIG. 9 (b) is a photograph of the gel before adding the born chip of Example 6
  • FIG. 9 (c) is a comparative example. It is the photograph of the gel before 2 born chip addition.
  • FIG. 10 (a) is a photograph of the gel (bone formation promoting material) after addition of the born chip of Example 5
  • FIG. 10 (b) is the gel (bone formation promoting material) after addition of the born chip of Example 6.
  • FIG. 10 (c) is a photograph of the gel (bone formation promoting material) after adding the born chip of Comparative Example 2.
  • the osteogenesis promoting material of the present invention contains a self-assembling peptide capable of forming a ⁇ sheet structure in an aqueous solution having a neutral pH and a bone fragment.
  • the total charge at pH 7.0 of amino acid residues constituting this self-assembling peptide is not zero.
  • the osteogenesis promoter of the present invention further comprises blood and / or blood-derived components.
  • the osteogenesis promoting material of the present invention further includes an osteogenesis factor.
  • the storage elastic modulus (G ′) at 37 ° C. in the dynamic viscoelasticity measurement using the rotary rheometer of the osteogenesis promoting material of the present invention is, for example, 1 Pa to 5000 Pa, preferably 1 Pa to 4000 Pa, more preferably Is 1 Pa to 3000 Pa. If the storage elastic modulus is within the above range, it can be used in combination with the bone formation promoting material holding device of the present invention described later, and bone formation can be preferably promoted.
  • the storage elastic modulus as used in this specification means the value when the angular frequency when frequency change measurement is performed is 1 radian / second.
  • any suitable peptide that can spontaneously assemble through the interaction of peptide molecules in an aqueous solution to form a gel can be used.
  • the self-assembling peptide used in the present invention can form a ⁇ sheet structure at a neutral pH. More specifically, a fibrous molecular assembly is formed spontaneously through interaction between peptide molecules in an aqueous solution, and a three-dimensional network structure is developed by the interaction between the molecular assemblies.
  • Peptides that can form gels can be preferably used. Examples of the interaction between peptide molecules include electrostatic interactions such as hydrogen bonds, ionic interactions, van der Waals forces, and hydrophobic interactions.
  • neutral pH (neutral region) means pH 5.0 to 8.0, preferably pH 5.5 to 7.5, more preferably pH 6.0 to 7.0, Preferably it refers to the region of pH 7.0.
  • the amino acid constituting the self-assembling peptide may be an L-amino acid or a D-amino acid. L-amino acids are preferred. Moreover, a natural amino acid may be sufficient and a non-natural amino acid may be sufficient. Natural amino acids are preferred because they are available at low cost and facilitate peptide synthesis.
  • the total sum of charges at pH 7.0 of amino acid residues constituting the self-assembling peptide is not zero.
  • the sum of the charges is preferably ⁇ 3 to ⁇ 1 or +1 to +3, and more preferably ⁇ 3, ⁇ 2, +2 or +3.
  • the charge of the self-assembling peptide at each pH can be performed by a program available on the website of PROTEIN CALCULATOR v3.4 (http://protocol.sourceforge.net/).
  • a 1 to a 4 are basic amino acid residues
  • b 1 to b 6 are uncharged polar amino acid residues and / or hydrophobic amino acid residues, at least of which 5 are hydrophobic amino acid residues
  • c 1 and c 2 are acidic amino acid residues
  • d is a hydrophobic amino acid residue.
  • a 1 to a 4 are basic amino acid residues.
  • the basic amino acid is preferably arginine, lysine or histidine, more preferably arginine or lysine. This is because these amino acids are strongly basic.
  • a 1 to a 4 may be the same amino acid residue or different amino acid residues.
  • b 1 to b 6 are uncharged polar amino acid residues and / or hydrophobic amino acid residues, and at least 5 of them are hydrophobic amino acid residues.
  • the hydrophobic amino acid is preferably alanine, leucine, isoleucine, valine, methionine, phenylalanine, tryptophan, glycine or proline.
  • the uncharged polar amino acid is preferably tyrosine, serine, threonine, asparagine, glutamine, or cysteine. This is because these amino acids are easily available.
  • b 3 and b 4 are each independently any suitable hydrophobic amino acid residue, more preferably a leucine residue, an alanine residue, a valine residue, or an isoleucine residue, particularly preferably Is a leucine residue or an alanine residue.
  • b 1 to b 6 are all hydrophobic amino acid residues. This is because the self-assembling peptide preferably forms a ⁇ -sheet structure and can self-assemble. More preferably, b 1 to b 6 are each independently a leucine residue, an alanine residue, a valine residue, or an isoleucine residue, and more preferably a leucine residue or an alanine residue. In a preferred embodiment, 4 or more of b 1 to b 6 are leucine residues, more preferably 5 or more of them are leucine residues, and more preferably all are leucine residues.
  • c 1 and c 2 are acidic amino acid residues.
  • the acidic amino acid is preferably aspartic acid or glutamic acid. This is because these amino acids are easily available.
  • c 1 and c 2 may be the same amino acid residue or different amino acid residues.
  • d is a hydrophobic amino acid residue.
  • d is preferably an alanine residue, a valine residue, a leucine residue, or an isoleucine residue.
  • two of the three consecutive amino acid residues of b 3 , d, b 4 are leucine residues and the rest are alanine residues.
  • any of b 3 , d, and b 4 may be an alanine residue.
  • all three consecutive amino acid residues of b 3 , d, and b 4 are leucine residues.
  • n-RLDLRLALRLLDLR-c SEQ ID NO: 1
  • n-RLDLRLLLLRLDLR-c SEQ ID NO: 2
  • n-RADLRLALRLLDLR-c SEQ ID NO: 3
  • n-RLDLRLALLRLDA-c SEQ ID NO: 4
  • n-RADLRLLLRLLDLR-c SEQ ID NO: 5
  • n-RADLRLLLRLDA-c SEQ ID NO: 6
  • n-RLDLRLALLLDLR-c SEQ ID NO: 7
  • n-RLDLRLLARLDLR-c SEQ ID NO: 8
  • Another self-assembling peptide that can be preferably used in the present invention is a peptide described in WO2007 / 000979, that is, a self-assembling peptide having a polar amino acid residue and a nonpolar amino acid residue (hydrophobic amino acid residue) Wherein the polar amino acid residue includes an acidic amino acid residue and a basic amino acid residue, and in the neutral region, the sum of the charge of the acidic amino acid residue and the charge of the basic amino acid residue is 0. And a self-assembling peptide capable of forming a ⁇ -sheet structure in which only the nonpolar amino acid residues are arranged on one surface when self-assembled in an aqueous solution.
  • peptides containing acidic amino acid residues, basic amino acid residues, and uncharged polar amino acids are preferred as polar amino acids.
  • Preferred specific examples of such self-assembling peptides are exemplified below.
  • n-RASARADARASARADA-c SEQ ID NO: 9
  • n-RANARADARANARADA-c SEQ ID NO: 10
  • n-RAAARADAARAAARADA-c SEQ ID NO: 11
  • n-RASARADARADARASA-c SEQ ID NO: 12
  • n-RADARASARASARADA-c SEQ ID NO: 13
  • n-RASARASARASARADA-c SEQ ID NO: 14
  • n-RASARADARASA-c SEQ ID NO: 15
  • n-KASAKAEAKASAKAEA-c SEQ ID NO: 16
  • n-SAEAKAEASAEAKAEA-c SEQ ID NO: 17
  • n-KLSLKLDLKLSL-c SEQ ID NO: 18
  • n-KLALKLDLKLAL-c SEQ ID NO: 19
  • the self-assembling peptide can be manufactured by any appropriate manufacturing method. Examples thereof include a chemical synthesis method such as a solid phase method such as the Fmoc method or a liquid phase method, and a molecular biological method such as gene recombinant expression.
  • the self-assembling peptide may be subjected to any appropriate modification depending on the purpose and the like.
  • the site where the modification is performed is not particularly limited, and examples thereof include an N-terminal amino group, a C-terminal carboxyl group, or both of the self-assembling peptide.
  • any appropriate modification can be selected as long as the modified peptide has the ability to self-assemble.
  • introduction of protecting groups such as acetylation of N-terminal amino group and amidation of C-terminal carboxyl group; introduction of functional groups such as alkylation, esterification or halogenation; hydrogenation; monosaccharide, disaccharide, oligo
  • Introduction of sugar compounds such as sugars or polysaccharides
  • introduction of lipid compounds such as fatty acids, phospholipids or glycolipids
  • introduction of amino acids or proteins introduction of DNA; introduction of compounds having other physiological activities.
  • Only one type of modification may be performed, or two or more types may be combined.
  • the N-terminus of an added peptide having a desired amino acid introduced at the C-terminus of the self-assembling peptide may be acetylated and the C-terminus amidated.
  • the number of amino acids to be introduced is preferably 1 to 180, more preferably 1 to 50, still more preferably 1 to 30, particularly preferably 1 to 10, and most preferably 1. ⁇ 5. If the number of amino acid residues to be introduced exceeds 180, the self-organizing ability may be impaired.
  • the osteogenesis promoting material of the present invention may contain only one kind of self-assembling peptide, or may contain two or more kinds of self-assembling peptides.
  • the concentration of the self-assembling peptide in the osteogenesis promoting material of the present invention can be appropriately set according to the composition, use, and the like.
  • the concentration of the self-assembling peptide is preferably 0.1% by weight to 5.0% by weight, more preferably 0.1% by weight to 3.0% by weight, and still more preferably 0.1% by weight to 2.0% by weight. %. If it is the density
  • the bone fragment used in the present invention may be the bone of the patient who is treated using the bone formation promoting material of the present invention, or may be the bone of another person. Moreover, the bone extract
  • a bone fragment excised for decompression can be used as the bone used as the bone fragment.
  • the collected bone piece may be used as it is, or may be used after any appropriate pretreatment.
  • pretreatment include washing by irrigating with phosphate buffered saline (PBS), drying, and the like.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the size of the bone fragment is not particularly limited, and may be any appropriate size depending on the site to which the bone formation promoting material is applied.
  • the collected bone fragment may be used as it is, may be cut into a desired thickness, or may be used after being processed into any appropriate size (for example, powder).
  • the size of the bone fragment is, for example, 0.5 mm to 5.0 mm, preferably 1.0 mm to 4.0 mm.
  • the size of the bone fragment is, for example, 0.01 mm to 0.5 mm, preferably 0.02 mm to 0.4 mm. is there.
  • the size of the bone fragment is preferably 0.03 mm to 0.3 mm, more preferably 0.04 mm to 0.2 mm. When the size of the bone fragment is within the above range, the bone formation can be more preferably promoted. In this specification, the size of a bone fragment refers to the size of the maximum size portion of one bone fragment.
  • the bone fragment can be processed into a desired size by any appropriate means.
  • a crushing mill etc. are mentioned.
  • the bone fragment content in the osteogenesis promoting material of the present invention is preferably 1 to 100 parts by weight, more preferably 1 to 90 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the self-assembled peptide gel. is there.
  • standard self-organization peptide gel means the gel which consists only of self-assembly peptide and water.
  • the osteogenesis promoting material of the present invention preferably further contains blood and / or blood-derived components.
  • blood-derived components include red blood cells, white blood cells, platelets, plasma, and the like. These blood-derived components may be used alone or in combination of two or more.
  • the blood and / or blood-derived component may be collected from a patient or collected from another person.
  • blood products such as whole blood products, erythrocyte products, plasma products, and platelet products may be used.
  • the concentration of blood and / or blood-derived components in the bone formation promoting material of the present invention is preferably 0.001 ppm to 1000 ppm, more preferably 0.01 ppm to 1000 ppm.
  • concentration of blood and / or blood-derived components is within the above range, bone formation can be promoted more suitably.
  • the osteogenesis promoting material of the present invention further contains a bone morphogenetic protein (BMP).
  • BMP bone morphogenetic protein
  • the osteogenesis promoting material of the present invention can further promote osteogenesis.
  • Specific examples of osteogenic factors include BMP2 / 4 BMP such as BMP2 and BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b and other OP-1 BMP, BMP9, BMP10 and other BMP9 BMP, GDF5, GDF6, Examples include GDF5-based BMP such as GDF7.
  • BMP-2 is preferable because it can favorably promote bone formation.
  • the bone morphogenetic factor may be appropriately modified within a range having the same bone formation promoting effect as the above bone morphogenetic factor.
  • the osteogenic factors may be used alone or in combination of two or more. Since these human BMPs have already been cloned, they can be obtained by genetic engineering techniques based on their nucleotide sequences.
  • the concentration of the bone formation factor in the osteogenesis promoting material of the present invention is usually 0.001 ppm to 1000 ppm, preferably 0.01 ppm to 1000 ppm. If it is the said density
  • the osteogenesis promoting material of the present invention may further contain a physiologically active substance other than the above osteogenic factor.
  • physiologically active substance that can be included in the osteogenesis promoting material of the present invention include differentiation regulators that induce or promote differentiation of bone or cartilage (eg, TGF- ⁇ ); growth hormones; cell function regulators such as EGF and FGF; Immunity or inflammation-related factors such as interferon and interleukin;
  • the concentration of the physiologically active substance in the bone formation promoting material of the present invention is usually 0.001 ppm to 1000 ppm, preferably 0.01 ppm to 1000 ppm. If it is the said density
  • the osteogenesis promoting material of the present invention may further contain any appropriate additive as required.
  • additives include pH adjusters; buffers; isotonic agents; salts; amino acids; vitamins; alcohols; proteins; These additives may be used alone or in combination of two or more.
  • pH adjuster examples include hydrochloric acid, citric acid, acetic acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium carbonate and the like.
  • Buffers include phosphates such as phosphoric acid, sodium phosphate, sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, potassium phosphate, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate; boric acid, borax Borate salts such as sodium borate and potassium borate; citrate salts such as sodium citrate and disodium citrate; acetates such as sodium acetate and potassium acetate; Tris and HEPES.
  • phosphates such as phosphoric acid, sodium phosphate, sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, potassium phosphate, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate
  • boric acid borax Borate salts such as sodium borate and potassium borate
  • citrate salts such as sodium citrate and disodium citrate
  • acetates such as sodium acetate and potassium acetate
  • Tris and HEPES Tris and HEPES.
  • Isotonic agents include chlorides such as sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride and magnesium chloride; monosaccharides such as glucose, fructose and galactose; disaccharides such as sucrose, trehalose, maltose and lactose; mannitol, sorbitol and the like Sugar alcohols; and the like.
  • any appropriate salt other than the additives exemplified above can be used.
  • examples thereof include sodium sulfate and magnesium sulfate.
  • the addition amount of the additive can be set to any appropriate value depending on the purpose and the like.
  • the osteogenesis promoting material of the present invention can be prepared by any appropriate method.
  • a self-assembling peptide gel can be prepared by mixing a self-assembling peptide, water, and other optional components, and then allowing to stand, and then mixing the gel and bone fragments.
  • the self-assembling peptide used in the present invention spontaneously assembles through interaction between peptide molecules in a solution to form a fibrous molecular assembly, and further continues to stand, whereby the molecular assembly Due to the interaction between them, a three-dimensional network structure develops to form a gel.
  • the standing time and the standing temperature can be appropriately set according to the administration subject, the concentration and type of the self-assembling peptide, and the like.
  • purified water such as ion exchange water or distilled water can be preferably used.
  • the self-assembled peptide gel and the bone pieces When using small bone pieces (for example, powdered bone pieces) as the bone pieces, it is preferable to mix the self-assembled peptide gel and the bone pieces because they can be uniformly dispersed.
  • a large bone fragment eg, a bone fragment of about 3 mm
  • the self-assembled peptide gel and the bone fragment may be mixed, or the gel and the bone fragment may be mixed. It is not necessary (only adding bone fragments in the gel).
  • the method for preparing the osteogenesis promoting material of the present invention may further include optional steps such as purification such as filtration; sterilization such as high-pressure steam sterilization, radiation sterilization, and dry heat sterilization;
  • the osteogenesis promoting material of the present invention is used together with a holding device for osteogenesis promoting material.
  • the bone formation promoting material has a sufficient strength at a neutral pH close to the in vivo environment.
  • the bone formation promoting material holding device is preferably a device having a net or mesh structure.
  • the holding device of the present invention can hold bone formation promotion without applying an excessive load to the administration target site. Therefore, for example, it can be used for elderly people whose strength of the bone itself has decreased without applying a burden to the bone. In the case of a fracture, it has been difficult to fix at a site having a complicated shape.
  • the holding device for osteogenesis promoting material of the present invention can use a net, it can follow a complex-shaped portion and can hold the osteogenesis promoting material satisfactorily.
  • An example of a device having a network structure is a stent.
  • the holding device for osteogenesis promoting material of the present invention is composed of a carbon-based material from the viewpoint of excellent biological safety. Any appropriate material can be used as the carbon-based material. Examples of the carbon-based material include carbon-based fibers and carbon nanotubes. As the carbon-based material, carbon-based fibers and carbon nanotubes are preferable.
  • any appropriate orthopedic implant product may be used as the holding device for the bone formation promoting material.
  • a cage, a screw, a rod, etc. are mentioned.
  • Orthopedic implant product can be composed of any suitable material.
  • suitable material for example, pure titanium, titanium alloy, titanium / nickel alloy, metal such as cobalt chrome, polycarbonate resin; polyacetal resin; polyester resin such as polyethylene terephthalate, polybutylene terephthalate, polycyclohexylene dimethyl terephthalate; polyphenylene ether resin; polyphenylene oxide; nylon 6, polyamide resins such as nylon 66 and aromatic polyamide; syndiotactic polystyrene; engineering resins such as ultrahigh molecular weight polyethylene, and polyphenylene sulfide resin, polysulfone resin, polyethersulfone resin, polyetheretherketone resin, polyarylate Resin, liquid crystal polymer, aromatic polyester resin, polyimide resin, polyamideimide resin, polyetherimide resin , Super engineering resins such as aramid resins. From the viewpoint of excellent heat resistance, mechanical strength, chemical resistance, and wear resistance, it is preferable to use an engineering resin or an orthopedic
  • the bone formation promoting material of the present invention is administered in the form of a gel, and a bone fragment having a small size (for example, a powdered bone fragment) can be preferably used. Therefore, it can be easily administered with a syringe or the like, and can be filled into a complicated or narrow administration target site (for example, a gap between bone cracks).
  • the osteogenesis promoting material of the present invention is used by gelling the osteogenesis promoting material and then administering (injecting) it to the administration target site.
  • the bone formation promoting material By gelling the bone formation promoting material, a state in which bone fragments are well dispersed in the bone formation promoting material can be maintained. Therefore, the bone formation promoting effect of the bone formation promoting material of the present invention can be suitably exhibited.
  • the injection of the bone formation promoting material into the administration target site can be performed using any appropriate means such as a syringe, a tube, and a pipette.
  • the self-assembled peptide contained in the bone formation promoting material of the present invention is excellent in biodegradability. Moreover, the bone fragment contained in the bone formation promoting material of the present invention advances bone formation and contributes to new bone formation. In addition, the bone fragment contained in the osteogenesis promoting material of the present invention remains at the administration target site even after decomposition of the self-assembling peptide, and can become a part of the fused bone.
  • the bone formation promoting material of the present invention is used together with the above-described holding device for bone formation promoting material.
  • a bone formation promoter is covered with a bone formation promoting material holding device in the form of a net, thereby forming bone formation. Promoters can be retained.
  • the holding device may be attached to a site to be administered.
  • a bone formation promoting material in the form of a gel may be administered to the administration target site in a state where a bone formation promoting material holding device (for example, a stent) is previously applied to the administration target site.
  • a bone formation promoting material holding device for example, a stent
  • the bone formation promoting material and the holding device can be integrated.
  • the self-assembling peptide contained in the osteogenesis promoting material of the present invention is excellent in biodegradability, it can be absorbed and decomposed over time, and bone fragments can become a part of fused bone. Therefore, after bone formation is completed, only the bone formation promoting material holding device can be removed as necessary.
  • the bone formation promoting material of the present invention may be used in combination with any appropriate fixing method as necessary.
  • the spine since the spine is a part that is constantly subjected to a large load, it needs to be fixed more stably. Therefore, for example, when the bone formation promoting material of the present invention is applied to a vertebral fracture, the bone formation promoting material of the present invention is used in combination with a plate or screw which is a conventional fixing method, so that the bone can be stably fixed. Bone formation can be promoted in this state, and bone union can be promoted in a more appropriate state.
  • the bone formation promoting material of the present invention can be used, for example, for repairing a defect site in bone tissue, periodontal tissue, and the like. Further, the bone formation promoting material of the present invention can promote bone formation while reducing the load on the bone. Therefore, it can be suitably applied to elderly people who are concerned about a decrease in bone strength and a decrease in bone regeneration function.
  • MC3T3-E1 cells are added to a 24-well plate at 50,000 cells / well. After seeding and culturing at room temperature for 24 hours, the medium is changed to a differentiation-inducing medium (the above medium further supplemented with 1% ascorbic acid, 0.2% hydrocortisone, and 2% ⁇ -glycerophosphate).
  • FBS fetal bovine serum
  • PenStrep penicillin streptomycin
  • self-assembling peptide gel C1 (manufactured by 3D Matrix, product name “Puramatrix TM ”, peptide concentration of Ac-RADARADARADARADA-CONH 2 was used.
  • the cells were cultured in the same manner except that 1% by weight gel was used, and the cells were cultured in the same manner without adding the self-assembling peptide gel. After 14 days and 28 days, the cells were subjected to ALP staining and RNA extraction, and the expression level in RNA was measured by RT-PCR. For phosphatase (ALP) staining, it was carried out in the manner described below.
  • ALP phosphatase
  • ALP staining Staining was performed using a Histofine SAB-PO® kit (manufactured by Nichirei Bioscience). The medium was aspirated from each well and washed 3 times with phosphate buffered saline (PBS). Subsequently, it was fixed with 4% paraformaldehyde (PFA), allowed to stand for 10 minutes, and then washed 3 times with PBS. Thereafter, it was permeabilized with 0.2% Triton X (registered trademark) -PBS solution, allowed to stand for 10 minutes, and washed 3 times with PBS.
  • PFA paraformaldehyde
  • blocking reagent I 3% methanol added with hydrogen peroxide
  • the mixture was allowed to stand for 10 to 15 minutes and washed 3 times with PBS.
  • blocking reagent II (10% goat normal serum) was added, and then allowed to stand for 10 minutes, and the first antibody (ALP antibody: abcam Anti-Alkaline Phosphatase, Tissue Non-Specific [EPR4477] antibody body ab 108337) was added. After standing for 2 hours, it was washed 3 times with PBS. Next, a second antibody (biotin-labeled anti-rabbit IgG antibody) was added, allowed to stand for 10 minutes, and washed 3 times with PBS.
  • ALP antibody abcam Anti-Alkaline Phosphatase, Tissue Non-Specific [EPR4477] antibody body ab 108337
  • an enzyme reagent peroxidase-labeled streptavidin
  • DAB substrate kit chromogenic substrate (reagent A)
  • substrate buffer reagent B
  • a drop of the reagent (reagent C) (a solution prepared by adding about 40 ⁇ l) and mixing without foaming) was added, and the mixture was allowed to stand for 5 to 20 minutes and washed with purified water three times. Subsequently, it was counterstained (hematoxylin), allowed to stand for 2 minutes, developed with water, allowed to stand for 10 minutes, and observed with a microscope.
  • FIGS. 1A to 1D show micrographs and ALP-stained photographs of cells after 0 days, 1 day, 7 days, 14 days, and 28 days of culture.
  • ALP which is a bone formation marker, is stained by ALP staining.
  • FIGS. 1A to 1D show micrographs and ALP-stained photographs of cells after 0 days, 1 day, 7 days, 14 days, and 28 days of culture.
  • ALP which is a bone formation marker
  • FIGS. 1A to 1D show micrographs and ALP-stained photographs of cells after 0 days, 1 day, 7 days, 14 days, and 28 days of culture.
  • ALP which is a bone formation marker
  • ALP bone formation markers
  • BMP-2 bone sialoprotein
  • BSP bone sialoprotein
  • osteocalcin Ostexix
  • osteopontin OSP
  • Example 1 Bone fragments (1 mm to 2 mm) were obtained by crushing the femur of the mouse using a pulverizer.
  • a self-assembled peptide gel 2 (manufactured by Menicon Co., Ltd., trade name: Panacea Gel SPG-178-204, peptide concentration: 0.4 w / w%) is placed on the obtained bone fragment and left to stand to form a gel.
  • the bone formation promoting material 1 was obtained.
  • the composition of the self-assembled peptide gel 2 is shown in Table 1.
  • the resulting bone formation promoting material was cultured using the medium MEM ⁇ , 10m% FBS, and 1% Anti-Anti.
  • FIG. 3 shows photographs of the osteogenesis promoting material after 14 days and 28 days of culture and photographs of the osteogenesis promoting material ALP stained.
  • Example 2 instead of the self-assembled peptide gel 2, a bone formation promoting material 2 was obtained in the same manner as in Example 1 except that 1 was used for the self-assembled peptide gel. The obtained bone formation promoting material 2 was cultured in the same manner as in Example 1.
  • FIG. 3 shows photographs of the osteogenesis promoting material after 14 days and 28 days of culture and photographs of the osteogenesis promoting material ALP stained.
  • Example 3 A bone formation promoting material 3 was obtained in the same manner as in Example 1 except that the self-assembled peptide gel 3 was used instead of the self-assembled peptide gel 2.
  • the composition of the self-assembled peptide gel 3 is shown in Table 1.
  • the obtained bone formation promoting material 3 was cultured in the same manner as in Example 1.
  • FIG. 3 shows photographs of the osteogenesis promoting material after 14 days and 28 days of culture and photographs of the osteogenesis promoting material ALP stained.
  • osteogenesis promoting materials 1 to 3 ALP-stained osteoblasts were confirmed.
  • the osteogenesis promoting material C1 the bone fragments were eroded, and osteoblasts were not confirmed.
  • Example 4 A bone defect part of 1 mm ⁇ 3 mm was prepared using a drill on the mouse femur to obtain a femur defect mouse.
  • the osteogenesis promoting material 1 obtained in Example 1 was transplanted into the femur defect portion of the obtained femur defect mouse. Two days, 7 days, 9 days, 14 days, and 21 days after transplantation, the femur portion of the mouse was incised, and the appearance of bone formation was observed.
  • bone healing of the defective part was progressing. Bone formation was clearly promoted in the bone formation promoting material 1 of the present invention as compared with the normal progress of bone fusion.
  • Preparation of femur defect model Anesthesia is performed by injecting 0.1-0.15 ml of somnopentyl (manufactured by Kyoritsu Pharmaceutical Co., Ltd.) into the abdominal cavity of a 10-week-old female rat (obtained from Chubu Scientific Materials). After the application, the thigh was incised and an external fixator (FIG. 4) was attached to the femur. Next, the femur in the middle of the part to which the external fixator was attached was shaved with an airtome to produce a bone defect portion of about 5 mm. (2) Production of born chip The femur collected from the rat was shaved with an airtome, and a bone chip was collected.
  • the collected born chip was stored at ⁇ 80 ° C. until use.
  • Self-assembled peptide gel 1 (manicon Corporation, trade name: Panacea Gel SPG-178-208, peptide concentration: 0.8 w / w%) in 80 ⁇ L of the above born chip 0.05 g
  • self-assembling peptide gel C1 (manufactured by 3D Matrix, product name “Puramatrix TM ”) or physiological saline was used in the same manner to obtain a bone formation promoting material. It was.
  • Each bone formation promoting material prepared in (3) above was made from PEEK cage (Yashima Proceed Co., Ltd., length: 5 mm, outer diameter: 5 mm, inner diameter: 3 mm, FIG. 5). Next, a cage into which a bone formation promoting material was injected was inserted into the femur defect portion of the femur defect mouse, and externally fixed as shown in FIG.
  • FIG. 7 shows an X-ray photograph
  • FIG. 8 shows a CT photograph of a femur defect portion that has been externally fixed using each bone formation promoting material.
  • the bone formation promoting material 1 obtained in Example 1 was applied to the femoral defect
  • bone regeneration was confirmed in the entire defect (SPG-178 in FIGS. 7 and 8).
  • the mouse to which the bone formation promoting material C1 was applied bone regeneration was confirmed only from both ends of the femur (PuraMatrix in FIGS. 7 and 8).
  • Example 5 Self-assembled peptide gel 3 was diluted with Milli-Q water to obtain a 1.0 w / w% aqueous solution. The obtained aqueous solution was dropped on a 24-well plate, and the properties of the gel were observed with a stereomicroscope (magnification 100 times). Further, the pH of the gel was measured with a pH test paper. After 5 mg of the born chip (rat femur) obtained in Test Example 2 was put in a test tube, 5 ⁇ L of the obtained aqueous solution was dropped. Subsequently, after stirring with a vortex mixer, air bubbles were removed with a centrifugal separator to obtain a bone formation promoting material 5. The properties of the obtained bone formation promoting material 5 were observed with a stereomicroscope (magnification 100 times). Further, the pH of the obtained bone formation promoting material was measured with a pH test paper.
  • Example 6 A bone formation promoting material 6 was obtained in the same manner as in Example 5 except that the self-assembled peptide gel 4 was used.
  • the composition of the self-assembled peptide gel 4 is shown in Table 1.
  • the properties and pH of the gel before adding the born chip, and the properties and pH of the bone formation promoting material 6 were evaluated in the same manner as in Example 5.
  • Bone formation promoting material C2 was obtained in the same manner as in Example 5 except that self-assembled peptide gel C1 was used. The properties and pH of the gel before adding the born chip, and the properties and pH of the bone formation promoting material C2 were evaluated in the same manner as in Example 5.
  • FIG. 9 A photograph of the gel before the addition of the born chip in Examples 5 to 6 and Comparative Example 2 is shown in FIG. 9, and a photograph of the gel after the born chip is added (the osteogenesis promoting material) is shown in FIG.
  • all the gels before adding the born chip were uniform gels (homogeneous).
  • the bone formation promoting materials of Examples 5 and 6 were observed with a stereomicroscope, they were in a homogeneous state in which the born chips were uniformly dispersed (FIGS. 10A and 10B).
  • the osteogenesis promoting material of Comparative Example 2 gel-like precipitates were confirmed, and the material was in a non-uniform state (heterogeneous) (FIG. 10C).
  • Example 5 the pH was neutral (about pH 6 to 8) before and after the addition of the born chip.
  • Comparative Example 2 the pH of the gel before adding the born chip was acidic (about pH 4), but the pH became neutral (about pH 6 to 8) after the born chip was added.
  • Example 5 since the pH of the gel was maintained before and after the addition of the born chip, the obtained bone formation promoting material maintained a uniform property. In these examples, since the born chips are uniformly dispersed, it is considered that the bone formation promoting material is used as a scaffold and the bone formation rate is improved. On the other hand, in Comparative Example 2, since the gel was in a heterogeneous state due to the change in pH due to the addition of born chip, it is considered that bone formation could not be promoted sufficiently.
  • the bone formation promoting material of the present invention can be suitably used in the fields of research and development and medicine.

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Abstract

　生体安全性が高く、骨形成を促進し得る骨形成促進材を提供すること。本発明の骨形成促進材は、中性ｐＨの水溶液中でβシート構造を形成し得る自己組織化ペプチドおよび骨片を含む。この自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基のｐＨ７．０における電荷の総和が０ではない。

Description

骨形成促進材
　本発明は、骨形成促進材に関する。より詳細には、自己組織化ペプチドおよび骨片を含む骨形成促進材に関する。
　脊椎は、身体を重力から支えるという役割だけではなく、中枢神経である脊髄を保護するという役割をも有する。整形外科、特に脊椎関連分野では、脊髄等の神経を圧迫する疾患（例えば、頚椎症性脊髄症）や、脊椎の骨折が大きな問題となっている。脊髄圧迫に対しては、脊髄を圧迫する骨を切除して対応せざるを得ない。通常、切除することにより不安定になった脊椎には、本人から採取した骨の移植や、金属のボルトまたはプレート等の金属を用いた固定術が施される。
　また、骨折治療の基本は整復と固定であり、一般的に、金属を用いて固定し、骨癒合させる方法がとられている。しかしながら、四肢骨折の場合には２～３ヶ月、脊椎骨折では半年から１年以上と長期の癒合期間が必要となる。なかでも、高齢者の場合には、骨自体が弱くなっているため、骨癒合が得られる前に再度骨折する場合や、固定のために用いた金属がずれる場合がある。また、大腿骨頚部骨折や脊椎骨折では安静臥床が必要となる場合も有り、そのため廃用症候群が進み介護が必要となるおそれもある。
　近年、様々な手術方法や固定材料が開発されており、骨折の治癒率が向上している。しかしながら、依然として、遷延治癒（骨癒合の遅れ）や偽関節（骨癒合の停止）といった後遺症が生じている。また、脊椎手術においても、脊椎再建のための脊椎固定術において、より効果的なインプラントや手術手技が開発されている。しかしながら、骨再生機能の低下した高齢者に適応する場合には、骨癒合が適切に進行しないおそれがある。
　近年、骨の再生を促進する手法として、骨芽細胞等の培養細胞を患部に移植する手法や、患部への細胞足場の留置等が試みられている。当該細胞足場としては、例えば、ゼラチンおよびコラーゲンに代表される細胞外基質が用いられているが、ゼラチンおよびコラーゲンは、材料の供給源となる動物等により用途が限定されるという欠点がある。これに対して、完全合成の自己組織化ペプチドの単独投与あるいは骨分化誘導因子との混合投与において骨再生の促進が報告されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、非特許文献１）。しかしながら、これまでに骨再生の促進が報告されている自己組織化ペプチドを含む骨形成促進材は、生体内環境に近い中性条件下では、十分な強度を確保することが困難である。
特開２０１２－８２１８０号公報 特表２０１０－５０４９７２号公報 国際公開第２００７／０００９７９号
Ｃｅｌｌ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１５，ｐ９０３－９１０，２００６
　本発明は、生体安全性が高く、骨形成を促進し得る骨形成促進材を提供することを目的とする。
　本発明の骨形成促進材は、中性ｐＨの水溶液中でβシート構造を形成し得る自己組織化ペプチド、および、骨片を含む。この自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基のｐＨ７．０における電荷の総和は０ではない。
　１つの実施形態において、上記自己組織化ペプチドは、下記のアミノ酸配列からなる自己組織化ペプチドである。
アミノ酸配列：ａ１ｂ１ｃ１ｂ２ａ２ｂ３ｄｂ４ａ３ｂ５ｃ２ｂ６ａ４
（該アミノ酸配列中、ａ１～ａ４は、塩基性アミノ酸残基であり；ｂ１～ｂ６は、非電荷極性アミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基であり、ただし、そのうちの少なくとも５個は、疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１およびｃ２は、酸性アミノ酸残基であり；ｄは、疎水性アミノ酸残基である）。
　１つの実施形態において、上記骨形成促進材は血液および／または血液由来成分をさらに含む。
　１つの実施形態において、上記骨形成促進材は骨形成因子をさらに含む。
　１つの実施形態において、上記骨形成促進材は骨形成促進材用保持器具と組み合せて用いられる。
　本発明の別の局面においては、骨形成促進材用保持器具が提供される。本発明の骨形成促進材用保持器具は、上記骨形成促進材と共に用いられる。
　１つの実施形態においては、上記骨形成促進材用保持器具は炭素系材料、エンジニアリング樹脂、または、スーパーエンジニアリング樹脂で構成される。
　本発明によれば、生体安全性が高く、骨形成を促進し得る骨形成促進材が提供される。本発明の骨形成促進材は、中性ｐＨの水溶液中でβシート構造を形成し得る自己組織化ペプチドおよび骨片を含む。これにより、骨形成の起点が多数形成され、骨形成を好適に促進し得る。そのため、骨自体の強度および骨再生能力が低下した高齢者においても、骨形成を向上させることができる。また、本発明の骨形成促進材は、骨形成に直接関与する細胞等を用いることなく、骨新生を誘導し得る。さらに、本発明で用いる自己組織化ペプチドは、中性ｐＨの水溶液中でβシート構造を形成し、上記自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基のｐＨ７．０における電荷の総和は０ではない。そのため、本発明の骨形成促進材は生体環境に近い中性のｐＨで十分な強度を発揮し得る。さらに、本発明の骨形成促進材用保持器具等の適切な保持器具を用いて、所望の位置に骨形成促進材を固定することができる。
培養０日後のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞の写真および培養１日後のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞の写真およびＡＬＰ染色した写真である。 培養７日後のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞の写真およびＡＬＰ染色した写真である。 培養１４日後のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞の写真およびＡＬＰ染色した写真である。 培養２８日後のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞の写真およびＡＬＰ染色した写真である。 培養１日後、７日後、１４日後および２８日後の各細胞における骨形成マーカーの発現量を示すグラフである。 実施例１～３の骨形成促進材および比較例１の骨形成促進材の培養１４日後および２８日後の写真およびＡＬＰ染色した写真である。 大腿骨欠損モデルの作製に用いた創外固定具の写真である。 大腿骨欠損モデルの作製に用いたケージの写真である。 創外固定を行ったマウスの大腿骨の写真である。 創外固定から５６日経過後のマウス大腿骨のＸ線画像である。 創外固定から５６日経過後のマウス大腿骨のＣＴ画像である。 図９（ａ）は実施例５のｂｏｒｎ　ｃｈｉｐ添加前のゲルの写真であり、図９（ｂ）は実施例６のｂｏｒｎ　ｃｈｉｐ添加前のゲルの写真であり、図９（ｃ）は比較例２のｂｏｒｎ　ｃｈｉｐ添加前のゲルの写真である。 図１０（ａ）は実施例５のｂｏｒｎ　ｃｈｉｐ添加後のゲル（骨形成促進材）の写真であり、図１０（ｂ）は実施例６のｂｏｒｎ　ｃｈｉｐ添加後のゲル（骨形成促進材）の写真であり、図１０（ｃ）は比較例２のｂｏｒｎ　ｃｈｉｐ添加後のゲル（骨形成促進材）の写真である。
［Ａ．骨形成促進材］
　本発明の骨形成促進材は、中性ｐＨの水溶液中でβシート構造を形成し得る自己組織化ペプチドと骨片とを含む。この自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基のｐＨ７．０における電荷の総和は０ではない。１つの実施形態においては、本発明の骨形成促進材は血液および／または血液由来成分をさらに含む。また、他の実施形態においては、本発明の骨形成促進材は、骨形成因子をさらに含む。
　本発明の骨形成促進材の回転式レオメーターを用いた動的粘弾性測定における３７℃での貯蔵弾性率（Ｇ’）は、例えば、１Ｐａ～５０００Ｐａであり、好ましくは１Ｐａ～４０００Ｐａ、より好ましくは１Ｐａ～３０００Ｐａである。貯蔵弾性率が当該範囲内であれば、後述する本発明の骨形成促進材用保持器具と併用し、好適に骨形成を促進することができる。なお、本明細書でいう貯蔵弾性率は、周波数変化測定を行ったときの角振動数が１ラジアン／秒であるときの値を意味する。
［Ａ－１．自己組織化ペプチド］
　自己組織化ペプチドとしては、水溶液中においてペプチド分子同士の相互作用を介して自発的に集合してゲルを形成し得る任意の適切なペプチドが用いられ得る。本発明で用いる自己組織化ペプチドは、中性ｐＨでβシート構造を形成し得るものである。より具体的には、水溶液中においてペプチド分子同士の相互作用を介して自発的に集合して繊維状分子集合体を形成し、当該分子集合体間の相互作用により三次元網目構造を発達させてゲルを形成し得るペプチドが好ましく用いられ得る。ペプチド分子同士の相互作用としては、例えば、水素結合、イオン間相互作用、ファンデルワールス力等の静電的相互作用および疎水性相互作用が挙げられる。なお、本明細書において、「中性ｐＨ（中性領域）」とは、ｐＨ５．０～８．０、好ましくはｐＨ５．５～７．５、より好ましくはｐＨ６．０～７．０、さらに好ましくはｐＨ７．０の領域をいう。
　自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ－アミノ酸であってもよく、Ｄ－アミノ酸であってもよい。好ましくはＬ－アミノ酸である。また、天然アミノ酸であってもよく、非天然アミノ酸であってもよい。低価格で入手可能であり、ペプチド合成が容易であることから、好ましくは天然アミノ酸である。
　自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基のｐＨ７．０における電荷の総和は０ではない。該電荷の総和は、好ましくは－３～－１または＋１～＋３であり、より好ましくは－３、－２、＋２または＋３である。このように、中性領域において自己組織化ペプチドに含まれるアミノ酸残基の側鎖に由来するプラス電荷とマイナス電荷とが相殺されないことにより、ゲル形成に適した静電的引力及び斥力のバランスが保たれ、その結果として、中性領域で透明かつ安定なゲルを形成し得るからである。
　各ｐＨにおける上記自己組織化ペプチドの電荷は、ＰＲＯＴＥＩＮ　ＣＡＬＣＵＬＡＴＯＲ　ｖ３．４のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｔｃａｌｃ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）上で利用可能なプログラムにより行なわれ得る。
　本発明に好ましく使用され得る自己組織化ペプチドの具体例としては、下記の式（Ｉ）のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
　　　ａ１ｂ１ｃ１ｂ２ａ２ｂ３ｄｂ４ａ３ｂ５ｃ２ｂ６ａ４　　　（Ｉ）
（上記アミノ酸配列中、ａ１～ａ４は、塩基性アミノ酸残基であり；ｂ１～ｂ６は、非電荷極性アミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基であり、ただし、そのうちの少なくとも５個は、疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１およびｃ２は、酸性アミノ酸残基であり；ｄは、疎水性アミノ酸残基である。）
　上記アミノ酸配列中、ａ１～ａ４は、塩基性アミノ酸残基である。塩基性アミノ酸は、好ましくはアルギニン、リシン、またはヒスチジンであり、より好ましくはアルギニンまたはリシンである。これらのアミノ酸は、塩基性が強いからである。ａ１～ａ４は、同一のアミノ酸残基であってもよく、異なるアミノ酸残基であってもよい。
　上記アミノ酸配列中、ｂ１～ｂ６は、非電荷極性アミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基であり、そのうちの少なくとも５個は、疎水性アミノ酸残基である。疎水性アミノ酸は、好ましくはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、またはプロリンである。非電荷極性アミノ酸は、好ましくはチロシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、またはシステインである。これらのアミノ酸は、入手が容易だからである。
　好ましくは、ｂ３およびｂ４は、それぞれ独立して任意の適切な疎水性アミノ酸残基であり、さらに好ましくはロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、またはイソロイシン残基であり、特に好ましくはロイシン残基またはアラニン残基である。
　好ましくは、ｂ１～ｂ６はすべて疎水性アミノ酸残基である。自己組織化ペプチドが好適にβシート構造を形成し、自己組織化し得るからである。より好ましくは、ｂ１～ｂ６は、それぞれ独立してロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、またはイソロイシン残基であり、さらに好ましくはロイシン残基またはアラニン残基である。好ましい実施形態においては、ｂ１～ｂ６のうちの４個以上がロイシン残基であり、より好ましくはそのうちの５個以上がロイシン残基であり、さらに好ましくは全てがロイシン残基である。
　上記アミノ酸配列中、ｃ１およびｃ２は、酸性アミノ酸残基である。酸性アミノ酸は、好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸である。これらのアミノ酸は、入手が容易だからである。ｃ１およびｃ２は、同一のアミノ酸残基であってもよく、異なるアミノ酸残基であってもよい。
　上記アミノ酸配列中、ｄは、疎水性アミノ酸残基である。ｄは、好ましくはアラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、またはイソロイシン残基である。
　１つの好ましい実施形態においては、ｂ３、ｄ、ｂ４の連続する３つのアミノ酸残基のうち２つがロイシン残基であり、残りがアラニン残基である。この場合、ｂ３、ｄ、ｂ４のいずれがアラニン残基であってもよい。また、別の好ましい実施形態においては、ｂ３、ｄ、ｂ４の連続する３つのアミノ酸残基がすべてロイシン残基である。
　式（Ｉ）のアミノ酸配列の好ましい具体例を以下に例示する。
　　　　　ｎ－ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ－ｃ（配列番号１）
　　　　　ｎ－ＲＬＤＬＲＬＬＬＲＬＤＬＲ－ｃ（配列番号２）
　　　　　ｎ－ＲＡＤＬＲＬＡＬＲＬＤＬＲ－ｃ（配列番号３）
　　　　　ｎ－ＲＬＤＬＲＬＡＬＲＬＤＡＲ－ｃ（配列番号４）
　　　　　ｎ－ＲＡＤＬＲＬＬＬＲＬＤＬＲ－ｃ（配列番号５）
　　　　　ｎ－ＲＡＤＬＲＬＬＬＲＬＤＡＲ－ｃ（配列番号６）
　　　　　ｎ－ＲＬＤＬＲＡＬＬＲＬＤＬＲ－ｃ（配列番号７）
　　　　　ｎ－ＲＬＤＬＲＬＬＡＲＬＤＬＲ－ｃ（配列番号８）
　本発明に好ましく使用され得る別の自己組織化ペプチドとしては、ＷＯ２００７／０００９７９に記載のペプチド、すなわち、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基（疎水性アミノ酸残基）とを有する自己組織化ペプチドであって、該極性アミノ酸残基として酸性アミノ酸残基及び塩基性アミノ酸残基を含み、中性領域において、該酸性アミノ酸残基の電荷と該塩基性アミノ酸残基の電荷との総和が０を除く数であり、水溶液中において自己組織化した際に該非極性アミノ酸残基のみが一方の面に配置されたβ－シート構造を形成しうる自己組織化ペプチドが挙げられる。
　上記自己組織化ペプチドのなかでも、極性アミノ酸として、酸性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基と非電荷極性アミノ酸とを含むペプチドが好ましい。係る自己組織化ペプチドの好ましい具体例を以下に例示する。
　　　　　ｎ－ＲＡＳＡＲＡＤＡＲＡＳＡＲＡＤＡ－ｃ（配列番号９）
　　　　　ｎ－ＲＡＮＡＲＡＤＡＲＡＮＡＲＡＤＡ－ｃ（配列番号１０）
　　　　　ｎ－ＲＡＡＡＲＡＤＡＲＡＡＡＲＡＤＡ－ｃ（配列番号１１）
　　　　　ｎ－ＲＡＳＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＳＡ－ｃ（配列番号１２）
　　　　　ｎ－ＲＡＤＡＲＡＳＡＲＡＳＡＲＡＤＡ－ｃ（配列番号１３）
　　　　　ｎ－ＲＡＳＡＲＡＳＡＲＡＳＡＲＡＤＡ－ｃ（配列番号１４）
　　　　　ｎ－ＲＡＳＡＲＡＤＡＲＡＳＡ－ｃ　　　　（配列番号１５）
　　　　　ｎ－ＫＡＳＡＫＡＥＡＫＡＳＡＫＡＥＡ－ｃ（配列番号１６）
　　　　　ｎ－ＳＡＥＡＫＡＥＡＳＡＥＡＫＡＥＡ－ｃ（配列番号１７）
　　　　　ｎ－ＫＬＳＬＫＬＤＬＫＬＳＬ－ｃ　　　　（配列番号１８）
　　　　　ｎ－ＫＬＡＬＫＬＤＬＫＬＡＬ－ｃ　　　　（配列番号１９）
　上記自己組織化ペプチドは、任意の適切な製造方法によって製造され得る。例えば、Ｆｍｏｃ法等の固相法又は液相法等の化学合成方法、遺伝子組換え発現等の分子生物学的方法が挙げられる。
　上記自己組織化ペプチドは、目的等に応じて任意の適切な修飾が施されていてもよい。修飾が行われる部位は、特に限定されず、例えば、自己組織化ペプチドのＮ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基、またはその両方が挙げられる。
　上記修飾としては、修飾後のペプチドが自己組織化能を有する範囲において任意の適切な修飾が選択され得る。例えば、Ｎ末端アミノ基のアセチル化、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化等の保護基の導入；アルキル化、エステル化、またはハロゲン化等の官能基の導入；水素添加；単糖、二糖、オリゴ糖、または多糖等の糖化合物の導入；脂肪酸、リン脂質、または糖脂質等の脂質化合物の導入；アミノ酸またはタンパク質の導入；ＤＮＡの導入；その他生理活性を有する化合物等の導入が挙げられる。修飾は１種のみ行われてもよく、２種以上を組み合わせて行ってもよい。例えば、上記自己組織化ペプチドのＣ末端に所望のアミノ酸を導入した付加ペプチドのＮ末端をアセチル化し、Ｃ末端をアミド化してもよい。
　アミノ酸またはタンパク質が導入される場合、導入されるアミノ酸の数は、好ましくは１～１８０であり、より好ましくは１～５０、さらに好ましくは１～３０、特に好ましくは１～１０、最も好ましくは１～５である。導入するアミノ酸残基数が１８０を超えると、自己組織化能が損なわれる場合がある。
　本発明の骨形成促進材は、１種類のみの自己組織化ペプチドを含んでもよく、２種以上の自己組織化ペプチドを含んでもよい。
　本発明の骨形成促進材における自己組織化ペプチドの濃度は、組成、用途等に応じて適切に設定され得る。自己組織化ペプチドの濃度は、好ましくは０．１重量％～５．０重量％、より好ましくは０．１重量％～３．０重量％、さらに好ましくは０．１重量％～２．０重量％である。上記範囲の濃度であれば、本発明の効果が好適に得られ得る。
［Ａ－２.骨片］
　本発明で用いる骨片は、本発明の骨形成促進材を用いて治療を行う患者自身の骨であってもよく、他者の骨であってもよい。また、骨形成促進材を適用しようとする部位から採取した骨であってもよく、他の部位から採取した骨であってもよい。骨片として用いる骨としては、例えば、除圧のために切除した骨片等を用いることができる。
　上記骨片は採取したものをそのまま用いてもよく、任意の適切な前処理を施した後、用いてもよい。前処理としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で灌流することによる洗浄、乾燥等が挙げられる。
　上記骨片の大きさは、特に制限はなく、骨形成促進材を適用する部位に応じて任意の適切な大きさであり得る。例えば、採取した骨片をそのまま用いてもよく、所望の厚みの切片にしてもよく、任意の適切な大きさ（例えば、粉末状）に加工して用いてもよい。採取した骨片をそのまま適用する場合、骨片の大きさは、例えば、０．５ｍｍ～５．０ｍｍであり、好ましくは１．０ｍｍ～４．０ｍｍである。また、任意の適切な大きさ（例えば、粉末状）に加工して用いる場合、骨片の大きさは、例えば、０．０１ｍｍ～０．５ｍｍであり、好ましくは０．０２ｍｍ～０．４ｍｍである。骨片の大きさは、好ましくは０．０３ｍｍ～０．３ｍｍであり、より好ましくは０．０４ｍｍ～０．２ｍｍである。骨片の大きさが上記の範囲内であることにより、より好適に骨形成を促進し得る。本明細書において、骨片の大きさは、１つの骨片において最大サイズの部分の大きさをいう。
　上記骨片は任意の適切な手段により、所望の大きさに加工し得る。例えば、粉砕ミル等が挙げられる。
　本発明の骨形成促進材における骨片の含有量は、好ましくは自己組織化ペプチドゲル１００重量部に対して、１重量部～１００重量部であり、より好ましくは１重量部～９０重量部である。骨片の含有量が上記の範囲内であることにより、より好適に骨形成を促進し得る。なお、本明細書において、基準となる自己組織化ペプチドゲルは自己組織化ペプチドおよび水のみからなるゲルをいう。
［Ａ－３．血液および血液由来成分］
　本発明の骨形成促進材は好ましくは、血液および／または血液由来成分をさらに含む。血液および／または血液由来成分をさらに含むことにより、軟骨形成の誘導の促進という効果を得ることができる。血液由来成分としては、例えば、赤血球、白血球、血小板、血漿等が挙げられる。これらの血液由来成分は単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　上記血液および／血液由来成分は、患者から採取したものであってもよく、他者から採取したものであってもよい。また、全血製剤、赤血球製剤、血漿製剤、血小板製剤等の血液製剤を用いてもよい。
　本発明の骨形成促進材における血液および／または血液由来成分の濃度は、好ましくは０．００１ｐｐｍ～１０００ｐｐｍであり、より好ましくは０．０１ｐｐｍ～１０００ｐｐｍである。血液および／または血液由来成分の濃度が上記の範囲内であることにより、より好適に骨形成を促進し得る。
［Ａ－４．骨形成因子］
　本発明の骨形成促進材は、骨形成因子（Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ,　ＢＭＰ）をさらに含むことが好ましい。骨形成因子をさらに含むことにより、本発明の骨形成促進材は骨形成をさらに促進し得る。骨形成因子の具体例としては、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４等のＢＭＰ２/４系ＢＭＰ、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ等のＯＰ-１系ＢＭＰ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０等のＢＭＰ９系ＢＭＰ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７等のＧＤＦ５系のＢＭＰ等が挙げられる。上記骨形成因子としては、骨形成を好適に促進することができる点から、ＢＭＰ－２が好ましい。なお、上記骨形成因子と同等の骨形成促進作用を有する範囲において、骨形成因子が適宜修飾されていてもよい。また、骨形成因子としてヒト組み換え骨形成因子（ｒｈＢＭＰ）を用いてもよい。骨形成因子は単独で用いてもよく、２種以上を組み合せて用いてもよい。これらのヒトＢＭＰは、すでにクローニングされているので、その塩基配列に基づいて遺伝子工学的手法によって得ることができる。
　本発明の骨形成促進材における骨形成因子の濃度は、通常０．００１ｐｐｍ～１０００ｐｐｍ、好ましくは０．０１ｐｐｍ～１０００ｐｐｍである。当該濃度範囲であれば、生理活性物質の作用が好適に発揮されて、骨形成が促進され得る。
［Ａ－５．他の生理活性物質］
　本発明の骨形成促進材は、上記骨形成因子以外の生理活性物質をさらに含んでいてもよい。本発明の骨形成促進材が含み得る生理活性物質としては、骨もしくは軟骨の分化を誘導または促進する分化制御因子（例えば、ＴＧＦ－β）；成長ホルモン；ＥＧＦ、ＦＧＦ等の細胞機能制御因子；インターフェロン、インターロイキン等の免疫または炎症関連因子；等が挙げられる。
　本発明の骨形成促進材における生理活性物質の濃度は、通常０．００１ｐｐｍ～１０００ｐｐｍ、好ましくは０．０１ｐｐｍ～１０００ｐｐｍである。当該濃度範囲であれば、生理活性物質の作用が好適に発揮されて、骨形成が促進され得る。
［Ａ－６．他の添加物］
　本発明の骨形成促進材は、必要に応じて任意の適切な添加物をさらに含み得る。添加物の具体例としては、ｐＨ調整剤；緩衝剤；等張化剤；塩類；アミノ酸類；ビタミン類；アルコール類；蛋白質；薬物等が挙げられる。これらの添加物は、単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　ｐＨ調整剤としては、塩酸、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられる。
　緩衝剤としては、リン酸、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等のリン酸塩；ホウ酸、ホウ砂、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウム等のホウ酸塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム等のクエン酸塩；酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸塩、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ等が挙げられる。
　等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等の塩化物；グルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖；スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース等の二糖；マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール；等が挙げられる。
　塩類としては、上記で例示した添加物以外の任意の適切な塩が用いられ得る。例えば、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が挙げられる。
　上記添加物の添加量は、その目的等に応じて任意の適切な値に設定され得る。
［Ｂ．調製方法］
　本発明の骨形成促進材は、任意の適切な方法により調製され得る。例えば、自己組織化ペプチドと水と他の任意成分とを混合した後、静置することにより自己組織化ペプチドゲルを調製し、該ゲルと骨片とを混合することにより調製することができる。本発明で用いる自己組織化ペプチドは、溶液中においてペプチド分子同士の相互作用を介して自発的に集合して繊維状の分子集合体を形成し、さらに静置を続けることにより、当該分子集合体間の相互作用によって三次元網目構造が発達してゲルの形態となる。静置時間および静置温度は、投与対象、自己組織化ペプチドの濃度および種類等に応じて適切に設定され得る。上記水としては、イオン交換水、蒸留水等の精製された水が好ましく用いられ得る。
　骨片としてサイズの小さい骨片（例えば、粉末状の骨片）を用いる場合には、均一に分散させることができるという点から、自己組織化ペプチドゲルと骨片とを混合することが好ましい。また、骨片としてサイズが大きい骨片（例えば、３ｍｍ程度の骨片）を用いる場合には、自己組織化ペプチドゲルと骨片とを混合してもよく、該ゲルと骨片とを混合しなくとも（ゲル内に骨片を添加するのみでも）よい。混合方法としては、特に制限はなく、任意の適切な手段を用いて混合すればよい。
　本発明の骨形成促進材の調製方法は、ろ過等の精製；高圧蒸気滅菌、放射線滅菌、乾熱滅菌等の滅菌；包装容器への分注；等の任意の工程をさらに含み得る。
［Ｃ．骨形成促進材用保持器具］
　１つの実施形態においては、本発明の骨形成促進材は骨形成促進材用保持器具と共に用いられる。上記骨形成促進材は、生体内環境に近い中性ｐＨで十分な強度を有する。この骨形成促進材を本発明の保持器具で固定することにより、骨形成促進材を投与対象部位に保持することができる。これにより、目的とする投与対象部位において、骨形成を促進することができ、例えば、骨癒合を促進することができる。
　骨形成促進材用保持器具は、好ましくはネット、または、網目状の構造を有する器具である。このような形態であることにより、本発明の保持器具は投与対象部位に過度の負荷をかけることなく、骨形成促進を保持し得る。そのため、例えば、骨自体の強度が低下した高齢者にも、骨に負担をかけることなく、適用することなく用いることができる。また、骨折の場合、形状が複雑な部位では固定を行うことが困難であった。しかしながら、本発明の骨形成促進材用保持器具ではネットを用いることが可能であるため、複雑な形状な部位にも追従可能であり、良好に骨形成促進材を保持し得る。網目状の構造を有する器具としては、例えば、ステントが挙げられる。
　本発明の骨形成促進材用保持器具は生体安全性に優れるという点から、炭素系材料で構成されることが好ましい。炭素系材料としては、任意の適切な材料を用いることができる。炭素系材料としては、例えば、炭素系繊維、カーボンナノチューブ等が挙げられる。炭素系材料としては、炭素系繊維、カーボンナノチューブが好ましい。
　また、骨形成促進材用保持器具として、任意の適切な整形インプラント製品を用いてもよい。具体的には、ケージ、スクリュー、ロッド等が挙げられる。
　整形インプラント製品は、任意の適切な材料で構成され得る。例えば、純チタン、チタン合金、チタン・ニッケル合金、コバルトクロム等の金属、ポリカーボネート樹脂；ポリアセタール樹脂；ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリシクロヘキシレンジメチルテレフタレート等のポリエステル樹脂；ポリフェニレンエーテル樹脂；ポリフェニレンオキシド；ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド樹脂；シンジオタクチックポリスチレン；超高分子量ポリエチレン等のエンジニアリング樹脂、および、ポリフェニレンサルファイド樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルホン樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂、ポリアリレート樹脂、液晶ポリマー、芳香族ポリエステル樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミドイミド樹脂、ポリエーテルイミド樹脂、アラミド樹脂等のスーパーエンジニアリング樹脂等が挙げられる。高耐熱性、機械的強度、耐薬品性、および、耐摩耗性に優れるという点から、エンジニアリング樹脂またはスーパーエンジニアリング樹製の整形インプラント製品を用いることが好ましい。また、エンジニアリング樹脂またはスーパーエンジニアリング樹脂は、炭素繊維等の強化材を含んだものであってもよい。
［Ｄ．骨形成促進材の使用方法］
　本発明の骨形成促進材は、１つの実施形態においては、ゲルの形態で投与され、サイズの小さい骨片（例えば、粉末状の骨片）を好適に用いることができる。そのため、シリンジ等で容易に投与することができ、複雑または狭小な投与対象部位（例えば、骨のひび割れの間隙）にも充填することができる。
　別の実施形態においては、本発明の骨形成促進材は、骨形成促進材をゲル化した後、投与対象部位に投与（注入）することにより使用される。骨形成促進材をゲル化することにより、骨形成促進材中に骨片が良好に分散した状態が維持され得る。そのため、本発明の骨形成促進材の骨形成促進効果を好適に発揮することができる。
　骨形成促進材の投与対象部位への注入は、シリンジ、チューブ、ピペット等の任意の適切な手段を用いて行われ得る。
　本発明の骨形成促進材に含まれる自己組織化ペプチドは生体分解性に優れる。また、本発明の骨形成促進材に含まれる骨片は、骨形成を進行させ、新たな骨形成に寄与する。なお、本発明の骨形成促進材に含まれる骨片は、自己組織化ペプチドの分解後も投与対象部位に残存し、癒合骨の一部となり得る。
　さらに、別の実施形態においては、本発明の骨形成促進材は、上記骨形成促進材用保持器具と共に使用される。例えば、投与対象部位にゲル状の骨形成促進材を投与した後、ネットの形態である骨形成促進材用保持器具を用いて、投与対象部位および骨形成促進材を被覆することにより、骨形成促進材を保持し得る。さらに、骨形成促進材用保持器具（例えば、ケージ）内に骨形成促進材を充填した後、該保持器具を投与対象部位に取り付けてもよい。また、投与対象部位に予め骨形成促進材用保持器具（例えば、ステント）を適用した状態で、投与対象部位に例えばゲルの形態の骨形成促進材を投与し、使用してもよい。この実施形態においては、骨形成促進材と保持器具とが一体化し得る。しかしながら、本発明の骨形成促進材に含まれる自己組織化ペプチドは生体分解性に優れることから、経時的に吸収・分解され、骨片は癒合骨の一部となり得る。そのため、骨形成が完了した後、必要に応じて、骨形成促進材用保持器具のみを除去することができる。
　本発明の骨形成促進材は、必要に応じて、任意の適切な固定方法を併用してもよい。例えば、脊椎は絶えず大きな負荷がかかる部位であるため、より安定して固定する必要がある。そのため、例えば、脊椎骨折に本発明の骨形成促進材を適用する場合には、従来の固定方法であるプレートやスクリューと併せて、本発明の骨形成促進材を用いることにより、安定して固定した状態で骨形成を促進し、より適切な状態において骨癒合を促進し得る。
　本発明の骨形成促進材は、例えば、骨組織、歯周組織等における欠損部位の修復等に用いられ得る。また、本発明の骨形成促進材は、骨への負荷を軽減させながら、骨形成を促進させ得る。そのため、骨の強度低下や骨再生の機能低下が懸念される高齢者にも好適に適用することができる。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
［試験例１：細胞培養試験］
　自己組織化ペプチドゲル１（株式会社メニコン製、商品名：Ｐａｎａｃｅａ　Ｇｅｌ　ＳＰＧ－１７８－２０８（Ｎ末端がアセチル化され、Ｃ末端がアミド化された配列番号１のペプチド（ＳＰＧ－１７８）（自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基の中性領域（ｐＨ７．０）における電荷の総和：＋２）を含むペプチドゲル、ペプチド濃度：０．８ｗ／ｗ％）６μｌを４℃で１．５時間静置した。次いで、培地（ＭＥＭαに１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリンストレプトマイシン（ＰｅｎＳｔｒｅｐ）溶液を添加したもの）５００μｌを添加し、３７℃で１時間静置した後、培地を交換し、２４ウェルプレートに添加した。添加した２４ウェルプレートにＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を５０，０００ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるよう播種し、室温で２４時間培養した後、培地を分化誘導培地（上記培地にさらに１％アスコルビン酸、０．２％ヒドロコルチゾン、２％β‐グリセロリン酸塩を添加したもの）に交換し、室温にて細胞培養を行った。また、比較として、自己組織化ペプチドゲル１に代えて、自己組織化ペプチドゲルＣ１（３Ｄマトリックス社製、製品名「ＰｕｒａｍａｔｒｉｘＴＭ」、Ａｃ－ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ－ＣＯＮＨ２のペプチド濃度１重量％のゲル）を用いた以外は同様にして、細胞培養を行った。さらに、自己組織化ペプチドゲルを添加せず、細胞のみの培養も同様に行った。培養から１日後、７日後、１４日後、２８日後に細胞のＡＬＰ染色およびＲＮＡ抽出を行った。ＲＮＡでの発現量はＲＴ－ＰＣＲにより測定した。アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色については、以下の方法で行った。
（ＡＬＰ染色）
　ヒストファインＳＡＢ－ＰＯ（Ｒ）キット（ニチレイバイオサイエンス社製）を用いて、染色処理を行った。各ウェルから培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、１０分間静置した後、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、０．２％トリトンＸ（登録商標）－ＰＢＳ溶液で透過処理を行い、１０分間静置し、ＰＢＳで３回洗浄した。ブロッキング試薬Ｉ（３％過酸化水素加メタノール）を添加した後、１０分～１５分間静置し、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、ブロッキング試薬ＩＩ（１０％ヤギ正常血清）を添加した後、１０分間静置し、第一抗体（ＡＬＰ抗体：ａｂｃａｍ　Ａｎｔｉ－Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｎｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　［ＥＰＲ４４７７］　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｂ　１０８３３７）を添加し、２時間静置した後、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、第二抗体（ビオチン標識抗ウサギＩｇＧ抗体）を添加して、１０分間静置し、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、酵素試薬（ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン）を添加し、５分間静置した後、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、基質溶液（ＤＡＢ基質キット：発色基質（試薬Ａ)２滴（約４０μｌ)と基質緩衝液（試薬Ｂ)２滴（約４０μｌ)を精製水１ｍｌに加え、泡立てないように混合し、発色試薬（試薬Ｃ)を１滴（約４０μｌ)を加え泡立てないように混合した溶液）を加え、５分～２０分間静置し、精製水で３回洗浄した。次いで、対比染色（ヘマトキシリン）し、２分間静置し、水で色出しし、１０分間静置し、顕微鏡で観察した。
＜結果＞
　培養０日後、１日後、７日後、１４日後、２８日後の細胞の顕微鏡写真およびＡＬＰ染色した写真を図１Ａ～図１Ｄに示す。ＡＬＰ染色により、骨形成マーカーであるＡＬＰが染色される。自己組織化ペプチドゲル１を用いた場合、ＡＬＰ染色される骨芽細胞が凝集しており、骨形成を十分に誘導し得ると考えられた（図１）。一方、細胞のみを培養した場合、細胞分化していないため、ＡＬＰ染色による発現は少なかった。自己組織化ペプチドゲルＣ１を用いた場合にも、ＡＬＰ染色された範囲が確認された（図１）。
　培養１日後、７日後、１４日後、２８日後の各細胞における骨形成マーカー（ＡＬＰ、ＢＭＰ－２、骨シアロタンパク（ＢＳＰ）、オステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、オステリクス（Ｏｓｔｅｒｉｘ）、オステオポンチン（ＯＳＰ））の発現量を示すグラフを図２に示す。培養２８日目（骨形成成熟時期）において、ＡＬＰ、ＢＭＰ－２、ＯＰＮ、ＢＳＰ、オステリクスにおいて、自己組織化ペプチドゲル１（図２中のＳＰＧ）を用いた場合、自己組織化ペプチドゲルＣ１（図２中のＰＭ）を用いて培養した場合に比べて有意に発現量が上昇した。ＡＬＰは通常、骨形成の初期において発現量が上昇するマーカーである。ＡＬＰが他の骨形成マーカーと同様に発現量が高いことから、自己組織化ペプチドゲル１を用いることにより、各骨形成マーカーが持続的に誘導されると考えられた。
［実施例１］
　マウスの大腿骨を粉砕機を用いて砕くことにより、骨片（１ｍｍ～２ｍｍ）を得た。得られた骨片に自己組織化ペプチドゲル２（株式会社メニコン製、商品名：Ｐａｎａｃｅａ　Ｇｅｌ　ＳＰＧ－１７８－２０４、ペプチド濃度：０．４ｗ／ｗ％）をのせて、静置することによりゲル状の骨形成促進材１を得た。自己組織化ペプチドゲル２の組成を表１に示す。
　得られた骨形成促進材を培地ＭＥＭαと１０m％ＦＢＳと１％Ａｎｔｉ－Ａｎｔｉを用いて培養した。培養１４日後、および２８日後の骨形成促進材の写真および該骨形成促進材をＡＬＰ染色した写真を図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例２］
　自己組織化ペプチドゲル２に代えて、自己組織化ペプチドゲルに１を用いた以外は実施例１と同様にして、骨形成促進材２を得た。得られた骨形成促進材２を実施例１と同様に培養した。培養１４日後、および２８日後の骨形成促進材の写真および該骨形成促進材をＡＬＰ染色した写真を図３に示す。
［実施例３］
　自己組織化ペプチドゲル２に代えて、自己組織化ペプチドゲル３を用いた以外は実施例１と同様にして、骨形成促進材３を得た。自己組織化ペプチドゲル３の組成を表１に示す。得られた骨形成促進材３を実施例１と同様に培養した。培養１４日後、および２８日後の骨形成促進材の写真および該骨形成促進材をＡＬＰ染色した写真を図３に示す。
（比較例１）
　自己組織化ペプチドゲル２に代えて、自己組織化ペプチドゲルＣ１（３Ｄマトリックス社製、製品名「ＰｕｒａｍａｔｒｉｘＴＭ」、Ａｃ－ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ－ＣＯＮＨ２のペプチド濃度１重量％のゲル）を用いた以外は実施例１と同様にして、骨形成促進材Ｃ１を得た。自己組織化ペプチドゲルＣ１の組成は表１に示す。得られた骨形成促進材Ｃ１を用いた以外は実施例１と同様にして培養した。培養１４日後、および２８日後の骨形成促進材の写真および該骨形成促進材をＡＬＰ染色した写真を図３に示す。
（結果）
　骨形成促進材１～３では、ＡＬＰ染色された骨芽細胞が確認された。一方、骨形成促進材Ｃ１では骨片が腐骨化し、骨芽細胞は確認されなかった。
［実施例４］
　マウス大腿骨にドリルを用いて１ｍｍ×３ｍｍの骨欠損部を作製し大腿骨欠損マウスを得た。
　得られた大腿骨欠損マウスの大腿骨欠損部分に実施例１で得られた骨形成促進材１を移植した。移植２日後、７日後、９日後、１４日後、２１日後のマウスの大腿骨部分を切開し、骨形成の様子を観察した。骨形成促進材１を移植したマウスにおいて、欠損部分の骨癒合が進行していた。通常の骨癒合の進行に比べて、本発明の骨形成促進材１では、明らかに骨形成が促進されていた。
［試験例２］大腿骨再生試験
　大腿骨欠損マウスを用いて、以下の手順により大腿骨再生試験を行った。創外固定後、５６日経過後の大腿骨欠損部をＸ線撮影およびＣＴ撮影し、大腿骨の再生性能を評価した。Ｘ線撮影およびＣＴ撮影の条件は、以下に示す。また、ＣＴ撮影の結果から、骨再生量を算出した。なお、骨形成促進材ごとに４検体のマウスを用いて試験を行った。
 
（１）大腿骨欠損モデルの作製
　１０週齢のメスのラット（中部科学資材から入手）の腹腔内にソムノペンチル（共立製薬（株）社製）を０．１ｍｌ～０．１５ｍｌ注射して麻酔をかけた後、大腿部を切開し、大腿骨に創外固定具（図４）を装着した。次いで、創外固定具を装着した部分の中間の大腿骨をエアトームで削り、約５ｍｍの骨欠損部を作製した。
（２）ｂｏｒｎ　ｃｈｉｐの作製
　上記ラットから採取した大腿骨をエアトームで削り、骨片（ｂｏｒｎ　ｃｈｉｐ）を採取した。採取したｂｏｒｎ　ｃｈｉｐは使用まで－８０℃で保存した。
（３）骨形成促進材の調製
　自己組織化ペプチドゲル１（株式会社メニコン製、商品名：Ｐａｎａｃｅａ　Ｇｅｌ　ＳＰＧ－１７８－２０８、ペプチド濃度：０．８ｗ／ｗ％）８０μＬに、上記ｂｏｒｎ　ｃｈｉｐ０．０５ｇを混ぜ、骨形成促進材を得た。自己組織化ペプチドゲル１に代えて、自己組織化ペプチドゲルＣ１（３Ｄマトリックス社製、製品名「ＰｕｒａｍａｔｒｉｘＴＭ」）、または、生理食塩水を用いた以外は同様にして、骨形成促進材を得た。
（４）大腿骨欠損部への創外固定
　上記（３）で調製した各骨形成促進材をＰＥＥＫ製のケージ（八十島プロシード（株）社製、長さ：５ｍｍ、外径：５ｍｍ、内径：３ｍｍ、図５）に注入した。次いで、大腿骨欠損マウスの大腿骨欠損部に骨形成促進材を注入したケージを挿入し、図６に示すように創外固定した。
＜Ｘ線撮影＞
Ｘ線撮影装置：ＳＯＦＴＥＸ／ＣＭＢ－２（ソフテックス（株）製）
 
（撮影条件）
電圧：５０ＫＶｐ
電流:１０ｍＡ
時間：１５秒
撮影距離：６０ｃｍ
フィルム：ＦＵＪＩＦＩＬＭ
 
＜ＣＴ撮影＞
ＣＴ撮影装置：高分解能ｉｎ　ｖｉｖｏマイクロＸ線ＣＴスキャナ（ＳＫＹＳＣＡＮ　１１７６）
 
（撮影条件）
Ｆｉｌｔｅｒ：Ｃｕ＋ＡＬ
Ｓｏｕｒｃｅ　Ｖｏｌｔａｇｅ：８０ＫＶ
Ｓｏｕｒｃｅ　Ｃｕｒｒｅｎｔ：３１３μＡ
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　Ｒｏｗｓ：１３３６
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　Ｃｏｌｕｍｎｓ：２０００
Ｉｍａｇｅ　Ｐｉｘｅｌ　Ｓｉｚｅ：１７．６μｍ
 
（Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ条件）
Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｐｒｏｇｒａｍ：ＮＲｅｃｏｎ
Ｐｉｘｅｌ　Ｓｉｚｅ:１７．６０２２３μｍ
Ｍｉｎｉｍｕｍ　ｆｏｒ　ＣＳ　ｔｏ　Ｉｍａｇｅ　Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ：０．００２
Ｍａｘｉｍｕｍ　ｆｏｒ　ＣＳ　ｔｏ　Ｉｍａｇｅ　Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ：０．０３
 
＜骨再生量算出方法＞
　ＳＫＹＳＣＡＮ社製の数値解析ソフト「ＣＴＡｎ」を用いて骨形態解析を行い、骨再生量の定量化を行った。
（結果）
　各骨形成促進材を用いて創外固定を行った大腿骨欠損部のＸ線写真を図７に、ＣＴ写真を図８にそれぞれ示す。実施例１で得られた骨形成促進材１を大腿骨欠損部に適用したマウスでは、欠損部全体で骨再生が確認された（図７および図８中のＳＰＧ－１７８）。また、全てのマウスで骨再生量が５０％以上であった（骨再生量の平均値：６６．６８％、ｐ＝０．０１）。一方、骨形成促進材Ｃ１を適用したマウスでは、骨再生は大腿骨の両端からでのみ確認された（図７および図８中のＰｕｒａＭａｔｒｉｘ）。また、骨形成促進材１を用いたものに比べて骨再生量が小さかった（骨再生量の平均値：３１．５４％、ｐ＝０．０１）。さらに、対照として生理食塩水を用いたものよりも骨再生量が小さかった（骨再生量の平均値：４４．１８％、ｐ＝０．０１）。また、骨形成促進材１を用いたマウスでの骨再生量は、骨形成促進材Ｃ１を用いたマウスよりも有意に高い値であった。
［実施例５］
　自己組織化ペプチドゲル３をＭｉｌｌｉ－Ｑ水で希釈し、１．０ｗ／ｗ％の水溶液を得た。得られた水溶液を２４ウェルプレートに滴下し、ゲルの性状を実体顕微鏡（倍率１００倍）で観察した。また、ゲルのｐＨをｐＨ試験紙で測定した。
　試験管に上記試験例２で得られたｂｏｒｎ　ｃｈｉｐ（ラット大腿骨）５ｍｇを入れた後、得られた水溶液５μＬを滴下した。次いで、ボルテックスミキサーで撹拌した後、遠心分離機により気泡を除去し、骨形成促進材５を得た。得られた骨形成促進材５の性状を実体顕微鏡（倍率１００倍）で観察した。また、得られた骨形成促進材のｐＨをｐＨ試験紙で測定した。
［実施例６］
　自己組織化ペプチドゲル４を用いた以外は実施例５と同様にして骨形成促進材６を得た。自己組織化ペプチドゲル４の組成を表１に示す。ｂｏｒｎ　ｃｈｉｐ添加前のゲルの性状およびｐＨ、ならびに、骨形成促進材６の性状およびｐＨを実施例５と同様に評価した。
（比較例２）
　自己組織化ペプチドゲルＣ１を用いた以外は実施例５と同様にして骨形成促進材Ｃ２を得た。ｂｏｒｎ　ｃｈｉｐ添加前のゲルの性状およびｐＨ、ならびに、骨形成促進材Ｃ２の性状およびｐＨを実施例５と同様に評価した。
［評価］
　実施例５～６および比較例２のｂｏｒｎ　ｃｈｉｐ添加前のゲルの写真を図９に、ｂｏｒｎ　ｃｈｉｐ添加後のゲル（骨形成促進材）の写真を図１０にそれぞれ示す。図９に示すように、ｂｏｒｎ　ｃｈｉｐ添加前のゲルはいずれも均一なゲル（ホモジニアス）であった。実施例５および６の骨形成促進材を実体顕微鏡で観察したところ、いずれも均一にｂｏｒｎ　ｃｈｉｐが分散したホモジニアスな状態であった（図１０（ａ）および（ｂ））。一方、比較例２の骨形成促進材では、ゲル状の析出物が確認され、不均一な状態（ヘテロジニアス）な状態であった（図１０（ｃ））。
　また、実施例５および６では、ｂｏｒｎ　ｃｈｉｐ添加前後のいずれにおいても、ｐＨは中性（ｐＨ６～８程度）であった。一方、比較例２ではｂｏｒｎ　ｃｈｉｐ添加前のゲルのｐＨは酸性（ｐＨ４程度）であったが、ｂｏｒｎ　ｃｈｉｐの添加後にｐＨは中性（ｐＨ６～８程度）になった。
　実施例５および６では、ｂｏｒｎ　ｃｈｉｐ添加前後でゲルのｐＨが維持されているため、得られる骨形成促進材が均一な性状を維持していた。これらの実施例では、ｂｏｒｎ　ｃｈｉｐが均一に分散しているため、骨形成促進材をスキャホールドとし、骨形成率が向上すると考えられる。一方、比較例２では、ｂｏｒｎ　ｃｈｉｐの添加によるｐＨの変化によりゲルがヘテロジニアスな状態になるため、骨形成を十分に促進できなかったと考えられる。
　本発明の骨形成促進材は、研究開発や医療の分野において好適に利用され得る。

Claims (7)

  1. 　中性ｐＨの水溶液中でβシート構造を形成し得る自己組織化ペプチド、および、骨片を含む、骨形成促進材であって、
    　該自己組織化ペプチドを構成するアミノ酸残基のｐＨ７．０における電荷の総和が０ではない、骨形成促進材。
  2. 　前記自己組織化ペプチドが、下記のアミノ酸配列からなる自己組織化ペプチドである、請求項１に記載の骨形成促進材。
    アミノ酸配列：ａ１ｂ１ｃ１ｂ２ａ２ｂ３ｄｂ４ａ３ｂ５ｃ２ｂ６ａ４
    （該アミノ酸配列中、ａ１～ａ４は、塩基性アミノ酸残基であり；ｂ１～ｂ６は、非電荷極性アミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基であり、ただし、そのうちの少なくとも５個は、疎水性アミノ酸残基であり；ｃ１およびｃ２は、酸性アミノ酸残基であり；ｄは、疎水性アミノ酸残基である。）
  3. 　血液および／または血液由来成分をさらに含む、請求項１または２に記載の骨形成促進材。
  4. 　骨形成因子をさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の骨形成促進材。
  5. 　骨形成促進材用保持器具と共に用いられる、請求項１から４のいずれかに記載の骨形成促進材。
  6. 　請求項１から５のいずれかに記載の骨形成促進材用の保持器具。
  7. 　炭素系材料、エンジニアリング樹脂、または、スーパーエンジニアリング樹脂で構成される、請求項６に記載の骨形成促進材用保持器具。
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