WO2014010721A1 - 自己組織化ペプチド誘導体の製造方法 - Google Patents

自己組織化ペプチド誘導体の製造方法 Download PDF

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WO2014010721A1
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group
leu
acid
arg
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秀典 横井
康弘 横山
恵介 松山
憲一郎 山本
欣清 安西
中村　大輔
豊浩 永野
和也 児玉
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株式会社メニコン
長瀬産業株式会社
ナガセケムテックス株式会社
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    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
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    • C07K5/0819—Tripeptides with the first amino acid being acidic

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a self-assembled peptide capable of forming a high-strength peptide gel.
  • peptide gels produced from self-assembled peptide derivatives are useful as gels used in the field of regenerative medicine and surgery (Patent Document 1).
  • Most preferred amino acid sequences and terminal modifications include the structural formulas: Ac-Arg-Leu-Asp-Leu-Arg-Leu-Ala-Leu-Arg-Leu-Asp-Leu-Arg-NH 2 , and Ac-Arg-Leu
  • a peptide derivative represented by -Asp-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Asp-Leu-Arg-NH 2 (wherein Ac represents an acetyl group, the same shall apply hereinafter) is disclosed. .
  • Examples of the use of the self-assembling peptide derivative and the gel thereof include cell culture substrates; cosmetics such as skin care products and hair care products; decubitus preparations, bone fillers, injections for cosmetic formation, and ophthalmic surgical aids. , Artificial vitreous body, artificial lens, joint lubricant, eye drops, DDS base material, hemostatic agent, etc .; wet water retention agent; desiccant; coating agent for medical devices such as contact lenses (Patent Document 1) ).
  • a chemical synthesis method As a peptide synthesis method, a chemical synthesis method, an enzyme synthesis method, and a gene recombination method are generally known.
  • Enzymatic synthesis has advantages such as being able to synthesize under mild reaction conditions and having few by-products.
  • an enzyme synthesis method for example, a method using a metallopeptidase such as thermolysin, an aminoacyl-tRNA synthetase, an alanine ligase, or a non-ribosomal peptide synthase is known.
  • a metallopeptidase such as thermolysin, an aminoacyl-tRNA synthetase, an alanine ligase, or a non-ribosomal peptide synthase is known.
  • some of the enzymes used in conventional enzyme synthesis methods are expensive, and the substrate specificity is biased, so the peptide design may not be as desired. There are challenges.
  • the genetic recombination method is a method of preparing DNA consisting of a nucleotide sequence encoding a target peptide and expressing it in a host cell or the like.
  • a vector for synthesizing a peptide by expressing a gene As a vector for synthesizing a peptide by expressing a gene, a plasmid, a baculovirus, or the like is used depending on the type of target cell.
  • a peptide to be produced may not be a desired peptide itself depending on a vector into which DNA is introduced.
  • the chemical synthesis method is a method of chemically linking amino acids, and synthesis methods by a liquid phase method and a solid phase method are generally known.
  • peptide solid phase synthesis method polystyrene polymer gel beads with a diameter of about 0.1 mm whose surface is modified with amino groups are used as the solid phase, and amino acid chains are extended one by one by dehydration reaction. is there.
  • this synthesis method after the synthesis of the target peptide sequence is completed, the peptide is cut out from the solid surface to obtain the target substance. It is also possible to synthesize ribosomal peptides that are difficult to synthesize in bacteria, introduce non-natural amino acids such as D-forms and heavy atom substitutions, and modify peptides and protein backbones.
  • the peptide solid phase synthesis method is inefficient because amino acids are linked one by one in each synthesis step, and the solid phase synthesis support is expensive and the amount of reagent used is large. Not right. Furthermore, there is a problem that it is difficult to scale up in terms of equipment.
  • Patent Document 1 The structural formulas disclosed in Patent Document 1 are: Ac-Arg-Leu-Asp-Leu-Arg-Leu-Ala-Leu-Arg-Leu-Asp-Leu-Arg-NH 2 , and Ac-Arg-Leu- Since the peptide derivative represented by Asp-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Asp-Leu-Arg-NH 2 was produced using a general solid phase synthesis method, The development of an efficient production method capable of scaling up peptide derivatives at low cost has been awaited.
  • the function and physical properties of peptide derivatives differ depending on the form of the salt, but these peptide derivatives are suitable for commercial production in addition to the function of dissolving in water to form a high-strength peptide gel. Therefore, physical properties such as ease of handling and storage stability have been demanded, and there has been a problem of searching for an embodiment of a salt that can satisfy these properties.
  • the present inventors have found that, among various salts of the self-assembled peptide derivatives, commercial production suitability, ease of handling, and storage stability. From the above, it was found that the tetrahydrochloride of the peptide derivative is the optimum form. Further, (i) paying attention to the fact that two identical amino acid sequences represented by Arg-Leu-Asp-Leu-Arg are included in the formula of the self-assembling peptide derivative, the peptides of the amino acid sequences are commonly used.
  • a salt such as a disulfate, 4 methanesulfonate or 4 trifluoroacetic acid (TFA) salt
  • TFA trifluoroacetic acid
  • a peptide derivative I represented by: Formula (II) (In the formula, the amino group of the N-terminal leucine and / or the carboxy group of the C-terminal leucine may be modified, and X is Ala or Leu.) are used as building blocks, which are sequentially coupled, and the side chain protecting group is deprotected with a strong acid, and further includes a terminal deprotection step, a modification step and / or a salt exchange step.
  • n means a coefficient of (acid valence) ⁇ n is 4 according to the valence of the acid
  • Formula (VIII) In the formula, n means a coefficient of (acid valence) ⁇ n is 4 according to the valence of the acid.
  • a peptide derivative Ia in which the N-terminal of the peptide derivative I is acetylated and a peptide derivative IIa in which the C-terminal of the peptide derivative II is protected with an ester group are coupled.
  • the peptide derivative Ic was further coupled with a peptide derivative Ic in which the C-terminus of the peptide derivative I was protected with an ester group, and the side-chain protecting group of the resulting peptide derivative IVb was deprotected.
  • the production method according to [2] including a step of converting a terminal ester group into an amide group.
  • [5] The production method according to [3] or [4], wherein the C-terminal ester of the peptide derivative IIa is a methyl ester.
  • the C-terminal ester of the peptide derivative Ic is a methyl ester.
  • the peptide derivative Va in which the N-terminus of the peptide derivative V is acetylated and the C-terminus of the peptide derivative VI is an ester group Coupling the peptide derivative VIa protected with, and then deprotecting the C-terminal ester to obtain the peptide derivative Ia; and / or the N-terminus of the peptide derivative V is protected with a protecting group other than an acetyl group.
  • n (acid) of the peptide derivative represented by the general formula (VII) and / or the general formula (VIII) is disulfuric acid.
  • Method. The “modification” in the present invention is not particularly limited. For example, N-terminal and / or C-terminal protection with a protecting group described later, N-terminal acetylation, and / or C-terminal amidation are usually used. Chemical conversions commonly used in the peptide field are listed.
  • the self-assembled peptide derivative useful in the field of regenerative medicine and the surgical field can be obtained economically, in large quantities and efficiently.
  • a preferred embodiment of the present invention uses a peptide derivative I represented by the general formula (I) and a peptide II represented by the general formula (II) as building blocks, which are sequentially coupled by coupling to form a side chain.
  • the general formula (I) is Wherein the protecting group A and the protecting group C are preferably arginine side chain protecting groups that are stable under basic conditions and can be deprotected under strongly acidic conditions, and may be the same or different from each other. May be.
  • the protective group B is preferably a protective group for the side chain of aspartic acid which is stable under basic conditions and can be deprotected under strongly acidic conditions.
  • the basic condition is usually preferably pH 8 to 11
  • the strongly acidic condition is usually preferably pH 1 or less, more preferably pH ⁇ 1 to 1.
  • the general formula (II) is (In the formula, the amino group of the N-terminal leucine and / or the carboxy group of the C-terminal leucine may be modified, and X is Ala or Leu.) Represented by General formula (VII) (In the formula, n is a coefficient according to the valence of the acid (the valence of the acid) ⁇ n becomes 4.) And General formula (VIII) is (In the formula, n is a coefficient according to the valence of the acid (the valence of the acid) ⁇ n is 4) It is represented by
  • the acid in the general formulas (VII) and (VIII) is not particularly limited and may be either an inorganic acid or an organic acid.
  • inorganic acids include hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid and the like
  • organic acids include acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, and citric acid.
  • hydrochloric acid, sulfuric acid, methanesulfonic acid, and trifluoroacetic acid are preferable from the viewpoint of ease of handling as a peptide salt, production efficiency, and the like.
  • the peptide derivative of the present invention can be synthesized by various chemical synthesis methods, but is preferably a liquid phase method from the viewpoint of ease of scale-up and economy.
  • peptide means a compound in which amino acids are covalently bonded together by peptide bonds.
  • a peptide consists of two or often more amino acids linked together.
  • the peptide sequence is conventionally represented as the N-terminus on the left side and the C-terminus on the right side of the formula.
  • amino acid means any compound comprising at least one NH 2 group and at least one carboxy group.
  • the amino acid used in the present invention may be a natural amino acid or a non-natural amino acid. Natural amino acids are preferably used because they are available at low cost and facilitate peptide synthesis. Amino acid residues are abbreviated herein as follows: arginine means Arg; leucine means Leu; aspartic acid Asp; alanine means Ala.
  • N-terminus of a peptide means the end of a peptide chain having a free amino group (—NH 2 ). This free amino group may be modified.
  • C-terminal means a terminal of a peptide chain having a free carboxy group (—COOH). This free carboxy group may be modified.
  • “coupling” means a reaction between the carboxy group of an amino acid or the C terminus of the first peptide and the amino group of another amino acid or the N terminus of the second peptide. That is, during coupling, two peptide intermediate fragments or one peptide intermediate fragment and a reactive amino acid are generally combined in an appropriate solvent, usually in the presence of an additional reagent that promotes the coupling reaction. To do.
  • the additional reagent include a carboxylic acid activator described later.
  • building block means a short-chain peptide derivative used for a coupling reaction at the time of peptide derivative synthesis.
  • the number of amino acids constituting the short-chain peptide derivative is not particularly limited, and any peptide derivative formed by combining two or more amino acids can be suitably used as a building block.
  • the building block can also be synthesized by coupling shorter peptide derivatives together.
  • the short-chain peptide derivative used at this time is also referred to as a subunit hereinafter.
  • peptide derivative I of general formula (I) and peptide derivative II of general formula (II) are coupled to obtain peptide derivative III of general formula (III).
  • the peptide derivative IV of the general formula (IV) is synthesized by coupling the peptide derivative of the general formula (III) and the peptide derivative I of the general formula (I) and deprotecting the side chain protecting group.
  • the general formula (III) is Wherein the protecting group A and the protecting group C are preferably arginine side chain protecting groups that are stable under basic conditions and can be deprotected under strongly acidic conditions, and may be the same or different from each other. May be.
  • the protective group B is preferably a protective group for the side chain of aspartic acid which is stable under basic conditions and can be deprotected under strongly acidic conditions.
  • the basic condition is usually preferably pH 8 to 11, and the strongly acidic condition is usually preferably pH 1 or less, more preferably pH ⁇ 1 to 1.
  • X is Ala or Leu.
  • the amino group of the N-terminal arginine and / or the carboxy group of the C-terminal leucine may be modified.
  • the general formula (IV) is Where X is Ala or Leu.
  • the subunit represented by the general formula (V) and the subunit represented by the general formula (VI) are coupled. Including the step of synthesizing.
  • protecting group means that an atom (for example, nitrogen or oxygen) or a functional group (for example, amino group or carboxy group) to which it is added is protected from undesired reactions during peptide synthesis and other processing. Any kind of group to do.
  • the protecting group include a protecting group for an N-terminal amino group and / or a C-terminal carboxy group, or a protecting group for a side chain functional group.
  • the protecting group for the amino group is not particularly limited.
  • benzyloxycarbonyl (Z) group p-chlorobenzyloxycarbonyl group, p-bromobenzyloxycarbonyl group, p-nitrobenzyloxycarbonyl group, p- Methoxybenzyloxycarbonyl group, benzhydryloxycarbonyl group, 2- (p-biphenylyl) isopropyloxycarbonyl group, 2- (3,5-dimethoxyphenyl) isopropyloxycarbonyl group, p-phenylazobenzyloxycarbonyl group, tri Aralkyloxycarbonyl type substituents or unsubstituted groups such as phenylphosphonoethyloxycarbonyl group or 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc); t-butyloxycarbonyl (Boc) group, t-amyl
  • amino-protecting groups a group containing a carbonyl group, a sulfenyl group or a sulfonyl group is preferred. Allyloxycarbonyl group, t-butyloxycarbonyl (Boc) group, benzyloxycarbonyl (Z) group, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group, 2-nitrobenzenesulfonyl (Nosyl) group, 2-nitrobenzenesulfenyl (Nps) groups and / or substituted derivatives are more preferred, and Boc groups and / or Fmoc groups are more preferred.
  • the introduction and deprotection of a protecting group for an amino group can be carried out by various commonly used methods.
  • the introduction of the protecting group can be carried out, for example, by a reaction with a suitable acid halide such as carbobenzoxyl chloride or a carbonic acid N-succinimidyl ester such as N- (fluorenylmethoxycarbonyloxy) succinimide.
  • a suitable acid halide such as carbobenzoxyl chloride or a carbonic acid N-succinimidyl ester such as N- (fluorenylmethoxycarbonyloxy) succinimide.
  • examples of the deprotection of the amino group include hydrogenolysis, treatment with dilute ammonium hydroxide or sodium hydroxide aqueous solution, treatment with sodium, treatment with sodium amide, treatment with hydrazine, or enzymatic hydrolysis.
  • the Boc group can be introduced and deprotected according to a conventional method.
  • it can be introduced by reacting di-tert-butyl dicarbonate (Boc 2 O) in the presence of a base such as pyridine, triethylamine, aqueous sodium hydroxide, or aqueous sodium carbonate.
  • Deprotection can be carried out with organic or inorganic acids.
  • the organic acid include trifluoroacetic acid (TFA), trifluoromethanesulfonic acid, formic acid, p-toluenesulfonic acid, and methanesulfonic acid.
  • the inorganic acid include hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrogen bromide, and the like. An acid, a sulfuric acid, etc. are mentioned.
  • Deprotection is preferably carried out with an inorganic acid, especially HCl, preferably dissolved in an organic solvent.
  • the Fmoc group can be introduced and deprotected according to a conventional method.
  • it can be introduced by reacting a reagent such as fluorenylmethyl chloroformate (Fmoc-Cl) in the presence of a base such as pyridine, triethylamine, or an aqueous sodium hydrogen carbonate solution.
  • a reagent such as fluorenylmethyl chloroformate (Fmoc-Cl)
  • a base such as pyridine, triethylamine, or an aqueous sodium hydrogen carbonate solution.
  • Deprotection can be performed by adding a DMF or THF solution of a secondary amine such as pyrrolidine, piperidine, or morpholine.
  • the carboxy group can be protected by esterification (protection with an ester group) or silylation (protection with a silyl group).
  • Esterification is not particularly limited, and examples thereof include lower alkyl esters such as methyl ester, ethyl ester, tert-butyl ester (t-Bu), benzyl ester, p-methoxybenzyl ester, p-nitrobenzyl ester aralkyl ester, and the like. It is done.
  • the silylation is not particularly limited, and examples thereof include trialkylsilyl such as trimethylsilyl, triethylsilyl, t-butyldimethylsilyl, i-propyl-dimethylsilyl and the like. In the present invention, it is preferably protected by esterification. More preferably, a methyl ester is used for protecting the C-terminal carboxy group of the peptide derivative, and a t-Bu ester is used for protecting the side chain carboxy group of aspartic acid.
  • Esterification can be carried out according to a conventional method.
  • a method of esterification using an acid catalyst or a condensing agent in alcohol can be used.
  • the t-Bu ester can be esterified using a condensing agent in tert-butyl alcohol, or can be synthesized by reacting isobutene with a sulfuric acid catalyst.
  • benzyl ester can be introduced by reacting carboxy group with benzyl bromide as cesium salt. Deprotection of the carboxy group can be generally performed by hydrolysis, saponification, hydrogenolysis, enzymatic hydrolysis, or the like.
  • the protection of the side chain of arginine used in the present invention will be described. Since the guanidino group on the side chain of arginine has strong nucleophilicity, it can be protected with an appropriate protecting group such as a sulfonyl group, nitro group, tosyl group, carbonyl group, etc. Is preferred.
  • the sulfonyl group is not particularly limited.
  • Pbf 2,2,4,6,7-pentamethyl-2,3-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl
  • p-Ts p-toluenesulfonyl
  • Mtr 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl
  • Pmc 2, 2, 5, 7, 8- A pentamethylchroman-6-sulfonyl
  • 2-methoxybenzenesulfonyl group and the like can be used.
  • N-terminal acetylation refers to modification of the N-terminus with an acetyl group
  • conversion to the N-terminal acetyl group refers to acetyl protecting the N-terminal amino group. This means that a protecting group other than a group is deprotected and then modified with an acetyl group.
  • the acetyl group can be introduced according to a conventional method.
  • triethylamine, pyridine, or hydroxylated in an organic solvent such as tetrahydroxyfuran (THF), dichloromethane (DCM), chloroform, carbon tetrachloride, ether, dioxane, benzene, toluene, N, N-dimethylformamide (DMF), etc.
  • organic solvent such as tetrahydroxyfuran (THF), dichloromethane (DCM), chloroform, carbon tetrachloride, ether, dioxane, benzene, toluene, N, N-dimethylformamide (DMF), etc.
  • an acetylating reagent such as acetyl chloride or acetic anhydride in the presence of a base such as an aqueous sodium solution.
  • peptide synthesis and / or coupling can be performed in the presence of a carboxylic acid activator.
  • Carboxylic acid activators useful in the present invention include carbodiimides, carbonyldiimidazoles, phosphonium salts, uronium salts, guanidinium salts, acyl halides, azides, symmetrical acid anhydrides, mixed acid anhydrides, or active esters. . Such carboxylic acid activators can be used before the coupling step or in situ before the introduction of peptide derivatives having free amino groups.
  • the carboxylic acid activator is not particularly limited. Specifically, for example, N, N′-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), 1- Carbodiimide reagents such as (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDCI also referred to as “WSC”); 1,1′-carbonyldiimidazole (CDI), diisopropylcarbodiimide (DIPCDI), diisopropylcarbodiimide ( DIC) or carbodiimidazole reagents such as derivatives thereof; (benzotriazol-1-yloxy) tris- (dimethylamino) phosphonium (BOP), benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphine
  • the carboxylic acid activator is preferably one or more selected from the group consisting of carbodiimide, carbonyldiimidazole, acyl halide, phosphonium salt, uronium salt and guanidinium salt, more preferably carbodiimide.
  • the coupling reaction is generally carried out in the presence of a base as an additional reagent, and in a preferred embodiment of the present invention, the coupling reaction is carried out in the presence of a base.
  • the base may be at least one selected from the group consisting of tertiary and heterocyclic aromatic amines such as N-methylmorpholine (NMM), pyridine, triethylamine (TEA), diisopropylethylamine (DIPEA) and the like. preferable. From the viewpoint of reaction efficiency, NMM and / or TEA are more preferable.
  • the above peptide coupling reaction is carried out in a polar organic solvent.
  • the polar organic solvent that can be used is not particularly limited, and examples thereof include N, N-dimethylacetamide (DMA), N, N-dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone (NMP), dimethylsulfoxide (DMSO), and ethyl acetate. (AcOEt), dichloromethane (DCM), pyridine, chloroform, acetonitrile, dimethoxyethane, dioxane, tetrahydrofuran (THF) and the like, and a mixture thereof can also be used. From the viewpoint of reaction efficiency, DMF and / or THF are more preferable.
  • the coupling reaction can be generally carried out at a temperature of from ⁇ 45 ° C. to + 45 ° C. In order to increase the efficiency of the reaction, it is preferably carried out at a temperature of ⁇ 25 ° C. to + 35 ° C., more preferably ⁇ 5 ° C. to + 25 ° C.
  • the peptide derivative Ia in which the N-terminus of the peptide derivative I represented by the general formula (I) is acetylated Peptide derivative IIa represented by (II) is coupled with peptide derivative IIa in which the C-terminus of the peptide derivative II is protected with an ester group to synthesize peptide derivative IIIa, and then deprotecting the C-terminus of peptide derivative IIIa, It is preferable that the process of obtaining the peptide derivative III represented by general formula (III) is included.
  • the ester group at the C-terminal of peptide derivative IIa is not particularly limited, and any ester group can be selected, and methyl ester is preferable from the viewpoint of ease of handling.
  • the peptide derivative IV represented by the general formula (IV) in the preparation of the peptide derivative IV represented by the general formula (IV), the peptide derivative III represented by the general formula (III) and the peptide represented by the general formula (I)
  • the peptide derivative IVa was synthesized by coupling with the peptide derivative Ib in which the C-terminal of the derivative I was amidated, and then the side chain protecting group of the peptide derivative IVa was deprotected, thereby being represented by the general formula (IV). To obtain a peptide derivative IV.
  • the peptide derivative III represented by the general formula (III) and the peptide represented by the general formula (I) By synthesizing peptide derivative IVb by coupling peptide derivative Ic in which the C-terminus of derivative I is protected with an ester group, deprotection of the side chain protecting group of peptide derivative IVb and amidation of the C-terminus And a step of obtaining a peptide derivative IV represented by the general formula (IV).
  • the ester group at the C-terminal of the peptide derivative Ic is not particularly limited, and any ester group can be selected. From the viewpoint of ease of handling and the like, methyl ester is preferable.
  • the N-terminus of the peptide derivative V represented by the general formula (V) Is coupled to a peptide derivative VIa of the peptide derivative VI represented by the general formula (VI) and the peptide derivative VIa in which the C-terminal of the peptide derivative VI is protected with an ester group.
  • a step of obtaining the peptide derivative Ia by deprotecting the terminal is included.
  • the ester group at the C-terminal of peptide derivative VIa is not particularly limited, and any ester group can be selected, and methyl ester is preferable from the viewpoint of ease of handling.
  • the peptide derivative V represented by the general formula (V) Coupling a peptide derivative Vb in which the N-terminal amino group is protected with a protecting group other than an acetyl group and a peptide derivative VIa in which the C-terminal of the peptide derivative VI represented by the general formula (VI) is protected with an ester group
  • the peptide derivative Ia is obtained by converting the resulting peptide derivative into an N-terminal acetyl group (deprotection after deprotection of the N-terminal protecting group) and deprotecting the C-terminal.
  • the protecting group other than the N-terminal acetyl group affects the protecting group A, protecting group B, protecting group C, and ester group (when the C-terminal deprotection is performed after conversion to the N-terminal acetyl group).
  • the protecting group is not particularly limited as long as it can be deprotected without losing, but is preferably Fmoc group, Boc group, benzyloxycarbonyl (Z) group, allyloxycarbonyl group, 2-nitrobenzenesulfonyl (Nosyl) group, and 2-nitrobenzenesulfuric group.
  • the ester group at the C-terminal of peptide derivative VIa is not particularly limited, and any ester group can be selected, and methyl ester is preferable from the viewpoint of ease of handling.
  • the order of converting the N-terminal acetyl group and deprotecting the C-terminal of the obtained peptide derivative is not particularly limited, and after converting the N-terminal to an acetyl group, the C-terminal is deprotected. Alternatively, after deprotecting the C-terminal, the N-terminal may be converted to an acetyl group.
  • the N-terminus of peptide derivative V represented by general formula (V) Obtained by coupling peptide derivative Vb protected with a protecting group other than acetyl group and peptide derivative VIb in which the C-terminal of peptide derivative VI represented by general formula (VI) is amidated
  • a step of obtaining the peptide derivative Ib by deprotecting the N-terminus of the peptide derivative is included.
  • the protecting group other than the N-terminal acetyl group is not particularly limited as long as it is a protecting group that can be deprotected without affecting the protecting group A, protecting group B, protecting group C, and amide group.
  • it is preferably selected from the group consisting of Fmoc group, Boc group, benzyloxycarbonyl (Z) group, allyloxycarbonyl group, 2-nitrobenzenesulfonyl (Nosyl) group and 2-nitrobenzenesulfenyl (Nps) group
  • Fmoc group Boc group
  • Z benzyloxycarbonyl
  • Z benzyloxycarbonyl
  • allyloxycarbonyl group 2-nitrobenzenesulfonyl
  • Nps 2-nitrobenzenesulfenyl
  • the peptide derivative represented by the general formula (V) A peptide derivative Vb in which the amino group at the N-terminal of V is protected with a protecting group other than an acetyl group; and a peptide derivative VIa in which the C-terminal of the peptide derivative VI represented by the general formula (VI) is protected with an ester group.
  • the step of obtaining the peptide derivative Ic by deprotecting the N-terminus of the obtained peptide derivative is included.
  • the protecting group other than the N-terminal acetyl group is not particularly limited as long as it is a protecting group that can be deprotected without affecting the protecting group A, protecting group B, protecting group C, and ester group. From the viewpoint, it is preferably selected from the group consisting of Fmoc group, Boc group, benzyloxycarbonyl (Z) group, allyloxycarbonyl group, 2-benzenesulfonyl (Nosyl) group, and 2-nitrobenzenesulfenyl (Nps) group. One or more, more preferably Fmoc group and / or Boc group.
  • the ester group at the C-terminal of peptide derivative VIa is not particularly limited, and any ester group can be selected, and methyl ester is preferable from the viewpoint of ease of handling.
  • a salt of a peptide derivative obtained after deprotection of an amino acid side chain protecting group such as a disulfate salt, a 4TFA salt, or a 4-methanesulfonate salt (a peptide represented by the general formula VII or VIII)
  • an amino acid side chain protecting group such as a disulfate salt, a 4TFA salt, or a 4-methanesulfonate salt
  • Derivatives is preferably salt-exchanged to the tetrahydrochloride salt.
  • a salt (generally, a TFA + scavenger (deprotecting protecting group scavenger) obtained by a combination of reagents used for deprotection
  • the form of the peptide derivative of formula VII or VIII is determined.
  • the weight ratio is (82 to 90) / (2 to 6) / (3 to 12) / (2 to 4). / (2-4) is desirable, and when TFA / methanesulfonic acid / triisopropylsilane is used, the weight ratio should be (87-90) / (2-6) / (5-8). Is desirable.
  • TFA / 1,2-ethanedithiol / phenol / triisopropylsilane / thioanisole 2 to 7 parts by weight of 1,2-ethanediol and 3 to 15 parts of phenol with respect to 100 parts by weight of TFA. Parts by weight, preferably 2 to 5 parts by weight of triisopropylsilane, and 2 to 5 parts by weight of thioanisole.
  • TFA / methanesulfonic acid / triisopropylsilane methane is added to 100 parts by weight of TFA. Desirably, 2 to 7 parts by weight of sulfonic acid and 5 to 10 parts by weight of triisopropylsilane are desirable.
  • the salt exchange method can also be carried out by directly adding hydrochloric acid to the peptide derivative subjected to salt exchange, or by reacting the peptide derivative subjected to salt exchange with hydrochloric acid in the presence of a solvent.
  • a solvent either a protic polar solvent or an aprotic organic solvent can be used.
  • a protic polar solvent Water, a secondary or tertiary alcohol, an acetic acid, formic acid, etc. are mentioned.
  • the aprotic polar solvent is not particularly limited, but N, N-dimethylacetamide (DMA), N, N-dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone (NMP), dimethyl sulfoxide (DMSO), dichloromethane (DCM) ), Chloroform, acetonitrile, dimethoxyethane, dioxane, tetrahydrofuran (THF), ether and the like.
  • tetrahydrochloride in the salt exchange reaction in the final step, tetrahydrochloride is effectively obtained by coexisting an organic solvent instead of simply reacting with hydrochloric acid.
  • the solvent used is preferably an aprotic polar solvent, more preferably THF (tetrahydrofuran), from the viewpoint of the efficiency of the salt exchange reaction.
  • the hydrochloric acid / organic solvent is preferably 80/20 to 60/40 by weight.
  • the concentration of hydrochloric acid used in this embodiment is not particularly limited, and can be any concentration, for example, 0.05 to 5N.
  • the reaction product can be isolated and purified by a purification method such as extraction, crystallization, freeze-drying, spray-drying, sedimentation or chromatography (eg, thin layer or column). Isolation and purification by precipitation or crystallization is preferred.
  • at least one intermediate peptide or final product is isolated and purified by precipitation or crystallization.
  • most intermediates and final products are isolated and purified by precipitation or crystallization, if desired.
  • Ac is an acetyl group
  • -OMe is a methyl ester group
  • Ot-Bu is a tertiary (tert-) butyl ester group
  • Pbf is 2, 2,4,6,7-pentamethyl-2,3-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl group
  • MsOH is methanesulfonic acid
  • TFA is trifluoroacetic acid
  • EDC is N-ethyl-N ′-(3-dimethyl Aminopropyl) carbodiimide
  • NMM is N-methylmorpholine
  • TEA is triethylamine
  • MeOH is methanol
  • t-BuOH is tert-butyl alcohol
  • IPA is isopropyl alcohol
  • MTBE is methyl-t-butyl ether
  • Tetrahydrofuran DMF is N, N-dimethylformamide
  • CPME is cyclope Chill
  • Peptide derivative IVb Synthesis of Reaction vessel 200mL, Cl - ⁇ H 2 + -Arg (Pbf) -Leu-Asp (Ot-Bu) -Leu-Arg (Pbf) -OMe ( hydrochloride of the peptide derivatives Ic) 2.50 g (1.9 mmol ), 341 mg (2.52 mmol) of HOBt were charged and suspended in THF (19.9 mL). It cooled in the ice bath, 1.42 g (6.48 mmol) of EDC * HCl was added, and 1.39 mL (12.6 mmol) of NMM was added dropwise.
  • Example 8 Peptide derivative tetrahydrochloride by salt exchange reaction Preparation.
  • a 50 mL reaction vessel was charged with 0.18 g (0.085 mmol) of Ac-Arg-Leu-Asp-Leu-Arg-Leu-Ala-Leu-Arg-Leu-Asp-Leu-Arg-NH 2 .4TFA. .3N Hydrochloric acid 12.4mL (3.72mmol) and THF (12mL) were added and shaken at room temperature. Centrifugation was performed and the supernatant was removed. After adding THF (9 mL), shaking, and allowing to stand, the supernatant was removed.
  • the separated organic layer was washed successively with 1N hydrochloric acid (88 mL) and clean water (88 mL), and then the organic layer was concentrated with an evaporator. To the residue were added MeOH (58.7 mL), clean water (29.4 mL), MTBE (58.7 mL), n-heptane (58.7 mL), and the mixture was dissolved and then separated. The lower layer was washed twice with a mixed solution (117.4 mL) of MTBE / heptane (1/1 (v / v)), and then MeOH was distilled off under reduced pressure.
  • the reaction mixture was partitioned by adding 9% brine (1500 mL) and ethyl acetate (3000 mL), then 7% multilayer water (1500 mL ⁇ twice), clean water (1500 mL), 1N hydrochloric acid (1500 mL), clean water ( The organic layer was washed in the order of 1500 mL ⁇ 3 times). After concentration under reduced pressure, CPME (1500 mL) was added to the concentrated residue, followed by displacement concentration to obtain a CPME solution of Boc-Ala-Leu-OMe. To this, 3300 mL (6.60 mol) of 2M HCl / CPME solution was added and stirred overnight at room temperature.
  • the reaction mixture was partitioned by adding 9% brine (1800 mL) and isopropyl acetate (3600 mL), then 7% multilayer water (1800 mL ⁇ twice), clean water (1800 mL), 1N hydrochloric acid (1800 mL), clean water ( The organic layer was washed in the order of 1800 mL ⁇ 3 times. The organic layer was filtered and the filtrate was concentrated. The concentrated residue was recrystallized from IPA (1000 mL), and the crystal collected by filtration was dissolved in a mixed solution of MTBE / IPA (9/1) (4800 mL), and insoluble matters were filtered off.
  • the self-assembled peptide derivative of the present invention thus produced is used according to a known technical level.
  • a self-assembled peptide derivative useful in the field of regenerative medicine and the surgical field can be produced efficiently at low cost. It is easy to scale up.

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Abstract

　再生医療分野及び外科領域において有用である、前記自己組織化ペプチド誘導体を、経済的で大量に得られる効率的な製造方法を提供することを課題とする。　（ｉ）アミノ酸配列の共通ユニットを用いた収斂的な配列構築工程、及び（ｉｉ）一旦、２硫酸塩、４メタンスルホン酸塩又は４トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩等の塩として単離した後に４塩酸塩へと塩交換する工程とを組み合わせた製造方法を提供する。

Description

自己組織化ペプチド誘導体の製造方法
　本発明は、高強度なペプチドゲルを形成し得る自己組織化ペプチドの製造方法に関する。
　再生医療分野及び外科領域において使用するゲルとして、自己組織化ペプチド誘導体から生成するペプチドゲルが有用であることが知られている（特許文献１）。最も好ましいアミノ酸配列と末端修飾型として、構造式：Ａｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２、及びＡｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２（式中、Ａｃはアセチル基を表す。以下同じ。）で表わされるペプチド誘導体が開示されている。
　前記自己組織化ペプチド誘導体、及びそのゲルの用途としては、例えば、細胞培養用基材；スキンケア用品、ヘアケア用品等の化粧品；じょくそう製剤、骨充填剤、美容形成用注入剤、眼科用手術補助剤、人工硝子体、人工水晶体、関節潤滑剤、点眼剤、ＤＤＳ基材、止血剤等の医薬品；湿潤用保水剤；乾燥剤；コンタクトレンズ等の医療機器へのコーティング剤が挙げられる（特許文献１）。
　ペプチドの合成方法としては、一般的に化学合成法、酵素合成法、及び遺伝子組み換え法が知られている。
　酵素合成法は、温和な反応条件での合成が可能であること、副生成物が少ないこと等の利点を有する。酵素合成法としては、例えば、サーモリシン等のメタロペプチダーゼ、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素、アラニンリガーゼ、又は非リボソームペプチド合成酵素を用いる方法等が知られている。一方、従来の酵素合成法で使用されている酵素の中には、コストが高いものもあり、また、基質特異性に偏りがあるため、望み通りのペプチド設計とすることができない場合もある等、課題がある。
　遺伝子組み換え法は、目的のペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを調製して宿主細胞等に発現させる方法である。遺伝子を発現させてペプチドを合成するためのベクターとしては、対象とする細胞の種類によりプラスミドやバキュロウイルス等が用いられる。一方、遺伝子組み換え法では、産生されるペプチドは、ＤＮＡの導入されたベクターによって欲しいペプチドそのものではないことがある等の課題がある。
　化学合成法は、化学的にアミノ酸を連結していく方法であり、一般的に液相法及び固相法による合成法が知られている。ペプチド固相合成法は、表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズ等を固相として用い、ここから脱水反応によって１つずつアミノ酸鎖を伸長していく方法である。この合成法では、目的とするペプチド配列の合成終了後にペプチドを固相表面から切り出し、目的物質を得る。バクテリア中で合成させることが難しいリボソームペプチドの合成や、Ｄ体や重原子置換体等の非天然アミノ酸の導入、ペプチド及びタンパク質主鎖の修飾等も可能である。
　しかしながら、前記ペプチド固相合成法では、各合成工程でアミノ酸を一つずつ繋げていくため効率が悪く、また、固相合成用担体が高価であり、試薬の使用量も多い等のことから経済的ではない。さらに、設備的にスケールアップが難しいという課題もある。
　特許文献１で開示されている、構造式：Ａｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２、及びＡｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２で表わされる前記ペプチド誘導体は、一般的な固相合成法を用いて製造されていたことから、前記ペプチド誘導体の低コスト、且つスケールアップが可能となる効率的な製造方法の開発が待たれていた。
　なお、特許文献１で開示されているＡｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２及びＡｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２は、塩基性アミノ酸残基であるＡｒｇを４つと酸性アミノ酸残基であるＡｓｐを２つその配列中に有することから、種々の塩の態様を取り得る。一般に、塩の態様によりペプチド誘導体の機能、物性が異なる事は知られているが、前記ペプチド誘導体には水に溶解して高強度のペプチドゲルを形成し得る機能に加え、商業的製造に適した取り扱いの容易さや保存安定性と言った物性が求められており、これらを充足できる塩の態様を探索する課題もあった。
国際公開第ＷＯ２０１０／１０３８８７号パンフレット
　再生医療分野及び外科領域において有用である、前記自己組織化ペプチド誘導体の、低コスト、且つスケールアップが可能となる効率的な製造方法を提供することが、本発明における最も重要な課題である。本発明の他の課題は、以下の記載から明らかになる。
　本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、前記自己組織化ペプチド誘導体の種々の塩の中から、商業的な製造適性、取り扱いの容易さ、保管上の安定性等から、前記ペプチド誘導体の４塩酸塩が最適な形態であることを見出した。更に、（ｉ）前記自己組織化ペプチド誘導体の式中、Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇで示される同一のアミノ酸配列が二つ含まれていることに着目し、前記アミノ酸配列のペプチドを共通ユニットとして用いた収斂的な配列構築工程、及び（ｉｉ）一旦、２硫酸塩、４メタンスルホン酸塩又は４トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩等の塩として単離した後に、４塩酸塩へと塩交換する工程とを組み合わせることにより、前記自己組織化ペプチド誘導体の効率的で堅牢な製造方法を見出した。さらに、本発明者等は、前記自己組織化ペプチド誘導体の２硫酸塩を形成させることにより、精製効率が向上することを見出した。本発明者等は、このような種々の新知見を得て、さらに検討を重ねて、本発明を完成させるに至った。なお、なぜ前記ペプチド誘導体の２硫酸塩が好都合であるのか、詳しいメカニズムは不明であるが、析出時における不純物との分離が有利に進行するものと推察される。
　すなわち、本発明は以下の発明に関する。
［１］一般式（IX）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 で表されるペプチド誘導体２硫酸塩、又は
一般式（X）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 で表わされる、ペプチド誘導体２硫酸塩。
［２］一般式（I）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 （式中、保護基Ａと保護基Ｃは塩基性条件下では安定で強酸性条件下において脱保護できるアルギニン側鎖の保護基であり、互いに同じであっても異なっていても良い。また式中、保護基Ｂは塩基性条件下では安定で強酸性条件下において脱保護できるアスパラギン酸側鎖の保護基である。さらに、Ｎ末端アルギニンのアミノ基及び／又はＣ末端アルギニンのカルボキシ基は修飾されていても良い。）
で表されるペプチド誘導体Iと、
一般式（II）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 （式中、Ｎ末端ロイシンのアミノ基及び／又はＣ末端ロイシンのカルボキシ基は修飾されていても良く、ＸはＡｌａ又はＬｅｕである。）
で表されるペプチド誘導体IIとを、ビルディングブロックとして用い、これらを順次カップリングし、側鎖保護基を強酸で脱保護し、さらに末端の脱保護工程、修飾工程及び／又は塩交換工程を含んでもよい各工程よりなる、
一般式（VII）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 （式中、ｎは酸の価数に応じて（酸の価数）×ｎが４となる係数を意味する。）、
又は、
一般式（VIII）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （式中、ｎは酸の価数に応じて（酸の価数）×ｎが４となる係数を意味する。）
で表されるペプチド誘導体の製造方法。
［３］前記ペプチド誘導体IのＮ末端がアセチル化されているペプチド誘導体Iａと、前記ペプチド誘導体IIのＣ末端がエステル基で保護されているペプチド誘導体IIａとをカップリングさせ、生じたペプチド誘導体IIIａのＣ末端を脱保護した後に、さらに前記ペプチド誘導体IのＣ末端がアミド基であるペプチド誘導体Iｂとカップリングさせ、得られたペプチド誘導体IVａの側鎖保護基を脱保護する工程を含む前記［２］に記載の製造方法。
［４］前記ペプチド誘導体IのＮ末端がアセチル化されているペプチド誘導体Iａと、前記ペプチド誘導体IIのＣ末端がエステル基で保護されているペプチド誘導体IIａとをカップリングさせ、生じたペプチド誘導体IIIａのＣ末端を脱保護した後に、さらに前記ペプチド誘導体IのＣ末端がエステル基で保護されているペプチド誘導体Iｃとカップリングさせ、得られたペプチド誘導体IVｂの側鎖保護基を脱保護した後にＣ末端エステル基をアミド基へと変換する工程を含む前記［２］に記載の製造方法。
［５］前記ペプチド誘導体IIａのＣ末端エステルがメチルエステルである前記［３］又は［４］に記載の製造方法。
［６］前記ペプチド誘導体IｃのＣ末端エステルがメチルエステルである、前記［４］に記載の製造方法。
［７］一般式（V）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （式中、保護基Ａは前記と同意義を示し、Ｎ末端は修飾されている。）
で表されるペプチド誘導体Vと、
一般式（VI）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 （式中、保護基Ｂ、Ｃは前記と同意義を示し、Ｃ末端は修飾されている。）
で表されるペプチド誘導体VIとをカップリングさせ、そのカップリング体のＮ末端アルギニンのアミノ基及び／又はＣ末端アルギニンのカルボキシ基の脱保護を行う工程及び／又は修飾を行う工程を含んでいてもよい、前記ペプチド誘導体Iを得る工程を含む前記［３］～［６］のいずれか１項に記載の製造方法。
［８］前記保護基Ａ及び前記保護基Ｃが、Ｐｂｆ（２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル）基である前記［３］～［７］のいずれか１項に記載の製造方法。
［９］前記保護基Ｂが、ｔ－ブチルエステルである前記［３］～［８］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１０］前記ペプチド誘導体IのＮ末端がアセチル化されているペプチド誘導体Iａの調製において、ペプチド誘導体VのＮ末端がアセチル化されているペプチド誘導体Vａと、前記ペプチド誘導体VIのＣ末端がエステル基で保護されているペプチド誘導体VIａをカップリングさせ、その後Ｃ末端エステルを脱保護してペプチド誘導体Iａを得る工程；及び／又は、前記ペプチド誘導体VのＮ末端がアセチル基以外の保護基で保護されているペプチド誘導体Vｂと、前記ペプチド誘導体VIａとのカップリング後に、Ｎ末端をアセチル基に変換、並びにＣ末端エステルを脱保護してペプチド誘導体Iａを得る工程を含む前記［７］～［９］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１１］前記ペプチドVIａのＣ末端エステル基がメチルエステルである、前記［１０］に記載の製造方法。
［１２］前記ペプチド誘導体IのＣ末端がアミド化されているペプチド誘導体Iｂの調製において、前記ペプチド誘導体VのＮ末端がアセチル基以外の保護基で保護されているペプチド誘導体Vｂと、前記ペプチド誘導体VIのＣ末端がアミド化されているペプチド誘導体VIｂとをカップリングさせ、その後Ｎ末端を脱保護してペプチド誘導体Iｂを得る工程を含む、前記［７］～［９］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１３］前記ペプチド誘導体IのＣ末端がエステル基で保護されたペプチド誘導体Iｃの調製において、前記ペプチド誘導体VのＮ末端がアセチル基以外の保護基で保護されているペプチド誘導体Vｂと、前記ペプチド誘導体VIのＣ末端がエステル基で保護されたペプチド誘導体VIａとをカップリングさせ、その後Ｎ末端を脱保護してペプチド誘導体Iｃを得る工程を含む、前記［７］～［９］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１４］一般式（VII）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 （式中、ｎは酸の価数に応じて（酸の価数）×ｎが４となる係数を意味する。但し、酸が塩酸である場合を除く。）
及び／又は、一般式（VIII）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 （式中、ｎは酸の価数に応じて（酸の価数）×ｎが４となる係数を意味する。但し、酸が塩酸である場合を除く。）
で表されるペプチド誘導体を、有機溶媒存在下塩酸で処理して、塩交換する工程を含む一般式（XI）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 又は一般式（XII）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 で表されるペプチド誘導体４塩酸塩の製造方法。
［１５］前記有機溶媒が、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）である前記［１４］に記載の製造方法。
［１６］一般式（VII）及び／又は一般式（VIII）で表されるペプチド誘導体のｎ（酸）が、２硫酸である前記［２］～［１５］のいずれか１項に記載の製造方法。
　なお、本発明における「修飾」とは、特に限定されないが、例えば、後述する保護基によるＮ末端及び／又はＣ末端の保護、Ｎ末端のアセチル化、及び／又はＣ末端のアミド化等の通常のペプチド分野で常用される化学変換が挙げられる。
　本発明により、再生医療分野及び外科領域において有用である前記自己組織化ペプチド誘導体を、経済的で大量に且つ効率的に得ることができる。
　本発明の好ましい実施態様は、一般式（I）で表されるペプチド誘導体Iと、一般式（II）で表されるペプチドIIをビルディングブロックとして用い、これらを順次カップリングによって結合させ、側鎖保護基を強酸で脱保護し、塩交換工程、末端の脱保護及び／又は修飾工程を含んでもよい各工程よりなる、一般式（VII）又は一般式（VIII）で表されるペプチド誘導体の製造方法である。
ここで、一般式（I）は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 で表され、式中、保護基Ａと保護基Ｃは、好ましくは塩基性条件下では安定で強酸性条件下において脱保護できるアルギニン側鎖の保護基であり、互いに同じであっても異なっていても良い。また式中、保護基Ｂは、好ましくは塩基性条件下では安定で強酸性条件下において脱保護できるアスパラギン酸側鎖の保護基である。前記塩基性条件としては、通常ｐＨ８～１１が好ましく、前記強酸性条件としては、通常ｐＨ１以下が好ましく、より好ましくはｐＨ－１～１である。さらに、Ｎ末端アルギニンのアミノ基及び／又はＣ末端アルギニンのカルボキシ基は修飾されていても良く、
一般式（II）は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 （式中、Ｎ末端ロイシンのアミノ基及び／又はＣ末端ロイシンのカルボキシ基は修飾されていても良く、ＸはＡｌａ又はＬｅｕである。）
で表され、
一般式（VII）は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 （式中、ｎは酸の価数に応じて（酸の価数）×ｎが４となる係数である。）
で表され、及び、
一般式（VIII）は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 （式中、ｎは酸の価数に応じて（酸の価数）×ｎが４となる係数である）
で表される。
　前記一般式（VII）及び（VIII）における酸は、特に限定されず、無機酸又は有機酸のいずれであってもよい。無機酸としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等が挙げられ、有機酸としては、例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられる。これらの中でも、ペプチドの塩としての扱いやすさ、製造効率等の観点から、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸及びトリフルオロ酢酸が好ましい。
　本発明のペプチド誘導体は種々の化学合成法でこれを合成することができるが、スケールアップの容易さ、経済性の観点から、好ましくは液相法である。
　本発明において、「ペプチド」とは、アミノ酸がペプチド結合によって共に共有結合している化合物を意味する。ペプチドは、２つ、又はしばしばそれ以上のアミノ酸が結合してなる。また、ペプチド配列は慣習的に、式の左側がＮ末端、右側がＣ末端として表される。
　本発明において、「アミノ酸」とは、少なくとも１つのＮＨ２基、及び少なくとも１つのカルボキシ基を含んでなる任意の化合物を意味する。本発明に用いるアミノ酸は、天然アミノ酸であってもよく、非天然アミノ酸であってもよい。低価格で入手可能であり、ペプチド合成が容易であることから、好ましくは天然アミノ酸を用いる。アミノ酸残基は、本明細書では、以下のとおり略号化されている：アルギニンは、Ａｒｇ；ロイシンは、Ｌｅｕ；アスパラギン酸は、Ａｓｐ；アラニンは、Ａｌａをそれぞれ意味する。
　本発明において、ペプチドの「Ｎ末端」とは、遊離アミノ基（－ＮＨ２）を有するペプチド鎖の末端を意味する。この遊離アミノ基は修飾されていても良い。また、「Ｃ末端」とは、遊離カルボキシ基（－ＣＯＯＨ）を有するペプチド鎖の端末を意味する。この遊離カルボキシ基は修飾されていても良い。
　本発明において、「カップリング」とは、アミノ酸のカルボキシ基又は第１のペプチドのＣ末端と、他のアミノ酸のアミノ基又は第２のペプチドのＮ末端との間の反応を意味する。すなわち、カップリング時、２つのペプチド中間体断片同士、又は１つのペプチド中間体断片と反応性アミノ酸とが、一般に、適切な溶媒中、通常はカップリング反応を促進する追加試薬の存在下で結合する。前記追加試薬としては、例えば後述するカルボン酸活性化剤等が挙げられる。
　本発明において、「ビルディングブロック」とは、ペプチド誘導体合成時のカップリング反応に用いる短鎖のペプチド誘導体を意味する。短鎖のペプチド誘導体を構成するアミノ酸の数は特に限定されず、２つ以上のアミノ酸が結合してなるペプチド誘導体であれば、ビルディングブロックとして好適に用いることができる。また、前記ビルディングブロックは、さらに短いペプチド誘導体同士をカップリングさせることによって合成することもでき、このとき用いられる短鎖のペプチド誘導体を、以下サブユニットともいう。
　本発明の好ましい態様において、一般式（I）のペプチド誘導体Iと、一般式（II）のペプチド誘導体IIとをカップリングさせ、一般式（III）のペプチド誘導体IIIを得る。さらに、一般式（III）のペプチド誘導体と、一般式（I）のペプチド誘導体Iとをカップリングさせ、側鎖保護基を脱保護することで一般式（IV）のペプチド誘導体IVを合成する。
　ここで、一般式（III）は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 で表され、式中、保護基Ａと保護基Ｃは、好ましくは塩基性条件下では安定で強酸性条件下において脱保護できるアルギニン側鎖の保護基であり、互いに同じであっても異なっていても良い。また式中、保護基Ｂは、好ましくは塩基性条件下では安定で強酸性条件下において脱保護できるアスパラギン酸側鎖の保護基である。前記塩基性条件としては、通常ｐＨ８～１１が好ましく、前記強酸性条件としては、通常ｐＨ１以下が好ましく、より好ましくはｐＨ－１～１である。ＸはＡｌａ又はＬｅｕである。さらに、Ｎ末端アルギニンのアミノ基及び／又はＣ末端ロイシンのカルボキシ基は修飾されていても良い。
　また、一般式（IV）は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 で表され、式中、ＸはＡｌａ又はＬｅｕである。
　本発明の別の好ましい態様では、一般式（I）のペプチド誘導体の合成において、一般式（V）で表されるサブユニット、及び一般式（VI）で表されるサブユニットをカップリングさせて合成する工程を含む。
　本発明において「保護基」とは、それが付加する原子（例えば、窒素又は酸素）又は官能基（例えば、アミノ基又はカルボキシ基）を、ペプチド合成及びその他の処理の間、望ましくない反応から保護するための、任意の種類の基である。保護基としては、Ｎ末端のアミノ基及び／又はＣ末端のカルボキシ基についての保護基、又は側鎖官能基についての保護基が挙げられる。
　アミノ基の保護基について具体的に説明する。
　本発明において、アミノ基の保護基は特に限定されず、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、ｐ－クロロベンジルオキシカルボニル基、ｐ－ブロモベンジルオキシカルボニル基、ｐ－ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｐ－メトキシベンジルオキシカルボニル基、ベンズヒドリルオキシカルボニル基、２－（ｐ－ビフェニリル）イソプロピルオキシカルボニル基、２－（３，５－ジメトキシフェニル）イソプロピルオキシカルボニル基、ｐ－フェニルアゾベンジルオキシカルボニル基、トリフェニルホスホノエチルオキシカルボニル基又は９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）等のアラルキルオキシカルボニルタイプの置換基又は非置換基；ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ｔ－アミルオキシカルボニル基、ジイソプロピルメチルオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、エチルオキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、２－メチルスルホニルエチルオキシカルボニル基又は２，２，２－トリクロロエチルオキシカルボニル基等のアルキルオキシカルボニルタイプの置換基又は非置換基；シクロペンチルオキシカルボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基又はイソボルニルオキシカルボニル基等のシクロアルキルオキシカルボニルタイプの基、及びベンゼンスルホニル基、ｐ－トルエンスルホニル基、メシチレンスルホニル基、メトキシトリメチルフェニルスルホニル基、２－ニトロベンゼンスルホニル基、２－ニトロベンゼンスルフェニル基、４－ニトロベンゼンスルホニル基又は４－ニトロベンゼンスルフェニル基等のヘテロ原子を含有する基を挙げることができる。
　前記のアミノ基の保護基の中で、カルボニル基、スルフェニル基又はスルホニル基を含有する基が好ましい。アリルオキシカルボニル基、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、２－ニトロベンゼンスルホニル（Ｎｏｓｙｌ）基、２－ニトロベンゼンスルフェニル（Ｎｐｓ）基及び／又は置換誘導体がより好ましく、Ｂｏｃ基及び／又はＦｍｏｃ基がさらに好ましい。
　アミノ基の保護基の導入及び脱保護は、一般に行われている種々の方法により実施することができる。保護基の導入は、例えば、カルボベンゾキシルクロリド等の好適な酸ハロゲン化物、又はＮ－（フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）コハク酸イミド等の炭酸Ｎ－スクシンイミジルエステルとの反応により行うことができる。他方、アミノ基の脱保護は、例えば、水素化分解、希釈水酸化アンモニウムもしくは水酸化ナトリウム水溶液による処理、ナトリウムによる処理、ナトリウムアミドによる処理、ヒドラジンによる処理、又は酵素的加水分解等が挙げられる。
　Ｂｏｃ基は、常法に従って導入及び脱保護することができる。例えば、ピリジン、トリエチルアミン、水酸化ナトリウム水溶液、又は炭酸ナトリウム水溶液等の塩基存在下、二炭酸ジ－tert-ブチル（Ｂｏｃ２Ｏ）を作用させることで導入することができる。脱保護は有機酸又は無機酸によって実施することができる。有機酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリフルオロメタンスルホン酸、ギ酸、ｐ－トルエンスルホン酸及びメタンスルホン酸等が挙げられ、無機酸としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等が挙げられる。脱保護は、好ましくは有機溶媒に溶解した無機酸、特にＨＣｌによって実施することが好ましい。
　Ｆｍｏｃ基は、常法に従って導入及び脱保護することができる。例えば、ピリジン、トリエチルアミン、又は炭酸水素ナトリウム水溶液等の塩基存在下、クロロギ酸フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ－Ｃｌ）等の試薬を作用させることで導入できる。脱保護は、ピロリジン、ピペリジン、又はモルホリン等の二級アミンのＤＭＦ又はＴＨＦ溶液を加えることで行うことができる。
　次に、カルボキシ基の保護について具体的に説明する。
　カルボキシ基の保護は、一般に、エステル化（エステル基による保護）又はシリル化（シリル基による保護）等により実施することができる。エステル化は特に限定されないが、例えばメチルエステル、エチルエステル、ｔｅｒｔ－ブチルエステル（ｔ－Ｂｕ）等の低級アルキルエステル、又はベンジルエステル、ｐ－メトキシベンジルエステル、ｐ－ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等が挙げられる。シリル化は、特に限定されないが、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ－ブチルジメチルシリル、ｉ－プロピル－ジメチルシリル等のトリアルキルシリル等が挙げられる。本発明においては、好ましくはエステル化により保護する。より好ましくは、ペプチド誘導体のＣ末端のカルボキシ基の保護には、メチルエステルを、アスパラギン酸の側鎖のカルボキシ基の保護には、ｔ－Ｂｕエステルを、それぞれ用いる。
　エステル化は、常法に従って実施することができる。例えば、アルコール中で酸触媒あるいは縮合剤を用いてエステル化する方法を用いることができる。ｔ－Ｂｕエステルは、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール中で縮合剤を用いてエステル化することもでき、イソブテンと硫酸触媒で反応させることでも合成できる。また、例えばベンジルエステルは、カルボキシ基をセシウム塩として臭化ベンジルと反応させても導入できる。
　カルボキシ基の脱保護は、一般的に、加水分解、ケン化、水素化分解又は酵素的加水分解等によって行うことができる。
　本発明で用いられるアルギニンの側鎖の保護について説明する。
　アルギニンの側鎖のグアニジノ基は求核性が強いため、電子求引基であるスルホニル基、ニトロ基、トシル基、カルボニル基等の適当な保護基により保護することができ、特にスルホニル基による保護が好ましい。スルホニル基としては、特に限定されないが、例えば、２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル（Ｐｂｆ）基、ｐ－トルエンスルホニル（ｐ－Ｔｓ）基、４－メトキシ－２，３，６－トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）基（M.Fujino et al., Chem.Pharm.Bull., 29,2825 (1981)）、２，２，５，７，８－ペンタメチルクロマン－６－スルホニル（Ｐｍｃ）基（R.Ramage at al., Tetrahedron Lett., 28, 2287 (1987)）、２－メトキシベンゼンスルホニル基等を用いることができる。本発明においては、Ｐｂｆ基を用いることが好ましい。
　本発明において、「Ｎ末端のアセチル化」とは、Ｎ末端をアセチル基で修飾することをいい、「Ｎ末端のアセチル基への変換」とは、Ｎ末端のアミノ基を保護しているアセチル基以外の保護基を脱保護後、アセチル基で修飾することをいう。アセチル基は、常法に従い、導入することができる。例えば、テトラヒドロキシフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、クロロホルム、四塩化炭素、エーテル、ジオキサン、ベンゼン、トルエン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒中、トリエチルアミン、ピリジン、又は水酸化ナトリウム水溶液等の塩基存在下で塩化アセチル又は無水酢酸等のアセチル化試薬を作用させることで導入することができる。
　本発明の好ましい態様において、ペプチドの合成及び／又はカップリングは、カルボン酸活性化剤の存在下で実施できる。
　本発明において有用なカルボン酸活性化剤としては、カルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、ホスホニウム塩、ウロニウム塩、グアニジニウム塩、ハロゲン化アシル、アジド、対称酸無水物、混合酸無水物、又は活性エステルが挙げられる。このようなカルボン酸活性化剤は、カップリングステップ前に使用するか、又は遊離アミノ基を有するペプチド誘導体の導入前にインサイチュ（in situ）で使用することができる。
　前記カルボン酸活性剤としては、特に限定されないが、具体的に例えば、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（「ＷＳＣ」とも称されるＥＤＣＩ）等のカルボジイミド試薬；１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）又はそれらの誘導体等のカルボジイミダゾール試薬；（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス－（ジメチルアミノ）ホスホニウム（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、（７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）、ブロモ－トリス－ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒｏＰ）、クロロ－トリス－ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＣｌｏＰ）等のホスホニウム塩類又はそれらの誘導体；ｏ－ベンゾトリアゾール－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－ウロニウム－ヘキサフルオロ－ホスフェート（ＨＢＴＵ）、ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、２－（７－アザ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－ビス（テトラメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＰｙＵ）等のウロニウム塩類もしくはグアニジニウム塩類又はそれらの誘導体；イソブチルクロロホルメート（ｉＢＣＦ）、塩化ピバロイル（ＰｉｖＣｌ）、ｔ－ブチルクロロホルメート（ＴＢＣＦ）、エチルクロロホルメート（ＥＣＦ）等のハロゲン化アシル類又はそれらの誘導体；ペンタフルオロフェノール（ＰｆＰ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）又はそれらの誘導体等のエステル化試薬；ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）又はその誘導体等のアジド化試薬が挙げられる。予め活性化したアミノ酸又はＮ－カルボン酸無水物形態、特にウレタン－Ｎ－カルボン酸無水物（ＵＮＣＡ）の形態もまた、カルボン酸活性化剤として用いることができる。
　カルボン酸活性化剤は、好ましくは、カルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、ハロゲン化アシル、ホスホニウム塩、ウロニウム塩及びグアニジニウム塩からなる群から選択される１種以上、より好ましくは、カルボジイミドである。
　カルボン酸活性化剤を用いる場合、カップリング反応は、一般に追加試薬として塩基の存在下で実施されることが多く、本発明の好ましい態様においても、カップリング反応は塩基の存在下で実施される。塩基は、Ｎ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）、ピリジン、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）等の第三級及び複素環式芳香族のアミンからなる群から選択される１種以上であることが好ましい。反応効率の観点から、より好ましくは、ＮＭＭ及び／又はＴＥＡである。
　本発明の好ましい態様において、上記のペプチドカップリング反応は極性有機溶媒中で実施される。使用できる極性有機溶媒は、特に限定されず、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ピリジン、クロロホルム、アセトニトリル、ジメトキシエタン、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等が挙げられ、これらの混合物を用いることもできる。反応効率の観点から、より好ましくは、ＤＭＦ及び／又はＴＨＦである。
　本発明において、カップリング反応は一般に－４５℃以上～＋４５℃以下の温度で実施することができる。反応の効率を高めるために、好ましくは－２５℃以上～＋３５℃以下、より好ましくは－５℃以上～＋２５℃以下で実施する。
　本発明の好ましい態様では、一般式（III）で表されるペプチド誘導体IIIの調製において、一般式（I）で表されるペプチド誘導体IのＮ末端がアセチル化されたペプチド誘導体Iａと、一般式（II）で表されるペプチド誘導体IIのＣ末端がエステル基で保護されたペプチド誘導体IIａとをカップリングさせてペプチド誘導体IIIａを合成した後、ペプチド誘導体IIIａのＣ末端を脱保護することにより、一般式（III）で表されるペプチド誘導体IIIを得る工程が含まれることが好ましい。ペプチド誘導体IIａのＣ末端のエステル基は特に限定されず、任意のエステル基を選択することができ、取り扱い易さ等の観点から、好ましくはメチルエステルである。
　さらに、本発明の好ましい態様においては、一般式（IV）で表されるペプチド誘導体IVの調製において、一般式（III）で表されるペプチド誘導体IIIと、一般式（I）で表されるペプチド誘導体IのＣ末端がアミド化されたペプチド誘導体Iｂとをカップリングさせてペプチド誘導体IVａを合成した後、ペプチド誘導体IVａの側鎖保護基を脱保護することにより、一般式（IV）で表されるペプチド誘導体IVを得る工程が含まれる。
　本発明の別の好ましい態様においては、一般式（IV）で表されるペプチド誘導体IVの調製において、一般式（III）で表されるペプチド誘導体IIIと、一般式（I）で表されるペプチド誘導体IのＣ末端がエステル基で保護されたペプチド誘導体Iｃとをカップリングさせてペプチド誘導体IVｂを合成した後、ペプチド誘導体IVｂの側鎖保護基の脱保護及びＣ末端のアミド化を行うことにより、一般式（IV）で表されるペプチド誘導体IVを得る工程が含まれる。また、ペプチド誘導体IｃのＣ末端のエステル基は特に限定されず、任意のエステル基を選択することができ、取り扱い易さ等の観点から、好ましくはメチルエステルである。
　本発明の好ましい態様においては、一般式（I）で表されるペプチド誘導体IのＮ末端がアセチル化されたペプチド誘導体Iａの調製において、一般式（V）で表されるペプチド誘導体VのＮ末端がアセチル化されたペプチド誘導体Vａと、一般式（VI）で表されるペプチド誘導体VIのＣ末端がエステル基で保護されたペプチド誘導体VIａとをカップリングさせた後、得られたペプチド誘導体のＣ末端を脱保護することにより、前記ペプチド誘導体Iａを得る工程が含まれる。ペプチド誘導体VIａのＣ末端のエステル基は特に限定されず、任意のエステル基を選択することができ、取り扱い易さ等の観点から、好ましくはメチルエステルである。
　本発明の別の好ましい態様においては、一般式（I）で表されるペプチド誘導体IのＮ末端がアセチル化されたペプチド誘導体Iａの調製において、一般式（V）で表されるペプチド誘導体VのＮ末端のアミノ基がアセチル基以外の保護基で保護されたペプチド誘導体Vｂと、一般式（VI）で表されるペプチド誘導体VIのＣ末端がエステル基で保護されたペプチド誘導体VIａとをカップリングさせた後、得られたペプチド誘導体のＮ末端のアセチル基への変換（Ｎ末端の保護基の脱保護後アセチル化）及びＣ末端の脱保護をすることにより、前記ペプチド誘導体Iａを得る工程が含まれる。前記Ｎ末端のアセチル基以外の保護基は、保護基Ａ、保護基Ｂ、保護基Ｃ及びエステル基（Ｃ末端の脱保護がＮ末端のアセチル基への変換後に行われる場合）に影響を与えずに脱保護できる保護基であれば特に限定されないが、好ましくはＦｍｏｃ基、Ｂｏｃ基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、アリルオキシカルボニル基、２－ニトロベンゼンスルホニル（Ｎｏｓｙｌ）基、及び２－ニトロベンゼンスルフェニル（Ｎｐｓ）基からなる群から選択される１種以上、より好ましくはＦｍｏｃ基及び／又はＢｏｃ基である。ペプチド誘導体VIａのＣ末端のエステル基は特に限定されず、任意のエステル基を選択することができ、取り扱い易さ等の観点から、好ましくはメチルエステルである。なお、カップリングさせた後、得られたペプチド誘導体のＮ末端のアセチル基へ変換及びＣ末端の脱保護させる順序は特に限定されず、Ｎ末端をアセチル基へ変換した後、Ｃ末端を脱保護しても良いし、Ｃ末端を脱保護した後、Ｎ末端をアセチル基へ変換しても良い。
　本発明の好ましい態様においては、一般式（I）で表されるペプチド誘導体IのＣ末端がアミド基であるペプチド誘導体Iｂの調製において、一般式（V）で表されるペプチド誘導体VのＮ末端がアセチル基以外の保護基で保護されたペプチド誘導体Vｂと、一般式（VI）で表されるペプチド誘導体VIのＣ末端がアミド化されたペプチド誘導体VIｂとをカップリングさせた後、得られたペプチド誘導体のＮ末端を脱保護することにより、前記ペプチド誘導体Iｂを得る工程が含まれる。前記Ｎ末端のアセチル基以外の保護基は、保護基Ａ、保護基Ｂ、保護基Ｃ及びアミド基に影響を与えずに脱保護できる保護基であれば、特に限定されないが、取り扱い易さ等の観点から、好ましくはＦｍｏｃ基、Ｂｏｃ基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、アリルオキシカルボニル基、２－ニトロベンゼンスルホニル（Ｎｏｓｙｌ）基及び２－ニトロベンゼンスルフェニル（Ｎｐｓ）基からなる群から選択される１種以上、より好ましくはＦｍｏｃ基及び／又はＢｏｃ基である。
　本発明の別の好ましい態様においては、一般式（I）で表されるペプチド誘導体IのＣ末端がエステル基で保護されたペプチド誘導体Iｃの調製において、一般式（V）で表されるペプチド誘導体VのＮ末端のアミノ基がアセチル基以外の保護基で保護されたペプチド誘導体Vｂと、一般式（VI）で表されるペプチド誘導体VIのＣ末端がエステル基で保護されたペプチド誘導体VIａとをカップリングさせた後、得られたペプチド誘導体のＮ末端を脱保護することにより、前記ペプチド誘導体Iｃを得る工程が含まれる。前記Ｎ末端のアセチル基以外の保護基は、保護基Ａ、保護基Ｂ、保護基Ｃ及びエステル基に影響を与えずに脱保護できる保護基であれば特に限定されないが、取り扱い易さ等の観点から、好ましくはＦｍｏｃ基、Ｂｏｃ基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、アリルオキシカルボニル基、２－ベンゼンスルホニル（Ｎｏｓｙｌ）基、及び２－ニトロベンゼンスルフェニル（Ｎｐｓ）基からなる群から選択される１種以上、より好ましくはＦｍｏｃ基及び／又はＢｏｃ基である。ペプチド誘導体VIａのＣ末端のエステル基は特に限定されず、任意のエステル基を選択することができ、取り扱い易さ等の観点から、好ましくはメチルエステルである。
　前記自己組織化ペプチド誘導体は、取り扱いの容易さ、保管上の安定性の高さ、及び水溶性である等の性質から、４塩酸塩が最適な形態であることが分かった。そのため、本発明の好ましい実施形態では、アミノ酸側鎖保護基の脱保護の後得られるペプチド誘導体の２硫酸塩、４ＴＦＡ塩及び４メタンスルホン酸塩等の塩（一般式VII又はVIIIで示されるペプチド誘導体。但し、酸が塩酸である場合を除く。）を、塩交換して４塩酸塩とする工程を含むことが好ましい。
　本発明の好ましい態様では、アミノ酸配列構築後の側鎖保護基の脱保護において、脱保護に用いる試薬の組み合わせ（基本はＴＦＡ＋スカベンジャー（脱保護した保護基の捕捉剤））によって得られる塩（一般式VII又はVIIIで示されるペプチド誘導体）の形態が決まる。即ち、９５ｖｏｌ％ＴＦＡ水溶液である場合は、２硫酸塩；ＴＦＡ／１，２－エタンジチオール／フェノール／トリイソプロピルシラン／チオアニソールである場合は、４ＴＦＡ塩；ＴＦＡ／メタンスルホン酸／トリイソプロピルシランである場合は、４メタンスルホン酸塩が、それぞれ得られる。これらの塩、特に２硫酸塩は溶媒に溶解し難く、一方で不純物は溶媒に溶解し易いために、高純度で反応生成物が取得される。なお、ＴＦＡ水溶液を使用する場合は、７５～９８ｖｏｌ％水溶液とすることが望ましい。またＴＦＡ／１，２－エタンジチオール／フェノール／トリイソプロピルシラン／チオアニソールを使用する場合は、重量比で（８２～９０）／（２～６）／（３～１２）／（２～４）／（２～４）とすることが望ましく、ＴＦＡ／メタンスルホン酸／トリイソプロピルシランを使用する場合は、重量比で（８７～９０）／（２～６）／（５～８）とすることが望ましい。又は、ＴＦＡ／１，２－エタンジチオール／フェノール／トリイソプロピルシラン／チオアニソールを使用する場合は、ＴＦＡ１００重量部に対して、１，２－エタンジオールを２～７重量部、フェノールを３～１５重量部、トリイソプロピルシランを２～５重量部、チオアニソールを２～５重量部とすることが好ましく、ＴＦＡ／メタンスルホン酸／トリイソプロピルシランを使用する場合は、ＴＦＡ１００重量部に対して、メタンスルホン酸を２～７重量部、トリイソプロピルシランを５～１０重量部とすることが望ましい。
　塩交換の方法は、種々の方法を採用することができる。塩交換に供するペプチド誘導体に直接塩酸を加えて行うこともでき、また、塩交換に供するペプチド誘導体に、溶媒の共存下で、塩酸を作用させて行うこともできる。前記溶媒は、プロトン性極性溶媒、非プロトン性有機溶媒のいずれも用いることができる。プロトン性極性溶媒としては、特に限定されないが、水、第２級又は第３級アルコール、酢酸、ギ酸等が挙げられる。非プロトン性極性溶媒としては、特に限定されないが、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、クロロホルム、アセトニトリル、ジメトキシエタン、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、エーテル等が挙げられる。
　本発明の好ましい態様では、最終工程の前記塩交換反応において、単に塩酸と反応させるのではなく有機溶媒を共存させることで、４塩酸塩が効果的に得られる。用いる溶媒は、塩交換反応の効率の観点から、非プロトン性極性溶媒が好ましく、より好ましくはＴＨＦ（テトラヒドロフラン）である。有機溶媒を共存させる場合、塩酸／有機溶媒は重量比で８０／２０～６０／４０とすることが望ましい。本態様で用いる塩酸の濃度は特に限定されず、任意の濃度とすることができ、例えば、０．０５～５Ｎであってもよい。
　反応生成物は、例えば、抽出、結晶化、凍結乾燥、スプレー乾燥、沈降又はクロマトグラフィー（例えば、薄層又はカラム）等の精製方法によって単離、且つ精製することができる。沈降又は結晶化による単離及び精製が好ましい。一実施形態において、少なくとも１つの中間体ペプチド又は最終生成物が、沈降又は結晶化により単離され且つ精製される。本発明による方法の特に好ましい実施形態において、ほとんどの中間体及び最終生成物が、所望の場合は、沈降又は結晶化により単離され且つ精製される。
　次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、多くの変形が本発明の技術的思想内で当分野において通常の知識を有する者により可能である。なお、実施例及び参考例で使用される原料物は、公知方法又は公知方法に準じた方法により容易に製造できる。
　なお、実施例及び参考例では、以下の略号を用いた：Ａｃは、アセチル基；－ＯＭｅは、メチルエステル基；Ｏｔ－Ｂｕは、三級（ｔｅｒｔ－）ブチルエステル基；Ｐｂｆは、２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル基；ＭｓＯＨは、メタンスルホン酸；ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸；ＥＤＣは、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；ＮＭＭは、Ｎ－メチルモルホリン；ＴＥＡは、トリエチルアミン；ＭｅＯＨは、メタノール；ｔ－ＢｕＯＨは、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール；ＩＰＡは、イソプロピルアルコール；ＭＴＢＥは、メチル－ｔ－ブチルエーテル；ＴＨＦは、テトラヒドロフラン；ＤＭＦは、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド；ＣＰＭＥは、シクロペンチルメチルエーテル；ＩＰＥは、イソプロピルエーテル；Ｆｍｏｃは、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル；Ｂｏｃはｔ－ブチルオキシカルボニル；ＨＯＢｔは、１－ヒドロキシベンゾトリアゾールを、それぞれ意味する。
［実施例１］
　一般式（IX）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 で表されるペプチド誘導体２硫酸塩の調製。
　（１）ペプチド誘導体IIIａ（Ｘ＝Ａｌａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 の合成。
　３００ｍＬの反応容器に、Ｃｌ－・Ｈ２ ＋－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（ペプチド誘導体IIａ（Ｘ＝Ａｌａ）の塩酸塩）２．６９ｇ（７．３ｍｍｏｌ）とＨＯＢｔ　１．０５ｇ（７．８ｍｍｏｌ）を仕込み、ＴＨＦ（３８．２ｍＬ）に懸濁させた。この懸濁液に、ＥＤＣ・ＨＣｌ　１．９６ｇ（１０．２ｍｍｏｌ）を加え、氷浴にて冷却しながらＮＭＭ２．５２ｇ（２４．９ｍｍｏｌ）を滴下した。Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（ペプチド誘導体Iａ）７．６５ｇ（６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５．３ｍＬ）とＴＨＦ（２２．９ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、この溶液を先の反応懸濁液に氷浴にて冷却しながら滴下した。氷浴にて冷却しながら終夜撹拌し、０．５Ｎ塩酸（３８ｍＬ）、ＴＨＦ（７４ｍＬ）、ＭＴＢＥ（４６ｍＬ）を加え、室温で分散した後、吸引ろ過、真空乾燥を行い、Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（ペプチド誘導体IIIａ）８．３９ｇを白色粉末として得た（Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（ペプチド誘導体Iａ）からの収率８８％）。
1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ ppm: 0.7-0.9（m, 24 H）; 1.19（d, J = 7.1 Hz, 3 H）; 1.33（s, 9 H）; 1.3-1.8（m, 32 H）; 1.84（s, 3 H）; 2.00（s, 6 H）; 2.42（s, 6 H）; 2.48（s, 6 H）; 2.4-2.6（m, 1 H）; 2.6-2.8（m, 1 H）; 2.96（s, 4 H）; 3.02（br. s, 4 H）; 3.60（s, 3 H）; 4.1-4.4（m, 7 H）; 4.56（q, J = 7.3 Hz, 1 H）; 6.39, 6.65（br. s×2, 6 H）; 7.68（d, J = 7.8 Hz, 1 H）; 7.78（d, J = 8.4 Hz, 1 H）; 7.9-8.1（m, 4 H）; 8.11（d, J = 7.5 Hz, 1 H）; 8.27（d, J = 8.0 Hz, 1 H）.
　（２）ペプチド誘導体IIIａのＣ末端脱保護により
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 を得る工程。
　５００ｍＬの反応容器に、Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（ペプチド誘導体IIIａ）７．９３ｇ（５ｍｍｏｌ）、上水（７１．４ｍＬ）、ｔ－ＢｕＯＨ（２３８ｍＬ）を仕込んだ。室温にて１Ｎ　水酸化ナトリウム水溶液２５ｍＬ（２５ｍｍｏｌ）を滴下した。室温で終夜撹拌した後、１Ｎ　塩酸（７９．３ｍＬ）を滴下した。ｔ－ＢｕＯＨを減圧留去し、残渣にＭＴＢＥ（１２３．１ｍＬ）、ＴＨＦ（７９．３ｍＬ）、酢酸エチル（２３．８ｍＬ）を加え、吸引ろ過を行った。シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－ＯＨ　７．４８ｇを白色粉末として得た（収率９４％）。
1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ ppm: 0.7-0.9（m, 24 H）; 1.19（d, J = 7.0 Hz, 3 H）; 1.33（s, 9 H）; 1.3-1.7（m, 32 H）; 1.84（s, 3 H）; 2.00（s, 6 H）; 2.42（s, 6 H）; 2.48（s, 6 H）; 2.4-2.6（m, 1 H）; 2.6-2.8（m, 1 H）; 2.96（s, 4 H）; 2.9-3.1（m, 4 H）; 4.1-4.4（m, 7 H）; 4.55（dd, J1 = 14.5 Hz, J2 = 7.9 Hz, 1 H）; 6.42, 6.79（br. s×2, 6 H）; 7.68（d, J = 8.1 Hz, 1 H）; 7.80（d, J = 7.8 Hz, 1 H）; 7.8-8.1（m, 5 H）; 8.27（d, J = 7.9 Hz, 1 H）.
　（３）ペプチド誘導体IVａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 の合成。
　１００ｍＬの反応容器に、Ｃｌ－・Ｈ２ ＋－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２（ペプチド誘導体Iｂの塩酸塩）１．００ｇ（０．７９１ｍｍｏｌ）、Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－ＯＨ　１．５１ｇ（０．９５６ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１０ｍＬ）、ＨＯＢｔ　０．１３ｇ（０．９６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ　０．３０ｇ（１．６ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（１８ｍＬ）を加え、氷浴にて冷却した。氷浴にて冷却、撹拌しながらＴＥＡ　０．３３ｍＬ（２．４ｍｍｏｌ）を添加した。氷浴にて冷却下、１週間撹拌した。０．５Ｎ塩酸（５ｍＬ）、上水（１５ｍＬ）、ＭＴＢＥ（１０ｍＬ）を添加し、室温下撹拌後静置、分液した。有機層を減圧濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２（ペプチド誘導体IVａ）１．２８ｇを白色粉末として得た（Ｃｌ－・Ｈ２ ＋－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２（ペプチド誘導体Iｂの塩酸塩）からの収率５８％）。
1H NMR（400 MHz、DMSO-d6）δ ppm: 0.7-0.9（m, 36 H）; 1.23（d, J = 7.2 Hz, 3 H）; 1.3-1.9（m, 76 H）; 1.88（s, 3 H）; 1.9-2.1（m, 12 H）; 2.4-2.45（m, 12 H）; 2.45-2.5（m, 12 H）; 2.5-2.6（m, 2 H）; 2.70（dd, J1 = 17.9 Hz, J2 = 6.9 Hz, 2 H）; 2.9-3.0（m, 8 H）; 3.02（br. s, 8 H）; 4.0-4.3（m, 11 H）; 4.4-4.6（m, 2 H）; 6.43, 6.72（br. s×2, 12 H）; 6.87（s, 1 H）; 7.00（br. s, 1 H）; 7.07（br. s, 1 H）; 7.65（t, J = 7.4 Hz, 1 H）; 7.7-7.9（m, 3 H）; 7.82（d, J = 6.8 Hz, 2 H）; 7.9-8.1（m, 3 H）; 8.0-8.2（m, 2 H）; 8.17（d, J = 7.2 Hz, 1 H）。MS（ESI）m/z: 1392.7（[M+2H]2+）.
　（４）ペプチド誘導体IVａ側鎖保護基の脱保護、及び
一般式（IX）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 で表されるペプチド誘導体２硫酸塩の調製。
　５００ｍＬの反応容器に、Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２（ペプチド誘導体IVａ）７．１９ｇ（２．５８ｍｍｏｌ）を仕込み、ＴＦＡ　５２ｍＬ（０．６７ｍｏｌ）、上水（２．７ｍＬ）を加えた。室温下　１．５時間撹拌し、減圧濃縮した。残渣（６１．７５ｇ）を撹拌しながら、ＭＴＢＥ（２１７ｍＬ）を加えて固体を析出させた。吸引ろ過、真空乾燥を行い、Ａｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２・２Ｈ２ＳＯ４　４．７１ｇを類白色粉末として得た（収率９８％）。
1H NMR（400 MHz、DMSO-d6）δ ppm: 0.8-0.9（m, 36 H）; 1.19（d, J = 6.8 Hz, 3 H）; 1.3-1.8（34 H）; 1.87（s, 3 H）; 2.4-2.6（m, 2 H）; 2.6-2.8（m, 2 H）; 3.09（d, J = 6.0 Hz, 8 H）; 4.1-4.4（m, 11 H）; 4.5-4.6（m, 2 H）, 6.5-8.3（m, 31 H）.
［実施例２］
一般式（VII）で表されるペプチド誘導体の４メタンスルホン酸塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 の調製。
　３０ｍＬの反応容器に、Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２（ペプチド誘導体IVａ）０．５４ｇ（０．１９ｍｍｏｌ）を仕込み、ＴＦＡ　４．０ｍＬ（５２ｍｍｏｌ）、ＭｓＯＨ　０．１０ｍＬ（１．３ｍｍｏｌ）、トリイソプロピルシラン　０．２０ｍＬ（０．９７ｍｍｏｌ）の混合物を加えた。室温下２．１時間撹拌し、減圧濃縮した。残渣（２．７６ｇ）を撹拌しながら、ＭＴＢＥ（１４ｍＬ）を加えて固体を析出させた。吸引ろ過、乾燥を行い、Ａｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２・４ＭｓＯＨ　０．４６ｇを淡黄色粉末として得た（収率は定量的）。
1H NMR（400 MHz、DMSO-d6）δ ppm: 0.8-0.9（m, 36 H）; 1.21（d, J = 6.8 Hz, 3 H）; 1.3-1.8（34 H）; 1.88（s, 3 H）; 2.38（s, 12 H）; 2.4-2.6（m, 2 H）; 2.7-2.8（m, 2 H）; 3.09（d, J = 5.6 Hz, 8 H）; 4.1-4.6（m, 13 H）; 4.5-4.6（m, 2 H）, 6.6-8.3（m, 31 H）.
［実施例３］
一般式（X）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 で表されるペプチド誘導体２硫酸塩の調製。
　（１）ペプチド誘導体IIIａ（Ｘ＝Ｌｅｕ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 の合成。
　１００ｍＬの反応容器に、Ｃｌ－・Ｈ２＋－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（ペプチド誘導体IIａ（Ｘ＝Ｌｅｕ）の塩酸塩）１．１４ｇ（２．７９ｍｍｏｌ）とＨＯＢｔ　０．４０ｇ（３．０ｍｍｏｌ）を仕込み、ＴＨＦ（５ｍＬ）に懸濁させた。この懸濁液に、ＥＤＣ・ＨＣｌ　０．７５ｇ（３．９ｍｍｏｌ）を加え、氷浴にて冷却しながらＮＭＭ　１．０４ｍＬ（９．４６ｍｍｏｌ）を滴下した。Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（ペプチド誘導体Iａ）２．９２ｇ（２．２９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（８．２ｍＬ）とＴＨＦ（１２．１ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、この溶液を先の反応懸濁液に氷浴にて冷却しながら滴下した。室温に上げながら３日間撹拌した。０．５Ｎ　塩酸（１９ｍＬ）、ＴＨＦ（１９ｍＬ）を加えて、吸引ろ過、乾燥を行い、Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（ペプチド誘導体IIIａ）　２．１０ｇを淡黄色粉末として得た（収率４６％）。
1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ ppm: 0.8-1.0（m, 30 H）; 1.37（s, 9 H）; 1.44（s, 12 H）; 1.2-1.8（m, 23 H）; 1.88（s, 3 H）; 2.04（s, 6 H）; 2.46（s, 6 H）; 2.57（s, 6 H）; 2.4-2.6（m, 1 H）; 2.71（dd, J1 = 16.2 Hz, J2 = 6.2 Hz, 1 H）; 3.00（s, 4 H）; 3.0-3.1（m, 4 H）; 3.63（s, 3 H）; 4.1-4.4（m, 7 H）; 4.59（dd, J1 = 14.4 Hz, J2 = 7.6 Hz, 1 H）; 6.42, 6.66（br. s×2, 6 H）; 7.74（d, J = 8.4 Hz, 1 H）; 7.81（d, J = 8.0 Hz, 1 H）; 7.87（d, J = 8.8 Hz, 1 H）; 7.96（d, J = 7.6 Hz, 1 H）; 7.9-8.1（m, 2 H）; 8.15（d, J = 7.6 Hz, 1 H）; 8.32（d, J = 8.0 Hz, 1 H）.
　（２）ペプチド誘導体IVａ（Ｘ＝Ｌｅｕ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 の合成。
　５０ｍＬの反応容器に、Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（ペプチド誘導体IIIａ）　１．２０ｇ（０．７３７ｍｍｏｌ）のｔ－ＢｕＯＨ（１０．３ｍＬ）溶液を仕込み、上水（８．５ｍＬ）を加えた。氷浴にて冷却しながら水酸化リチウム一水和物　４５．７６ｍｇ（１．０９０ｍｍｏｌ）の上水（２．８ｍＬ）溶液を添加し、氷浴にて冷却しながら１週間撹拌した。上清をデカンテーションで除き、上水（１４．３ｍＬ）、１Ｎ　塩酸（１．１ｍＬ）、ｔ－ＢｕＯＨ（３ｍＬ）を加えて吸引ろ過、乾燥してＡｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－ＯＨの白色粉末を得た。これを５０ｍＬ反応容器に仕込み、Ｃｌ－・Ｈ２ ＋－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２（ペプチド誘導体Iｂの塩酸塩）　０．９３ｇ（０．７３ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（８．３ｍＬ）、ＨＯＢｔ　９７．８２ｍｇ（０．７２３９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ　０．３６ｇ（１．９ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（１４．５ｍＬ）を加え氷浴にて冷却した。氷浴にて冷却、撹拌しながらＴＥＡ　０．３７ｍＬ（２．７ｍｍｏｌ）を添加した。氷浴にて冷却下、終夜撹拌した。０．５Ｎ　塩酸（３．６ｍＬ）、上水（１０ｍＬ）、ＭＴＢＥ（７．２ｍＬ）を添加し、室温下撹拌後静置、分液した。有機層を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２（ペプチド誘導体IVａ）０．６５　ｇを類白色非晶質固体として得た（Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（ペプチド誘導体IIIａ）から２工程での収率３１％）。
1H NMR（400 MHz、DMSO-d6）δ ppm: 0.7-0.9（m, 42 H）; 1.3-1.8（m, 73 H）; 1.88（s, 3 H）; 1.9-2.1（m, 12 H）; 2.4-2.5（m, 24 H）; 2.6-2.8（m, 4 H）; 2.9-3.0（m, 8 H）; 2.9-3.1（br. s, 8 H）; 4.0-4.8（m, 13 H）; 6.40, 6.63（br. s×2, 12 H）; 7.0-8.4（m, 15 H）.
　（３）ペプチド誘導体２硫酸塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 の調製。
　５０ｍＬの反応容器に、Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２（ペプチド誘導体IVａ）０．７８ｇ（０．２８ｍｍｏｌ）を仕込み、ＴＦＡ　５．７ｍＬ（７４ｍｍｏｌ）、上水（０．２９ｍＬ）を加えた。室温下　１．９時間撹拌後、ＭＴＢＥ（１５ｍＬ）を加えて固体を析出させた。室温下　１．５時間撹拌後、吸引ろ過を行い、Ａｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２・２Ｈ２ＳＯ４　０．４５ｇを類白色粉末として得た（収率８６％）。
1H NMR（400 MHz、DMSO-d6）δ ppm: 0.8-1.0（m, 42 H）; 1.3-1.8（37 H）; 1.90（s, 3 H）; 2.4-2.6（m, 2 H）; 2.7-2.9（m, 2 H）; 3.1-3.2（br. s, 8 H）; 4.1-4.4（m, 11 H）; 4.5-4.6（m, 2 H）, 6.6-8.4（m, 31 H）.
［実施例４］
　一般式（IX）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 で表されるペプチド誘導体２硫酸塩の調製。
　（１）ペプチド誘導体IVｂ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 の合成。
　２００ｍＬの反応容器に、Ｃｌ－・Ｈ２ ＋－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅ（ペプチド誘導体Iｃの塩酸塩）　２．５０ｇ（１．９ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ　３４１ｍｇ（２．５２ｍｍｏｌ）を仕込み、ＴＨＦ（１９．９ｍＬ）に懸濁させた。氷浴にて冷却し、ＥＤＣ・ＨＣｌ　１．４２ｇ（６．４８ｍｍｏｌ）を加え、ＮＭＭ　１．３９ｍＬ（１２．６ｍｍｏｌ）を滴下した。Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－ＯＨ　２．８３ｇ（１．８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１９．８ｍＬ）とＴＨＦ（１９．８ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、この溶液を先の反応懸濁液に氷浴にて冷却しながら滴下した。氷浴にて冷却しながら３日間撹拌し、０．５Ｎ　塩酸（５６．６ｍＬ）、酢酸エチル（２８．３ｍＬ）を加え分液した。この有機層を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してＡｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅ（ペプチド誘導体IVｂ）２．８１ｇを白色固体として得た（Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－ＯＨからの収率５６％）。
1H NMR（400 MHz、DMSO-d6）δ ppm: 0.81-0.94（m, 36 H）, 1.20（d, J = 6.8 Hz, 3 H）, 1.2-1.6（76 H）; 1.85（s, 3 H）; 2.00（s, 12 H）; 2.42（s, 12 H）; 2.47（s, 12 H）; 2.5-2.7（m, 4 H）; 2.95（s, 8 H）, 3.01（br, 8 H）, 3.58（s, 3 H）; 4.1-4.4（m, 11 H）; 4.52（m, 2 H）.
　（２）ペプチド誘導体IVｂ側鎖保護基の脱保護により
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 を得る工程。
　５０ｍＬの反応容器に、Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅ（ペプチド誘導体IVｂ）２．８０ｇ（１．０ｍｍｏｌ）を仕込み、水冷にてＴＦＡ４０ｍＬ（０．５２ｍｏｌ）、上水（２ｍＬ）を加えた。室温下１時間撹拌し、エバポレーターで濃縮した。濃縮残渣にＭＴＢＥ（９１ｍＬ）を加え、室温で終夜撹拌した。吸引ろ過し、真空乾燥を行ってＡｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＯＭｅ・２Ｈ２ＳＯ４　２．１６ｇを白色固体として得た（収率は定量的）。
1H NMR（400 MHz、DMSO-d6）δ ppm: 0.7-0.9（m, 36 H）, 1.20（d, J = 5.0 Hz, 3 H）; 1.3-1.7（m, 34 H）; 1.88（s, 3 H）; 2.4-2.7（m, 4 H）; 3.10（d, J = 5.6 Hz, 8 H）, 3.61（s, 3 H）; 4.2-4.3（m, 11 H）; 4.53（m, 2 H）.
　（３）Ｃ末端のアミド化により
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
 を得る工程。
　５０ｍＬの反応容器に、Ａｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＯＭｅ・２Ｈ２ＳＯ４　２．１３ｇ（１．１ｍｍｏｌ）を仕込み、水冷にて８Ｎ　アンモニア／ＭｅＯＨ溶液４２．６ｍＬ（３４１ｍｍｏｌ）を加えた。室温にて１週間撹拌し、吸引ろ過し、ケーキをＭｅＯＨ（８．５ｍＬ）で２回、ＭＴＢＥ（８．５ｍＬ）で１回洗浄し、真空乾燥を行い、Ａｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２・２Ｈ２ＳＯ４　２．０７ｇを白色固体として得た（収率は定量的）。
［実施例５］
　塩交換反応による、ペプチド誘導体４塩酸塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 の調製。
　５００ｍＬの反応容器に、Ａｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２・２Ｈ２ＳＯ４　４．７１ｇ（２．５４ｍｍｏｌ）を仕込み、０．５Ｎ　塩酸１８０ｍＬ（９０ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（３００ｍＬ）を加え室温下１５時間撹拌した後、上清（３７０ｍＬ）を除去し、ＴＨＦ（３６０ｍＬ）を加え撹拌、静置後上清を除去した。ＴＨＦ（１００ｍＬ）、ＭＴＢＥ（２６３ｍＬ）を加えて室温下０．４時間撹拌後、吸引ろ過し、真空乾燥して、Ａｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２・４ＨＣｌ　３．１５ｇを白色粉末として得た（収率６９％）。
IR（KBr）ν cm-1: 3273（s）; 2957（m）; 1626（s）; 1541（s）.
［実施例６］
　塩交換反応による、ペプチド誘導体４塩酸塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 の調製。
　５０ｍＬの反応容器に、Ａｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２・２Ｈ２ＳＯ４　０．４１ｇ（０．２２ｍｍｏｌ）を仕込み、０．５Ｎ　塩酸１５ｍＬ（７．５ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（１０ｍＬ）を加え室温下１９時間撹拌した後、上清（３２ｍＬ）を除去し、ＴＨＦ（４５ｍＬ）を加え撹拌、静置後上清を除去した。ＭＴＢＥ（８ｍＬ）を加えて室温下０．５時間撹拌後、吸引ろ過し、真空乾燥して、Ａｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２・４ＨＣｌ　０．１１ｇを白色粉末として得た（収率２８％）。
1H NMR（400 MHz、DMSO-d6）δ ppm: 0.8-1.0（m, 42 H）; 1.3-1.8（37 H）; 1.89（s, 3 H）; 2.4-2.6（m, 2 H）; 2.75（dd, J1 = 16.6 Hz、J2 = 5.8 Hz、2 H）; 3.0-3.1（m, 8 H）; 4.1-4.4（m, 11 H）; 4.4-4.6（m, 2 H）, 6.6-8.4（m, 31 H）.
［実施例７］
　塩交換反応による、ペプチド誘導体４塩酸塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 の調製。
１０ｍＬの反応容器に、Ａｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２・４ＭｓＯＨ　０．１７ｇ（０．０８３ｍｍｏｌ）を仕込み、０．５Ｎ塩酸６．９ｍＬ（３．５ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（４．６ｍＬ）を加え室温下終夜撹拌した後、上清を除去し、ＴＨＦ（１５ｍＬ）を加え撹拌、静置後上清を除去した。ＭＴＢＥ（５ｍＬ）を加えて室温下１．１時間撹拌後、吸引ろ過、真空乾燥を行って、Ａｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２・４ＨＣｌ　０．０６ｇを白色固体として得た（収率４０％）。
［実施例８］
　塩交換反応による、ペプチド誘導体４塩酸塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 の調製。
　５０ｍＬの反応容器に、Ａｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２・４ＴＦＡ　０．１８ｇ（０．０８５ｍｍｏｌ）を仕込み、０．３Ｎ　塩酸　１２．４ｍＬ（３．７２ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（１２ｍＬ）を加え室温下振とうした。遠心沈降を行い、上清を除去した。ＴＨＦ（９ｍＬ）を加え振とう、静置後上清を除去した。ＭＴＢＥ（４ｍＬ）を加えて振とう後、吸引ろ過し、真空乾燥を行って、Ａｃ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２・４ＨＣｌ０．０７ｇを白色固体として得た（収率４６％）。
［実施例９］
　ペプチド誘導体Iａの合成。
　（１）ペプチド誘導体Vｂ（Ｎ末端保護基はＦｍｏｃ基）と、ペプチド誘導体VIａのカップリングにより、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 を得る工程。
　２００ｍＬの反応容器にＣｌ－・Ｈ２ ＋－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅ（ペプチド誘導体VIａの塩酸塩）８．２６ｇ（１０．９ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ　１．４７ｇ（１０．９ｍｍｏｌ）を加え、ＴＨＦ（８４．６ｍＬ）に懸濁させた。氷浴にて冷却し、ＥＤＣ・ＨＣｌ　２．４０ｇ（１２．５ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴にて冷却しながらＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－ＯＨ（ペプチド誘導体Vｂ（Ｎ末端保護基はＦｍｏｃ基））８．５２ｇ（１０．９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（９．２ｍＬ）溶液を滴下した後、ＮＭＭ　２．７５ｇ（２７．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３３ｍＬ）溶液を滴下した。氷浴にて冷却しながら終夜撹拌した後、酢酸エチル（５９．２ｍＬ）と上水（４２．３ｍＬ）を加え、分液した。有機層を５％重曹水（５０．８ｍＬ）、１Ｎ　塩酸（５０．８ｍＬ）、上水（５０．８ｍＬ）の順で洗浄した。エバポレーターにて減圧濃縮後、真空ポンプでポンプアップし、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅ　２０．５４ｇを白色固体として得た（収率は定量的）。
1H NMR（400 MHz, CDCl3）δ ppm: 0.84（d, J = 6.2 Hz, 6 H）; 0.88（d, J = 6.2 Hz, 6 H）; 1.3-2.0（m, 35 H）; 2.07（s, 6 H）; 2.49（s, 3 H）; 2.51（s, 3 H）; 2.56（s, 3 H）; 2.59（s, 3 H）; 2.84（dd, J1 = 15.1 Hz, J2 = 4.2 Hz, 2 H）; 2.91（s, 4 H）; 3.1-3.3（br. s, 2 H）; 3.32（br. s, 2 H）; 3.71（s, 3 H）; 4.0-4.2（m, 2 H）; 4.2-4.4（m, 3 H）; 4.4-4.6（m, 1 H）; 4.5-4.7（m, 2 H）; 6.14, 6.37（br. s×2, 6 H）; 6.66（br. s, 1 H）; 7.1-7.3（m, 1 H）; 7.21（d, J = 7.8 Hz, 2 H）; 7.36（t, J = 7.4 Hz, 2 H）; 7.5-7.6（br. s, 2 H）; 7.60（t, J = 6.7 Hz, 2 H）; 7.6-7.8（br. s, 1 H）; 7.73（d, J = 7.6 Hz, 2 H）.
　（２）Ｎ末端の脱保護により
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 を得る工程。
　２００ｍＬの反応容器に、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅ　１４．６８ｇ（１０ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（９５．４ｍＬ）を仕込み、室温にてピペリジン　１．５３ｇ（１８ｍｍｏｌ、１．８ｅｑ．）を滴下した。反応溶液を室温で７時間撹拌し、ＭＴＢＥ（５８．７ｍＬ）、ＡｃＯＥｔ（１４．７ｍＬ）、０．５Ｎ　塩酸（８８ｍＬ）を加えた。分液した有機層を１Ｎ　塩酸（８８ｍＬ）、上水（８８ｍＬ）で順次洗浄した後、有機層をエバポレーターで濃縮した。残渣にＭｅＯＨ（５８．７ｍＬ）、上水（２９．４ｍＬ）、ＭＴＢＥ（５８．７ｍＬ）、ｎ－ヘプタン（５８．７ｍＬ）を加え、溶解させた後、分液した。下層をＭＴＢＥ／ヘプタン（１／１（ｖ／ｖ））の混合溶液（１１７．４ｍＬ）で２回洗浄した後、減圧でＭｅＯＨを留去した。残渣に上水（２９．４ｍＬ）、酢酸エチル（５８．７ｍＬ）、食塩（２．０ｇ）を加え分液した後、有機層を減圧濃縮し、Ｃｌ－・Ｈ２ ＋－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅ　１２．６６ｇを白色固体として得た（収率９８％）。
1H NMR（400 MHz, CDCl3）δ ppm: 0.84（m, 12 H）; 1.38（s, 9 H）; 1.45（s, 12 H）; 1.6-2.4（m, 14 H）; 2.07（s, 6 H）; 2.47（s, 6 H）; 2.54（s, 6 H）; 2.7-2.9（m, 2 H）; 2.94（s, 4 H）; 3.1-3.4（m, 4 H）; 3.68（s, 3 H）; 4.0-4.7（m, 5 H）; 6.50（br. s, 6 H）; 7.6-9.4（m, 8 H）.
　（３）Ｎ末端のアセチル化により
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 を得る工程。
　１００ｍＬの反応容器に、Ｃｌ－・Ｈ２ ＋－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅ　８．９７ｇ（７ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（６３ｍＬ）を加え、氷浴にて冷却した。氷浴にて冷却しながら、無水酢酸１．０７ｇ（１０．５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を加えた後、氷浴にて冷却しながらＴＥＡ１．７７ｇ（１７．５ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ．）を滴下した。氷浴にて冷却しながら２時間撹拌し、酢酸エチル（３６ｍＬ）、１Ｎ　塩酸（３６ｍＬ）を加えた。分液した有機層を１Ｎ　塩酸（３６ｍＬ）、５％重曹水（３６ｍＬ）で順次洗浄した後、有機層を減圧濃縮し、Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅ８．４６ｇを白色固体として得た（収率９３％）。
1H NMR（400 MHz, CDCl3）δ ppm: 0.85（d, J = 6.6 Hz, 3 H）; 0.88（d, J = 6.4 Hz, 6 H）; 0.93（d, 5.4 Hz, 3 H）; 1.42（s, 9 H）; 1.46（s, 12 H）; 1.3-2.0（m, 14 H）; 2.05（s, 3 H）; 2.09（s, 6 H）; 2.48（s, 3 H）; 2.50（s, 3 H）; 2.55（s, 3 H）; 2.57（s, 3 H）; 2.7-2.8（m, 1 H）; 2.9-3.1（m, 1 H）; 2.95（s, 4 H）; 3.1-3.3（m, 3 H）; 3.3-3.4（m, 1 H）; 3.72（s, 3 H）; 3.9-4.1（m, 1 H）; 4.4-4.6（m, 2 H）; 4.5-4.7（m, 2 H）; 6.0-6.5（m, 6 H）; 7.14（d, J = 8.7 Hz, 1 H）; 7.4-7.5（m, 1 H）; 7.5-7.7（m, 3 H）.
　（４）Ｃ末端の脱保護により、ペプチド誘導体Iａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 を得る工程。
　５００ｍＬの反応容器に、Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅ　８．１１ｇ（６．３ｍｍｏｌ）、ｔ－ＢｕＯＨ（２４３．５ｍＬ）、上水（７３．１ｍＬ）を加え、溶解させた。水浴で冷却しながら、１Ｎ　水酸化ナトリウム水溶液　９．４５ｍＬ（９．４５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を滴下した。氷浴で冷却しながら終夜撹拌し、１Ｎ　塩酸　１０．４ｍＬ（１０．４ｍｍｏｌ；１．６５ｅｑ．）を滴下した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチル（１０５．５ｍＬ）、上水（４０．６ｍＬ）を加え、分液した。有機層を０．５％ＫＨＣＯ３水溶液（８１．２ｍＬ）、０．２５％ＫＨＣＯ３水溶液（８１．２ｍＬ）、０．２Ｎ　塩酸（８１．２ｍＬ）で順次洗浄した後、有機層を減圧濃縮し、Ａｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（ペプチド誘導体Iａ）７．６８ｇを白色固体として得た（収率９５．６％）。
1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ ppm: 0.82（d, J = 6.4 Hz, 6 H）; 0.85（d, J = 6.6 Hz, 6 H）; 1.33（s, 9 H）; 1.41（s, 12 H）; 1.3-1.5（m, 8 H）; 1.5-1.7（m, 5 H）; 1.6-1.9（m, 1 H）; 1.84（s, 3 H）; 2.00（s, 6 H）; 2.42（s, 6 H）; 2.48（s, 6 H）; 2.4-2.6（m, 1 H）; 2.68（dd, J1 = 15.8 Hz, J2 = 6.2 Hz, 1 H）; 2.96（m, 4 H）; 2.9-3.1（m, 4 H）; 4.09（dd, J1 = 13.1 Hz, J2 = 7.6 Hz, 1 H）; 4.1-4.4（m, 3 H）; 4.55（dd, J1 = 14.6 Hz, J2 = 7.7 Hz, 1 H）; 6.39, 6.5-6.9（br. s×2, 6 H）; 7.63（d, J = 8.5 Hz, 1 H）; 7.91（d, J = 8.0 Hz, 1 H）; 7.98（d, J = 7.7 Hz, 1 H）; 8.06（d, J = 7.4 Hz, 1 H）; 8.26（m, 1 H）.
［実施例１０］
　ペプチド誘導体Iｂの合成。
　（１）ペプチド誘導体Vｂ（Ｎ末端保護基はＦｍｏｃ）と、ペプチド誘導体VIｂとをカップリングさせ、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 を得る工程。
　１００ｍＬの反応容器を用い、Ｃｌ－・Ｈ２ ＋－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２（ペプチド誘導体VIｂの塩酸塩）　１．００ｇ（１．４１ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（２．１ｍＬ）、ＴＨＦ（１．５ｍＬ）、ＨＯＢｔ　０．２０ｇ（１．５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ　０．３２ｇ（１．７ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ　０．２４ｍＬ（１．７ｍｍｏｌ）を仕込み氷浴で冷却した。氷浴にて冷却しながら、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－ＯＨ（ペプチド誘導体Vｂ（Ｎ末端保護基はＦｍｏｃ基））１．０４ｇ（１．３２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３ｍＬ）溶液を添加した。氷浴にて冷却しながら終夜撹拌した後、ＭＴＢＥ（１５ｍＬ）、上水（１５ｍＬ）を加えると固体が析出した。吸引ろ過を行い、乾燥して、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２　１．７７ｇを類白色粉末として得た（Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－ＯＨ（ペプチド誘導体Vｂ（Ｎ末端保護基はＦｍｏｃ基））からの収率８６％）。
1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ ppm: 0.7-0.9（m, 12 H）; 1.32（s, 9 H）; 1.3-1.8（m, 26 H）; 2.00（s, 3 H）; 2.00（s, 3 H）; 2.42（s, 6 H）; 2.5（s, 6 H）; 2.5-2.6（m, 1 H）; 2.6-2.7（m, 1 H）; 2.94（s, 2 H）; 2.95（s, 2 H）; 3.0-3.1（m, 4 H）; 4.00（m, 1 H）; 4.13（dd, J1 = 13.6 Hz, J2 = 8.0 Hz, 1 H）; 4.2-4.4（m, 5 H）; 4.4-4.6（m, 1 H）; 4.58（dd, J1 = 14.6 Hz, J2 = 7.8 Hz, 1 H） 6.42, 6.68（br. s×2, 6 H）; 6.99（s, 1 H）; 7.16（s, 3 H）; 7.31（t, J = 7.5 Hz, 2 H）; 7.41（t, J = 7.5 Hz, 2 H）; 7.46（d, J = 8.4 Hz, 1 H）; 7.7-7.8（m, 4 H）; 7.8-7.9（m, 1 H）; 7.88（d, J = 7.6 Hz, 2 H）; 8.31（d, J = 7.6 Hz, 1 H）.
　（２）Ｎ末端の脱保護により、ペプチド誘導体Iｂの塩酸塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 を得る工程。
　３０ｍＬの反応容器を用い、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２　０．９７ｇ（０．６７ｍｍｏｌ）にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加えて溶解した。ピペリジン　０．１０ｍＬ（１．０ｍｍｏｌ）を加え、室温下２．１時間撹拌した。ＭＴＢＥ（３ｍＬ）、酢酸エチル（７ｍＬ）、０．２４Ｎ　塩酸（８．５ｍＬ）を加えると固体が析出した。室温下終夜撹拌後、吸引ろ過し、乾燥してＣｌ－・Ｈ２ ＋－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２（ペプチド誘導体Iｂの塩酸塩）０．７７ｇを淡黄色粉末として得た（収率９１．２％）。
1H NMR（400 MHz, CDCl3）δ ppm: 0.82（d, J = 6.4 Hz, 3 H）; 0.8-0.9（m, 9 H）; 1.33（s, 9 H）; 1.3-1.6（m, 10 H）, 1.41（s, 12 H）; 1.6-1.8（m, 4 H）; 2.01（s, 3 H）; 2.01（s, 3 H）; 2.42（s, 3 H）; 2.43（s, 3 H）; 2.48（s, 6 H）; 2.4-2.6（m, 1 H）; 2.6-2.8（m, 1 H）; 2.96（s, 4 H）; 3.0-3.1（m, 4 H）; 3.79（br. s, 1 H）; 4.14（dd, J1 = 13.6 Hz, J2 = 8.0 Hz, 1 H）; 4.26（dd, J1 = 14.8 Hz, J2 = 7.6 Hz, 1 H）; 4.3-4.5（m, 1 H）; 4.61（dd, J1 = 14.4 Hz, J2 = 8.0 Hz, 1 H）; 6.51, 6.86（br. s×2, 6 H）; 7.00（s, 1 H）; 7.21（s, 1 H）7.3-8.2（m, 5 H）; 8.47（d, J = 8.0 Hz, 1 H）; 8.55（d, J = 8.0 Hz, 1 H）.
［参考例１］
　ペプチド誘導体Vｂ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
 の合成。
（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 の調製。
　２００ｍＬの反応容器を用い、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ・０．５ＩＰＥ　５．６０ｇ（８．０ｍｍｏｌ）、Ｃｌ－・Ｈ２ ＋－Ｌｅｕ－Ｏｔ－Ｂｕ　１．８８ｇ（８．４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ　１．０８ｇ（８．０ｍｍｏｌ）を加え、ＴＨＦ（３９．２ｍＬ）に懸濁させた。氷浴にて冷却した後、ＥＤＣ・ＨＣｌ　１．６９ｇ（８．８ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴にて冷却しながら３０分撹拌した後、ＮＭＭ　１．７８ｇ（１７．６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５．６ｍＬ）溶液を滴下した。氷浴にて冷却しながら４時間撹拌した後、酢酸エチル（１４ｍＬ）と９％食塩水（２８ｍＬ）を加え、分液した。有機層を飽和重曹水（２８ｍＬ）、５％重曹水（２８ｍＬ）、０．５Ｎ　塩酸（２８ｍＬ）、０．１Ｎ　塩酸（２８ｍＬ）、上水（２８ｍＬ）の順で洗浄した。エバポレーターにて減圧濃縮後、真空ポンプでポンプアップし、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ｏｔ－Ｂｕ　６．６６ｇを白色固体として得た（収率は定量的）。
1H NMR（400 MHz、CDCl3）δ ppm: 0.85（d, J = 6.8 Hz, 6 H）; 1.42（m, 15 H）; 1.54-1.97（m, 7 H）; 2.07（s, 3 H）; 2.51（s, 3 H）; 2.59（s, 3 H） ; 2.91（s, 2 H）; 3.31（br. s, 2 H）; 4.14（m, 1 H）; 4.31-4.38（m, 4 H）; 5.95-6.30（br. s, 3 H）; 7.23（m, 2 H）; 7.33（t, J = 7.5 Hz, 2 H）; 7.56（d, J = 7.4 Hz, 2 H）; 7.72（d, J = 7.6 Hz, 2 H）.
（２）Ｃ末端を脱保護し、ペプチド誘導体Ｖｂ（Ｎ末端保護基はＦｍｏｃ基）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 を得る工程。
　１００ｍＬの反応容器を用い、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－Ｏｔ－Ｂｕ　５．０１ｇ（６．０ｍｍｏｌ）を仕込み、上水（３ｍＬ）、濃塩酸（３ｍＬ）を加え、８０℃の油浴上で加熱、撹拌した。酢酸エチル（２０ｍＬ）、上水（２０ｍＬ）を加え分液した後、有機層を減圧濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｌｅｕ－ＯＨ（ペプチド誘導体Vｂ（Ｎ末端保護基はＦｍｏｃ基））４．７９ｇを白色固体として得た（収率は定量的）。
1H NMR (400 MHz、CDCl3) δ ppm: 0.87（d, J = 4.9 Hz, 6 H）; 1.42（s, 6 H）; 1.54-1.97（m, 7 H）; 2.05（s, 3 H）; 2.47（s, 3 H）; 2.55（s, 3 H）; 2.90（s, 2 H）; 3.14-3.31（br. s, 2 H）; 4.1-4.5（m, 5 H）; 6.0 -6.6（br. s, 3 H）; 7.22（m, 2 H）; 7.34（t, J = 7.4 Hz, 2 H）; 7.54（d, J = 7.4 Hz, 2 H）; 7.71（d, J = 7.6 Hz, 2 H).
［参考例２］
　ペプチド誘導体VIａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
 の合成。
（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
 の調製。
　３０ｍＬの反応容器を用い、Ｂｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ　２．１１ｇ（４．０ｍｍｏｌ）に５．２％　ＨＣｌ／ＭｅＯＨ溶液　６．７３ｇ（９．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応溶液を室温で終夜撹拌した後、内温３９～４２℃で５時間撹拌した。反応溶液をエバポレーターで濃縮、真空ポンプでポンプアップした。濃縮乾固物にＭＴＢＥ（１０ｍＬ）、上水（１０ｍＬ）を加えて溶解し、分液した。水層をＭＴＢＥ（１０ｍＬ）で洗浄した後、炭酸ナトリウム　５９４ｍｇ（５．６ｍｍｏｌ、１．４ｅｑ．）、酢酸エチル（４０ｍＬ）を加え、分液した。有機層を１０％炭酸カリウム水溶液（１０ｍＬ）で３回洗浄した。有機層を濃縮し、析出した白色固体を綿栓ろ過にてろ別し、ろ液を濃縮した。Ｈ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅ　１．５３ｇを微黄色粘ちょう油状物として得た（収率７１％）。
1H NMR（400 MHz、CDCl3）δ ppm: 1.46（s, 6 H）; 1.62-1.85（m, 4 H）; 2.09（s. 3 H）; 2.53（s, 3 H）; 2.58（s, 3 H）; 2.95（s, 2 H）; 3.19（m, 2 H）; 3.50（m, 1 H）; 3.83（s, 3 H）; 6.0-6.15（m, 3 H）.
（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
 の調製。
　１００ｍＬの反応容器を用い、ＴＨＦ（４ｍＬ）中、Ｈ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅ　０．９６ｇ（２．１７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ　０．３０ｇ（２．２ｍｍｏｌ、１．０２ｅｑ．）、ＥＤＣ・ＨＣｌ　０．４９ｇ（２．６ｍｍｏｌ、１．１８ｅｑ．）、ＴＥＡ　０．２６ｇ（２．６ｍｍｏｌ、１．２７ｅｑ．）を懸濁した。氷浴で冷却しながら、Ｂｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ・Ｈ２Ｏ　０．５３ｇ（２．１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４ｍＬ）溶液を添加した。氷浴で冷却しながら終夜撹拌した後、酢酸エチル（５ｍＬ）を加え内温２℃で析出結晶をろ別した。ろ液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、Ｂｏｃ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅ　１．４３ｇを白色固体として得た（収率は定量的）。
1H NMR (400 MHz、CDCl3) δ ppm: 0.93（d, J = 6.4 Hz, 3 H）; 0.95（d, J = 6.4 Hz, 3 H）; 1.42（s, 9 H）; 1.46（s, 6 H）; 1.4-1.8（m, 6 H）; 1.8-2.0（m, 1 H）; 2.09（s, 3 H）; 2.53（s, 3 H）; 2.59（s, 3 H）; 2.95（s, 2 H）; 3.1-3.3（br. s, 2 H）; 3.74（s, 3 H）; 4.0-4.2（m, 1 H）; 4.55（dt, J1 = 8.3 Hz, J2 = 4.5 Hz, 1 H）; 5.13（d, J = 6.8 Hz, 1 H）; 6.06, 6.15（br. s×2, 3 H）; 7.03（d. J = 8.0 Hz, 1 H）.
（３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
 の調製。
　３０ｍＬの反応容器を用い、Ｂｏｃ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅ　１．２０ｇ（１．７６ｍｍｏｌ）に５．８８％　ＨＣｌ／ＭｅＯＨ　２．１９ｇ（３．５３ｍｍｏｌ）を加え、内温４１～４３℃で終夜撹拌後、室温下２日間撹拌した。減圧濃縮し、残渣にＴＨＦ（１ｍＬ）を加えて置換濃縮した後、ＴＨＦ（３ｍＬ）を加えて１００ｍＬの反応容器へ移送した。Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ　０．７４ｇ（１．８ｍｍｏｌ、１．０３ｅｑ．）、ＨＯＢｔ　０．２４ｇ（１．８ｍｍｏｌ、１．０２ｅｑ．）、ＥＤＣ・ＨＣｌ　０．３９ｇ（２．０ｍｍｏｌ、１．１６ｅｑ．）を順に加え、懸濁した。氷浴にて冷却しながらＮＭＭ　０．４１ｍＬ（３．７ｍｍｏｌ、２．１３ｅｑ．）を添加した。氷浴にて冷却しながら終夜撹拌した後、酢酸エチル（６ｍＬ）を加え析出結晶をろ別した。ろ液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅ　１．２８ｇを、白色固体として得た（Ｂｏｃ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅから２工程での収率９９．９％）。
1H NMR（400 MHz, CDCl3）δ ppm: 0.88（d, J = 5.6 Hz, 3 H）; 0.93（d, J = 6.0 Hz, 3 H）; 1.44（s, 9 H）; 1.44（s, 6 H）; 1.4-1.9（m, 7 H）; 2.08（s, 3 H）; 2.52（s, 3 H）; 2.58（s, 3 H）; 2.66（dd, J1 = 17.1 Hz, J2 = 4.9 Hz, 1 H）; 2.88（dd, J1 = 17.1 Hz, J2 = 3.6 Hz, 1 H）; 2.93（s, 2 H）; 3.19（br. s, 2 H）; 3.70（s, 3 H）; 4.21（t, J = 6.6 Hz, 1 H）; 4.43（d, J = 6.4 Hz, 1 H）;4.4-4.5（br. s, 1 H）; 4.57（dt, J1 = 8.5 Hz, J2 = 4.1 Hz, 1 H）; 5.8, 6.10（br. s×2, 3 H）; 6.0-6.2（br. s, 1 H）; 6.8-6.9（m, 1 H）; 7.31（t, J = 7.6 Hz, 1 H）; 7.41（t, J = 7.6 Hz, 1 H）; 7.57（d, J = 7.6 Hz, 1 H）; 7.77（d, J = 7.6 Hz, 1 H）.
（４）Ｎ末端を脱保護し、ペプチド誘導体VIａの塩酸塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
 を調製する工程。
　５０ｍＬの反応容器を用い、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅ　０．７４ｇ（１．０９ｍｍｏｌ）にＴＨＦ（１．６ｍＬ）を加え溶解した。ピペリジン　０．２１ｍＬ（２．１ｍｍｏｌ、１．９４ｅｑ．）を加え、室温下終夜撹拌した。酢酸エチル（２ｍＬ）と上水（４ｍＬ）を加えると白色固体が析出した。析出結晶をろ別し、ろ液に酢酸エチル（３．５ｍＬ）を加え、撹拌後静置、分液した。淡黄色濁った有機層を０．５Ｎ　塩酸（１ｍＬ）、１Ｎ　塩酸（１ｍＬ）、１Ｎ　塩酸（２ｍＬ×２）の順で洗浄した。減圧濃縮し、Ｃｌ－・Ｈ２ ＋－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅ（ペプチド誘導体VIａの塩酸塩）０．７１ｇを淡黄色水アメ状残さとして得た（収率８６％）。
1H NMR（400 MHz, CDCl3）δ ppm: 0.90（d, J = 5.6 Hz, 3 H）; 0.94（d, J = 6.0 Hz, 3 H）; 1.45（s, 9 H）; 1.47（s, 6 H）; 1.6-1.9（m, 7 H）; 2.10（s, 3 H）; 2.49（s, 3 H）; 2.55（s, 3 H）; 2.97（s, 2 H）; 3.06（dd, J1 = 19.0 Hz, J2 = 6.8 Hz, 1 H）; 3.12（dd, J1 = 19.0 Hz, J2 = 6.4 Hz, 1 H）; 3.27（br. s, 2 H）; 3.70（s, 3 H）; 4.3-4.5（m, 2 H）；4.5-4.6（m, 1 H）; 6.68（br. s, 3 H）; 8.5-8.9（br. s, 1 H）; 8.17（br. s, 1 H）; 8.58（br. s, 3 H）.
［参考例３］
　ペプチド誘導体VIｂ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
 の合成。
（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
 の調製。
　１００ｍＬの反応容器を用い、Ｂｏｃ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅ　６．５４ｇ（１０ｍｍｏｌ）に８Ｎ　ＮＨ３／ＭｅＯＨ溶液　３０ｍＬ（２４０ｍｍｏｌ）を添加した。反応溶液を室温下２日間撹拌した後、減圧濃縮した。残渣にＣＰＭＥ（１４．５ｍＬ）を加えて置換濃縮を行い、無色液状のＢｏｃ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２のＣＰＭＥ溶液を得た。１００ｍＬの反応容器を用い、４Ｍ　ＨＣｌ／ＣＰＭＥ溶液　１０．４ｍＬ（４１．６ｍｍｏｌ）を仕込み、氷浴にて冷却しながら前記で合成したＢｏｃ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２のＣＰＭＥ溶液を滴下した。室温下終夜撹拌し、吸引ろ過を行い、ＣＰＭＥ（１２．１ｍＬ×２）で洗い込んだ。４０℃で温風乾燥し、Ｃｌ－・Ｈ２ ＋－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２　５．６８ｇを白色粉末として得た（Ｂｏｃ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＭｅから２工程での収率は定量的）。
1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ ppm: 0.8-1.0（m, 6 H）; 1.41（s, 6 H）; 1.3-1.6（m, 5 H）; 1.6-1.8（m, 2 H）; 2.01（s, 3 H）; 2.43（s, 3 H）; 2.49（s, 3 H）; 3.0-3.1（br. s, 2 H）; 3.8-3.9（br. s, 1 H）; 4.2-4.3（m, 1 H）; 6.08, 6.54（br. s×2, 3 H）; 7.06（s, 1 H）; 7.52（s, 1 H）; 8.2-8.4（m, 3 H）; 8.6-8.7（m, 1 H）.
（２）ペプチド誘導体VIｂ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
 の調製。
　１００ｍＬの反応容器を用い、上記で合成したＣｌ－・Ｈ２ ＋－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２　１．０２ｇ（１．７７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ　０．２５ｇ（１．９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣ　ｌ０．４０ｇ（２．１ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－ＯＨ　０．６３ｇ（１．５ｍｍｏｌ）を仕込んだ。撹拌しながらＴＨＦ（８ｍＬ）を加え、氷浴にて冷却しながらＮＭＭ　０．４５ｍＬ（４．１ｍｍｏｌ）を添加した。氷浴にて冷却しながら５．８時間撹拌した後、酢酸エチル（８ｍＬ）、上水（８ｍＬ）を加え室温下撹拌後静置、分液した。有機層を飽和重層水（４ｍＬ）、上水（４ｍＬ）、１Ｎ　塩酸（４ｍＬ×２回）、上水（４ｍＬ×２）の順で洗浄した。得られたＦｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２の酢酸エチル溶液にピペリジン　０．３６ｍＬ（３．６ｍｍｏｌ、２．０５ｅｑ．）を加え、室温下終夜撹拌した。上水（４ｍＬ）を加え撹拌、静置、分液を行い、有機層を上水洗浄（４ｍＬ×２回）した。減圧濃縮し、残渣にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え再度減圧濃縮を行った。析出した固体をろ別し、ろ液をポンプアップしてＨ－Ａｓｐ（Ｏｔ－Ｂｕ）－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２（ペプチド誘導体VIｂ）０．９８ｇを得た（Ｃｌ－・Ｈ２ ＋－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＮＨ２から２工程での収率７８％）。
1H NMR（400 MHz, CDCl3）δ ppm: 0.91（d, J = 6.0 Hz, 3 H）; 0.96（d, J = 6.0 Hz, 3 H）; 1.43（s, 9 H）; 1.46（s, 6 H）; 1.5-1.9（m, 6 H）; 1.9-2.0（m, 1 H）; 2.09（s, 3 H）; 2.51（s, 3 H）; 2.58（s, 3 H）; 2.5-2.7（m, 1 H）; 2.7-2.8（m, 1 H）; 2.9-3.0（s, 2 H）; 3.2-3.3（m, 2 H）; 3.68（dd, J1 = 7.2 Hz, J2 = 4.8 Hz, 2H）; 3.7-3.8（m, 1 H）; 4.2-4.4（m, 1 H）; 4.48（dt, J1 = 8.6 Hz, J2 = 4.7 Hz, 1 H）; 5.66（s, 1 H）; 6.18, 6.28（br. s×2, 3 H）; 6.94（s, 1 H）; 7.45（d, J = 8.0 Hz, 1 H）; 7.90（d, J = 6.8 Hz, 1 H）.
［参考例４］
　ペプチド誘導体IIａ（Ｘ＝Ａｌａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
 の合成。
（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
 の調製。
　１０Ｌの反応容器にＣｌ－・Ｈ２ ＋－Ｌｅｕ－ＯＭｅ　３００ｇ（１．６５ｍｏｌ）、Ｂｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ　３２７ｇ（１．７３ｍｏｌ）、ＨＯＢｔ　２６８ｇ（１．９８ｍｏｌ）、ＴＨＦ（３６００ｍＬ）を仕込んだ後、内温－５～０℃でＴＥＡ　５５０ｍＬ（３．９６ｍｏｌ）を滴下した。この溶液にＥＤＣ・ＨＣｌ　３８０ｇ（１．９８ｍｏｌ）を加えた後、氷浴で冷却しながら終夜撹拌した。反応液に９％食塩水（１５００ｍＬ）、酢酸エチル（３０００ｍＬ）を加えて分液した後、７％重層水（１５００ｍＬ×２回）、上水（１５００ｍＬ）、１Ｎ　塩酸（１５００ｍＬ）、上水（１５００ｍＬ×３回）の順で有機層を洗浄した。減圧濃縮した後、濃縮残渣にＣＰＭＥ（１５００ｍＬ）を加えて置換濃縮し、Ｂｏｃ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－ＯＭｅのＣＰＭＥ溶液を得た。これに２Ｍ　ＨＣｌ／ＣＰＭＥ溶液３３００ｍＬ（６．６０ｍｏｌ）を加え、室温で終夜撹拌した。減圧濃縮し、Ｃｌ－・Ｈ２ ＋－Ａｌａ－Ｌｅｕ－ＯＭｅを得た。これに、ＴＨＦ（１８００ｍＬ）を加えた。外温４０℃に加熱し、Ｂｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ　３６４ｇ（１．４６ｍｏｌ）、ＨＯＢｔ　２３０ｇ（１．７０ｍｏｌ）を加えた。内温－５～０℃でＥＤＣ・ＨＣｌ　３２６ｇ（１．７０ｍｏｌ）を加え、ＴＥＡ　４７０ｍＬ（３．４１ｍｏｌ）を滴下した。この反応液を氷浴で冷却しながら終夜撹拌した。反応液に９％食塩水（１８００ｍＬ）、酢酸イソプロピル（３６００ｍＬ）を加えて分液した後、７％重層水（１８００ｍＬ×２回）、上水（１８００ｍＬ）、１Ｎ　塩酸（１８００ｍＬ）、上水（１８００ｍＬ×３回）の順で有機層を洗浄した。有機層をろ過し、ろ液を濃縮した。濃縮残渣をＩＰＡ（１０００ｍＬ）から再結晶し、ろ取した結晶をＭＴＢＥ／ＩＰＡ（９／１）混合溶液（４８００ｍＬ）に溶解し、不溶物をろ別した。ろ液を減圧濃縮後、ＩＰＡ（９１２ｍＬ）から再結晶を行い、ろ取した結晶を真空乾燥し２９４ｇのＢｏｃ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－ＯＭｅを得た（Ｃｌ－・Ｈ２ ＋－Ｌｅｕ－ＯＭｅから３工程での収率４０％）。
1H NMR (400 MHz、CDCl3)δ ppm: 0.9-1.0（m, 12 H）; 1.38（d, J = 7.2 Hz, 3 H）; 1.44（s, 9 H）; 1.5-1.7（m, 6 H）; 3.73（s, 3 H）; 4.09（br. s, 1 H）; 4.4-4.6（m, 2 H）; 4.86（br. s, 1 H）; 6.5-6.7（m, 2 H）.
（２）ペプチド誘導体IIａ（Ｘ＝Ａｌａ）の塩酸塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
 の調製。
　５Ｌの反応容器にＢｏｃ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－ＯＭｅ　２５０ｇ（０．５６ｍｏｌ）、２Ｍ　ＨＣｌ／ＣＰＭＥ溶液１１６０ｍＬ（２．３２ｍｏｌ）を仕込み、室温で終夜撹拌した。ＩＰＥ（１２５０ｍＬ）を加えて１０分撹拌した後、デカンテーションにより上澄みを除去した。ＩＰＥ（３０００ｍＬ）を加えて１０分撹拌した後、デカンテーションにより上澄みを除去した。減圧濃縮し、１９９ｇのＣｌ－・Ｈ２ ＋－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（ペプチド誘導体IIａ（Ｘ＝Ａｌａ）の塩酸塩）を得た（収率９６．３％）。
1H NMR（400 MHz、CDCl3）δ ppm: 0.90-0.97（m, 12 H）; 1.42（d, J = 6.8 Hz, 3 H）; 1.63-1.82（m, 6 H）; 3.71（s, 3 H）; 4.38（br. s, 1 H）; 4.47-4.50（m, 1 H）; 4.71（br. s, 1 H）; 7.59（br. s, 1 H）; 8.28（br. s, 3 H）; 8.51（br. s, 1 H）.
［参考例５］
　ペプチド誘導体IIａ（Ｘ＝Ｌｅｕ）の塩酸塩
の合成。
　３０ｍＬの反応容器にＨ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ　１．００ｇ（２．８０ｍｍｏｌ）を仕込み、２Ｍ　ＨＣｌ／ＭｅＯＨ溶液５ｍＬ（１０ｍｍｏｌ）を加えて室温下終夜撹拌した。減圧濃縮を行い、Ｃｌ－・Ｈ２ ＋－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－ＯＭｅ（ペプチド誘導体IIａ（Ｘ＝Ｌｅｕ）の塩酸塩）１．１７ｇを得た（収率は定量的）。
1H NMR (400 MHz、D2O) δ ppm: 0.82 (d, J = 6.6 Hz, 3 H); 0.83-0.90 (m, 12 H); 0.92 (d, J = 6.6 Hz, 3 H); 1.3-1.8 (m, 9 H); 3.5-3.7 (s, 3 H); 3.6-3.9 (m, 1 H); 4.2-4.4 (m, 1 H); 4.4-4.5 (m, 1 H); 8.14 (br. s, 3 H); 8.46 (d, J = 7.8 Hz, 1 H); 8.61 (d, J = 8.4 Hz, 1 H).
　このようにして製造された、本発明の自己組織化ペプチド誘導体は、公知の技術水準に従って使用される。
　本発明により、再生医療分野及び外科領域において有用である自己組織化ペプチド誘導体を、低コストで効率的に製造することができる。またスケールアップが容易である。

Claims (16)

  1. 　一般式（IX）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     で表されるペプチド誘導体２硫酸塩、又は
    一般式（X）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     で表わされる、ペプチド誘導体２硫酸塩。
  2. 　一般式（I）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、保護基Ａと保護基Ｃは塩基性条件下では安定で強酸性条件下において脱保護できるアルギニン側鎖の保護基であり互いに同じであっても異なっていても良い。また式中、保護基Ｂは塩基性条件下では安定で強酸性条件下において脱保護できるアスパラギン酸側鎖の保護基である。さらに、Ｎ末端アルギニンのアミノ基及び／又はＣ末端アルギニンのカルボキシ基は修飾されていても良い。）
    で表されるペプチド誘導体Iと、
    一般式（II）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、Ｎ末端ロイシンのアミノ基及び／又はＣ末端ロイシンのカルボキシ基は修飾されていても良く、ＸはＡｌａ又はＬｅｕである。）
    で表されるペプチド誘導体IIとを、ビルディングブロックとして用い、これらを順次カップリングし、側鎖保護基を強酸で脱保護し、さらに末端脱保護工程、修飾工程及び／又は塩交換工程を含んでもよい各工程よりなる、
    一般式（VII）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （式中、ｎは酸の価数に応じて（酸の価数）×ｎが４となる係数を意味する。）、
    又は、
    一般式（VIII）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式中、ｎは酸の価数に応じて（酸の価数）×ｎが４となる係数を意味する。）
    で表されるペプチド誘導体の製造方法。
  3. 　前記ペプチド誘導体IのＮ末端がアセチル化されているペプチド誘導体Iａと、前記ペプチド誘導体IIのＣ末端がエステル基で保護されているペプチド誘導体IIａとをカップリングさせ、生じたペプチド誘導体IIIａのＣ末端を脱保護した後に、さらに前記ペプチド誘導体IのＣ末端がアミド基であるペプチド誘導体Iｂとカップリングさせ、得られたペプチド誘導体IVａの側鎖保護基を脱保護する工程を含む請求項２に記載の製造方法。
  4. 　前記ペプチド誘導体IのＮ末端がアセチル化されているペプチド誘導体Iａと、前記ペプチド誘導体IIのＣ末端がエステル基で保護されているペプチド誘導体IIａとをカップリングさせ、生じたペプチド誘導体IIIａのＣ末端を脱保護した後に、さらに前記ペプチド誘導体IのＣ末端がエステル基で保護されているペプチド誘導体Iｃとカップリングさせ、得られたペプチド誘導体IVｂの側鎖保護基を脱保護した後にＣ末端エステル基をアミド基へと変換する工程を含む請求項２に記載の製造方法。
  5. 　前記ペプチド誘導体IIａのＣ末端エステルがメチルエステルである、請求項３又は４に記載の製造方法。
  6. 　前記ペプチド誘導体IｃのＣ末端エステルがメチルエステルである、請求項４に記載の製造方法。
  7. 　一般式（V）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （式中、保護基Ａは前記と同意義を示し、Ｎ末端アルギニンのアミノ基は修飾されている。）
    で表されるペプチド誘導体Vと、
    一般式（VI）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     （式中、保護基Ｂ、Ｃは前記と同意義を示し、Ｃ末端アルギニンのカルボキシ基は修飾されている。）
    で表されるペプチド誘導体VIとをカップリングさせ、そのカップリング体のＮ末端アルギニンのアミノ基及び／又はＣ末端アルギニンのカルボキシ基の脱保護を行う工程及び／又は修飾を行う工程を含んでいてもよい、前記ペプチド誘導体Iを得る工程を含む請求項３～６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　前記保護基Ａ及び前記保護基Ｃが、２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル基である請求項３～７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　前記保護基Ｂが、ｔ－ブチルエステルである請求項３～８のいずれか１項に記載の製造方法。
  10. 　前記ペプチド誘導体IのＮ末端がアセチル化されているペプチド誘導体Iａの調製において、ペプチド誘導体VのＮ末端がアセチル化されているペプチド誘導体Vａと、前記ペプチド誘導体VIのＣ末端がエステル基で保護されているペプチド誘導体VIａをカップリングさせ、その後Ｃ末端エステルを脱保護してペプチド誘導体Iａを得る工程；及び／又は、前記ペプチド誘導体VのＮ末端がアセチル基以外の保護基で保護されているペプチド誘導体Vｂと、前記ペプチド誘導体VIａとのカップリング後に、Ｎ末端をアセチル基に変換、並びにＣ末端エステルを脱保護してペプチド誘導体Iａを得る工程を含む請求項７～９のいずれか１項に記載の製造方法。
  11. 　前記ペプチドVIａのＣ末端エステル基がメチルエステルである、請求項１０に記載の製造方法。
  12. 　前記ペプチド誘導体IのＣ末端がアミド化されているペプチド誘導体Iｂの調製において、前記ペプチド誘導体VのＮ末端がアセチル基以外の保護基で保護されているペプチド誘導体Vｂと、前記ペプチド誘導体VIのＣ末端がアミド化されているペプチド誘導体VIｂとをカップリングさせ、その後Ｎ末端を脱保護してペプチド誘導体Iｂを得る工程を含む、請求項７～９のいずれか１項に記載の製造方法。
  13. 　前記ペプチド誘導体IのＣ末端がエステル基で保護されたペプチド誘導体Iｃの調製において、前記ペプチド誘導体VのＮ末端がアセチル基以外の保護基で保護されているペプチド誘導体Vｂと、前記ペプチド誘導体VIのＣ末端がエステル基で保護されたペプチド誘導体VIａとをカップリングさせ、その後Ｎ末端を脱保護してペプチド誘導体Iｃを得る工程を含む、請求項７～９のいずれか１項に記載の製造方法。
  14. 　一般式（VII）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     （式中、ｎは酸の価数に応じて（酸の価数）×ｎが４となる係数を意味する。但し、酸が塩酸である場合を除く。）
    及び／又は、一般式（VIII）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     （式中、ｎは酸の価数に応じて（酸の価数）×ｎが４となる係数を意味する。但し、酸が塩酸である場合を除く。）
    で表されるペプチド誘導体を、有機溶媒存在下塩酸で処理して、塩交換する工程を含む一般式（XI）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     又は一般式（XII）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     で表されるペプチド誘導体４塩酸塩の製造方法。
  15. 　前記有機溶媒がＴＨＦである、請求項１４に記載の製造方法。
  16. 　一般式（VII）及び／又は一般式（VIII）で表されるペプチド誘導体のｎ（酸）が２硫酸である、請求項２～１５のいずれか１項に記載の製造方法。
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