CN107735686B

CN107735686B - 具有内部蛋白质衔接子的纳米孔

Info

Publication number: CN107735686B
Application number: CN201680034399.2A
Authority: CN
Inventors: G·马格利亚; M·索斯堪; A·别斯曼斯; V·范米维尔特; B·珀尔曼; G·舒尔曼-沃尔特斯
Original assignee: Katholieke Universiteit Leuven; Rijksuniversiteit Groningen
Current assignee: Katholieke Universiteit Leuven; Rijksuniversiteit Groningen
Priority date: 2015-04-14
Filing date: 2016-04-14
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2036-04-14
Also published as: EP3283887B1; WO2016166232A1; US11169138B2; CN107735686A; US20220091096A1; EP3283887A1; US20180209952A1

Abstract

本发明涉及检测样品中的分析物的方法，其包括步骤：获得含有纳米孔和内化于纳米孔内腔的蛋白质衔接子的纳米孔传感器，将含有分析物的样品加入纳米孔的顺式侧或反式侧，和测量贯穿纳米孔的电导，其中在加入样品后电导的变化表明分析物存在于样品之中并且已经结合至蛋白质衔接子。本发明同样还涉及含有纳米孔和内化在纳米孔内腔内的蛋白质衔接子的纳米孔传感器。本文所述蛋白质衔接子是功能性酶或配体结合蛋白质。

Description

具有内部蛋白质衔接子的纳米孔

发明领域

本发明涉及含有纳米孔(nanopore)蛋白质和内化于纳米孔内腔的蛋白质衔接子的纳米孔传感器。蛋白质衔接子保留了其对特定底物的结合特异性以及其功能活性，因此纳米孔传感器可以用于对分析物进行检测以及对结合的分析物独特的性质进行表征。

背景技术

在过去的二十年中，纳米孔分析已经成为了单分子分析中理想的分析工具[Howorka,S.和Siwy,Z.(2009)Chem Soc Rev 38,2360-2384；Bayley,H.(2015)Clin.chem.61,25-31；Luchian,T等.(2003)Angew.Chem.42,3766-3771；Bezrukov,S.M.等.(1994)Nature 370,279-281]。纳米孔技术允许使用高取样频宽对天然分子进行研究，不需要标记、化学修饰或表面固定。进一步而言，离子电流输出信号可以很容易的通过小型和便携式电子设备连接。例如，集成到MinION^TM测序仪的纳米孔的阵列最近已经被用于基因组DNA的概况[Ashton,P.M.等.(2014)Nat.Biotechnol.33,296–300；Mikheyev,A.S.和Tin,M.M.(2014)Mol.ecol.res.14,1097-1102；Quick,J.等.(2014)GigaScience 3,22]。此外，生物纳米孔被重建成形成在玻璃纳米管(White,R.J.等(2007).J Am Chem Soc 129,11766-11775)和玻璃尖上的双层，用于扫描离子导电显微镜(Zhou,Y.等(2014)Langmuir30,15351-15355)。因此，可以检测和定量代谢物的纳米孔功能化的纳米管是用于在单细胞内进行测量的理想平台。

之前的研究显示，结合到环糊精(Gu,L.Q.等(1999)Nature 398,686-690)和环肽衔接子(Sanchez-Quesada,(2000)J.Am.Chem.Soc.122,11757-11766)或瓜环载体(Braha,O.等.(2005)Chemphyschem,6,889-892)的小分子(“客体衔接子”)，可以通过离子电流记录使用α-溶血素(αHL)纳米孔进行检测。然而，这些客体衔接子和载体并不选择性地结合至主体分子，使得特定分析物的鉴定变得复杂化，特别是对于如生物样品的化合物的复杂混合物。因此，本领域仍需要对目标分析物赋予高选择性结合的新型纳米孔传感器。

众所周知蛋白质选择性地结合至靶标，并且进一步的研究证明电渗透力和电泳力使得如凝血酶的小蛋白质陷于纳米孔内[Soskine,M.等.(2013)J Am Chem Soc,135,13456-13463；Soskine,M.(2012)Nano Lett.12,4895-4900]，这意味着蛋白质可以被用做纳米孔内的衔接子。然而，组装这样的混合型装置是具有挑战的。大部分蛋白质太大以至于不能被αHL和其他生物纳米孔所包含[Jung,Y.等.(2005)Biochem.44,8919-8929；Movileanu,L.(2000)Nat.Biotechnol.18,1091-1095。Fahie,M.等.(2015)ACS nano,9,1089-1098]，并且也无法太快的移位通过固态的纳米孔，从而正确地进行取样(Plesa,C.等(2013)Nano Lett.,13,658-663)。此外，固态的纳米孔中的分析表明在纳米孔的内腔的蛋白质不会预期保持它们的结构或功能。在固态的纳米孔中，蛋白质被电场拉伸(Oukhaled,A.等.(2011)ACS nano 5,3628-3638)并且在施加高于+200mV的电位时解折叠(Freedman,K.J.(2013).J.Scientific reports 3,1638)。如果蛋白质被拉伸或解折叠，它们的目标结合位点和功能有可能丢失。

发明内容

本文描述了一种基于纳米孔和内化于纳米孔内腔的蛋白质衔接子的纳米孔传感器。可以使用不同类型的蛋白质，包括酶。不使用共价化学或其它固定化技术，蛋白质衔接子保留在纳米孔的内腔之中，并且出人意料地，蛋白质衔接子保持其折叠结构、功能和/或结合性质。分析物结合至内化的蛋白质衔接子通过纳米孔电导中的变化反映。相应地，本文同样描述了使用传感器检测分析物的方法，并且本文公开了传感器在发现新的治疗方法以及检测生物样品中的生物标志物中的应用。

本发明的第一方面涉及包含纳米孔和内化于纳米孔内腔的蛋白质衔接子，其中蛋白质衔接子是功能性酶或配体结合蛋白质。

在一些实施方式中，纳米孔中的第一开口具有比纳米孔中的第二开口更大的直径。

在某些实施方式中，纳米孔传感器是细胞溶素A(ClyA)或其突变体或变体。

在一些实施方式中，蛋白质衔接子是球状的。蛋白质衔接子可以是选自脱甲基酶和还原酶的功能性酶。在某些实施方式中，蛋白质衔接子包含标签。标签可以具有总净正或负电荷。

在某些实施方式中，蛋白质衔接子与一个或多个其他分子形成复合物。在一些实施方式中，蛋白质衔接子结合目标分析物。目标分析物可以选自小分子分析物、蛋白质分析物、和核酸分析物。在一些实施方式中，目标分析物是带电荷的。

在一些实施方式中，纳米孔传感器是ClyA，并且含有多个亚基，各亚基含有由SEQID NO:3表示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，纳米孔传感器是脱甲基酶，例如AlkB脱甲基酶。在某些实施方式中，纳米孔传感器是还原酶，例如二氢叶酸还原酶。在一个具体实施方式中，脱甲基酶是包含Asn120Asp突变的AlkB脱甲基酶。

本发明的另一方面涉及检测样品中的分析物的方法，其包括以下步骤：

a)获得含有纳米孔和内化于纳米孔内腔的蛋白质衔接子的纳米孔传感器，其中蛋白质衔接子是功能性酶或配体结合蛋白质。

b)将含有分析物的样品加入纳米孔的顺式侧或反式侧，并且

c)测量贯穿纳米孔的电导，其中在加入样品后电导的变化表明分析物与蛋白质衔接子的结合以及分析物存在于样品之中。

本发明因此公开了检测样品中的分析物的方法，其包括：(a)获得含有纳米孔和内化于纳米孔内腔的蛋白质衔接子的纳米孔传感器，(b)将样品加入纳米孔的顺式侧或反式侧，并且(c)测量贯穿纳米孔的电导，其中在加入样品后电导的变化表明分析物存在于样品之中并且已经结合至蛋白质衔接子。

本发明因此公开了鉴定蛋白衔接子的配体的方法，其包括：(a)获得含有纳米孔和内化于纳米孔内腔的蛋白质衔接子的纳米孔传感器，(b)将测试化合物加入纳米孔的顺式侧或反式侧，并且(c)测量贯穿纳米孔的电导，其中在加入测试化合物后电导的变化表明测试化合物是结合蛋白质衔接子的配体。

本文中，纳米孔具有第一和第二开口，其中第一开口具有比第二开口更大的直径。

在具体实施方式中，纳米孔传感器是细胞溶素A(ClyA)或其突变体或变体，如细胞溶素A(ClyA)突变体Gln56Trp。

在具体实施方式中，ClyA含有多个亚基，各亚基含有由SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列。

在具体实施方式中，蛋白质衔接子是球状的。

在具体实施方式中，其中蛋白质衔接子是脱甲基酶或还原酶，如AlkB脱甲基酶(例如，含有Asn120Asp突变的AlkB脱甲基酶)或二氢叶酸还原酶。

在具体实施方式中，蛋白质衔接子含有标签，其可以具有总净正或负电荷。

在具体实施方式中，其中蛋白质衔接子与一个或多个其他分子形成复合物。

在具体实施方式，分析物是小分子、蛋白质、或核酸。

在具体实施方式中，分析物是带电荷的。

本发明的另一方面是上述纳米孔传感器检测样品中的分析物中的应用。

在具体实施方式，分析物是小分子、蛋白质、或核酸。

在具体实施方式中，分析物是带电荷的。

附图的简要说明

图1显示了AlkB-Fe⁺⁺到ClyA-AS的内化。图1a显示了E.coli AlkB(绿色)的卡通图，其包含金属离子(Co²⁺，球状)并与辅因子结合(2-OG，标记的)。DNA结合位点用橘色线描绘。PDB_ID 3KHB.图1b显示了在负电位施加下，约束在被嵌在平面的脂质双层(标记的)中的ClyA-AS纳米孔内的单AlkB-Fe⁺⁺酶的示意图(以横截面示出)。孔的尺寸考虑了原子的范德华半径。图1c，(上图)显示了由AlkB-Fe⁺⁺分子(～4nM，顺式)在-60mV进入ClyA-AS纳米孔引发的典型的电流阻断(current blockade)。开口孔电流(I_O)由蓝色的虚线表示，其中水平1和水平2分别用虚线示出。星号表示在AlkB-Fe⁺⁺从孔中离开后的I_O的复位。下图示出了单AlkB-Fe⁺⁺阻断的细节，示出了水平1和水平2电流水平。电流痕迹通过应用具有2kHz截止的低贝塞耳(Bessel)滤波器进行收集，并以10kHz进行采样。将另外一个具有50Hz截止的贝塞耳8孔滤波器数字化地应用于图1c(下图)中示出的痕迹。所有的记录都在150mM NaCl,15mMTris HCl pH 8.0中以28℃进行，并且将AlkB加入顺式隔室。

图2显示了配体与约束在ClyA-AS中的AlkB-Fe⁺⁺的结合。图2a显示了对于约束在ClyA-AS中的个体AlkB-Fe⁺⁺酶在-60mV的典型的配体诱导的阻断。使用的配体显示在痕迹的右侧。结合水平1电流水平(L_1O、L_1N、L_1S)由最下方的虚线表示。底物浓度是：0.6mM的2-OG，0.6mM的N-OG和2mM结合至野生型AlkB-Fe⁺⁺的SUC，和7.2mM结合至N120D-AlkB-Fe⁺⁺的2-OG。图1b(左侧图)显示了解离速率常数(k_off)在-60mV随配体浓度的变化；同时，图1b(右侧图)显示了事件频率(1/τ_on)在-60mV随配体浓度的变化。2-OG以方块示出，SUC以圆圈示出，并且N-OG以三角形示出。k_off和f的所有数值都是基于从N>3的单通道实验中收集的所有>350的结合事件，其中各实验典型地分析n>8的AlkB阻断。所有的电流痕迹通过应用2kHz截止的低贝塞耳滤波器进行收集，并以10kHz进行采样。将另外一个具有50Hz截止的贝塞耳8孔滤波器数字化地应用于电流痕迹。所有的记录都在150mM NaCl,15mM Tris HCl pH 8.0中以28℃进行，并且将配体加入顺式隔室。误差以标准差给出。

图3显示了DHFR作为蛋白质衔接子。图3a是大肠杆菌DHFR(标记的)与结合的甲氨蝶呤(MTX，球体)和NADPH(球体)，PDB_ID 1RH3的卡通图。图3b显示了在负电位施加下，约束在被嵌在平面的脂质双层(标记的)中的ClyA-AS纳米孔内的MTX与单DHFR_标签酶复合的示意图(以横截面示出)。对加在DHFR的C末端的带正电荷的多肽标签进行标记。图3c显示了由ClyA-AS纳米孔在-90mV对于DHFR_标签：MTX复合物(20nM DHFR_标签，400nM MTX，顺式)捕获所引发的典型的电流阻断。开口孔电流(I_O)由最下方的虚线表示，而L_1M和L_2M分别由中间和最上方的虚线示出。星号表示在DHFR_标签：MTX从孔中离开后的I_O的复位。电流痕迹通过应用具有2kHz截止的低贝塞耳(Bessel)滤波器进行收集，以10kHz进行采样，在150mM NaCl、15mMTris HCl pH 7.5中以28℃收集电流的追踪记录。

图4显示了在配体结合DHFR_标签后的电流增强。图4a显示了在-90mV个体DHFR_标签：MTX阻断的配体诱导的电流增强。在20nM DHFR_标签和400nM MTX加入顺式隔室后，将NADP+和NADPH加入反式隔室。从上至下：无配体；5.7μM的NADP+；0.7μM的NADPH；7.4μM的NADP+与0.7μM的NADPH一起。游离和结合水平1(L1和L1o)通过虚线示出。星号表示在DHFR_标签：MTX从孔中离开后的I_O的复位。电流痕迹的右侧是DHFR_标签与MTX、NADP+或NADPH的相互作用的示意图。图4b(上图)显示了解离速率常数(k_off)在-90mV随添加到反式隔室的NADP+浓度的变化。图4b(下图)显示了事件频率(1/τ_on)在-90mV随添加到反式隔室的NADP+浓度的变化。误差以标准差示出。k_off和f的所有数值都是基于从N>8的单通道实验中收集的所有>2000的结合事件，其中各实验典型地分析n>8的DHFR_标签：MTX阻断。所有的电流的痕迹通过应用2kHz截止的低贝塞耳滤波器进行收集，并以10kHz进行采样。将另外一个具有50Hz截止的贝塞耳8孔滤波器数字化地应用于图4a中示出的痕迹。所有的记录都在150mM NaCl,15mM Tris HCl pH7.5中以28℃进行。

图5显示了2-OG诱导的对于单AlkB-Fe⁺⁺分子的结合事件。电流痕迹显示了AlkB-Fe⁺⁺分子(箭头)的捕获，其先被加入顺式隔室，其后将2-OG加入顺式隔室。约束的AlkB-Fe⁺⁺显示了L1和L2电流水平，而2-OG结合诱导了L1B和L2B离子电流水平。(所有的电流水平都被标记)。灰色的虚线对应开口孔电流(I_o)。痕迹是使用2kHz过滤速率和10kHz取样速率在这样的条件下记录的：-60mV施加电位，150mM NaCl、15mM Tris.HCl pH 8.0中，28℃，并且用具有50Hz截止的贝塞耳(8孔)低通滤波器数字化地过滤。

图6显示了2-OG诱导的对于AlkB-Fe⁺⁺的电流水平。图6a显示了延长的电流痕迹，其显示了2-OG与单一约束的AlkB-Fe⁺⁺结合所诱导的L1、L1B、L2和L2B电流水平。图6b中是显示了配体诱导的电流水平的选择的痕迹。转变总是从L1B到L2B或从L1到L2，或从L2到L1或从L2B到L1B。电流痕迹是使用2kHz过滤速率和10kHz取样速率在这样的条件下进行记录的：存在4.8mM 2-OG，-60mV施加电位，150mM NaCl、15mM Tris.HCl pH 8.0，28℃，并且用具有50Hz截止的贝塞耳(8孔)低通滤波器数字化地过滤。

图7显示了NADP+诱导的对于DHFR_标签：MTX的结合事件。电流痕迹显示了在5.7μMNADP+(箭头)加入反式隔室之前(左侧)和之后(右侧)DHFR_标签：MTX(加入顺式隔室，50nM的DHFR_标签和400nM MTX)阻断。NADP+的结合导致从L1_M(最上方虚线)到L1_M:N+(标记的)可逆的电流增强。灰色的虚线(最下方虚线)对应开口孔电流(I_o)。痕迹是使用2kHz过滤速率和10kHz取样速率在这样的条件下记录的：-90mV施加电位，150mM NaCl、15mM Tris.HCl pH 7.5中，28℃，并且用具有50Hz截止的贝塞耳(8孔)低通滤波器数字化地过滤。

图8显示了同源抗-AlkB适体对AlkB-Fe⁺⁺诱导的电流阻断的效果。由于AlkB：适配体复合物之间的静电排斥和/或位阻以及带负电荷的ClyA-AS内腔，40μM同源适体(TGCCTAGCGTTTCATTGTCCCTTCTTATTAGGTGATAATA,SEQ ID NO:27，表5)的添加降低了由21nM AlkB_Fe⁺⁺引起的对于ClyA-AS的AlkB-Fe⁺⁺阻断的频率(Soskine,M.(2012)Nano Lett.12,4895-4900)。记录是在150mM NaCl,15mM Tris HCl pH 8.0中以28℃和-35mV施加电位进行。

图9显示了NADPH和NADP+结合至DHFR_标签：MTX的异质性。在图9a和9b中，电流痕迹显示了在向反式隔室添加了0.74μM NADPH之后，在ClyA-AS(50nM的DHFR_标签和400nM的MTX加入顺式隔室)中对DHFR_标签：MTX的捕获。最上方的虚线代表DHFR_标签：MTX L1_M水平。星号指示“短的”(即低亲和性)NADPH结合事件，而实线指示“长的”(即高亲和性)NADPH诱导的结合事件。箭头表示新的DHFR_标签：MTX复合物的捕获。(a)中的电流痕迹显示了表现出非“短的”即“长的”NADPH结合事件的DHFR_标签：MTX b阻断。在(b)中的电流痕迹显示了在相同DHFR_标签：MTX b阻断中在“短的”和“长的”结合模式之间的切换。图9c和9d显示了在反式中加入5.7μM NADP+后，DHFR_标签：MTX阻断(50nM DHFR_标签和400nM MTX在顺式中)。虚线代表DHFR_标签：MTX L1_M水平，二元复合物对于NADP+的无响应状态由实线指示。箭头表示新的DHFR_标签：MTX复合物的捕获。(c)中的电流痕迹显示了对于NADP+添加响应或者无响应的DHFR_标签：MTX阻断。(d)中的电流痕迹显示了在相同的DHFR_标签：MTX阻断中非响应和响应状态的切换。痕迹是使用2kHz过滤速率和10kHz取样速率在这样的条件下记录的：-90mV施加电位，150mM NaCl、15mMTris.HCl pH 7.5中，28℃，并且用具有50Hz截止的贝塞耳(8孔)低通滤波器数字化地过滤。

图10显示了融合至DHFR C末端的1+、4+、标签(5正电荷)和10+的序列。DHFR的C末端、S-标签的序列、阳性卷曲和Strep-标签分别上色为绿色，灰色，青色和黄色。柔性接头的序列用下划线表示。多肽标签中带正电荷的氨基酸通过星号(*)指示，并且带负电荷的氨基酸通过减号(-)指示。

图11显示了DHFR_n+、DHFR_n+：MTX和DHFR_n+：MTX：NADPH诱导的对于ClyA-AS纳米孔的电流阻断。在添加到顺式隔室中的约50nM的图11a：DHFR、图11b：DHFR₁₀₊、图11c：DHFR₄₊、图11d：DHFR_标签存在下记录了代表性的痕迹。每组的三幅图显示了记录的没有配体(左侧图)、添加400nM MTX到顺式隔室后(中间图)和进一步添加20μM的NADPH到顺式隔室(a)或0.7μM的NADPH到反式隔室(图11b、11c、11d)后(右侧图)的DHFR_n+阻断。箭头指示对于二元DHFR_n+:MTX复合物的NADPH结合事件。星号指示DHFR₁₀₊:MTX到低电导水平的转变。电流痕迹是使用2kHz过滤速率和10kHz取样速率在这样的条件下记录的：-90mV施加电位，150mM NaCl、15mMTris.HCl pH 7.5中，28℃，并且用具有500Hz截止的高斯低通滤波器数字化地过滤。

图12显示了通过12％SDS PAGE分析的strep-标签的纯化的野生型AlkB-Fe⁺⁺的纯度。在左泳道中是蛋白质标志物(Page Ruler Plus前染蛋白梯标，热科学公司(ThermoScientific))；右侧泳道是5μg纯化的AlkB-Fe⁺⁺。

图13显示了通过15％SDS PAGE分析的strep-标签的纯化DHFR_n+的纯度。在泳道1是蛋白质标志物(Page Ruler Plus前染蛋白梯标，热科学公司)。泳道2至4各自包含约5μg纯化的DHFR(泳道2)、DHFR₄₊(泳道3)、DHFR_标签(泳道4)并且泳道5大约10μg纯化的DHFR₁₀₊。

图14SBD(底物结合结构域)蛋白与ClyA纳米孔。左图。嵌在脂质双层中的I型Cly-AS纳米孔。ClyA纳米孔的尺寸考虑了原子的范德华半径。右侧，上部分，开口构造中SBD1的表面表示图(PDB ID＝4LA9)。下部分，开口(PDB ID＝4KR5)和封闭的Gln-结合的(PDB ID＝4KQP)构造中SBD2的表面表示图。蛋白质根据它们的“真空中”静电进行上色(红色是负电区域，蓝色是正电区域，Pymol)。

图15显示了I型ClyA-AS中SBD1的捕获。

(A)由I型ClyA-AS纳米孔在-60mV对SBD1(底物结合结构域1)(74nM，顺式)的捕获所引起的典型的离子电流阻断。标明了开口孔，水平I和水平II电流水平。(B)0.40μM天冬酰胺(顺式)添加之前(上半部分)和之后，SBD1电流阻断的细节。通过应用具有2kHz截止的低贝塞耳滤波器，电流痕迹在150mM NaCl、15mM Tris HCl pH 7.5中以24℃进行收集，并以10kHz进行采样。应用了100Hz的采集后高斯滤波器。(C)从位于指定底物浓度的开口的(水平I)和封闭的配体结合的(水平II)群获得SBD1(74nM，顺式)对于天冬酰胺的K_d值。实验在-60mV下实施。(D)SBD1的开口(k_开口)和封闭(k_封闭)率常数由陷于处于-60mV纳米孔中的SBD1分子的转变速率随天冬酰胺浓度的变化确定。K_封闭获得自线性拟合的斜率。

图16显示了SBD2的捕获。

(A)在0.40μM谷氨酰胺顺式添加之前(左侧)和之后，I型ClyA-AS纳米孔在-100mV对SBD2(70nM，顺式)的捕获所引起的典型的电流阻断。通过应用具有2kHz截止的低贝塞耳滤波器，电流痕迹在150mM NaCl、15mM Tris HCl pH 7.5中以24℃进行收集，并以10kHz进行采样。应用了100Hz的采集后高斯滤波器。(B)从水平II(结合状态)和位于指定底物浓度的水平I和水平III获得SBD2(70nM，顺式)对于天冬酰胺的K_d值。实验在-100mV下实施。(C)SBD2的开口(k_开口)和封闭(k_封闭)率常数。

图17显示了失活的SBD2并不与谷氨酰胺结合。

(A)在200μM谷氨酰胺顺式添加之前(左侧)和之后，I型ClyA-AS纳米孔在-100mV对E417W-SBD2(顺式)的捕获所引起的典型的电流阻断。红色星号表示在SBD2_D417F从孔中离开后的I_O的复位。水平I和水平II转变最有可能代表SBD2以两种不同的构造进入ClyA纳米孔。

图18用捕蝇草(venus flytrap)蛋白质结构域对葡萄糖传感。a)纵切穿(Cut-through)包含GBP的ClyA纳米孔。b)GBP的捕蝇草结构域的开口(蓝色)和封闭(橘色)构造的卡通图。c)在不存在(上)和存在(中和下)葡萄糖浓度的增加下的GPB阻碍的电流的电记录。

图19显示了用ClyA变体的蛋白质识别。

A)纵切穿ClyA-AS纳米孔显示了纳入HT。蛋白质嵌入(lodge)纳米孔内被称为L1和L2的两个位点。B)ClyA-AS内HT的离子电流阻断显示了HT在L1和L2之间在-35mV的运动。C)针对不同ClyA-AS突变体，滞留在ClyA-AS中的L1和L2的百分比。

图20显示了纳米孔突变在人凝血酶阻断上的影响。图表表示由人凝血酶在-35、-50和-80mV(从上到下)对ClyA-AS-WT、CLyA-AS-125W和ClyA-AS-v60w(从左到右)诱导的阻断。由人凝血素诱导的阻断对于ClyA-AS-WT和CLyA-AS-125W是相似的，并且对于ClyA-AS-v60w是不同的，这表明凝血素结合位点靠近ClyA纳米孔内的60位。

图21显示了用ClyA纳米孔的分析物识别。

A)ClyA-AS纳米孔内谷氨酰胺与SBD2的结合。水平I和水平III对应开口SBD2构造(参见word文件)，同时水平II对应配体结合构造。

B)突变体筛选显示水平I、水平II和水平III之间的不同(如剩余电流％)。Q56W提供了更好的识别。

图22显示了SBD2对于ClyA-AS-q56w的阻断。当与测量的ClyA-WT孔的信号相比(图21)，由于谷氨酰胺与内化的衔接子的结合(水平L2)，信号增强。

发明详述

蛋白质已经进化到以高特异性在许多非常相似的化学物质中识别它们的配体。相应地，在纳米孔的内腔内具有纳入的蛋白质衔接子的纳米孔尤其适用于检测配体分析物。当内化的蛋白质衔接子结合其目标分析物时，蛋白质衔接子内构象变化和/或结合至蛋白质衔接子的目标分析物出现由纳米孔电导的变化进行测量，例如，由纳米孔中离子电流阻断事件的增加。

相应地，本公开一方面涉及包括纳米孔(也称为“孔”、“孔蛋白”或“纳米孔蛋白”)和蛋白质衔接子(或“衔接子”或“内化的衔接子”或“蛋白质”)的纳米孔传感器，其中蛋白质衔接子完全或部分内化于(或“包含于”、“纳入”、“陷于”、“设置于”、“容纳于”、“安置于”、“嵌入”、或“约束于”)纳米孔的内腔内。

纳米孔

示例性的纳米孔包括但不限于，细胞溶素、溶血素、孔蛋白、DNA包装蛋白、和机动蛋白。在一些实施方式中，纳米孔是Phi29(Wendell,D.等.(2009)Nat.nanotech.4,765-772)、肺炎链球菌溶血素(Gilbert,R.J.等.(1999)Cell 97,647-655)FhuA(NiedzwieckiDJ等.(2012)Biophys J.103,2115-2124)或固态的纳米孔。

在某些实施方式中，纳米孔传感器是造孔细胞毒素蛋白，例如细菌细胞溶素。在某些实施方式中，纳米孔是来自如沙门菌(Salmonella)或大肠杆菌(Escherichia coli(E.coli))的革兰氏阴性细菌的细胞溶素。在一些实施方式中，纳米孔是来自伤寒沙门菌(Salmonella typhi(S.typhi))或副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi(S.paratyphi))的细胞溶素A(ClyA)。在一些实施方式中，纳米孔是ClyA的突变体或变体，如经修饰的ClyA的变体，像如WO2014153625所述的ClyA-CS或ClyA-AS。

在某些实施方式中，纳米孔是具有至少两个开口的圆柱形，例如，一个顺式开口和一个反式开口。纳米孔中的第一开口可以具有比第二开口更大的直径。在一些实施方式中，顺式开口具有比反式开口更大的直径。因此，“顺式直径”比“反式直径”更大。或者，反式开口具有比顺式开口更大的直径。典型地，纳米孔是一个包含亚基(或“单体”)的低聚物结构，空内腔的尺寸取决于低聚物结构内亚基的数量和/或组成。在一些实施方式中，纳米孔可以包含至少7个单体，例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个单体亚基。在一些实施方式中，纳米孔可以包含至少20个单体亚基，例如20至25、25至30、35至40、或45至50个亚基。在某些实施方式中，纳米孔包含12个亚基。在其它实施方式中，纳米孔包含13个亚基、或14个亚基。取决于亚基的氨基酸序列，亚基可以优选地组装成12聚体和/或13聚体。

纳米孔含有可以组装成不同低聚物形式的亚基。在单纳米孔(例如ClyA纳米孔)内，各亚基可以是相同的，或这些亚基可以是不同的，因此孔中的亚基可以含有与相同纳米孔中的其它多肽亚基序列不同的序列。在某些实施方式中，如本文公开的纳米孔，如ClyA纳米孔或变体，如ClyA-CS和ClyA-AS，可以根据亚基组成形成超过一种亚型。例如，取决于亚基的组成，纳米孔中的亚基可以是至少2或3种不同的亚型。ClyA-AS[Mueller,M.等.(2009)Nature,459,726-730；Soskine,M.等.(2013)J Am Chem Soc,135,13456-13463](SEQ IDNO:3)可以被组装成至少3种低聚物形式(I型、II型和III型ClyA)(Soskine,M.等.(2013)JAm Chem Soc,135,13456-13463)，它们足够大到容纳蛋白质或蛋白质-DNA复合物(VanMeervelt,V.等(2014)ACS nano,8,128262-12835)。任何由个体亚基组装成的纳米孔可以具有不同的低聚物形式，并且该低聚物形式可以具有不同性质，如尺寸和纳米孔的电压依赖性开口和封闭(门选)。亚型可以优选地由特定的多肽序列的亚基形成。

在一些实施方式中，纳米孔是来自伤寒沙门菌的ClyA，并且含有多个亚基，其中各亚基含有与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列所表示的多肽。在某些实施方式中，亚基由与SEQ ID NO:1至少85％相同、90％相同、95％相同、99％相同或100％相同的氨基酸序列所表示。相同可以指氨基酸相同性，或者可以指结构和/或功能相同性。相应地，与SEQ IDNO:1比较，可以替换、删除和/或添加一个或多个氨基酸。修饰可以改变孔内腔从而改变孔的尺寸、结合性质、和/或结构。修饰还可以改变内腔外的ClyA纳米孔。

在某些实施方式中，ClyA纳米孔包含多个亚基，其中各亚基含有由氨基酸序列SEQID NO:1(或与SEQ ID NO:1至少85％、90％、95％、96％、96％、98％、或99％相同的序列)所表示的多肽，并且其中一个Cys残基被Ser精确地取代。Cys残基可以是SEQ ID NO:1中的Cys87和/或Cys285。在一些实施方式中，Cys残基是Cys285。剩余的氨基酸残基也可以被取代，例如，被具有相似的如结构、电荷、疏水性、或亲水性等性质的氨基酸。在某些实施方式中，被取代的残基是L99、E103、F166、和K294中的一个或多个。例如，被取代的残基可以是L99Q、E103G、F166Y、和K294R中的一个或多个。示例性的亚基可以含有L99Q、E103G、F166Y、K294R、和C285S取代。因此，各亚基可以含有由氨基酸序列SEQ ID NO:2表示的多肽。含有一个Cys残基被Ser精确地取代的亚基的示例性的ClyA纳米孔可以被称为ClyA-CS。

本发明的其它ClyA突变体是具有Ser110、Lys125、Val67、Val60、Gln56或Arg49突变的变体。这些变体的特定实施方式是Lys125Trp、Val60Trp和Gln56Trp。

在一些实施方式中，ClyA纳米孔包含多个亚基，其中各亚基含有由氨基酸序列SEQID NO:1(或与SEQ ID NO:1至少85％、90％、95％、96％、96％、98％、或99％相同的序列)所表示的多肽，并且其中一个Cys残基被Ala精确地取代。半胱氨酸残基可以是SEQ ID NO:1中的Cys87或Cys285。在一些实施方式中，各亚基含有由氨基酸序列SEQ ID NO:1(或与SEQ IDNO:1至少85％、90％、95％、96％、96％、98％、或99％相同的序列)所表示的多肽，并且其中一个Cys残基被Ser取代和/或一个Cys残基被Ala精确地取代。半胱氨酸残基可以是SEQ IDNO:1中的Cys87或Cys285。其它的氨基酸残基可以被取代，例如，被具有相似的如结构、电荷、疏水性、或亲水性等性质的氨基酸。在某些实施方式中，被取代的残基是L99、E103、F166、K294、L203和H207中的一个或多个。例如，被取代的残基可以是L99Q、E103G、F166Y、K294R、L203V和H207Y。示例性的亚基可以含有L99Q、E103G、F166Y、K294R、L203V、和H207Y、和C285S取代。相应地，各亚基可以包含由氨基酸序列SEQ ID NO:3表示的多肽。含有一个Cys残基被Ser精确地取代并且一个Cys残基被Ala精确地取代的亚基的示例性的ClyA纳米孔可以被称为ClyA-AS。

本公开进一步涉及编码经修饰的ClyA纳米孔的核酸。在一些实施方式中，编码经修饰的ClyA纳米孔的核酸由与SEQ ID NO:4至少80％、90％、95％、96％、96％、98％、或99％相同的核苷酸序列表示。核酸可以由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6表示。核苷酸序列可以是针对在合适宿主，例如大肠杆菌中表达进行优化的密码子。

在一些实施方式中，纳米孔的内腔大到足够容纳下折叠的并且要么(1)未结合至或(2)结合至如特定目标分析物的靶标的蛋白质衔接子。蛋白质衔接子可以与一种或多种其它分子复合，如辅因子或底物或抑制剂，从而形成蛋白质衔接子复合物(或“衔接子复合物”)。蛋白质衔接子在以高亲和性结合其靶标之前，可以非特异性地和/或以低亲和性结合非靶标，特别是如果非靶标是与靶标的化学性质是相似的。在异质性的生物样品中，可以将蛋白质衔接子暴露于各种非其目标分析物的分析物。蛋白质衔接子还可以在与其目标分析物结合之后，在纳米孔的内腔中进行构象变化。

在某些实施方式中，纳米孔的内腔的直径至少是3nm，例如，直径可以测量为3nm、3.5nm、4nm、4.5nm、5nm、5.5nm、6nm、6.5nm、7nm、或更高。纳米孔内腔的顺式直径可以是至少3.5nm和/或纳米孔的反式直径可以是至少6nm。通常，顺式是指添加分析物的经修饰的孔的末端，而反式是指在纳米孔内腔的长度上移位之后分析物从其中离开的经修饰的孔的末端。例如，在人工脂质双层中，可以将孔的反式末端插入脂质双层，而纳米孔的顺式末端保留在脂质双层的相同一侧。相应地，纳米孔的顺式直径是位于纳米孔的顺式末端的开口的直径，而纳米孔的反式直径是位于纳米孔对面的反式末端的开口的直径。可以将分析物加入纳米孔的任一侧，例如，可以将分析物加入纳米孔的顺式开口，因此其横穿(transverse)纳米孔并且从反式侧离开。或者，可以将分析物加入纳米孔的反式侧。纳米孔通过被排列在如脂质双层的膜内，可以贯穿其施加电位。通常，在贯穿膜施加电位是指反式电极的电位。可以将纳米孔从顺式隔室插入脂质双层，其与地电极相连。

蛋白质衔接子

各种蛋白质衔接子可以完全或部分纳入纳米孔的内腔中以形成纳米孔传感器。在一些实施方式中，蛋白质衔接子是球状蛋白质(同样被称为“球蛋白”)。蛋白质衔接子可以大致为球形的，并且可以在水中形成胶体。例如，蛋白质衔接子可以通过非极性(疏水性)氨基酸朝分子内部方向结合而极性(亲水性)氨基酸向外结合进行表征。

在一些实施方式中，蛋白质衔接子是单一蛋白质。在某些实施方式中，蛋白质衔接子是蛋白质结构域、低聚物、和/或蛋白质的片段。蛋白质衔接子还可以是单一蛋白质和/或片段的复合物或组合。在某些实施方式中，蛋白质衔接子包含与小分析物(小分子和/或抑制剂)复合的蛋白质(或片段或结构域)。在某些实施方式中，蛋白质衔接子是功能性酶。在某些实施方式中，蛋白质衔接子是配体结合结构域。

蛋白质衔接子必须具有契合纳米孔的尺寸，例如，蛋白质衔接子可以具有小于纳米孔的顺式直径但是大于纳米孔的反式直径的直径。在一些示例性的纳米孔中，顺式直径比反式直径大，所以蛋白质衔接子可以穿过纳米孔的顺式末端但是无法通过反式末端。蛋白质衔接子可以保持内化至少0.1至1μs、1至10μs、或10至100μs。

纳米孔的顺式直径可以是至少4.5nm、5.0nm、5.5nm、6.0nm、6.5nm、或7nm，而纳米孔的反式直径是至少1.5nm、2.0nm、3.0nm、3.3nm、3.5nm、或4.0nm。在某些实施方式中，纳米孔的顺式直径是5.5nm，并且纳米孔的反式直径是约3.0nm，例如3.3nm。适合在纳米孔中内化的蛋白质衔接子可以具有的小于纳米孔的顺式直径(例如，小于5.5nm)但是大于纳米孔的反式直径(例如，大于3.0nm或3.3nm)的平均直径。相应地，这样的蛋白质衔接子当从纳米孔的顺式侧加入时，其可以能够进入纳米孔但是不能从纳米孔的反式侧离开。相反地，如果反式直径大于顺式直径，那么从纳米孔的反式侧加入的蛋白质衔接子可以从反式开口进入但是不能从顺式开口离开。

蛋白质衔接子的平均直径可以通过晶体结构的检查，如果可以，或通过基于测量值(如分子量)的估计进行确定。例如，可以预期约20kDa分子量的蛋白质具有小于3.5nm的平均直径，而可以预期约25kDa分子量的蛋白质具有超过3.5nm的平均直径。

纳米孔通常具有带负电荷的或带正电荷的内腔，因为当电场作用在纳米孔上时，带电分子(例如，分析物)贯穿纳米孔的电渗流需要电荷。例如，当纳米孔具有带负电荷的内腔并且负电位作用在纳米孔的一侧(例如，纳米孔的反式侧)时，带正电荷的分子将自由地从纳米孔的顺式末端穿过反式末端。相应地，对于具有负电荷内腔的纳米孔，对于内化在纳米孔中合适的蛋白质衔接子可以是带正电荷的或带负电荷的。电荷并不限于蛋白质衔接子的纳入。例如，可以将适当带负电荷的分子(pI>4—等电点)纳入。

一些蛋白质衔接子要么太小以至于无法保持在纳米孔中的内化和/或所具有的电荷对于进入纳米孔并不合适(即，纳米孔具有带负电荷的内腔，而蛋白质是高负电荷)。例如，如果蛋白质的平均直径小于纳米孔的两个直径，那么可以预期该蛋白质将会在纳米孔内腔中保持内化。具有小于3.5nm的平均直径的蛋白质在顺式直径约为6.5nm且反式直径约为3.5nm的纳米孔中保持内化的时间预期将不会超过几毫秒。在一些实施方式中，为了内化于纳米孔中和/或保留在纳米孔的内腔中，对蛋白质衔接子进行标记。标签可以是带电标签。例如，蛋白质可以具有带正电荷的标签，从而被内化于带负电荷的纳米孔中。标签可以以共价或其它化学的方式进行连接，或者标签可以以与蛋白质衔接子融合的形式出现，例如，蛋白质衔接子和标签可以是已经基因编码的。在一些实施方式中，标签含有至少4、5、6、7、8、9、或10个带正电荷的氨基酸残基。标签可以含有带正电荷的卷曲(coil)、间隔子(例如，柔性接头)、和/或用于纯化的标记(例如，strep标签)。在一些实施方式中，标签的出现将标记的蛋白质衔接子的保留时间增加100倍或1000倍。相应地，标记的蛋白质衔接子可以保持内化于纳米孔中几秒钟，然而未标记的蛋白质衔接子单独只能持续几毫秒的内化。

在一些实施方案中，蛋白质衔接子是酶(同样被称为“酶衔接子”)。酶可以是氧化还原酶(酶委员会(EC)1)、转移酶(EC2)、水解酶(EC3)、裂解酶(EC4)、异构酶(EC5)、或连接酶(EC6)。酶可以是选自脱甲基酶或还原酶。在一些实施方式中，酶是脱甲基酶。例如，酶可以是AlkB脱甲基酶。在某些实施方式中，酶是还原酶，例如二氢叶酸还原酶(DHFR)。蛋白质衔接子可以与如小分子(例如，辅因子、抑制剂、和/或任何其它结合蛋白质衔接子的小分子)的分子复合，从而形成衔接子复合物，并且该衔接子复合物可以结合目标分析物。例如，DHFR可以与甲氨嘌呤(MTX)复合，从而形成衔接子复合物。

在某些实施方式中，蛋白质衔接子含有蛋白质亚基、片段、和/或蛋白质的结构域。蛋白质亚基、片段、或结构域可以适用于内化，或者可以通过添加标签以增加尺寸和/或电荷而变得适用。蛋白质衔接子复合物可以含有蛋白质亚基、片段、或结构域。

其它示范性的蛋白质衔接子包括但不限于，抗体、纳米抗体、人工设计的结合元件、配体结合蛋白质(例如，捕蝇草(venus fly trap)结构域)、转录因子、金属结合蛋白质、本质上未折叠的粘结剂、和更多。

纳米孔传感器的应用

(a)分析物的检测和鉴定

结合蛋白质衔接子的任何分析物(或“靶标”、“目标分析物”、“配体”、“底物”、或“结合伴侣”)可以使用本文所述纳米孔传感器检测。分析物包括小分子，包括有机和无机分子，以及如蛋白质和核酸的生物分子。分析物可以是带电荷或可以是不带电荷的分子。在一些实施方式中，通过本文所述纳米孔传感器检测的分析物是带电荷的分子。带电荷的分子可以是蛋白质或小分子。

例如，如果使用纳米孔检测蛋白质衔接子的已知结合伴侣是否存在于混合物之中，分析物可以是蛋白质衔接子的已知靶标。或者，例如，通过对先前并不知与蛋白质衔接子结合的组合物或分子的文库进行筛选，可以鉴定蛋白质衔接子新的结合伴侣。

相应地，本发明一方面涉及检测样品中的分析物的方法，其包括：获得含有纳米孔和内化于纳米孔内腔的蛋白质衔接子的纳米孔传感器，将样品加入纳米孔的顺式侧或反式侧，并且测量贯穿纳米孔的电导，其中在加入样品后，电导的变化表明分析物存在于样品之中并且已经结合至蛋白质衔接子。在一些实施方式中，在添加分析物之前、之中、和之后持续测量电导。

另一方面，涉及鉴定蛋白质衔接子的配体的方法，其包括：获得含有纳米孔和内化于纳米孔内腔的蛋白质衔接子的纳米孔传感器，将测试化合物加入纳米孔的顺式侧或反式侧，并且测量贯穿纳米孔的电导，其中在加入测试化合物后电导的变化表明测试化合物是结合蛋白质衔接子的配体。。

在一些实施方式中，电导的变化是电流阻断的变化(I_B)，即将剩余电流计算成开口孔电流的百分比(IRES％)。因此，分析物与蛋白质衔接子的结合可以导致电流阻断的增加。在一些实施方式中，电流阻断减少。在某些实施方式中，电流电导的变化是噪点模式(noise pattern)中可测量的变化。

贯穿纳米孔的电导对于结合蛋白质衔接子的配体的种类是敏感的并且高度特异性的电导测量值可以用于对只有单一原子不相同的两种配体进行区分。例如，蛋白质衔接子(或衔接子复合物)与特定底物的结合和蛋白质衔接子(或衔接子复合物)与缺少氢负离子的底物的结合具有不同的电导。因此，内化的蛋白质与NADPH的结合可以是不同于内化的蛋白质与NADP+的结合。

(b)酶结合和活性

蛋白质衔接子可以是酶(“酶衔接子”、“内化的酶”、或“酶”)并且使用含有纳米孔和酶衔接子的纳米孔传感器可以研究酶结合、活性、和功能的多个方面。本公开的另一方面涉及测量酶动力学的方法，其包括：获得含有纳米孔和内化于纳米孔内腔的酶衔接子的纳米孔传感器，将配体加入纳米孔的顺式侧或反式侧，测量贯穿纳米孔的第一电导，其反映配体与酶衔接子的结合，并且测量贯穿纳米孔的额外的电导变化，其反映酶动力学，如配体和酶衔接子的结合和解离。在一些实施方式中，随时间持续获得测量值，而配体浓度不断变化(例如，增加的)。

在某些实施方式中，方法还包括增加贯穿纳米孔施加的电位直至配体与酶衔接子解离，并且通过电导的变化对解离进行测量(例如，I_B减少或增加)。在某些实施方式中，方法还包括减小贯穿纳米孔施加的电位直至配体与酶衔接子结合，并且通过电导的变化对结合进行测量(例如，I_B增加或减少)。在一些实施方式中，由配体结合事件的停留时间的倒数(1/τ_off)测量解离速率常数(k_off)，并且并不依赖于配体的浓度。在某些实施方式中，配体诱导的事件的频率(f＝1/τ_on)随配体的浓度线性地增长，从斜率计算出结合速率常数(k_on)。

应注意，酶衔接子保留其结构、结合位点、和活性。酶衔接子的配体可以是酶的底物。因此，本公开的另一方面涉及测量酶衔接子对底物的活性的方法，其包括：获得含有纳米孔和内化于纳米孔内腔的酶衔接子的纳米孔传感器，将底物加入纳米孔的顺式侧或反式侧，并且测量贯穿纳米孔的电导，其中在加入配体后电导的变化表明酶衔接子对底物的活性。活性可以是结合、切割、构象变化、和/或其它通过在底物上作用的酶介导的变化。

在一些实施方式中，两种底物间的竞争性结合可以通过电导随着底物与酶衔接子的结合和解离的改变进行监测。

本文提到的所有出版物和专利在此通过引用全文纳入本文，如同每个单独的出版物或专利被明确地且单独地表明是通过引用纳入。在抵触的情况下，以本申请(包括任何定义在内)为准。

尽管讨论了本发明的具体实施方式，但以上说明书仅为说明性而非限制性的。本领域的技术人员阅读了本说明书和下面权利要求后将清楚了解本发明的许多变化。本发明的全部范围应该通过参考所附权利要求书连同其等同物的全部范围，以及说明书连同此类变化来确定。

现在参照公开本发明的特定实施方式的实施例对本发明进行阐述。

实施例

实施例1材料和方法

除非另外规定，所有的化学物都获自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。DNA购自整合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)，酶来自Fermentas公司，脂质来自阿凡提极性脂质公司(Avanti Polar Lipids)。NADPH和NAPD+的原料(在15mM Tris.HCl pH7.5 150mM NaCl中准备)保存在-20℃并且为单次使用解冻。本研究中所述误差以标准差给出。从线性拟合(图1e，图2e)计算出的值的标准偏差(SD)是根据应用公式

通过拟合所给定的标准误差(SE)计算出来的，其中N是在图表中独立的数据点的数量。

AlkB克隆

为了进行克隆，将Nco位点I(CCATGG)引入来自大肠杆菌的野生型AlkB基因的起点(5’端)。为了将该基因保持在阅读框内，在Nco位点I之后插入另外两个碱基，这导致在起始甲硫氨酸产生后产生额外的丙氨酸残基。出于纯化的目的，在AlkB的C末端，通过柔性甘氨酸-丝氨酸-丙氨酸接头接合strep标签并且开放阅读框由两个连续的停止密码子终止，以及其后的Hind III限制性位点(3’末端)。Strep标签的接合是在两个连续PCR反应中进行的。在第一PCR反应中，使用Phire热启动II DNA聚合酶(Finnzymes公司)、6μM的fAlkB(表5)和AlkBr1(表5)引物，在50μL的反应体积中直接从单BL21(DE3)大肠杆菌(Lucigen)集落的基因组DNA扩增AlkB基因。PCR反应循环方案如下设置：以98℃进行30秒预孵育步骤，然后30个循环在98℃变性5秒，然后72℃延伸1分钟。扩增产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化(凯杰公司(Qiagen))进行纯化并且作为第二PCR反应的模板，其使用约100ng通过使用的6μM的fAlkB(表5)和AlkBr2(表5)引物的Phire热启动II DNA聚合酶在300μL的体积中扩增的纯化的PCR产物。循环方案与之前的步骤相同。获得的包含strep标签标记的AlkB基因PCR产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒(凯杰公司)进行纯化并且使用Nco I和Hind III(FastDigest，Fermentas公司)进行消化。在T7启动子的控制下，凝胶纯化的插入(QIAquickPCR纯化试剂盒纯化，凯杰公司)通过Nco I(5’)和Hind III(3’)位点使用粘性末端连接(T4连接酶，Fermentas公司)克隆进pT7-SC1表达质粒。0.6μL的连接混合物通过电穿孔转化到50μL的E.

10G细胞(Lucigen公司)。转化的细菌在氨苄青霉素(100μg/ml)LB琼脂板上以37℃过夜生长。克隆的种类通过测序确定。Strep-标签标记的AlkB的DNA和蛋白质序列包括在序列表中(参见表6)。

DHFR_n+基因的构建

编码大肠杆菌DHFR的合成基因是通过GenScript制造的。通过分别用Ala和Ser取代位于85和152位的两Cys残基对野生型基因进行修饰(这被称为DHFR贯穿SI和全文)。这些取代基显示出对DHFR的功能性耐受(Plesa,C.等(2013)Nano Lett.,13,658-663)。此外，为了导入Nco I限制性位点，编码Met-Ala-Ser-Ala的DNA序列添加到基因的起点。为了促进构建步骤，Xho I限制性位点被引入到C末端标签和DHFR之间。

作为第一步，建立了DHFR₁₀₊构建体(图10，对于DNA和蛋白质序列参见下文)。使用5μM的DHf和DHr引物(表5)与Phire热启动II DNA聚合酶(Finnzymes公司)在400μL最终体积内，对100ng的合成DHFR基因进行扩增(以98℃进行30秒预孵育，然后循环：以98℃进行5秒退火，以72℃进行1分钟延伸30个循环)。编码10+标签(由IDT制作，序列参见下文)的合成片段如上所述使用Cof和Cor引物(表5)进行扩增。DHf和Cof引物包含相互间反向互补的序列，引入重叠在DHFR和10+标签PCR产物之间的序列，对于下一步骤是必须的，其中使用Phire热启动II DNA聚合酶(Finnzymes公司)在50μL最终体积内将两种PCR产物(各2μg，凝胶纯化的，QIAquick凝胶提取试剂盒，凯杰公司)组装在一起(以98℃进行30秒预孵育，然后循环：以98℃进行5秒退火，以72℃进行1分钟延伸7个循环)。使用Phire热启动II DNA聚合酶(Finnzymes公司)在400μL最终体积内，约100ng的纯化的(QIAquick PCR纯化试剂盒(凯杰公司))组装产物与5μM的DHf和DHr引物(表5)进行扩增(以98℃进行30秒预孵育，然后循环：以98℃进行5秒退火，以72℃进行1分钟延伸30个循环)。编码全长DHFR₁₀₊的PCR产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒(凯杰公司)进行纯化并且使用Nco I和Hind III(FastDigest，Fermentas公司)进行消化。在T7启动子的控制下，获得的插入经凝胶纯化，并通过Nco I(5’)和Hind III(3’)位点使用粘性末端连接(T4连接酶，Fermentas公司)克隆进pT7-SC1表达质粒[Miles,G.等.(2001)Biochem.40,8514-8522]。0.6μL的连接混合物通过电穿孔转化到E.

10G细胞(Lucigen公司)。转化的细菌在氨苄青霉素(100μg/ml)LB琼脂板上以37℃过夜选择。通过测序确定克隆的种类。DHFR₁₀₊的DNA和蛋白质序列如下提供，10+标签序列由DNA序列中的大写字母表示。

DHFR、DHFR₄₊和DHFR_标签构建体(图10)通过删除部分10+标签来构建，其经由如下全质粒PCR扩增以及随后的Xho I消化和单分子连接实现：使用5μM的dcr和delF(为了生成DHFR)、或2dcF(DHFR₄₊)或dcf(DHFR_标签)和Phire热启动II DNA聚合酶(Finnzymes公司)在100μL最终体积内，对约100ng的DHFR_10+标签质粒进行扩增(以98℃进行30秒预孵育，然后循环：以98℃进行5秒退火，以72℃进行1.5分钟延伸30个循环，引物序列参见表5)。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(凯杰公司)对PCR产物进行纯化，然后用Xho I(FastDigest，Fermentas公司)进行消化并用T4连接酶(Fermentas公司)连接。0.6μL的连接混合物通过电穿孔转化到E.

10G细胞(Lucigen公司)。转化的细菌在氨苄青霉素(100μg/ml)LB琼脂板上以37℃过夜选择。通过测序确定克隆的种类。

N120D AlkB突变体的构建

AlkB基因使用120D(正向)和T7终止子(反向)引物进行扩增(图5)。PCR条件是：0.3mL最终体积的PCR混合物(150μl的RED Taq ReadyMix、6μM的正向和反向引物、约400ng的模板质粒)，进行27个循环(在以95℃进行3分钟的预孵育后，使用循环方案：以95℃进行15秒变性，以55℃进行15秒退火，以72℃进行3分钟延伸)。获得的PCR产物经凝胶纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，凯杰公司)并通过MEGAWHOP方法[Miyazaki,K.(2011)MethodsEnzymol 498,399-406]克隆到pT7表达质粒(pT7-SC1)：约500ng的纯化的PCR产物与约300ng的WT AlkB环状DNA模板混合，并且使用Phire热启动II DNA聚合酶(Finnzymes)在50μL最终体积内进行扩增(以98℃进行30秒预孵育，然后循环：以98℃进行5秒退火，以72℃进行1.5分钟延伸30个循环)。环状模板通过与Dpn I(1FDU)在37℃进行2小时的孵育从去除。0.6μL获得的混合物通过电穿孔转化到50μL的E.

10G细胞(Lucigen公司)。转化的细菌在氨苄青霉素(100μg/ml)LB琼脂板上以37℃过夜生长。通过测序确定克隆的种类。

strep标签标记的AlkB-Fe⁺⁺的纯化

将含有strep标签标记的AlkB基因的T7-SC1质粒转化到E.

EXPRESS BL21(DE3)细胞(Lucigen公司)。在37℃过夜生长的补充有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上选择转化体。获得的集落以37℃(200rpm振荡)在补充有100μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基中生长到在600nm的O.D.值约为0.8。随后用来自新鲜储液(ddH₂O中25mM FeSO₄和100mM L(+)-抗坏血酸)的25μM FeSO₄和100μM L(+)-抗坏血酸(默克公司(Merck))补充培养物，并且通过补充0.5mM的IPTG诱导的蛋白质表达。细菌进一步在25℃、200rpm振荡下过夜生长。第二天，通过在4℃进行25分钟6000x g离心收获细菌。获得的沉淀在-80℃冻存直到日后使用。

AlkB-Fe⁺⁺进行如下的纯化：源自100ml培养物的细菌沉淀在补充了5μlβ-巯基乙醇(默克公司(Merck))和25μM FeSO₄和100μM L(+)-抗坏血酸的30ml裂解缓冲液(150mMNaCl、15mM Tris.HCl pH 8.0、1mM MgCl₂、0.2单位/ml DNA酶、10μg/ml细胞溶素)中重悬，并且在室温孵育20分钟。通过探头超声处理进一步破坏细菌，并且通过4℃ 6000x g离心30分钟来澄清粗裂解物。允许上清液与约150μl(微珠体积)用补充了25μM FeSO₄和100μM L(+)-抗坏血酸的清洗缓冲液(150mM NaCl、15mM Tris.HCl pH 8.0)预平衡的Strep-

(IBA)在4℃结合1小时(“上下倒置”混合)。然后将树脂上样到柱(Mirco Bio Spin，伯乐公司(Bio-Rad))内并用约20柱体积的补充了25μM FeSO₄和100μM L(+)-抗坏血酸的洗涤缓冲液以及其后约3柱体积的150mM NaCl、15mM Tris.HCl pH 8.0洗涤(金属离子可能会干扰ClyA的记录，未发表的结果，因此避免过量的铁)。随后，从柱内洗脱AlkB-Fe⁺⁺至约300μl的洗脱缓冲液(150mM NaCl、15mM Tris.HCl pH 8.0、5mM D-脱硫生物素(IBA))。纯化的AlkB-Fe⁺⁺持续具有数周活性，这与AlkB的自失活需要存在2-OG的事实一致³²。AlkB-Fe⁺⁺的浓度使用Bradford试验进行测量并且使用12％SDS-PAGE检查纯度(图12)。

strep-标签标记的DHFR_n+的纯化

在将包含strep-标签标记的DHFR_n+基因的pT7-SC1质粒转化到E.

EXPRESSBL21(DE3)细胞(Lucigen公司)之后，在补充有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上37℃过夜生长后选择转化体，获得的集落以37℃(200rpm振荡)在补充有100μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基中生长到在600的O.D.值约为0.8，之后通过添加0.5mM IPTG诱导DHFR_n+表达，并且随后切换为25℃过夜生长。第二天，通过在4℃进行25分钟6000x g离心收获细菌，并且获得的沉淀在-80℃冻存直到日后使用。

对于纯化，源自100ml培养物的细菌沉淀在30ml裂解缓冲液(150mM NaCl、15mMTris.HCl pH 7.5、1mM MgCl₂、0.2单位/ml DNA酶、10μg/ml细胞溶素)中重悬，并且在室温孵育20分钟。通过探头超声处理进一步分裂细菌，并且通过4℃ 6000x g离心30分钟来澄清粗裂解物。允许上清液与约150μl(微珠体积)用清洗缓冲液(150mM NaCl、15mM Tris.HClpH 7.5)预平衡的Strep-

(IBA)结合—“上下倒置”混合。然后将树脂上样到柱(Micro Bio Spin，伯乐公司)内并用约20柱体积的洗涤缓冲液洗涤。随后，从柱内洗脱DHFR_n+至约300μl的洗脱缓冲液(150mM NaCl、15mM Tris.HCl pH 7.5、5mM D-脱硫生物素(IBA))。DHFR_n+的浓度使用Bradford试验进行测量并且使用12％SDS-PAGE检查纯度(图13)。蛋白质在4℃(至多3周)下储存直至使用。

ClyA-AS蛋白质过表达和纯化

E.

EXPRESS BL21(DE3)细胞用含有ClyA-AS基因的pT7-SC1质粒转化。ClyA-AS包括与S.Typhi ClyA-WT相关的8个突变：C87A、L99Q、E103G、F166Y、I203V、C285S、K294R和H307Y(H307Y突变在为了纯化而添加的C-末端六聚组氨酸标签)¹⁸。在补充有100mg/L氨苄青霉素37℃的LB琼脂板上过夜生长后选择转化体。获得集落接种至含有100mg/L的氨苄青霉素的2xYT培养基。培养物在37℃以200rpm振荡下生长，直到其达到约0.8的OD₆₀₀。其后ClyA-AS的表达通过添加0.5mM IPTG进行诱导，并且在25℃继续生长。第二天，通过在4℃进行25分钟6000x g离心收获细菌，并且将沉淀储存于-80℃。

将含有单体ClyA-AS的沉淀解冻并将其重悬于20mL补充了1mM MgCl₂和0.05单位/mL的DNA酶I的洗涤缓冲液(10mM咪唑、150mM NaCl、15mM Tris.HCl、pH 8.0)，同时细菌通过声波进行裂解。通过4℃ 6000x g离心20分钟来澄清粗裂解物，并且上清液与200μL的Ni-NTA树脂(凯杰公司)在洗涤缓冲液中混合。1小时后，将树脂上样到柱(Micro Bio Spin，伯乐公司)内并用约5ml的洗涤缓冲液洗涤。使用大约0.5mL含有300mM咪唑的洗涤缓冲液洗脱ClyA-AS。蛋白质浓度通过Bradford试验确定。因为ClyA-AS单体在冷冻后不具有活性，将其储存于4℃待日后使用。

通过使用0.5％的β-十二烷基麦芽苷(DDM，GLYCON生物药剂有限公司(GLYCONBiochemicals,GmbH))在25℃对ClyA-AS单体进行15分钟的孵育获得I型ClyA-AS低聚物。通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN-PAGE，伯乐公司)，使用4至20％的聚丙烯酰胺凝胶，ClyA-AS低聚物与单体分离。将对应I型ClyA-AS的条带从凝胶中切除并将其置于补充了0.2％DDM和10mM EDTA的150mM NaCl、15mM Tris.HCl pH 8.0中，让蛋白质从凝胶中扩散出。

平面的脂质双层中的电记录

施加电位是指反式电极的电位。将ClyA-AS纳米孔从顺式隔室插入脂质双层，其与地电极相连。两隔室通过包含直径约为100μm的孔口的25μm厚的聚四氟乙烯膜(格拉汉姆·古德费勒剑桥有限公司(Goodfellow Cambridge Limited))分隔。使用约5μl的戊烷中的10％十六烷对小孔进行预处理，并且通过向两电生理学腔室添加约10μL的戊烷中的1，2-二植酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)形成双层。典型地，将0.01至0.1ng的ClyA-AS低聚物添加到顺式隔室(0.5mL)就足以获得单通道。ClyA-AS纳米孔在施加正电位时表现出比施加负电位时更高的开口孔电流，这为确定孔的方向提供了有用的工具。在150mM NaCl、15mMTris.HCl pH 8.0(AlkB实验)或150mM NaCl、15mM Tris.HCl pH 7.5(DHFR实验)中进行电记录。通过让水循环通过与腔室底部和侧面直接接触的金属壳，将记录腔室的温度维持在28℃。

数据记录和分析

来自平面双层记录的电信号使用Axopatch 200B膜片钳放大器(Axon仪器公司)进行放大并且通过Digidata 1440A/D转换器(Axon仪器公司)数字化。通过使用Clampex 10.4软件(分子设备公司(Molecular Devices))记录数据并且其后使用Clampex软件(分子设备公司)进行分析。电记录在150mM NaCl、15mM Tris.HCl pH 8.0(AlkB)或pH 7.5(DHFR)中通过应用2kHz低通贝塞耳滤波器和10kHz取样速率进行。对于痕迹进一步的分析用具有50Hz截止的贝塞耳(8孔)低通滤波器数字化地过滤。剩余电流值(I_RES％)由阻塞的孔电流值(I_B)和开孔电流值(I_O)经I_RES％＝100*I_B/I_O计算。I_B和I_O由对于至少15个单独的蛋白质阻断的所有点电流直方图(0.05pA面元)的高斯拟合确定。ΔI_RES％值使用误差传播由I_RES％计算。

由水平1的电流转换用Clamfit中的“单通道搜索(single-channel search)”功能进行分析。用于收集AlkB的配体诱导的事件的检测阈值被设置在4pA，并且忽略短于10毫秒的事件。对于DHFR_标签：MTX的NADP+和“短”NADPH结合事件，检测阈值同样被设为4Pa，并且忽略短于1毫秒的事件。获得的事件停留时间(t_off)和事件之间的时间(t_on)以累积分布合并在一起，并且拟合成单一指数，从而检索配体诱导的寿命(τ_off)和配体诱导的事件频率(f＝1/τ_on)。事件收集的过程是手动监测的。对于AlkB，τ_on和τ_off的最终值是基于衍生自至少3个处于各自浓度的单通道实验的平均值。各实验分析超过8个AlkB阻断。处于低配体浓度(0.2mM)时，测量约100个配体结合事件。否则收集超过150个事件。总计，500至1200个事件被认为是2-OG，350至2100个事件是SUC(在最低浓度收集到350个事件，其它浓度超过800个事件)并且500至1300个事件是N-OG。对于DHFR_标签：MTX，总计使用>500的NADPH和>2000的NADP+结合事件，从而确定τ_on和τ_off的值，其中t_on和t_off的个体值是由至少5个单通道实验衍生的，其各自分析超过40个DHFR_标签：MTX阻断和超过2000个配体结合事件。因为“长”NADPH结合事件对DHFR_标签：MTX二元复合物的寿命超过了二元复合物在ClyA-AS纳米孔中的滞留时间(“长”NADPH的解离只是偶尔观察到)，t_off值无法确定。NADPH的t_on值通过收集DHFR_标签：MTX二元复合物在纳米孔中的捕获和在持续时间长于0.2秒的相同阻断中转变到约4pA较高电流水平之间的时间确定。其后，t_on值以累积分布合并在一起，并且拟合成单一指数，而检索特征τ_on值。图2b和图4b中呈现的k_off值是通过取至少3个单通道实验的1/t_off的平均±标准差确定的。结合速率常数(k_on)的值由线性回归曲线确定，该线性回归曲线由事件频率(f＝1/τ_on)对配体浓度(OriginLab公司，图2b和4b)的相关性计算。图表使用Origin(OriginLab公司)或Clampfit软件(分子设备公司)制作。

实施例2：脱甲基酶作为蛋白质衔接子

大肠杆菌AlkB脱甲基酶(Mw＝25kDa)作为我们选择的第一模型蛋白质是一种球状蛋白质，预计其将通过ClyA的顺式入口，但是太大以至于无法穿过纳米孔的反式出口(图1a、b)。与铁离子组成的复合物(AlkB-Fe⁺⁺)中，AlkB共同氧化甲基化的DNA和其辅因子2-氧戊二酸盐(2-OG)，生成琥珀酸盐(SUC)、二氧化碳和甲醛(Aravind,L.和Koonin,E.V.(2001)Genome biol.2,RESEARCH0007；Trewick,S.C.(2002)Nature 419,174-178)，2-氧戊二酸盐是一种重要的代谢物，其影响衰老和与衰老相关的疾病(Chin,R.M.等(2014)Nature,510,397-401)，并且是非酒精性脂肪性肝病((Rodriguez-Gallego,E.(2015)Int.j.obesity39,279-287)、心脏衰竭和心肾综合征(Nikolaidou,T.等.(2010)Heart,96,e14)的生物标志物。尿液中琥珀酸盐的水平是肾脏损伤的生物标志物(Peti-Peterdi,J.(2014)US8652771)。

使用I型ClyA-AS(此后称为ClyA-AS)对个体AlkB-Fe⁺⁺分子进行研究。在150mMNaCl、15mM Tris HCl和pH 8.0中，ClyA-AS在宽范围的施加电位下形成的具有稳定开口孔电导(I_O＝-1.7±0.1nSi，平均值±SD，N＝38，-60mV，28℃)的纳米孔。此处及下文中N表示独立的单一纳米孔实验数量，np表示个体蛋白质阻断的数量，并且nl表示分析的配体结合事件的总数量。将AlkB-Fe⁺⁺(约4nM)添加到ClyA-AS的顺式侧引发了电流阻断(I_B)，在这里被引用为计算为开放孔电流的百分比(I_RES％)的剩余电流，由于蛋白质纳米孔较宽的顺式入口和较窄的反式出口之间的AlkB-Fe⁺⁺电渗的限制(图1b)^18,20。方便地，AlkB-Fe⁺⁺仍然陷于纳米孔中数分钟(图1c)。由AlkB-Fe⁺⁺诱导的信号在L1(I_RES％＝52.6±2.0％，n＝15，N＝7)和L2(I_RES％＝39.0±1.0％，n_p＝15，N＝7，图1c)两个截然不同的电流水平之间波动可能是由于Cly-AS纳米孔的内腔内蛋白质的两个滞留位点所导致的(Soskine,M.(2012)NanoLett.12,4895-4900)。

在-60mV，向顺式容器添加辅因子(2-OG)、等量抑制剂(N-乙二酰甘氨酸，N-OG)或处理的辅因子(SUC)诱导了在AlkB-Fe⁺⁺阻断中可逆的电流增强(ΔI_RES％＝+4.7±1.3％、+4.9±1.0和+4.6±1.3，分别地，n＝15AlkB阻断具有各AlkB阻断典型地n_p>15，n_l>75配体结合事件，N>4,N>4单通道实验，图2a，图5和6，和表1)，其显示了分别为1.7±0.5秒、1.8±0.4秒和61±11毫秒的平均持续时间(τ_off)(>4500配体结合事件，N>8单通道实验，各实验典型地分析n>10AlkB阻断)。

表1.AlkB-Fe⁺⁺诱导的电流阻断的I_RES％值。所有数据均是以-60mV施加电位在150mMNaCl、15mM Tris.HCl pH 8.0在28℃收集的。数值由15个个体AlkB阻断计算而得。误差以标准差给出。ClyA-AS开口空电导(I_o)是1.7±0.1nSi(N＝38单通道)。ΔI_RES％是AlkB-Fe⁺⁺蛋白质阻断的I_RES％和由配体诱导的I_RES％(L1B或L2B)之间的差值。蛋白质和配体添加至顺式腔室。

由L2电流水平同样观察到电流增强(图6)。我们假设这样的电流事件反映了发生在由脱-辅酶(apo-enzyme)的开口构象到AlkB-Fe⁺⁺配体结合形式的封闭状态的转变期间的构象改变(图2a)[Bleijlevens,B.等.(2008)EMBO rep.9,872-877；Bleijlevens,B.等.(2012)Biochem.2012,51,3334-3341]。为了证实该假设，我们测试了AlkB突变体，其位于120位的天冬酰胺被天冬胺酸盐(N120D)取代，而该位点被报道涉及2-OG与AlkB的结合。添加7.2mM的2-OG并没有诱导电流向N120D-AlkB-Fe⁺⁺阻断的转变(N＝4)，这表明该AlkB突变体对于2-OG的亲和性被大幅降低。正如预期的蛋白质配体结合过程，由配体结合事件的停留时间的倒数(1/τ_off)测量的解离速率常数(k_off，表2)并不依赖于配体的浓度，然而配体诱导的事件的频率(f＝1/τ_on)随着3个配体浓度线性地增加，由其斜率可以计算出将结合速率常数(k_on)(图2b，表2)。

表2.配体结合至AlkB-Fe⁺⁺的动力学参数。所有的数据在150mM NaCl、15mMTris.HCl pH 8.0中以28℃收集。误差以标准差给出。蛋白质和配体添加至顺式腔室。

AlkB阻断

AlkB-Fe⁺⁺诱导的电流阻断中约30％并未表现出配体诱导的转变，这表明被困的酶在ClyA-AS内腔中可能具有优选取向。另一解释是的AlkB-Fe⁺⁺的亚群可能由于自失活(self-inactivation)(Welford,R.W.等.(2003)J Biol Chem 278,10157-10161)、蛋白酶解、铁的损失、错误折叠等原因而失活。将并未表现出配体诱导的电流转变的AlkB阻断忽略，并且通过将电位颠倒至+60mV将酶从孔中排出。AlkB-Fe⁺⁺阻断在添加40μM的同源适体后几乎消除(图8，表5)，这表明如同之前对于另一蛋白质的报道[Soskine(2012)引用如上]，AlkB-Fe⁺⁺与适体形成复合物，其由于静电排斥和/或空间位阻，不可以被ClyA纳米孔捕获(Franceschini,L.等.(2013)Nat.Comm.4,2415)。这表明捕获的AlkB蛋白质中的大部分是自然折叠的，因此适体进化出了与折叠的AlkB结合(Krylova,S.M.等.(2011)Anal Biochem414,261-265)。

实施例3：还原酶作为蛋白质衔接子

选择大肠杆菌二氢叶酸还原酶(DHFR，Mw＝19kDa)作为第二模型蛋白质衔接子(图3a、b)。在DHFR催化循环期间，二氢叶酸被还原成四氢叶酸，并且辅因子NADPH被氧化成NADP+。四氢叶酸是许多代谢反应的辅因子，因此DHFR的抑制剂，如甲氨蝶呤(MTX)是抗生素或抗癌剂。NADP+和NADPH细胞内浓度的比例被用于检测细胞中的氧化应激(Ogasawara,Y.等.(2009)Biol.&pharmaceut.bull.32,1819-1823)。我们发现小于AlkB的脱-DHFR(apo-DHFR)仅在ClyA-AS中停留几毫秒。在添加MTX到顺式溶液之后，蛋白质阻断的频率和停留时间降低，然而剩余电流增加。通过随后向相同侧添加NADPH，阻隔被消除(图11)。因为抑制剂和辅因子都是带负电荷的，这些结果表明额外的负电荷增加了电泳的/静电的拖拽力，其阻碍DHFR进入以及滞留在纳米孔中。为了提高蛋白质的滞留时间，我们通过在蛋白质的C末端引入在含有4个额外正电荷的多肽标签对DHFR进行工程改造(DHFR_标签，图10)。在与MTX组成的复合物的情况下，添加到顺式隔室的DHFR_标签诱导平均停留时间为3.1±1.4秒(N＝5，n_p＝230，图3c)的电流阻断，其比DHFR_标签或DHFR：MTX阻断平均停留时间长3个量级。对于这一结果可能的解释是由于额外的正电荷的调整，二元DHFR_标签：MTX复合物在纳米孔中处于最低电位，而电渗、电泳、静电力都是平衡的。MTX由二元复合物的解离比该复合物在纳米孔中的滞留时间缓慢，并且不可以通过离子电流记录观察到。正如前述脱-AlkB-Fe⁺⁺(apo-AlkB-Fe⁺⁺)所示，DHFR_标签：MTX阻断显示了较少出现第二电流水平L2(L2_M，I_RES％,＝53.5±0.9％，n_p＝25，N＝5，图3c)的主要电流水平L1(L1_M，_RES％＝74.7±0.5％，n_p＝25,N＝5)。

在–90mV向ClyA-AS的反式隔室添加氧化的辅因子NADP+产生对于在顺式溶液中形成的DHFR_标签：MTX复合物阻断可逆的电流增强(L1_M:N+，ΔI_RES％＝+2.3±0.5％，n_p＝15阻断，n_l>225，N＝3；和τ_M:N+＝102±11ms，n_l＝19,000，N＝9n_p>800，图4a，表3，图7)。结合和解离速率常数可由滴定实验测量(图4b，表4)。

加入反式隔室的NADPH同样诱导对于二元复合物阻断额外的电流增强(图4a)。显著地，由NADPH诱导的电流事件表现出比NADPH+阻断(ΔI_RES％＝+2.3±0.5％)稍高一些的剩余电流(L1_M:NH，ΔI_RES％＝+2.7±0.7％，n_p＝15n_l＝15，N＝4，表3)，并且具有比纳米孔中三元复合物的滞留时间更长的停留时间(图4a)。因此，尽管NADPH和NADP+(氢负离子)之间微小的不同，两个配体与DHFR_标签：MTX的结合可以是明显不同的(图4a)。

表3.DHFR_标签:MTX配体诱导的电流阻断的I_RES％值。所有数据均是以-90mV施加电位在150mM NaCl、15mM Tris.HCl pH 7.5在28℃收集的。数值由至少15个个体DHFR_标签:MTX阻断计算而得。误差以标准差给出。ClyA-AS开口孔电导(I_o)是1.6±0.1nSi(N＝15单通道)。ΔI_RES％是DHFR_标签:MTX阻断的I_RES％和由配体诱导的I_RES％(L1B或L2B)之间的差值。50nM的DHFR_标签和400nM MTX添加到顺式腔室，NADPH和NADP+添加到反式腔室。

表4.配体结合至DHFR_标签:MTX的动力学参数。所有的数据在150mM NaCl、15mMTris.HCl pH 7.5中以28℃收集。误差以标准差给出。50nM的DHFR_标签和400nM MTX添加到顺式腔室，NADPH和NADP+添加到反式腔室。

虽然NADP+和NADPH与MTX：DHFR结合的体积动力学常数(bulk kinetic constant)无法从文献中获得，但2-OG与AlkB-Mn⁺⁺结合的平衡解离常数最近通过固有色氨酸荧光淬灭试验测出(K_D ^体积＝4.1±0.6 10^-6M于24℃)(Ergel,B.等.(2014)J biol chem 289,29584-29601)。通过比较，由结合和解离常数的比率(K_D ^孔＝k_off/k_on)测量出的2-OG对于纳米孔内AlkB-Fe⁺⁺的平衡解离常数比体积值(K_D ^孔＝3.7±1.9 10^-4M，-60mV，28℃)高2个量级。这一影响可能与纳米孔内AlkB-Fe⁺⁺的限制以及施加电位的影响有关。ClyA纳米孔具有负电荷的内部并且因此具有阳离子选择性(Ludwig,A.等.(1999)Mol.Microbiol.31,557-567)。因此，在负电位施加下(反式)，添加到顺式溶液的带负电荷的配体的通过纳米孔的扩散很可能是相反的。这可能由于配体和纳米孔内腔壁之间不利的静电作用而进一步加剧。这一问题可以通过使用具有相反符号的内部电荷的纳米孔克服。

DHFR_标签：MTX阻断和NAPDH结合事件中的异质性

大约45％的DHFR_标签：MTX阻断并不响应NADP+的添加(添加在反式中，图9c、d)。由于ClyA-AS捕获的所有观察到的DHFR_标签分子都结合至MTX，这种效果不太可能是由于错误折叠的DHFR分子造成的。此外，当将NADPH添加到反式腔室时，观察到两种不同的DHFR_标签：MTX阻断群：第一种(约55％的阻断)使得NADPH结合事件具有长于复合物在Cly-AS内滞留时间的寿命(寿命>3秒，“长”NADPH事件)，第二群(约45％的阻断)对应显示具有38.5±0.8毫秒寿命的NADPH结合事件(“短”NADPH事件)的DHFR_标签：MTX阻断。大部分的阻断显示“长”或“短”NADPH事件(图9a)。然而极少地，相同的DHFR_标签：MTX阻断在两种NADPH结合行为之间切换(图9b)。“长”和“短”NADPH事件表现出相似的结合速率常数(分别为k_on＝4.8±1.2s^-1μM^-1和k_on＝5.8±1.2s^-1μM^-1)以及相似的Δ_IRES％值(分别为2.7±0.7％和2.2±0.9％，图9a、b)。尽管“短”NADPH结合事件可以是源自NADP+污染，但这是不可能的，因为每次实验都是使用新鲜的NADPH等分试样(纯度>95％)。而且，“短”NADPH事件的寿命显著地短于NADP+事件的寿命。此外，事实上大多数DHFR_标签：MTX阻断只显示一种结合行为，这表明观察到的异质性并不是由于底物样品中的杂质所引起的，而是由于蛋白质衔接子中的异质性所导致的(图9)。结合行为中的这种可变性还可以由于ClyA-AA纳米孔内DHFR_标签：MTX不同的构象和/或由于DHFR_标签：MTX复合物的不同构象所引起。虽然第一个假设不可以被轻易的测试，但是值得注意的是之前的研究揭示了MTX可以以对于NADP+和NADPH不同的结合亲和性结合两种不同的DHFR构象(Rajagopalan,P.T.等.(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99,13481-13486)。

为最佳纳米孔滞留调节DHFR纳米孔衔接子

我们最初的DHFR构建体是由来自大肠杆菌的DHFR组成的，其具有分别被丙氨酸和丝氨酸取代了85和152位的半胱氨酸残基的并且具有C末端Strep-标签，其中C末端Strep-标签是为了纯化的目的而插入的，并且被9个氨基酸长的接头(参见后文)所隔开。融合标签多肽链相对于野生型序列(源自在蛋白质的DNA序列中引入的Xho I限制性位点)包含一个额外的净正电荷。将DHFR(50nM，图10)添加到顺式隔室在–90mV的施加电位下诱导了对ClyA-AS开口孔电流的瞬时阻断，其具有71.5±0.8％的I_RES％和21±2毫秒的寿命(n＝200阻断，N＝4单通道)(图11a，左侧)。后续将400nM的MTX添加到顺式隔室导致了I_RES％值增加(I_RES％＝78.4±0.6％)而寿命降低(3.3±0.7毫秒，n＝300阻断，N＝3单通道，图11a，中间)的阻断。进一步将20μM NADPH添加到相同的隔室导致了DHFR阻断几乎完全消失(图11a，右侧)，这表明DHFR：MTX：NADPH复合物大部分被ClyA-AS纳米孔排除。因此，尽管我们可以观察配体和DHFR之间的相互作用，但是蛋白质并不在ClyA-AS纳米孔内保留足够长的时间以确定结合动力学，这促使我们设计能够在ClyA-AS纳米孔内具有更长的滞留时间的DHFR构建体。

为了提高DHFR在ClyA中的滞留时间，我们已经设计并测试了用不同数量整合至柔性C末端融合标签的正电荷修饰的三种DHFR构建体。我们预计由于带负电荷的蛋白质(DHFR的pI是4.8)和带负电荷的纳米孔内腔(Soskine(2013)，引用如上)之间静电排斥的降低，以及在负电位施加下对于DHFR电泳拖拽的减少，这些额外的电荷将会延长三元复合物在ClyA-AS纳米孔内的停留时间。最初我们测试了DHFR₁₀₊，其是由相对于野生型DHFR具有携带10净正电荷的C末端重组标签的DHFR基因组成的。10+标签的序列包含衍生自胰核糖核酸酶A的S-标签(KETAAAKFERQHMDS)(SEQ ID NO:16)，其后带正电荷的卷曲(KIAALKQKIAALKYKNAALKKKIAALKQ，通过参考文献40获得)(SEQ ID NO:17)(表6)，以及用于简易纯化的Strep标签。DHFR和三个标签通过柔性接头隔开(图10)。由于我们无法预测带正电荷的标签和接头长度对DHFR阻断的影响，我们同样设计了具有较短标签和较少数量的额外正电荷的两个构建体：各自携带4和5净正电荷的DHFR₄₊和DHFR_标签(图10)。

DHFR₁₀₊、DHFR₄₊和DHFR_标签对ClyA-AS纳米孔诱导快速的电流阻断，其在结合MTX之后转换成第二长的阻断(图11)。DHFR_{10+/4+/标签}：MTX阻断显著地长于DHFR：MTX阻断(例如，DHFR_标签：MTX阻断的寿命是DHFR：MTX阻断的约1000倍)，这表示带正电荷的标签高效地抵消了由MTX结合所诱导的静电和电泳效应(图11)。尽管由DHFR_{10+/4+/标签}：MTX复合物诱导的阻断通过剩余离子电流的约4pA增强报告了NADPH的结合(图11b、c、d，右侧)，DHFR₁₀₊和DHFR₄₊阻断产生了不理想的输出信号。DHFR₁₀₊阻断的剩余电流常常切换至较低电导的水平(图11b，中间和右侧)，而NADPH与DHFR₄₊：MTX的结合促进复合物从孔中快速释放，这表示4个额外的正电荷不足以将三元复合物保持在空内(图11c，右侧)。另一方面，为了准确进行动力学分析，对DHFR_标签：MTX：NADPH进行足够时间的内化，并且因此将其选作我们的纳米孔衔接子进行全面表征。

实施例5使用捕蝇草结构域对分析物进行检测

周质结合蛋白质(PBP)的捕蝇草结构域家族可以提供理想的蛋白质衔接子，这是因为：1)它们所具有的结构域具有细长的形状，这样的形状似乎在纳米孔内良好契合，并且提供了安静的阻塞的孔信号(图14)。2)结构域包含2个瓣叶(lobe)，其经过大的构象变化紧密结合在底物上。3)周质结合蛋白质(PBP)通过与内细胞膜中的转运蛋白偶联来清除或感知环境中不同的营养物质，因此它们以高亲和性和选择性结合生理或技术上相关底物。4)它们结合数以百计的底物和代谢物(B12维生素、许多糖、氨基酸、神经递质等)。

5)底物结合似乎是由8残基基序进行调节，15个这样的靶向突变可以允许调整对于目标分析物的选择性以满足实验需要。

结论

天冬酰胺传感器

SBD1与天冬酰胺的相互作用使用I型ClyA-AS纳米孔进行采样。ClyA-AS(C87A/L99Q/E103G/F166Y/I203V/C285S/K294R/H307Y)。150mM NaCl和15mM Tris-HCl(pH 7.5)中，将74nM的SBD1添加到I型ClyA-AS的顺式隔室在负电位施加下(反式)诱导了瞬时电流阻断。在-60mV时，阻断显示具有I_res％＝67.6±0.1％(N＝5)的剩余电流(I_res％＝I_B/I₀x 100)的一个主要水平(水平I，图15A、B)。每隔3.5±0.1秒^-1(平均值±标准差，n＝212)，电流切换至具有109±1毫秒(平均值±标准差，n＝340)寿命的水平II。蛋白质阻断在4.2±1.8秒(平均值±标准差，n＝291)后自发地释放。在天冬酰胺(浓度范围从200nM到4μM，图15B)添加之后，水平II的频率增加(图15B)，这表明电流阻断是由于精氨酸与纳米孔内的SBD1衔接子的结合所导致的。一含有突变E184W的无活性SBD1变体在-60mV表现出与I型ClyA-AS孔相似的阻断(I_res％＝66.7)。然而，添加了上至1mM的天冬酰胺仍未显示任何水平II阻断，这表示水平II阻断证实了SBD1的封闭构象或天冬酰胺结合。

解离常数通过对底物进行滴定并绘制由全点电流直方图的面积确定的相对封闭群(CL/(O+CL))与浓度的图进行确定。将该曲线拟合成一位点结合等温线，得到0.47±0.03μM的K_d值(图15C)，这与之前所述通过smFRET和等温滴定量热法(ITC)(Gouridis,G.等.(2015)Nature struct.&mol.biol.22,57-64)获得的值一致。封闭和开口速率常数分别由开口和封闭状态寿命的对数确定，并相对于天冬酰胺浓度进行作图。封闭速率线性依赖于底物浓度，并且线性拟合的斜率给出k_封闭＝1.2x 10⁷秒^-1M^-1。开孔速率常数并未表现出浓度依赖性，并且k_开口的值是通过零9.4秒^-1的截距确定的(图15D)。

谷氨酰胺传感器

SBD2与谷氨酰胺的相互作用使用I型ClyA-AS纳米孔在-100mV进行采样。72nM的SBD2的添加诱导了在水平I(I_res％＝63.6±0.3％，τ＝256±5ms，N＝3)和水平III(I_res％＝61.0±0.2％，τ＝145±13ms，N＝3)两个水平之间波动的电流阻断。蛋白质阻断保留在纳米孔中3.9±0.7秒(平均值±标准差，n＝225)。电流极少到达额外的离子电流水平——水平II(I_res％＝62.5±0.3％，τ＝18±1毫秒，n＝856,N＝3)。

我们通过逐步从200nM至3μM浓度范围添加谷氨酰胺研究了配体结合。在添加谷氨酰胺之后，水平II的频率随着谷氨酰胺浓度线性增加，这表明这一水平是谷氨酰胺结合状态。添加上至200μM谷氨酰胺到作为一种不可以封闭的变体的SBD2(D417F)，并没有表现出人任何水平II阻断；尽管仍然观察到水平I和水平II之间的转换(图17A)。这些结果进一步表明水平II对应谷氨酰胺结合(图16A)，而水平I和III可以表示纳米孔内蛋白质的不同构象。结合速率经上述由寿命确定。再将结合速率曲线线性拟合之后，确定来自水平I和III的谷氨酰胺结合速率。来自水平I(k_on＝3.7x 10⁷秒^-1M^-1)的谷氨酰胺结合表现出与水平II(k_on＝3.8x 10⁷秒^-1M^-1)几乎相同的速率(图3C)。开口速率常数通过在零k_off＝39.7秒¹的截距确定。获得的谷氨酰胺结合到SBD2的K_d值(1.27±0.14μM，图16B)与之前所述通过smFRET和ITC(Gouridis,G.等.(2015)Nature struct.&mol.biol.22,57-64)获得的值一致。

葡萄糖传感器

初步的结果表明来自大肠杆菌的葡萄糖结合蛋白(GBP)的捕蝇草结构域可以是用于葡萄糖传感器的良好蛋白质衔接子。GBP表现出低背景信号(图18)以及约2秒的平均滞留时间。有趣的是，在不存在配体时，我们观察到两个电流水平，这可能反应了蛋白质的开口和封闭构象(图18b至c)。将葡萄糖添加到顺式溶液增加了一个水平的停留时间(推测是封闭状态，图18)，这表明与配体和纳米孔的结合相关的构象变化可以被观察到。根据美国FDA推荐，葡萄糖传感器应检测浓度在1.65和22mM之间的葡萄糖(Yoo,E.-H.和Lee,S.-Y.(2010)Sensors 10,4558-4576)。GBP对葡萄糖的灵敏度高约1000倍，这表明在数秒内基于GBP的传感器可以测量血液中葡萄糖的浓度。此外，还可在如唾液或汗液的其它体液中测量葡萄糖，这些体液中的葡萄糖浓度非常低(分别为8-210μM⁴和0.277–1.11mM(Makaram,P.等.(2014)Diagnostics 4,27-46；Moyer,J.等.(2012)Diabetes Technology&Therapeutics 14,398-402)。基于GBP的装置将不会要求“手指点刺”。

实施例6.Cly突变体在蛋白质识别上的作用

对ClYA-AS纳米孔内几个突变(图19)进行测试以发现纳米孔内哪个位置允许更好的识别。我们将人凝血酶(HT)用做模型系统。当添加到纳米孔的顺式侧之时，HT进入纳米孔并且在L1和L2结合位点间切换(图19B)。在高施加电位时，L2的填充比L1多(图19c)。为了测试ClyA-AS中的识别点，我们将纳米孔内几个位置取代成色氨酸残基(W)(图19A)。L1和L2在不同电位的占有率取决于测试的突变体(图19C)。在49、56和60位的取代具有最强的效果，从而揭示了纳米孔内HT的潜在结合位点。

此外，检测了分析物与嵌入纳米孔内的蛋白质的结合(图20A，SBD2)。

我们发现对于底物的识别通过在56位放置色氨酸残基增加。56或60位放置赖氨酸残基使识别降低。

实施例7本发明公开的引物和适配子序列

序列表

<110> 鲁汶天主教大学（Katholieke Universiteit Leuven）

G·马格利亚（Maglia, Giovanni）

M·索斯堪（Soskine, Mikhael）

A·别斯曼斯（Biesemans, Annemie）

V·范米维尔特（Van Meervelt, Veerle）

B·珀尔曼（Poolman, Bert）

G·斯胡尔曼斯-沃尔特斯（Schuurman-Wolters, Gea K）

<120> 具有内部蛋白质衔接子的纳米孔

<130> KUL3934CN

<140> PCT/EP2016/058252

<141> 2016-04-14

<150> GB1506307.6

<151> 2015-04-14

<150> GB1507264.8

<151> 2015-04-29

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 305

<212> PRT

<213> 伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）

<400> 1

Met Ile Met Thr Gly Ile Phe Ala Glu Gln Thr Val Glu Val Val Lys

1 5 10 15

Ser Ala Ile Glu Thr Ala Asp Gly Ala Leu Asp Leu Tyr Asn Lys Tyr

20 25 30

Leu Asp Gln Val Ile Pro Trp Lys Thr Phe Asp Glu Thr Ile Lys Glu

35 40 45

Leu Ser Arg Phe Lys Gln Glu Tyr Ser Gln Glu Ala Ser Val Leu Val

50 55 60

Gly Asp Ile Lys Val Leu Leu Met Asp Ser Gln Asp Lys Tyr Phe Glu

65 70 75 80

Ala Thr Gln Thr Val Tyr Glu Trp Cys Gly Val Val Thr Gln Leu Leu

85 90 95

Ser Ala Tyr Ile Leu Leu Phe Asp Glu Tyr Asn Glu Lys Lys Ala Ser

100 105 110

Ala Gln Lys Asp Ile Leu Ile Arg Ile Leu Asp Asp Gly Val Lys Lys

115 120 125

Leu Asn Glu Ala Gln Lys Ser Leu Leu Thr Ser Ser Gln Ser Phe Asn

130 135 140

Asn Ala Ser Gly Lys Leu Leu Ala Leu Asp Ser Gln Leu Thr Asn Asp

145 150 155 160

Phe Ser Glu Lys Ser Ser Tyr Phe Gln Ser Gln Val Asp Arg Ile Arg

165 170 175

Lys Glu Ala Tyr Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ile Val Ala Gly Pro Phe

180 185 190

Gly Leu Ile Ile Ser Tyr Ser Ile Ala Ala Gly Val Ile Glu Gly Lys

195 200 205

Leu Ile Pro Glu Leu Asn Asn Arg Leu Lys Thr Val Gln Asn Phe Phe

210 215 220

Thr Ser Leu Ser Ala Thr Val Lys Gln Ala Asn Lys Asp Ile Asp Ala

225 230 235 240

Ala Lys Leu Lys Leu Ala Thr Glu Ile Ala Ala Ile Gly Glu Ile Lys

245 250 255

Thr Glu Thr Glu Thr Thr Arg Phe Tyr Val Asp Tyr Asp Asp Leu Met

260 265 270

Leu Ser Leu Leu Lys Gly Ala Ala Lys Lys Met Ile Asn Thr Cys Asn

275 280 285

Glu Tyr Gln Gln Arg His Gly Lys Lys Thr Leu Phe Glu Val Pro Asp

290 295 300

Val

305

<210> 2

<211> 312

<212> PRT

<213> 伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）

<400> 2

Met Thr Gly Ile Phe Ala Glu Gln Thr Val Glu Val Val Lys Ser Ala

1 5 10 15

Ile Glu Thr Ala Asp Gly Ala Leu Asp Leu Tyr Asn Lys Tyr Leu Asp

20 25 30

Gln Val Ile Pro Trp Lys Thr Phe Asp Glu Thr Ile Lys Glu Leu Ser

35 40 45

Arg Phe Lys Gln Glu Tyr Ser Gln Glu Ala Ser Val Leu Val Gly Asp

50 55 60

Ile Lys Val Leu Leu Met Asp Ser Gln Asp Lys Tyr Phe Glu Ala Thr

65 70 75 80

Gln Thr Val Tyr Glu Trp Cys Gly Val Val Thr Gln Leu Leu Ser Ala

85 90 95

Tyr Ile Gln Leu Phe Asp Gly Tyr Asn Glu Lys Lys Ala Ser Ala Gln

100 105 110

Lys Asp Ile Leu Ile Arg Ile Leu Asp Asp Gly Val Lys Lys Leu Asn

115 120 125

Glu Ala Gln Lys Ser Leu Leu Thr Ser Ser Gln Ser Phe Asn Asn Ala

130 135 140

Ser Gly Lys Leu Leu Ala Leu Asp Ser Gln Leu Thr Asn Asp Phe Ser

145 150 155 160

Glu Lys Ser Ser Tyr Tyr Gln Ser Gln Val Asp Arg Ile Arg Lys Glu

165 170 175

Ala Tyr Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ile Val Ala Gly Pro Phe Gly Leu

180 185 190

Ile Ile Ser Tyr Ser Ile Ala Ala Gly Val Ile Glu Gly Lys Leu Ile

195 200 205

Pro Glu Leu Asn Asn Arg Leu Lys Thr Val Gln Asn Phe Phe Thr Ser

210 215 220

Leu Ser Ala Thr Val Lys Gln Ala Asn Lys Asp Ile Asp Ala Ala Lys

225 230 235 240

Leu Lys Leu Ala Thr Glu Ile Ala Ala Ile Gly Glu Ile Lys Thr Glu

245 250 255

Thr Glu Thr Thr Arg Phe Tyr Val Asp Tyr Asp Asp Leu Met Leu Ser

260 265 270

Leu Leu Lys Gly Ala Ala Lys Lys Met Ile Asn Thr Ser Asn Glu Tyr

275 280 285

Gln Gln Arg His Gly Arg Lys Thr Leu Phe Glu Val Pro Asp Val Gly

290 295 300

Ser Ser His His His His His His

305 310

<210> 3

<211> 312

<212> PRT

<213> 伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）

<400> 3

Met Thr Gly Ile Phe Ala Glu Gln Thr Val Glu Val Val Lys Ser Ala

1 5 10 15

Ile Glu Thr Ala Asp Gly Ala Leu Asp Leu Tyr Asn Lys Tyr Leu Asp

20 25 30

Gln Val Ile Pro Trp Lys Thr Phe Asp Glu Thr Ile Lys Glu Leu Ser

35 40 45

Arg Phe Lys Gln Glu Tyr Ser Gln Glu Ala Ser Val Leu Val Gly Asp

50 55 60

Ile Lys Val Leu Leu Met Asp Ser Gln Asp Lys Tyr Phe Glu Ala Thr

65 70 75 80

Gln Thr Val Tyr Glu Trp Ala Gly Val Val Thr Gln Leu Leu Ser Ala

85 90 95

Tyr Ile Gln Leu Phe Asp Gly Tyr Asn Glu Lys Lys Ala Ser Ala Gln

100 105 110

Lys Asp Ile Leu Ile Arg Ile Leu Asp Asp Gly Val Lys Lys Leu Asn

115 120 125

Glu Ala Gln Lys Ser Leu Leu Thr Ser Ser Gln Ser Phe Asn Asn Ala

130 135 140

Ser Gly Lys Leu Leu Ala Leu Asp Ser Gln Leu Thr Asn Asp Phe Ser

145 150 155 160

Glu Lys Ser Ser Tyr Tyr Gln Ser Gln Val Asp Arg Ile Arg Lys Glu

165 170 175

Ala Tyr Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ile Val Ala Gly Pro Phe Gly Leu

180 185 190

Ile Ile Ser Tyr Ser Ile Ala Ala Gly Val Val Glu Gly Lys Leu Ile

195 200 205

Pro Glu Leu Asn Asn Arg Leu Lys Thr Val Gln Asn Phe Phe Thr Ser

210 215 220

Leu Ser Ala Thr Val Lys Gln Ala Asn Lys Asp Ile Asp Ala Ala Lys

225 230 235 240

Leu Lys Leu Ala Thr Glu Ile Ala Ala Ile Gly Glu Ile Lys Thr Glu

245 250 255

Thr Glu Thr Thr Arg Phe Tyr Val Asp Tyr Asp Asp Leu Met Leu Ser

260 265 270

Leu Leu Lys Gly Ala Ala Lys Lys Met Ile Asn Thr Ser Asn Glu Tyr

275 280 285

Gln Gln Arg His Gly Arg Lys Thr Leu Phe Glu Val Pro Asp Val Gly

290 295 300

Ser Ser Tyr His His His His His

305 310

<210> 4

<211> 1194

<212> DNA

<213> 伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）

<400> 4

cctgcgtaga taagcaggaa gcaggcagta tttccagctt ctggaatgtt aaagctacaa 60

aagttgtctg gaggtaatag gtaagaatac tttataaaac aggtacttaa ttgcaattta 120

tatatttaaa gaggcaaatg attatgaccg gaatatttgc agaacaaact gtagaggtag 180

ttaaaagcgc gatcgaaacc gcagatgggg cattagatct ttataacaaa tacctcgacc 240

aggtcatccc ctggaagacc tttgatgaaa ccataaaaga gttaagccgt tttaaacagg 300

agtactcgca ggaagcttct gttttagttg gtgatattaa agttttgctt atggacagcc 360

aggacaagta ttttgaagcg acacaaactg tttatgaatg gtgtggtgtc gtgacgcaat 420

tactctcagc gtatatttta ctatttgatg aatataatga gaaaaaagca tcagcccaga 480

aagacattct cattaggata ttagatgatg gtgtcaagaa actgaatgaa gcgcaaaaat 540

ctctcctgac aagttcacaa agtttcaaca acgcttccgg aaaactgctg gcattagata 600

gccagttaac taatgatttt tcggaaaaaa gtagttattt ccagtcacag gtggatagaa 660

ttcgtaagga agcttatgcc ggtgctgcag ccggcatagt cgccggtccg tttggattaa 720

ttatttccta ttctattgct gcgggcgtga ttgaagggaa attgattcca gaattgaata 780

acaggctaaa aacagtgcaa aatttcttta ctagcttatc agctacagtg aaacaagcga 840

ataaagatat cgatgcggca aaattgaaat tagccactga aatagcagca attggggaga 900

taaaaacgga aaccgaaaca accagattct acgttgatta tgatgattta atgctttctt 960

tattaaaagg agctgcaaag aaaatgatta acacctgtaa tgaataccaa caaagacacg 1020

gtaagaagac gcttttcgag gttcctgacg tctgatacat tttcattcga tctgtgtact 1080

tttaacgccc gatagcgtaa agaaaatgag agacggagaa aaagcgatat tcaacagccc 1140

gataaacaag agtcgttacc gggctgacga ggttatcagg cgttaagctg gtag 1194

<210> 5

<211> 971

<212> DNA

<213> 伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）

<400> 5

atgacgggta tctttgcgga acagacggtg gaagttgtga aaagtgcgat tgaaacggct 60

gacggtgcgc tggacctgta taataaatat ctggatcagg tcatcccgtg gaaaaccttt 120

gacgaaacga ttaaagaact gagccgtttc aaacaggaat acagtcaaga agcgtccgtc 180

ctggtgggcg atatcaaagt gctgctgatg gattctcagg acaaatattt tgaagctacc 240

caaacggttt acgaatggtg tggtgtggtt acccagctgc tgtccgcata tattcagctg 300

ttcgatggat acaacgagaa aaaagcgagc gcgcagaaag acattctgat ccgcattctg 360

gatgacggcg tgaaaaaact gaatgaagcc cagaaatcgc tgctgaccag ctctcaatca 420

tttaacaatg cctcgggtaa actgctggca ctggatagcc agctgacgaa cgacttttct 480

gaaaaaagtt cctattacca gagccaagtc gatcgtattc gtaaagaagc ctacgcaggt 540

gccgcagcag gtattgtggc cggtccgttc ggtctgatta tctcatattc gattgctgcg 600

ggcgttatcg aaggtaaact gattccggaa ctgaacaatc gtctgaaaac cgttcagaac 660

tttttcacca gtctgtctgc tacggtcaaa caagcgaata aagatatcga cgccgcaaaa 720

ctgaaactgg ccacggaaat cgctgcgatt ggcgaaatca aaaccgaaac ggaaaccacg 780

cgcttttatg ttgattacga tgacctgatg ctgagcctgc tgaaaggtgc cgcgaagaaa 840

atgattaata cctctaatga atatcagcag cgtcacggta gaaaaaccct gtttgaagtc 900

ccggatgtgg gcagcagcca ccaccatcat caccactaaa agcttggatc cggctgctaa 960

caaagcccga a 971

<210> 6

<211> 945

<212> DNA

<213> 伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）

<400> 6

atgacgggta tctttgcgga acagacggtg gaagttgtga aaagtgcgat tgaaacggct 60

gacggtgcgc tggacctgta taataaatat ctggatcagg tcatcccgtg gaaaaccttt 120

gacgaaacga ttaaagaact gagccgtttc aaacaggaat acagtcaaga agcgtccgtc 180

ctagtgggcg atatcaaagt gctgctgatg gattctcagg acaaatattt tgaagctacc 240

caaacggttt acgaatgggc gggtgtggtt acccagctgc tgtccgcata tattcagctg 300

ttcgatggat acaatgagaa aaaagcgagc gcgcagaaag acattctgat ccgcattctg 360

gatgacggcg tgaaaaaact gaatgaagcc cagaaatcgc tgctgaccag ctctcaatca 420

tttaacaatg cctcgggtaa actgctggca ctggatagcc agctgacgaa cgacttttct 480

gaaaaaagtt cctattacca gagccaagtc gatcgtattc gtaaagaagc ctacgcaggt 540

gccgcagcag gtattgtggc cggtccgttc ggtctgatta tctcatattc aattgctgcg 600

ggcgttgtcg aaggtaaact gattccggaa ctgaacaatc gtctgaaaac cgttcagaac 660

tttttcacca gtctgtctgc tacggtcaaa caagcgaata aagatatcga cgccgcaaaa 720

ctgaaactgg ccacggaaat cgctgcgatt ggcgaaatca aaaccgaaac ggaaaccacg 780

cgcttttatg ttgattacga tgacctgatg ctgagcctgc tgaaaggtgc cgcgaagaaa 840

atgattaata cctctaatga atatcagcag cgtcacggta gaaaaaccct gtttgaagtc 900

ccggatgtgg gcagcagcta ccaccatcat caccactaaa agctt 945

<210> 7

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 7

Met Ala Leu Asp Leu Phe Ala Asp Ala Glu Pro Trp Gln Glu Pro Leu

1 5 10 15

Ala Ala Gly Ala Val Ile Leu Arg Arg Phe Ala Phe Asn Ala Ala Glu

20 25 30

Gln Leu Ile Arg Asp Ile Asn Asp Val Ala Ser Gln Ser Pro Phe Arg

35 40 45

Gln Met Val Thr Pro Gly Gly Tyr Thr Met Ser Val Ala Met Thr Asn

50 55 60

Cys Gly His Leu Gly Trp Thr Thr His Arg Gln Gly Tyr Leu Tyr Ser

65 70 75 80

Pro Ile Asp Pro Gln Thr Asn Lys Pro Trp Pro Ala Met Pro Gln Ser

85 90 95

Phe His Asn Leu Cys Gln Arg Ala Ala Thr Ala Ala Gly Tyr Pro Asp

100 105 110

Phe Gln Pro Asp Ala Cys Leu Ile Asn Arg Tyr Ala Pro Gly Ala Lys

115 120 125

Leu Ser Leu His Gln Asp Lys Asp Glu Pro Asp Leu Arg Ala Pro Ile

130 135 140

Val Ser Val Ser Leu Gly Leu Pro Ala Ile Phe Gln Phe Gly Gly Leu

145 150 155 160

Lys Arg Asn Asp Pro Leu Lys Arg Leu Leu Leu Glu His Gly Asp Val

165 170 175

Val Val Trp Gly Gly Glu Ser Arg Leu Phe Tyr His Gly Ile Gln Pro

180 185 190

Leu Lys Ala Gly Phe His Pro Leu Thr Ile Asp Cys Arg Tyr Asn Leu

195 200 205

Thr Phe Arg Gln Ala Gly Lys Lys Glu Gly Ser Ala Trp Ser His Pro

210 215 220

Gln Phe Glu Lys

225

<210> 8

<211> 694

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 8

atggcgttgg atctgtttgc cgatgctgaa ccgtggcaag agccactggc ggctggtgcg 60

gtaattttac ggcgttttgc ttttaacgct gcggagcaac tgatccgcga tattaatgac 120

gttgccagcc agtcgccgtt tcgccagatg gtcacccccg ggggatatac catgtcggtg 180

gcgatgacca actgtgggca tctgggctgg acgacccatc ggcaaggtta tctctattcg 240

cccattgatc cgcaaacaaa taaaccgtgg cccgccatgc cacagagttt tcataattta 300

tgtcaacgtg cggctacggc ggcgggctat ccagatttcc agccagatgc ttgtcttatc 360

aaccgctacg ctcctggcgc gaaactgtcg ctgcatcagg ataaagacga accggatctg 420

cgcgcgccaa ttgtttctgt ttctctgggc ttacccgcga tttttcaatt tggcggcctg 480

aaacgaaatg atccgctcaa acgtttgttg ttggaacatg gcgatgtggt ggtatggggc 540

ggtgaatcgc ggctgtttta tcacggtatt caaccgttga aagcggggtt tcatccactc 600

accatcgact gccgctacaa cctgacattc cgtcaggcag gtaaaaaaga aggcagcgcg 660

tggagccatc cgcagtttga aaaatgataa gctt 694

<210> 9

<211> 691

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 9

atggcttcgg ctatgatttc tctgattgcg gcactggctg tcgatcgtgt tattggtatg 60

gaaaacgcta tgccgtggaa tctgccggct gatctggcgt ggtttaaacg taacactctg 120

gacaagccgg tcattatggg ccgccatacg tgggaaagca tcggtcgtcc gctgccgggt 180

cgcaaaaata ttatcctgag cagccagccg ggcaccgatg accgtgtgac gtgggttaag 240

agcgtcgatg aagcaattgc ggcggcaggc gacgtgccgg aaattatggt tatcggcggt 300

ggccgcgttt atgaacagtt cctgccgaaa gcccaaaagc tgtacctgac ccatatcgat 360

gcagaagtcg aaggtgatac gcactttccg gactatgaac cggatgactg ggaaagtgtg 420

ttctccgaat ttcacgacgc cgacgctcag aacagccact catactcatt cgaaatcctg 480

gaacgccgtg gcagcagtac tcgagcgaaa gaaaccgcgg cggcgaaatt tgaacgccag 540

catatggata gcggcagcgc gaaaattgcc gcacttaaac aaaaaatcgc ggcgctgaag 600

tataaaaatg cggcactaaa aaagaagatt gcggccctaa aacagggcag cgcgtggagc 660

catccgcagt ttgaaaaatg ataagcttgg a 691

<210> 10

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 10

Met Ala Ser Ala Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg

1 5 10 15

Val Ile Gly Met Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu

20 25 30

Ala Trp Phe Lys Arg Asn Thr Leu Asp Lys Pro Val Ile Met Gly Arg

35 40 45

His Thr Trp Glu Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile

50 55 60

Ile Leu Ser Ser Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys

65 70 75 80

Ser Val Asp Glu Ala Ile Ala Ala Ala Gly Asp Val Pro Glu Ile Met

85 90 95

Val Ile Gly Gly Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln

100 105 110

Lys Leu Tyr Leu Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His

115 120 125

Phe Pro Asp Tyr Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe

130 135 140

His Asp Ala Asp Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Ser Phe Glu Ile Leu

145 150 155 160

Glu Arg Arg Gly Ser Ser Thr Arg Ala Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys

165 170 175

Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Gly Ser Ala Lys Ile Ala Ala Leu

180 185 190

Lys Gln Lys Ile Ala Ala Leu Lys Tyr Lys Asn Ala Ala Leu Lys Lys

195 200 205

Lys Ile Ala Ala Leu Lys Gln Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe

210 215 220

Glu Lys

225

<210> 11

<211> 66

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 11

Glu Arg Arg Gly Ser Ser Thr Arg Ala Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Gly Ser Ala Lys Ile Ala Ala Leu

20 25 30

Lys Gln Lys Ile Ala Ala Leu Lys Tyr Lys Asn Ala Ala Leu Lys Lys

35 40 45

Lys Ile Ala Ala Leu Lys Gln Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe

50 55 60

Glu Lys

65

<210> 12

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 12

Glu Arg Arg Gly Ser Ser Thr Arg Ala Lys Lys Lys Ile Ala Ala Leu

1 5 10 15

Lys Gln Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25

<210> 13

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 13

Glu Arg Arg Gly Ser Ser Thr Arg Ala Lys Lys Ile Ala Ala Leu Lys

1 5 10 15

Gln Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25

<210> 14

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 14

Glu Arg Arg Gly Ser Ser Thr Arg Ala Gly Ser Ala Trp Ser His Pro

1 5 10 15

Gln Phe Glu Lys

20

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 15

Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser

1 5 10 15

<210> 16

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 16

Lys Ile Ala Ala Leu Lys Gln Lys Ile Ala Ala Leu Lys Tyr Lys Asn

1 5 10 15

Ala Ala Leu Lys Lys Lys Ile Ala Ala Leu Lys Gln

20 25

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 17

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成结构

<400> 18

Gly Ser Ser Thr Arg Ala

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 19

Gly Ser Ser Thr Arg Ala Gly Ser Ala

1 5

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 20

agatatagcc atggcgttgg atctgtttgc cgatgctgaa c 41

<210> 21

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 21

cggatggctc cacgcgctgc cttctttttt acctgcctga cggaatg 47

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 22

tatatataag cttatcattt ttcaaactgc ggatggctcc acgcgctgcc 50

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 23

gccagatgct tgtcttatca accgctacgc tcctggcgcg aaactgtcgc 50

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 24

gctagttatt gctcagcgg 19

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 25

tgcctagcgt ttcattgtcc cttcttatta ggtgataata 40

<210> 26

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 26

atatatatat ccatggcttc ggctatgatt tctctgattg cg 42

<210> 27

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 27

cgcggtttct ttcgctcgag tactgctgcc acggcgttcc aggatttcga atgag 55

<210> 28

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 28

ctcattcgaa atcctggaac gccgtggcag cagtactcga gcgaaagaaa ccgcg 55

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 29

atatatatat aagcttatca tttttcaaac tgcggatggc 40

<210> 30

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> atatatatatCTCGAGTACTGCTGCCACGGCGTTCCAGGATTTCG

<400> 30

atatatatat ctcgagtact gctgccacgg cgttccagga tttcg 45

<210> 31

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 31

atatatatat ctcgagcggg cagcgcgtgg agccatccgc agtttg 46

<210> 32

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 32

atatatatat ctcgagcgaa gaagattgcg gccctaaaac aggg 44

<210> 33

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 33

atatatatat ctcgagcgaa aaagaagatt gcggccctaa aacaggg 47

Claims

1.一种检测样品中的配体的方法，其包括步骤：

a)获得含有纳米孔和内化于纳米孔内腔的蛋白质衔接子的纳米孔传感器，其中所述蛋白质衔接子是能够结合配体的功能性酶，并且所述蛋白质衔接子在不使用共价化学或其它固定化技术的情况下保持内化于所述纳米孔的内腔之中，并且其中所述纳米孔具有第一和第二开口，其中第一开口具有比第二开口更宽的直径，并且所述纳米孔是细胞溶素A(ClyA)或细胞溶素A(ClyA)突变体，

b)将含有分析物的样品加入纳米孔的顺式侧或反式侧，并且

c)测量贯穿所述纳米孔的第一电导变化，其反映所述配体与内化的酶衔接子的结合，并测量贯穿所述纳米孔的额外的电导变化，其反映酶动力学，并且其中所述酶动力学是所述配体与所述内化的酶衔接子的结合和解离。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述纳米孔是细胞溶素A(ClyA)突变体Gln56Trp。

3.如权利要求1所述的方法，其中ClyA包含多个亚基，各亚基包含由SEQ IDNO:3表示的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质衔接子是球状的。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质衔接子是脱甲基酶或还原酶。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述脱甲基酶是AlkB脱甲基酶，任选地包含Asn120Asp突变。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述还原酶是二氢叶酸还原酶。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质衔接子含有标签，其中所述标签具有总净正或总净负电荷。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质衔接子与一个或多个其它分子形成复合物。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述分析物是小分子、蛋白质、或核酸。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述分析物是带电的。

12.一种纳米孔传感器，其含有纳米孔和内化于纳米孔内腔的蛋白质衔接子，并且所述蛋白质衔接子在不使用共价化学或其它固定化技术的情况下保持内化于所述纳米孔的内腔之中，其中所述蛋白质衔接子是功能性酶，其能够在所述功能性酶内化时结合配体，并且其中所述纳米孔具有第一和第二开口，其中第一开口具有比第二开口更宽的直径，并且所述纳米孔是细胞溶素A(ClyA)或细胞溶素A(ClyA)突变体，并且其中所述传感器配制为测量贯穿所述纳米孔的第一电导变化，其反映所述配体与内化的酶衔接子的结合，并测量贯穿所述纳米孔的额外的电导变化，其反映酶动力学，并且其中所述酶动力学是所述配体与所述内化的酶衔接子的结合和解离。

13.根据权利要求12所述的纳米孔传感器的用途，用于检测样品中的分析物。