JP2020530276A - 新規タンパク質細孔 - Google Patents

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Abstract

本発明は、新規タンパク質細孔および分析物検出および特徴付けにおけるそれらの用途に関する。本発明は、ＣｓｇＧ様の細孔および修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体によって形成された単離された細孔複合体に特に関連し、それによってナノ細孔内に追加のチャネル収縮部またはリーダーヘッドを組み込む。本発明はさらに、膜貫通細孔複合体および細孔複合体の製造方法、および分子感知および核酸配列決定用途での使用に関する。

Description

本発明は、新規タンパク質細孔および分析物検出および特徴解析におけるそれらの用途に関する。本発明はさらに、膜貫通細孔複合体および細孔複合体の製造方法、および分子感知および核酸配列決定用途での使用に関する。
ナノ細孔感知は、分析物分子とイオン導電性チャネルとの間の個々の結合事象または相互作用事象の観察に依存する分析物検出および特徴付けのアプローチである。ナノ細孔センサーは、電気的に絶縁された膜にナノメートル寸法の単一の細孔を配置し、分析物分子の存在下の細孔を通して電圧駆動イオン電流を測定することによって作成されうる。ナノ細孔内またはその近くの分析物の存在は、細孔を通るイオンの流れを変化させ、結果としてチャネル上で測定されるイオン電流または電流を変化させる。分析物の同一性は、その独特の電流シグネチャ、特に電流ブロックの持続時間および程度、および細孔とのその相互作用時間中の電流レベルの差異を通して明らかになる。分析物は、有機および無機の小分子、ならびに様々な生物学的または合成の巨大分子およびポリヌクレオチド、ポリペプチド、および多糖類を含むポリマーでありうる。ナノ細孔感知は同一性を明らかにし、検出された分析物の単一分子カウンティングを実施することができるが、ヌクレオチド、アミノ酸またはグリカン配列などの分析物組成に関する情報、ならびにメチル化およびアシル化、リン酸化、水酸化、酸化、還元、グリコシル化、脱炭酸、脱アミノ、その他などの、塩基、アミノ酸またはグリカンの修飾の存在に関する情報も提供できる。ナノ細孔感知は、迅速かつ安価なポリヌクレオチドを可能にする可能性があり、数十〜数万個の塩基長のポリヌクレオチドの単分子配列読み取りを提供する。
ナノ細孔感知を使用したポリマー特徴付けの重要な二つの構成要素は、（１）細孔を通したポリマー移動の制御と、（２）ポリマーが細孔を通して移動するときの構成された基本要素の差別である。ナノ細孔感知の間、細孔の最も狭い部分は、通過する分析物の関数としての電流シグネチャに関してナノ細孔の最も差別化された部分であるリーダーヘッドを形成する。ＣｓｇＧは、ゲートのない非選択的タンパク質分泌チャネルとして大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から識別されたもの（Ｇｏｙａｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）であり、分析物を検出および特徴付けるためのナノ細孔として使用されてきた。この文脈で細孔の特性を改善する野生型ＣｓｇＧ細孔に対する突然変異が開示されてきた（ＷＯ２０１６／０３４５９１、ＷＯ２０１７／１４９３１６、ＷＯ２０１７／１４９３１７およびＷＯ２０１７／１４９３１８、ＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５１１９１、全てが参照により本明細書に組み込まれる）。
分析物がポリヌクレオチドである場合、ヌクレオチド差別はこうした突然変異体細孔を通る通路によって達成されるが、電流シグネチャは、チャネル収縮の高さおよび分析物との相互作用表面の範囲が、観察された電流とポリヌクレオチド配列との間の関係に影響を及ぼすように、配列依存であること、また複数のヌクレオチドが観察された電流に寄与することが示されてきた。ヌクレオチド差別の電流範囲は、ＣｓｇＧ細孔の突然変異を通して改善されてきたが、ヌクレオチド間の電流の差異をさらに改善できる場合、配列決定システムはより高い性能を持つことになる。従って、ナノ細孔感知の機能を改善する新しい方法を特定する必要性がある。
本開示は、ＣｓｇＧ細孔を結合しそれによってＣｓｇＧ細孔内に別の追加的なチャネルまたは細孔の収縮を導入する、修飾ＣｓｇＦペプチド、特に切断ＣｓｇＦ断片に関する。本発明のその他の態様はまた、単離された膜貫通細孔複合体と、二つの連続したリーダーヘッドを持つナノ細孔感知プラットフォーム内での、前記ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体と修飾ＣｓｇＦペプチドまたは断片の使用に関する。
本発明の第一の態様は、ＣｓｇＧ細孔およびＣｓｇＦペプチドを含む細孔に関する。一態様では、ＣｓｇＦペプチドは、ＣｓｇＧ結合領域と、細孔内の収縮部を形成する領域とを含む。一態様では、ＣｓｇＦペプチドはＣｓｇＦのＣ末端ヘッドドメインを欠く切断ＣｓｇＦペプチドである。別の態様では、ＣｓｇＦペプチドは、Ｃ末端ヘッドおよびＣｓｇＦのネックドメインの一部を欠く切断ＣｓｇＦペプチドである。別の態様では、ＣｓｇＦペプチドは、ＣｓｇＦのＣ末端ヘッドドメインおよびネックドメインを欠く切断ＣｓｇＦペプチドである。細孔はまた、本明細書で細孔複合体として、単離された細孔複合体としても言及される。単離された細孔複合体は、ＣｓｇＧ細孔またはその相同体もしくは突然変異体、ならびに修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体、特に切断ＣｓｇＦ断片またはその相同体もしくは突然変異体を含む。一実施形態では、前記修飾ＣｓｇＦペプチド、または相同体もしくは突然変異体は、ＣｓｇＧ細孔またはその相同体もしくは突然変異体の内腔内に位置する。別の実施形態では、前記単離された細孔複合体は二つ以上のチャネル収縮部を有し、一つは、ＣｓｇＧ細孔によって位置付けまたは提供され、その収縮ループによって形成されたもので、もう一つの追加的なチャネル収縮部またはリーダーヘッドは、修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体によって導入されたものである。一実施形態では、前記ＣｓｇＧ−細孔またはＣｓｇＧ様の細孔は、野生型の細孔ではなく突然変異体ＣｓｇＧ細孔であり、特定の実施形態では、例えば、前記チャネル収縮ループ内に突然変異が存在する。別の実施形態では、修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体を含む単離された細孔複合体は、０．５ ｎｍ〜２．０ ｎｍの範囲の直径を有するＣｓｇＦチャネル収縮部を有する。一実施形態では、細孔複合体は、（ｉ）第一の開口部と、βバレルを含む中間部分と、第二の開口部と、第一の開口部から中間部分を通って第二の開口部に延びる内腔とを備えたＣｓｇＧ細孔であって、中間部分の内腔表面がＣｓｇＧ収縮部を画定するものと、（ｉｉ）複数の修飾ＣｓｇＦペプチドであって、ＣｓｇＦ収縮領域およびＣｓｇＦ結合領域（本明細書では、ＣｓｇＧ結合ドメインまたはＣｓｇＦの領域ともいう）を有し、修飾ＣｓｇＦペプチドが、ＣｓｇＧ細孔のβバレル内にＣｓｇＦ収縮部を形成し、またＣｓｇＧ収縮部およびＣｓｇＦ収縮部がＣｓｇＧ細孔のβバレル内で同軸に間隙を介しているものとを含む。ＣｓｇＧ細孔の内腔表面は、ＣｓｇＧ収縮を画定するＣｓｇＧモノマーの一つ以上のループ領域を含みうる。ＣｓｇＦ収縮領域およびＣｓｇＦ結合領域は通常、ＣｓｇＦ成熟ペプチドのＮ末端部分に対応する。一実施形態では、細孔複合体は、ＣｓｇＡ、ＣｓｇＢ、およびＣｓｇＥを含まない。
第二の態様では、本発明は、修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体に関し、タンパク質またはペプチドは、タンパク質の一部の切断または欠失を介して修飾され、配列番号６のＣｓｇＦ断片またはその相同体または突然変異体のＣｓｇＦ断片をもたらす。一実施形態は、修飾または切断ＣｓｇＦペプチド、またはＣｓｇＦ相同体もしくは突然変異体の修飾ペプチドに関し、前記修飾ペプチドは、配列番号３９、または配列番号４０またはその相同体もしくは突然変異体を含み、別の方法として、前記修飾ペプチドは、配列番号１５またはその相同体もしくは突然変異体、別の方法として配列番号５４、または配列番号５５またはその相同体もしくは突然変異体を含む。別の実施形態では、修飾ＣｓｇＦペプチドが開示されており、ここで、配列番号１５を含む領域内の一つ以上の位置が修飾され、また、前記突然変異体は、配列番号１５に対する最低でも３５％のアミノ酸同一性を、配列番号１５を含む領域に対応するペプチド断片内に保持することが要求される。
一実施形態は、ＣｓｇＧ細孔および修飾ＣｓｇＦペプチドを含む細孔に関し、ここで、修飾ＣｓｇＦペプチドは、ＣｓｇＧに結合し、細孔内に収縮部を形成する。
一実施形態は、本発明の第二の態様による、前記修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体をコードするポリヌクレオチドに関する。別の実施形態では、ＣｓｇＧ細孔および修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体を含む、単離された細孔複合体は、前記修飾ＣｓｇＦペプチドが、本発明の第二の態様で開示されたペプチドにより提供されるペプチドであるという点で特徴付けられる。
別の実施形態は、単離された細孔複合体に関し、ここで修飾ＣｓｇＦペプチドおよびＣｓｇＧ細孔または前記細孔またはその相同体もしくは突然変異体のモノマーが共有結合されている。さらに具体的には、前記結合は、ＣｓｇＧモノマー内の配列番号３またはその相同体の１３２、１３３、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、２０１、２０３、２０５、２０７または２０９に対応する位置にある、システイン残基を介して、または、非天然の反応性または光反応性アミノ酸を介してなされる。
好ましい実施形態は、単離された膜貫通細孔複合体、または膜組成物に関し、これは、本発明の単離された細孔複合体、および膜の構成要素を含む。特に、前記膜貫通細孔複合体または膜組成物は、本発明の単離された細孔複合体、膜の構成要素または絶縁層の構成要素で構成される。
一実施形態は、本明細書に開示される細孔を生成するための方法に関し、方法は、本明細書で開示される一つ以上のＣｓｇＧモノマーおよび本明細書で開示されるＣｓｇＦペプチドを宿主細胞内で共発現して、それによって細胞内での膜貫通細孔複合体形成を可能にする工程を含む。ＣｓｇＦペプチドは、アミノ酸配列の適切な位置に酵素切断部位を含む修飾ＣｓｇＦペプチドまたはタンパク質を切断することによって細胞内で製造されてもよい。
一実施形態は、本明細書に開示される細孔を生成するための方法に関し、方法は、一つ以上の精製されたＣｓｇＧモノマーを一つ以上の精製された修飾ＣｓｇＦペプチドと接触させて、それによって細孔のｉｎ ｖｉｔｒｏ形成を可能にする工程を含む。修飾ＣｓｇＦペプチドは、細孔の形成の前または後に切断されるアミノ酸配列の適切な位置にある酵素切断部位を含むペプチドでもよい。
本発明の第三の態様は、前記膜貫通細孔複合体を生成するための方法に関し、ここで、細孔は、ＣｓｇＧ細孔またはその相同体もしくは突然変異体、および修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体によって形成された単離された複合体であり、方法は、適切な宿主細胞内で、ＣｓｇＧ配列番号２またはその相同体もしくは突然変異体、および修飾または切断されたＣｓｇＦ（配列番号５の断片を含む）またはその相同体もしくは突然変異体を共発現して、それによってｉｎ ｖｉｖｏ細孔複合体形成を可能にする工程を含む。特定の実施形態では、前記修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体は、配列番号１２または配列番号１４またはその相同体もしくは突然変異体を含む。別の方法として、単離された細孔複合体を生成するための方法は、細孔複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成のために、配列番号３またはその相同体もしくは突然変異体のＣｓｇＧモノマーを、修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体と接触させる工程を含む。特定の実施形態では、前記方法の修飾ＣｓｇＦペプチドは、配列番号１５または配列番号１６またはその相同体もしくは突然変異体を含む。
本発明の別の態様は、標的分析物の存在、不在または一つ以上の特性を決定するための方法に関連し、この方法は、
（ｉ） 標的分析物が細孔チャネル内に移動するように、標的分析物を前記単離された細孔複合体または膜貫通細孔複合体と接触させる工程と、
（ｉｉ） 分析物が細孔チャネルを通って移動する時に一つ以上の測定値を取り、それによって分析物の存在、不在または一つ以上の特性を決定する工程とを含む。
一実施形態では、前記分析物はポリヌクレオチドである。特に、ポリヌクレオチドを分析物として使用する前記方法は、（ｉ）ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）ポリヌクレオチドが修飾されているかどうかから選択される一つ以上の特性を決定する工程を含む。
別の実施形態では、分析物は、タンパク質、またはペプチドであり、またさらなる実施形態では、前記分析物は、多糖類、または例えば、薬理学的活性化合物、有毒化合物および汚染物質などであるがこれに限定されない小さな有機または無機の化合物である。
別の実施形態では、単離された膜貫通細孔複合体を使用したポリヌクレオチドまたは（ポリ）ペプチドを特徴付ける方法が説明されており、ここで、細孔複合体は、ＣｓｇＧ細孔またはその相同体もしくは突然変異体、および修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体を含む単離された複合体である。特に、前記ＣｓｇＧ細孔またはその相同体もしくは突然変異体は、ＣｓｇＧ細孔チャネルを形成する６〜１０個のＣｓｇＧモノマーを含む。
本発明のさらなる態様は、標的分析物の存在、不在、または一つ以上の特性を決定するための本発明の前述の態様による前記単離された細孔複合体または膜貫通細孔複合体の使用を開示している。さらに、本発明は、（ａ）前記単離された細孔複合体および（ｂ）膜の構成要素を含む標的分析物を特徴付けるためのキットにも関連する。
図の説明
説明した図面は概略的であり、非限定的である。図面では、図示目的のために一部の要素のサイズが誇張され、尺度通りには描かれていない場合がある。
ＣｓｇＧ細孔の構造および複合体形成のためのＣｓｇＦとの界面。ＣｓｇＧオリゴマー（例えば、九量体）（金色）の断面図（Ａ）、側面図（Ｂ）および上面図（Ｃ）、表面（Ａ）およびリボン（Ｂ、Ｃ）を表示）、単一のＣｓｇＧプロトマーは淡青色で着色（Ｄ）（ＣｓｇＧ Ｘ線構造ＰＤＢエントリー：４ｕｖ３に基づく）。ＣｓｇＧ収縮ループ（ＣＬループ）は、配列番号３に従って残基４６〜６１にわたり、すべてのパネルで濃灰色で示され、また（Ｅ）の左下にあるループに対応する。側鎖がＣｓｇＧ βバレルの内腔に面するＣｓｇＧ残基は、（Ｅ）および（Ｄ）に示すように灰色中間色であり、β鎖で標識されている。これらの残基は、天然または非天然のアミノ酸、例えば、細孔性ペプチド（例えば、修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体を含む）のＣｓｇＧ細孔またはモノマーへの付着（共有結合架橋）に使用できるものなど、置換に使用できる部位を表す。一部の実施形態では、架橋残基には、Ｃｙｓおよび反応性アミノ酸、および光反応性アミノ酸、アジドホモアラニン、ホモプロパルギルグリシン、ホモアレルグリシン、ｐ−アセチル−Ｐｈｅ、ｐ−アジド−Ｐｈｅ、ｐ−プロパルギルオキシ−Ｐｈｅ、およびｐ−ベンゾイル−Ｐｈｅが含まれ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１２、 Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ． ２００２）、また配列番号３に従って、位置１３２、１３３、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、２０１、２０３、２０５、２０７または２０９に置換することができる。（Ｅ）ＣｓｇＧモノマーのＣＬループおよび膜貫通型ベータ鎖の拡大図を示す。ＣｓｇＧ収縮ループ（濃青色で着色）は、ＣｓｇＧ細孔（パネルＡ）内のオリフィスまたは最も狭い通路を形成する。一部の実施形態では、配列番号３によるＣＬループ、５６、５５、および５１の三つの位置は、ＣｓｇＧチャネルオリフィスまたは「リーダーヘッド」の直径および化学的特性および物理的特性に特に重要である。これらは、ＣｓｇＧ細孔および相同体のナノ細孔感知特性を変化させるための好ましい位置を表す。 ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体タンパク質の共発現および複合体精製。（Ａ）ＣｓｇＧ（配列番号２＋Ｃ末端ストレップＩＩタグ）およびＣｓｇＦ（配列番号４＋Ｃ末端６×Ｈｉｓタグ）を共発現するＥ． ｃｏｌｉ培養から始まるＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の精製プロトコルの概略図を示す。このプロトコルには、再懸濁細胞を中断し、膜結合タンパク質の１％ ＤＤＭ抽出を行う工程が含まれる。ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体および過剰なＣｓｇＦは、ニッケルＩＭＡＣカラム上で親和性精製による第一の濃縮を受け、その後、ストレプトアビジンカラム上のＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の第二の親和性濃縮を受ける。（Ｂ）ＩＭＡＣ（左）およびストレプトアビジン（右）精製工程のＣｏｏｍｍａｓｓｉｅ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＣｓｇＧおよびＣｓｇＦに対応するタンパク質バンドが標識化されている。特に、ＩＭＡＣ溶出物は、ＣｓｇＧ結合型ストレップタグを使用して親和性プルダウンに保持されなかったＮ末端で切断ＣｓｇＦ断片（ラベル＊）を含有し、ＣｓｇＦのＮ末端がＣｓｇＧとの複合体形成に必要であることを示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成に伴うＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体タンパク質精製。（Ａ）ＣｓｇＧ（淡灰色）と、過剰ＣｓｇＦで補足されたＣｓｇＧ（濃灰色）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）実施（ＢｉｏＲａｄ Ｅｎｒｉｃｈ ６５０ １０／３００カラムを使用）を重ね合わせたクロマトグラム。クロマトグラムは、ＣｓｇＧ実施のためのＣｓｇＧ ９量体（ａ）およびＣｓｇＧ １８量体（ｂ）と、過剰な遊離ＣｓｇＦ（ｃ）と、複合体にＣｓｇＦを組み込むためにより高めの水力動力学的半径（分子量）で溶出する９量体ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体（ｄ）および１８量体ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体（ｅ）とに対応する溶出ピークを示す。（Ｂ）パネル（Ａ）で標識化された代表的種のネイティブＰＡＧＥ分析であって、ＣｓｇＧ ９量体とＣｓｇＧ １８量体の複合体へのＣｓｇＦの組み込みによる高めの分子量へのシフトを確認する。これらの実験は、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体が、精製された構成要素から始めてｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成できることを実証している。（Ｃ）これまでに報告されているＣｓｇＧ ９量体およびＣｓｇＧ １８量体のリボン表現（Ｇｏｙａｌ ｅｔ ａｌ． ２０１４（ＰＤＢエントリー４ｕｖ３））。ＣｓｇＧ １８量体は、ＣｓｇＧ ９量体の二量体で形成される。パネルＡおよびパネルＢに示されるＳＥＣおよびネイティブＰＡＧＥ解析は、ＣｓｇＧ １８量体がＣｓｇＦと複合体形成しやすいことを実証する。 （図３−１と同じ） ｃｒｙｏ−ＥＭで決定されるＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ構造。（Ａ）ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の低温電子顕微鏡写真であり、９量体および１８量体のＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の存在を示し、９量体および１８量体形態の数多くの単一粒子がそれぞれ実線の円および破線の円で強調表示されている。（Ｂ）側面から見たＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ ９量体複合体の二つの代表的クラス平均。クラス平均には、それぞれ６０２０〜４１５９個の個別粒子が含まれる。クラス平均は、ＣｓｇＦのオリゴマー複合体に対応するＣｓｇＧ粒子の上部の追加的な密度の存在を明らかにする。ＣｓｇＦオリゴマー内には、「ヘッド」領域と「ネック」領域、およびＣｓｇＧ βバレルの内腔内に存在する領域の三つの明確な領域が見られ、ＣｓｇＧ ＣＬループ（ラベルＧ）によって形成される収縮部の上部に積み重ねられた収縮部または狭い通路（ラベルＦ）を形成する。この後者のＣｓｇＦ領域は、ＣｓｇＦ収縮ペプチド（ＦＣＰ）と呼ばれる。 （図４−１と同じ） ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の三次元構造モデル。２１個のクラス平均に割り当てられた２０．０００粒子から計算された、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ ９量体複合体の３Ｄ ｃｒｙｏＥＭ電子密度の断面図。右図は、ｃｒｙｏＥＭ密度にドッキングされたＣｓｇＧ ９量体のＸ線構造（ＰＤＢエントリー：４ｕｖ３）と重ね合わせたものを示す。ＣｓｇＧ、ＣｓｇＦ、およびＣｓｇＦのヘッド、ネックおよびＦＣＰドメインに対応する領域が示されている。断面図は、ＣｓｇＦ ＦＣＰ領域が、ＣｓｇＧ収縮ループ（ラベルＧ）の上およそ２ ｎｍにＣｓｇＧチャネル内に追加的な収縮部（ラベルＦ）を形成することを示す。 ｃｒｙｏ−ＥＭ構造に基づくＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ細孔複合体の概略図。（Ａ）単一の収縮部（ラベル（１））を保持する、断面図のＣｓｇＧナノ細孔の概略図。ＣｓｇＧベースのナノ細孔は、ＣｓｇＧ収縮ループ（配列番号３による残基４６〜６１）によって作製された０．５〜１．５ ｎｍのオリフィスを含む３．５〜４ ｎｍ幅のチャネルを形成する。ＣｓｇＦと複合体を形成する時、第二の収縮部またはオリフィスは、ＣｓｇＧチャネル（ラベル（２）／Ｆ）に導入され、チャネル出口はＣｓｇＦヘッドドメイン（図５参照）によって塞がれるようになる（図５参照）。修飾ＣｓｇＦペプチドを使用する時、例えば、ネック領域およびヘッド領域を欠くＣｓｇＦ収縮ペプチド（ＦＣＰ）に対応するものを使用する時、パネル（Ｂ）でＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ ｃｒｙｏ−ＥＭ密度の断面図と、パネル（Ｃ）で概略図で示されるように、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ細孔複合体が二つの連続したチャネル収縮またはオリフィス（（１）および（２））で形成される。修飾ＣｓｇＦペプチドのネック領域およびヘッド領域を除去することで、チャネル出口の閉塞が緩和される。 （バイオ）ポリマー（Ａ）または単一分子分析物（Ｂ）のナノ細孔感知用途のためのＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ細孔複合体の使用の概略図。ポリマー感知で使用される場合、修飾ＣｓｇＦペプチドによって導入される第二のチャネル収縮部は、分析物との接触領域を増加させ、第二の相互作用部位およびリーダーヘッドを形成する。単一分子ナノ細孔感知で使用される場合、修飾ＣｓｇＦペプチドによって導入される第二のチャネル収縮部は、第二の独立した分析物相互作用部位を作り出す。（Ｃ）連続したＣｓｇＧ（１）およびＣｓｇＦ（２）収縮部またはリーダーヘッドを通過し、それらと相互作用する小分子の理論的チャネルコンダクタンスプロファイルの概略図（六角形と三角形で示される）。 例示的なＣｓｇＦ相同体の多重配列アライメント。整列された配列は成熟タンパク質として示されている（すなわち、それらのＮ末端シグナルペプチド（ＳＰ）を欠く）。ボックスで囲まれた配列は、一部の実施形態においてＣｓｇＦ収縮ペプチド（ＦＣＰ）に対応する配列保存のＣｓｇＦ領域（３５〜１００％の一対配列同一性の間を参照―図１０を参照）を示す。多重配列アライメントに含まれるＣｓｇＦ相同体は、Ｑ８８Ｈ８８、Ａ０Ａ１４３ＨＪＡ０、Ｑ５Ｅ２４５、Ｑ０８４Ｅ５、Ｆ０ＬＺＵ２、Ａ０Ａ１３６ＨＱＲ０、Ａ０Ａ０Ｗ１ＳＲＬ３、Ｂ０ＵＨ０１、Ｑ６ＮＡＵ５、Ｇ８ＰＵＹ５、Ａ０Ａ０Ｓ２ＥＴＰ７、Ｅ３Ｉ１Ｚ１、Ｆ３Ｚ０９４、Ａ０Ａ１７６Ｔ７Ｍ２、Ｄ２ＱＰＰ８、Ｎ２ＩＹＴ１、Ｗ７ＱＨＶ５、Ｄ４ＺＬＷ２、Ｄ２ＱＴ９２、Ａ０Ａ１６７ＵＪＡ２である。Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦ（配列番号１５）および示されたＣｓｇＦ相同体のＦＣＰ領域は、配列番号１８〜３６に対応する。 ＣｓｇＧ相互作用配列およびＣｓｇＦ収縮ペプチド（ＦＣＰ）を形成するＥ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦ領域の実験的評価。パネル（Ａ）は、Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＧ（配列番号２）と共発現された四つのＮ末端 ＣｓｇＦ断片（配列番号８のＣｓｇＦ残基１〜２７、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４）の成熟配列（すなわち、配列番号５の残基１〜１９に対応するＣｓｇＦシグナルペプチドを除去した後）、（配列番号８、配列番号１〜２７、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１２、および配列番号１４）を示す。（Ｂ）ＣｓｇＧおよびＣｓｇＦ共発現実験の粗製細胞可溶化物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析についての抗ストレップ（左）および抗Ｈｉｓ（右）ウエスタンブロット分析。抗ストレップ分析は、すべての共発現実験におけるＣｓｇＧの発現を示し、抗Ｈｉｓウエスタンブロット分析は、切断突然変異体ＣｓｇＦ １〜６４（配列番号１４）に対してのみＣｓｇＦ断片の検出可能レベルを示す。Ｈｉｓタグ付きナノ本体（Ｎｂ）を陽性対照として使用した。（Ｃ）ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ共発現実験におけるＣｓｇＦ断片の存在についての抗Ｈｉｓドットブロット解析。上部の行は、細胞可溶化物全体を、中間および下部の行は、ストレップ親和性プルダウン実験の溶出物および貫流を示す。これらのデータは、ＣｓｇＦ断片１〜６４およびずっと小さな範囲ＣｓｇＦ １〜４８が、ストレップタグ付きＣｓｇＧとの複合体として特異的にプルダウンされることを実証する。ＣｓｇＦ断片１〜２７および１〜３８は、対応するＣｓｇＦ断片の検出可能レベルをもたらさず、ＣｓｇＧとの複合体形成の兆候を示さない。 ＣｓｇＧ相互作用配列およびＣｓｇＦ収縮ペプチド（ＦＣＰ）を形成するＣｓｇＦ領域の多重配列アライメント。図は、ＣｓｇＧ相互作用に対応する領域における、ＣｓｇＦペプチドの多重配列アライメントおよびコンセンサス配列およびその既知の相同体を示す。ＣｓｇＦ相同体は、ＰＦＡＭドメインＰＦ０３７８３によって定義される。これらのペプチドはＣｓｇＧに結合し、ＣｓｇＧ βバレルの内腔に局在化し、ここで、これらはＣｓｇＧチャネル内に追加的な収縮部を形成する。これらのペプチドおよびその相同体は、ＣｓｇＦ収縮ペプチドまたはＦＣＰの例である。示されるＦＣＰの一対配列同一性は、３５〜９８％の範囲である。 （図１０−１と同じ） （図１０−１と同じ） ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の高解像度ｃｒｙｏＥＭ構造。ＣｓｇＧは淡灰色で示され、ＣｓｇＦは濃灰色で示されている。Ａ． ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の３．４Å解像度での最終電子密度マップ。側面図。Ｂ． ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦが９：９化学量論を含み、Ｃ９対称性を有することを示すｃｒｙｏＥＭ構造の上面図。Ｃ． ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の内部構造。ＧＣ、ＣｓｇＧ収縮部、ＦＣ、ＣｓｇＦ収縮部。Ｄ． ＣｓｇＧタンパク質とＣｓｇＦタンパク質の間の相互作用。ＣｓｇＧおよびＣｓｇＧ収縮部はそれぞれ淡灰色および灰色で着色されている。ＣｓｇＦは濃灰色で着色されている。ＣｓｇＧおよびＣｓｇＦの残基は、それぞれ淡灰色および黒色でラベル付けされている。 ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の２つのリーダーヘッド。ＣｓｇＧは淡灰色で示され、ＣｓｇＧ細孔のリーダーヘッドは濃灰色で示されている。ＣｓｇＦは黒色に示され、ＣｓｇＦのリーダーヘッドはラベル付けされている。 ＣｓｇＦ ＷＴとのｉｎ ｖｉｖｏでのＣｓｇＧの共発現。アンピシリン抵抗性を有するｐＴ７ベクター中のＣ末端ストレップタグ付きＣｓｇＧポリペプチドをコードする遺伝子と、カナマイシン抵抗性を有するｐＲｈａｍベクター中のＣ末端タグＣｓｇＦポリペプチドをコードする遺伝子とが、アンピシリンおよびカナマイシンの両方の存在下でまとめてＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１ＤＥ３細胞に形質転換された。タンパク質を、１８℃、２５０ｒｐｍで一晩発現させ、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＦ複合体をストレップタグ精製を使用して精製した後、Ｈｉｓタグ精製を行った。Ａ．ストレップ精製前のタンパク質試料（複製）。Ｂ．Ｈｉｓ精製後のタンパク質試料（三つの溶出画分）。タンパク質を４〜２０％のトリスゲル上に流した。 ＣｓｇＧおよびＣｓｇＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ共発現およびＣｓｇＧ−ＣｓｇＦ複合体の熱安定性。異なるベクター中のＣｓｇＧおよびＣｓｇＦ ＤＮＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳反応で共発現されている。タンパク質は、Ｓ−３５メチオニンで放射能標識化され、Ｘ線フィルム上に露出されている。複合体の安定性は、反応混合物を異なる温度で１０分間培養することによって評価される。 プロテアーゼ切断部位を用いたＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の作製。Ａ． ＴＥＶまたはＣ３またはその他任意のプロテアーゼ切断部位は、要求される部位（例えば、配列番号６の３０と３１、３５と３６、４０と４１、４５と４６の間）でＣｓｇＦペプチドに導入されうる。ＣｓｇＧは金色で、ＣｓｇＦドメインは赤で表示されている。一つのＣｓｇＦサブユニット１〜３５は明瞭化のために緑色で着色されている。３６〜４５は紫色で示されている。１０個のヒスチジンタグがピンクで示され、ＣｓｇＧのストレップタグが青色で示されている。Ｂ． 全長ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体のプロテアーゼ切断のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％ＴＧＸ）であって、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位が配列番号６の３５〜３６の間に挿入されている。Ｍ：分子量マーカー、レーン１：ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ全長複合体のストレップ後精製、レーン２：ストレップ後濃縮、レーン３：ゲルろ過後、レーン４：ＴＥＶプロテアーゼで切断されＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を生成、レーン５：ストレップ精製後のＣｓｇＧ：ＣｓｇＦの貫流、レーン６：ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦを６０°Ｃで１０分間加熱。レーン７：ストレップカラムから溶出されたＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体、レーン８：対照としてのＣｓｇＧ細孔、レーン９：対照としてのＴＥＶプロテアーゼ。 ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の熱安定性。Ｍ： 分子量マーカー、レーン１：ＣｓｇＧ細孔、レーン２：室温でのＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体：レーン３〜９：ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ試料を、異なる温度（それぞれ４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００℃）で１０分間加熱した。レーン１：Ａ． Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｖ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）：ＣｓｇＦ−（１−４５）．Ｂ． Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｖ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）：ＣｓｇＦ−（１−３５）．Ｃ． Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｖ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）：ＣｓｇＦ−（１−３０）．試料を７．５％ＴＧＸゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＣｓｇＦ−（１−４５）とＣｓｇＦ−（１−３５）の両方を有するＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体は、レーン１のＣｓｇＧ細孔バンドからのシフトを示す。従って、これらの複合体の両方は９０℃まで熱安定性があることが明らかである。複合体および細孔は、１００℃でＣｓｇＧモノマーまで分解する（レーン９）。同じ熱安定性パターンがＣｓｇＦ−（１−３０）を有するＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体で見られるが、ＣｓｇＧ細孔（レーン１）とＣｓｇＧ−ＣｓｇＦ複合体（レーン２−８）のタンパク質バンド間のシフトを確認するのは困難である。 合成ＣｓｇＦペプチドを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ。再構成を介したＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ形成。野生型ＣｓｇＧまたは改変した収縮部Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−ｌ１０７）を有するＣｓｇＧ突然変異体を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成を介したＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ形成を示すネイティブＰＡＧＥ。成熟ＣｓｇＦ（配列番号６）の最初の３４残基に対応するＡｌｅｘａ５９４標識化ＣｓｇＦペプチドを、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ ｍＭ ＮａＣｌ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、５ ｍＭ ＬＤＡＯ／Ｃ８Ｄ４中、２：１モル比で、精製されたストレップタグ付きＣｓｇＧまたはＹ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−ｌ１０７）に室温で１５分間にわたり加え、再構成させた。ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎビーズに対してＣｓｇＧ−ｓｔｒｅｐをプルダウンした後、試料をネイティブＰＡＧＥで分析した。ＷＴおよびＹ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−ｌ１０７）ＣｓｇＧの両方が、蛍光タグによって視覚化されたＣｓｇＦ Ｎ末端ペプチドを結合する。 図１８ ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦまたはＣｓｇＧ：ＦＣＰ複合体の安定化。Ａ． ＳＳ結合を作製できるＣｓｇＧ（配列番号３）およびＣｓｇＦ（配列番号６）の対の特定されたアミノ酸位置。Ｂ． ＣｓｇＧ−Ｑ１５３ＣとＣｓｇＦ−Ｇ１Ｃの間のＳ−Ｓ結合を示す概略図。 ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体のシステイン架橋。Ａ． Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｑ１５３Ｃ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）およびＣｓｇＦ−Ｇ１Ｃタンパク質を別個に精製され、４℃で１時間または一晩培養して、複合体を形成し、Ｓ−Ｓ形成させた。Ｓ−Ｓ形成を促進するための酸化剤は加えられなかった。対照のＣｓｇＧ細孔（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｑ１５３Ｃ−ＤＥＬ（Ｖ１０５−Ｉ１０７））および複合体（ＤＴＴを有するものと有しないもの）を、１００℃で１０分間加熱して、複合体をＣｓｇＧモノマー（ＣｓｇＧｍ、３０ＫＤａ）とＣｓｇＦモノマー（ＣｓｇＦｍ、１５ＫＤａ）とに分解した。ＣｓｇＧｍおよびＣｓｇＦｍ間の二量体（ＣｓｇＧｍ−ＣｓｇＦｍ、４５Ｋｄａ）は、Ｓ−Ｓ結合形成を確認する還元剤が存在しない場合に見られる。二量体形成の増加は、１時間培養に比べて一晩培養したものに見られる。Ｂ． 質量分析解析が、一晩培養したものからゲル精製されたｍ−ＣｓｇＦｍバンド上で実施された。タンパク質をタンパク質分解的に切断してトリプシンペプチドを生成した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ配列決定方法を実施し、示されたリンクペプチドに対応して、上記の前駆体イオンの特定がなされた。この前駆体イオンを断片化し、断片イオンを観察した。これらには、それぞれのペプチド用のイオンと、無傷のジスルフィド結合を組み込む断片とが含まれる。このデータは、ＣｓｇＦのＣ１とＣｓｇＦのＣ１５３との間のジスルフィド結合の存在についての強力な証拠を提供する。 ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体のシステイン架橋の効率の改善。レーン１：Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｎ１３３Ｃ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）およびＣｓｇＦ−Ｔ４Ｃタンパク質は共発現され、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体が精製された。レーン２：複合体をＤＴＴの存在下で加熱し、複合体を置換モノマー（ＣｓｇＧｍおよびＣｓｇＦｍ）に分解した。ＤＴＴは、形成された場合にＣｓｇＧ−Ｎ１３３ＣとＣｓｇＦ−Ｔ４Ｃの間の任意のＳ−Ｓ結合に分解される。レーン３：複合体を酸化剤銅オルソフェナントロリンと共にインキュベートし、Ｓ−Ｓ結合形成を促進する。レーン４：酸化した試料を、ＤＴＴの不在化で１００℃に加熱して、複合体を分解した。ＣｓｇＧｍ−ＣｓｇＦｍに対応する４５Ｋｄａの新しいバンドが現れ、Ｓ−Ｓ結合形成が確認される。 ＤＮＡ鎖がＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を通過するときの電流シグネチャ。Ｃ末端ストレップタグを含むＣｓｇＧ細孔（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７））を、Ｃ末端Ｈｉｓタグおよび配列番号６の３５と３６の間のＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む全長ＣｓｇＦタンパク質と共発現させて、複合体を作製した。 次に、精製された複合体をＴＥＶプロテアーゼによって切断して、所与のＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を作製した。ＴＥＶ切断は、切断部位にＥＮＬＹＦＱ配列を残すことに注目されたい。Ａ． ＣｓｇＦの１７位置では突然変異はない。Ｂ． ＣｓｇＦではＮ１７Ｓ突然変異体。 ＤＮＡ鎖がＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を通過するときの電流シグネチャ。複合体は、ＣｓｇＦ−（１〜３５）突然変異体を有するＣ末端ストレップタグを含むＹ５１Ａ／Ｎ５５Ｖ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）細孔を培養することによって作製された。Ａ． ＣｓｇＦ−Ｎ１７Ｓ−（１−３５）。Ｂ． ＣｓｇＦ−Ｎ１７Ｖ−（１−３５）。 ＤＮＡ鎖がＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を通過するときの電流シグネチャ。複合体は、ＣｓｇＦ−Ｎ１７Ｓ−（１−３５）を有するＣ末端ストレップタグを含む異なるＣｓｇＧ細孔を培養することによって作製した。Ａ． ＣｓｇＧ細孔はＹ５１Ａ／Ｎ５５Ｖ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）である。Ｂ． ＣｓｇＧ細孔は、Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５Ｖ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）である。Ｃ． ＣｓｇＧ細孔はＹ５１Ａ／Ｎ５５Ｉ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）である。Ｄ． ＣｓｇＧ細孔は、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ａ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）である。Ｅ． ＣｓｇＧ細孔は、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｉ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）である。Ｆ． ＣｓｇＧ細孔は、Ｙ５１Ｓ／Ｎ５５Ｖ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）である。 （図２３−１と同じ） ＤＮＡ鎖がＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を通過するときの電流シグネチャ。複合体は、三つの異なる長さのＣｓｇＦを有するＣ末端を含むＥ． ｃｏｌｉ精製されたＹ５１Ａ／Ｎ５５Ｖ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）細孔を培養することにより作製された。Ａ． ＣｓｇＦ−（１−２９）、Ｂ． ＣｓｇＦ−（１−３５）、Ｃ． ＣｓｇＦ−（１−４５）。矢印は信号の範囲を示す。意外にも、ＣｓｇＦ−（１−２９）を有する複合体は、最大範囲を有する信号を生成する。 ＤＮＡ鎖がＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を通過するときの電流シグネチャの信号対雑音比。異なるＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体は、同じＣｓｇＦペプチドＣｓｇＦ−（１−３５）を有する異なるＣｓｇＧ細孔（１−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）２−Ｙ５１Ａ／Ｎ５５Ｉ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）３−Ｙ５１Ａ／Ｎ５５Ｖ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）４−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ａ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）５−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｉ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）６−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｖ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）７−Ｙ５１Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）８−Ｙ５１Ｓ／Ｎ５５Ｖ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）９−Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５Ｖ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７））を培養することにより作製された。ＤＮＡ転座実験で異なる短くくねくねした線のパターンが観察され、その信号対雑音比が測定された。より高い精度は、より大きな信号対雑音比で得ることができる。 狭いリーダーヘッドでの配列決定エラー。ＣｓｇＧ細孔のリーダーヘッドとのＤＮＡ塩基相互作用の表現。約５個の塩基が、ＤＮＡ鎖が細孔を通して転座する時に、任意の時点で電流信号を支配する。Ｂ． 信号のプロットのマッピング。カスタムＨＭＭを使用してモデル化された信号にマップされた複数の読取値について、ホモポリマー実施を欠く混合配列について、および１０ Ｔの三つのホモポリマー実施を含む配列についての事象検出シグナル。 ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体のリーダーヘッドのマッピング。ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体についてのリーダーヘッド差別プロット。各リードヘッド位置で塩基が変動する時のモデル化された電流の平均変動。長さｎのアルファベットを有する長さｋのモデルについての位置ｉでのリードヘッド差別を計算するために、リードヘッド位置ｉでの差別を、サイズｎのそれぞれのｎｋ−１群についての電流レベルの標準偏差の中央値として定義した。式中、位置ｉは変動し、一方でその他の位置は一定に保たれる。Ｂ． リーダーヘッドをマップする静止ＤＮＡ鎖：一つの塩基がＤＮＡバックボーン（Ｉｓｐｃ３）から欠失している一組のｐｏｌｙＡ ＤＮＡ鎖（ＳＳ２０〜ＳＳ３８）が作成された。各鎖において、ＩＳｐｃ３の位置は３’末端から５’末端に向かって移動する。ＣｓｇＧ細孔を用いた前回の実験に基づき、ＤＮＡの７番目の位置はＣｓｇＧ収縮部内に位置することが期待される。このＤＮＡに対応するＳＳ２６は強調表示されている。（Ａ）からのモデルに基づき、４〜５の塩基はＣｓｇＧおよびＣｓｇＧリーダーヘッドを分離することが期待される。従って、およそ位置１２および１３はＣｓｇＦ収縮部内にあることが期待される。これらの位置に対応するＳＳ３１およびＳＳ３２のＤＮＡ鎖は強調表示されている。ＣおよびＤ。二つのリーダーヘッドのマッピング：各鎖の３’末端でのビオチン修飾が一価ストレプトアビジンと共に複合体化され、各鎖から生成される電流ブロックがＭｉｎＩＯＮセットアップ内に記録される。ｉＳｐｃ３位置が細孔内の収縮部の上または下に存在する場合、偏向は期待されない。ところが、ｉＳｐｃ３が収縮部内に位置する時、より高い電流レベルが細孔を通過することが期待される。これは、塩基の欠失によって生成される余分な空間がより多くのイオンを通過させるためである。従って、各ＤＮＡ鎖について通過する電流をプロットすることによって、二つのリーダーヘッドの位置をマッピングすることができる。予想されるように、ＤＮＡ鎖の位置７がｉＳｐｃ３（Ｃ）によって占有されるとき、電流の最も大きな偏向が見られる。位置６および８でのｉＳｐｃ３はまた、平均ｐｏｌｙＡ電流レベル全体にわたって高めの偏向を生成する。従って、ＤＮＡ鎖の６、７および８位置は、第一のリーダーヘッド（ＣｓｇＧリーダーヘッド）を表す。予想されるとおり、１２番目および１３番目の位置はｉＣｓｐ３によって占有され、ベースラインのｐｏｌｙＡからの別の逸脱が観察される（Ｄ）。これは、細孔の第二のリーダーヘッド（ＣｓｇＦリーダーヘッド）を示す。結果はまた、二つのリーダーヘッドがおよそ４〜５塩基分離れていることを確認する。 （図２７−１と同じ） リーダーヘッド差別および塩基寄与。左側のパネルは、各突然変異体の細孔のリードヘッドの差別を示し、これは、各リードヘッド位置の塩基が変動するときのモデル化された電流の平均変動である。長さｎのアルファベットを有する長さｋのモデルについての位置ｉでのリードヘッド差別を計算するために、リードヘッド位置ｉでの差別を、サイズｎのそれぞれのｎｋ−１群についての電流レベルの標準偏差の中央値として定義した。式中、位置ｉは変動し、一方でその他の位置は一定に保たれる。右側のパネルは塩基寄与プロットを示す。リーダーヘッドの位置ｉに塩基ｂ（Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）を有するすべての配列文脈についての電流中央値。 ダブルリーダーヘッド細孔のエラープロファイル。Ａ． ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体および二つのリーダーヘッドを有するＤＮＡの塩基の相互作用の概略図。赤色：強力な相互作用、オレンジ色：弱い相互作用、灰色：相互作用なし。Ｂ． 欠失におけるエラーの比較。Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）およびＹ５１Ａ／Ｎ５５Ｖ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）からの読取：ＣｓｇＦ−Ｎ１７Ｓ−（１−３５）細孔は、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡの同一の領域から呼び出された塩基であった。読取は、Ｍｉｎｉｍａｐ２（ｈｔｔｐｓ：／／ａｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ａｂｓ／１７０８．０１４９２）を使用して基準ゲノムと整列され、結果的なアライメントがＳａｖａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／２０５６２４４９）で視覚化された。Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）読取の大部分は、Ｔホモポリマー内に単一の塩基欠失（黒いボックス）を含み、これはＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ読取の大部分には存在しない。Ｃ． ホモポリマーの長さに対する、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）（青色）およびＹ５１Ａ／Ｎ５５Ｖ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）：ＣｓｇＦ−Ｎ１７Ｓ−（１−３５）細孔（緑色）から生成された粗製データからのコンセンサス精度の比較。 ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体のホモポリマー呼び出し。（Ａ）に示される配列を有するＤＮＡは、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）細孔（Ｂ）およびＹ５１Ａ／Ｎ５５Ｖ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）：ＣｓｇＦ−Ｎ１７Ｓ−（１−３５）細孔（Ｃ）を通して転座され、それらの信号が（Ａ）で赤色で示された第一のｐｏｌｙＴセクションについて分析された。ポリＴセクションが単一のリーダーヘッドを含むＣｓｇＧ細孔を通過する時（モデルはリーダーヘッド内に位置する５つの塩基に基づく）、信号内に平坦な線を生成する。従って、欠失エラーを引き起こすことの多いこの領域の塩基の正確な数を決定するのは困難である。ＤＮＡが二つのリーダーヘッドを含むＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を通過する時（モデルは、二つのリーダーヘッド内とその間に位置する９つの塩基に基づく）、ポリＴセクションは平坦な線ではなく複数の段を示す。これらの段についての情報は、ホモポリマー領域内の塩基数を正確に特定するのに使用されうる。この追加情報は、欠失エラーを著しく減少させ、全体的なコンセンサス精度を改善する。 （図３０−１と同じ） （図３０−１と同じ） （図３０−１と同じ） ＣｓｇＧ細孔の特徴付け（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）。Ａ．ＣｓｇＧ細孔のリーダーヘッド差別。各リードヘッド位置で塩基が変動する時のモデル化された電流の平均変動。長さｎのアルファベットを有する長さｋのモデルについての位置ｉでのリードヘッド差別を計算するために、リードヘッド位置ｉでの差別を、サイズｎのそれぞれのｎｋ−１群についての電流レベルの標準偏差の中央値として定義した。式中、位置ｉは変動し、一方でその他の位置は一定に保たれる。Ｂ． ＣｓｇＧ細孔の塩基寄与プロット。リーダーヘッドの位置Ｉに塩基ｂ（Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）を有するすべてのｋ量体についての電流中央値。Ｃ． ＤＮＡ鎖がＣｓｇＧ細孔を通過するときの電流シグネチャ。
本発明は、特定の実施形態に関して説明され、特定の図面を参照しながら説明するが、本発明はそれに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。請求項の参照符号は、範囲を限定するものと解釈されないものとする。もちろん、当然のことながら、本発明の任意の特定の実施形態に従ってすべての態様または利点が必ずしも達成されるわけでないことが理解されるべきである。従って、当業者であれば、本明細書に教示または推奨されるように、本明細書に教示されるように、一つまたは複数の利点を達成または最適化する方法で本発明が具現化または実行されうることを認識するであろう。
本発明は、構成および作動方法の両方で、その特徴および利点と共に、以下の詳細な説明を添付図面と併せて読んだときに最も良好に理解されうる。本発明の態様および利点は、以下に記述される実施形態を参照しながら明らかとなり、かつそれによって解明される。本明細書全体を通して、「一実施形態」または「実施形態」に関する言及は、実施形態に関連して説明した特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書全体での様々な場所で「一実施形態での」または「実施形態での」という表現の出現は、必ずしも同じ実施形態に言及するとは限らないが、そのように言及している可能性もある。同様に、当然のことながら、本発明の例示的な実施形態の説明では、本発明の様々な特徴は、本開示を合理化し、さまざまな発明の態様のうちの一つ以上を理解を助ける目的で、単一の実施形態、図またはその記述にまとめられることがある。しかしながら、本開示のこの方法は、特許請求の範囲において、各請求項に明示的に記載されているよりも多くの特徴が必要とされる意図を反映するものとして解釈されるべきではない。むしろ、以下の特許請求の範囲が反映するように、発明の態様は、開示された上記の単一の実施形態のすべての特徴よりも少ない。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が明確に別途指示されない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「ポリヌクレオチド」は２つ以上のポリヌクレオチドを含み、「ポリヌクレオチド結合タンパク質」は２つ以上のこのようなタンパク質を含み、「ヘリカーゼ」は２つ以上のヘリカーゼを含み、「モノマー」は２つ以上の「モノマー」を意味し、「細孔」は２つ以上の細孔および同種のものを含む。
本明細書のすべての考察において、アミノ酸の標準的な一文字コードが使用される。これらは、以下のとおりである：アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）およびバリン（Ｖ）。標準的な置換法も使用され、すなわち、Ｑ４２Ｒは位置４２のＱがＲと置き換えられることを意味する。
特定の位置における異なるアミノ酸が／記号によって分離される段落では、／記号は「または」を意味する。例えば、Ｑ８７Ｒ／Ｋは、Ｑ８７ＲまたはＱ８７Ｋを意味する。
異なる位置が／記号で分離されている段落では、／記号は「および」を意味し、Ｙ５１／Ｎ５５はＹ５１およびＮ５５であることを意味する。
本明細書に開示されるすべてのアミノ酸置換、欠失、および／または追加は、これと反対の記載がない限り、配列番号３に示される配列の変異体を含む突然変異体ＣｓｇＧモノマーを意味する。
配列番号３に示される配列の変異体を含む突然変異体であるＣｓｇＧモノマーへの言及は、以下に開示されるさらなる配列番号に記載された配列の変異体を含む突然変異体ＣｓｇＧモノマーを含む。配列番号３に示される配列の変異体を含む突然変異体ＣｓｇＧモノマーを参照しながら本明細書に開示される置換物、欠失および／または追加に相当する配列の変異体を含むＣｓｇＧモノマーに対し、アミノ酸置換、欠失、および／または追加を行うことができる。
本明細書に引用されるすべての刊行物、特許および特許出願は、上記または下記かを問わず、参照によりその全体が本明細書に援用される。
定義
単数の名詞を言及する時に不定冠詞または定冠詞（例えば、「ａ」、または「ａｎ」、「ｔｈｅ」）が使用される場合、これには、別途特に記載のない限りその名詞の複数が含まれる。「含む」という用語が本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、その他の要素または工程は除外されない。さらに、明細書および特許請求の範囲における第一、第二、第三およびこれに類する用語は、類似した要素を区別するために使用され、また必ずしも逐次的または時間的順序を説明するために使用されるとは限らない。使用される用語は、適切な状況下で互換性があり、本明細書に記述した本発明の実施形態は、本明細書に記述または図示される他の配列で動作する能力があることが理解されるべきである。以下の用語または定義は、本発明の理解を助けるためにのみ提供される。本明細書に特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語は、本発明の当業者にとって同じ意味を有する。実施者は特に、当技術の定義および用語については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ４ｔｈ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２０１２）、 ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １１４）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２０１６）を参照のこと。本明細書に提供される定義は、当業者によって理解されるものよりも狭い範囲を有すると解釈されるべきではない。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、開示された方法を実施するために適切な±２０％または±１０％、より好ましくは±５％の変化、より好ましくは±１％の変化、より好ましくは±０．１％の変化を包含するとともに本明細書で使用される。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド配列」、「ＤＮＡ配列」または「核酸分子」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのどちらかの、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。この用語は、分子の主要構造のみを指す。従って、この用語は、二本鎖ＤＮＡ、および一本鎖ＤＮＡ、およびＲＮＡを含む。本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、各ヌクレオチド上の３’末端および５’末端がホスホジエステル結合によって結合される、単一鎖または二本鎖の共有結合型のヌクレオチド配列である。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基から構成されてもよい。核酸はｉｎ ｖｉｔｒｏで合成で製造されるか、または天然源から単離されうる。核酸は、修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、メチル化されたＤＮＡまたはＲＮＡなど、または、７−メチルグアニオシンによる５’キャッピング、切断およびポリアデニル化など３’プロセシング、およびスプライシングなどの翻訳後修飾を受けたＲＮＡなどさらに含みうる。核酸は、例えばヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣＥｎａ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）などの合成核酸（ＸＮＡ）も含みうる。「ポリヌクレオチド」として本明細書で言及される核酸のサイズは、一般的に二本鎖ポリヌクレオチドについては塩基対（ｂｐ）の数として表現され、または一本鎖ポリヌクレオチドの場合にはヌクレオチド（ｎｔ）の数として表現される。１０００ ｂｐまたは１０００ ｎｔは、１キロベース（ｋｂ）に等しい。長さが約４０ヌクレオチド未満のポリヌクレオチドは典型的に「オリゴヌクレオチド」と呼ばれ、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などのＤＮＡの操作で使用するためのプライマーを含みうる。
本明細書で使用される場合、「遺伝子」とは、遺伝子のプロモーター領域、ならびにコード配列の両方を含む。これは、ゲノム配列（可能性のあるイントロンを含む）のことである場合と、プロモーター配列に動作可能に連結された、重ね継ぎされたメッセンジャーに由来するｃＤＮＡのことである場合の両方がある。
「コード配列」はヌクレオチド配列であり、これは、適切な調節配列の制御下に配置されたときに、ｍＲＮＡに転写および／またはポリペプチドに翻訳される。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンおよび３’末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組み換えヌクレオチド配列、またはゲノムＤＮＡを含みうるが、これらに限定されず、また、イントロンがある一定の状況下で存在してもよい。
本開示の文脈における「アミノ酸」という用語は、その最も広い意味で使用され、アミン（ＮＨ２）およびカルボキシル（ＣＯＯＨ）官能基を、各アミノ酸に特異的な側鎖（例えば、Ｒ基）と共に含有する有機化合物を含むことを意味する。一部の実施形態では、アミノ酸は、天然のＬ α−アミノ酸または残基を指す。天然アミノ酸について一般的に使用される１文字および３文字の略語が本明細書で使用される： Ａ＝Ａｌａ、Ｃ＝Ｃｙｓ、Ｄ＝Ａｓｐ、Ｅ＝Ｇｌｕ、Ｆ＝Ｐｈｅ、Ｇ＝Ｇｌｙ、Ｈ＝Ｈｉｓ、Ｉ＝Ｉｌｅ、Ｋ＝Ｌｙｓ、Ｌ＝Ｌｅｕ、Ｍ＝Ｍｅｔ、Ｎ＝Ａｓｎ、Ｐ＝Ｐｒｏ、Ｑ＝Ｇｌｎ、Ｒ＝Ａｒｇ、Ｓ＝Ｓｅｒ、Ｔ＝Ｔｈｒ、Ｖ＝Ｖａｌ、Ｗ＝Ｔｒｐ、Ｙ＝Ｔｙｒ（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ａ． Ｌ．， （１９７５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２ｄ ｅｄ．， ｐｐ． ７１−９２， Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。「アミノ酸」という用語はさらに、Ｄ−アミノ酸、レトロ−インベルソアミノ酸ならびにアミノ酸類似体などの化学修飾アミノ酸、ノルロイシンなどの通常はタンパク質に組み込まれていない天然アミノ酸、ならびに当業界ではβ−アミノ酸などのアミノ酸に特徴的なものとして知られる特性を有する化学的に合成された化合物を含む。例えば、ペプチド化合物が天然のＰｈｅまたはＰｒｏと同じ構造制限をもたらすことを可能にする、フェニルアラニンまたはプロリンの類似体または模倣体が、アミノ酸の定義に含まれる。このような類似体および模倣体は、本明細書では、それぞれのアミノ酸の「機能的等価物」と呼ばれる。アミノ酸の他の例は、Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｖｅｌｌａｃｃｉｏ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅs： Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｈｏｆｅｒ， ｅｄｓ．， Ｖｏｌ． ５ ｐ． ３４１， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ． １９８３に記載があり、参照により本明細書に組み込まれる。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、本明細書でさらに互換性をもって使用され、アミノ酸残基のポリマーおよびアミノ酸残基の変異体および合成類似体を指す。従って、これらの用語は、一つ以上のアミノ酸残基が、合成非天然のアミノ酸（対応する天然のアミノ酸の化学的類似体など）、および天然のアミノ酸ポリマーである、アミノ酸ポリマーに適用される。ポリペプチドはまた、グリコシル化、タンパク質分解切断、脂質化、シグナルペプチド切断、プロペプチド切断、リン酸化等を含み得るが、これに限定されない、成熟修飾プロセスまたは翻訳後修飾プロセスを受けることができる。「組み換えポリペプチド」とは、組み換え型技術を使用して、例えば、組み換え型ポリヌクレオチドまたは合成ポリヌクレオチドの発現を介して、作製されたポリペプチドを意味する。キメラポリペプチドまたはその生物学的活性部分が組み換えによって生成される場合、それはまた、実質的に培養培地を含まないことが好ましく、例えば、培養培地はタンパク質調製物の体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満を占める。「単離された」とは、自然状態で正常に付随する構成要素を実質的にまたは本質的に含まない材料を意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「単離ポリペプチド」は、自然発生的な状態でそれに隣接する分子から精製されたポリペプチド、例えば、前記ポリペプチドに隣接する産生宿主内に存在する分子から除去されたタンパク質複合体またはＣｓｇＦペプチドなどを指す。単離されたＣｓｇＦペプチド（任意選択的に切断ＣｓｇＦペプチド）は、アミノ酸化学合成により生成することも、組み換え型生成によって生成することもできる。単離された複合体は、複合体（例えば、ＣｓｇＧ細孔およびＣｓｇＦペプチド）の成分の精製後にｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成によって生成することもでき、また組み換え型共発現によって生成することもできる。
「オルソログ」および「パラログ」は、遺伝子の祖先関係を説明するために使用される進化的概念を包含する。パラログは、祖先遺伝子の複製を起源とする同じ種内の遺伝子であり、オルソログは種分化によって起源となった異なる生物体由来の遺伝子であり、共通の祖先遺伝子にも由来する。
タンパク質の「相同体」、「相同体（複数）」は、問題の未修飾または野生型のタンパク質に対してアミノ酸置換、欠失および／または挿入を有し、かつそれらが由来する未修飾タンパク質と類似した生物学的活性および機能的活性を有する、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素を包含する。本明細書で使用される場合、「アミノ酸同一性」という用語は、配列がある比較枠にわたってアミノ酸ごとに同一である程度を指す。従って、「配列同一性の割合」は、二つの最適に並べられた配列を比較枠にわたり比較し、同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両方の配列内で発生する位置の数を決定して、一致する位置の数を求め、比較枠内の位置の総数（すなわち、枠サイズ）で割って、結果に１００を掛けて配列の同一性の割合を求めることによって計算される。
「ＣｓｇＧ細孔」という用語は、複数のＣｓｇＧモノマーを含む細孔を定義する。各々のＣｓｇＧモノマーは、Ｅ． ｃｏｌｉ（配列番号３）からの野生型モノマー、Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＧの野生型相同体であってもよく、例えば、配列番号６８〜８８に示されるアミノ酸配列のいずれか一つ、またはその任意の変異体（例えば、配列番号３および６８〜８８のいずれか一つの変異体）を有するモノマーなどがある。変異体ＣｓｇＧモノマーはまた、修飾ＣｓｇＧモノマーまたは突然変異体ＣｓｇＧモノマーと呼ばれうる。変異体における修飾または突然変異には、本明細書に開示される修飾のうちのいずれか一つ以上、または前記修飾の組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。
本発明のすべての態様および実施形態について、ＣｓｇＧ相同体は、配列番号３に示す野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＧに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の完全な配列同一性を持つポリペプチドを意味する。ＣｓｇＧ相同体はまた、ＣｓｇＧ様タンパク質の特性であるＰＦＡＭドメインＰＦ０３７８３を含むポリペプチドも意味する。現在知られているＣｓｇＧ相同体およびＣｓｇＧ構造の一覧については、ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／／ｆａｍｉｌｙ／ＰＦ０３７８３に記載がある。同様に、ＣｓｇＧ相同ポリヌクレオチドは、配列番号１に示す野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＧに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の完全な配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むことができる。配列番号３に示すＣｓｇＧの相同体の例は、配列番号６８〜８８に示す配列を有する。
「修飾ＣｓｇＦペプチド」または「ＣｓｇＦペプチド」という用語は、そのＣ末端（例えば、Ｎ末端断片）から切断されたＣｓｇＦペプチド、および／または切断部位を含むように修飾されたＣｓｇＦペプチドを定義する。ＣｓｇＦペプチドは、野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦ（配列番号５または配列番号６）の断片、またはＥ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦの野生型相同体の断片であってもよく、例えば、ＣｓｇＦ（例えば、配列番号１７〜３６に示されるアミノ酸配列のいずれか一つを含むペプチド）、またはそれらの任意の変異体（例えば、切断部位を含むように修飾されたもの）などがある。
本発明のすべての態様および実施形態について、ＣｓｇＦ相同体は、配列番号６に示す野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の完全な配列同一性を持つポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、ＣｓｇＦ相同体はまた、ＣｓｇＦ様タンパク質の特性であるＰＦＡＭドメインＰＦ１０６１４を含むポリペプチドを意味する。現在知られているＣｓｇＦ相同体およびＣｓｇＦ構造の一覧については、ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／／ｆａｍｉｌｙ／ＰＦ１０６１４に記載がある。同様に、ＣｓｇＦ相同ポリヌクレオチドは、配列番号４に示す野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の完全な配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むことができる。配列番号６に示すＣｓｇＧの相同体の切断された領域の例は、配列番号１７〜３６に示す配列を有する。
「ＣｓｇＦ成熟ペプチドのＮ末端部分」という用語は、ＣｓｇＦ成熟ペプチドのＮ末端から始まる最初の６０、５０、または４０個のアミノ酸残基（シグナル配列は含まない）に対応するアミノ酸配列を有するペプチドを指す。ＣｓｇＦ成熟ペプチドは、野生型または突然変異体（例えば、一つ以上の突然変異体を有する）でもよい。
配列同一性は、全長ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの断片または部分に対するものでもありうる。従って、配列は、全長基準配列と全体的な配列同一性が５０％しかない場合でも、特定の領域、ドメインまたはサブユニットの配列は、基準配列と８０％、９０％、または９９％の配列同一性を共有することがある。それぞれＣｓｇＧ相同体については配列番号１、またはＣｓｇＦ相同体ついては配列番号４の核酸配列に対する相同性は、単純に配列同一性に限定されるものではない。多くの核酸配列は、明らかに低い配列同一性しか持たないにも関わらず、相互に生物学的に有意な相同性を示すことがある。相同核酸配列は、低い厳密性の条件下で相互に雑種形成するものと考えられる（Ｍ．Ｒ． Ｇｒｅｅｎ、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ、２０１２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｆｏｕｒ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｂｏｏｋｓ １−３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。
「野生型」という用語は、天然の発生源から単離された遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団で最も頻繁に観察されるものであり、従って任意にデザインされた遺伝子の「標準」または「野生型」の形態である。対照的に、「修飾された」、「突然変異体」または「変異体」という用語は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、配列の修飾（例えば、置換、切断、または挿入）、翻訳後修飾および／または機能的特性（例えば、変更された特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。天然の突然変異体は単離されることができ、これらは、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較したときに、特性が変化したという事実によって識別されることが注目に値する。天然のアミノ酸を導入または置換するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、メチオニン（Ｍ）は、突然変異体モノマーをコードするポリヌクレオチドの関連する位置で、メチオニンのコドン（ＡＴＧ）をアルギニンのコドン（ＣＧＴ）で置換することによって、アルギニン（Ｒ）で置換されうる。非天然のアミノ酸を導入または置換するための方法も、当技術分野で周知である。例えば、非天然のアミノ酸は、突然変異体モノマーを発現するために使用されるＩＶＴＴシステムに合成アミノアシル−ＴｒＮＡを含めることによって導入されうる。別の方法として、非天然のアミノ酸は、それらの特定のアミノ酸の合成（すなわち、非天然型）類似体の存在下で、特定のアミノ酸に対する栄養要求性であるＥ． ｃｏｌｉ内に突然変異体モノマーを発現することによって導入されてもよい。突然変異体モノマーが部分的なペプチド合成を用いて生成される場合、それらは裸のライゲーションによって生成されうる。同類置換は、アミノ酸を、類似の化学構造、類似の化学的特性、または類似の側鎖体積を持つ他のアミノ酸で置換する。導入されたアミノ酸は、置換するアミノ酸に類似した極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中和性または電荷を有しうる。あるいは、同類置換は、既存の芳香族アミノ酸または脂肪族アミノ酸の場所に、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入してもよい。保存アミノ酸の変化は当技術分野で周知であり、以下の表１に定義される２０個の主要アミノ酸の特性に従って選択されうる。アミノ酸が類似の極性を持つ場合、これは表２のアミノ酸側鎖についてのヒドロパシースケールを参照することによっても決定されうる。
突然変異体または修飾タンパク質、モノマーまたはペプチドは、任意の方法で、また任意の部位で化学修飾されてもよい。突然変異体または修飾モノマーまたはペプチドは、一つ以上のシステインへの分子の付着（システイン連鎖）、一つ以上のリジンへの分子の付着、一つ以上の非天然アミノ酸への分子の付着、エピトープの酵素修飾、または末端修飾によって、化学修飾されることが好ましい。こうした修飾を実施するための適切な方法は、当技術分野で周知である。修飾タンパク質、モノマーまたはペプチドの突然変異体は、任意の分子の付着によって化学修飾されてもよい。例えば、修飾タンパク質、モノマーまたはペプチドの突然変異体は、染料または発蛍色素分子の付着によって化学修飾されうる。一部の実施形態では、突然変異体または修飾モノマーまたはペプチドは、モノマーまたはペプチドを含む細孔と標的ヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチド配列との間での相互作用を促進する分子アダプターによって化学修飾される。分子アダプターは、環状分子、シクロデキストリン、雑種形成能力のある種、ＤＮＡ結合剤またはインターキレーター、ペプチドまたはペプチド類似体、合成ポリマー、芳香族平面分子、正電荷を持つ分子、またはまたは水素結合の能力を持つ小分子であることが好ましい。
アダプターの存在は、細孔およびヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列のホストゲスト化学を改善し、それによって突然変異体モノマーから形成される細孔の配列決定能力を改善する。ホストゲスト化学の原理は当技術分野で周知である。アダプターは、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列とのその相互作用を改善する細孔の物理的または化学的特性に対する効果を持つ。アダプターは、細孔のバレルまたはチャネルの電荷を変化させるか、またはヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列と特異的に相互作用するか、またはそれに結合して、それによって細孔とのその相互作用を促進しうる。従って、本開示において提供される修飾ＣｓｇＦペプチドは、前記タンパク質または酵素の細孔に対して十分に近接する酵素またはタンパク質に結合されてもよく、これは修飾ＣｓｇＦペプチドを含む細孔複合体の特定の用途を促進しうる。
この文脈では、タンパク質はまた、例えば、組み換えＤＮＡ技術によって作製される融合タンパク質（特に遺伝子融合と呼ばれる）であってもよい。タンパク質はまた、共役結合されてもよく、または「共役結合」してもよく、これは本明細書で使用される場合、安定した共有結合をもたらす化学的および／または酵素的な共役結合を意味する。
タンパク質は、いくつかのポリペプチドまたはタンパク質モノマーが相互に結合または相互作用する時、タンパク質複合体を形成しうる。「結合」は、直接的または間接的を問わず何らかの相互作用を指す。直接的な相互作用とは、結合相手間の接触、例えば共有結合または結合による接触を意味する。間接的相互作用とは、相互作用相手が二つ以上の化合物の複合体内で相互作用する任意の相互作用を意味する。相互作用は、一つ以上の架橋分子の支援によって完全に間接的でもよく、または相手間で依然として直接接触がある部分的に間接的なものでもよく、この場合、一つ以上の化合物の追加的な相互作用によって安定化される。本開示で言及される「複合体」は、異なる機能を有しうる、二つ以上の関連性のあるタンパク質の群として定義される。タンパク質複合体の異なるポリペプチド間の関連性は、疎水性またはイオン力などの非共有相互作用を介してもよく、またはジスルフィド架橋またはペプチド結合などの共有結合または結合を介するものでもよい。共有「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」または「結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）」は本明細書では互換的に使用され、それぞれシステイン間または（光）反応性アミノ酸間での生体共役を意味し、安定した複合体を形成する化学的共有結合である、「システイン結合」または「反応性または光反応性アミノ酸結合」が関与してもよい。光反応性アミノ酸の例には、アジドホモアラニン、ホモプロパルギルグリシン、ホモアレルグリシン、ｐ−アセチルＰｈｅ、ｐ−アジド−Ｐｈｅ、ｐ−プロパルギルオキシ−Ｐｈｅ、およびｐ−ベンゾイル−Ｐｈｅが含まれる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ２０１２、ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ＤＯＩ： １０．５７７２／２８７１９、 Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ． ２００２、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９（１７）、 １１０２０−２４）。
「生物学的細孔」は、膜の一方の側から他方の側への分子およびイオンの転位を可能にするチャネルまたは穴を画定する膜貫通型タンパク質構造である。細孔を通ったイオン種の転位は、細孔の両側に適用される電位差によって駆動されうる。「ナノ細孔」は、分子またはイオンが通過するチャネルの最小直径がナノメートル（１０−９メートル）である生物学的細孔である。一部の実施形態では、生物学的細孔は膜貫通型タンパク質細孔でありうる。生物学的細孔の膜貫通型タンパク質構造は、本質的にモノマーまたはオリゴマーであってもよい。一般に、細孔は、中心軸の周りに配置された複数のポリペプチドサブユニットを含み、それによってナノ細孔が存在する膜に対して実質的に垂直に延びるタンパク質で裏打ちされたチャネルを形成する。ポリペプチドサブユニットの数は限定されない。一般に、サブユニット数は５から最大３０であり、サブユニットの数は６〜１０であることが適切である。別の方法として、サブユニットの数は、ペルフリンゴリシンまたは関連する大きな膜孔の場合には定義されない。タンパク質で裏打ちされたチャネルを形成するナノ細孔内のタンパク質サブユニットの部分は一般に、一つ以上の貫通膜型βバレルおよび／またはα−らせんセクションを含みうる二次構造モチーフを含む。
本明細書で互換的に使用される「細孔」、「細孔複合体」、または「複合体細孔」という用語は、オリゴマー細孔のことであり、例えば、少なくとも一つのＣｓｇＧモノマー（例えば、二つ以上のＣｓｇＧモノマー、三つ以上のＣｓｇＧモノマーなど、一つ以上のＣｓｇＧモノマー）またはＣｓｇＧ細孔（ＣｓｇＧモノマーを含む）、およびＣｓｇＦペプチド（例えば、修飾または切断ＣｓｇＦペプチド）が複合体で関連付けられ、共に細孔またはナノ細孔を形成する。本開示の細孔複合体は、生物学的細孔の特徴を持つ、すなわち、典型的な膜貫通型タンパク質構造を持つ。細孔複合体が膜構成要素、膜、細胞、または絶縁層を持つ環境で提供される時、細孔複合体は膜または絶縁層に挿入され、「膜貫通細孔複合体」を形成する。
本開示の細孔複合体または膜貫通細孔複合体は、分析物の特徴付けに適している。一部の実施形態では、記載されている細孔複合体または膜貫通型複合体は、例えば、異なるヌクレオチド間を高い感度で差別化できるため、ポリヌクレオチド配列の配列決定に使用することができる。本開示の細孔複合体は、実質的に単離されたか、精製されたかまたは実質的に精製された、単離された細孔複合体としうる。本開示の細孔複合体は、通常はその天然の状態に関連付けられる脂質またはその他の細孔、またはその他のタンパク質（例えば、ＣｓｇＥ、ＣｓｇＡ、ＣｓｇＢ）などその他の化合物が全く含まれていない場合に、または膜の区画から十分に濃縮されている場合に、「単離」または精製されている。細孔複合体は、その意図された使用に干渉しない担体または希釈剤と混合される場合、実質的に単離される。例えば、細孔複合体は、１０％未満、５％未満、２％未満、または１％未満のその他の構成要素（トリブロック共重合体、脂質、またはその他の細孔など）を含む形態で存在する場合に、実質的に単離または実質的に精製されている。別の方法として、本開示の細孔複合体は、膜内に存在するときに膜貫通細孔複合体でありうる。本開示は、同一の突然変異体モノマーを含むＣｓｇＧから誘導されたホモオリゴマー細孔を含む単離された細孔複合体を提供し、これはその相同体としてのＣｓｇＧモノマーの突然変異形態も含みうる。別の方法として、ヘテロオリゴマーＣｓｇＧ細孔を含む単離された細孔複合体が提供されており、これは突然変異体および野生型ＣｓｇＧモノマーから成る、または異なる形態のＣｓｇＧ変異体、突然変異体、または相同体から成るＣｓｇＧ細孔でもよい。単離された細孔複合体は、典型的に少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個のＣｓｇＧモノマーを含み、また２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個のＣｓｇＦペプチドなど、一つ以上の（修飾）ＣｓｇＦペプチドを含む。細孔複合体は、任意のＣｓＧモノマー：ＣｓｇＦペプチド比を含みうる。一実施形態では、ＣｓＧモノマー：ＣｓｇＦペプチド比は１：１である。
本明細書で互換的に使用される「収縮部」、「オリフィス」、「収縮領域」、「チャネル収縮」、または「収縮部位」は、イオンおよび標的分子（例えば、ポリヌクレオチドまたは個別ヌクレオチドを含むがこれらに限定されない）の通過を許容するが、細孔複合体チャネルを通した他の非標的分子の通過を許容しない、細孔または細孔複合体の内腔表面によって画定される開口部を意味する。一部の実施形態では、収縮部は、細孔または細孔複合体内の最も狭い開口部である。この実施形態では、収縮部は、細孔を通る分子の通過を制限するように機能しうる。収縮部のサイズは典型的には、核酸配列決定用途でのナノ細孔の適合性を決定する主要要因である。収縮部が小さすぎる場合、配列決定される分子は通過できない。しかし、チャネルを通るイオン流に対する最大効果を達成するために、収縮部は大きすぎるべきではない。例えば、収縮部は、標的分析物の溶剤にアクセス可能な横断直径よりも広くてはならない。理想的には、任意の収縮部は、分析物を通過する分析物の横断直径にできるだけ近づけるべきである。核酸および核酸塩基の配列決定について、適切な収縮部直径はナノメートルの範囲（１０−９メートル範囲）内である。適切には、直径は０．５〜２．０ ｎｍの領域であるべきであり、典型的には、直径は０．７〜１．２ ｎｍの領域である。野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＧの収縮部は、約９Å（０．９ ｎｍ）の直径を有する。ＣｓｇＧ様の細孔および修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体を含む細孔複合体内で形成されたＣｓｇＦ収縮部は、０．５〜２ ｎｍの範囲または０．７〜１．２ ｎｍの範囲の直径を持ち、従って核酸配列決定に適している。
二つ以上の収縮部が存在し、かつ各収縮部が間隔を置いている時、それぞれの収縮部は、同時に核酸鎖内の個別のヌクレオチドと相互作用するか、または「読み取る」場合がある。この状況では、チャネルを通るイオン流の低減は、ヌクレオチドを含むすべての収縮部の流れの制限が組み合わされた結果である。従って、一部の実例では、二重の収縮部は複合電流信号をもたらしうる。一定の状況では、一つの収縮部、または「リーディングヘッド」についての電流読み出しは、二つのこうしたリーディングヘッドが存在する時には個別に決定できない場合がある。野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＧ（配列番号３）の収縮部は、隣接するタンパク質モノマー内の位置５１（Ｔｙｒ５１）における一連のチロシン残基の並置によって形成される、またそれぞれ位置５６および５５におけるフェニルアラニン残基およびアスパラギン残基（Ｐｈｅ ５６およびＡｓｎ ５５）からも形成される二つの環状リングを含む（図１）。ＣｓｇＧの野生型細孔構造は、ほとんどの場合、ＣｓｇＧ収縮部（本明細書で「ＣｓｇＧ チャネル収縮部」として言及）を構成する二つの環状リングの幅を広げる、変更する、または除去するといった組み換え遺伝子技術を介して再操作されて、単一の明確なリーディングヘッドを残す。ＣｓｇＧオリゴマー細孔内の収縮部モチーフは、配列番号３で示す、野生型モノマーＥ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＧポリペプチド内の位置３８〜６３のアミノ酸残基に位置する。 この領域を考慮すると、任意のアミノ酸残基位置５０〜５３、５４〜５６、および５８〜５９での突然変異体と、野生型ＣｓｇＧ構造のチャネル内でのＴｙｒ５１、Ａｓｎ５５、およびＰｈｅ５６の側鎖の位置付けの重要さとが、リーディングヘッドの特性を修正または変更するために有利であることが示された。ＣｓｇＧ細孔および修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体を含む細孔複合体に関する本開示は、意外にも、ＣｓｇＧ含有細孔複合体に対して別の収縮部（本明細書では「ＣｓｇＦチャネル収縮部」として言及）を追加し、修飾ＣｓｇＦペプチドによる複合体形成を介して、細孔内に適切な追加的な第二のリーダーヘッドを形成する。前記追加的なＣｓｇＦチャネル収縮部またはリーダーヘッドは、ＣｓｇＧ細孔の収縮ループ、または突然変異したＧｃｓＧ細孔の収縮ループに隣接して位置付けられる。前記追加的なＣｓｇＦチャネル収縮部またはリーダーヘッドは、ＣｓｇＧ細孔の締付ループから、または突然変異したＧｃｓＧ細孔の収縮ループから、５ ｎｍ以下など、１、２、３、４、５、６、７、８、９ ｎｍなど、約１０ ｎｍ以下の位置に位置付けられる。本開示の細孔複合体または膜貫通細孔複合体は、二つのリーダーヘッドを備えた細孔複合体を含み、すなわち、こうした方法で位置付けられたチャネル収縮部は、他の収縮部チャネルリーダーヘッドの精度に干渉することなく、適切な別個のリーダーヘッドを提供する。従って、前記細孔複合体は、ＣｓｇＧ突然変異体細孔（組み込まれた参考文献ＷＯ２０１６／０３４５９１、ＷＯ２０１７／１４９３１６、ＷＯ２０１７／１４９３１７、ＷＯ２０１７／１４９３１８、国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５１１９１号を参照、それぞれ細孔の特性を改善する野生型ＣｓｇＧ細孔に対する突然変異体が列挙されている）と、野生型ＣｓｇＧ細孔またはその相同体を、修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体と共に含んでもよく、前記ＣｓｇＦペプチドはリーダーヘッドを形成する別の収縮チャネルを有する。
細孔
本発明は、意外にも細孔複合体内に追加的なチャネル収縮部またはリーダーヘッドを導入する、細胞外に位置するＣｓｇＦペプチドと複合体を形成するＣｓｇＧ細孔に関する。さらに、本開示は、細孔複合体内でＣｓｇＦペプチドによって作製される収縮部の位置情報を提供し、ペプチドはＣｓｇＧ細孔の内腔に挿入され、収縮部位はＣｓｇＦタンパク質のＮ末端部分内にある。さらに、本開示の修飾または切断ＣｓｇＦペプチドは、細孔複合体形成に十分であることが示されたと共に、バイオセンシング用途のための手段および方法を提供する。本開示は、野生型および突然変異体のＣｓｇＧ細孔（例えば、ＷＯ２０１６／０３４５９１、ＷＯ２０１７／１４９３１６、ＷＯ２０１７／１４９３１７、ＷＯ２０１７／１４９３１８および国際特許出願公開第ＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５１１９１号で開示）またはその相同体もしくは突然変異体であって、修飾または切断されたＣｓｇＦペプチドおよびその突然変異体または相同体と組み合わせて、まとめて、ＣｓｇＧ様の細孔複合体が分析物（ポリヌクレオチドなど）と相互作用する能力を改善するものを含む。（修飾または切断された）ＣｓｇＦペプチドを用いた複合体形成によってＣｓｇＧ様ナノ細孔チャネル内に導入された追加的な収縮部は、通過する分析物との接触面を拡張し、分析物検出および特徴付けのための第二のリーダーヘッドの役目をすることができる。ＣｓｇＦの新規突然変異体または修飾型と組み合わされた突然変異体ＣｓｇＧモノマーを含む細孔は、ポリヌクレオチドなどの分析物の特徴付けを改善することができ、ポリヌクレオチドが孔を通して移動するときに観察された電流間でのより差別化された直接的な関係を提供する。特に、明確な距離で間隙をおいて積み重ねられた二つのリーダーヘッドを持つことで、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ細孔複合体は、少なくとも一つのホモポリマー的な区間（例えば、単一のＣｓｇＧリーダーヘッドの相互作用の長さを超過する、同じヌクレオチドのいくつかの連続的コピー）を含むポリヌクレオチドの特徴付けを促進しうる。さらに、定義された距離で二つの積み重ねられた収縮部を有することにより、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体細孔を通過する有機または無機の薬剤および汚染物質を含む小分子分析物は、二つの独立したリーダーヘッドを連続的に通過する。どちらのリーダーヘッドの化学的性質も独立して修飾することができ、それぞれに分析物と一意的な相互作用特性が与えられ、そのため分析物検出中に追加的な差別力を提供する。
第一の態様では、本発明は、ＣｓｇＧ細孔またはその相同体もしくは突然変異体、またはＣｓｇＧ様の細孔、および修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体を含む、単離された細孔複合体に関する。実際に、本開示は、修飾ＣｓｇＦペプチド（その切断されたもの、突然変異体および／または変異体でありうる）を含む、修飾ＣｓｇＧ生物学的細孔に関する。一実施形態では、前記修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体の間の相互作用領域は、ＣｓｇＧ細孔またはその相同体もしくは突然変異体の内腔に位置する。別の実施形態では、細孔複合体は、ＣｓｇＧ細孔の少なくとも一つの収縮部によって提供され、また少なくとも一つがＣｓｇＦペプチドによって導入され、ＣｓｇＧ細孔と共に複合体を形成する、二つ以上の収縮部位またはリーダーヘッドを有する。配列番号５のアミノ酸残基３９〜６４の範囲、あるいはより具体的には配列番号５のアミノ酸残基４９〜６４の範囲内の位置を含めたＮ末端ＣｓｇＧ位置が、検出可能な量の安定したＣｓｇＧ：ＣｓｇＧ複合体を可能にするように示されている。一実施形態では、修飾ＣｓｇＦペプチド（例えば、本明細書に記述したもの）によって生成されるＣｓｇＦ収縮部は、細孔複合体のＣｓｇＧ細孔の第一の収縮部に隣接するか、または接近する。ＣｓｇＧまたはＣｓｇＧ様タンパク質細孔の場合、収縮部位は、ベータ鎖のループ領域によって形成されるように決定されている（図１参照）。
一実施形態では、修飾ＣｓｇＦペプチドは、前記修飾が特に、収縮領域を含み、かつＣｓｇＧモノマーまたはその相同体もしくは突然変異体を結合する制約によって画定されるＮ末端ＣｓｇＦペプチド断片を含む、切断ＣｓｇＦタンパク質または断片を意味する、ペプチドである。前記修飾ＣｓｇＦペプチドはさらに、細孔複合体の特定の特性を促進しうる突然変異または相同配列を含んでもよい。特定の実施形態では、修飾ＣｓｇＦペプチドは、野生型前タンパク質（配列番号５）または成熟タンパク質（配列番号６）配列またはその相同体と比較して、ＣｓｇＦタンパク質切断を含む。これらの修飾ペプチドは、ＣｓｇＧおよび修飾または切断されたＣｓｇＦペプチドによって形成されるＣｓｇＧ様細孔内に、追加的な収縮部位またはリーダーヘッドを導入する細孔複合体の構成要素として機能することが意図されている。切断された修飾ペプチドの例を以下に記載する。
修飾ＣｓｇＦペプチドの相同体の例は、例えば、実施例３で決定され、異なる細菌株に相同または類似の収縮部領域を含むＣｓｇＦ様のタンパク質またはＣｓｇＦペプチドを明らかにし、これは類似の細孔複合体の使用において有用でありうる。ＣｓｇＦペプチドが異なる野生型または突然変異体ＣｓｇＧ細孔と組み合わせて使用できるように、様々なＣｓｇＦ相同体に由来するＣｓｇＦペプチド中の構造的特性およびＣｓｇＧ−結合要素が保存される。これには、ＣｓｇＧ細孔の非同族ＣｓｇＦとの複合体が含まれ、ＣｓｇＧ細孔およびＣｓｇＦが由来する親ＣｓｇＧ相同体は、同じオペロン、細菌種または株から生じる必要がないことを意味する。
代替的な実施形態では、細孔複合体内のＣｓｇＧ細孔は野生型の細孔ではないが、細孔特性も同様に増加させるための突然変異または修飾を含む。ＣｓｇＧ細孔またはその相同体、および修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体によって形成される、本開示の単離された細孔複合体は、ＣｓｇＧ細孔の野生型形態によって形成されうるか、または特定のアミノ酸残基の有向の突然変異誘発によるなど、ＣｓｇＧ細孔内でのさらなる修飾がなされて、細孔複合体内で使用するためのＣｓｇＧ細孔の望ましい特性がさらに改善される。例えば、本発明の実施形態では、突然変異はチャネル内の収縮部の数、サイズ、形状、配置または配向を変更することが意図されている。修飾突然変異体ＣｓｇＧ細孔を含む細孔複合体は、ポリペプチド配列内の特定の標的アミノ酸残基の挿入、置換、および／または欠失をもたらす公知の遺伝子工学技術によって準備されてもよい。オリゴマーＣｓｇＧ細孔の場合、突然変異は各モノマーのポリペプチドサブユニット内、またはモノマーのうちのいずれか一つまたはすべてのモノマー内で作製されうる。本発明の一実施形態では、説明した突然変異は、オリゴマータンパク質構造内のすべてのモノマーポリペプチドに対して作製されるのが適切である。突然変異体ＣｓｇＧモノマーは、配列が野生型ＣｓｇＧモノマーの配列から変異し、かつ細孔を形成する能力を維持するモノマーである。細孔を形成するための突然変異体モノマーの能力を確認する方法は、当技術分野で周知である。本開示は、野生型および突然変異体のＣｓｇＧ細孔（例えば、ＷＯ２０１６／０３４５９１、ＷＯ２０１７／１４９３１６、ＷＯ２０１７／１４９３１７、ＷＯ２０１７／１４９３１８および国際特許出願公開第ＰＣＴ／ＧＢ２０１８／０５１１９１号で開示）またはその相同体であって、修飾または切断されたＣｓｇＦペプチドおよびその突然変異体または相同体と組み合わせて、まとめて、ＣｓｇＧ様の細孔複合体が分析物（ポリヌクレオチドなど）と相互作用する能力を改善するものを含む。突然変異体ＣｓｇＧ細孔は、一つ以上の突然変異体モノマーを含みうる。ＣｓｇＧ細孔は、同一のモノマー、または二つ以上の異なるモノマーを含むヘテロポリマーを含むホモポリマーであってもよい。モノマーは、任意の組み合わせで下記に説明した一つ以上の突然変異体を有してもよい。
修飾ＣｓｇＦペプチドを含むナノ細孔複合体は、特定の実施形態では野生型ＣｓｇＦタンパク質のＮ末端断片または切断のみを含むため、配列番号６に示される野生型ＣｓｇＦタンパク質と比較して異なる。ところが、修飾ＣｓｇＦペプチドは、ＣｓｇＧ細孔および修飾ＣｓｇＦペプチドを含む複合体によって形成される細孔においてアミノ酸置換としての突然変異がより良好な第二の収縮部位を許容するという意味で、追加的または代替的に突然変異したＣｓｇＦペプチドであり得る。そのため、突然変異体モノマーは、二つのリーダーヘッドを含むように複合体の機能が改善されることに加えて、前記複合体がヌクレオチド配列決定に使用される時、すなわち、改善されたポリヌクレオチド捕捉およびヌクレオチド差別の改善が示される時、ポリヌクレオチド読取特性を改善しうる可能性がある。特に、突然変異ペプチドから構成される細孔が、野生型よりも簡単にヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを捕捉する。さらに、突然変異ペプチドから構成された細孔は、電流範囲の増加を示す場合があり、これは異なるヌクレオチド間の差別を容易にし、状態の分散を減少させ、これが信号対雑音比を増大させる。さらに、ポリヌクレオチドが突然変異体から構成される細孔を通して移動するとき、電流に寄与するヌクレオチドの数は減少しうる。これは、ポリヌクレオチドが細孔およびポリヌクレオチド配列を通して移動する時、観察される電流間の直接的な関係の識別を容易にする。さらに、突然変異ペプチドから構成される細孔は、増加したスループットの増大を示すことがあり、例えば、ポリヌクレオチドなどの分析物と相互作用する可能性が高い。これにより、細孔を使用した分析物の特徴付けが容易になる。突然変異ペプチドから構成された細孔は、より簡単に膜に挿入することができ、または細孔複合体の近傍に追加的なタンパク質を保持するより簡単な方法を提供しうる。
別の実施形態では、本発明の細孔複合体内に提供されるＣｓｇＦ収縮部位は、０．５ ｎｍ〜２．０ ｎｍの範囲の直径を有し、それによって上述のように核酸配列決定に適した細孔複合体を提供する。
細孔は、ＣｓｇＦペプチドのＣｓｇＧ細孔への共有結合によって安定化されうる。共有結合性は、例えば、ジスルフィド結合であってもよく、またはクリックケミストリーでもよい。ＣｓｇＦペプチドおよびＣｓｇＧ細孔は、例えば、１と１５３、４と１３３、５と１３６、８と１８７、８と２０３、９と２０３、１１と１４２、１１と２０１、１２と１４９、１２と２０３、２６と１９１、および２９と１４４といった、それぞれ配列番号６と配列番号３の位置の対に対応する位置にある一つ以上の残基を介して、共有結合されてもよい。
細孔において、ＣｓｇＦペプチドとＣｓｇＧ細孔との間の相互作用は、例えば、１と１５３、４と１３３、５と１３６、８と１８７、８と２０３、９と２０３、１１と１４２、１１と２０１、１２と１４９、１２と２０３、２６と１９１、および２９と１４４とった、それぞれ配列番号６および配列番号３の位置の対の一つ以上に対応する位置での疎水性相互作用または静電気的相互作用によって安定化されうる。
上記の一つ以上の位置にあるＣｓｇＦおよび／またはＣｓｇＧの残基は、細孔内のＣｓｇＧとＣｓｇＦとの間の相互作用を強化するために修飾されてもよい。
一実施形態では、本発明の細孔は、単離されうる、実質的に単離されうる、精製されうる、または実質的に精製されうる。本発明の細孔は、脂質またはその他の細孔などのその他任意の構成要素を全く含まない場合、単離または精製されている。細孔は、その意図された使用に干渉しない担体または希釈剤と混合される場合、実質的に単離されている。例えば、細孔は、１０％未満、５％未満、２％未満、または１％未満のその他の構成要素（トリブロック共重合体、脂質、またはその他の細孔など）を含む形態で存在する場合、実質的に単離または実質的に精製されている。別の方法として、本発明の細孔は膜内に存在しうる。適切な膜について以下で考察する。
本発明の細孔は、個別または単一の細孔として存在しうる。別の方法として、本発明の細孔は、二つ以上の細孔の相同集団または異種集団に存在しうる。
ＣｓｇＦペプチド
本発明の第二の態様は、新規修飾ＣｓｇＦモノマー（ペプチド）、またはＣｓｇＦタンパク質、またはＣｓｇＦ相同体または突然変異体の修飾もしくは切断されたペプチドに関する。これらの新規の修飾ＣｓｇＦペプチドは、第二または追加のリーダーヘッドを組み込むために細孔複合体で使用されてもよい。前記修飾または切断は、野生型ＣｓｇＦの、または突然変異体または相同体のＣｓｇＦタンパク質の断片をもたらすことが好ましく、Ｎ末端断片がより好ましい。
成熟ＣｓｇＦ（配列番号６に示す）は、「ＣｓｇＦ収縮ペプチド」（ＦＣＰ）、「ネック」領域および「ヘッド」領域（図４および５に示す）といった３つの主領域に分けることができる。ＣｓｇＦペプチドの「ヘッド」領域は、本明細書に記載の細孔のリーダーヘッドとは異なる。ＣｓｇＦペプチドの「ヘッド」領域はまた、「Ｃ末端ヘッドドメイン」と呼ばれてもよい。
ＦＣＰはＣｓｇＧ β−バレルと接触領域を形成し、ここで追加的な収縮部が生じる。ネック領域は、β−バレルから突き出す。ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦオリゴマーでは、これはＦＣＰを球状ヘッド領域に接続する薄壁の中空管を形成する。
多重配列アライメント（図８）、共精製実験（図９）、３．４ Å分解能（図１１）におけるＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体のｃｒｙｏＥＭ再構成に基づき、ＣｓｇＦ収縮ペプチド、ネック領域およびヘッド領域は、成熟ＣｓｇＦ内の連続した三つの残基として画定されうる。
ＦＣＰは、成熟ＣｓｇＦ（配列番号６）のおよそ残基１〜３５にわたる。ＦＣＰは、異なるＣｓｇＦオルソログを比較する時に、タンパク質の最も保存された領域を形成する（図８、図１０）。ＣｒｙｏＥＭの３Ｄ再構成は、ＣｓｇＧ膜貫通ヘアピンＴＭ１（配列番号３の残基１３４〜１５４）およびＴＭ２（配列番号３の残基１８４〜２０８）（図１Ｅ、１１）との非共有結合性の接触による、ＣｓｇＧ β−バレル内部を結合する十分に画定された構造であるＦＣＰ形態を示す（ＴＭ１およびＴＭ２は、Ｇｏｙａｌ Ｐら、２０１４で定義）。再構成では、ＦＣＰの９つのコピーが、ＣｓｇＧオリゴマー（９個のモノマーを含む）を結合し、まとめて成熟ＣｓｇＧ（配列番号３、図１Ｅ、図１１）の残基４６〜６１にわたる連続ループによって形成されたＣｓｇＧ収縮部の上部の約２ ｎｍよりも高い追加的収縮部を生じさせる。
ｃｒｙｏＥＭの３Ｄ再構成はまた、ＣｓｇＦ Ｎ末端残基も、ＣｓｇＧ β−バレルの底部または上部（配向に応じて）付近を結合し、β−バレルを残基３２で出ることを示す。これは、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ結合面における残基対の平均接触時間を示すＭＤシミュレーション（表４）とよく一致している。ｃｒｙｏＥＭ構造およびＭＤシミュレーションは、残基３３〜３４が、十分に（ただし厳密にではない）保存されたＰｒｏ残基（配列番号６のＰｒｏ ３５）がＣｓｇＦネック領域に移行するＣｓｇＧ β−バレルの外側に存在することを示す。ＣｓｇＦネックは、立体配置的柔軟性を指し示すＣｓｇＧ：ＣｓｇＦの３Ｄ再構成において原子レベルでは分解されていない。ＣｓｇＦネックは、多重配列アライメントおよび二次構造予測に基づいて、残基３６からほぼ残基５０（配列番号６）にわたることが予測される。ＣｓｇＦヘッド領域は、ＣｓｇＦのＣ末端部を形成し、およそ残基５１からＣｓｇＦ Ｃ末端までわたることが予測される。ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体では、この領域は、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦチャネルを塞ぐように見える球状構造を生じさせるようオリゴマー形成する（図４、５）。ＣｓｇＦオルソログの多重配列アライメントは、ＣｓｇＦネックが最も保存されていない領域であることを示しており、またあるオルソログと別のオルソログでは長さが変化しうることを示唆している（図８）。
本発明の一部を形成するＣｓｇＦペプチドは、Ｃ末端ヘッドを欠くか、Ｃ末端ヘッドおよびＣｓｇＦのネックドメインの一部を欠く（例えば、切断ＣｓｇＦペプチドはＣｓｇＦのネックドメインの一部分のみを含みうる）か、Ｃ末端ヘッドおよびＣｓｇＦのネックドメインを欠く、切断ＣｓｇＦペプチドである。ＣｓｇＦペプチドはＣｓｇＦネックドメインの一部を欠いていてもよく、例えば、ＣｓｇＦペプチドは、例えば、ネックドメインのＮ末端にあるアミノ酸残基３６（配列番号６を参照）からなど（例えば、配列番号６の残基３６−４０、３６−４１、３６−４２、３６−４３、３６−４５、３６−４６から、残基３６−５０または３６−６０まで）、ネックドメインの一部分を含みうる。ＣｓｇＦペプチドは、ＣｓｇＧ結合領域と、細孔内の収縮部を形成する領域とを含むことが好ましい。ＣｓｇＧ結合領域は典型的に、ＣｓｇＦタンパク質（配列番号６または別の種由来の相同体）の残基１〜８、および／または残基２９〜３２を含み、一つ以上の修飾を含みうる。細孔内の収縮部を形成する領域は典型的に、ＣｓｇＦタンパク質（配列番号６または別の種由来の相同体）の残基９〜２８を含み、一つ以上の修飾を含みうる。残基９〜１７は、保存されたモチーフＮ９ＰＸＦＧＧＸＸＸ１７を含み、回転領域を形成する。残基９〜２８は、αらせんを形成する。Ｘ１７（配列番号６のＮ１７は、細孔内のＣｓｇＦ収縮部の最も狭い部分に対応する収縮部領域の頂点を形成する。ＣｓｇＦ収縮領域はまた、ＣｓｇＧ βバレル、主に配列番号６の残基９、１１、１２、１８、２１および２２との接触を安定化させる。
ＣｓｇＦペプチドは典型的に、２８〜５０アミノ酸、例えば２９〜４９、３０〜４５または３２〜４０アミノ酸などの長さを有する。ＣｓｇＦペプチドは、２９〜３５アミノ酸、または２９〜４５アミノ酸を含むことが好ましい。ＣｓｇＦペプチドは、配列番号６の残基１〜３５に対応するＦＣＰのすべてまたは一部を含む。 ＣｓｇＦペプチドがＦＣＰより短い場合、切断はＣ末端でなされることが好ましい。
配列番号６またはその相同体もしくは突然変異体のＣｓｇＦ断片は、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１，３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４または５５のアミノ酸の長さを有してもよい。
ＣｓｇＦペプチドは、残基１から残基２５〜６０のうちのいずれか一つ（例えば配列番号６の２７〜５０、例えば２８〜４５）までの配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６の相同体からの対応する残基、またはそのいずれかの変異体を含みうる。より具体的には、ＣｓｇＦペプチドは、配列番号３９（配列番号６の残基１〜２９）またはその相同体または変異体を含みうる。
このようなＣｓｇＦペプチドの例は、配列番号１５（配列番号６の残基１〜３４）、配列番号５４（配列番号６の残基１〜３０）、配列番号４０（配列番号６の残基１〜４５）、または配列番号５５（配列番号６の残基１〜３５）およびそれらの任意の相同体または変異体から本質的に構成されるかまたは構成される。ＣｓｇＦペプチドの他の例は、以下の配列番号を含む、それらから本質的に構成されるか、またはそれらから構成される：配列番号 ７、配列番号 ８、配列番号 ９、配列番号 １０、配列番号 １１、配列番号 １２、配列番号 １３、配列番号 １４、配列番号 １６。
ＣｓｇＦペプチドでは、一つ以上の残基、例えば、配列番号 １５、配列番号 ３９、配列番号 ４０、配列番号５４、または配列番号５５は修飾されてもよい。
例えば、ＣｓｇＦペプチドは、配列番号６の以下の一つ以上に対応する位置に修飾を含んでもよい：Ｇ１、Ｔ４、Ｆ５、Ｒ８、Ｎ９、Ｎ１１、Ｆ１２、Ａ２６およびＱ２９。
ＣｓｇＦペプチドは、システイン、疎水性アミノ酸、荷電アミノ酸、非ネイティブ反応性アミノ酸、または光反応性アミノ酸を、例えば、配列番号６の以下の一つ以上に対応する位置に導入するように修飾されてもよい：Ｇ１、Ｔ４、Ｆ５、Ｒ８、Ｎ９、Ｎ１１、Ｆ１２、Ａ２６およびＱ２９。
例えば、ＣｓｇＦペプチドは、配列番号６の以下の一つ以上に対応する位置に修飾を含んでもよい：Ｎ１５、Ｎ１７、Ａ２０、Ｎ２４、およびＡ２８。ＣｓｇＦペプチドは、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＦ複合体を安定化させるためにＤ３４に対応する位置に修飾を含みうる。特定の実施形態では、ＣｓｇＦペプチドは、以下の置換のうちの一つ以上を含む：Ｎ１５Ｓ／Ａ／Ｔ／Ｑ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｃ、Ｎ１７Ｓ／Ａ／Ｔ／Ｑ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｃ、Ａ２０Ｓ／Ｔ／Ｑ／Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｃ、Ｎ２４Ｓ／Ｔ／Ｑ／Ａ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｃ、Ａ２８Ｓ／Ｔ／Ｑ／Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／ＣおよびＤ３４Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｃ。ＣｓｇＦペプチドは、例えば、一つ以上の以下の置換を含みうる：Ｇ１Ｃ、Ｔ４Ｃ、Ｎ１７Ｓ、およびＤ３４ＹまたはＤ３４Ｎ。
ＣｓｇＦペプチドは、全長ＣｓｇＦなどの長いタンパク質を酵素を使用して切断することによって生成されうる。特定の部位での切断は、適切な位置に酵素切断部位を含むように全長ＣｓｇＦなどの長いタンパク質を修飾することによって指図されうる。こうした酵素切断部位を含むように修飾されたＣｓｇＦアミノ酸配列の例が、配列番号５６〜６７に示されている。切断後、追加された酵素切断部位のすべてまたは一部は、ＣｓｇＧと関連付けられて細孔を形成するＣｓｇＦペプチド内に存在しうる。従って、ＣｓｇＦペプチドは、そのＣ末端における酵素切断部位のすべてまたは一部をさらに含んでもよい。
適切なＣｓｇＦペプチドの一部の例を、以下の表３に示す。
特定の実施形態では、前記ＣｓｇＦ断片は、アミノ酸配列番号３９、またはその突然変異体または相同体を含む。特に、配列番号３９は、成熟ＣｓｇＦペプチド（配列番号６）の最初の２９個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、本発明の修飾ＣｓｇＦペプチドは配列番号４０を含む切断ペプチドである。特に、配列番号４０は、成熟ＣｓｇＦペプチド（配列番号６）の最初の４５個のアミノ酸を含む。特に、ＣｓｇＦ収縮部位およびＣｓｇＧへの結合部位は、Ｎ末端ＣｓｇＦペプチド領域内に位置し、配列番号５のアミノ酸３９〜６４（配列番号３９および配列番号４０内に存在）、または特に配列番号５のアミノ酸４９〜６４（配列番号４０内に存在するが、配列番号３９内には存在しない、配列番号３９によってコードされる後者の断片はＣｓｇＧとの弱めの相互作用を示す（例を参照））が、複合体により高い安定性を与えるという点で、さらに特徴付けられる。従って、本開示は、ＣｓｇＧ細孔またはその相同体もしくは突然変異体とのｉｎ ｖｉｖｏでの複合体形成を可能にするために、前記ペプチド、または前記Ｎ末端断片または収縮部位領域を含むペプチドに対してタンパク質の切断をすることによって、ＣｓｇＦタンパク質の修飾を提供する。一実施形態では、配列番号３７または配列番号３８を含む修飾ＣｓｇＦペプチドに関して、さらなる制限がある。最後に、ＣｓｇＦ相同ペプチド、特に収縮領域（ＦＣＰペプチド）内に配置されているＣｓｇＦ相同ペプチドの識別は、前記単離された複合体の一部を形成しうる修飾ＣｓｇＦペプチド相同体も提供する（例えば、図８および１０を参照）。
さらなる実施形態は、配列番号１５を含む修飾または切断ＣｓｇＦペプチドに関連し、ここで前記配列番号１５は、ＣｓｇＦチャネル収縮を含む単離された細孔複合体をもたらすために、ＣｓｇＧまたはその相同体および修飾ＣｓｇＦペプチドを含む複合体細孔のｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成に十分なＣｓｇＧ結合部位および／または収縮部位の領域からのいくつかの残基を含むＣｓｇＦタンパク質の領域を含む。別の実施形態は、配列番号１６を含む前記修飾ＣｓｇＦペプチドを説明しており、これは、ＣｓｇＦタンパク質のＮ末端断片および二つの追加的なアミノ酸（ＫＤ）を含み、これが、（合成）ペプチドの溶解性および安定性を増加させるとともに、前記複合体細孔のｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成を許容する。前記修飾ＣｓｇＦペプチドが配列番号１５、配列番号１６またはその相同体もしくは突然変異体を含む実施形態がさらに提供されており、ここで、前記修飾ＣｓｇＦペプチドはさらに突然変異がなされているが、前記配列番号１５または１６に対応する修飾ＣｓｇＦペプチドの領域内で、それぞれ配列番号１５、または配列番号１６に対して、例えば、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％のアミノ酸同一性など、最低でも３５％のアミノ酸同一性がなおも保持されている。前記修飾ＣｓｇＦペプチドが配列番号１５、配列番号１６またはその相同体もしくは突然変異体を含む実施形態がさらに提供されており、ここで、前記修飾ＣｓｇＦペプチドはさらに突然変異がなされているが、前記配列番号１５または１６に対応する修飾ＣｓｇＦペプチドの領域内で、それぞれ配列番号１５、または配列番号１６に対して、最低でも４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％のアミノ酸同一性がなおも保持されている。これらの突然変異領域は、上述の通り、ＣｓｇＦ収縮部位の特性を変更および／または改善することを意図しており、そのため例えば、より正確な標的分析を得ることができる。別の実施形態では、修飾ＣｓｇＦペプチドが開示されており、ここで、配列番号３９、配列番号４０、配列番号５４、または配列番号５５を含む領域の一つ以上の位置が修飾され、また前記突然変異体が配列番号３９、配列番号４０、配列番号５４、または配列番号５５を含む領域に対応するペプチド断片において、配列番号３９、配列番号４０、配列番号５４、または配列番号５５の最低でも３５％のアミノ酸同一性、または４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％のアミノ酸同一性を保持する。
そのため、本発明のさらなる実施形態は、ＣｓｇＧ細孔またはその相同体もしくは突然変異体、ならびにその変性ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体を含む単離された細孔複合体に関連し、ここで、前記修飾ＣｓｇＦペプチドは本発明の第二の態様に記載されるように定義される。
追加的な実施形態は、単離された細孔複合体に関連し、ここで、少なくとも一つのモノマーを介した前記ＣｓｇＧ細孔および修飾ＣｓｇＦペプチドは、共有結合を介して結合される。前記共有結合または結合は、システイン結合を介して可能な一つの例であり、システインのスルフヒドリル側基は、別のアミノ酸残基または部分と共有結合する。第二の可能性において、共有結合性、非天然の（光）反応性アミノ酸間の相互作用を介して得られる。（光）反応性アミノ酸は、タンパク質複合体の架橋に使用できる天然アミノ酸の人工的アナログを指し、タンパク質およびペプチドにｉｎ ｖｉｖｏまたは ｉｎ ｖｉｔｒｏで組み込まれうる。一般的な使用における光反応性アミノ酸類似体は、ロイシンおよびメチオニン、およびパラ−ベンゾイル−フェニル−アラニン、ならびにアジドホモアラニン、ホモプロパルギルグリシン、ホモアレルグリシン、ｐ−アセチル−Ｐｈｅ、ｐ−アジド−Ｐｈｅ、ｐ−プロパルギルオキシ−Ｐｈｅ、およびｐ−ベンゾイル−Ｐｈｅに対する光反応性ジアジリン類似体である（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１２、Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ． ２００２）。紫外線光に暴露されると、これらは活性化され、光反応性アミノ酸類似体のいくつかのオングストローム内にある相互作用タンパク質に結合される。しかしながら、前記共有結合性が発生しうるＣｓｇＧモノマー中の位置は、修飾ＣｓｇＦペプチドへの暴露に依存する。図１に示すように、いくつかのアミノ酸は、共有結合性を提供する位置、すなわち配列番号３またはその相同体の位置１３２、１３３、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、２０１、２０３、２０５、２０７または２０９にある。
本発明の別の態様は、前記修飾ＣｓｇＦペプチドを含む構成体に関し、前記ペプチドは共有結合している。「構成体」は、修飾ＣｓｇＦおよび／またはＣｓｇＧまたはその相同体から誘導される二つ以上の共有結合したモノマーを含む。別の言い方をすると、構成体は複数のモノマーを含みうる。別の態様では、本発明は本発明の少なくとも一つの構成体を含む細孔複合体も提供する。細孔複合体は、十分な構成体を含み、必要に応じて細孔を形成するモノマーを含む。例えば、八量体細孔は、（ａ）それぞれ二つのモノマーを含む四つの構成体、（ｂ）それぞれ四つのモノマーを含む二つの構成体、（ｃ）二つのモノマーを含む一つの構成体と構成体の一部を形成しない六つのモノマー、または（ｄ）一つの構成体内の一つもしくは二つのＣｓｇＦモノマーと、六つもしくは七つのＣｓｇＧモノマーを有する一つの構成体、あるいはさらには（ｅ）ＣｓｇＧモノマーのみを含む別の構成体に加えてＣｓｇＦおよびＣｓｇＧモノマーを有する構成体を含みうる。例えば、九量体細孔に対して同一および追加的な可能性が提供される。構成体およびモノマーのその他の組み合わせが、当業者によって想定され得る。本発明の一つ以上の構成体は、配列決定、ポリヌクレオチドなどの特徴付けのための細孔複合体を形成するために使用されうる。構成体は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個のモノマーを含みうる。構成体は二つのモノマーを含むことが好ましい。二つ以上のモノマーは同一であっても異なっていてもよく、ＣｓｇＦ、ＣｓｇＧ、ＣｓｇＧ／ＣｓｇＦ融合モノマーまたはその相同体、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
別の実施形態は、本発明の前記修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体をコードするポリヌクレオチドまたは核酸分子、または上述の構成体をコードするポリヌクレオチドに関する。
特定の実施形態は、本発明の第一および第二の態様による単離された細孔複合体と、膜の構成要素とを含む、単離された膜貫通細孔複合体に関する。前記単離された膜貫通細孔複合体は、核酸配列決定などの分子感知の使用に直接適用可能である。別の方法として、本明細書で説明した本発明の単離された細孔複合体による修飾ＣｓｇＧ／ＣｓｇＦ生物学的細孔、および膜、膜構成要素、または絶縁層を含む、膜組成物が提供される。一つの実施形態は、本発明による単離された細孔複合体から成る単離された膜貫通細孔複合体と、膜の構成要素とに関する。
ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体は非常に安定しているが、ＣｓｇＦが切断されると、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の安定性は全長ＣｓｇＦを含む複合体と比較して減少する。従って、例えば、本明細書で特定される位置にシステイン残基を導入した後で、ジスルフィド結合をＣｓｇＧとＣｓｇＧの間に作製して、複合体をより安定させることができる。細孔複合体は、これまでに述べた方法のいずれかで作製することができ、ジスルフィド結合形成は、酸化剤（例えば、銅−オルソフェナントロリン）を使用することによって誘発されうる。その他の相互作用（例えば、疎水性相互作用、電荷充電相互作用／静電相互作用）も、システイン相互作用の代わりにそれらの位置で使用することができる。
別の実施形態では、非天然アミノ酸がそれらの位置に組み込まれてもよい。この実施形態では、共有結合は、クリックケミストリーを介して作製される。例えば、アジドまたはアルキンを有する非天然アミノ酸、またはジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）基および／またはビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）基を、これらの位置の一つ以上に導入されうる。
こうした安定化させる突然変異は、例えば、本明細書に開示される修飾などのＣｓｇＧおよび／またはＣｓｇＦに対するその他の任意の修飾と組み合わせることができる。
ＣｓｇＧ細孔は、ＣｓｇＦペプチドへの付着を促進するように修飾された２、３、４、５、６、７、８、９または１０個など少なくとも一つのＣｓｇＧモノマーを含みうる。例えば、システイン残基は、配列番号３の位置１３２、１３３、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、２０１、２０３、２０５、２０７および２０９に対応する一つ以上の位置に、および／またはＣｓｇＦと接触してＣｓｇＧへの共有結合を促進することが予測される表４に記載された任意の一つの位置に導入されうる。システイン残基を介した共有結合に対する代替的または追加として、細孔は疎水性相互作用または静電相互作用によって安定化されうる。こうした相互作用を促進するために、配列番号３の位置１３２、１３３、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、２０１、２０３、２０５、２０７および２０９の一つ以上に対応する位置で、および／またはＣｓｇＦと接触することが予測される表４に記載された任意の一つの位置で、非ネイティブ反応性または光反応性アミノ酸が。
ＣｓｇＦペプチドは、ＣｓｇＧ細孔への付着を促進するように修飾されうる。例えば、システイン残基は、配列番号６の位置１、４、５、８、９、１１、１２、２６または２９に対応する一つ以上の位置に、および／またはＣｓｇＦと接触してＣｓｇＧへの共有結合を促進することが予測される表４に記載された任意の一つの位置に導入されうる。システイン残基を介した共有結合に対する代替的または追加として、細孔は疎水性相互作用または静電相互作用によって安定化されうる。こうした相互作用を促進するために、配列番号６の位置１、４、５、８、９、１１、１２、２６または２９の一つ以上に対応する位置で、および／またはＣｓｇＦと接触することが予測される表４に記載された任意の一つの位置で、非ネイティブ反応性または光反応性アミノ酸が。
好ましい例示的なＣｓｇＦペプチドは、配列番号６に対する以下の突然変異を含む： Ｎ１５Ｘ１／Ｎ１７Ｘ２／Ａ２０Ｘ３／Ｎ２４Ｘ４／Ａ２８ＸＸ５／Ｄ３４Ｘ６、式中、Ｘ１はＮ／Ｓ／Ａ／Ｔ／Ｑ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｃ、Ｘ２はＮ／Ｓ／Ａ／Ｔ／Ｑ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｃ、Ｘ３はＡ／Ｓ／Ｔ／Ｑ／Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｃ、Ｘ４はＮ／Ｓ／Ｔ／Ｑ／Ａ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｃ、Ｘ５はＡ／Ｓ／Ｔ／Ｑ／Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／ＣおよびＸ５はＤ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｃである。位置Ｎ１５、Ｎ１７、Ａ２０、Ｎ２４およびＡ２８での突然変異体は、収縮突然変異体であり、位置３４での突然変異体は、ＣｓｇＧ細孔の底部との相互作用ｐｆ ＣｓｇＦに影響して相互作用を安定化させる。
ＣｓｇＧ細孔
ＣｓｇＧ細孔は、本発明の同一の突然変異体モノマーを含むホモオリゴマー細孔であってもよい。ＣｓｇＧ細孔は、例えば、本明細書に開示される少なくとも一つの突然変異体モノマーを含む、ＣｓｇＧから誘導されるヘテロオリゴマー細孔であってもよい。
ＣｓｇＧ細孔は、任意の数の突然変異体モノマーを含みうる。細孔は、一般に、７個、８個、９個、または１０個の突然変異体モノマーなど、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の同一の突然変異体モノマーを含む。ＣｓｇＧ細孔は、８個または９個の同一の突然変異体モノマーを含むことが好ましい。
好ましい実施形態では、ヘテロオリゴマーＣｓｇＧ細孔（モノマーのうちの１０個、９個、８個または７個など）内のすべてのモノマーは、本明細書に開示される突然変異体モノマーであり、ここでそれらの少なくとも一つは他と異なる。これらは互いに異なりうる。
ＣｓｇＧ細孔内の突然変異体モノマーは、すべてほぼ同一の長さであるか、または同一の長さであることが好ましい。本発明の細孔内の突然変異体モノマーのバレルは、ほぼ同一の長さであるか、または同一の長さであることが好ましい。長さは、アミノ酸数および／または長さの単位で測定されうる。
突然変異体モノマーは、配列番号３の変異体であってもよい。配列番号３のアミノ酸配列の全長にわたり、変異体は、アミノ酸同一性に基づき、その配列に対し少なくとも５０％相同であることが好ましい。変異体は、配列全体にわたる配列番号３のアミノ酸配列に対するアミノ酸同一性に基づき、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％であることが好ましく、また少なくとも９５％、９７％または９９％の相同性を持ちうることがより好ましい。例えば、１００以上、例えば１２５、１５０、１７５または２００以上の連続的なアミノ酸範囲にわたり、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性を有しうる（「ハード相同性」）。
ＣｓｇＧモノマーは、高度に保存されている（ＷＯ２０１７／１４９３１７の図４５〜４７から容易に理解できる）。さらに、配列番号３に関連した突然変異の知識から、配列番号３以外のＣｓｇＧモノマー突然変異の同等の位置を決定することが可能である。
従って、配列番号３に示される配列の変異体および本明細書の特許請求の範囲その他に記載される特定のそのアミノ酸突然変異体を含む突然変異体ＣｓｇＧモノマーに関する言及は、配列番号６８〜８８およびその対応するアミノ酸突然変異に示される配列の変異体を含む突然変異体ＣｓｇＧモノマーも包含する。同様に、配列番号３に示される配列の変異体および本明細書において記載される特定のアミノ酸突然変異を含むＣｓｇＧモノマーに関する細孔の使用が関与する構成体、細孔または方法への言及は、上記に開示された配列番号およびその対応するアミノ酸突然変異の変異体を含む突然変異体ＣｓｇＧモノマーに関連する構成体、細孔または方法を包含する。さらに理解されるとおり、本発明は、高度に保存された領域を示す特異化では明示的に特定されていない他の変異体ＣｓｇＧモノマーにも及ぶ。
当技術分野の標準的な方法を使用して、相同性を決定してもよい。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、例えば、そのデフォルト設定で使用して、相同性を計算するために使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ （１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２， ｐ３８７−３９５）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、相同性またはラインアップ配列（同等な残基または対応する配列を特定するなど（典型的に、それらのデフォルト設定で））の計算に使用されうる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ． Ｆ． （１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００、 Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ ｅｔ ａｌ （１９９０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０に記載がある。ＢＬＡＳＴ解析を実行するソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公に利用可能である。
配列番号３は、野生型ＣｓｇＧモノマーであり、大腸菌株 Ｋ−１２ ｓｕｂｓｔｒ． ＭＣ４１００に由来する。配列番号３の変異体は、別のＣｓｇＧ相同体に存在する任意の置換を含みうる。好ましいＣｓｇＧ相同体を配列番号６８〜８８に示す。変異体は、配列番号３と比較して配列番号６８〜８８に存在する置換のうちの一つ以上の組み合わせを含みうる。例えば、配列番号３と配列番号６８〜８８のいずれか一つとの間で異なる配列番号３の位置のうち任意の一つ以上の位置で突然変異を作製してもよい。こうした突然変異は、配列番号３におけるアミノ酸を、配列番号６８〜８８のいずれか一つにおける対応する位置からのアミノ酸の置換であってもよい。あるいは、これらの任意の一つの位置での突然変異は、任意のアミノ酸との置換でもよく、または欠失または挿入の突然変異（１〜１０アミノ酸の欠失または挿入などで、２〜８または３〜６アミノ酸の欠失または挿入など）でもよい。本明細書に開示される突然変異以外に、配列番号３と配列番号６６〜８８の全ての間に保存されるアミノ酸は、本発明の変異体中に存在することが好ましい。しかしながら、配列番号３と配列番号６６〜８８の全ての間に保存されるこれらの位置のうちの任意の一つ以上の位置で保存的突然変異を作製してもよい。
本発明は、配列番号３の特定の位置に対応するＣｓｇＧモノマーの構造内の位置で、配列番号３の特定の位置に置換されたものとして本明細書に記載した任意の一つ以上のアミノ酸を含む細孔形成ＣｓｇＧ突然変異体モノマーを提供する。対応する位置は、当技術分野の標準技術によって決定されうる。例えば、上述のＰＩＬＥＵＰアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、ＣｓｇＧモノマーの配列を配列番号３と整列させ、それによって対応する残基を特定できる。
細孔形成突然変異体モノマーは一般に、配列番号３の配列を有するＣｓｇＧモノマーと同じ３Ｄ構造など、野生型ＣｓｇＧモノマーと同じ３Ｄ構造を形成する能力を保持する。ＣｓｇＧの３Ｄ構造は当技術分野で周知であり、例えば、Ｇｏｙａｌ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５１６（７５３０）：２５０−３に開示されている。本発明の突然変異によってＣｓｇＧ突然変異体モノマーに与えられる改善された特性が保持されることを条件に、本明細書に記載の突然変異に加えて野生型ＣｓｇＧ配列で任意の数の突然変異を作製しうる。
典型的には、ＣｓｇＧモノマーは、３つのαらせんおよび５つのβシートを含む構造を形成する能力を保持する。突然変異体は、少なくとも、第一のαらせん（配列番号３内のＳ６３で開始される）に対するＮ末端であるＣｓｇＧの領域内と、第二のαらせん（配列番号３のＧ８５〜Ａ９９）内と、第二のαらせんと第一のβシートの間のループ（配列番号３のＱ１００〜Ｎ１２０）内と、第四および第五のシート（配列番号３のそれぞれ、Ｓ１７３〜Ｒ１９２およびＲ１９８〜Ｔ１０７）内と、第四および第五のβシート間のループ（配列番号３のＦ１９３〜Ｑ１９７）内に、ＣｓｇＧモノマーが膜貫通細孔（ここで膜貫通細孔はポリペプチドを転位する能力を持つ）を形成する能力に影響を及ぼすことなく作製されうる。従って、ポリヌクレオチドを転位できる細孔を形成するために、モノマーの能力に影響を与えることなく、任意のＣｓｇＧモノマー内のこれらの領域にさらなる突然変異がなされうることが想定される。突然変異体は、ポリヌクレオチドを転位できる細孔を形成するモノマーの能力に影響を及ぼすことなく、任意のαらせん（配列番号３のＳ６３〜Ｒ７６、Ｇ８５〜Ａ９９またはＶ２１１〜Ｌ２３６）内、または任意のβシート（配列番号３のＩ１２１〜Ｎ１３３、Ｋ１３５〜Ｒ１４２、Ｉ１４６〜Ｒ１６２、Ｓ１７３〜Ｒ１９２またはＲ１９８〜Ｔ１０７）内など、その他の領域内に作製されうることも予想される。また、一つ以上のアミノ酸の欠失は、ポリヌクレオチドを転位できる細孔を形成するモノマーの能力に影響を及ぼすことなく、αらせんおよびβシートを連結する任意のループ領域内、および／またはＣｓｇＧモノマーのＮ末端および／またはＣ末端領域内に作製できることも予想される。
アミノ酸置換は、上述のものに加えて、例えば、最大１、２、３、４、５、１０、２０または３０個の置換など、配列番号３のアミノ酸配列に作製されてもよい。同類置換は、アミノ酸を、類似の化学構造、類似の化学的特性、または類似の側鎖体積の他のアミノ酸で置換する。導入されたアミノ酸は、置換するアミノ酸に類似した極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中和性または電荷を有しうる。あるいは、同類置換は、既存の芳香族アミノ酸または脂肪族アミノ酸の場所に、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入してもよい。保存アミノ酸の変化は当技術分野で周知であり、上記表１に定義される２０の主要アミノ酸の特性に従って選択されうる。アミノ酸が類似の極性を持つ場合、これは表２のアミノ酸側鎖についてのヒドロパシースケールを参照することによっても決定されうる。
配列番号３のアミノ酸配列の一つ以上のアミノ酸残基を、上述のポリペプチドから追加的に欠失させてもよい。最大１、２、３、４、５、１０、２０または３０またはそれ以上の残基が欠失されうる。
変異体は、配列番号３の断片を含みうる。こうした断片は細孔形成活性を保持する。断片は、長さが少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００または少なくとも２５０アミノ酸であってもよい。こうした断片は、細孔を生成するために使用されうる。断片は、配列番号３のドメインにわたる膜、すなわちＫ１３５〜Ｑ１５３およびＳ１８３〜Ｓ２０８を含むことが好ましい。
一つ以上のアミノ酸が、代替的にまたは追加的に上述のポリペプチドに追加されてもよい。延長部が、配列番号３のアミノ酸配列またはポリペプチド変異体またはその断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に提供されてもよい。延長部は、例えば長さが１〜１０アミノ酸の間でかなり短くてもよい。あるいは、延長部は、例えば、最大５０アミノ酸または１００アミノ酸など長めでもよい。担体タンパク質が、本発明によるアミノ酸配列に融合されてもよい。その他の融合タンパク質について以下で詳細に検討する。
本明細書に記載のＣｓｇＧ細孔は、野生型ＣｓｇＧ細孔またはその相同体もしくは突然変異体／変異体を含む。変異体は、配列番号３のアミノ酸配列から変化し、かつ細孔を形成するその能力を保持するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変異体は一般に、細孔形成を担う配列番号３の領域を含む。β−バレルを含む、ＣｓｇＧの細孔形成能力は、各サブユニット内のβ−シートによって提供される。配列番号３の変異体は典型的に、β−シート、すなわちＫ１３４〜Ｑ１５４およびＳ１８３〜Ｓ２０８を形成する配列番号３内の領域を含む。一つ以上の修飾は、結果として生じる変異体が細孔を形成する能力を保持する限り、β−シートを形成する配列番号３の領域に作製されうる。配列番号３の変異体は、そのαらせんおよび／またはループ領域内に、置換、付加または欠失など、一つ以上の修飾を含むことが好ましい。
突然変異体ＣｓｇＧモノマーは、その配列が野生型ＣｓｇＧモノマーの配列から変化し、細孔を形成する能力を保持するモノマーである、突然変異体ＣｓｇＧモノマーであってもよい。突然変異体モノマーはまた、本明細書では変異体と呼ばれうる。細孔を形成するための突然変異体モノマーの能力を確認するための方法は当技術分野で周知であり、以下でより詳細に検討される。
ＣｓｇＧ細孔に含まれうる特定の細孔形成ＣｓｇＧ突然変異体モノマーは、以下の修飾のうちの任意の一つ以上を含みうる。
− 配列番号３のＲ９７に相当する位置でのＷ、
− 配列番号３のＲ９３に相当する位置でのＷ、
− 配列番号３のＲ９７に相当する位置でのＹ、
− 配列番号３のＲ９３に相当する位置でのＹ、
− 配列番号３におけるＲ９３およびＲ９７に対応するそれぞれの位置でのＹ、
− 配列番号３のＲ１９２に対応する位置でのＤ、
− 配列番号３のＶ１０５−Ｉ１０７に対応する位置での残基の欠失、
− 配列番号３のＦ１９３〜Ｌ１９９に対応する一つ以上の位置での残基の欠失、
− 配列番号３の１９５〜Ｌ１９９に対応する位置の残基の欠失、
− 配列番号３の１９３〜Ｌ１９９に対応する位置の残基の欠失、
− 配列番号３のＲ１９１に対応する位置でのＴ、
− 配列番号３のＫ４９に対応する位置でのＱ、
− 配列番号３のＫ４９に対応する位置でのＮ、
− 配列番号３のＫ４２に対応する位置でのＱ、
− 配列番号３のＥ４４に対応する位置でのＱ、
− 配列番号３のＥ４４に対応する位置でのＮ、
− 配列番号３のＬ９０に対応する位置でのＲ、
− 配列番号３のＬ９１に対応する位置でのＲ、
− 配列番号３のＩ９５に対応する位置でのＲ、
− 配列番号３のＡ９９に対応する位置でのＲ、
− 配列番号３のＥ１０１に対応する位置でのＨ、
− 配列番号３のＥ１０１に対応する位置でのＫ、
− 配列番号３のＥ１０１に対応する位置でのＮ、
− 配列番号３のＥ１０１に対応する位置でのＱ、
− 配列番号３のＥ１０１に対応する位置でのＴ、
− 配列番号３のＱ１１４に対応する位置でのＫ。
ＣｓｇＧ細孔形成モノマーは、配列番号３内のＹ５１に対応する位置にあるＡおよび／または配列番号３内のＦ５６に対応する位置にあるＱをさらに含むことが好ましい。
配列番号３の位置９７に対応する位置でＲからＷへの置換を含むＣｓｇＧモノマーから構成された細孔は、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける時（または配列決定する）に、位置９７に修飾のない同一の細孔と比較して、精度の増大を示す。精度の増大はまた、Ｒ９７Ｗの代わりに、ＣｓｇＧモノマーが、配列番号３の位置９７に対応する位置でＲからＷへの修飾、または配列番号３の位置９３および９７に対応する位置でＲからＹへの修飾を含む場合にも見られる。従って、細孔は、修飾がアミノ酸の疎水性を増大させるように、配列番号３のＲ９７またはＲ９３に対応する位置に修飾を含む、一つ以上の突然変異体ＣｓｇＧモノマーから構成されうる。例えば、こうした修飾は、例えば、ＷおよびＹを含むがこれに限定されない、疎水性側鎖を含む任意のアミノ酸でのアミノ酸置換を含みうる。
配列番号３の位置１９２に対応する位置にＲからＤ、Ｑ、Ｆ、ＳまたはＴへの突然変異を含むＣｓｇＧモノマーは、正電荷の減少に起因しうる位置１９２での置換を持たないモノマーよりも発現しやすい。従って、位置１９２は、正電荷を減少させるアミノ酸で置換されうる。Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔを含むモノマーはまた、モノマーから形成された突然変異体細孔の能力を改善して、ポリヌクレオチドなどの分析物と相互作用し、それを特徴付ける追加的修飾も含みうる。しかしながら、一実施形態では、配列番号３の位置１９３に対応する位置での残基はＲまたはＫであることが好ましく、Ｒであることがより好ましい。
Ｖ１０５、Ａ１０６およびＩ１０７の欠失、Ｆ１９３、Ｉ１９４、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８およびＬ１９９の欠失、またはＤ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８およびＬ１９９の欠失、および／またはＦ１９１Ｔを含むＣｓｇＧモノマーを含む細孔は、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける（または配列決定する）時に、精度の増大を示す。位置１０５〜１０７のアミノ酸は、ナノ細孔のキャップ内のｃｉｓ−ループに対応し、位置１９３〜１９９のアミノ酸は、細孔の別の端にあるｔｒａｎｓ−ループに対応する。理論に束縛されることは望まないが、ｃｉｓ−ループの欠失は、細孔との酵素の相互作用を改善し、またｔｒａｎｓ−ループの除去は、細孔のｔｒａｎｓ側にあるＤＮＡ間の好ましくない相互作用を減少させると考えられる。
配列番号３のＫ９４に対応する位置にＫからＱまたはＫからＮへの突然変異を含むＣｓｇＧモノマーを含む細孔は、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける（または配列決定する）時に、Ｋ９４に突然変異のない同一の細孔と比べて、雑音が多い細孔（すなわち、信号対雑音比を増加させる細孔）の数の減少を示す。位置９４は、細孔の玄関口に見出され、電流信号の雑音に関連して特に敏感な位置であることが見いだされた。
Ｔ１０４ＫまたはＴ１０４Ｒ、Ｎ９１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｈ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ、Ｑ１１４Ｋ、Ａ９９Ｒ、Ｉ９５Ｒ、Ｎ９１Ｒ、Ｌ９０Ｒ、Ｅ４４Ｑ／Ｎおよび／またはＱ４２Ｋ、または対応する突然変異を含むＣｓｇＧモノマーを含む細孔はすべて、これらの位置に置換のない同一の細孔と比較して、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける（配列決定する）時に、標的ポリヌクレオチドを捕捉する能力の増大を示す。
一実施形態では、ＣｓｇＧ細孔は、（ａ）Ｉ４１、Ｒ９３、Ａ９８、Ｑ１００、Ｇ１０３、Ｔ１０４、Ａ１０６、Ｉ１０７、Ｎ１０８、Ｌ１１３、Ｓ１１５、Ｔ１１７、Ｙ１３０、Ｋ１３５、Ｅ１７０、Ｓ２０８、Ｄ２３３、Ｄ２３８およびＥ２４４の位置にある一つ以上の突然変異体（すなわち、それらの位置の一つ以上にある突然変異体）および／または（ｂ）Ｄ４３Ｓ、Ｅ４４Ｓ、Ｆ４８Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｙ／Ｗ／Ｉ／Ｖ／Ｈ／Ｒ／Ｋ、Ｑ８７Ｎ／Ｒ／Ｋ、Ｎ９１Ｋ／Ｒ、Ｋ９４Ｒ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｓ／Ｎ、Ｒ９７Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｖ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｑ／Ｈ、Ｅ１０１Ｉ／Ｌ／Ａ／Ｈ、Ｎ１０２Ｋ／Ｑ／Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｓ／Ｈ、Ｒ１１０Ｆ／Ｇ／Ｎ、Ｑ１１４Ｒ／Ｋ、Ｒ１４２Ｑ／Ｓ、Ｔ１５０Ｙ／Ａ／Ｖ／Ｌ／Ｓ／Ｑ／Ｎ、Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／ＴおよびＤ２４８Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒのうち一つ以上を含む、配列番号３の変異体である一つ以上のモノマーを含む。変異体は、（ａ）、（ｂ）、または（ａ）および（ｂ）を含んでもよい。一部の実施形態では、変異体はＲ９７Ｗを含む。一部の実施形態において、変異体はＲ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔ（Ｒ１９２Ｄ／Ｑなど）を含む。（ａ）において変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個の位置など、任意の数および組み合わせの位置での修飾を含みうる。
（ａ）において、変異体は、Ｉ４１Ｎ、Ｒ９３Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｎ／Ｑ／Ｓ、Ａ９８Ｋ／Ｒ、Ｑ１００Ｋ／Ｒ、Ｇ１０３Ｆ／Ｗ／Ｓ／Ｎ／Ｋ／Ｒ、Ｔ１０４Ｒ／Ｋ、Ａ１０６Ｒ／Ｋ、Ｉ１０７Ｒ／Ｋ／Ｗ／Ｆ／Ｙ／Ｌ／Ｖ、Ｎ１０８Ｒ／Ｋ、Ｌ１１３Ｋ／Ｒ、Ｓ１１５Ｒ／Ｋ、Ｔ１１７Ｒ／Ｋ、Ｙ１３０Ｗ／Ｆ／Ｈ／Ｑ／Ｎ、Ｋ１３５Ｌ／Ｖ／Ｎ／Ｑ／Ｓ、Ｅ１７０Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒ、Ｓ２０８Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｔ、Ｄ２３３Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒ、Ｄ２３８Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／ＲおよびＥ２４４Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒのうち一つ以上を含むことが好ましい。
（ａ）では、変異体は、モノマーを含む膜貫通細孔などに関して（貫通するなど）標的ポリヌクレオチドのより一貫した移動を提供する一つ以上の修飾を含むことが好ましい。特に（ａ）では、変異体は、Ｒ９３、Ｇ１０３、およびＩ１０７の位置に一つ以上の突然変異（すなわち、これらの位置の一つ以上に突然変異）を含むことが好ましい。変異体は、Ｒ９３、Ｇ１０３、Ｉ１０７、Ｒ９３およびＧ１０３、Ｒ９３およびＩ１０７、Ｇ１０３およびＩ１０７、またはＲ９３、Ｇ１０３およびＩ１０７を含みうる。変異体は、Ｒ９３Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｎ／Ｑ／Ｓ、Ｇ１０３Ｆ／Ｗ／Ｓ／Ｎ／Ｋ／ＲおよびＩ１０７Ｒ／Ｋ／Ｗ／Ｆ／Ｙ／Ｌ／Ｖのうち一つ以上を含むことが好ましい。これらは、Ｒ９３、Ｇ１０３およびＩ１０７の位置について示される任意の組み合わせに存在しうる。
（ａ）において、変異体は、突然変異体モノマーから構成される細孔が、好ましくはヌクレオチドおよびポリヌクレオチドをより簡単に捕捉するようにする一つ以上の修飾を含むことが好ましい。特に（ａ）では、変異体は、Ｉ４１、Ｔ１０４、Ａ１０６、Ｎ１０８、Ｌ１１３、Ｓ１１５、Ｔ１１７、Ｅ１７０、Ｄ２３３、Ｄ２３８およびＥ２４４の位置に一つ以上の突然変異（すなわち、これらの位置の一つ以上に突然変異）を含むことが好ましい。変異体は、任意の数および組み合わせの位置（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１など）での修飾を含みうる。変異体は、Ｉ４１Ｎ、Ｔ１０４Ｒ／Ｋ、Ａ１０６Ｒ／Ｋ、Ｎ１０８Ｒ／Ｋ、Ｌ１１３Ｋ／Ｒ、Ｓ１１５Ｒ／Ｋ、Ｔ１１７Ｒ／Ｋ、Ｅ１７０Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒ、Ｄ２３３Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒ、Ｄ２３８Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／ＲおよびＥ２４４Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒのうち一つ以上を含むことが好ましい。あるいはまたは別の方法として、変異体は、（ｃ）Ｑ４２Ｋ／Ｒ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ、Ｌ９０Ｒ／Ｋ、Ｎ９１Ｒ／Ｋ、Ｉ９５Ｒ／Ｋ、Ａ９９Ｒ／Ｋ、Ｅ１０１Ｈ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｔおよび／またはＱ１１４Ｋ／Ｒを含みうる。
（ａ）では、変異体は、より一貫した移動を提供し、捕捉を増加させる一つ以上の修飾を含むことが好ましい。特に（ａ）では、変異体は、（ｉ）Ａ９８、（ｉｉ）Ｑ１００、（ｉｉｉ）Ｇ１０３、および（ｉｖ）Ｉ１０７の位置に一つ以上の突然変異（すなわち、これらの位置の一つ以上に突然変異）を含むことが好ましい。変異体は、（ｉ）Ａ９８Ｒ／Ｋ、（ｉｉ）Ｑ１００Ｋ／Ｒ、（ｉｉｉ）Ｇ１０３Ｋ／Ｒ、および（ｉｖ）Ｉ１０７Ｒ／Ｋのうちの一つ以上を含むことが好ましい。
ポリヌクレオチドなどの分析物の捕捉を提供する特に好ましい突然変異体モノマーは、位置Ｑ４２、Ｅ４４、Ｅ４４、Ｌ９０、Ｎ９１、Ｉ９５、Ａ９９、Ｅ１０１およびＱ１１４のうち一つ以上に突然変異を含み、ここで突然変異は、突然変異位置で負電荷を除去し、および／または正電荷を増加させる。特に、以下の突然変異を、分析物、好ましくはポリヌクレオチドを捕捉する能力が改善されたＣｓｇＧ細孔を産生する本発明の突然変異体モノマーに含めることができる：Ｑ４２Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｌ９０Ｒ、Ｎ９１Ｒ、Ｉ９５Ｒ、Ａ９９Ｒ、Ｅ１０１Ｈ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１ＴおよびＱ１１４Ｋ。その他の有益な突然変異体と組み合わせてこれらの突然変異体のうちの一つを含む特定の突然変異体モノマーの例は、以下のとおりである：
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）−Ｑ４２Ｋ
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）−Ｅ４４Ｎ
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）−Ｅ４４Ｑ
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）−Ｌ９０Ｒ
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）−Ｎ９１Ｒ
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）−Ｉ９５Ｒ
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）−Ａ９９Ｒ
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）−Ｅ１０１Ｈ
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）−Ｅ１０１Ｋ
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）−Ｅ１０１Ｎ
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）−Ｅ１０１Ｑ
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）−Ｅ１０１Ｔ
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）−Ｑ１１４Ｋ。
（ａ）では、変異体は、特徴付けの精度を増加させる一つ以上の修飾を含むことが好ましい。特に（ａ）では、変異体は、Ｙ１３０、Ｋ１３５およびＳ２０８（Ｙ１３０など）、Ｋ１３５、Ｓ２０８、Ｙ１３０およびＫ１３５、Ｙ１３０およびＳ２０８、Ｋ１３５およびＳ２０８、またはＹ１３０、Ｋ１３５およびＳ２０８の位置に一つ以上の突然変異（すなわち、これらの位置の一つ以上に突然変異）を含むことが好ましい。変異体は、Ｙ１３０Ｗ／Ｆ／Ｈ／Ｑ／Ｎ、Ｋ１３５Ｌ／Ｖ／Ｎ／Ｑ／ＳおよびＲ１４２Ｑ／Ｓのうちの一つ以上を含むことが好ましい。これらの置換は、Ｙ１３０、Ｋ１３５およびＳ２０８に対して記載される任意の数および組み合わせで存在してもよい。
（ｂ）では、変異体は、任意の数および組み合わせの置換（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２など）を含みうる。（ｂ）では、変異体は、モノマーを含む膜貫通細孔などに関して（貫通するなど）標的ポリヌクレオチドのより一貫した移動を提供する一つ以上の修飾を含むことが好ましい。特に、（ｂ）では、変異体は、（ｉ）Ｑ８７Ｎ／Ｒ／Ｋ、（ｉｉ）Ｋ９４Ｒ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｓ／Ｎ、（ｉｉｉ）Ｒ９７Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｖ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｑ／Ｈ、（ｉｖ）Ｎ１０２Ｋ／Ｑ／Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｓ／Ｈ ａｎｄ（ｖ）Ｒ１１０Ｆ／Ｇ／Ｎのうち一つ以上を含むことが好ましい。変異体は、Ｋ９４ＤまたはＫ９４Ｑおよび／またはＲ９７ＷまたはＲ９７Ｙを含むことがより好ましい。モノマーを含む膜貫通細孔に対する（貫通するなど）標的ポリヌクレオチドのより一貫した移動を提供する修飾であるその他の好ましい変異体は、（ｖｉ）Ｒ９３ＷおよびＲ９３Ｙを含む。好ましい変異体は、Ｒ９３ＷおよびＲ９７Ｗ、Ｒ９３ＹおよびＲ９７Ｗ、Ｒ９３ＷおよびＲ９７Ｗ、またはより好ましくはＲ９３ＹおよびＲ９７Ｙを含みうる。
（ｂ）において、変異体は、突然変異体モノマーから構成される細孔が、好ましくはヌクレオチドおよびポリヌクレオチドをより簡単に捕捉するようにする一つ以上の修飾を含むことが好ましい。特に、（ｂ）では、変異体は、（ｉ）Ｄ４３Ｓ、（ｉｉ）Ｅ４４Ｓ、（ｉｉｉ）Ｎ９１Ｋ／Ｒ、（ｉｖ）Ｑ１１４Ｒ／Ｋおよび（ｖ）Ｄ２４８Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｋ／Ｒのうちの一つ以上を含むことが好ましい。
（ｂ）では、変異体は、より一貫した移動を提供し、捕捉を増加させる一つ以上の修飾を含むことが好ましい。特に、（ｂ）では、変異体は、Ｑ８７Ｒ／Ｋ、Ｅ１０１Ｉ／Ｌ／Ａ／ＨおよびＮ１０２Ｋ（Ｑ８７Ｒ／Ｋなど）、Ｅ１０１Ｉ／Ｌ／Ａ／Ｈ、Ｎ１０２Ｋ、Ｑ８７Ｒ／ＫおよびＥ１０１Ｉ／Ｌ／Ａ／Ｈ、Ｑ８７Ｒ／ＫおよびＮ１０２Ｋ、Ｅ１０１Ｉ／Ｌ／Ａ／ＨおよびＮ１０２Ｋ、またはＱ８７Ｒ／Ｋ、Ｅ１０１Ｉ／Ｌ／Ａ／ＨおよびＮ１０２Ｋのうち一つ以上を含むことが好ましい。
（ｂ）では、変異体は、特徴付けの精度を増加させる一つ以上の修飾を含むことが好ましい。特に、（ａ）では、変異体は、Ｆ４８Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｙ／Ｗ／Ｉ／Ｖを含むことが好ましい。
（ｂ）では、変異体は、特徴付けの精度を増加させ、かつ捕捉を増加させる一つ以上の修飾を含むことが好ましい。特に、（ａ）では、変異体は、Ｆ４８Ｈ／Ｒ／Ｋを含むことが好ましい。
変異体は、より一貫した移動を提供する（ａ）および（ｂ）の両方の修飾を含みうる。変異体は、捕捉を増加させる（ａ）および（ｂ）の両方での修飾を含んでもよい。
本発明は、変異体を含む細孔を使用して、ポリヌクレオチドなどの分析物を特徴付けるためのアッセイのスループットを増加させる配列番号３の変異体を提供する。こうした変異体は、Ｋ９４、好ましくはＫ９４ＱまたはＫ９４Ｎでの突然変異、より好ましくはＫ９４Ｑでの突然変異を含みうる。その他の有益な突然変異体と組み合わせてＫ９４Ｑ突然変異またはＫ９４Ｎ突然変異を含む特定の突然変異体モノマーの例は以下のとおりである：
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ）９−Ｋ９４Ｎ
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ）９−Ｋ９４Ｑ。
ＣｓｇＧ細孔を形成するための配列番号３の変異体であるモノマーを使用することで、ポリヌクレオチドなどの分析物を特徴付けるためのアッセイにおける特徴付けの精度が増加されうる。こうした変異体は、Ｆ１９１（好ましくはＦ１９１Ｔ）での突然変異、Ｖ１０５−Ｉ１０７の欠失、Ｆ１９３−Ｌ１９９またはＤ１９５−Ｌ１９９の欠失、および／またはＲ９３および／またはＲ９７（好ましくはＲ９３Ｙ、Ｒ９７Ｙ、あるいはより好ましくはＲ９７Ｗ、Ｒ９３ＷまたはＲ９７ＹおよびＲ９７Ｙの両方）での突然変異を含む。その他の有益な突然変異体と組み合わせてこれらの突然変異体のうちの一つ以上を含む特定の突然変異体モノマーの例は以下のとおりである：
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ）９−ｄｅｌ（Ｄ１９５−Ｌ１９９）
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ）９−ｄｅｌ（Ｆ１９３−Ｌ１９９）
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ）９−Ｆ１９１Ｔ
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）−ＳｔｒｅｐＩＩ）９
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ）９−Ｒ９３Ｗ
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ）９−Ｒ９３Ｗ−ｄｅｌ（Ｄ１９５−Ｌ１９９）
ＣｓｇＧ−（ＷＴ−Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｄ−ＳｔｒｅｐＩＩ）９−Ｒ９３Ｙ／Ｒ９７Ｙ。
別の実施形態では、配列番号３の変異体は、（Ａ）位置Ｒ１９２、Ｆ１９３、Ｉ１９４、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、Ｌ１９９、Ｌ２００およびＥ２０１の一つ以上の欠失および／または（Ｂ）Ｖ１３９／Ｇ１４０／Ｄ１４９／Ｔ１５０／Ｖ１８６／Ｑ１８７／Ｖ２０４／Ｇ２０５（本明細書ではバンド１と呼ばれる）、Ｇ１３７／Ｇ１３８／Ｑ１５１／Ｙ１５２／Ｙ１８４／Ｅ１８５／Ｙ２０６／Ｔ２０７（本明細書ではバンド２と呼ばれる）およびＡ１４１／Ｒ１４２／Ｇ１４７／Ａ１４８／Ａ１８８／Ｇ１８９／Ｇ２０２／Ｅ２０３（本明細書ではバンド３と呼ばれる）のうち一つ以上の欠失を含む。
（Ａ）では、変異体は、任意の数および組み合わせの位置（１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０など）の欠失を含みうる。（Ａ）では、変異体は、以下の欠失を含むことが好ましい：
− Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、およびＬ１９９、
− Ｒ１９２、Ｆ１９３、Ｉ１９４、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、Ｌ１９９、およびＬ２００、
− Ｑ１９７、Ｒ１９８、Ｌ１９９およびＬ２００、
− Ｉ１９４、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８およびＬ１９９、
− Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、Ｌ１９９およびＬ２００、
− Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、Ｌ１９９、Ｌ２００およびＥ２０１、
− Ｑ１９７、Ｒ１９８、Ｌ１９９、Ｌ２００およびＥ２０１、
− Ｑ１９７、Ｒ１９８、Ｌ１９９、または
− Ｆ１９３、Ｉ１９４、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、およびＬ１９９。
変異体は、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８およびＬ１９９またはＦ１９３、Ｉ１９４、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８およびＬ１９９の欠失を含むことがより好ましい。（Ｂ）では、バンド１、バンド２、バンド３、バンド１および２、バンド１および３、バンド２および３、またはバンド１、２および３など、バンド１〜３の任意の数および組み合わせが欠失されうる。変異体は、（Ａ）、（Ｂ）、または（Ａ）および（Ｂ）による欠失を含みうる。
上記の（Ａ）および／または（Ｂ）による一つ以上の位置の欠失を含む変異体は、上記および下記で考察される修飾または置換のいずれかをさらに含みうる。配列番号３の欠失位置の後に表示される一つ以上の位置で修飾または置換が行われる場合、修飾または置換の一つ以上の位置の番号付けは、それに応じて調整されなければならない。例えば、Ｌ１９９が欠失されると、Ｅ２４４はＥ２４３になる。同様に、バンド１が欠失されると、Ｒ１９２はＲ１８６になる。
別の実施形態では、配列番号３の変異体は、（Ｃ）位置Ｖ１０５、Ａ１０６およびＩ１０７のうち一つ以上の欠失を含む。（Ｃ）による欠失は、（Ａ）および／または（Ｂ）による欠失に加えて行うことができる。
上述の欠失は、典型的には、モノマーを含む膜貫通細孔などに関して（貫通するなど）、標的ポリヌクレオチドの移動に関連する雑音を減少させる。結果として、標的ポリヌクレオチドはより正確に特徴付けられうる。
特定の位置で異なるアミノ酸が／記号によって分離される段落では、／記号は「または」を意味する。例えば、Ｑ８７Ｒ／Ｋは、Ｑ８７ＲまたはＱ８７Ｋを意味する。
ポリヌクレオチドなどの分析物の捕捉の増大を提供する配列番号３の変異体は、Ｔ１０４（好ましくはＴ１０４ＲまたはＴ１０４Ｋ）での突然変異、Ｎ９１（好ましくはＮ９１Ｒ）での突然変異、Ｅ１０１（好ましくはＥ１０１Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｈ）での突然変異、位置Ｅ４４（好ましくはＥ４４ＮまたはＥ４４Ｑ）での突然変異および／または位置Ｑ４２（好ましくはＱ４２Ｋ）での突然変異を含みうる。
配列番号３の異なる位置での突然変異は、任意の可能な方法で組み合わせうる。特に、ＣｓｇＧ細孔内のモノマーは、精度を改善する一つ以上の突然変異、雑音を低減する一つ以上の突然変異、および／または分析物の捕捉を強化する一つ以上の突然変異体を含みうる。
配列番号３の変異体は、以下の一つ以上を備えることが好ましい：（ｉ）Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｒ９７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０およびＲ１９２の位置での一つ以上の突然変異体（すなわち、それらの位置のうち一つ以上での突然変異）、例えば、Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｅ１３１およびＴ１５０、またはＮ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｅ１０１およびＥ１３１などの位置での一つ以上の突然変異（すなわち、それらの位置のうち一つ以上での突然変異）、（ｉｉ）Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６での突然変異、（ｉｉｉ）Ｑ４２ＲまたはＱ４２Ｋ、（ｉｖ）Ｋ４９Ｒ、（ｖ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹまたはＮ１０２Ｗ、（ｖｉ）Ｄ１４９Ｎ、Ｄ１４９ＱまたはＤ１４９Ｒ、（ｖｉｉ）Ｅ１８５Ｎ、Ｅ１８５ＱまたはＥ１８５Ｒ、（ｖｉｉｉ）Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１９５ＱまたはＤ１９５Ｒ、（ｉｘ）Ｅ２０１Ｎ、Ｅ２０１ＱまたはＥ２０１Ｒ、（ｘ）Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０３ＱまたはＥ２０３Ｒ、および（ｘｉ）位置Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およびＳ５７のうち一つ以上の欠失。変異体は、（ｉ）〜（ｘｉ）の任意の組み合わせを含みうる。
変異体が、（ｉ）および（ｉｉｉ）〜（ｘｉ）のいずれか一つを含む場合、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６など、Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６のうちの一つ以上での突然変異をさらに含みうる。
（ｉ）では、変異体は、Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｒ９７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０およびＲ１９２の任意の数および組み合わせでの突然変異を含みうる。（ｉ）では、変異体は、Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｅ１３１およびＴ１５０の位置に一つ以上の突然変異（すなわち、これらの位置の一つ以上に突然変異）を含むことが好ましい。（ｉ）では、変異体は、Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｅ１０１およびＥ１３１の位置に一つ以上の突然変異（すなわち、これらの位置の一つ以上に突然変異）を含むことが好ましい。（ｉ）では、変異体は、Ｓ５４および／またはＳ５７に突然変異を含むことが好ましい。（ｉ）では、変異体は、（ａ）Ｓ５４および／またはＳ５７、（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６）など、Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６のうち一つ以上での突然変異を含むことがより好ましい。Ｓ５４および／またはＳ５７が欠失された場合、（ｘｉ）では、それ／それらは、（ｉ）では突然変異することができず、その逆も同様である。（ｉ）では、変異体は、Ｔ１５０Ｉなど、Ｔ１５０での突然変異を含むことが好ましい。別の方法として、変異体は、（ａ）Ｔ１５０、（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６など、Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６のうち一つ以上での突然変異を含むことが好ましい。（ｉ）では、変異体は、Ｑ６２ＲまたはＱ６２Ｋなど、Ｑ６２での突然変異を含むことが好ましい。別の方法として、変異体は、（ａ）Ｑ６２、（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６など、Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６のうち一つ以上での突然変異を含むことが好ましい。変異体は、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｑ６２での突然変異、またはそれらの任意の組み合わせ、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｑ６２、Ｄ４３／Ｅ４４、Ｄ４３／Ｑ６２、Ｅ４４／Ｑ６２またはＤ４３／Ｅ４４／Ｑ６２などを含みうる。別の方法として、変異体は、（ａ）Ｄ４３、Ｅ４４、Ｑ６２、Ｄ４３／Ｅ４４、Ｄ４３／Ｑ６２、Ｅ４４／Ｑ６２またはＤ４３／Ｅ４４／Ｑ６２、（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６など、Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６のうち一つ以上での突然変異を含むことが好ましい。
（ｉｉ）およびその他の場所では、異なる位置が／記号によって分離されているこの用途の場合、／は「および」を意味し、Ｙ５１／Ｎ５５がＹ５１およびＮ５５であることを意味する。（ｉｉ）では、変異体はＹ５１／Ｎ５５に突然変異を含むことが好ましい。ＣｓｇＧの収縮は、残基Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の側鎖によって形成された３つの積層された同心環から成ることが提案されてきた（Ｇｏｙａｌ ｅｔ ａｌ、２０１４、Ｎａｔｕｒｅ、５１６、２５０−２５３）。従って、（ｉｉ）のこれらの残基の突然変異は、ポリヌクレオチドが細孔を通って移動し、それによって観察された電流（ポリヌクレオチドが細孔を通して移動する時）とポリヌクレオチドとの間の直接的関係を識別することを容易にするヌクレオチドの数を減少させうる。Ｆ５６は、本発明の方法において有用な変異体および細孔を参照しながら、以下で考察した任意の方法で突然変異しうる。
（ｖ）では、変異体は、Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹまたはＮ１０２Ｗを含みうる。（ｉ）では、変異体は、（ａ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹまたはＮ１０２Ｗ、ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６のうち一つ以上での、例えばＹ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６での突然変異体を含むことが好ましい。
（ｘｉ）では、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およびＳ５７の任意の数および組み合わせが欠失されうる。Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５およびＳ５７のうちの一つ以上が削除されうることが好ましい。Ｙ５１、Ｎ５５、およびＦ５６のいずれかが（ｘｉ）で欠失された場合、それらを（ｉｉ）で突然変異させることはできず、その逆も同様である。
（ｉ）では、変異体は、置換Ｎ４０Ｒ、Ｎ４０Ｋ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ５７Ｐ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｒ９７Ｎ、Ｒ９７Ｇ、Ｒ９７Ｌ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１Ｗ、Ｅ１２４Ｎ、Ｅ１２４Ｑ、Ｅ１２４Ｒ、Ｅ１２４Ｋ、Ｅ１２４Ｆ、Ｅ１２４Ｙ、Ｅ１２４Ｗ、Ｅ１３１Ｄ、Ｒ１４２Ｅ、Ｒ１４２Ｎ、Ｔ１５０Ｉ、Ｒ１９２ＥおよびＲ１９２Ｎのうち一つ以上、例えばＮ４０Ｒ、Ｎ４０Ｋ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ５７Ｐ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１Ｗ、Ｅ１３１ＤおよびＴ１５０Ｉのうち一つ以上の、またはＮ４０Ｒ、Ｎ４０Ｋ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１ＷおよびＥ１３１Ｄのうち一つ以上を含むことが好ましい。変異体は、これらの置換の任意の数および組み合わせを含みうる。（ｉ）では、変異体はＳ５４Ｐおよび／またはＳ５７Ｐを含むことが好ましい。（ｉ）では、変異体は、（ａ）Ｓ５４Ｐおよび／またはＳ５７Ｐならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６のうち一つ以上での、例えばＹ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６での突然変異体を含むことが好ましい。Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６のうちの一つ以上での突然変異は、以下に考察されるもののいずれかであってもよい。（ｉ）では、変異体はＦ５６Ａ／Ｓ５７ＰまたはＳ５４Ｐ／Ｆ５６Ａを含むことが好ましい。変異体はＴ１５０Ｉを含むことが好ましい。別の方法として、変異体は、（ａ）Ｔ１５０Ｉおよび（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の一つ以上、例えばＹ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６での突然変異を含むことが好ましい。
（ｉ）では、変異体はＱ６２ＲまたはＱ６２Ｋを含むことが好ましい。あるいは、変異体は（ａ）Ｑ６２ＲまたはＱ６２Ｋ、および（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｆ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６などのＹ５１、Ｎ５５およびＦ５６のうちの一つ以上での突然変異を含むことが好ましい。変異体は、Ｄ４３Ｎ、Ｅ４４Ｎ、Ｑ６２ＲまたはＱ６２Ｋまたはそれらの任意の組み合わせ、例えばＤ４３Ｎ、Ｅ４４Ｎ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ、Ｄ４３Ｎ／Ｑ６２Ｒ、Ｄ４３Ｎ／Ｑ６２Ｋ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｒ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｋ、Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２ＲまたはＤ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｋを含みうる。あるいは、変異体は、（ａ）Ｄ４３Ｎ、Ｅ４４Ｎ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ、Ｄ４３Ｎ／Ｑ６２Ｒ、Ｄ４３Ｎ／Ｑ６２Ｋ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｒ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｋ、Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２ＲまたはＤ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｋ、および（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６など、Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６のうち一つ以上での突然変異を含むことが好ましい。
（ｉ）では、変異体はＤ４３Ｎを含むことが好ましい。
（ｉ）では、変異体は、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｓ、Ｅ１０１ＦまたはＥ１０１Ｎを含むことが好ましい。
（ｉ）では、変異体は、Ｅ１２４Ｎ、Ｅ１２４Ｑ、Ｅ１２４Ｒ、Ｅ１２４Ｋ、Ｅ１２４Ｆ、Ｅ１２４Ｙ、Ｅ１２４ＷまたはＥ１２４Ｄ（Ｅ１２４Ｎなど）を含むことが好ましい。
（ｉ）では、変異体はＲ１４２ＥおよびＲ１４２Ｎを含むことが好ましい。
（ｉ）では、変異体はＲ９７Ｎ、Ｒ９７ＧまたはＲ９７Ｌを含むことが好ましい。
（ｉ）では、変異体はＲ１９２ＥおよびＲ１９２Ｎを含むことが好ましい。
（ｉｉ）では、変異体は、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｎ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｑ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｓ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５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／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｇ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｑ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｒ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｋ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｇ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ａ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｌ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｖ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｑ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｓ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５Ｔ／Ｙ５１Ｇ、Ｆ５６Ｅ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｅ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｄ／Ｎ５５Ｒ、Ｆ５６Ｄ／Ｎ５５Ｋ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｅ、Ｆ５６Ｒ／Ｎ５５Ｄ、Ｆ５６Ｋ／Ｎ５５ＥまたはＦ５６Ｋ／Ｎ５５Ｄを含むことが好ましい。
（ｉｉ）では、変異体は、Ｙ５１Ｒ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｍ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｌ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｉ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｖ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｐ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｇ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｃ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｓ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｅ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｄ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｋ／Ｆ５６ＱまたはＹ５１Ｈ／Ｆ５６Ｑを含むことが好ましい。
（ｉｉ）では、変異体は、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６ＱまたはＹ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含むことが好ましい。
（ｉｉ）では、変異体は、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｆ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｍ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｌ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｉ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｖ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｐ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｇ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｃ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｔ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｓ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｅ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｄ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｋ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６ＨまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｒを含むことが好ましい。
（ｉｉ）では、変異体は、Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５Ｑ、Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５ＳまたはＹ５１Ｔ／Ｎ５５Ａを含むことが好ましい。
（ｉｉ）では、変異体は、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｆ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｌ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｉ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｖ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｐ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｇ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｃ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｔ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｓ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｅ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｄ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｋ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６ＨまたはＹ５１Ａ／Ｆ５６Ｒを含むことが好ましい。
（ｉｉ）では、変異体は、Ｙ５１Ｃ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｅ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｄ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｋ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｈ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｓ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｐ／Ｆ５６ＡまたはＹ５１Ｖ／Ｆ５６Ａを含むことが好ましい。
（ｘｉ）では、変異体は、Ｙ５１／Ｐ５２、Ｙ５１／Ｐ５２／Ａ５３、Ｐ５０〜Ｐ５２、Ｐ５０〜Ａ５３、Ｋ４９〜Ｙ５１、Ｋ４９〜Ａ５３の欠失および単一のプロリン（Ｐ）での置換、Ｋ４９〜Ｓ５４および単一のＰでの置換、Ｙ５１〜Ａ５３、Ｙ５１〜Ｓ５４、Ｎ５５／Ｆ５６、Ｎ５５〜Ｓ５７、Ｎ５５／Ｆ５６および単一のＰでの置換、Ｎ５５／Ｆ５６および単一のグリシン（Ｇ）での置換、Ｎ５５／Ｆ５６および単一のアラニン（Ａ）での置換、Ｎ５５／Ｆ５６および単一のＰおよびＹ５１Ｎでの置換、Ｎ５５／Ｆ５６および単一のＰおよびＹ５１Ｑでの置換、Ｎ５５／Ｆ５６および単一のＰおよびＹ５１Ｓでの置換、Ｎ５５／Ｆ５６および単一のＧおよびＹ５１Ｎでの置換、Ｎ５５／Ｆ５６および単一のＧおよびＹ５１Ｑでの置換、Ｎ５５／Ｆ５６および単一のＧおよびＹ５１Ｓでの置換、Ｎ５５／Ｆ５６および単一のＡおよびＹ５１Ｎでの置換、Ｎ５５／Ｆ５６および単一のＡ／Ｙ５１Ｑでの置換、またはＮ５５／Ｆ５６および単一のＡおよびＹ５１Ｓでの置換を含むことが好ましい。
変異体は、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０１Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｄ１９５Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｄ１９５Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｄ１９５Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｄ１９５Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／ Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｑ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｑ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｑ、Ｄ１４９Ｑ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｑ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｑ、Ｅ１３１Ｄ／Ｋ４９Ｒ、Ｅ１０１Ｎ／Ｎ１０２Ｆ、Ｅ１０１Ｎ／Ｎ１０２Ｙ、Ｅ１０１Ｎ／Ｎ１０２Ｗ、Ｅ１０１Ｆ／Ｎ１０２Ｆ、Ｅ１０１Ｆ／Ｎ１０２Ｙ、Ｅ１０１Ｆ／Ｎ１０２Ｗ、Ｅ１０１Ｙ／Ｎ１０２Ｆ、Ｅ１０１Ｙ／Ｎ１０２Ｙ、Ｅ１０１Ｙ／Ｎ１０２Ｗ、Ｅ１０１Ｗ／Ｎ１０２Ｆ、Ｅ１０１Ｗ／Ｎ１０２Ｙ、Ｅ１０１Ｗ／Ｎ１０２Ｗ、Ｅ１０１Ｎ／Ｎ１０２Ｒ、Ｅ１０１Ｆ／Ｎ１０２Ｒ、Ｅ１０１Ｙ／Ｎ１０２ＲまたはＥ１０１Ｗ／Ｎ１０２Ｆを含むことがより好ましい。
ポリヌクレオチドが細孔を通して移動する際に、少なめのヌクレオチドが電流に寄与する細孔を形成する本発明の好ましい変異体は、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｉ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｌ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｉ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｌ／Ｆ５６ＮまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｎを含むか、またはより好ましくはＹ５１Ｉ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｌ／Ｆ５６ＡまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ａを含む。上述のように、これは、（ポリヌクレオチドが細孔およびポリヌクレオチドを通して移動する時に）観察される電流間の直接的な関係の識別を容易にする。
増加した範囲を表示する細孔を形成する好ましい変異体は、以下の位置での突然変異を含む：
Ｙ５１、Ｆ５６、Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｅ２０１およびＥ２０３、
Ｎ５５およびＦ５６、
Ｙ５１およびＦ５６、
Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６、または
Ｆ５６およびＮ１０２。
増加した範囲を表示する細孔を形成する好ましい変異体は、
Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ、Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｅ２０１ＮおよびＥ２０３Ｎ、
Ｎ５５ＳおよびＦ５６Ｑ、
Ｙ５１ＡおよびＦ５６Ａ、
Ｙ５１ＡおよびＦ５６Ｎ、
Ｙ５１ＩおよびＦ５６Ａ、
Ｙ５１ＬおよびＦ５６Ａ、
Ｙ５１ＴおよびＦ５６Ａ、
Ｙ５１ＩおよびＦ５６Ｎ、
Ｙ５１ＬおよびＦ５６Ｎ、
Ｙ５１ＴおよびＦ５６Ｎ、
Ｙ５１ＴおよびＦ５６Ｑ、
Ｙ５１Ａ、Ｎ５５ＳおよびＦ５６Ａ、
Ｙ５１Ａ、Ｎ５５Ｓ、およびＦ５６Ｎ、
Ｙ５１Ｔ、Ｎ５５ＳおよびＦ５６Ｑ、または
Ｆ５６ＱおよびＮ１０２Ｒ。
ポリヌクレオチドが細孔を通って移動する際に、少ないヌクレオチドが電流に寄与する細孔を形成する好ましい変異体は、以下の位置での突然変異を含む：
Ｎ５５およびＦ５６（Ｎ５５ＸおよびＦ５６Ｑなど）、ここでＸは任意のアミノ酸であり、
Ｙ５１およびＦ５６（Ｙ５１ＸおよびＦ５６Ｑなど）で、ここでＸは任意のアミノ酸である。
特に好ましい変異体は、Ｙ５１ＡおよびＦ５６Ｑを含む。
増加したスループットを表示する細孔を形成する好ましい変形体は、以下の位置での突然変異を含む：
Ｄ１４９、Ｅ１８５およびＥ２０３、
Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｅ２０１、およびＥ２０３、または
Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｄ１９５、Ｅ２０１、およびＥ２０３。
増加したスループットを表示する細孔を形成する好ましい変異体は、
Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５ＮおよびＥ２０３Ｎ、
Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｎ、Ｅ２０１ＮおよびＥ２０３Ｎ、
Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｄ１９５Ｎ、Ｅ２０１ＮおよびＥ２０３Ｎ、または
Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｄ１９５Ｎ、Ｅ２０１ＲおよびＥ２０３Ｎ。
ポリヌクレオチドの捕捉が増大する細孔を形成する好ましい変異体は、以下の突然変異を含む：
Ｄ４３Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、
Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、
Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、
Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ、
Ｄ４３Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ、
Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ、または
Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ。
好ましい変異体は以下の突然変異体を含む：
Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３ＲまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｒ、
Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３ＮまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、
Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３ＲまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｒ
Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３ＲまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｒ、
Ｅ２０３ＲまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０３Ｒ、
Ｅ２０３ＮまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、
Ｅ２０１ＲまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０１Ｒ、
Ｅ２０１ＮまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０１Ｎ、
Ｅ１８５ＲまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１８５Ｒ、
Ｅ１８５ＮまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１８５Ｎ、
Ｄ１４９ＲまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｄ１４９Ｒ、
Ｄ１４９ＮまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｄ１４９Ｎ、
Ｒ１４２ＥまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１４２Ｅ、
Ｒ１４２ＮまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１４２Ｎ、
Ｒ１９２ＥまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｅ、または
Ｒ１９２ＮまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｎ。
好ましい変異体は以下の突然変異体を含む：
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｎ／Ｎ１０２Ｒ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｎ／Ｎ１０２Ｇ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｎ／Ｎ１０２Ｒ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｎ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｇ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｌ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｒ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｆ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｇ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｒ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｆ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｎ、または
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｇ
変異体はＴ１５０での突然変異をさらに含むことが好ましい。増加した挿入を表示する細孔を形成する好ましい変異体は、Ｔ１５０Ｉを含む。Ｔ１５０（Ｔ１５０Ｉなど）での突然変異は、上述の任意の突然変異または突然変異の組み合わせと組み合わされてもよい。
配列番号３の好ましい変異体は、（ａ）Ｒ９７Ｗおよび（ｂ）Ｙ５１および／またはＦ５６での突然変異を含む。配列番号３の好ましい変異体は、（ａ）Ｒ９７Ｗ、および（ｂ）Ｙ５１Ｒ／Ｈ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｑ／Ｃ／Ｇ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍおよび／またはＦ５６Ｒ／Ｈ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｑ／Ｃ／Ｇ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍを含む。配列番号３の好ましい変異体は、（ａ）Ｒ９７Ｗ、および（ｂ）Ｙ５１Ｌ／Ｖ／Ａ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｇおよび／またはＦ５６Ａ／Ｑ／Ｎを含む。配列番号３の好ましい変異体は、（ａ）Ｒ９７Ｗ、および（ｂ）Ｙ５１Ａおよび／またはＦ５６Ｑを含む。配列番号３の好ましい変異体は、Ｒ９７Ｗ、Ｙ５１ＡおよびＦ５６Ｑを含む。
配列番号３の変異体は、Ｒ１９２での突然変異を含むことが好ましい。変異体は、Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ、Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／ＴまたはＲ１９２Ｄ／Ｑを含むことが好ましい。配列番号３の好ましい変異体は、（ａ）Ｒ９７Ｗ、（ｂ）Ｙ５１および／またはＦ５６での突然変異、および（ｃ）Ｒ１９２での突然変異、Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ、Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／ＴまたはＲ１９２Ｄ／Ｑなどを含む。配列番号３の好ましい変異体は、（ａ）Ｒ９７Ｗ、（ｂ）Ｙ５１Ｒ／Ｈ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｑ／Ｃ／Ｇ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍおよび／またはＦ５６ Ｒ／Ｈ／Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｑ／Ｃ／Ｇ／Ｐ／Ａ／Ｖ／Ｉ／Ｌ／Ｍ、および（ｃ）Ｒ１９２での突然変異、Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ、Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／ＴまたはＲ１９２Ｄ／Ｑなどを含む。配列番号３の好ましい変異体は、（ａ）Ｒ９７Ｗ、（ｂ）Ｙ５１Ｌ／Ｖ／Ａ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｇおよび／またはＦ５６Ａ／Ｑ／Ｎ、および（ｃ）Ｒ１９２での突然変異、Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ、Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／ＴまたはＲ１９２Ｄ／Ｑなどを含む。配列番号３の好ましい変異体は、（ａ）Ｒ９７Ｗ、（ｂ）Ｙ５１Ａおよび／またはＦ５６Ｑ、および（ｃ）Ｒ１９２での突然変異、Ｒ１９２ Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｅ、Ｒ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／ＴまたはＲ１９２Ｄ／Ｑなどを含む。配列番号３の好ましい変異体は、Ｒ９７Ｗ、Ｙ５１Ａ、Ｆ５６ＱおよびＲ１９２Ｄ／Ｑ／Ｆ／Ｓ／ＴまたはＲ１９２Ｄ／Ｑを含む。配列番号３の好ましい変異体は、Ｒ９７Ｗ、Ｙ５１Ａ、Ｆ５６ＱおよびＲ１９２Ｄを含む。配列番号３の好ましい変異体は、Ｒ９７Ｗ、Ｙ５１Ａ、Ｆ５６ＱおよびＲ１９２Ｑを含む。特定の位置で異なるアミノ酸が／記号によって分離される段落では、／記号は「または」を意味する。例えば、Ｒ１９２Ｄ／Ｑは、Ｒ１９２ＤまたはＲ１９２Ｑを意味する。
配列番号３の上記の好ましい変異体のいずれかは、Ｒ９３での突然変異をさらに含みうる。配列番号３の好ましい変異体は、（ａ）Ｒ９３Ｗ、および（ｂ）Ｙ５１および／またはＦ５６での突然変異、好ましくはＹ５１ＡおよびＦ５６Ｑを含む。
配列番号３の上記の好ましい任意の変異体は、Ｋ９４Ｎ／Ｑ突然変異を含みうる。配列番号３の上記の好ましい任意の変異体は、Ｆ１９１Ｔ突然変異を含みうる。
ＣｓｇＧモノマーは、ＣｓｇＦペプチドへの付着を促進するように修飾されうる。例えば、システイン残基は、配列番号３の位置１３２、１３３、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、２０１、２０３、２０５、２０７および２０９に対応する一つ以上の位置に、および／またはＣｓｇＦと接触してＣｓｇＧへの共有結合を促進することが予測される、表４に記載された任意の一つの位置に導入されうる。システイン残基を介した共有結合に対する代替的または追加として、細孔は疎水性相互作用または静電相互作用によって安定化されうる。こうした相互作用を促進するために、配列番号３の位置１３２、１３３、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、２０１、２０３、２０５、２０７および２０９の一つ以上に対応する位置で、および／またはＣｓｇＦと接触することが予測される表４に記載された任意の一つの位置で、非ネイティブ反応性または光反応性アミノ酸が。
好ましい例示的な細孔には、配列番号３に対して以下の突然変異を有する少なくとも一つのＣｓｇＧモノマーが含まれる：Ｙ５１Ｘ１／Ｎ５５Ｘ２／Ｆ５６Ｘ３／Ｎ９１Ｒ／Ｋ９４Ｑ／Ｒ９７Ｗ／Ｒ１９２Ｄ−ｄｅｌ（Ｖ１０５−Ｉ１０７）、ここでＸ１はＩ／Ｖ／Ｓ／Ｔ、Ｘ２はＮ／Ｉ／Ｖ／Ｓ／Ｔおよび／またはＸ３はＱ／Ｉ／Ｖ／Ｓ／Ｔである。
天然のアミノ酸を導入または置換するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、メチオニン（Ｍ）は、突然変異体モノマーをコードするポリヌクレオチドの関連位置で、メチオニンのコドン（ＡＴＧ）をアルギニンのコドン（ＣＧＴ）で置換することによって、アルギニン（Ｒ）で置換されうる。次に、ポリヌクレオチドは以下で考察するように発現することができる。
二重細孔
ＣｓｇＧ／ＣｓｇＦ細孔は、第一の細孔および第二の細孔を含む二重細孔であってもよい。少なくとも第一の細孔は、本明細書で開示されているＣｓｇＧ／ＣｓｇＦ細孔である。第二の細孔は、ＣｓｇＧ細孔またはＣｓｇＧ／ＣｓｇＦ細孔であってもよい。一実施形態では、第一の細孔および第二の細孔の両方は、本明細書で開示されるようなＣｓｇＧ／ＣｓｇＦ細孔である。第一および第二の細孔は、同一であっても異なっていてもよい。本明細書に開示される突然変異のいずれかに加えて、二重細孔では、ＣｓｇＧモノマーは、以下に記載される追加的な突然変異のうちの一つ以上を含みうる。
二重細孔では、第一の細孔は、疎水性の相互作用および／または一つ以上のジスルフィド結合によって、第二のＣｓｇＧ細孔に付着されうる。第一の細孔および／または第二の細孔内のモノマーのうち一つ以上、２、３、４、５、６、８、９など、例えば、すべてが、こうした相互作用を強化するように修飾されうる。これは、任意の適切な方法で達成されうる。
第一の細孔と第二の細孔との間の界面にある第一の細孔のアミノ酸配列における少なくとも一つのシステイン残基は、第一の細孔と第二の細孔との間の界面における第二の細孔のアミノ酸配列における少なくとも一つのシステイン残基にジスルフィド結合されてもよい。第二の細孔内の第一の細孔および／またはシステイン残基のシステイン残基は、野生型ＣｓｇＧモノマーに存在しないシステイン残基であってもよい。２、３、４、５、６、７、８または９〜１６、１８、２４、２７、３２、３６、４０、４５、４８、５４、５６または６３など、複数のジスルフィド結合は、二つの細孔内の二つの細孔間に形成しうる。第一または第二の細孔の一方または両方は、配列番号３のＲ９７、Ｉ１０７、Ｒ１１０、Ｑ１００、Ｅ１０１、Ｎ１０２および／またはＬ１１３に対応する位置で第一の細孔と第二の細孔間の界面にシステイン残基を含む、最大８、９または１０のモノマーなどの少なくとも一つのモノマーを含んでもよい。
第一の細孔および／または第二の細孔内の少なくとも一つのモノマーにおける少なくとも一つのモノマーは、第一の細孔と第二の細孔間の界面に少なくとも一つの残基を含んでもよく、この残基は野生型ＣｓｇＧモノマー内の対応する位置に存在する残基よりも疎水性である。例えば、２〜１０のように、３、４、５、６、７、８、または９の残基は、第一の細孔および／または第二の細孔の残基が、対応する野生型ＣｓｇＧモノマー内の同じ位置での残基をより疎水性である場合がある。こうした疎水性残基は、二重細孔の二つの細孔間の相互作用を強化する。第一の細孔と第二の細孔との間の界面における少なくとも一つの残基は、配列番号３のＲ９７、Ｉ１０７、Ｒ１１０、Ｑ１００、Ｅ１０１、Ｎ１０２およびＬ１１３に対応する位置にあってもよい。野生型ＣｓｇＧモノマー内の界面にある残基がＲ、Ｑ、ＮまたはＥである場合、疎水性残基は一般的にＩ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＷまたはＹである。野生型ＣｓｇＧモノマー内の界面にある残基がＩである場合、疎水性残基は一般的にＬ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＷまたはＹである。野生型ＣｓｇＧモノマー内の界面にある残基がＬである場合、疎水性残基は一般的にＩ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＷまたはＹである。
二重細孔は、細孔間の界面に一つ以上のシステイン残基を含む一つ以上のモノマーを含みうるか、または細孔間の界面において一つ以上の疎水性残基を含むか、またはこうしたシステイン残基およびこうした疎水性残基を含む一つ以上のモノマーを含みうる。例えば、配列番号３のＲ９７、Ｉ１０７、Ｒ１１０、Ｑ１００、Ｅ１０１、Ｎ１０２および／またはＬ１１３の位置に対応するモノマー内の位置のうち一つ以上（任意の２、３または４など）は、システイン（Ｃ）残基を含むことができ、配列番号３のＲ９７、Ｉ１０７、Ｒ１１０、Ｑ１００、Ｅ１０１、Ｎ１０２および／またはＬ１１３の位置に対応するモノマー内の位置のうち一つ以上（任意の２、３または４など）は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＷまたはＹなどの疎水性残基を含みうる。
よって、二重細孔はテール領域内の一つ以上（２、３、４、５、６または７など）の位置にある嵩張る残基を含みうるが、この残基は一般に、第一および第二の細孔の間の界面にあり、野生型ＣｓｇＧモノマー内の対応する位置にある残基よりも嵩張る。これらの残基の大きさが、二重細孔の第一の細孔と第二の細孔の間の界面で細孔の壁に孔が生じるのを阻止する。第一の細孔と第二の細孔との間の界面における少なくとも一つの嵩張る残基は、一般に、配列番号３のＡ９８、Ａ９９、Ｔ１０４、Ｖ１０５、Ｌ１１３、Ｑ１１４またはＳ１１５に対応する位置である。野生型ＣｓｇＧモノマー内の界面にある残基がＡである場合、嵩張る残基は一般にＩ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、ＳまたはＴである。野生型ＣｓｇＧモノマー内の界面にある残基がＴである場合、嵩張る残基は一般にＬ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＤまたはＥである。野生型ＣｓｇＧモノマー内の界面にある残基がＶである場合、嵩張る残基は一般にＩ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｎ、Ｑである。野生型ＣｓｇＧモノマー内の界面にある残基がＬである場合、嵩張る残基は一般にＭ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＤまたはＥである。野生型ＣｓｇＧモノマー内の界面にある残基がＱである場合、嵩張る残基は一般にＦ、ＷまたはＹである。野生型ＣｓｇＧモノマー内の界面にある残基がＳである場合、嵩張る残基は一般にＭ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、ＥまたはＲである。
第二の細孔が膜の外にある場合、第二の細孔、および随意に第一の細孔は、野生型ＣｓｇＧ細孔のバレル内の電荷と比較してバレル内の負電荷を減少させる、細孔のバレル領域内の残基を含むことが好ましい。これらの突然変異はバレルをより親水性にする。二重細孔の第一の細孔内にある少なくとも一つのモノマーおよび／または第二の細孔内にある少なくとも一つのモノマーは、細孔のバレル領域内の少なくとも一つの残基を含みうるが、この残基は、野生型ＣｓｇＧモノマー内の対応する位置にある残基よりも負電荷が少ない。バレル内部の電荷は、ポリヌクレオチドなどの負荷電した分析物が、静電気電荷によって細孔に入ることがないように、十分にニュートラルまたは正電荷である。配列番号３のＤ１４９、Ｅ１８５、Ｄ１９５、Ｅ２１０および／またはＥ２０３に対応する位置にある細孔のバレル領域内の少なくとも一つの残基（２、３、４または５の残基など）は、ニュートラルまたは正荷電されたアミノ酸としうる。配列番号３のＤ１４９、Ｅ１８５、Ｄ１９５、Ｅ２１０および／またはＥ２０３に対応する位置にある細孔のバレル領域内の少なくとも一つの残基（２、３、４または５の残基など）は、Ｎ、Ｑ、ＲまたはＫであることが好ましい。
配列番号３での荷電を除去する突然変異の特定の例は、以下を含む： Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｄ１９５／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１４９Ｎ／Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０３、Ｅ２０３Ｒ、Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０１Ｒ、Ｅ２０１Ｎ、Ｄ１９５Ｒ、Ｄ１９５Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｅ１８５Ｎ、Ｄ１４９ＲおよびＤ１４９Ｎ。
第一の細孔内の少なくとも一つのＣｓｇＧモノマーは、第一の細孔のバレル領域の収縮部に少なくとも一つの残基を含んでもよく、この残基は、野生型ＣｓｇＧ細孔と比較して収縮部の長さを減らす、維持する、または増やし、および／または第二の細孔内の少なくとも一つのＣｓｇＧモノマーは、第二の細孔のバレル領域の収縮部に少なくとも一つの残基を含んでもよく、この残基は、野生型ＣｓｇＧ細孔と比較して収縮部の長さを減らす、維持する、または増やす。第一の細孔内の収縮部の長さおよび／または第二の細孔内の収縮部の長さは、少なくとも野生型細孔と同程度の長さであり、それより長いことがより好ましい。
細孔の長さは、配列番号３の位置Ｋ４９とＦ５６の間の領域に対応する領域に残基を挿入することによって増大されてもよい。 １〜５個（２、３、または４個など）のアミノ酸残基を、配列番号３を参照することにより定義された以下の位置のうち任意の一つ以上の位置に挿入してもよい。Ｋ４９およびＰ５０、Ｐ５０およびＹ５１、Ｙ５１およびＰ５２、Ｐ５２およびＡ５３、Ａ５３およびＳ５４、Ｓ５４およびＮ５５および／またはＮ５５およびＦ５６。合計で１〜１０個（２〜８個など）または３〜５個のアミノ酸残基がモノマーの配列に挿入されることが好ましい。第一の細孔内のすべてのモノマーおよび／または第二の細孔内のすべてのモノマーは、この領域内に同一数の挿入を持つことが好ましい。挿入された残基は、配列番号３のＹ５１およびＮ５５に対応する残基間のループの長さを増加しうる。挿入された残基は、柔軟性を維持するためのＡ、Ｓ、ＧまたはＴ、ループに捻じれを追加するためのＰ、および／または適用された電位差のもとで分析物が細孔のバレルと相互作用する時に生成される信号に寄与するＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｖおよび／またはＩの任意の組み合わせでもよい。挿入されたアミノ酸は、Ｓ、Ｇ、ＳＧ、ＳＧＧ、ＳＧＳ、ＧＳ、ＧＳＳおよび／またはＧＳＧの任意の組み合わせであってもよい。
二重細孔では、第一の細孔および／または第二の細孔のバレルの収縮部は、分析物の検出または特徴付けに使用した時に、野生型収縮部を持つ第一の細孔または第二の細孔が使用された時と比較して、細孔の性質に影響を及ぼす、少なくとも一つの残基（２、３、４または５個の残基など）を含んでもよく、ここで細孔のバレル領域の収縮部内の少なくとも一つの残基は、配列番号３のＹ５１、Ｎ５５、Ｙ５１、Ｐ５２および／またはＡ５３に対応する位置にある。少なくとも一つの残基は、配列番号３のＦ５６に対応する位置のＱまたはＶ、配列番号３のＹ５１に対応する位置のＡまたはＱ、および／または配列番号３のＮ５５に対応する位置のＶでもよい。
二重細孔は、第一のＣｓｇＧ細孔内の少なくとも一つのモノマーおよび／または第二のＣｓｇＧ細孔内の少なくとも一つのモノマーを含んでもよく、ここで、モノマーは上記に定義された二つ以上の突然変異体を含む。
二重細孔内のＣｓｇＧモノマーは、配列番号３のＲ９７、Ｉ１０７、Ｒ１１０、Ｑ１００、Ｅ１０１、Ｎ１０２、またはＬ１１３に対応する位置にシステイン残基を含みうる。
二重細孔内のＣｓｇＧモノマーは、配列番号３のＲ９７、Ｑ１００、Ｉ１０７、Ｒ１１０、Ｅ１０１、Ｎ１０２およびＬ１１３のうち任意の一つ以上に対応する位置の残基を含んでもよく、この残基は、配列番号３の対応する位置（配列番号６８〜８８の任意の一つに対応する位置など）に存在する残基よりも疎水性であり、ここで、Ｒ９７および／またはＩ１０７に対応する位置にある残基はＭであり、Ｒ１１０に対応する位置にある残基はＩ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、ＷまたはＹであり、および／またはＥ１０１またはＮ１０２に対応する位置にある残基はＶまたはＭである。Ｑ１００に対応する位置にある残基は一般にＩ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＷまたはＹであり、および／またはＬ１１３に対応する位置にある残基は一般にＩ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＷまたはＹである。
特定のモノマーは、Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ置換およびＲ９７Ｉ／Ｖ／Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｗ／Ｙ、Ｉ１０７Ｌ／Ｖ／Ｍ／Ｆ／Ｗ／Ｙ、Ｒ１１０Ｉ／Ｖ／Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｗ／Ｙ、Ｑ１００Ｉ／Ｖ／Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｗ／Ｙ、Ｅ１０１Ｉ／Ｖ／Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｗ／Ｙ、Ｎ１０２Ｉ／Ｖ／Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｗ／ＹおよびＬ１１３ＣＩ／Ｖ／Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｗ／Ｙの組み合わせ、Ｒ９７Ｉ／Ｖ／Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｗ／ＹおよびＮ１０２Ｉ／Ｖ／Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｗ／Ｙの組み合わせ、および／またはＲ９７Ｉ／Ｖ／Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｗ／ＹおよびＥ１０１Ｉ／Ｖ／Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｗ／Ｙの組み合わせを含む、配列番号３に示す配列を有する。Ｉ１０７は、二つの細孔間に疎水性の相互作用をすでに形成している場合がある。
二重細孔内の少なくとも一つの細孔内のＣｓｇＧモノマーは、配列番号３のＡ９８、Ａ９９、Ｔ１０４、Ｖ１０５、Ｌ１１３、Ｑ１１４およびＳ１１５のうち任意の一つ以上に対応する位置（配列番号６８〜８８のうち任意の一つの対応する位置など）に、配列番号３の対応する位置にある残基よりも嵩張る残基を含みうる。ここで、Ｔ１０４に対応する位置にある残基はＬ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、ＤまたはＥであり、Ｌ１１３に対応する位置にある残基はＭ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｎ、Ｇ、ＤまたはＥであり、および／またはＳ１１５に対応する位置にある残基はＭ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｎ、ＱまたはＥである。Ａ９８またはＡ９９に対応する位置にある残基は、一般にＩ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、ＳまたはＴである。Ｖ１０５に対応する位置にある残基はＩ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＮまたはＱである。Ｑ１１４に対応する位置にある残基はＦ、ＷまたはＹである。Ｅ２１０に対応する位置にある残基はＮ、Ｑ、ＲまたはＫである。
特定のモノマーは、Ｙ５１Ａ、Ｆ５６Ｑ置換および１、２、３、４、５、６または以下の置換のすべてを含む配列番号３に示される配列を持ちうる。Ａ９８Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｍ／Ｆ／Ｗ／Ｙ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ、Ａ９９Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｍ／Ｆ／Ｗ／Ｙ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ、Ｔ１０４Ｎ／Ｑ／Ｌ／Ｒ／Ｄ／Ｅ／Ｍ／Ｆ／Ｗ／Ｙ、Ｖ１０５Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｗ／Ｙ／Ｎ／Ｑ、Ｌ１１３Ｍ／Ｆ／Ｗ／Ｙ／Ｎ／Ｑ／Ｄ／Ｅ／Ｌ／Ｒ、Ｑ１１４Ｙ／Ｆ／Ｗ、およびＳ１１５Ｎ／Ｑ／Ｍ／Ｆ／Ｗ／Ｙ／Ｅ／Ｒ。
二重細孔内にある細孔の少なくとも一つのＣｓｇＧモノマーは、配列番号３の対応する位置にある残基（配列番号６８〜８８のうち任意の一つの対応する位置など）よりも少ない負電荷の、Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｄ１９５、Ｅ２１０およびＥ２０３のうち任意の一つ以上に対応する位置にある細孔のバレル領域の残基を含んでもよく、ここで、Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｄ１９５および／またはＥ２０３に対応する位置にある残基はＫである。
二重細孔内にある細孔うちの少なくとも一つのＣｓｇＧモノマーは、細孔のバレル領域の収縮部内に少なくとも一つの残基を含んでもよく、この残基は野生型ＣｓｇＧ細孔と比較して収縮部の長さを増加させる。少なくとも一つの残基は、野生型ＣｓｇＧ細孔の収縮部に存在する残基に追加的なものである。
細孔の長さは、配列番号３の位置Ｋ４９とＦ５６の間の領域に対応する領域に残基を挿入することによって増大されてもよい。１〜５個（２、３、または４個など）のアミノ酸残基を、配列番号３を参照することにより定義された以下の位置のうち任意の一つ以上の位置に挿入してもよい。Ｋ４９およびＰ５０、Ｐ５０およびＹ５１、Ｙ５１およびＰ５２、Ｐ５２およびＡ５３、Ａ５３およびＳ５４、Ｓ５４およびＮ５５および／またはＮ５５およびＦ５６。合計で１〜１０個（２〜８個など）または３〜５個のアミノ酸残基がモノマーの配列に挿入されることが好ましい。挿入された残基は、配列番号３のＹ５１およびＮ５５に対応する残基間のループの長さを増加しうる。挿入された残基は、柔軟性を維持するためのＡ、Ｓ、ＧまたはＴ、ループに捻じれを追加するためのＰ、および／または適用された電位差のもとで分析物が細孔のバレルと相互作用する時に生成される信号に寄与するＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｖおよび／またはＩの任意の組み合わせでもよい。挿入されたアミノ酸は、Ｓ、Ｇ、ＳＧ、ＳＧＧ、ＳＧＳ、ＧＳ、ＧＳＳおよび／またはＧＳＧの任意の組み合わせであってもよい。
二重細孔内の細孔のうち少なくとも一つにあるＣｓｇＧモノマーは、対応する野生型モノマー内に存在する残基とは異なる、配列番号３のＮ５５、Ｐ５２および／またはＡ５３に対応する位置にある細孔のバレル領域の収縮部内の少なくとも一つの残基を含んでもよく、ここで、Ｎ５５に対応する位置にある残基はＶである。
上記の任意の二つ以上の残基は同一のモノマー内に存在してもよい。特に、モノマーは、少なくとも一つのシステイン残基、少なくとも一つの疎水性残基、少なくとも一つの嵩張る残基、少なくとも一つの前記中性または正荷電の残基、および／または収縮部の長さを増加させる少なくとも一つの前記残基を含みうる。
二重細孔内のＣｓｇＧモノマーは、第一の細孔および／または第二の細孔のバレルの収縮部は、分析物の検出または特徴付けに使用した時に、野生型収縮部を持つ第一の細孔または第二の細孔が使用された時と比較して、細孔の性質に影響を及ぼす、少なくとも一つ以上の残基（２、３、４または５個の残基など）を追加的に含んでもよく、ここで細孔のバレル領域の収縮部内の少なくとも一つの残基は、配列番号３のＹ５１、Ｎ５５、Ｙ５１、Ｐ５２および／またはＡ５３に対応する位置にある。少なくとも一つの残基は、配列番号３のＦ５６に対応する位置のＱまたはＶ、配列番号３のＹ５１に対応する位置のＡまたはＱ、および／または配列番号３のＮ５５に対応する位置のＶでもよい。
修飾タンパク質を作製する方法
非天然のアミノ酸を導入または置換するための方法も、当技術分野で周知である。例えば、非天然のアミノ酸は、突然変異体モノマーを発現するために使用されるＩＶＴＴシステムに合成アミノアシル−ＴｒＮＡを含めることによって導入されうる。別の方法として、非天然のアミノ酸は、それらの特定のアミノ酸の合成（すなわち、非天然型）類似体の存在下で、特定のアミノ酸に対する栄養要求性であるＥ． ｃｏｌｉ内に突然変異体モノマーを発現することによって導入されてもよい。突然変異体モノマーが部分的なペプチド合成を用いて生成される場合、それらは裸のライゲーションによって生成されうる。
ＣｓｇＧに由来するモノマーは、例えば、ストレプトアビジンタグの追加により、またはモノマーがそのような配列を自然には含まない細胞からの分泌を促進するシグナル配列の追加により、それらの識別または精製を補助するように修飾されうる。その他の適切なタグについては、以下でより詳細に検討する。モノマーは、明らかなラベルで標識されうる。明らかなラベルは、モノマーが検出されるようにする任意の適切なラベルとしうる。適切なラベルを以下に記載する。
ＣｓｇＧに由来するモノマーはＤ−アミノ酸を使用して生成されてもよい。例えば、ＣｓｇＧに由来するモノマーは、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の混合物を含みうる。これは、当該タンパク質またはペプチドを産生するための当技術分野で慣習的である。
ＣｓｇＧに由来するモノマーは、ヌクレオチド差別を促進するための一つ以上の特異的修飾を含有する。ＣｓｇＧに由来するモノマーは、細孔形成に干渉しない限り、その他の非特異的修飾も含みうる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野で周知であり、ＣｓｇＧに由来するモノマーの側鎖になされてもよい。こうした修飾には、例えば、アルデヒドとの反応によるアミノ酸の還元性アルキル化、それに続くＮａＢＨ４を用いた還元、アセトイミド酸メチルを用いたアミド化、または無水酢酸を用いたアシル化が含まれる。
ＣｓｇＧに由来するモノマーは、当技術分野で周知の標準的な方法を使用して製造することができる。ＣｓｇＧに由来するモノマーは、合成的にまたは組み換え型手段によって作製されうる。例えば、モノマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）により合成されうる。細孔およびモノマーを製造するための適切な方法は、国際出願ＷＯ ２０１０／００４２７３、ＷＯ ２０１０／００４２６５またはＷＯ ２０１０／０８６６０３に記載されている。細孔を膜に挿入するための方法は周知である。
細孔内の二つ以上のＣｓｇＧモノマーは、互いに共有結合しうる。例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個のモノマーが共有結合しうる。共有結合されたモノマーは、同一であっても異なっていてもよい。
モノマーは、随意にリンカーを介して遺伝学的に融合、または、例えば化学架橋剤を介して化学的に融合されてもよい。モノマーを共有結合する方法は、ＷＯ２０１７／１４９３１６、ＷＯ２０１７／１４９３１７およびＷＯ２０１７／１４９３１８に開示されている。
一部の実施形態では、突然変異体モノマーは化学修飾される。突然変異体モノマーは、任意の方法および任意の部位で化学修飾されうる。突然変異体モノマーは、分子の一つ以上のシステイン（システイン結合）、一つ以上のリジンへの分子の付着、一つ以上の非天然アミノ酸への分子の付着、エピトープの酵素修飾、または末端の修飾によって化学修飾されることが好ましい。こうした修飾を実施するための適切な方法は、当技術分野で周知である。突然変異体モノマーは、任意の分子の付着によって化学修飾されてもよい。例えば、突然変異体モノマーは、染料または発蛍色素分子の付着によって化学修飾されうる。
一部の実施形態では、突然変異体モノマーは、モノマーと標的ヌクレオチド配列または標的ポリヌクレオチド配列とを含む細孔間の相互作用を促進する分子アダプターで化学修飾される。アダプターの存在は、細孔およびヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列のホストゲスト化学を改善し、それによって突然変異体モノマーから形成される細孔の配列決定能力を改善する。ホストゲスト化学の原理は当技術分野で周知である。アダプターは、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列とのその相互作用を改善する細孔の物理的または化学的特性に対する効果を持つ。アダプターは、細孔のバレルまたはチャネルの電荷を変化させるか、またはヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列と特異的に相互作用するか、またはそれに結合して、それによって細孔とのその相互作用を促進しうる。
分子アダプターは、環状分子、シクロデキストリン、雑種形成能力のある種、ＤＮＡ結合剤またはインターキレーター、ペプチドまたはペプチド類似体、合成ポリマー、芳香族平面分子、正電荷を持つ小さな分子、または水素結合の能力を持つ小分子であることが好ましい。
アダプターは環状であってもよい。環状アダプターは、細孔と同じ対称性を持つことが好ましい。アダプターは、ＣｓｇＧが、典型的には中央軸の周りに８または９つのサブユニットを有するので、８倍または９倍の対称性を有することが好ましい。これについては、以下で詳細に説明する。
アダプターは一般に、ホストゲスト化学によってヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列と相互作用する。アダプターは一般に、ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列と相互作用する能力を有する。アダプターは、ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列と相互作用する能力を有する一つ以上の化学基を含む。一つ以上の化学基は、疎水性相互作用、水素結合、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌ力、π−カチオンの相互作用および／または静電力など、非共有結合相互作用によってヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列と相互作用することが好ましい。ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列と相互作用する能力を持つ一つ以上の化学基は、正電荷を帯びていることが好ましい。ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列と相互作用する能力を有する一つ以上の化学基は、アミノ基を含むことがより好ましい。アミノ基は、第一炭素原子、第二炭素原子または第三炭素原子に付着することができる。アダプターは、６、７または８アミノ基の環などのアミノ基の環を含むことがさらに好ましい。アダプターは、８個のアミノ基の環を含むことが最も好ましい。プロトン化アミノ基の環は、ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列内で負電荷のリン酸基と相互作用してもよい。
細孔内のアダプターの正しい位置決めは、アダプターと突然変異体モノマーを含む細孔との間のホストゲスト化学によって促進されうる。アダプターは、細孔内の一つ以上のアミノ酸と相互作用する能力を持つ一つ以上の化学基を含むことが好ましい。アダプターは、疎水性相互作用、水素結合、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌ力、π−カチオンの相互作用および／または静電力など、非共有結合相互作用によって細孔内の一つ以上のアミノ酸と相互作用することができる一つ以上の化学基を含むことがより好ましい。細孔内の一つ以上のアミノ酸と相互作用することができる化学基は、典型的にはヒドロキシルまたはアミンである。ヒドロキシル基は、第一炭素原子、第二炭素原子または第三炭素原子に付着することができる。ヒドロキシル基は、細孔内の無電荷アミノ酸と水素結合を形成してもよい。細孔とヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列との間の相互作用を促進する任意のアダプターを使用することができる。
適切なアダプターとしては、シクロデキストリン、環状ペプチド、およびククルビツリルが挙げられるが、これらに限定されない。アダプターは、シクロデキストリンまたはその誘導体であることが好ましい。シクロデキストリンまたはその誘導体は、次の文献に開示される任意のものとしうる：Ｅｌｉｓｅｅｖ， Ａ． Ｖ．， ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｈ−Ｊ． （１９９４） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１６， ６０８１−６０８８。アダプターは、ヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１− ＣＤ）またはヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）であることがより好ましい。ｇｕ７−βＣＤ内のグアニジノ基は、ａｍ７−βＣＤ内の一次アミンよりもずっと高いｐＫａを有するため、より高く正荷電される。このｇｕ７−βＣＤアダプターは、細孔内のヌクレオチドのドゥエル時間を延長させる、測定された残留電流の精度を増加させる、また高温または低データ取得速度で塩基検出速度を増加させるために使用されうる。
スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）架橋剤が、以下でより詳細に検討されるように使用される場合、アダプターは、ヘプタキス（６−デオキシ−６−アミノ）−６−Ｎ−モノ（２−ピリジル）ジチオプロパノイル−β−シクロデキストリンであることが好ましい（ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ）。
より適切なアダプターには、９個の糖単位を含むγ−シクロデキストリンが含まれる（従って、９倍対称性を有する）。γ−シクロデキストリンは、リンカー分子を含有してもよく、または上述のβ−シクロデキストリンの例で使用される修飾糖単位のすべてまたはそれ以上を含むように修飾されてもよい。
分子アダプターは、突然変異体モノマーに共有結合していてもよい。アダプターは、当技術分野で周知の任意の方法を使用して細孔に共有結合されうる。アダプターは通常、化学結合を介して付着される。分子アダプターがシステイン結合を介して付着される場合、一つ以上のシステインは、（例えば、バレル内で）置換によって、突然変異体に導入されることが好ましい。突然変異体モノマーは、突然変異体モノマー内の一つ以上のシステインへの分子アダプターの付着によって化学修飾されうる。一つ以上のシステインは、自然発生的、すなわち、配列番号３において、位置１および／または２１５であってもよい。別の方法として、突然変異体モノマーは、その他の位置に導入された一つ以上のシステインへの分子の付着によって化学修飾されうる。位置２１５のシステインは、分子アダプターが、位置１のシステイン、または別の位置に導入されたシステイン以外のその位置に付着しないよう確保するために、例えば、置換によって除去されてもよい。
システイン残基の反応性は、隣接した残基の修飾によって強化されうる。例えば、隣接するアルギニン、ヒスチジンまたはリジン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａをより反応性のＳ−基に変化させる。システイン残基の反応性は、ｄＴＮＢなどのチオール保護基によって保護されうる。これらは、リンカーが結合する前に、突然変異体モノマーの一つ以上のシステイン残基と反応しうる。
分子は、突然変異体モノマーに直接付着されてもよい。分子は、化学架橋剤またはペプチドリンカーなどのリンカーを使用して突然変異体モノマーに付着されることが好ましい。
適切な化学架橋剤は当技術分野で周知である。好ましい架橋剤には、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパン酸塩、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタン酸塩、および２，５−ジオキソピロリジン−１−イル８−（ピリジン−２−イルジスルファニル）オクタン酸塩が含まれる。最も好ましい架橋剤は、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）である。典型的には、分子／架橋剤複合体が突然変異体モノマーに共有結合される前に、分子は二官能性架橋剤に共有結合されるが、二官能性架橋剤／モノマー複合体が分子に結合される前に、二官能性架橋剤を共有結合してモノマーに共有結合することも可能である。
リンカーは、ジチオスレトール（ＤＴＴ）に対して耐性があることが好ましい。適切なリンカーとしては、ヨードアセトアミドベースおよびマレイミドベースのリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。
他の実施形態では、モノマーはポリヌクレオチド結合タンパク質に付着されてもよい。これは、本発明の配列決定の方法で使用されうるモジュール式配列決定システムを形成する。ポリヌクレオチド結合タンパク質については以下で考察する。
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、突然変異体モノマーに共有結合していることが好ましい。タンパク質は、当技術分野で周知の任意の方法を使用してモノマーに共有結合されうる。モノマーおよびタンパク質は、化学的に融合または遺伝学的に融合されうる。構成体全体が単一ポリヌクレオチド配列から発現される場合、モノマーおよびタンパク質は遺伝学的に融合される。ポリヌクレオチド結合タンパク質に対するモノマーの遺伝子融合は、ＷＯ ２０１０／００４２６５号で考察される。
ポリヌクレオチド結合タンパク質がシステイン結合を介して取り付けられる場合、一つ以上のシステインが置換によって突然変異体に導入されることが好ましい。一つ以上のシステインは、突然変異または挿入が許容されうることを示す相同体間で低い保存性を持つループ領域に導入されることが好ましい。従って、ポリヌクレオチド結合タンパク質を取り付けるために適切である。こうした実施形態では、位置２５１にある天然のシステインを取り除くことができる。システイン残基の反応性は、上述のように修飾によって強化されうる。
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、突然変異体モノマーまたは一つ以上のリンカーを介して直接結合することができる。分子は、ＷＯ ２０１０／０８６６０２号に記載される雑種形成リンカーを使用して、突然変異体モノマーに付着されてもよい。あるいは、ペプチドリンカーを使用してもよい。ペプチドリンカーはアミノ酸配列である。ペプチドリンカーの長さ、柔軟性および親水性は典型的に、モノマーおよび分子の機能を妨害しないように設計される。好ましい可撓性のペプチドリンカーは、セリンアミノ酸、および／またはグリシンアミノ酸など、２〜２０個分の長さ（４、６、８、１０または１６個分など）である。より好ましい可撓性のリンカーには、（ＳＧ）１、（ＳＧ）２、（ＳＧ）３、（ＳＧ）４、（ＳＧ）５および（ＳＧ）８が含まれ、ここで、Ｓはセリンであり、Ｇはグリシンである。好ましい剛性リンカーは、プロリンアミノ酸２〜３０個分の長さ（４、６、８、１６または２４個分）である。より好ましい剛性リンカーは、（Ｐ）１２を含み、ここで、Ｐはプロリンである。
化学修飾
突然変異体ＣｓｇＧモノマーまたはＣｓｇＦペプチドは、分子アダプターおよびポリヌクレオチド結合タンパク質で化学修飾されてもよい。
分子（モノマーまたはペプチドが化学修飾されているもの）は、ＷＯ ２０１０／００４２７３、ＷＯ ２０１０／００４２６５、またはＷＯ ２０１０／０８６６０３号に開示されているように、モノマーまたはペプチドに直接取り付けられてもよく、またはリンカーを介して取り付けられてもよい。
ＣｓｇＧモノマーおよび／またはＣｓｇＦペプチドなど本明細書に記載される任意のタンパク質は、例えば、ヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、フラグタグ、ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグを追加することにより、またはポリペプチドがシグナル配列を自然に含有しない細胞からの分泌を促進するシグナル配列の追加によって、それらの特定または精製を支援するよう修飾されうる。遺伝子タグを導入する代替は、タンパク質上の天然または改変された位置にタグを化学的に反応させることである。この一例は、ゲル−シフト試薬を、タンパク質の外側で改変されたシステインに反応させることである。これは、ヘモリシンヘテロオリゴマーを分離する方法として実証されている（Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． １９９７ Ｊｕｌ、４（７）：４９７−５０５）。
ＣｓｇＧモノマーおよび／またはＣｓｇＦペプチドなど本明細書に記載される任意のタンパク質は、明らかなラベルで標識されうる。明らかなラベルは、タンパク質が検出されるようにする任意の適切なラベルとしうる。適切なラベルには、蛍光分子、放射性同位体、例えば１２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチド、およびビオチンなどのリガンドなどがあるが、これらに限定されない。
ＣｓｇＧモノマーおよび／またはＣｓｇＦペプチドなどの本明細書に記載される任意のタンパク質は、合成的にまたは組み換え型手段によって作製されうる。例えば、タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）により合成されうる。タンパク質のアミノ酸配列は、非天然のアミノ酸を含むか、またはタンパク質の安定性を増加させるように修飾されてもよい。合成手段によってタンパク質が生成されると、こうしたアミノ酸が生成中に導入されうる。タンパク質はまた、合成または組み換えのいずれかの製造の後にも変更されうる。
タンパク質はＤ−アミノ酸を使用して生成されてもよい。例えば、タンパク質は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の混合物を含みうる。これは、当該タンパク質またはペプチドを産生するための当技術分野で慣習的である。
タンパク質は、タンパク質の機能に干渉しない限り、その他の非特異的修飾も含みうる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野で周知であり、タンパク質の側鎖になされてもよい。こうした修飾には、例えば、アルデヒドとの反応によるアミノ酸の還元性アルキル化、それに続くＮａＢＨ４を用いた還元、アセトイミド酸メチルを用いたアミド化、または無水酢酸を用いたアシル化が含まれる。
ＣｓｇＧモノマーおよび／またはＣｓｇＦペプチドなどの本明細書に記載される任意のタンパク質は、当技術分野で周知の標準的な方法を使用して製造することができる。タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野の標準的な方法を使用して誘導され、複製されてもよい。タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野の標準技術を使用して細菌宿主細胞内で発現されてもよい。タンパク質は、ｉｎ ｓｉｔｕ組み換え型発現ベクターからのポリペプチドの発現によって、細胞内で生成されうる。発現ベクターは随意に、誘導性プロモーターを担持して、ポリペプチドの発現を制御する。これらの方法は、以下の文献に記載がある：Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ． （２００１）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ。
タンパク質は、タンパク質生成生物体から、または組み換え型発現後に、任意のタンパク質液体クロマトグラフィーシステムによって精製された後で大規模に製造されうる。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィーシステムには、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡシステム、Ｂｉｏ−Ｃａｄシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＢｉｏLｏｇicシステム、およびＧｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣシステムが含まれる。
細孔を生成する方法
第三の態様では、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで、二つ以上の収縮部位を保持するＣｓｇＧ：修飾ＣｓｇＧ細孔複合体を製造する方法を提供する。一実施形態は、ＣｓｇＧ細孔またはその相同体もしくは突然変異体形態と、修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体とを含む膜貫通細孔複合体を共発現によって生成する方法を提供する。前記方法は、ＣｓｇＧモノマー（配列番号２で提供される前タンパク質またはその相同体もしくは突然変異体として発現）を発現する工程と、修飾または切断されたＣｓｇＦモノマー（どちらも適切な宿主細胞内）を発現して、ｉｎ ｖｉｖｏ複合体細孔を形成させる工程とを含む。前記複合体は、ＣｓｇＧ細孔との複合体を形成する修飾ＣｓｇＦペプチドを含み、その細孔を追加的なリーダーヘッドに提供する。修飾ＣｓｇＦペプチドを使用して前記方法によって生成される結果的な細孔複合体は、分析物（特にポリヌクレオチド鎖）の通過を許容するため、核酸配列決定などの標的分析物の特徴付けで細孔複合体を使用するために十分な構造を提供し、また、前記用途で適切な設定で使用される時、前記ポリヌクレオチド配列の読取を改善するための二つ以上のリーダーヘッドを含む。
より具体的には、前記方法で発現される修飾ＣｓｇＦペプチドは、配列番号８、１０、１２、または１４、またはそれらの相同体に示される前タンパク質を含む。これらの配列は、方法を、細孔複合体内に収縮部位を導入して、ＣｓｇＧタンパク質細孔に結合して生物学的細孔を獲得することができるＣｓｇＦ断片に限定する。
ＣｓｇＧタンパク質およびＣｓｇＦタンパク質またはこれに類するものによって形成された単離された細孔複合体を生成する別の方法は、前記モノマーをｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成して機能的細孔を獲得することに関する。前記方法は、複合体形成を可能にする適切なシステムで、配列番号３またはその相同体もしくは突然変異体で描写された成熟ＣｓｇＧモノマーを、修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体と接触させる工程を含む。前記システムは、「ｉｎ ｖｉｔｒｏシステム」であってもよく、これは前記方法を実行するために少なくとも必要な構成要素および環境を含み、かつ通常の天然の環境外にある生物学的分子、生物体、細胞（または細胞の部分）を使用して、生物体全体を用いて実行できるよりも、より詳細にわたり、より好都合で、またはより効率的な分析を許容するシステムを意味する。ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムはまた、試験管内に提供される適切な緩衝液組成物を含んでもよく、ここに複合体を形成するための前記タンパク質構成要素が追加される。当業者であれば、前記システムを提供するオプションを認識している。特定の実施形態でｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成のために、前記方法において適用される前記修飾ＣｓｇＦペプチドまたはそれに類するものは、配列番号１５または配列番号１６、またはその突然変異体もしくは相同体を含むペプチドで、これは合成されるか、または組換え生成されうる。あるいは、配列番号４０、３９、３８、または３７、１５、５４、５５またはそれらの相同体または突然変異体を含む修飾ＣｓｇＦペプチドは、前記方法で、ＣｓｇＧまたはＣｓｇＧ様細孔と接触させて、細孔複合体を生成するために提供されている。
ＣｓｇＧ／ＣｓｇＦ細孔は、任意の適切な方法で作製することができる。こうした適切な方法の例が記載されている。
一実施形態では、ＣｓｇＧ／ＣｓｇＦ細孔は共発現によって生成されうる。この実施形態では、一つのベクター中でＣｓｇＧモノマーポリペプチド（突然変異体ポリペプチドでもよい）をコードする少なくとも一つの遺伝子と、第二のベクター中で少なくとも一つの全長または切断ＣｓｇＦポリペプチド（突然変異体ポリペプチドでもよい）をコードする遺伝子とが、一緒に形質転換されてタンパク質を発現させ、形質転換された細胞内で複合体を作製しうる。これは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏのどちらでもよい。別の方法として、ＣｓｇＧおよびＣｓｇＦのポリペプチドをコードする二つの遺伝子を、単一のプロモーターの制御下、または異なる二つの別個のプロモーター（これらは同じでも異なってもよい）の制御下で一つのベクター内に配置することができる。
別の実施形態では、ＣｓｇＧ／ＣｓｇＦ細孔は、ＣｓｇＦペプチドとは別個にＣｓｇＧモノマーを発現することによって生成される。ＣｓｇＧモノマーまたはＣｓｇＧ細孔は、少なくとも一つのＣｓｇＧモノマーをコードするベクターで、またはそれぞれがＣｓｇＧモノマーを発現する一つ以上のベクターで、形質転換された細胞から精製されてもよい。ＣｓｇＦペプチドは、少なくとも一つのＣｓｇＦペプチドをコードするベクターで形質転換された細胞から精製されてもよい。次に、精製されたＣｓｇＧモノマー／細孔をＣｓｇＦペプチドと共に培養して、細孔複合体を作製してもよい。
別の実施形態では、ＣｓｇＧモノマーおよび／またはＣｓｇＦペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）により別々に生成される。次に、ＣｓｇＧモノマーをＣｓｇＦペプチドと共に培養して、細孔複合体を作製してもよい。この方法の使用は図１４に図示されている。
上記の実施形態は、例えば、（ｉ）ＣｓｇＧがｉｎ ｖｉｖｏでかつＣｓｇＦがｉｎ ｖｉｖｏで産生、（ｉｉ）ＣｓｇＧがｉｎ ｖｉｔｒｏでかつＣｓｇＦがｉｎ ｖｉｖｏで産生、（ｉｉｉ）ＣｓｇＧがｉｎ ｖｉｖｏでかつＣｓｇＦがｉｎ ｖｉｔｒｏで産生、または（ｉｖ）ＣｓｇＧがｉｎ ｖｉｔｒｏでかつＣｓｇＦがｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されてもよい。
ＣｓｇＧモノマーおよびＣｓｇＦペプチドの一方または両方は、精製を促進するためにタグ付けされうる。精製は、ＣｓｇＧモノマーおよび／またはＣｓｇＦペプチドがタグ付けされていない場合にも実施されうる。当技術分野で知られている方法（例えば、イオン交換、ゲルろ過、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー）は、細孔の構成要素を精製するために単独でまたは異なる組み合わせで使用することができる。
任意の既知のタグを、二つのタンパク質のいずれかで使用することができる。一実施形態では、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体をＣｓｇＧ細孔およびＣｓｇＦから精製するために二つのタグ精製を使用することができる。例えば、ストレップタグをＣｓｇＧで使用することができ、ＨｉｓタグをＣｓｇＦで使用することができ、またはその逆でもよい。これは図１３に例証されている。二つのタンパク質が個別に精製され、その後にまとめて混合されてから、ストレップ精製およびＨｉｓ精製をもう一度行った時、類似した最終結果を得ることができる。
全長ＣｓｇＦタンパク質がＣｓｇＧと複合体を形成する場合、ＣｓｇＦ（図４Ｂ）のネックドメインおよびヘッドドメインは、ＣｓｇＧ細孔のβバレルから突き出す。
従って、ＣｓｇＧ細孔および全長ＣｓｇＦを含む細孔が単一チャネル記録実験で使用された場合、ヘッドドメインは膜への細孔の挿入を妨げるかまたは防止しうる。これらはまた、分析物が細孔を通過するのを妨害する可能性がある。従って、細孔を膜に挿入するとき、βバレルからぶら下がっている可撓性のポリペプチドの数を減らすことができればより良い。複合体のｃｒｙｏ ＥＭ構造内で解決されたＦＣＰ領域を模倣し、かつ構造上の完全性を維持する、ＣｓｇＦタンパク質の切断バージョンが、本明細書に提供されている。
ＣｓｇＧ／ＣｓｇＦ細孔は、ＣｓｇＧ細孔を膜に挿入する前、または膜に挿入した後に作製することができる。膜に挿入する前に細孔複合体が作製される時、切断突然変異体が使用されることが好ましい。しかしながら、ＣｓｇＧおよびＣｓｇＧ複合体がｉｎ ｓｉｔｕで形成されるように、ＣｓｇＧ細孔を膜に挿入して、その後にＣｓｇＦペプチドを追加することもできる。例えば、一つの実施形態では、膜の貫通側にアクセス可能なシステム（例えば、電気生理学測定用のチップまたはチャンバー内）では、複合体がｉｎ−ｓｉｔｕで形成されるように、ＣｓｇＧ細孔が膜に挿入されてから、ＣｓｇＦペプチドが膜の貫通側から追加されてもよい。ＣｓｇＧ細孔が原位置で形成される任意の実施形態では、より大きなＣｓｇＦペプチドを使用してもよい。例えば、ＣｓｇＦペプチドは、ＣｓｇＦ（配列番号６のおよそ残基３６に由来）のネックドメインすべてまたは一部を含んでもよい。一部の実施形態では、ＣｓｇＦはすべてのネックドメインおよびヘッドドメインの一部（配列番号６の残基３６〜ＸＸ）を含みうる。
複合体を作製する方法および特定の切断のある複合体の安定性に応じて、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦおよびＣｓｇＧ：ＦＣＰ複合体は異なる方法で作製することができる。
一実施形態では、必要な長さにおけるＣｓｇＦポリペプチドの切断バージョンが直接使用される。
別の実施形態では、ＣｓｇＦの全長ポリペプチド、または要求される切断よりも長いもの（複合体を安定に保つのに十分な長さ）が使用され、ここで、プロテアーゼによる切断によって、要求される長さのＣｓｇＦペプチドが生成されるように、プロテアーゼ切断部位が挿入されている（例えば、ＴＥＶ、ＨＲＶ ３またはその他任意のプロテアーゼ切断部位）。この実施形態では、ＣｓｇＧ／ＣｓｇＦ複合体が形成されると、プロテアーゼが必要な部位でＣｓＧＦを切断するために使用される。あるいは、プロテアーゼは、複合体の組立前にＣｓｇＦペプチドを生成するために使用されてもよい。
一部のプロテアーゼ部位は、切断後に追加的タグを残す。例えば、ＴＥＶプロテアーゼ切断配列はＥＮＬＹＦＱＳである。ＴＥＶプロテアーゼは、ＱとＳの間でタンパク質を切断し、ＣｓｇＦペプチドのＣ末端にＥＮＬＹＦＱを無傷で残す。図１５は、複合体形成後にＴＥＶプロテアーゼを使用して切断されたＴＥＶ切断部位を含む修飾ＣｓｇＦを使用した実施例を示す。別の例として、ＨＲＶ Ｃ３切断部位はＬＥＶＬＦＱＧＰであり、酵素はＱとＧの間で切断し、ＣｓｇＦペプチドのＣ末端にＬＥＶＬＦＱを無傷で残す。
分析物を特徴付ける方法
さらなる態様では、本発明は、標的分析物の存在、不在、または一つ以上の特性を決定する方法を提供する。方法は、標的分析物が細孔チャネルと関連して（中に入る、または貫通するなど）、移動するように、標的分析物を単離された細孔複合体、または膜貫通細孔（本発明の細孔など）と接触させる工程と、分析物が細孔に関連して移動する時に一つ以上の測定値を取り、それによって分析物の存在、不在または一つ以上の特性を決定する工程とが関与する。標的分析物はまた、テンプレート分析物または対象分析物と呼ばれてもよい。単離された細孔複合体は一般に、７個、８個、９個、または１０個のＣｓｇＧモノマーなど、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個のモノマーを含む。単離された細孔複合体は、８個または９個の同一のＣｓｇＧモノマーを含むことが好ましい。ＣｓｇＧモノマーのうち一つ以上（２、３、４、５、６、７、８、９または１０など）は、化学修飾されることが好ましく、またはＣｓｇＦペプチドが化学修飾される。ＣｓｇＧモノマーまたはその相同体もしくは突然変異体と、修飾ＣｓｇＦモノマーまたはその相同体もしくは突然変異体などの単離された細孔複合体モノマーは、任意の生物体に由来しうる。分析物はＣｓｇＧ収縮部を通過した後、ＣｓｇＦ収縮を通過してもよい。別の実施形態では、分析物はＣｓｇＦ収縮部を通過した後、膜内のＣｓｇＧ／ＣｓｇＦ複合体の配向に応じてＣｓｇＧ収縮部を通過してもよい。
方法は、標的分析物の存在、不在、または一つ以上の特性を決定することである。方法は、少なくとも一つの分析物の存在、不在、または一つ以上の特性を決定するためのものであってもよい。本方法は、二つ以上の分析物の存在、不在、または一つ以上の特性を決定することに関連しうる。本方法は、任意の数の分析物（２、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００以上の分析物など）の存在、不在、または一つ以上の特性を決定することを含みうる。一つ以上の分析物の任意の数の特性（１、２、３、４、５、１０以上の特性など）が決定されうる。
細孔複合体のチャネル内、またはチャネルの開口部のいずれかの開口部の近傍にあるの分子の結合は、細孔を通した開放チャネルイオン流に対する効果を有するが、これが細孔チャネルの「分子感知」の本質である。核酸配列決定用途と類似した様式で、開放チャネルイオン流の変化は、電流の変化によって適切な測定技術を用いて測定することができる（例えば、ＷＯ ２０００／２８３１２およびＤ． Ｓｔｏｄｄａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ２０１０， １０６， ７７０２−７またはＷＯ ２００９／０７７７３４）。電流の減少によって測定されるイオン流の減少の程度は、細孔内の障害物のサイズ、または細孔の近接さに関する。よって、細孔の中または近くにある対象分子（「分析物」とも呼ばれる）の結合は、検出可能かつ測定可能な事象を提供し、それによって「生物学的センサー」の基礎を形成する。ナノ細孔感知のための適切な分子には、核酸、タンパク質、ペプチド、多糖類および小分子（例えば、医薬品、毒素、サイトカイン、および汚染物質など）などの低分子量または無機化合物（本明細書では、低分子量（例えば、＜ ９００Ｄａまたは＜ ５００Ｄａ）の有機または無機の化合物を意味する）を含む。生物分子の存在を検出することは、個別化された薬物開発、医療、診断、ライフサイエンス研究、環境モニタリング、およびセキュリティおよび／または防衛産業における用途がある。
別の態様では、単離された細孔複合体、または野生型または修飾Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＧナノ細孔またはその相同体もしくは突然変異体と、チャネル収縮を複合体内の細孔に提供する修飾ＣｓｇＦペプチドとを含む膜貫通細孔複合体は、分子センサーまたは生物学的センサーとして機能しうる。一部の実施形態では、ＣｓｇＧナノ細孔は、細菌タンパク質（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ， Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）から誘導または単離されてもよい。一部の実施形態では、ＣｓｇＧナノ細孔を組換え生成することができる。分析物検出の手順は、Ｈｏｗｏｒｋａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （２０１２） Ｊｕｎ ７、 ３０（６）：５０６−７に記載がある。検出される分析物分子は、チャネルのいずれかの面に結合してもよく、またはチャネル自体の内腔内に結合してもよい。結合の位置は、感知される分子のサイズによって決定されうる。
標的分析物は、金属イオン、無機塩、ポリマー、アミノ酸、ペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、多糖類、染料、漂白剤、医薬品、診断用薬、娯楽用薬物、爆薬、有毒化合物、環境汚染物質が好ましい。本方法は、二つ以上のタンパク質、二つ以上のヌクレオチド、または二つ以上の医薬品など、同じタイプの二つ以上の分析物の存在、不在、または一つ以上の特性を決定することに関連しうる。別の方法として、方法は、一つ以上のタンパク質、一つ以上のヌクレオチド、および一つ以上の医薬品など、異なるタイプの二つ以上の分析物の存在、不在、または一つ以上の特性を決定することに関連しうる。
標的分析物は細胞から分泌されうる。あるいは、標的分析物は、方法を実行する前に分析物を細胞から抽出されなければならないように、細胞内に存在する分析物であってもよい。
野生型の細孔は、センサーとして作用してもよいが、感知される分子の結合強度、結合位置、または結合の特異性を増大させるために、組み換え方法または化学的方法を介して修飾されることがよくある。典型的な修飾には、感知される分子の構造に対して相補的な特異的結合部分の添加が含まれる。分析物分子が核酸を含む場合、この結合部分はシクロデキストリンまたはオリゴヌクレオチドを含んでもよく、小分子の場合には、これは補足的な結合領域、例えば、単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）領域またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）由来の抗原認識ドメインを含む、抗体分子または非抗体分子の抗原結合部分でもよく、またタンパク質の場合には、標的タンパク質の既知のリガンドでもよい。このようにして、野生型または修飾Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＧナノ細孔またはその相同体は、適切な抗原（エピトープを含む）の試料中の存在を検出する分子センサーとして作用する能力を与えることができ、抗原には、細胞表面抗原（受容体、固形腫瘍細胞、または血液がん細胞（例えば、リンパ腫もしくは白血病）のマーカー）、ウイルス性抗原、細菌性抗原、原生動物性抗原、アレルゲン、アレルギー関連分子、アルブミン（例えば、ヒト、齧歯類、またはウシ）、蛍光分子（フルオレセインを含む）、血液型抗原、小分子、薬物、酵素、酵素の触媒部位または酵素基質、および酵素基質の遷移状態の類似体が含まれうる。上述のように、修飾は、既知の遺伝子工学および組み換えＤＮＡ技術を使用して達成されうる。任意の適合の位置決めは、感知される分子の性質、例えば、サイズ、三次元構造、およびその生化学的性質に依存する。適合された構造の選択は、計算的構造設計を使用してもよい。タンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−小分子相互作用の決定および最適化は、表面プラズモン共鳴を使用した分子相互作用を検出するＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）などの技術を使用して調査できる（ＢＩＡｃｏｒｅ， Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ、ｗｗｗ．ｂｉａｃｏｒｅ．ｃｏｍも参照）。
一実施形態では、分析物はアミノ酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である。アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、天然のものでも非天然でもよい。ポリペプチドまたはタンパク質は、それらの合成アミノ酸または修飾アミノ酸内に含まれうる。アミノ酸に対するいくつかの異なるタイプの修飾が当技術分野で既知である。適切なアミノ酸およびその修飾は上記のとおりである。当然のことながら、標的分析物は当技術分野で利用可能な任意の方法によって修飾されうる。
別の実施形態では、分析物は核酸などのポリヌクレオチドであり、これは二つ以上のヌクレオチドを含む巨大分子として定義される。核酸はナノ細孔配列決定に特に適している。ＤＮＡおよびＲＮＡにおける天然の核酸塩基は、その物理的サイズによって区別されうる。核酸分子または個別の塩基がナノ細孔のチャネルを通過する時、塩基間のサイズ差はチャネルを通るイオン流量の直接相関する減少を引き起こす。イオン流の変動は記録されてもよい。イオン流の変動を記録するための適切な電気測定技術は、例えば、ＷＯ ２０００／２８３１２ ａｎｄ Ｄ． Ｓｔｏｄｄａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ２０１０， １０６， ｐｐ ７７０２−７（単一チャネル記録機器）、および例えば、ＷＯ ２００９／０７７７３４（マルチチャネル記録技術）に記載がある。適切な較正をすることで、イオン流の特性減少を使用して、リアルタイムでチャネルを特定のヌクレオチドおよび関連する塩基を特定することができる。典型的なナノ細孔核酸配列決定では、対象の核配列の個別ヌクレオチドがヌクレオチドによるチャネルの部分的閉塞によってナノ細孔のチャネルを逐次的に通過する時、開放チャネルイオン流が減少する。上述の適切な記録技術を使用して測定されるのは、イオン流のこの減少である。イオン流の減少は、チャネルを通過する既知のヌクレオチドに対する測定されたイオン流の減少に対して較正されてもよく、これが、どのヌクレオチドがチャネルを通過しているかを決定する手段となり、従って、順次実行される時、ナノ細孔を通過する核酸のヌクレオチド配列を決定する方法となる。個別のヌクレオチドの正確な決定については、収縮部（または「リーディングヘッド」）を通過する個別のヌクレオチドのサイズが、チャネルを通るイオン流の減少と直接相関していることが一般的には必要とされる。当然のことながら、配列決定は、例えば、関連するポリメラーゼの作用を介して、細孔を通して「通された」無傷の核酸ポリマーによって実施されてもよい。あるいは、配列は、細孔に近接して標的核酸から逐次的に除去されたヌクレオチド三リン酸塩基の通過によって決定されてもよい（例えば、ＷＯ ２０１４／１８７９２４を参照）。
ポリヌクレオチドまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組み合わせを含みうる。ヌクレオチドは天然または人工でありうる。ポリヌクレオチドの一つ以上のヌクレオチドを酸化またはメチル化することができる。ポリヌクレオチドの一つ以上のヌクレオチドが損傷を受けうる。例えば、ポリヌクレオチドはピリミジン二量体を含みうる。こうした二量体は典型的には、紫外線による損傷と関連付けられ、皮膚黒色腫の主要原因である。ポリヌクレオチド内の一つ以上のヌクレオチドは、例えば、当業者によって知られている適切な例であるラベルまたはタグを用いて修飾されてもよい。ポリヌクレオチドは、一つ以上のスペーサーを含みうる。ヌクレオチドは典型的には、核酸塩基、糖および少なくとも一つのリン酸基を含む。核酸塩基および糖はヌクレオシドを形成する。核酸塩基は典型的には複素環式である。核酸塩基には、プリンおよびピリミジンおよびより具体的にはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）およびシトシン（Ｃ）が含まれるが、これらに限定されない。糖は典型的にはペントース糖である。ヌクレオチド糖には、リボースおよびデオキシリボースが含まれるが、これらに限定されない。糖はデオキシリボースであることが好ましい。ポリヌクレオチドは、デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシウリジン（ｄＵ）および／またはチミジン（ｄＴ）、デオキシグアニオシン（ｄＧ）およびデオキシシチジン（ｄＣ）を含むことが好ましい。ヌクレオチドは典型的にはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは典型的には、モノリン酸、二リン酸塩または三リン酸塩を含有する。ヌクレオチドは、３つ以上のリン酸（４または５個のリン酸など）を含んでもよい。リン酸は、ヌクレオチドの５’側または３’側に取り付けられてもよい。ポリヌクレオチド内のヌクレオチドは、任意の方法で互いに取り付けられてもよい。ヌクレオチドは典型的には、核酸の中のその糖およびリン酸基によって取り付けられる。ヌクレオチドは、ピリミジン二量体の中のその核酸塩基を介して接続されてもよい。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドの少なくとも一部分は二本鎖であることが好ましい。ポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であることが最も好ましい。特に、ポリヌクレオチドを分析物として使用する前記方法は、（ｉ）ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）ポリヌクレオチドが修飾されているかどうかから選択される一つ以上の特性を決定する工程を含む。
ポリヌクレオチドは任意の長さ（ｉ）とすることができる。例えば、ポリヌクレオチドの長さは、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、または少なくとも５００個分のヌクレオチドまたはヌクレオチド対とすることができる。ポリヌクレオチドの長さは、１０００以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド対、５０００以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド対、または長さが１０００００以上のヌクレオチド対でありうる。任意の数のポリヌクレオチドを調査できる。例えば、方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、１００以上のポリヌクレオチドを特徴付けることに関連しうる。二つ以上のポリヌクレオチドが特徴付けられる場合、それらは異なるポリヌクレオチドまたは二つの同じポリヌクレオチドの例でありうる。ポリヌクレオチドは天然または人工でありうる。例えば、方法を使用して、製造されたオリゴヌクレオチドの配列を検証してもよい。この方法は通常、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実行される。
ヌクレオチドは、任意の同一性（ｉｉ）を有することができ、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、５−メチルシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチルシトシン一リン酸、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）およびデオキシメチルシチジン一リン酸を含むが、これに限定されない。ヌクレオチドは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＵＭＰから選択されることが好ましい。ヌクレオチドは、脱塩基であってもよい（すなわち、核酸塩基を欠く）。ヌクレオチドはまた、核酸塩基および糖を欠いてもよい（すなわち、Ｃ３スペーサーである）。ヌクレオチド（ｉｉｉ）の配列は、鎖の５’から３’方向にポリヌクレオチド株を通して互いに結合した以下のヌクレオチドの連続した同一性によって決定される。
ＣｓｇＧ細孔およびＣｓｇＦペプチドを含む細孔は、ホモポリマー分析において特に有用である。例えば、細孔を使用して、同一の連続したヌクレオチドなど、二つ以上のポリヌクレオチド、例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９または１０などのポリヌクレオチドの配列を決定してもよい。例えば、細孔は、ｐｏｌｙＡ、ｐｏｌｙＴ、ｐｏｌｙＧおよび／またはｐｏｌｙＣ領域を含むポリヌクレオチドを配列するために使用されてもよい。
ＣｓｇＧ細孔収縮は、配列番号３の５１、５５、および５６位置での残基で作製される。ＣｓｇＧのリーダーヘッドおよびその収縮突然変異体は一般的に鋭利である。ＤＮＡが収縮部を通過する時、任意の所与の時点での細孔のリーダーヘッドとおよそ５塩基の相互作用が電流信号を支配する。これらの鋭利なリーダーヘッドは、ＤＮＡ（Ａ、Ｔ、ＧおよびＣが混合された時）の読み出し混合配列領域で非常に良好であるが、ＤＮＡ（例えば、ｐｏｌｙＴ、ｐｏｌｙＧ、ｐｏｌｙＡ、ｐｏｌｙＣ）内にホモポリマー領域がある場合、信号は平坦になり、情報が欠如する。５つの塩基はＣｓｇＧおよびその収縮突然変異体の信号を支配するため、追加的なドウェル時間情報を使用せずに５より長い光ポリマーを差別するのが困難である。ところが、ＤＮＡが第２のリーダーヘッドを通過する場合、多くのＤＮＡ塩基が組み合わされたリーダーヘッドと相互作用し、差別され得るホモポリマーの長さを延長する。例および図面は、ＣｓｇＧ細孔およびＣｓｇＦペプチドを含む細孔を使用して、ホモポリマー配列決定精度のこうした増大が達成されることを示す。
キット
さらなる態様では、本発明は標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットも提供する。キットは、本発明による単離された細孔複合体と、膜構成要素または絶縁層を含む。膜は構成要素から形成されることが好ましい。単離された細孔複合体は、膜または絶縁層内に存在することが好ましく、まとめて膜貫通細孔複合体チャネルを形成する。キットは、両親媒性層またはトリブロック共重合体膜などの任意のタイプの膜の構成要素を含みうる。キットはポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含んでもよい。キットは、ポリヌクレオチドを膜に結合するための一つ以上のアンカーをさらに含みうる。キットは、上述の実施形態のいずれかを実行することを可能にする一つ以上の他の試薬または測定器を追加的に含みうる。こうした試薬または器具は、適切な緩衝液（水溶液）、対象から試料を獲得する手段（容器または針を含む器具など）、ポリヌクレオチドまたは電圧またはパッチクランプ装置を増幅および／または発現させる手段のうちの一つ以上を含む。試薬は、流体試料が試薬を再懸濁するように、乾燥状態でキット内に存在してもよい。キットはまた、随意に、キットが本発明の方法で使用されることを可能にする説明書、または方法でどの生物体が使用されうるのかに関する詳細を含みうる。最後に、キットはペプチド特徴付けに有用な追加的構成要素も含みうる。
一実施形態では、本発明により提供される単離された細孔複合体または膜貫通細孔複合体は、核酸配列決定に使用される。前記使用のために、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）を、膜内に位置するＣｓｇＧ：ＣｓｇＦナノ細孔複合体とともに用いて、細孔を通るオリゴマープローブＤＮＡ鎖の制御された移動を可能にしてもよい。電圧は、細孔およびナノ細孔の両側の塩溶液中のイオンの移動から生成される電流を横切って適用されうる。プローブＤＮＡが細孔を通って移動するにつれて、細孔がＤＮＡに関してイオン流が変化する。この情報は配列に依存することが示され、プローブの配列を現在の測定値から正確に読み取ることができるようにする。
特定の実施形態、特定の構成および／または分子は、本発明による操作された細胞および方法について本明細書に記載してきたが、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、形態および詳細における様々な変更または修飾を行うことができることが理解されるべきである。以下の実施例は、特定の実施形態をよりよく説明するために提供されており、用途を限定すると考えられるべきではない。用途は特許請求の範囲によってのみ限定される。
はじめに
ＣｓｇＧ細孔は、多構成要素タイプＶＩＩＩ分泌システムの一部であり、これはｃｕｒｌｉ生合成システムとしても知られており、これはＥ． ｃｏｌｉにおいてｃｕｒｌｉとして知られる凝集繊維の形成を引き起こす。Ｃｕｒｌｉは、細菌バイオフィルム形成および非生物性表面への付着に主に関与する細胞外タンパク質繊維である。ｃｕｒｌｉ生合成は、Ｅ． ｃｏｌｉ内のｃｓｇＢＡＣおよびｃｓｇＤＥＦＧ（ｃｕｒｌｉ特異的遺伝子）（Ｈａｍｍａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５）と呼ばれる二つのオペロンの指示による。ＣｕｒｌｉのサブユニットＣｓｇＡおよびＣｓｇＢの分泌は、外膜内にオリゴマー分泌チャネルを形成することが分かっている専用のリポタンパク質であるＣｓｇＧに依存する。輸送のために、ＣｓｇＧは、ペリプラズムアクセサリータンパク質および細胞外アクセサリータンパク質ＣｓｇＥおよびＣｓｇＧと連携して作用する。ＣｓｇＥは、ＣｓｇＧ媒介性輸送のための特異性因子を形成する一方、ＣｓｇＦはＣｓｇＢテンプレート化された凝集へのＣｓｇＡ分泌を細胞外繊維に結合させるようである。
ＣｓｇＧ分泌チャネルの結晶構造は、ＣｓｇＧがＯＭを横断し、内径４０ Åの３６鎖のβ−バレルを貫通する直径１２０ Åおよび高さ８５ Åの九量体輸送複合体を形成することを示した（Ｇｏｙａｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１４、図１）。膜貫通β−バレルからアイリス様の隔膜によって分離されたチャネルのペリプラズムドメインは、２４，０００ Å３の大きな溶媒アクセス可能な空洞を形成する。この隔膜は、各サブユニット内に存在する１２残基「収縮ループ」（ＣＬ）によって形成され、ＣｓｇＧオリゴマーの同心組織は溶剤を除外した直径約０．６ ｎｍと高さ約１．５ ｎｍのオリフィスを形成する（図１）。タンパク質分泌チャネルとして作用する時、ＣｓｇＧチャネル内のこのオリフィスまたは収縮部は、転位ポリペプチドとの相互作用の主要部位を形成する。ＣｓｇＧがナノ細孔感知プラットフォームとして使用される場合、このオリフィスは、チャネル内に存在するか、または流路を通過する分析物の主要リーダーヘッドの役割を果たす。オリフィスの直径ならびにその物理的および化学的特性は、配列番号３の残基４６〜６１に対応するタンパク質の領域におけるアミノ酸置換、欠失、または挿入によって修飾されうる（図１Ｄ）。特に、配列番号３による位置５１、５５、および５６の突然変異は、まとめてまたは独立して、ナノ細孔のコンダクタンス特性およびポリヌクレオチドを含む分析物とのその相互作用に有益な影響を有する。
集合因子ＣｓｇＦは、ｃｕｒｌｉ分泌装置の構成要素を表す。ＣｓｇＦ前タンパク質は、ＳＥＣ経路を介してペリプラズムに達し、その後、ＣｓｇＧに依存する形で成熟ＣｓｇＦ（１２．９ ＫＤａ）が表面が晒されたタンパク質として見出された。ＣｓｇＧの存在下では、ＣｓｇＦはＯＭで断片化し、共免疫沈降実験は、二つのタンパク質が直接接触状態にあることを示唆している。利用可能なデータは、ＣｓｇＦは生産的サブユニット分泌に不可欠ではなく、むしろタンパク質が、ＣｓｇＢサブユニットの各形成機能を調整または監視することにより、ＣｓｇＡ分泌と細胞外重合との間の結合因子をｃｕｒｌｉ繊維内に形成することを示唆している。
［実施例１］
ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体タンパク質の産生（ＣｓｇＦ合成ペプチドを用いたＣｓｇＧの共発現、ｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写および翻訳の結合、およびＣｓｇＦ合成ペプチドとのＣｓｇＧ再構成）
ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を産生するために、両方のタンパク質は、適切なグラム陰性宿主（Ｅ． ｃｏｌｉなど）内で共発現して、外膜から複合体として抽出し、精製されうる。このＣｓｇＧ細孔およびＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体のｉｎ ｖｉｖｏ形成は、外膜へのタンパク質の標的化を必要とする。そのためには、ＣｓｇＧはリポタンパク質シグナルペプチド（Ｊｕｎｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００３， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． １２（８）： １６５２−６２）と、成熟タンパク質（配列番号３）のＮ末端位置にあるＣｙｓ残基とを伴う、プレプロタンパク質として発現される。このようなリポタンパク質シグナルペプチドの例は、配列番号２に示す全長Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＧの１〜１５残基である。プレプロＣｓｇＧの処理は、シグナルペプチドの切断および成熟ＣｓｇＧの脂質化をもたらし、その後、成熟リポタンパク質が外膜に移動し、そこで、オリゴマー細孔として挿入される（Ｇｏｙａｌ ｅｔ ａｌ． ２０１４， Ｎａｔｕｒｅ ５１６（７５３０）：２５０−３）。ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を形成するために、ＣｓｇＦは、ＣｓｇＧと共発現して、配列番号５の残基１〜１９に対応するネイティブのシグナルペプチドなど、リーダー配列によって、ペリプラズムに標的化されうる。次に、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ組み合わせ細孔は、洗浄剤を使用して外膜から抽出し、クロマトグラフィーによって均質な複合体に精製することができる（図２）。
別の方法として、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ細孔複合体は、ＣｓｇＧ細孔およびＣｓｇＦを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成によって産生されうる。下記および図３を参照。
図２に示す例のｉｎ ｖｉｖｏ ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体形成について、ネイティブのシグナルペプチドを使用して、Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦ（配列番号５）およびＣｓｇＧ（配列番号２）が共発現され、両方のタンパク質のペリプラズム標的化、およびＣｓｇＧのＮ末端脂質化を確保した。さらに、精製を容易にするために、ＣｓｇＦは、Ｃ末端６ｘヒスチジンタグを導入し、ＣｓｇＧをＣ末端でストレップ−ＩＩタグに融合することにより修飾された。共発現および複合体精製は、方法に記載されるとおりに実施された。Ｈｉｓ親和性精製溶出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ＣｓｇＦ−Ｈｉｓの濃縮と、ＣｓｇＧ−Ｓｔｒｅｐの共精製が明らかになり、後者はＣｓｇＦを伴う複合体内にあったことが示唆された（図２Ｂ）。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、タンパク質のＮ末端断片の損失のために、溶出されたＣｓｇＦの著しい画分が低分子量で実施されることを明らかにした（図２Ｂ、星印で示す）。第二の親和性精製のＨｉｓトラップ溶出物のプールされた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、見かけの等モル濃縮物内のＣｓｇＧおよびＣｓｇＦの存在ならびにＨｉｓ−トラップ溶出物で見られたＣｓｇＦ切断断片の損失を明らかにした（図２Ｂ）。ストレップ−親和性精製におけるＣｓｇＦの共溶出は、タンパク質がＣｓｇＧと非共有結合複合体として存在することを示した。特筆すべきことに、ＣｓｇＦのＮ末端切断断片がストレップ−親和性精製で失われ、ＣｓｇＧを結合するにはＣｓｇＦ Ｎ末端が必要があることが示唆されている（図２Ｂ）。
図１３は、ｉｎ ｖｉｖｏ共発現によるＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体形成の別の例を示す。この例では、ＣｓｇＧＡタンパク質はＣ末端ストレップ−ＩＩタグで修飾され、ＣｓｇＧ全長タンパク質はＣ末端１０Ｘヒスチジンタグで修飾される。共発現ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体は、分析物の特徴付けについての材料および方法セクションに示すように、ストレップタグ精製により、続いてヒスチジンタグ精製により、その成分構成要素からその成分構成要素から分離されて精製された。分子量の差異により、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析内のＣｓｇＧ細孔から明確に差別化されることができる（図１３Ａ）。図１３Ｂに示すように、二つのタグ精製方法を首尾よく適用して、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体をその成分構成要素から分離して精製することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成によってＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を製造するために、ＣｓｇＧおよびＣｓｇＦが、それぞれｐＰＧ１およびｐＮＡ１０１を用いて形質転換された別々のＥ． ｃｏｌｉ培養内で発現され、精製された後、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成をした（方法を参照）。比較のために、精製されたＣｓｇＧは、複合体としてＳｕｐｅｒｏｓｅ ６カラム上で同様に実施された。ＣｓｇＧ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６の実行は、九量体ＣｓｇＧ細孔（図３Ａ（ａ）および３Ｃ）と、九量体ＣｓｇＧ細孔の二量体（図３Ａ（ｂ）および３Ｃ）に対応する二つの不連続の集団の存在を明らかにした（Ｇｏｙａｌ ｅｔ ａｌ．で前に説明したとおり）。（２０１４）。ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ再構成のＳｕｐｅｒｏｓｅ ６実行は、過剰なＣｓｇＦ（図３Ａ（ｃ））、九量体のＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体（図３Ａ（ｄ））および九量体のＣｓｇＧ：ＣｓｇＦの二量体（図３Ａ（ｅ））に対応する３つの個別群の存在を明らかにした。ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の形成について独立的に確認をするために、様々なＳｕｐｅｒｏｓｅ ６溶出ピークをネイティブＰＡＧＥ（図３Ｂ）で分析した。
意外にも、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体は、分析物の特徴付けのための材料および方法セクションに記載のあるｉｎ ｖｉｔｒｏ 転写および翻訳（ＩＶＴＴ）結合方法によっても作製されうる。複合体は、同じＩＶＴＴ反応においてＣｓｇＧタンパク質およびＣｓｇＦタンパク質を発現するか、または二つの異なるＩＶＴＴ反応で、ＣｓｇＧおよびＣｓｇＦを別々に再構成するかのどちらかによって作製することができる。図１４に示す実施例では、循環ＤＮＡ用のＥ． ｃｏｌｉ Ｔ７−Ｓ３０抽出システム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、一つの反応混合物中でＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を作製し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＩＶＴＴのタンパク質発現はタンパク質発現の天然分子機械を使用していないため、ＩＶＴＴにおいてタンパク質を発現するために使用されるＤＮＡは、シグナルペプチド領域をコードするＤＮＡを欠いている。ＣｓｇＦのＤＮＡがＣＳＴＴの不在下でＩＶＴＴ内で発現された場合、ＣｓｇＧのモノマーのみが産生されうる。意外にも、これらの発現されたモノマーは、ＩＶＴＴ反応混合物中に存在する細胞抽出膜を使用することによってＣｓｇＧオリゴマー細孔にｉｎ ｓｉｔｕで組み立てることができる（図１４、レーン１）。ＣｓｇＧのオリゴマーはＳＤＳ安定性があるが、試料が１００°Ｃに加熱された時にその成分モノマーに分解する（図１４、レーン２）。ＣｓｇＦのＤＮＡが、ＣｓｇＧのＤＮＡの不在下でＩＶＴＴ内で発現された時、ＣｓｇＦモノマーのみを見ることができる（図、１４、レーン３）。ＣｓｇＧおよびＣｓｇＦのＤＮＡが１：１の比で混合され、同一のＩＶＴＴ反応混合物内同時に発現された場合、ＣｓｇＦタンパク質は、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を作製する高い効率を有する組み立てられたＣｓｇＧ細孔と相互作用する（図１４、レーン５）。ＩＶＴＴで作製されたこのＳＤＳ安定複合体は、少なくとも７０°Ｃまで熱安定性がある（図１４、レーン６〜１２）。
切断ＣｓｇＦを有するＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体はまた、全長バージョンではなく切断ＣｓｇＦをコードするＤＮＡを使用することによって、上述した方法のいずれかによって作製することもできる。ただし、複合体の安定性は、ＣｓｇＦがＦＣＰドメインより下で切断されると損なわれうる。さらに、切断ＣｓｇＦを有するＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体は、全長ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体が形成された後で、全長ＣｓｇＦを適切な位置で切断することによって作製することができる。切断は、切断が必要な位置にプロテアーゼ切断部位を組み込むことによって、ＣｓｇＦタンパク質をコードするＤＮＡを修飾することによって行うことができる（図１５Ａ）。配列番号５６〜６７は、切断ＣｓｇＦを有するＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を生成するために、ＣｓｇＦの様々な位置に組み込まれたＴＥＶまたはＨＣＶ Ｃ３プロテアーゼ部位を示す。配列番号６１で作製されたＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体のＴＥＶ切断のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す（図１５Ｂ）。ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体（全長ＣｓｇＦを有する）が、分析物の特徴付けのための材料および方法セクションに記載されたＴＥＶプロテアーゼ酵素で処理された場合、ＣｓｇＦは位置３５で切断される（図１５Ｂ、レーン３および４）。ただし、ＴＥＶ切断は、切断部位のＣ末端に過剰な６個のアミノ酸を残す。従って、ＣｓｇＧ細孔を有する複合体内の残りのＣｓｇＦ切断タンパク質は４２アミノ酸の長さである。この複合体とＣｓｇＧ細孔（ＣｓｇＦなし）の分子量差は、なおもＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視である（図１５Ｂ、レーン７および８）。
意外にも、切断ＣｓｇＦを有するＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体はまた、精製されたＣｓｇＧ細孔（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで製造）を、適切な長さの合成ペプチドを用いて再構成することによって作製することができる。再構成はｉｎ ｖｉｔｒｏで起こるため、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を作製するためにＣｓｇＦのシグナルペプチドは必要とされない。さらに、この方法は、ＣｓｇＦのＣ末端に過剰なアミノ酸を残さない。突然変異および修飾はまた、合成ＣｓｇＦペプチドに容易に組み込まれうる。従って、この方法は、異なるＣｓｇＦペプチドまたはその突然変異体、または相同体を用いて、異なるＣｓｇＧ細孔または突然変異体またはその相同体を再構成して、異なるＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体変異体を生成するための非常に便利な方法である。複合体の安定性は、ＣｓｇＦがＦＣＰドメインを超えて切断されると損なわれうる。ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体変異体を生成するために使用される切断ＣｓｇＦおよびＦＣＰペプチドの例を表３に示す。意外にも、この方法によってＣｓｇＦ−（１−４５）（図１６．Ａ）、ＣｓｇＦ−（１−３５）（図１６．Ｂ）およびＣｓｇＦ−（１−３０）（図１６．Ｃ）を用いて作製されたＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の熱安定性のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、少なくともＣｓｇＦ−（１−４５）およびＣｓｇＦ−（１−３５）ペプチドが少なくとも９０°Ｃまで熱安定性のあるＣｓｇＧを有する複合体を作製することを示している。ＣｓｇＧ細孔は９０°Ｃでその成分モノマーまで分解するため、９０°Ｃを超える複合体の安定性を評価することは困難である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中のＣｓｇＧ細孔バンドとＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ−（１〜３０）複合体バンドとの間の差はわずかであるため、この方法は、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ−（１〜３０）複合体の熱安定性を分析するのに十分ではない（図１６Ｃ）。ただし、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体は、３つすべての事例で観察され、電気生理学実験においてはＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ−（１〜２９）でさえも観察され、ＣｓｇＦ−（１〜２９）ペプチドが少なくともいくらかのＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を産生することを示している（図２４）。
［実施例２］
Ｃｒｙｏ−ＥＭによるＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ構造解析
ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体における構造的実態を得るために、共精製されたかｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成されたＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ粒子を透過型電子顕微鏡によって分析した。ｃｒｙｏ−ＥＭ分析の準備において、二倍親和性精製ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体のピーク分画５００μＬを、緩衝液Ｄ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｐｈ８、２００ｍＭ Ｎａｃｌ、および０．０３％ ＤＤＭ）で平衡化した、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に注入し、０．５ ｍＬ／分で実施した。タンパク質濃度は、計算された吸光度２８０ ｎｍに基づき、化学量論１：１を仮定して決定された。電子染色体検査用の試料を、「方法」に記載されるように分析した。ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体のｃｒｙｏ−ＥＭ顕微鏡写真、ならびに選ばれたＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ粒子から選択された二つのクラス平均を図４に示す。顕微鏡写真は、九量体細孔および九量体細孔複合体の二量体の存在を示す。画像再構成については、九量体ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ粒子を選び、ＲＥＬＩＯＮを用いて整列させた。側面図としてのＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体のクラス平均、および３Ｄの再構成電子密度は、ＣｓｇＧ β−バレルの側面に位置するＣｓｇＧ粒子からの突出部として見たＣｓｇＦに対応する追加的な密度の存在を示す（図４Ｂ、５）。追加的な密度は、球状のヘッドドメイン、中空のネックドメインおよびＣｓｇＧ β−バレルと相互作用するドメインを包含する三つの識別可能な領域を明らかにする。ＣｓｇＦ収縮ペプチドまたはＦＣＰと呼称される後者のＣｓｇＦ領域は、ＣｓｇＧβバレルの内腔内に挿入され、ＣｓｇＧ収縮部ループによって形成された収縮部（図４Ｂ、５のラベルＧ）の上約２ ｎｍに位置する、ＣｓｇＧ細孔の追加的な収縮部（図４Ｂ、５のラベルＦ）を形成するものとして見られる。
［実施例３］
ＣｓｇＦの切断によるＣｓｇＦ相互作用および収縮ペプチドの識別
ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ細孔複合体における第二の収縮部の存在は、ＣｓｇＧのみの細孔と比較して、ナノ細孔感知用途の機会を提供し、第二のリーダーヘッドとして、またはＣｓｇＧ収縮ループによって提供される主要リーダーヘッドの延長部として使用可能な、ナノ細孔内の第二のオリフィスを提供する（図６、７）。ところが、複合体が全長ＣｓｇＦを有する時、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ組み合わせ細孔の出口側がＣｓｇＦネックドメインおよびヘッドドメインによってブロックされる。従って、ＣｓｇＧ β−バレルとの相互作用およびそれへの挿入に必要なＣｓｇＦ領域を決定しようとした。当社のストレップ−タクチン親和性精製実験では、Ｈｉｓ−トラップ親和性精製内に存在するＣｓｇＦのＮ末端切断断片が失われ、ＣｓｇＧと共精製されなかったため、ＣｓｇＦのＮ末端領域が、ＣｓｇＧ相互作用にとって必要であるという手がかりが得られた（図２Ｂ）。ＣｓｇＦ相同体は、ＰＦＡＭドメインＰＦ０３７８３の存在により特徴付けられる。グラム陰性細菌に見出されたＣｓｇＧ相同体の多重配列アライメント（ＭＳＡ）を実施する時（図８は選択されたＣｓｇＦ相同体のＭＳＡを示す）、配列保存領域（３５〜１００％の一対配列同一性のＭＳＡを示す）は成熟ＣｓｇＦ（配列番号６）の最初の約３０〜３５アミノ酸に対応することが示された。組み合わされたデータに基づき、ＣｓｇＦのこのＮ末端領域は、ＣｓｇＧ相互作用ペプチドまたはＦＣＰを形成するという仮説が立てられた。既知のＣｓｇＦ相同体におけるＦＣＰの多重配列アライメントを図１０に示す。
ＣｓｇＦ Ｎ末端がＣｓｇＧ結合領域に対応し、ＣｓｇＧ β−バレル内腔内に存在するＣｓｇＦ収縮ペプチドを形成するという仮説をテストするために、ストレップタグ付きＣｓｇＧおよびＨｉｓタグ付ＣｓｇＦ切断体をＥ． ｃｏｌｉ内で共過剰発現させた（「方法」を参照）。ｐＮＡ９７、ｐＮＡ９８、ｐＮＡ９９およびｐＮＡ１００は、ＣｓｇＦ（配列番号５）の残基１〜２７、１〜３８、１−４８および１〜６４に対応するＮ末端ＣｓｇＦ断片をコードする。これらのペプチドは、配列番号５の残基１〜１９に対応するＣｓｇＦシグナルペプチドを含み、従って、成熟ＣｓｇＦ（配列番号６、図９Ａ）の最初の８、１９、２９および４５個の残基に対応するペリプラズムペプチドを生成し、それぞれＣ末端の６ｘ Ｈｉｓタグを含む。細胞可溶化物全体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、全ての試料中のＣｓｇＧ、ならびに成熟ＣｓｇＦ（配列番号６、図９Ｂ）の最初の４５残基に対応するＣｓｇＦ断片の存在が明らかになった。短めのＮ末端ＣｓｇＦ断片については、細胞可溶化物全体でペプチドの検出可能な発現は見られなかった。二回の凍結／解凍サイクル後、さまざまなＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ断片の細胞質量を精製によってさらに濃縮した。細胞可溶化物全体およびストレップ親和性精製の溶出画分を、Ｈｉｓタグ付ＣｓｇＦ断片の検出のために抗Ｈｉｓ抗体を使用して、ドットブロット解析用のニトロセルロース膜上にスポットを付けた（図９Ｃ）。ドットブロット法は、ＣｓｇＦ２０：６４ペプチドがＣｓｇＧと共精製し、ＣｓｇＧ断片がＣｓｇＧと安定した共有結合ではない複合体を形成するのに十分であることを示す。ＣｓｇＧ ２０：４８断片については、少量のペプチドがＣｓｇＧと共精製するのが見られ、一方、ＣｓｇＦ ２０：２７またはＣｓｇＦ ２０：３８では、細胞可溶化物全体またはストレップ親和性精製（図９Ｃ）のいずれについても、検出可能なレベルが見られず、後者のペプチドはＥ． ｃｏｌｉ内では安定して発現されず、および／またはＣｓｇＧと安定した複合体を形成しないことを示唆している。
［実施例４］
原子解像度でのＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ相互作用の説明
ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦの相互作用について原子レベルの詳細を得るために、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の高解像度ｃｒｙｏＥＭ構造を決定した。この目的のために、ＣｓｇＧおよびＣｓｇＦをＥ． ｃｏｌｉ内で共発現させ、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を洗浄剤抽出によりＥ． ｃｏｌｉ外膜から単離し、タンデム親和性精製を使用して精製した。低温電子顕微鏡用の試料を、酸化グラフェンで被覆されたＲ２／１ Ｈｏｌｅｙグリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ）上に３ μｌ試料をスポットすることにより調製し、データを、Ｇａｔａｎ Ｋ２直接電子検出器を計数モードで使用して３００Ｋｖ ＴＩＴＡＮ Ｋｒｉｏｓで収集した。６２．０００個の単一ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ粒子が使用され、最終電子密度マップを３．４Å解像度で計算した（図１１Ａ）。マップによって、ＣｓｇＧ結晶構造の明瞭な結合および局所的な再構成と、成熟ＣｓｇＦのＮ末端３５残基のｄｅ ｎｏｖｏ構築（すなわち配列番号５の残基２０：５４）が得られ、これは、ＣｓｇＧを結合し、ＣｓｇＧ膜貫通β−バレルの高さで第二の収縮部を形成するＦＣＰを包含する（図１１Ｃ、Ｄ）。ｃｒｙｏＥＭ構造は、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦがＣ９対称性を有する９：９化学量論を含むことを示す（図１１Ｂ）。ＦＣＰはＣｓｇＧ β−バレルの内部で、ＣｓｇＦのＣ末端がＣｓｇＧ β−バレルの外を指し、ＣｓｇＦのＮ末端がＣｓｇＧ収縮部の近くに位置する状態で結合する。構造は、成熟ＣｓｇＦのＰ３５が、ＣｓｇＧ β−バレルの外にあり、ＣｓｇＦ ＦＣＰとネック領域との間の接続を形成することを示す。ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の本体に対する柔軟性により、ＣｓｇＦネック領域およびヘッド領域は高解像度のｃｒｙｏＥＭマップで分解されない。ＣｓｇＧ β−バレル内の三つの領域は、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ相互作用を安定化させる：すなわち、成熟ＣｓｇＧ（配列番号３）の（ＩＲ１）残基Ｙ１３０、Ｄ１５５、Ｓ１８３、Ｎ２０９およびＴ２０７は、四つのＨ結合および静電気的相互作用を含む、成熟ＣｓｇＦ（配列番号６）のＮ末端アミンおよび残基１〜４との相互作用ネットワークを形成し、成熟ＣｓｇＧ（配列番号３）の（ＩＲ２）残基Ｑ１８７、Ｄ１４９およびＥ２０３は、三つのＨ結合および二つの静電気的相互作用を含む、成熟ＣｓｇＦ（配列番号６）のＲ８およびＮ９との相互作用ネットワークを形成し、成熟ＣｓｇＧ（配列番号３）の（ＩＲ３）残基Ｆ１４４、Ｆ１９１、Ｆ１９３およびＬ１９９は、成熟ＣｓｇＦ（配列番号６）の残基Ｆ２１、Ｌ２２およびＡ２６との疎水性相互作用表面を形成する。後者は、成熟ＣｓｇＦの残基１９〜３０によって形成されるα−らせん（ｈｅｌｉｘ １）内に位置する。保存された配列Ｎ−Ｐ−Ｘ−Ｆ−Ｇ−Ｇ（配列番号６の残基９〜１４）は、ＣｓｇＦ ｈｅｌｉｘ １で残基１５〜１９によって形成されるループ領域をＣｓｇＦ ｈｅｌｉｘ １と接続する内向きの方向転換を形成する。まとめて、これらの要素はＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体内に収縮部を生じさせ、そのうち残基１７（成熟Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦ内のＮ１７、配列番号６）は、最も狭いポイントを形成し、それにより直径１５Åのオリフィスが得られる（図１１Ｃ）。第二の収縮部（Ｆ締付またはＦＣ）は、ＣｓｇＧ残基４６〜５９（Ｇ収縮またはＧＣ）によって形成される収縮部のそれぞれ上部および下部の上およそ１５Å〜３０Åの位置にある。
［実施例５］
ＣｃＧｇ−ＣｓｇＦ複合体の安定性を改善するためのシミュレーション
ＣｓｇＧおよびＣｓｇＧのどの残基が近接するかを確立するために分子動力学シミュレーションを実施した。この情報を使用して、複合体の安定性を高めることができるＣｓｇＧおよびＣｓｇＦ突然変異体を設計した。
ＧＲＯＭＡＳパッケージバージョン４．６．５を用いて、ＧＲＯＭＯＳ ５３ａ６強制フィールドおよびＳＰＣ水モデルと共に用いてシミュレーションを実施した。ＣｓｇＧ−ＣｓｇＦ複合体のｃｒｙｏ−ＥＭ構造をシミュレーションで使用した。複合体を溶媒和してから、最急降下アルゴリズムを使用してエネルギーを最小化した。シミュレーション全体を通して、複合体のバックボーンに抑制が適用されたが、残基側鎖は自由に移動した。このシステムは、ＢｅｒｅｎｄｓｅｎサーモスタットおよびＢｅｒｅｎｄｓｅｎバロスタット３００ Ｋを使用して、２０ｎｓのＮＰＴアンサンブルでシミュレートされた。
ＣｓｇＧとＣｓｇＦとの間の接触は、ＧＲＯＭＡＣＳ分析ソフトウェアおよび現場で記述されたコードの両方を使用して分析された。二つの残基は、３オングストローム内に入った場合に接触したものと定義された。結果を以下の表４に示す。
ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の構造決定のための材料および方法：
クローン化
外膜局在細孔としてのＥ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＧの発現のために、Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＧのコード配列（配列番号１）をｐＡＳＫ−Ｉｂａ１２にクローン化し、プラスミドｐＰＧ１を得た（Ｇｏｙａｌ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。
Ｅ． ｃｏｌｉ細胞質内のＣ末端での６ｘ−Ｈｉｓタグ付きＣｓｇＦの発現のために、成熟Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦ（配列番号６、すなわちシグナル配列のないＣｓｇＦ）のコード配列を、プライマー「ＣｓｇＦ−Ｈｉｓ＿ｐＥＴ２２ｂ＿ＦＷ」（配列番号４６）および「ＣｓｇＦ−Ｈｉｓ＿ｐＥＴ２２ｂ＿Ｒｅｖ」（配列番号４７）を使用して生成されたＰＣＲ製品を用いて、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位を介してｐＥＴ２２ｂにクローン化し、ＣｓｇＦ−Ｈｉｓ発現プラスミドｐＮＡ１０１を得た。
ｃｓｇＦ−ＨｉｓおよびＣｓｇＧ−ｓｔｒｅｐを発現するｐＴｒｃ９９ａベースのベクターであるｐＮＡ６２プラスミドは、ｐＧＶ５４０３（ｐＤＥＳＴ１４ Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）カセットが統合されたｐＴｒｃ９９ａ）に基づき作成された。ＰｇＶ５４０３アンピシリン抵抗性カセットは、ストレプトマイシン／スペクチノマイシン抵抗性カセットで置き換えられた。ｃｓｇＥ、ｃｓｇＦおよびＣｓｇＧのコード配列に対応するＥ． ｃｏｌｉ ＭＣ４１００ ｃｓｇＤＥＦＧオペロンの部分を包含するＰＣＲ断片が、プライマーｃｓｇＥＦＧ＿ｐＤＯＮＲ２２１＿ＦＷ（配列番号４８）およびｃｓｇＥＦＧ＿ｐＤＯＮＲ２２１＿Ｒｅｖ（配列番号４９）を用いて生成され、ｐＤＯＮＲ２２１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にＢＰ Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）組み換えを介して挿入された。次に、ｐＤＯＮＲ２２１ドナープラスミドに由来するこの組み換え型ｃｓｇＥＦＧオペロンが、ＬＲ Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）組み換えを介して、ストレプトマイシン／スペクチノマイシン抵抗性カセットを用いてｐＧＶ５４０３に挿入された。ＰＣＲを介して、プライマーＭｕｔ＿ｃｓｇＦ＿Ｈｉｓ＿ＦＷ（配列番号５０）およびＭｕｔ＿ｃｓｇＦ＿Ｈｉｓ＿Ｒｅｖ（配列番号５１）を使用して、６×ＨｉｓタグがＣｓｇＦ Ｃ末端に追加された。最後に、ｃｓｇＥが、外向きＰＣＲ（プライマーＤｅｌＣｓｇＥ＿ＦＷ（配列番号５２）およびＤｅｌＣｓｇＥ＿Ｒｅｖ（配列番号５３））によって除去され、ｐＮＡ６２を取得した。
推定上の収縮ペプチド（図９Ａ）に対応するＣ末端Ｈｉｓタグ付ＣｓｇＧ断片のペリプラズム発現のための構成体は、ＣｓｇＦ−ｈｉｓおよびＣｓｇＧ−ｓｔｒｅｐを発現するｐＴｒｃ９９ａベースのベクターであるｐＮＡ６２に対する外向きＰＣＲによって作成された。プライマーの組み合わせは、以下のとおりである：順方向プライマーとしてｐＮａ６２＿ＣｓｇＦ＿ｈｉｓｔａｇ＿Ｆｗ（配列番号４５）で、ＣｓｇＦ＿ｄ２７＿ｅｎｄ（配列番号４１）、ＣｓｇＦ＿ｄ３８＿ｅｎｄ（配列番号４２）、ＣｓｇＦ＿ｄ４８＿ｅｎｄ（配列番号４３）またはＣｓｇＦ＿ｄ６４＿ｅｎｄ（配列番号４４）を逆方向プライマーとして伴い、それぞれｐＮＡ９７、ｐＮＡ９８、ｐＮＡ９９およびｐＮＡ１００を作成した。
ｐＮＡ９７では、ｃｓｇＦが配列番号７に切断されて、残基１〜２７（配列番号８）を含むＣｓｇＦ断片をコードし、ｐＮＡ９８では、ｃｓｇＦが配列番号９に切断されて、残基１〜３８（配列番号１０）を含むＣｓｇＦ断片をコードし、ｐＮＡ９９では、ｃｓｇＦが配列番号１１に切断されて、残基１〜４８（配列番号１２）を含むＣｓｇＦ断片をコードし、ｐＮＡ１００では、ｃｓｇＦが配列番号１３に切断されて、残基１〜６４（配列番号１４）を含むＣｓｇＦ断片をコードする。Ｅ． ｃｏｌｉにおけるｐＮＡ９７、ｐＮＡ９８、ｐＮＡ９９およびｐＮＡ１００の発現は、外膜におけるＣｓｇＧ細孔（配列番号３）の産生と、以下の配列を有するＣｓｇＦ由来ペプチドのペリプラズム標的化をもたらさない：
それぞれ、「ＧＴＭＴＦＱＦＲＨＨＨＨＨＨ」（配列番号３７＋ ６ｘＨｉｓ）、「ＧＴＭＴＦＱＦＲＮＰＮＦＧＧＮＰＮＮＧＨＨＨＨＨＨ「（配列番号３８ ＋ ６ｘＨｉｓ）、「ＧＴＭＴＦＱＦＲＮＰＮＦＧＧＮＰＮＮＧＡＦＬＬＮＳＡＱＡＱＨＨＨＨＨＨ」（配列番号３９＋ ６ｘＨｉｓ）、および「ＧＴＭＴＦＱＦＲＮＰＮＦＧＧＮＰＮＮＧＡＦＬＬＮＳＡＱＡＱＮＳＹＫＤＰＳＹＮＤＤＦＧＩＥＴＨＨＨＨＨＨ」（配列番号４０＋ ６ｘＨｉｓ）。
株
Ｅ． ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０（Ｆ− ｍｃｒＡ Δ（ ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ） Φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ Δ ｌａｃＸ７４ ｒｅｃＡ１ ａｒａＤ１３９ Δ（ａｒａｌｅｕ） ７６９７ ｇａｌＵ ｇａｌＫ ｒｐｓＬ （ＳｔｒＲ） ｅｎｄＡ１ ｎｕｐＧ）が、すべてのクローン化工程に使用された。Ｅ． ｃｏｌｉ Ｃ４３（ＤＥ３）（Ｆ− ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ− ｍＢ−）ｇａｌ ｄｃｍ（ＤＥ３））およびＴｏｐ１０がタンパク質産生に使用された。
共発現による組み換え型ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の産生
Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦ（配列番号５）およびＣｓｇＧ（配列番号２）の共発現について、それらのネイティブＳｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含む両方の組み換え型遺伝子が、ｐＴｒｃ９９ａ由来プラスミド内で誘導性のｔｒｃプロモーターの制御下に置かれ、プラスミドｐＮＡ６２を形成した。ＣｓｇＧおよびＣｓｇＦをプラスミドｐＮＡ６２で形質転換し、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地中３７°Ｃで培養した、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｃ４３（ＤＥ３）細胞内で過剰発現させた。細胞培養物が６００ ｎｍで０．７の光学密度（ＯＤ）に達した時、組み換え型タンパク質発現を０．５ ｍＭ ＩＰＴＧで誘発し、２８℃で１５時間放置して培養した後、５５００ ｇでの遠心分離により収穫された。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成による組み換え型ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の産生
Ｃ末端ストレップＩＩ−タグで修飾された全長Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＧ（配列番号２）は、プラスミドＰｐＧ１（Ｇｏｙａｌ ｅｔ ａｌ． ２０１３）で形質転換されたＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞内で過剰発現させた。細胞を３７℃で、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地中でＯＤ ６００ ｎｍが０．６になるまで培養した。組み換え型タンパク質の産生を０．０００２％アンヒドロテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ社）で誘発し、細胞を２５℃でさらに１６時間培養した後、５５００ ｇで遠心分離により収穫した。
６ｘ ＨｉｓタグによるＣ末端融合内のＥ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦ（配列番号６、すなわち、ＣｓｇＦシグナル配列を欠く）を、プラスミドｐＮＡ１０１で形質転換したＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の細胞質内で過剰発現させた。細胞を３７°Ｃで６００ ｎｍのＯＤまで培養し、続いて１ｍＭ ＩＰＴＧにより誘発し、３７℃で１５時間放置してタンパク質を発現した後、５５００ ｇで遠心分離して収穫した。
ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体、ＣｓｇＧ、およびＣｓｇＦの組み換え型タンパク質精製
ｐＮＡ６２で形質転換され、ＣｓｇＧ−ＳｔｒｅｐおよびＣｓｇＦ−Ｈｉｓを共発現するＥ． ｃｏｌｉ細胞を、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０、２００ ｍＭ ＮａＣｌ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．４ ｍＭ ＡＥＢＳＦ、１ μｇ／ｍＬロイペプチン、０．５ ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉおよび０．１ ｍｇ／ｍＬリゾチーム内で再懸濁した。細胞を、ＴＳシリーズの細胞粉砕器（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ）を使用して２０ ｋＰｓｉで粉砕し、溶解した細胞懸濁液を１％ ｎ−ドデシル−β−ｄ−マルトピラノシド（ＤＤＭ、Ｉｎａｌｃｏ）を用いて３０分間培養し、外膜構成要素のさらなる細胞溶解および抽出をした。次に、残りの細胞破片および膜を、超遠心分離により１００．０００ｇで４０分間遠心分離した。上清を、緩衝液Ａ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２００ｍＭ Ｎａｃｌ、１０ｍＭイミダゾール、１０％スクロース、および０．０６％ ＤＤＭ）中で平衡化した５ ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐカラム上に装填した。カラムを＞１０ＣＶ ５％緩衝液Ｂ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２００ｍＭ Ｎａｃｌ、５００ｍＭイミダゾール、１０％スクロース、０．０６％ ＤＤＭ）イオン緩衝液Ａで洗浄し、６０ ｍＬに対して５〜１００％の緩衝液Ｂの勾配で溶出した。
溶出液を２倍に希釈し、緩衝液Ｃ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２００ｍＭ Ｎａｃｌ、１０％スクロース、および０．０６％ ＤＤＭ）を用いて平衡化した５ｍＬストレップ−タクチンカラム（ＩＢＡ Ｇｍｂｈ）上に一晩装填した。カラムを、＞１０ ＣＶ緩衝液Ｃで洗浄し、タンパク質を２．５ ｍＭデスチオビオチンの添加により溶出した。次に、二倍親和性精製複合体のピーク分画５００ μＬを、緩衝液Ｄ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２００ ｍＭ Ｎａｃｌ、および０．０３％ ＤＤＭ）で平衡化されたＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に注入し、電子顕微鏡用の試料を調製するために０．５ ｍＬ／分で実施した。タンパク質濃度は、２８０ ｎｍでの吸光度計算値に基づき、１／１化学量論と仮定して決定された。緩衝液Ｄ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２００ ｍＭ Ｎａｃｌ、０．０３％ ＤＤＭ）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成用のＣｓｇＧ−ｓｔｒｅｐ精製は、緩衝液中でスクロースを除外し、ＩＭＡＣおよびサイズ除外工程を迂回する時、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ用のプロトコルと同一である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成のためのＣｓｇＦ−Ｈｉｓ精製は、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ ｐＨ ８．０、２００ ｍＭ Ｎａｃｌ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．４ ｍＭ ＡＥＢＳＦ、１ μｇ／ｍＬロイペプチン、０．５ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉ、０．１ ｍｇ／ｍＬリゾチーム中に細胞質量を再懸濁することにより実施された。細胞を、ＴＳシリーズの細胞粉砕器（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ）を使用して２０ ｋＰｓｉで粉砕し、１０．０００ｇで３０分間遠心分離して、無傷の細胞および細胞破片を除去した。上清を、緩衝液Ａ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）で平衡化した５Ｍｌ Ｎｉ−ＩＭＡＣ−ビーズ（Ｗｏｒｋｂｉｓ ４０ ＩＤＡ、Ｂｉｏ−Ｗｏｒｋｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡＢ）に加え、放置して４℃で１時間培養した。Ｎｉ−ＮＴＡビーズを、重力流カラム内にプールし、１００ ｍＬの５％緩衝液Ｂ（２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２００ ｍＭ Ｎａｃｌ、緩衝液Ａ中で希釈された５００ ｍＭイミダゾール）で洗浄した。結合されたタンパク質は、緩衝液Ｂの段階的増加によって溶出された（各５ｍＬで１０％のステップ）。
ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体のＩｎ ｖｉｔｒｏ再構成
精製されたＣｓｇＧおよびＣｓｇＧはプールされ、複合体をｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成するのに使用された。従って、モル比１ ＣｓｇＧ：２ ＣｓｇＦを混合して、ＣｓｇＧバレルをＣｓｇＦで飽和させた。次に、再構成混合物を、緩衝液Ｄ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２００ｍＭ Ｎａｃｌ、および０．０３％ ＤＤＭ）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に注入し、電子顕微鏡用の試料を準備するために０．５ ｍＬ／分で実施した（図３）。タンパク質濃度は、２８０ ｎｍでの吸光度計算値に基づき、１／１化学量論と仮定して決定された。
電子顕微鏡を使用した構造解析
サイズ排除率の試料挙動は、ネガティブ染色電子顕微鏡を使用してプローブされる。試料は、１％のギ酸ウラニルで染色され、ＬａＢ６フィラメントを装備した社内の１２０ ｋＶ ＪＥＭ １４００（ＪＥＯＬ）顕微鏡を用いて撮像される。電子染色体検査用の試料は、２ μＬの試料をＲ２／１連続炭素（２ｎｍ）被覆グリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ）にスポットし、手動でブロットし、社内のプランジ装置を使用して液体エタン内にプランジすることによって調製した。試料の品質を、社内のＪＥＯＬ ＪＥＭ １４００でスクリーニングしてから、Ｆａｌｃｏｎ−３直接電子検出カメラを装備した２００ ｋＶ ＴＡＬＯＳ ＡＲＣＴＩＣＡ（ＦＥＩ）顕微鏡でデータセットを収集した。画像はＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２．１を用いて動作補正され（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１７）、デフォーカス値がｃｔｆｆｉｎｄ４を使用して決定され（Ｒｏｈｏｕ ａｎｄ Ｇｒｉｇｏｒｉｅｆｆ， ２０１５）、データは、ＲＥＬＩＯＮ（Ｓｃｈｅｒｅｓ、２０１２）およびＥＭＡＮ２（Ｌｕｄｔｋｅ、２０１６）の組み合わせを使用してさらに分析された。Ｃ９対称性は、ヘッド基についての追加的な密度を特徴とする選択された２Ｄクラス平均に対する３Ｄモデル生成および精密化の間に課された。
高解像度ｃｒｙｏＥＭ解析については、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ試料は、酸化グラフェン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で被覆されたＲ２／１ Ｈｏｌｅｙグリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ）上に３ μｌの試料をスポットし、手動でブロットし、ＣＰ３プランジャー（Ｇａｔａｎ）を使用して液体エタン内にプランジすることによって低温電子顕微鏡用に調製した。試料品質が社内のＪＥＯＬ ＪＥＭ １４００でスクリーニングされた後、Ｋ２ Ｓｕｍｍｉｔ電子検出器（Ｇａｔａｎ）を装備した３００ｋＶ ＴＩＴＡＮ ＫＲＩＯＳ（ＦＥＩ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）顕微鏡でデータセットを回収した。検出器は、５０フレーム以上にわたり、電子数５６個／Å２の累積電子用量を持つ計数モードで使用された。２０４５画像が、ピクセルサイズ１．０７Åで収集された。画像はＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２．１で動作補正され（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１７）、デフォーカス値はｃｔｆｆｉｎｄ４を使用して決定された（Ｒｏｈｏｕ ａｎｄ Ｇｒｉｇｏｒｉｅｆｆ， ２０１５）。粒子はＧａｕｔｏｍａｔｃｈ（Ｄｒ． Ｋａｉ Ｚｈａｎｇ）を使用して自動的に捕捉され、データはＲＥＬＩＯＮ２．０（Ｋｉｍａｎｉｕｓ ｅｔ ａｌ． ２０１６， Ｅｌｉｆｅ ５． ｐｉｉ： ｅ１８７２２）およびＥＭＡＮ２（Ｌｕｄｔｋｅ， ２０１６）を使用してさらに分析された。Ｃ９対称性は、ヘッド基についての追加的な密度を特徴とする選択された２Ｄクラス平均に対する３Ｄモデル生成および精密化の間に課された。６２．０００粒子が使用され、３．４Å解像度での最終マップが計算された。ＣｓｇＦのＤｅ ｎｏｖｏモデル構築は、ＣＯＯＴ（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ． ２０１５ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ７１（Ｐｔ １）：１３６−５３）を用いて実施され、また複合体全体のモデル構築および精密化の反復サイクルは、ＰＨＥＮＩＸ（Ａｆｏｎｉｎｅ ２０１８， Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ７４（Ｐｔ ６）：５３１−５４４）実空間精密化をＣＯＯＴと組み合わせて使用して実施した。
ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ断片のタンパク質発現および精製
ＣｓｇＦ断片およびＣｓｇＧを共発現し、ＣｓｇＦ断片はＣ末端でＨｉｓ−タグ付けされ、ＣｓｇＧはＣ末端でストレップタグに融合された。ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ断片複合体は、プラスミドｐＮＡ９７、ｐＮＡ９８、ｐＮＡ９９またはｐＮＡ１００で形質転換されたＥ． ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０細胞内で過剰発現された。プレートを３７℃ ＯＮで培養し、ストレプトマイシン／スペクトマイシンを追加したＬＢ培地中でコロニーを再懸濁した。細胞培養物が６００ ｎｍで０．７の光学密度（ＯＤ）に達した時、組み換え型タンパク質発現を０．５ ｍＭ ＩＰＴＧで誘発し、２８℃で１５時間放置して培養した後、５５００ ｇでの遠心分離により収穫した。ペレットを−２０°Ｃで凍結した。
さまざまなＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ断片の細胞質量を、２００Ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０、２００ ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．４ ｍＭ ＡＥＢＳＦ、１ μｇ／ｍＬロイペプチン、０．５ ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉおよび ０．１ ｍｇ／ｍＬリゾチーム中で再懸濁し、超音波処理し、さらなる細胞溶解および外膜成分の抽出のために１％ ｎ−ドデシル−β−ｄ−マルトピラノシド（ＤＤＭ、Ｉｎａｌｃｏ）で培養した。次に、残りの細胞破片および膜を、遠心分離により１５．０００ ｇで４０分間遠心分離した。上清を、１００ μＬのストレップ−タクチンビーズを用いて室温で３０分間培養した。ストレップビーズを緩衝液（２５ ｍＭトリス ｐＨ８、２００ ｍＭ Ｎａｃｌ、および１％ ＤＤＭ）を用いて遠心分離により洗浄し、２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２００ ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ ＤＤＭに２．５ ｍＭデスチオビオチンを追加して結合したタンパク質を溶出した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成によるＣｓｇＧ：ＦＣＰの産生
成熟ＣｓｇＦ（配列番号６）のＮ末端３４残基に対応する合成ペプチドを、緩衝液０．１Ｍ ＭＥＳ、０．５Ｍ Ｎａｃｌ、０．４ｍｇ／ＭｌのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、０．６ ｍｇ／ｍｌのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシアミノプロピル）カルボジイミド）中で１ ｍｇ／ｍｌに希釈し、室温で１５分間培養し、ペプチドカルボキシ末端を活性化させた。次に、２時間の培養中に１ ｍｇ／ｍｌのカドベリンＡｌｅｘａ５９４のＰＢＳ溶液を添加して、室温で共有結合を許容した。Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎフィルターを使用して緩衝液を５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ＮａＣｌ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＤＤＭに換えることにより反応をクエンチした。
標識化されたペプチドを、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ ｍＭ ＮａＣｌ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、５ ｍＭ ＬＤＡＯ／Ｃ８Ｄ４中でストレップ親和性精製ＣｓｇＧに室温で１５分間にわたり２：１のモル比で加え、ＣｓｇＧ：ＦＣＰ複合体を再構成させた。ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎビーズに対してＣｓｇＧ−ｓｔｒｅｐをプルダウンした後、試料をネイティブＰＡＧＥで分析した。
［実施例６］
共有結合架橋によるＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体のさらなる安定化
全長ＣｓｇＦおよびいくつかの切断バージョンのＣｓｇＦは、ＣｓｇＧ細孔と安定したＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を形成するが、特定の条件下では、ＣｓｇＦはなおもＣｓｇＧ細孔のバレル領域から外れることがある。従って、ＣｓｇＧサブユニットとＣｓｇＦサブユニットとの間で共有結合を形成することが望ましい。分子シミュレーション研究に基づき、相互に近接しているＣｓｇＧおよびＣｓｇＦの位置が識別された（実施例５および表４）。これらの特定された位置の一部は、ＣｓｇＧおよびＣｓｇＦの両方にシステインを組み込むように修正されてきた。図１９は、ＣｓｇＧのＱ１５３位置とＣｓｇＦのＧ１位置との間のチオール−チオール結合形成の実施例を示す。Ｑ１５３Ｃ突然変異を含むＣｓｇＧ細孔を、Ｇ１Ｃ突然変異を含むＣｓｇＦで再構成し、１時間培養してＳ−Ｓ結合形成をできるようにした。ＤＴＴが不在の時に複合体を１００℃に加熱すると、ＣｓｇＧモノマーとＣｓｇＦモノマーの間の二量体（ＣｓｇＧｍ−ＣｓｇＦｍ）に対応する４５ ｋＤａバンドを見ることができ、これは二つのモノマー（ＣｓｇＧｍは３０ ｋＤａ、ＣｓｇＦｍは１５ ｋＤａ）間のＳ−Ｓ結合形成を示す（図１９Ａ）。このバンドは、ＤＴＴの存在下で加熱されるときに消失する。ＤＴＴはＳ−Ｓ結合を分解する。ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体が１時間ではなく一晩培養された時、ＣｓｇＧｍ−ＣｓｇＦｍ二量体形成の範囲が増大する（図１９Ａ）。二量体バンドをさらに識別するために、質量分析方法が実施された。ゲル精製タンパク質をタンパク質分解的に切断してトリプシンペプチドを生成した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ配列決定法を実施すると、ＣｓｇＧのＱ１５３位置とＣｓｇＦのＧ１位置との間のＳ−Ｓ結合が特定された（図１９Ｂ）。Ｓ−Ｓ結合形成を強化するために、銅−オルソフェナントロリンなどの酸化剤を使用することができる。Ｎ１３３Ｃ修飾を含むＣｓｇＧ細孔が、方法セクションに記載される銅−オルソフェナントロリンの存在下で、Ｔ４Ｃ修飾を含むＣｓｇＦで再構成され、次に、ＤＴＴの不在下で１００°Ｃに加熱されることによりその成分モノマーに分解される時、ＣｓｇＧｍ−ＣｓｇＦｍに対応する強力な二量体バンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で観察されうる（図２０、レーン３およびレーン４）。加熱がＤＴＴの存在下で実施された時、二量体はその成分モノマーに分解する（図２０、レーン１およびレーン２）。
［実施例７］
ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の電気生理学的特徴付け
ＤＮＡ鎖がＣｓｇＧを通して転座するときに観察された信号は、細孔が共重合体膜内に挿入され、また実験がＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭｉｎｉＯＮを使用して実行される時に十分に特徴付けられる（図３１）。ＣｓｇＧの各サブユニットのＹ５１、Ｎ５５およびＦ５６は、ＣｓｇＧ細孔の収縮部を形成する（図１２）。この急な収縮部は、ＣｓｇＧ細孔のリーダーヘッドとしての役割を果たし（図３１Ａ）、細孔を通過するときにＡ、Ｃ、ＧおよびＴの混合配列を正確に差別することができる。これは、測定された信号が、配列の同一性を導き出すことができる特徴的な電流の偏向を含むためである。しかしながら、ＤＮＡのホモポリマー領域では、測定された信号は、単一塩基の識別を可能にするのに十分な大きさの電流偏向を示さない場合があり、その結果、ホモポリマーの長さの正確な決定を測定された信号の大きさのみから行うことができない（図２６Ｂおよび図２６Ｃ）。ＣｓｇＧリーダーヘッドの精度の低下は、ホモポリマー領域の長さと相関する（図２９Ｃ）。ＣｓｇＦがＣｓｇＧ細孔と相互作用してＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を形成する場合、ＣｓｇＦはＣｓｇＧバレル内に第二のリーダーヘッドを導入する。この第二のリーダーヘッドは、主に配列番号６のＮ１７位置から成る。「方法」セクションおよび図２７に記載された静的鎖実験は、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体の二つのリーダーヘッドを実験的にマップするために実施され、結果は、およそ５〜６塩基で相互に分離された二つのリーダーヘッドの存在を示す（図２７、Ｂ、ＣおよびＤ）。ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体のリーダーヘッド差別プロットは、ＣｓｇＦによって導入された第二のリーダーヘッドのベース差別への寄与は、ＣｓｇＧリーダーヘッドの塩基識別への寄与よりも小さいことを示す（図２７Ａ）。意外にも、第二のリーダーヘッドがＣｓｇＧバレル内でＣｓｇＦによって導入される時、それまで平坦であったホモポリマー領域は、階段状の信号を示す（図３０ＢおよびＣ）。これらの階段には、正確に配列を識別するために使用できる情報が含まれており、エラーが減少する。ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体のＤＮＡ信号の精度は、ＣｓｇＧ細孔それ自体による精度プロファイルと比較して、長めのホモポリマー長さ全体にわたり比較的一定のままである（図２９Ｃ）。
「方法」セクションで説明したいずれかの方法で作製されたＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体は、ＤＮＡ配列決定実験で複合体を特徴付けるために使用することができる。異なるＣｓｇＧ突然変異体細孔と、異なる長さを有する異なるＣｓｇＦペプチドとから成る異なる方法で作製された様々なＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を通過するラムダＤＮＡ鎖の信号を、図２１〜２４に示す。それらの細孔複合体およびそれらの塩基寄与プロファイルのリーダーヘッド差別を図２８（Ａ〜Ｈ）に示す。意外にも、ＣｓｇＧ細孔およびＣｓｇＦペプチドの両方の収縮部での異なる修飾は、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ細孔複合体の信号を著しく変化させうる。例えば、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体が同じＣｓｇＧ細孔で作製されても、位置１７（配列番号６）にＡｓｎまたはＳｅｒのいずれかを含む同じ長さの二つの異なるＣｓｇＦペプチドが使われる時（全長ＣｓｇＦタンパク質の同じ共発現方法の後、位置３５および３６でのＣｓｇＦのＴＥＶプロテアーゼ切断によって作製される）は、生成される信号が互いに異なる（図２１）。ＣｓｇＦペプチドの位置１７にＳｅｇを有するＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体は、ＣｓｇＦペプチドの位置１７にＡｓｎを有するＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体と比較して、より低い雑音および高い信号対雑音比が示されている。同様に、同じＣｓｇＧ細孔が同じ長さの二つの異なるペプチド（配列番号６の１〜３５）で再構成され、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を作製するために位置１７のＶａｌまたはＳｅｒが使用された場合、ＣｓｇＦの位置１７のＶａｌはＣｓｇＦの位置１７にＳｅｒを持つ複合体よりも雑音の多い信号を示す（図２２）。同じ長さの同じＣｓｇＦペプチドが、ＣｓｇＧリーダーヘッド（位置５１、５５および５６）に異なる突然変異を含む異なるＣｓｇＧ細孔で再構成された場合、結果として得られるＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体は、異なる信号対雑音比（図２５）を持つ異なる信号（図２３、Ａ〜Ｆ）を示した。意外にも、同じ収縮領域を含む異なる長さのＣｓｇＦペプチドが同じＣｓｇＧ細孔で再構成されてＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体を形成する時は、異なる範囲の信号が得られた（図２４）。最も短いＣｓｇＦペプチド（配列番号６の１〜２９）を含むＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体は、最も大きな範囲を示し、最も長いＣｓｇＦペプチド（配列番号６の１〜４５）を含むＣｓｇＧ：ＣｓｇＦ複合体は、最小範囲を示した（図２４）。
分析物の特徴付けのための材料および方法：
以下に記載される方法によって生成されたタンパク質は、構造決定に関して上述した方法によって生成されたものと互換的に使用することができる。
方法
共発現によるＣｓｇＧ：ＣｓｇＦまたはＣｓｇＧ：ＦＣＰ複合体の発現
ＣｓｇＧタンパク質およびその突然変異体をコードする遺伝子は、アンピシリン抵抗性遺伝子を含むＰｔ７ベクターで構築される。ＣｓｇＦタンパク質またはＦＣＰタンパク質をコードする遺伝子、およびその突然変異体は、カナマイシン抵抗性遺伝子を含有するｐＲｈａｍベクターで構成される。両方の１ｕＬのプラスミドは、氷上で１０分間、５０ｕＬのＬｅｍｏ（ＤＥ３）ΔＣｓｇＥＦＧと混合される。次に、試料を４２℃で４５秒間加熱した後、さらに５分間氷に戻す。１５０ｕＬのＮＥＢ ＳＯＣ増殖培地を加え、試料を３７℃で２５０ｒｐｍで１時間振盪しながら培養する。全容積を、カナマイシン（４０ｕｇ／ｍＬ）、アンピシリン（１００ｕｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（３４ｕｇ／ｍＬ）を含む寒天プレート上に広げて、３７℃で一晩培養する。プレートから単一コロニーを採取し、カナマイシン（４０ｕｇ／ｍＬ）、アンピシリン（１００ｕｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（３４ｕｇ／ｍＬ）を含む１００ＭｌのＬＢ培地に培養し、３７℃で２５０ｒｐｍで振盪しながら一晩培養した。２５ｍＬの開始培養を、３ｍＭ ＡＴＰ、１５ｍＭ ＭｇＳＯ４、カナマイシン（４０ｕｇ／ｍＬ）、アンピシリン（１００ｕｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（３４ｕｇ／ｍＬ）を含む５００ＭｌのＬＢ培地に加え、３７℃で一晩培養した。この培養物を７時間増殖させ、その時点でＯＤ６００は３．０より大きかった。ラクトース（最終濃度１．０％）、グルコース（最終濃度０．２％）およびラムノース（最終濃度２ｍＭ）を加え、温度を１８℃に下げ、一方で振盪は２５０ｒｐｍで１６時間維持される。培養物を４℃で２０分間、６０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨て、ペレットを保持した。精製まで、細胞を−８０℃で保存した。
Ｃ末端ストレップタグおよびＣ末端ストレップまたはＨｉｓタグなしのＣｓｇＧ細孔、またはＣ末端ストレップまたはＨｉｓタグなしでのＣｓｇＦの発現
すべてのＣｓｇＧタンパク質およびＣｓｇＧタンパク質またはＣｓｇＧタンパク質またはＦＣＰタンパク質をコードする遺伝子はすべて、アンピシリン抵抗性遺伝子を含むｐＴ７ベクターで構築される。カナマイシンが全ての媒介および緩衝液で省略されている場合を除き、発現手順は上記と同じである。
細胞溶解（共発現複合体または個別ＣｓｇＧ／ＣｓｇＦ／ＦＣＰタンパク質）
溶解緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ Ｎａｃｌ、０．１％ ＤＤＭ、１ｘブガスタータンパク質抽出試薬（Ｍｅｒｃｋ）、２．５ｕＬベンゾナーゼヌクレアーゼ（ストック≧２５０単位／μＬ）／１００ｍＬの溶解緩衝剤、および１錠のシグマプロテアーゼインヒビターカクテル／１００ｍＬ溶解緩衝液で作製される。５Ｘ容量の溶解緩衝液を使用して、１Ｘ重量の収穫細胞を溶解する。細胞は再懸濁され、均質な溶解物が生成されるまで、室温で４時間にわたって放置される。溶解物を４℃で３５分間２０，０００ｒｐｍで回転させる。上清を注意深く抽出し、０．２ ｕＭ Ａｃｒｏｄｉｓｃシリンジフィルターを通して濾過する。
ＣｓｇＧがＣ末端ストレップタグを含む場合、およびＣｓｇＦまたはＦＣＰがＣ末端Ｈｉｓタグを含む場合の、ＣｓｇＧまたはＣｓｇＦ／ＦＣＰタンパク質または共発現複合体のストレップ精製
次に、濾過された試料が、５ｍＬ ＳｔｒｅｐＴｒａｐカラムに次のパラメータで装填される。装填速度：０．８ｍＬ／分、全試料装填量：１０ｍＬ、未結合の洗浄：１０ＣＶ（５ｍＬ／分）、追加洗浄：１０ＣＶ（５ｍＬ／分）、溶出： ３ＣＶ（５ｍＬ／分）。親和性緩衝液：５０ｍＬ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ Ｎａｃｌ、０．１％ ＤＤＭ、洗浄緩衝液：５０ｍＬ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、２Ｍ Ｎａｃｌ、０．１％ ＤＤＭ、溶出緩衝液：５０ｍＬ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＤＤＭ、１０ｍＭデスチオビオチン。溶出された試料が収集される。
ＣｓｇＧがＣ末端ストレップタグを含む場合、およびＣｓｇＦまたはＦＣＰがＣ末端Ｈｉｓタグを含む場合の、ＣｓｇＧまたはＣｓｇＦ／ＦＣＰタンパク質または共発現複合体のＨｉｓ精製
濾過した試料またはＳｔｒｅｐ精製からの溶出ピークをプールしたもの（複合体の場合）を、以下の緩衝液以外は上記のパラメータを使用して、５ ｍＬのＨｉｓＴｒａｐカラムに装填した：親和性緩衝液および洗浄緩衝液：５０ｍＬ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＤＤＭ、２５ｍＭイミダゾール、溶出：５０Ｍｌ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ Ｎａｃｌ、０．１％ ＤＤＭ、３５０ｍＭ イミダゾール。ピーク溶出し、３０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ遠心分離装置で濃縮し、５００ｕＬの容積にした。
ｉｎ ｖｉｖｏで精製された構成要素を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの複合体形成。
発現し精製されたＣｓｇＧおよびＣｓｇＦ／ＦＣＰタンパク質の両方を、さまざまな比で別個に混合して、正しい比率を特定する。ところが、常に過剰ＣｓｇＧ状態である。次に、複合体を２５°Ｃで一晩培養した。過剰なＣｓｇＦを除去し、緩衝液からＤＴＴを除去するために、混合物を５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ Ｎａｃｌ、０．１％ ＤＤＭで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ２００ １０／３００に再度注入した。複合体は通常、このカラム上で９〜１０ｍＬの間で溶出する。
複合体のためのゲル濾過による研磨工程（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの共発現または作製）
必要に応じて、ストレップ精製、またはＨｉｓ精製、またはＨｉｓ精製に続いてストレップ精製をしたＣｓｇＧ：ＣｓｇＦまたはＣｓｇＧ：ＦＣＰに、ゲル濾過によってさらに研磨工程を施すことができる。５００ｕＬの試料を１ｍＬ試料ループに注入し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＤＤＭ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ２００ １０／３００上に注入した。複合体に関連付けられたピークは、通常、１ ｍＬ／分の実行時にこのカラムで９〜１０ ｍＬで溶出される。試料を６０℃で１５分間加熱し、２１，０００ｒｃｆで１０分間遠心分離した。テスト用に上清を取った。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、複合体で溶出された画分を確認し、特定した。
ＴＥＶプロテアーゼ部位でのＣｓｇＦまたはＦＣＰの切断
ＣｓｇＦまたはＦＣＰがＴＥＶ切断部位を含む場合、Ｃ末端ヒスチジンタグを用いたＴＥＶ−プロテアーゼが試料に、２ｍＭ ＤＴＴと共に追加される（追加量はタンパク質複合体のおおまかな濃度に基づいて特定）。試料を、２５ｒｐｍのローラーミキサー上、４℃で一晩培養した。次に、混合物を５ｍＬ ＨｉＳｔｒａｐカラムに戻し、貫流分が回収された。切断されていないものはすべてカラムに結合されたままで、切断されたタンパク質が溶出する。上述のＨｉｓ精製で使用されたものと同一の緩衝液およびパラメータおよび最終加熱工程が使用される。
ｉｎ ｖｉｖｏ精製されたＣｓｇＧ細孔および合成ＦＣＰによるＣｓｇＧ：ＦＣＰ複合体の精製
ＧｅｎｓｃｒｉｐｔおよびＬｉｆｅｔｅｉｎからのＦＣＰペプチドを凍結乾燥した。１ｍｇのペプチドを１ｍＬのヌクレアーゼ遊離ｄｄＨ２Ｏに溶解し、１ｍｇ／ｍＬの試料を得る。ペプチドが見えなくなるまで、試料はボルテックスされた。ＣｓｇＧ細孔および突然変異体の発現レベルの違いにより、濃度を正確に測定することは困難である。既知のマーカーに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のタンパク質バンドの強度を使用して、試料のおおまかな推定をすることができる。次に、ＣｓｇＧおよびＦＣＰを約１：５０モル比で混合し、２５℃で７００ｒｐｍで一晩培養する。試料を６０℃で１５分間加熱し、２１，０００ｒｃｆで１０分間遠心分離した。テスト用に上清を取った。必要に応じて、複合体を共発現で上述したように精製することができる。
システイン突然変異体を含むＣｓｇＧ：ＣｓｇＦまたはＣｓｇＧ：ＦＣＰの精製
一方または両方の構成要素がシステインを含む場合に、Ｈｉｓ精製およびＳｔｒｅｐ精製での親和性緩衝液、洗浄緩衝液および溶出緩衝液、ならびにゲル濾過で使用される緩衝液の組成を除いて、上述と同じ手順が、ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦまたはＣｓｇＧ：ＦＣＰ複合体（下記のＩまたはＩＩまたはＩＩＩ）を精製するために使用されうる。システイン突然変異体を精製するために、これらの緩衝液はすべて、２ｍＭ ＤＴＴを含むべきである。２ｍＭ ＤＴＴも、システインを含む合成ペプチドがｄｄＨ２Ｏ中で溶解される時に追加された。
Ｉ． ＣｓｇＧおよびＣｓｇＦまたはＦＣＰの共発現
ＩＩ． ｉｎ ｖｉｖｏ精製された個別構成要素を用いたＣｓｇＧ：ＣｓｇＦまたはＣｓｇＧ：ＦＣＰ複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ作製
ＩＩＩ． ｉｎ ｖｉｖｏ精製されたＣｓｇＧおよび合成ＦＣＰを用いたＣｓｇＧ：ＣｓｇＦまたはＣｓｇＧ：ＦＣＰ複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ作製
Ｃｙｓ結合形成の決定
最終溶出からそれぞれ５０ｕＬの二本のチューブをそれぞれ分離した。一方のチューブに、２ｍＭ ＤＴＴを還元剤として加え、他方のチューブに１００μＭのＣｕ（ＩＩ）：１−１０フェナンスロライン（３３ ｍＭ：１００ ｍＭ）を酸化剤として加えた。試料を４％のＳＤＳを含むＬａｅｍｍｌｉ緩衝液と１：１で混合した。試料の半分を１００℃で１０分間（変性条件）熱処理し、半分を未処置のままにした後、ＴＧＳ緩衝液中で４〜２０％のＴＧＸゲル（Ｂｉｏ−ｒａｄ Ｃｒｉｔｅｒｉo n）上で実施した。
インビトロ転写および翻訳（ＩＶＴＴ）の結合
すべてのタンパク質は、環状ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）用のＥ． ｃｏｌｉ Ｔ７−Ｓ３０抽出システムを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳（ＩＶＴＴ）の結合により生成された。完全な１ ｍＭのアミノ酸混合物からシステインを差し引いたものと、完全な１ ｍＭのアミノ酸混合物からメチオニンを差し引いたものとを同量で混合して、高濃度のタンパク質を生成するために必要な作用アミノ酸溶液を得た。アミノ酸（１０ｕＬ）を予混合溶液（４０ｕＬ）、［３５Ｓ］Ｌ−メチオニン（２ｕＬ、１１７５ Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍＬ）、プラスミドＤＮＡ（１６ｕＬ、４００ｎｇ／ｕＬ）、およびＴ７ Ｓ３０抽出物（３０ｕＬ）およびリファンピシン（２ｕＬ、２０ ｍｇ／ｍＬ）と混合し、ＩＶＴＴタンパク質の１００ｕＬ反応物を生成した。合成を３０℃で４時間実施し、その後室温で一晩培養した。ＣｓｇＧ：ＣｓｇＦまたはＣｓｇＧ：ＦＣＰ複合体を共発現で作製した場合、各構成要素をコードするプラスミドＤＮＡを等量で混合し、混合物（１６ｕＬ）の一部をＩＶＴＴに使用した。培養後、チューブを２２０００ｇで１０分間遠心分離し、その上清を捨てた。得られたペレットを再懸濁し、ＭＢＳＡ（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ ｐＨ７．４）で洗浄し、同じ条件下で再度遠心分離した。ペレット中に存在するタンパク質を１Ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中に再懸濁し、３００Ｖで２５分間、４〜２０％のＴＧＸゲル中で実施した。次に、ゲルを乾燥し、Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ（登録商標）Ｋｏｄａｋ（登録商標）ＢｉｏＭａｘ（登録商標）ＭＲフィルムに一晩露出させた。次いで、フィルムを処理し、ゲル中のタンパク質を視覚化した。
ＭｉｎＩＯＮでの試験用の試料
試験前のすべての試料は、Ｂｒｉｊ５８（最終濃度０．１％）で１０分間、室温で培養してから、細孔挿入に必要なその後の細孔希釈を作製した。
静的鎖の準備および実行方法
一つの塩基がＤＮＡバックボーン（ＩＳｐｃ３）から欠失している一組のｐｏｌｙＡ ＤＮＡ鎖（図２７のＳＳ２０〜ＳＳ３８）は、これらの各鎖の、統合ＤＮＡ技術（ＩＤＴ）によって得られる。これらの鎖の各々の３’末端もビオチン修飾を含む。静的鎖は、一価ストレプトアビジンで室温で２０分間培養され、その結果、ストレプトアビジンにビオチン結合が生じる。ストレプトアビジン−静的鎖複合体を、２５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４３０ ｍＭ ＫＣｌ、３０ ｍＭ ＡＴＰ、３０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．１５ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８（ＲＢＣとして知られる）中で、５００ Ｎｍ（Ｂ、図２７）および２ ｕＭ（Ｃ、図２７）に希釈した。各静的鎖によって生成される残留電流は、ＭｉｎＩＯＮセットアップに記録される。ＭｉｎＩＯｎフローセルを標準走行プロトコルに従ってフラッシュし、次いで、配列決定プロトコルを１分間の静的フリックで始めた。最初に１０分の開放細孔記録を生成してから、１５０ｕＬの第一のストレプトアビジン−静的鎖複合体を加えた。１０分後、フローセルを通して８００ｕＬのＲＢＣＦＭをフラッシュした後、次のストレプトアビジン−静的鎖複合体を加えた。このプロセスが、すべてのストレプトアビジン−静的鎖に対して繰り返された。最後のストレプトアビジン−静的鎖複合体がフローセル上で培養されると、８００ ｕＬのＲＢＦＭをフローセルを通してフラッシュし、１０分間の開放細孔記録を生成してから実験を終了した。
差別プロファイルプロットを作成する方法
リーダーヘッド差別プロファイルは、各リーダーヘッド位置にある塩基が変化する時のモデル化された電流の平均変動を示す。長さｎのアルファベットを有する長さｋのモデルについての位置ｉでのリーダーヘッド差別を計算するために、リーダーヘッド位置ｉでの差別を、サイズｎのそれぞれのｎｋ−１群についての電流レベルの標準偏差の中央値として定義した。式中、位置ｉは変動し、一方でその他の位置は一定に保たれる。
本開示の態様
１．ＣｓｇＧ細孔またはその相同体もしくは突然変異体、および修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体を含む、単離された細孔複合体。
２．修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体が、ＣｓｇＧ細孔またはその相同体もしくは突然変異体の内腔に挿入される、態様１に記載の単離された細孔複合体。
３．細孔複合体がＣｓｇＧチャネル収縮およびＣｓｇＦチャネル収縮を含む二つ以上のチャネル収縮部を有する、態様２に記載された単離された細孔複合体。
４．ＣｓｇＧ細孔またはその相同体もしくは突然変異体が突然変異体ＣｓｇＧ細孔である、態様１〜３のいずれか一項に記載の単離された細孔複合体。
５．ＣｓｇＦチャネル収縮部が０．５ ｎｍ〜２．０ ｎｍの範囲の直径を持つ、態様３または４に記載の単離された細孔複合体。
６．修飾がＣｓｇＦタンパク質配列番号６またはその相同体もしくは突然変異体の切断を含む、修飾ＣｓｇＦペプチド、またはＣｓｇＦ相同体もしくは突然変異体の修飾ペプチド。
７．前記修飾ＣｓｇＦペプチドが、配列番号３９、または配列番号４０またはその相同体もしくは突然修飾ペプチド。
８．前記修飾ＣｓｇＦペプチドが、配列番号１５またはその相同体もしくは突然変異体を含む、態様６に記載の、修飾ＣｓｇＦペプチド、またはＣｓｇＦ相同体もしくは突然変異体の修飾ペプチド。
９．配列番号１５を含む領域内の一つ以上の位置が、配列番号１５に対して最低でも３５％のアミノ酸同一性で突然変異を起こす、態様８に記載の修飾ＣｓｇＦペプチド、またはＣｓｇＦ相同体もしくは突然変異体の修飾ペプチド。
１０．態様６〜９のいずれか一項に記載の修飾ＣｓｇＦペプチドをコードするポリヌクレオチド。
１１．前記修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体が、態様６〜９のいずれか一項に記載のペプチドである、態様１〜５のいずれか一項に記載の単離された細孔複合体。
１２．修飾ＣｓｇＦペプチドおよびＣｓｇＧ細孔またはその相同体もしくは突然変異体が共有結合される、態様１１に記載された単離された細孔複合体。
１３．共有結合が以下による、態様１２に記載の単離された細孔複合体：
（ｉ）配列番号３の１３２、１３３、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、２０１、２０３、２０５、２０７または２０９またはその相同体に対応する位置にあるシステイン残基、
（ｉｉ）配列番号３の１３２、１３３、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、２０１、２０３、２０５、２０７または２０９またはその相同体に対応する位置にある非ネイティブ反応性または光反応性アミノ酸。
１４．態様１〜５または態様１１〜１３のいずれか一項に記載の単離された細孔複合体と、膜の構成要素とを含む、単離された膜貫通細孔複合体。
１５．細孔複合体が、ＣｓｇＧ細孔および修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体によって形成され、配列番号２に描写されているＣｓｇＧまたはその相同体もしくは突然変異体と、修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体とを、適切な宿主細胞内で共発現し、それによってｉｎ ｖｉｖｏ膜貫通細孔複合体形成を行う工程を含む、膜貫通細孔複合体を生成するための方法。
１６．修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体が、配列番号１２または配列番号１４またはその相同体もしくは突然変異体を含む、態様１５に記載の方法。
１７．単離された細孔が、ＣｓｇＧ細孔またはその相同体もしくは突然変異体と、修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体とによって形成され、配列番号３またはその相同体もしくは突然変異体のＣｓｇＧモノマーを、修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体と接触させ、それによって単離された細孔複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成を行う工程を含む、単離された細孔複合体を生成するための方法。
１８．修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体が、配列番号１５または配列番号１６またはその相同体もしくは突然変異体を含む、態様１７に記載の方法。
１９．標的分析物の存在、不在または一つ以上の特性を決定するための方法であって、
（ｉ）標的分析物を、標的分析物が細孔複合体内に移動するように、態様１〜５または態様１１〜１３のいずれか一項に記載の細孔複合体と、または態様１４に記載の膜貫通細孔複合体と接触させる工程と、
（ｉｉ）分析物が細孔複合体の中を移動する時に一つ以上の測定値を取って、それによって分析物の存在、不在または一つ以上の特性を決定する工程を含む、方法。
２０．分析物がポリヌクレオチドである、態様１９に記載の方法。
２１．分析物が（ポリ）ペプチドである、態様１９に記載の方法。
２２．分析物が多糖類である、態様１９に記載の方法。
２３．分析物が、薬理学的活性化合物、有毒化合物および汚染物質など、小さな有機化合物または無機化合物である、態様１９に記載の方法。
２４．（ｉ）ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）ポリヌクレオチドが修飾されているかどうかから選択される一つ以上の特性を決定する工程を含む、態様２０に記載の方法。
２５．細孔複合体がＣｓｇＧ細孔またはその相同体もしくは突然変異体と、修飾ＣｓｇＦペプチドまたはその相同体もしくは突然変異体とを含む複合体である、単離された膜貫通細孔複合体を使用してポリヌクレオチドまたは（ポリ）ペプチドを特徴付ける方法。
２６．ＣｓｇＧ細孔またはその相同体もしくは突然変異体が６〜１０個のモノマーを含む、態様２５に記載の方法。
２７．標的分析物の存在、不在または一つ以上の特性を決定するための、態様１〜５または態様１１〜１３のいずれか一項に記載の、または態様１４に記載の膜貫通細孔複合体の単離された細孔複合体の使用。
２８．（ａ）態様１〜５または態様１１〜１３のうちのいずれか一つに記載の単離された細孔複合体および（ｂ）膜の構成要素を含む、標的分析物を特徴付けるためのキット。
配列
配列の説明：
配列番号１は、シグナル配列（遺伝子ＩＤ：９４５６１９）を含む、株Ｋ１２由来の野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＧのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号２は、シグナル配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ０ＡＥＡ２）を含む野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＧのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、成熟タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ０ＡＥＡ２）としての野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＧのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、シグナル配列（遺伝子ＩＤ：９４５６２２）を含む、株Ｋ１２由来の野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号５は、シグナル配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ０ＡＥ９８）を含む野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦのアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、成熟タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ０ＡＥ９８）としての野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、アミノ酸１〜２７およびＣ末端６ Ｈｉｓタグをコードする、野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦの断片のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号８は、アミノ酸１〜２７およびＣ末端６ Ｈｉｓタグを包含する、野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦの断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、アミノ酸１〜３８およびＣ末端６ Ｈｉｓタグをコードする、野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦの断片のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０は、アミノ酸１〜３８およびＣ末端６ Ｈｉｓタグを包含する、野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦの断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、アミノ酸１〜４８およびＣ末端６ Ｈｉｓタグをコードする、野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦの断片のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号１２は、アミノ酸１〜４８およびＣ末端６ Ｈｉｓタグを包含する、野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦの断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、アミノ酸１〜６４およびＣ末端６ Ｈｉｓタグをコードする、野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦの断片のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号１４は、アミノ酸１〜６４およびＣ末端６ Ｈｉｓタグを包含する、野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦの断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦの残基２０〜５３に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦの残基２０〜４２（そのＣ末端にＫＤを含む）に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７は、ＣｓｇＦ相同体Ｑ８８Ｈ８８の残基２３〜５５に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８は、ＣｓｇＦ相同体Ａ０Ａ１４３ＨＪＡ０の残基２５〜５７に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、ＣｓｇＦ相同体Ｑ５Ｅ２４５の残基２１〜５３に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、ＣｓｇＦ相同体Ｑ０８４Ｅ５の残基１９〜５１に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、ＣｓｇＦ相同体Ｆ０ＬＺＵ２の残基１５〜４７に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、ＣｓｇＦ相同体Ａ０Ａ１３６ＨＱＲ０の残基２６〜５８に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３は、ＣｓｇＦ相同体Ａ０Ａ０Ｗ１ＳＲＬ３の残基２１〜５３に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、ＣｓｇＦ相同体Ｂ０ＵＨ０１の残基２６〜５９に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５は、ＣｓｇＦ相同体Ｑ６ＮＡＵ５の残基２２〜５３に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２６は、ＣｓｇＦ相同体Ｇ８ＰＵＹ５の７〜３８残基に相当するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２７は、ＣｓｇＦ相同体Ａ０Ａ０Ｓ２ＥＴＰ７の残基２５〜５７に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２８は、ＣｓｇＦ相同体Ｅ３Ｉ１Ｚ１の残基１９〜５１に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は、ＣｓｇＦ相同体Ｆ３Ｚ０９４の残基２４〜５５に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３０は、ＣｓｇＦ相同体Ａ０Ａ１７６Ｔ７Ｍ２の残基２１〜５３に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３１は、ＣｓｇＦ相同体Ｄ２ＱＰＰ８の残基１４〜４５に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、ＣｓｇＦ相同体Ｎ２ＩＹＴ１の残基２８〜５８に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は、ＣｓｇＦ相同体Ｗ７ＱＨＶ５の残基２６〜５８に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３４は、ＣｓｇＦ相同体Ｄ４ＺＬＷ２の残基２３〜５５に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３５は、ＣｓｇＦ相同体Ｄ２ＱＴ９２の残基２１〜５３に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３６は、ＣｓｇＦ相同体Ａ０Ａ１６７ＵＪＡ２の残基２０〜５１に対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３７は、アミノ酸２０〜２７を包含する野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦ断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号３８は、アミノ酸２０〜３８を包含する野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦ断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号３９は、アミノ酸２０〜４８を包含する野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦ断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号４０は、アミノ酸２０〜６４を包含する野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦ断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号４１は、プライマーＣｓｇＦ＿ｄ２７＿ｅｎｄのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４２は、プライマーＣｓｇＦ＿ｄ３８＿ｅｎｄのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４３は、プライマーＣｓｇＦ＿ｄ４８＿ｅｎｄのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４４は、プライマーＣｓｇＦ＿ｄ６４＿ｅｎｄのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４５は、プライマーｐＮａ６２＿ＣｓｇＦ＿ｈｉｓｔａｇ＿Ｆｗのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４６は、プライマーＣｓｇＦ−Ｈｉｓ＿Ｐｅｔ２２ｂ＿ＦＷ のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４７は、プライマーＣｓｇＦ−Ｈｉｓ＿Ｐｅｔ２２ｂ＿Ｒｅｖ のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４８は、プライマーｃｓＧｅＦＧ＿ＰｄＯＮＲ２２１＿ＦＷ のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４９は、プライマーｃｓＧｅＦＧ＿ＰｄＯＮＲ２２１＿Ｒｅｖ のヌクレオチド配列を示す。
配列番号５０は、プライマーＭｕｔ＿ｃｓｇＦ＿Ｈｉｓ＿ＦＷ のヌクレオチド配列を示す。
配列番号５１は、プライマーＭｕｔ＿ｃｓｇＦ＿Ｈｉｓ＿Ｒｅｖ のヌクレオチド配列を示す。
配列番号５２は、プライマーＤｅｌＣｓｇＥ＿Ｒｅｖ のヌクレオチド配列を示す。
配列番号５３は、プライマーＤｅｌＣｓｇＥ ＦＷ のヌクレオチド配列を示す。
配列番号５４は、成熟Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦの残基１〜３０のアミノ酸配列を示す。
配列番号５５は、成熟Ｅ． ｃｏｌｉ ＣｓｇＦの残基１〜３５のアミノ酸配列を示す。
配列番号５６は、シグナル配列を有する突然変異（Ｔ４Ｃ／Ｎ１７Ｓ）ＣｓｇＦ配列のアミノ酸配列と、成熟タンパク質の配列の残基３５と３６の間に挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＳ）を示す。
配列番号５７は、シグナル配列を有する突然変異（Ｎ１７Ｓ−Ｄｅｌ）ＣｓｇＦ配列のアミノ酸配列と、成熟タンパク質の配列の残基３５と３６の間に挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＳ）を示す。
配列番号５８は、シグナル配列を有する突然変異（Ｇ１Ｃ／Ｎ１７Ｓ）ＣｓｇＦ配列のアミノ酸配列と、成熟タンパク質の配列の残基３５と３６の間に挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＳ）を示す。
配列番号５９は、シグナル配列を有する突然変異（Ｇ１Ｃ）ＣｓｇＦ配列のアミノ酸配列と、成熟タンパク質の配列の残基３５と３６の間に挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＳ）を示す。
配列番号６０は、シグナル配列を有するＣｓｇＦのアミノ酸配列と、成熟タンパク質の配列の残基４５および４６の間に挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＳ）と、Ｃ末端のＨｉｓ１０タグを示す。
配列番号６１は、シグナル配列を有するＣｓｇＦのアミノ酸配列と、成熟タンパク質の配列の残基３５および３６の間に挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＳ）と、Ｃ末端のＨｉｓ１０タグを示す。
配列番号６２は、シグナル配列を有するＣｓｇＦのアミノ酸配列と、成熟タンパク質の配列の残基３０および３１の間に挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＳ）と、Ｃ末端のＨｉｓ１０タグを示す。
配列番号６３は、シグナル配列を有するＣｓｇＦのアミノ酸配列と、成熟タンパク質の配列の残基４５および５１の間に挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＳ）と、Ｃ末端のＨｉｓ１０タグを示す。
配列番号６４は、シグナル配列を有するＣｓｇＦのアミノ酸配列と、成熟タンパク質の配列の残基３０および３７の間に挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＳ）と、Ｃ末端のＨｉｓ１０タグを示す。
配列番号６５は、シグナル配列を有するＣｓｇＦのアミノ酸配列と、成熟タンパク質の配列の残基３４および３６の間に挿入されたＨＣＶ Ｃ３プロテアーゼ切断部位（ＬＥＶＬＦＱＧＰ）と、Ｃ末端のＨｉｓ１０タグを示す。
配列番号６６は、シグナル配列を有するＣｓｇＦのアミノ酸配列と、成熟タンパク質の配列の残基４２および４３の間に挿入されたＨＣＶ Ｃ３プロテアーゼ切断部位（ＬＥＶＬＦＱＧＰ）と、Ｃ末端のＨｉｓ１０タグを示す。
配列番号６７は、シグナル配列を有するＣｓｇＦのアミノ酸配列と、成熟タンパク質の配列の残基３８および４７の間に挿入されたＨＣＶ Ｃ３プロテアーゼ切断部位（ＬＥＶＬＦＱＧＰ）と、Ｃ末端のＨｉｓ１０タグを示す。
配列番号６８は、仮説的タンパク質ＣＫＯ＿０２０３２［Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−８９５］ のＹＰ＿００１４５３５９４．１：１−２４８のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３と９９％同一である。
配列番号６９は、ｃｕｒｌｉ生産組立／輸送構成要素ＣｓｇＧ、部分的に［Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ］のＷＰ＿００１７８７１２８．１：１６−２３８のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３に対して９８％である。
配列番号７０は、ｃｕｒｌｉ生産組立／輸送タンパク質ＣｓｇＧ ［Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ］のＫＥＹ４４９７８．１｜：１６−２７７のアミノ酸配列を示し、これは、配列番号３と９８％同一である。
配列番号７１は、ｃｕｒｌｉ生産組立／輸送構成要素 ［Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ ＩＣＣ１６８］のＹＰ＿００３３６４６９９．１：１６−２７７のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３と９７％同一である。
配列番号７２は、ｃｕｒｌｉ生産組立／輸送構成要素ＣｓｇＧ ［Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｓｂｕｒｉａｅ ＬＦ７ａ］のＹＰ＿００４８２８０９９．１：１６−２７７のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３と９４％同一である。
配列番号７３は、輸送体 ［Ｙｏｋｅｎｅｌｌａ ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇｅｉ］ のＷＰ＿００６８１９４１８．１：１９−２８０のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３と９１％同一である。
配列番号７４は、ｃｕｒｌｉ生産組立／輸送タンパク質 ＣｓｇＧ ［Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｐｕｌｖｅｒｉｓ］の ＷＰ＿０２４５５６６５４．１：１６−２７７のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３と８９％同一である。
配列番号７５は、ｃｕｒｌｉ生産組立／輸送タンパク質 ＣｓｇＧ ［Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ ＨＸ２］ のＹＰ＿００５４００９１６．１ ：１６−２７７のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３と８４％同一である。
配列番号７６は、ＣｓｇＧ ｆａｍｉｌｙ ｃｕｒｌｉ生産組立／輸送構成要素 ［Ｋｌｕｙｖｅｒａ ａｓｃｏｒｂａｔａ ＡＴＣＣ ３３４３３］ のＫＦＣ９９２９７．１：２０−２７８のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３と８２％同一である。
配列番号７７は、ＣｓｇＧ ｆａｍｉｌｙ ｃｕｒｌｉ生産組立／輸送構成要素 ［Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ ＡＴＣＣ １３３３７］ のＫＦＣ８６７１６．１｜：１６−２７４のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３と８１％同一である。
配列番号７８は、ｃｕｒｌｉポリマーの形成に関与する特徴付けされていないタンパク質 ［Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＦＧＩ ５７］のＹＰ＿００７３４０８４５．１｜：１６−２７０のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３と７６％同一である。
配列番号７９は、ｃｕｒｌｉ生産組立／輸送タンパク質ＣｓｇＧ ［Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ］のＷＰ＿０１０８６１７４０．１：１７−２７４のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３と７０％同一である。
配列番号８０は、ｃｕｒｌｉ生産組立／輸送外膜リポタンパク質構成要素ＣｓｇＧ ［Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ ＥＳ１１４］の ＹＰ＿２０５７８８．１ ：２３−２７０のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３と６０％同一である。
配列番号８１は、ｃｕｒｌｉ生産組立タンパク質ＣｓｇＧ ［Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ ｌｏｇｅｉ］の ＷＰ＿０１７０２３４７９．１：２３−２７０のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３と５９％同一である。
配列番号８２は、ｃｕｒｌｉ生産組立／輸送構成要素ＣｓｇＧ ［Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＡＫ１５］のＷＰ＿００７４７０３９８．１：２２−２７５のアミノ酸配列を示し、これは 配列番号３と５７％同一である。
配列番号８３は、ｃｕｒｌｉ生産組立タンパク質ＣｓｇＧ ［Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉ］の ＷＰ＿０２１２３１６３８．１：１７−２７７のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３と５６％同一である。
配列番号８４は、ｃｕｒｌｉ生産組立／輸送タンパク質ＣｓｇＧ ［Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ． ＥＣＳＭＢ１４１０１］の ＷＰ＿０３３５３８２６７．１：２７−２６５のアミノ酸配列を示し、これは 配列番号３と５６％同一である。
配列番号８５は、ｃｕｒｌｉ生産組立タンパク質ＣｓｇＧ ［Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ］のＷＰ＿００３２４７９７２．１：３０−２６２のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３と５４％同一である。
配列番号８６は、ｃｕｒｌｉ生産組立／輸送構成要素ＣｓｇＧ ［Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｖｉｏｌａｃｅａ ＤＳＳ１２］のＹＰ＿００３５５７４３８．１：１−２３４のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３と５３％同一である。
配列番号８７は、ｃｕｒｌｉ生産組立／輸送タンパク質ＣｓｇＧ ［Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ］のＷＰ＿０２７８５９０６６．１：３６−２８０のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３と５３％同一である。
配列番号８８は、ｃｕｒｌｉ生産組立／輸送構成要素ＣｓｇＧ ［Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｒａｎｉｍｅｎｓｅ Ｇ３１１］のＣＥＪ７０２２２．１：２９−２６２のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３と５０％同一である。
タンパク質に作製されたプロテアーゼ切断部位を有するＣｓｇＦ配列の例。シグナルペプチドは太字で、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位は太字および下線で、およびＨＣＶ Ｃ３プロテアーゼ切断部位は下線で表示されている。ＳｔｒｅｐＩＩはＣ末端におけるストレップタグを示し、Ｈ１０はＣ末端で１０ｘＨｉｓｔｉｄｉｎｅタグを示し、＊＊はＳＴＯＰコドンを示す。

Claims (61)

  1. ＣｓｇＧ細孔および修飾ＣｓｇＦペプチドを含む細孔であって、前記修飾ＣｓｇＦペプチドがＣｓｇＧに結合され、前記細孔内に収縮部を形成する、細孔。
  2. 前記ＣｓｇＦペプチドが、ＣｓｇＦのＣ末端ヘッドドメインおよびＣｓｇＦのネックドメインの少なくとも一部とを欠く、切断ＣｓｇＦペプチドである、請求項１に記載の細孔。
  3. 前記ＣｓｇＦペプチドが、２５〜５０アミノ酸の長さを有する、請求項１または２に記載の細孔。
  4. 前記ＣｓｇＦペプチドが、配列番号６の残基１から配列番号６の残基２８〜４５のいずれか一つ、または配列番号６の相同体またはそのいずれかの変異体の対応する残基までのアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細孔。
  5. 前記ＣｓｇＦペプチドが、配列番号３９（配列番号６の残基１〜２９）またはその相同体または変異体を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細孔。
  6. 前記ＣｓｇＦペプチドが、配列番号１５（配列番号６の残基１〜３４）、配列番号４０（配列番号６の残基１〜４５）、配列番号５４（配列番号６の残基１〜３０）、または配列番号５５（配列番号６の残基１〜３５）またはその相同体または変異体を含む、請求項５に記載の細孔。
  7. 請求項６に記載の細孔であって、前記ＣｓｇＦペプチド内において、配列番号 １５、配列番号 ３９、配列番号 ４０、配列番号５４、または配列番号５５のうち一つ以上の残基が修飾される、細孔。
  8. 前記ＣｓｇＦペプチドが、以下の位置 Ｇ１、Ｔ４、Ｆ５、Ｒ８、Ｎ９、Ｎ１１、Ｆ１２、Ａ２６およびＱ２９のうちの一つ以上に修飾を含む、請求項７に記載の細孔。
  9. 前記修飾が、システイン、疎水性アミノ酸、荷電アミノ酸、非ネイティブ反応性アミノ酸、または光反応性アミノ酸の導入である、請求項７または８に記載の細孔。
  10. 前記ＣｓｇＦペプチドが、以下の位置 Ｎ１５、Ｎ１７、Ａ２０、Ｎ２４、Ａ２８およびＤ３４のうちの一つ以上に修飾を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の細孔。
  11. 前記ＣｓｇＦペプチドが、以下の置換 Ｎ１５Ｓ／Ａ／Ｔ／Ｑ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｃ、Ｎ１７Ｓ／Ａ／Ｔ／Ｑ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｃ、Ａ２０Ｓ／Ｔ／Ｑ／Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｃ、Ｎ２４Ｓ／Ｔ／Ｑ／Ａ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｃ、Ａ２８Ｓ／Ｔ／Ｑ／Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｃ、およびＤ３４Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｃのうちの一つ以上を含む、請求項１０に記載の細孔。
  12. 前記ＣｓｇＦペプチドが、以下の置換 Ｇ１Ｃ、Ｔ４Ｃ、Ｎ１７Ｓ、およびＤ３４ＹまたはＤ３４Ｎのうちの一つ以上を含む、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の細孔。
  13. 前記ＣｓｇＦペプチドが、前記Ｃ末端に酵素切断部位のすべてまたは一部をさらに含む、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の細孔。
  14. 前記切断ＣｓｇＦペプチドが前記ＣｓｇＧ細孔の内腔に挿入される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細孔。
  15. 前記ＣｓｇＧ細孔が６〜１０個のＣｓｇＧモノマーを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細孔。
  16. 前記細孔内の前記ＣｓｇＧモノマー：切断ＣｓｇＦペプチドの比が１：１である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細孔。
  17. 前記ＣｓｇＦペプチドと前記ＣｓｇＧ細孔が共有結合されている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の細孔。
  18. 請求項１７に記載の細孔であって、前記共有結合が、
    （ｉ） 配列番号３またはその相同体の１３２、１３３、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、２０１、２０３、２０５、２０７または２０９に対応する位置にあるシステイン残基、
    （ｉｉ） 配列番号３またはその相同体の１３２、１３３、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、２０１、２０３、２０５、２０７または２０９に対応する位置にある非ネイティブ反応性または光反応性アミノ酸、を介する細孔。
  19. 前記ＣｓｇＦペプチドおよび前記ＣｓｇＧ細孔が、それぞれ配列番号６および配列番号３の１と１５３、４と１３３、５と１３６、８と１８７、８と２０３、９と２０３、１１と１４２、１１と２０１、１２と１４９、１２と２０３、２６と１９１、および２９と１４４位置の対のうち一つ以上に対応する位置にある残基を介して、共有結合されている、請求項１７または１８に記載の細孔。
  20. 前記共有結合性がジスルフィド結合、またはクリックケミストリーである、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の細孔。
  21. 前記ＣｓｇＦペプチドと前記ＣｓｇＧ細孔との間の相互作用が、それぞれ配列番号６および配列番号３の１と１５３、４と１３３、５と１３６、８と１８７、８と２０３、９と２０３、１１と１４２、１１と２０１、１２と１４９、１２と２０３、２６と１９１、および２９と１４４の位置の対のうち一つ以上に対応する位置での疎水性相互作用、または静電気的相互作用または共有結合相互作用により安定化される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の細孔。
  22. 前記ＣｓｇＧ細孔が、配列番号３の以下の修飾
    （ｉ） 位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の一つ以上での修飾、
    （ｉｉ） Ｒ９７ＷまたはＲ９７ＹおよびＲ９３ＷまたはＲ９３Ｙから選択される少なくとも一つの置換、
    （ｉｉｉ） 配列番号３のＶ１０５、Ａ１０６、およびＩ１０７の欠失、
    （ｉｖ） 配列番号３の位置Ｒ１９２、Ｆ１９３、Ｉ１９４、Ｄ１０５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８、Ｌ１９９、およびＥ２０１のうちの一つ以上の欠失、
    （ｖ） Ｋ９４Ｎ／Ｑ／Ｒ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｌ／Ｓ、Ｄ４３Ｓ、Ｅ４４Ｓ、Ｆ４８Ｓ／Ｎ／Ｑ／Ｙ／Ｗ／Ｉ／Ｖ／Ｈ／Ｒ／Ｋ、Ｑ８７Ｎ／Ｒ／Ｋ、Ｎ９１Ｋ／Ｒ、Ｒ９７Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｖ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｑ／Ｈ、Ｅ１０１Ｉ／Ｌ／Ａ／Ｈ、Ｎ１０２Ｋ／Ｑ／Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｓ／Ｈ、Ｒ１１０Ｆ／Ｇ／Ｎ、Ｑ１１４Ｒ／Ｋ、Ｒ１４２Ｑ／Ｓ、Ｔ１５０Ｙ／Ａ／Ｖ／Ｌ／Ｓ／Ｑ／Ｎから選択される少なくとも一つの置換、および／または
    （ｖｉ） 位置Ｉ４１、Ｒ９３、Ａ９８、Ｑ１００、Ｇ１０３、Ｔ１０４、Ａ１０６、Ｉ１０７、Ｎ１０８、Ｌ１１３、Ｓ１１５、Ｔ１１７、Ｙ１３０、Ｋ１３５、Ｅ１７０、Ｓ２０８、Ｄ２３３、Ｄ２３８、Ｅ２４４、Ｑ４２、Ｅ４４、Ｌ９０、Ｎ９１、Ｉ９５、Ａ９９、Ｅ１０１およびＱ１１４のうち一つ以上での修飾、に対応する一つ以上の修飾を含む少なくとも一つのモノマーを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の細孔。
  23. 前記ＣｓｇＧ細孔が、配列番号３の以下の修飾
    （ｉ） Ｙ５１Ａ／Ｉ／Ｖ／Ｓ／Ｔ、Ｎ５５Ａ／Ｉ／Ｖ／Ｓ／ＴおよびＦ５６／Ａ／Ｉ／Ｖ／Ｓ／Ｔ／Ｑから選択される少なくとも一つの置換、
    （ｉｉ） 前記置換Ｒ９７Ｗ、
    （ｉｉｉ） Ｆ１９３、Ｉ１９４、Ｄ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８およびＬ１９９の欠失、またはＤ１９５、Ｙ１９６、Ｑ１９７、Ｒ１９８およびＬ１９９の欠失、
    （ｉｖ） Ｖ１０５、Ａ１０６およびＩ１０７の欠失、
    （ｖ） Ｋ９４ＱおよびＫ９４Ｎから選択される置換、
    （ｖｉ） Ｑ４２ＫまたはＱ４２Ｒ、Ｅ４４ＮまたはＥ４４Ｑ、Ｌ９０ＲまたはＬ９０Ｋ、Ｎ９１ＲまたはＮ９１Ｋ、Ｉ９５ＲまたはＩ９５Ｋ、Ａ９９ＲまたはＡ９９Ｋ、Ｅ１０１Ｈ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１ＱまたはＥ１０１Ｔ、および／またはＱ１１４Ｋから選択される少なくとも一つの置換、および／または
    （ｖｉｉ） 前記置換Ｎ５５Ｖ、に対応する一つ以上の修飾を含む少なくとも一つのモノマーを含む、請求項２２に記載の細孔。
  24. 前記ＣｓｇＧ細孔が、配列番号３のＲ１９２に対応する位置に、ＲまたはＫを含む少なくとも一つのモノマーを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の細孔。
  25. 二つのＣｓｇＧ細孔を含む二重細孔であり、前記ＣｓｇＦペプチドが前記ＣｓｇＧ細孔のうちの少なくとも一つの内腔に挿入される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の細孔。
  26. 膜内に含まれる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の細孔。
  27. 前記方法が、一つ以上のＣｓｇＧモノマーおよびＣｓｇＦペプチドを宿主細胞内で共発現し、それによって前記細胞内の膜貫通細孔複合体形成を許容する工程を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の細孔を生成する方法。
  28. 前記方法が、一つ以上の精製されたＣｓｇＧモノマーを修飾ＣｓｇＦペプチドと接触させて、それによって前記細孔のｉｎ ｖｉｔｒｏ形成を許容する工程を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の細孔を生成するための方法。
  29. 前記修飾ＣｓｇＦペプチドが切断される、請求項２７または２８に記載の細孔を生成する方法。
  30. 前記方法が、前記ＣｓｇＦペプチドの切断がＣｓｇＧ結合領域と前記細孔内に収縮部を形成する領域とを含む切断ＣｓｇＦペプチドを生成するように位置付けられた酵素切断部位を含む、修飾ＣｓｇＦペプチドを発現する工程を含み、前記方法が、前記ＣｓｇＦペプチドを切断する工程を含む、請求項２７または２８に記載の細孔を生成する方法。
  31. 前記修飾ＣｓｇＦペプチドが配列番号１５または配列番号１６またはその相同体もしくは突然変異体を含む、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 標的分析物の存在、不在または一つ以上の特性を決定するための方法であって、
    （ｉ） 前記標的分析物が前記細孔複合体内に移動するように、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の細孔に前記標的分析物を接触させる工程と、
    （ｉｉ） 前記分析物が前記細孔複合体を通って移動する時に、一つ以上の測定値を取り、それによって前記分析物の存在、不在または一つ以上の特性を決定する工程とを含む、方法。
  33. 前記分析物が、（ポリ）ペプチド、多糖類、小さな有機化合物または無機化合物（薬理学的活性化合物、有毒化合物および汚染物質など）である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記分析物がポリヌクレオチドである、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記ポリヌクレオチドが少なくとも１つのホモポリマー領域を含む、請求項３４に記載の方法。
  36. （ｉ）前記ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）前記ポリヌクレオチドが修飾されているかどうかのうち一つ以上の特性を決定する工程を含む、請求項３４または３５に記載の方法。
  37. 請求項１〜２６のいずれか一項に記載の細孔を使用してポリヌクレオチドまたは（ポリ）ペプチドを特徴付ける方法。
  38. 標的分析物の存在、不在または一つ以上の特性を決定するための、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の細孔の使用。
  39. 請求項１〜２６のいずれか(ａ)項に記載の細孔と、（ｂ）膜の構成要素とを含む標的分析物を特徴付けるためのキット。
  40. ＣｓｇＧ結合領域を含む修飾ＣｓｇＦペプチドと、細孔内に収縮部を形成する領域とを含む、ＣｓｇＦペプチド。
  41. ＣｓｇＦのＣ末端ヘッドドメインを欠く切断ＣｓｇＦペプチドである、請求項４０に記載のＣｓｇＦペプチド。
  42. ＣｓｇＦの前記ネックドメインの少なくとも一部を欠く、請求項４１に記載のＣｓｇＦペプチド。
  43. 前記ＣｓｇＦのＣ末端ヘッドドメイン、および前記ＣｓｇＦのネックドメインを欠く、請求項４２に記載のＣｓｇＦペプチド。
  44. ２５〜５０アミノ酸の長さを有する、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載のＣｓｇＦペプチド。
  45. 配列番号６の残基１から配列番号６または相同体またはその変異体の残基２８〜４５のうちいずれか一つまでのアミノ酸配列を含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載のＣｓｇＦペプチド。
  46. 配列番号３９（配列番号６の残基１〜２９）またはその相同体または変異体を含む、請求項４０〜４５のいずれか一項に記載のＣｓｇＦペプチド。
  47. 配列番号１５（配列番号６の残基１〜３４）、配列番号５４（配列番号６の残基１〜３０）、配列番号４０（配列番号６の残基１〜４５）、または配列番号５５（配列番号６の残基１〜３５）またはその相同体または変異体を含む、請求項４６に記載のＣｓｇＦペプチド。
  48. 請求項４５〜４７のいずれか一項に記載のＣｓｇＦペプチドであって、配列番号 ６、配列番号 １５、配列番号 ３９、配列番号 ４０、配列番号５４の残基１と残基２８〜４５との間の領域または配列番号５５（残基１〜３５）にある一つ以上の残基が修飾される、ＣｓｇＦペプチド。
  49. 以下の位置 Ｇ１、Ｔ４、Ｆ５、Ｒ８、Ｎ９、Ｎ１１、Ｆ１２、Ａ２６およびＱ２９のうちの一つ以上における修飾を含む、請求項４８に記載のＣｓｇＦペプチド。
  50. 前記修飾が、システイン、疎水性アミノ酸、荷電アミノ酸、非ネイティブ反応性アミノ酸、または光反応性アミノ酸の導入である、請求項４５に記載のＣｓｇＦペプチド。
  51. 以下の位置 Ｎ１５、Ｎ１７、Ａ２０、Ｎ２４、Ａ２８およびＤ３４のうちの一つ以上における修飾を含む、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載のＣｓｇＦペプチド。
  52. 以下の置換 Ｎ１５Ｓ／Ａ／Ｔ／Ｑ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｃ、Ｎ１７Ｓ／Ａ／Ｔ／Ｑ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｃ、Ａ２０Ｓ／Ｔ／Ｑ／Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｃ、Ｎ２４Ｓ／Ｔ／Ｑ／Ａ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｃ、Ａ２８Ｓ／Ｔ／Ｑ／Ｎ／Ｇ／Ｌ／Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｃ、およびＤ３４Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｃのうちの一つ以上を含む、請求項５１に記載のＣｓｇＦペプチド。
  53. 以下の置換 Ｇ１Ｃ、Ｔ４Ｃ、Ｎ１７Ｓ、およびＤ３４ＹまたはＤ３４Ｎのうちの一つ以上を含む、請求項４８〜５２のいずれか一項に記載のＣｓｇＦペプチド。
  54. 前記Ｃ末端に酵素切断部位のすべてまたは一部をさらに含む、請求項４０〜５３のいずれか一項に記載のＣｓｇＦペプチド。
  55. シグナルペプチドをさらに含む、請求項４０〜５４のいずれか一項に記載のＣｓｇＦペプチド。
  56. 請求項４０〜５５のいずれか一項に記載のＣｓｇＦペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  57. 細孔複合体であって、
    （ｉ） 第一の開口部と、βバレルを含む中間部分と、第二の開口部と、前記第一の開口部から前記中間部分を通って前記第二の開口部に延びる内腔とを含み、前記中間部分の内腔表面がＣｓｇＧ収縮部を画定するＣｓｇＧ細孔と、
    （ｉｉ） それぞれがＣｓｇＦ収縮領域およびＣｓｇＧ結合領域を有する複数の修飾ＣｓｇＦペプチドであって、前記修飾ＣｓｇＦペプチドが、前記ＣｓｇＧ細孔内に前記βバレル内のＣｓｇＦ収縮部を形成し、前記ＣｓｇＧ収縮部および前記ＣｓｇＦ収縮部が、前記ＣｓｇＧ細孔の前記βバレル内で同軸的に間隙を介しているものとを含む、細孔複合体。
  58. 前記内腔表面が前記ＣｓｇＧ収縮部を画定するＣｓｇＧモノマーの一つ以上のループ領域を含む、請求項５７に記載の細孔複合体。
  59. 前記ＣｓｇＦ収縮領域および前記ＣｓｇＧ結合領域が、ＣｓｇＦ成熟ペプチドのＮ末端部分に対応する、請求項５７に記載の細孔複合体。
  60. 前記細孔複合体がＣｓｇＡ、ＣｓｇＢおよびＣｓｇＥを含まない、請求項５７に記載の細孔複合体。
  61. 前記ＣｓｇＦペプチドが、前記ＣｓｇＧ細孔に共有結合されている、請求項５７に記載の細孔複合体。
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