JP7383480B2 - 修飾ナノポア、それを含む組成物、およびそれらの使用 - Google Patents
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Description
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれ、それらの特定の態様は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面のうちの1つ以上を参照することによってよりよく理解することができる。
配列番号1は、Salmonella enterica由来の短縮型InvG(N0およびN1ドメインを有しない全長InvG)の391個のアミノ酸配列である。
本開示のいくつかの態様は、修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドを提供する。修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドは、配列が参照セクレチンアミノ酸配列の配列と異なるポリペプチドである。修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドのアミノ酸配列は、(i)シス開口部形成アミノ酸配列、(ii)内腔形成アミノ酸配列、および(iii)トランス開口部形成アミノ酸配列を含む。シス開口部形成アミノ酸配列は、修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドが他のサブユニットポリペプチドと相互作用して膜中にナノポアを形成するときに、ナノポアのシス開口部の一部を形成するアミノ酸配列のうちの1つ以上の部分である。内腔形成アミノ酸配列は、修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドが他のサブユニットポリペプチドと相互作用して膜中にナノポアを形成するときに、ナノポアの内腔の一部を形成するアミノ酸配列のうちの1つ以上の部分である。トランス開口部形成アミノ酸配列は、修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドが他のサブユニットポリペプチドと相互作用して膜中にナノポアを形成するときに、ナノポアのトランス開口部の一部を形成するアミノ酸配列のうちの1つ以上の部分である。セクレチンナノポアのシス開口部、内腔、およびトランス開口部を形成するセクレチンアミノ酸配列の部分を同定する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、一部が膜に埋め込まれているナノポアは、例えば、Humphrey et al.,「VMD:Visual Molecular Dynamics」J.Mol.Graphics(1996)14:33-38に記載されるVMDを使用して、および例えば、Phillips et al.,「Scalable Molecular Dynamics with NAMD」J.Comput.Chem.(2005)26:1781-1802に記載されるNAMDを使用して、既知のセレクチン構造から相同性モデリングによって構築することができる。例えば、図1Dは、Vibrio cholerae由来のGspD(PDB:5wq8)およびE.coli由来のGspD(PDB:5wq7)の構造を示し、図8は、InvGナノポアの構造およびその異なるタンパク質ドメイン、ならびにナノポアの内腔内の例示的なアミノ酸修飾の対応位置を示していることを参照のこと。
本明細書に記載の修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドのいずれか1つをコードするポリヌクレオチド配列もまた本明細書に提供される。
本開示の一態様は、例えば、膜中に配置され、分析物、例えば標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの修飾セクレチンナノポアへの捕捉および/または修飾セクレチンナノポアを介した分析物の転位を可能にする修飾セクレチンナノポアを特徴とする。修飾セクレチンナノポアは、例えば膜中に配置され、シス開口部とトランス開口部との間で例えば膜を通って延在する内腔を画定する内腔表面を含み、この内腔表面は1つ以上のアミノ酸修飾を含む。本明細書で使用する場合、「内腔表面」との用語は、ナノポアの内部表面を指し、この表面は、溶液に曝される内腔を規定する複数のナノポアサブユニットの一連のアミノ酸を含む。
同一の修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドを含むホモ多量体ナノポアもまた本明細書に提供される。ホモ多量体ナノポアは、本明細書に記載の修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドの任意の実施形態を含み得る。ホモ多量体ナノポアは、分析物、例えば標的ポリヌクレオチドおよび/または標的ポリペプチドを特徴付けるために使用することができる。本明細書に記載のホモ多量体ナノポアは、上記で論じた利点のうちのいずれかを有し得る。
少なくとも1つの修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドを含むヘテロ多量体ナノポアもまた本明細書に提供される。ヘテロ多量体ナノポアは、標的分析物、例えば標的ポリヌクレオチドおよび/または標的ポリペプチドを特徴付けるために使用することができる。ヘテロ多量体ナノポアは、当該技術分野で既知の方法(例えば、Protein Sci.2002 Jul; 11(7):1813-24)を使用して作製することができる。
修飾セクレチンナノポアは、分析物、例えば標的ポリヌクレオチド(例えば、二本鎖ポリヌクレオチドおよび/または一本鎖ポリヌクレオチド)および/または標的ポリペプチドを特徴付けるまたは検出するために使用することができる。したがって、試料中の分析物を検出するおよび/または特徴付けるための方法もまた本明細書中に提供される。本方法は、本明細書に記載の修飾セクレチンナノポアの任意の実施形態および膜を含む水溶液を提供することであって、修飾セクレチンナノポアは膜中に配置される、上記提供することと、膜のシス側またはトランス側で水溶液に分析物を添加することと、を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド結合タンパク質、例えばヘリカーゼ、エキソヌクレアーゼ、および/またはポリメラーゼなどの酵素もまた、膜のシス側またはトランス側で水溶液に添加することができる。ポリヌクレオチド結合タンパク質などの酵素は、修飾セクレチンナノポアの内腔に入るか、または修飾セクレチンナノポアのシス開口部もしくはトランス開口部と(例えば、限定するものではないが、イオン性および/または疎水性相互作用により)接触し、またはこれと共有結合し得る。いくつかの実施形態において、分析物は、ポリヌクレオチド結合タンパク質などの酵素に結合し得る。分析物は、標的ポリヌクレオチド、ポリペプチド、リガンド、または疎水性分子であり得る。
本開示の別の態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法を提供する。本方法は、(a)水溶液中に、本明細書に記載の任意の実施形態による修飾セクレチンナノポアおよび膜を提供することであって、修飾セクレチンナノポアは膜中に存在する、上記提供することと、(b)工程(a)の水溶液中に標的ポリヌクレオチドを添加することと、(c)ナノポアにわたって電位を印加している間に、修飾セクレチンナノポアを通るイオンフローを測定することであって、イオンフローの測定値は標的ポリヌクレオチドの1つ以上の特徴を示す、上記測定することと、を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは水溶液のシス側に添加される。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは水溶液のトランス側に添加される。いくつかの実施形態において、水溶液は、本明細書に記載の装置の一実施形態に存在する。
核酸等のポリヌクレオチドは、2つ以上のヌクレオチドを含む高分子である。ポリヌクレオチドまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組み合わせを含み得る。ヌクレオチドは、天然であっても人工であってもよい。ポリヌクレオチド中の1つ以上のヌクレオチドは、酸化またはメチル化されてもよい。ポリヌクレオチド中の1つ以上のヌクレオチドは、損傷していてもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、ピリミジンダイマーを含んでもよい。かかるダイマーは、典型的には、紫外線による損傷に関連付けられ、皮膚メラノーマの主因である。ポリヌクレオチド中の1つ以上のヌクレオチドは、例えば標識またはタグによって修飾され得る。好適な標識は、以下に記載される。ポリヌクレオチドは、1つ以上のスペーサを含み得る。
本方法は、ポリヌクレオチドの2、3、4、または5つ以上の特徴を測定することを伴い得る。1つ以上の特徴は、好ましくは、(i)ポリヌクレオチドの長さ、(ii)ポリヌクレオチドの同一性、(iii)ポリヌクレオチドの配列、(iv)ポリヌクレオチドの二次構造、および(v)ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される。{i}、{ii}、{iii}、{iv}、{v}、{i,ii}、{i,iii}、{i,iv}、{i,v}、{ii,iii}、{ii,iv}、{ii,v}、{iii,iv}、{iii,v}、{iv,v}、{i,ii,iii}、{i,ii,iv}、{i,ii,v}、{i,iii,iv}、{i,iii,v}、{i,iv,v}、{ii,iii,iv}、{ii,iii,v}、{ii,iv,v}、{iii,iv,v}、{i,ii,iii,iv}、{i,ii,iii,v}、{i,ii,iv,v}、{i,iii,iv,v}、{ii,iii,iv,v}、または{i,ii,iii,iv,v}などの(i)~(v)のうちの任意の組み合わせが本明細書に記載の方法に従って測定され得る。(i)~(v)の異なる組み合わせは、第2のポリヌクレオチドと比較して、第1のポリヌクレオチドについて測定され得、上記に列挙された組み合わせのいずれかが含まれる。
いくつかの実施形態において、分析物(例えば標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチド)を特徴付ける方法は、酵素が分析物(例えば、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチド)に結合するように、ポリヌクレオチド結合タンパク質などの酵素を分析物を含む水溶液中に添加することを含み得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド結合タンパク質などの酵素への分析物(例えば標的ポリヌクレオチド)の結合は、修飾セクレチンナノポアを通る分析物(例えば標的ポリヌクレオチド)の移動を制御し、それによって分析物(例えば標的ポリヌクレオチド)を特徴付ける。いくつかの実施形態において、リガンド結合タンパク質などの酵素に結合する分析物(例えば、標的ポリペプチドまたはリガンド)の移動を測定して、分析物を検出し、および/または分析物と酵素との相互作用を特徴付けることができる。
一実施形態において、本方法は、
(a)ポリヌクレオチドに結合した1つ以上のヘリカーゼおよび1つ以上の分子ブレーキを有するポリヌクレオチドを提供することと、
(b)膜中に存在する修飾セクレチンナノポアを含む低イオン強度溶液中にポリヌクレオチドを添加し、1つ以上のヘリカーゼおよび1つ以上の分子ブレーキが一緒となり、その両方がポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するように、ポアにわたって電位を印加することと、
(c)ナノポアにわたって電位を印加している間に、ポリヌクレオチドがポアに対して動くときに修飾セクレチンナノポアを通るイオンフローを測定することであって、イオンフローの測定値はポリヌクレオチドの1つ以上の特徴を示す、上記測定し、それによってポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む。この種の方法は、国際出願第PCT/GB2014/052737号(WO2015/110777として公開)に詳細に論じられており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の修飾セクレチンナノポアは、膜中に存在し得る。分析物(例えば、標的ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはリガンド)を特徴付ける方法において、分析物(例えば、標的ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはリガンド)を、典型的には、膜中の修飾セクレチンナノポアと接触させる。任意の膜を使用し得る。好適な膜は、当該技術分野で周知である。膜は、好ましくは、両親媒性層である。両親媒性層は、親水および親油特性の両方を有する、リン脂質などの両親媒性分子から形成された層である。両親媒性分子は、合成または天然であり得る。非天然型両親媒性物質および単分子層を形成する両親媒性物質は、当該技術分野で既知であり、例えば、ブロックコポリマー(Gonzalez-Perez et al.,Langmuir,2009,25,10447-10450)が含まれる。ブロックコポリマーは、2つ以上のモノマーサブユニットが共に重合されて単一ポリマー鎖を作成する、ポリマー材料である。ブロックコポリマーは、典型的には、各モノマーサブユニットによって寄与される特性を有する。しかしながら、ブロックコポリマーは、個々のサブユニットから形成されたポリマーが保有しない固有の特性を有し得る。ブロックコポリマーは、モノマーサブユニットのうちの1つが疎水性または親油性である一方で他のサブユニット(複数可)が水性媒体中で親水性であるように操作することができる。この場合、ブロックコポリマーは、両親媒性特性を保有し得、生体膜を模倣する構造を形成し得る。ブロックコポリマーは、ジブロック(2つのモノマーサブユニットからなる)であり得るが、3つ以上のモノマーサブユニットから構築されて、両親媒性物質として挙動するより複雑な配置でもあり得る。コポリマーは、トリブロック、テトラブロック、またはペンタブロックコポリマーであってもよい。膜は、好ましくは、トリブロックコポリマー膜である。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは二本鎖であり得る。ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、本方法は、好ましくは、接触工程の前に、ヘアピンアダプターをポリヌクレオチドの一末端にライゲーションすることをさらに含む。次いで、ポリヌクレオチドが本明細書に記載の修飾セクレチンナノポアと接触もしくは相互作用するときにまたはその前に、ポリヌクレオチドの2本の鎖を分離し得る。2本の鎖は、ポアを通るポリヌクレオチドの移動が、ヘリカーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質または分子ブレーキによって制御される間に分けられてもよい。これは、国際出願第PCT/GB2012/051786号(WO2013/014451として公開)に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。このようにして二本鎖構造体の両方の鎖を結び付け、調べることにより、特徴付けの効率および精度が増す。
好ましい実施形態において、標的二本鎖ポリヌクレオチドは、一末端にヘアピンループアダプターを提供され、本方法は、該ポリヌクレオチドの両方の鎖がポアを通って移動するように該ポリヌクレオチドを本明細書に記載の修飾セクレチンナノポアのいずれか1つと接触させることと、該ポリヌクレオチドの両方の鎖がポアに対して移動するときに1つ以上の測定値を取ることであって、測定値は該ポリヌクレオチド鎖の1つ以上の特徴を示す、上記測定値を取り、これによって、該標的二本鎖ポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む。上記の実施形態のいずれも、この実施形態に同等に適用される。
接触工程前に、本方法は、好ましくは、ポアに優先的に入るリーダー配列をポリヌクレオチドに結合させることを含む。リーダー配列は本明細書に記載の方法のいずれかを容易にする。リーダー配列は、本明細書に記載の修飾セクレチンナノポアのいずれか1つに優先的に入り、それによってナノポアを通るポリヌクレオチドの移動を容易にするように設計される。リーダー配列を使用して、上記のようにポリヌクレオチドを1つ以上のアンカーに結合することもできる。
特徴付けの前に、ポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して修飾ポリヌクレオチドを形成する条件下でポリヌクレオチドをポリメラーゼおよび遊離ヌクレオチドの集団と接触させることにより、標的ポリヌクレオチドを修飾してもよく、ポリメラーゼは、修飾ポリヌクレオチドを形成するときに標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチド種のうちの1つ以上を異なるヌクレオチド種で置換する。修飾ポリヌクレオチドは次いで、ポリヌクレオチドに結合した1つ以上のヘリカーゼ、およびポリヌクレオチドに結合した1つ以上の分子ブレーキを提供される。この種の修飾は、国際出願第PCT/GB2015/050483号に記載され、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。上記のポリメラーゼのいずれかを使用することができる。
別の実施形態において、ポリメラーゼがヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込むときに放出される標識種を検出することによって、ポリヌクレオチドは特徴付けされる。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドを鋳型として使用する。各標識種は、各ヌクレオチドに特異的である。ヌクレオチドがポリメラーゼによってポリヌクレオチド(複数可)に付加されるときにリン酸標識種が順次放出されるように、ポリヌクレオチドを本明細書に記載の修飾セクレチンナノポア、ポリメラーゼ、および標識ヌクレオチドと接触させ、リン酸種は各ヌクレオチドに特異的な標識を含有する。ポリメラーゼは、上記のもののいずれかであり得る。リン酸標識種はポアを使用して検出され、それによりポリヌクレオチドを特徴付ける。この種類の方法は、欧州出願第13187149.3号(EP2682460として公開)に開示されている。上記に論じられる実施形態のいずれかを、この方法に等しく適用する。
検出または特徴付けされる分析物を含む任意の好適な試料を本明細書に記載の任意の方法のいずれかに供し得る。本明細書に記載の方法は、分析物を含むことが既知であるかまたは分析物を含むことが疑われる2つ以上の試料に対して実施され得る。あるいは、本方法は、試料中の存在が既知であるかまたは予想される2つ以上の分析物の同一性を確認するために、2つ以上の試料に対して実施され得る。いくつかの実施形態において、本方法は、二本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖ポリヌクレオチドから区別するために試料に対して実施され得る。
本開示の別の態様はまた、例えば標的ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはリガンドなどの標的分析物を特徴付けるためのキットを提供する。キットは、本明細書に記載の修飾セクレチンナノポアのうちのいずれか1つおよび膜の成分を含む。膜は、好ましくは、構成要素から形成される。修飾セクレチンナノポアは、好ましくは膜中に存在する。キットは、上に開示される膜、例えば両親媒性層またはトリブロックコポリマー膜のいずれかの構成要素を含み得る。
本明細書に記載の別の態様は、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはリガンドなどの標的分析物を特徴付けるための装置も提供する。装置は、本明細書に記載の複数の修飾セクレチンナノポアおよび複数の膜を含む。いくつかの実施形態において、複数の修飾セクレチンナノポアは複数の膜中に存在する。いくつかの実施形態において、修飾セクレチンナノポアおよび膜の数は等しい。一実施形態において、単一の修飾セクレチンナノポアが各膜中に存在する。
C末端ヘキサ-ヒスチジン(His)タグを有する修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチド(例えば、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30またはそれ以上、および最大50の本明細書に記載のアミノ酸修飾)を有する配列番号1または2に記載のアミノ酸配列)をコードする遺伝子を含有するアンピシリン耐性pT7ベクター、およびInvHタンパク質(InvGの発現を増強する20Kdタンパク質)をコードする遺伝子を含有するカナマイシン耐性pRhamベクターを、C43 DE3 pLysS細胞に共形質転換し、アンピシリン(100μg/ml)およびカナマイシン(30μg/ml)の両方を含有する寒天プレート上でプレートアウトし(plated out)、37℃で一晩増殖させた。単一コロニーを使用して、アンピシリン(100μg/ml)およびカナマイシン(30μg/ml)の両方を含有するTB培地の100mlのスターター培養物を播種した。培養物を250rpm、37℃で18時間増殖させた。15mlのスターター培養物を使用して、アンピシリン(100μg/ml)およびカナマイシン(30μg/ml)の両方を含有する500mlのTB培地に播種し、600nmのODが0.6に達するまで培養物を250rpm、37℃で増殖させた。温度を18℃に下げ、培養物を1時間低温にして平衡化させた。IPTGを0.5mMの最終濃度まで添加し、ラムノースを0.2%まで添加してタンパク質生成を誘導した。培養物を250rpm、18℃で18時間インキュベートした。培養物を6000gで20分の遠心分離により採集した。細胞ペレットを、ペレット1gあたり7.5mlの25mM HEPES、500mM NaCl、15mMイミダゾール、プロテアーゼ阻害剤、25単位/mlベンゾナーゼヌクレアーゼ、0.01%DDM(pH7.5)に再懸濁することによって溶解し、均一になるまで混合した。次いで、再懸濁したペレットを超音波処理(20秒間オンを15サイクル/20秒間オフを15サイクル)により溶解した。溶解物を50,000gで1時間の遠心分離により分離した。上清を0.22μmフィルターを通して濾過し、1mLのHisトラップ粗製カラムに適用した。25mM HEPES、500mM NaCl、15mMイミダゾール、0.01%DDM(pH7.5)をローディング緩衝液として使用し、25mM HEPES、500mM NaCl、75mMイミダゾール、0.01%DDM(pH7.5)を洗浄緩衝液として使用し、25mM HEPES、500mM NaCl、500mMイミダゾール、0.01%DDM(pH7.5)を溶出緩衝液として使用し、製造業者の指示書に従ってAKTAシステムによってタンパク質を精製した。
タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ切断部位などのエンドペプチダーゼ切断部位を含む、C末端ヘキサ-ヒスチジン(His)タグを有する修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチド(例えば、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30またはそれ以上、および最大50の本明細書に記載のアミノ酸修飾)を有する配列番号3に記載のアミノ酸配列)をコードする遺伝子を含有するアンピシリン耐性pT7ベクターをC43 DE3 pLysS細胞に形質転換し、アンピシリン(100μg/ml)を含有する寒天プレートでプレートアウトした。単一コロニーを用いて、アンピシリン(100μg/ml)を含有するTB培地の100mlのスターター培養物を播種した。培養物を250rpm、37℃で18時間増殖させた。15mlのスターター培養物を使用して、アンピシリン(100μg/ml)を含む500mlのTB培地に接種し、600nmのODが0.6に達するまで250rpm、37℃で培養物を増殖させた。温度を18℃に下げ、培養物を1時間低温にして平衡化させた。IPTGを0.5mMの最終濃度まで添加してタンパク質生成を誘導した。培養物を250rpm、18℃で18時間インキュベートし、6000gで20分間の遠心分離によって採集した。細胞ペレットを、ペレット1gあたり7.5mlの25mM HEPES、500mM NaCl、15mMイミダゾール、プロテアーゼ阻害剤、25単位/mlベンゾナーゼヌクレアーゼ、および0.01%DDM(pH7.5)に再懸濁することによって溶解し、均一になるまで混合した。次いで、再懸濁したペレットを超音波処理(20秒間オンを15サイクル/20秒間オフを15サイクル)により溶解した。溶解物を50,000gで1時間の遠心分離により分離した。上清を0.22μmフィルターを通して濾過し、1mlのHisトラップ粗製カラムに適用した。25mM HEPES、500mM NaCl、15mMイミダゾール、および0.01%DDM(pH7.5)をローディング緩衝液として使用し、25mM HEPES、500mM NaCl、75mMイミダゾール、および0.01%DDM(pH7.5)を洗浄緩衝液として使用し、25mM HEPES、500mM NaCl、500mMイミダゾール、および0.01%DDM(pH7.5)を溶出緩衝液として使用して、製造業者の指示書に従ってAKTAシステムによってタンパク質を精製した。
配列番号32に示されるVibrio cholerae GspD配列を出発配列として使用して、GspD変異体を以下の表に示されるように設計した。
実験の設定は、2つの工程、i)単一のGspD変異体ナノポアが挿入されたバルクコポリマー膜の複数のウェルを含み、シーケンシングの準備ができたチップを調製すること、およびii)シーケンシングのためにチップに添加されるDNA試料を調製することを伴った。両工程の材料および方法を以下に説明する。
本明細書に開示される全ての特徴は任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示される各特徴は、同じ、同等、または類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。したがって、他に明示的に述べられていない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の同等または類似の特徴の一例にすぎない。
本発明のいくつかの実施形態を本明細書で記載および示してきたが、当業者は、機能を果たすための、ならびに/あるいは本明細書に記載の結果および/または1つ以上の利点を得るための様々な他の手段および/または構造を想定し、そのような変形および/または改変のそれぞれは、本明細書に記載の本発明の実施形態の範囲内にあるとみなされる。より一般には、当業者は、本明細書に記載の全てのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および/または構成は本発明の教示が使用される特定の用途に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載の特定の本発明の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常を超えない実験を使用して確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は例示としてのみ提示されており、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、本発明は具体的に記載されおよび特許請求の範囲に記載されている以外にも実施され得ることを理解すべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載のそれぞれの個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および/または方法に関する。さらに、2つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、および/または方法のうちの任意の組み合わせは、そのような特徴、システム、物品、材料、および/または方法が互いに矛盾しない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
[1]
膜中に配置された修飾セクレチンナノポアであって、前記修飾セクレチンナノポアはシス開口部とトランス開口部との間で前記膜を通って延在する内腔を画定する内腔表面を含み、前記内腔表面が1つ以上のアミノ酸修飾を含む、修飾セクレチンナノポア。
[2]
前記1つ以上のアミノ酸修飾が、荷電改変修飾を含む、上記[1]に記載の修飾セクレチンナノポア。
[3]
前記荷電改変修飾が、正に荷電したアミノ酸での負に荷電したアミノ酸の置換である、上記[2]に記載の修飾セクレチンナノポア。
[4]
前記1つ以上のアミノ酸修飾が、疎水性アミノ酸での中性アミノ酸の置換を含む、上記[1]または[2]に記載の修飾セクレチンナノポア。
[5]
前記シス開口部が、60Å~120Åの範囲の直径を有する、上記[1]~[4]のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
[6]
前記トランス開口部が、40Å~100Åの範囲の直径を有する、上記[1]~[5]のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
[7]
前記セクレチンナノポアが、約7.5Å~25Åの直径を有する狭窄部を含む、上記[1]~[6]のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
[8]
前記セクレチンがII型分泌系である、上記[1]~[7]のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
[9]
前記セクレチンがGspDである、上記[8]に記載の修飾セクレチンナノポア。
[10]
配列番号36に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含むサブユニットポリペプチドを含む、上記[9]に記載の修飾セクレチンナノポア。
[11]
配列番号34または35に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含む、上記[9]または[10]に記載の修飾セクレチンナノポア。
[12]
前記GspDがキャップゲートを含まない、上記[9]~[11]のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
[13]
前記GspDの中央ゲートが、アミノ酸をより小さな側基を有するアミノ酸で置換するように、かつ/または負に荷電したアミノ酸を中性アミノ酸もしくは正に荷電したアミノ酸で置換するように修飾されている、上記[9]~[12]のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
[14]
配列番号36に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含むサブユニットポリペプチドを含み、(i)D55もしくはT56~T77のアミノ酸の全部もしくは一部が欠失もしくは置換され、K60、D64、R71、およびE73のうちの1つ以上が荷電していないアミノ酸で置換され、ならびに/またはD55、T56、T77、およびK78のうちの1つ以上がPで置換され、かつ/あるいは(ii)F156がより小さいアミノ酸で置換され、N151および/またはN152がより小さいアミノ酸で置換され、D153が荷電していないアミノ酸で置換され、G137およびG165がそれぞれ独立して未修飾であるかまたはAもしくはVで置換されている、上記[13]に記載の修飾セクレチンナノポア。
[15]
Y63~R71が欠失されおよび/またはGSGもしくはSGSで置換され、F156がAで置換され、D153がSで置換され、かつ/あるいはN151およびN152がそれぞれ独立してGまたはSで置換されている、上記[14]に記載の修飾セクレチンナノポア。
[16]
前記セクレチンがIV型分泌系である、上記[1]~[7]のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
[17]
前記セクレチンがPilQである、上記[16]に記載の修飾セクレチンナノポア。
[18]
前記セクレチンがIII型分泌系である、上記[1]~[7]のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
[19]
前記セクレチンがYscCである、上記[18]に記載の修飾セクレチンナノポア。
[20]
前記セクレチンがInvGである、上記[18]に記載の修飾セクレチンナノポア。
[21]
(N1またはN0ドメインを有しないInvGのアミノ酸配列に対応する)配列番号1に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含む、上記[20]に記載の修飾セクレチンナノポア。
[22]
前記内腔表面が、前記内腔内の狭窄部をさらに画定し、前記狭窄部が、配列番号1のアミノ酸D28、E225、R226、および/またはE231において1つ以上のアミノ酸修飾(例えば、荷電改変修飾)を有する、上記[20]または[21]に記載の修飾セクレチンナノポア。
[23]
前記狭窄部の前記1つ以上のアミノ酸修飾(例えば、荷電改変修飾)が、以下のうちの1つ以上を含む、上記[22]に記載の修飾セクレチンナノポア:
i.D28N/Q/T/S/G/R/K、
ii.E225N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/R/K、
iii.R226N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/K/V、
iv.E225の欠失、
v.R226の欠失、および
vi.E231N/Q/T/A/S/G/P/H/R/K。
[24]
前記内腔表面が、アミノ酸E41、Q45、またはE114において1つ以上のアミノ酸修飾を有する捕捉部分を含む、上記[20]~[22]のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポア。
[25]
前記捕捉部分が、以下のアミノ酸修飾のうちの1つ以上を含む、上記[24]に記載の修飾セクレチンナノポア:
i.Q45R/K、
ii.E41N/Q/T/S/G/R/K、および
iii.E114N/Q/T/S/G/R/K。
[26]
(N1またはN0ドメインを有しないInvGのアミノ酸配列に対応する)配列番号1に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、修飾InvGナノポアサブユニットポリペプチドであって、前記修飾InvGナノポアサブユニットポリペプチドが、配列番号1のD28、E41、E114、Q45、E225、R226、およびE231から選択されるアミノ酸(複数可)において1つ以上のアミノ酸修飾(例えば、荷電改変アミノ酸修飾)を含む、修飾InvGナノポアサブユニットポリペプチド。
[27]
前記1つ以上のアミノ酸修飾(例えば、荷電改変アミノ酸修飾)が、以下のうちの1つ以上を含む、上記[26]に記載の修飾InvGナノポアサブユニットポリペプチド:
i.D28N/Q/T/S/G/R/K、
ii.E225N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/R/K、
iii.R226N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/K/V、
iv.E225の欠失、
v.R226の欠失、および
vi.E231N/Q/T/A/S/G/P/H/R/K。
[28]
以下のアミノ酸修飾のうちの1つ以上を含む、上記[26]または[27]に記載の修飾InvGナノポアサブユニットポリペプチド:
i.Q45R/K、
ii.E41N/Q/T/S/G/R/K、および
iii.E114N/Q/T/S/G/R/K。
[29]
(N1およびN0ドメインを含むWT InvGのアミノ酸配列に対応する)配列番号2に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、修飾InvGナノポアサブユニットポリペプチドであって、前記修飾InvGナノポアサブユニットポリペプチドが、配列番号2のD199、E212、E285、Q216、E396、R397、およびE402から選択されるアミノ酸(複数可)において1つ以上のアミノ酸修飾(例えば、荷電改変アミノ酸修飾)を含み、かつ/またはエンドペプチダーゼ切断部位が配列番号2の170位と171位との間もしくは171位と172位との間に挿入されている、修飾InvGナノポアサブユニットポリペプチド。
[30]
前記1つ以上のアミノ酸修飾(例えば、荷電改変アミノ酸修飾)が、以下のうちの1つ以上を含む、上記[29]に記載の修飾InvGナノポアサブユニットポリペプチド:
i.D199N/Q/T/S/G/R/K、
ii.E396N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/R/K、
iii.R397N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/K/V、
iv.E396の欠失、
v.R397の欠失、および
vi.E402N/Q/T/A/S/G/P/H/R/K。
[31]
以下のアミノ酸修飾のうちの1つ以上を含む、上記[29]または[30]に記載の修飾InvGナノポアサブユニットポリペプチド:
i.Q216R/K、
ii.E212N/Q/T/S/G/R/K、および
iii.E285N/Q/T/S/G/R/K。
[32]
配列番号34に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含む、修飾GspDナノポアサブユニットポリペプチド。
[33]
配列番号33に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含む、上記[32]に記載の修飾GspDナノポアサブユニットポリペプチド。
[34]
前記GspDがキャップゲートを含まない、上記[32]または[33]に記載の修飾GspDナノポアサブユニットポリペプチド。
[35]
前記GspDの中央ゲートが、アミノ酸をより小さな側基を有するアミノ酸で置換するように、かつ/または負に荷電したアミノ酸を中性もしくは正に荷電したアミノ酸で置換するように修飾されている、上記[32]~[34]のいずれか一項に記載の修飾GspDナノポアサブユニットポリペプチド。
[36]
配列番号34に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含み、(i)D55もしくはT56~T77のアミノ酸の全部もしくは一部が欠失もしくは置換され、K59、K60、R63、Q66、Q69、K71、Q74、およびQ75のうちの1つ以上が荷電していないアミノ酸で置換され、ならびに/またはD55、T56、T57、およびK394のうちの1つ以上がPで置換され、かつ/あるいは(ii)F157がより小さいアミノ酸で置換され、N152および/またはN153がより小さいアミノ酸で置換され、D154が荷電していないアミノ酸で置換され、G453およびG481がそれぞれ独立して未修飾であるかまたはAもしくはVで置換されている、上記[32]~[35]のいずれか一項に記載の修飾GspDナノポアサブユニットポリペプチド。
[37]
Y379-GSG-R387またはY379-SGS-R387、F472A、D469S、N467G/N468S、N467S468G、N467G/N468S/D469Sである、上記[14]に記載の修飾セクレチンナノポア。
[38]
上記[26]~[31]のいずれか一項に記載の修飾InvGナノポアサブユニットポリペプチドまたは上記[32]~[37]のいずれか一項に記載の修飾GspDナノポアサブユニットポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
[39]
上記[26]~[31]のいずれか一項に記載の複数の修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドまたは上記[32]~[37]のいずれか一項に記載の複数の修飾GspDナノポアサブユニットポリペプチドを含む、修飾セクレチンナノポア。
[40]
9~20個の前記修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドを含む、上記[39]に記載の修飾セクレチンナノポア。
[41]
各モノマーが、上記[26]~[31]または[32]~[37]のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドである、上記[40]に記載の修飾セクレチンナノポア。
[42]
異なるモノマーを含み、前記モノマーのうちの少なくとも1つが上記[26]~[31]または[32]~[37]のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドである、上記[40]に記載の修飾セクレチンナノポア。
[43]
セクレチンナノポアを含む膜が内部に配置された水溶液を収容するチャンバを含む装置であって、前記セクレチンナノポアがシス開口部とトランス開口部との間で前記膜を通って延在する内腔を画定する内腔表面を含む、装置。
[44]
前記セクレチンナノポアが修飾セクレチンナノポアであり、前記内腔表面が1つ以上のアミノ酸修飾を含む、上記[43]に記載の装置。
[45]
前記修飾セクレチンナノポアが、上記[1]~[25]および[39]~[42]のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアである、上記[44]に記載の装置。
[46]
前記水溶液中に存在する分析物をさらに含む、上記[43]~[45]のいずれか一項に記載の装置。
[47]
前記分析物がポリヌクレオチドである、上記[46]に記載の装置。
[48]
前記ポリヌクレオチドに結合したポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含む、上記[47]に記載の装置。
[49]
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、ヘリカーゼ、エキソヌクレアーゼ、またはポリメラーゼである、上記[48]に記載の装置。
[50]
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記膜の前記シス側にある、上記[48]または[49]に記載の装置。
[51]
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記ナノポアの前記シス開口部と接触または共有結合している、上記[50]に記載の装置。
[52]
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記膜の前記トランス側にある、上記[48]または[49]に記載の装置。
[53]
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記ナノポアの前記トランス開口部と接触または共有結合している、上記[52]に記載の装置。
[54]
上記[43]~[45]のいずれか一項に記載の装置を得ることと、分析物を前記膜の前記シス側または前記トランス側で前記水溶液に添加することと、を含む、方法。
[55]
前記分析物がポリヌクレオチドである、上記[54]に記載の方法。
[56]
ポリヌクレオチド結合タンパク質を前記膜の前記シス側で前記水溶液に添加することをさらに含み、前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記ポリヌクレオチドに結合する、上記[55]に記載の方法。
[57]
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記ナノポアの前記シス開口部と接触もしくは共有結合しているか、または前記ナノポアのシス玄関部内にある、上記[56]に記載の方法。
[58]
ポリヌクレオチド結合タンパク質を前記膜の前記トランス側で前記水溶液に添加することをさらに含み、前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記ポリヌクレオチドに結合する、上記[55]に記載の方法。
[59]
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記ナノポアの前記トランス開口部と接触もしくは共有結合しているか、または前記ナノポアのトランス玄関部内にある、上記[58]に記載の方法。
[60]
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、ヘリカーゼ、エキソヌクレアーゼ、またはポリメラーゼである、上記[54]~[59]のいずれか一項に記載の方法。
[61]
前記膜にわたって電圧勾配を印加することによって前記ナノポアを通るイオン電流フローを誘導することをさらに含む、上記[54]~[60]のいずれか一項に記載の方法。
[62]
前記印加された電圧勾配下で前記ナノポアを通るイオン電流フローを検出することをさらに含む、上記[61]に記載の方法。
[63]
前記検出されたイオン電流フローに基づいて前記分析物の存在を決定することをさらに含む、上記[62]に記載の方法。
[64]
セクレチンナノポアおよび前記セクレチンナノポアのシスまたはトランス玄関部内に提供される酵素を含む、組成物。
[65]
前記セクレチンナノポアが野生型セクレチンナノポアである、上記[64]に記載の組成物。
[66]
前記セクレチンナノポアが修飾セクレチンナノポアである、上記[64]に記載の組成物。
[67]
前記修飾セクレチンナノポアが、上記[1]~[25]および[39]~[42]のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアである、上記[66]に記載の組成物。
[68]
前記ナノポアが、膜内に提供され、シス開口部とトランス開口部との間で前記膜を通って延在する、上記[64]~[67]のいずれか一項に記載の組成物。
[69]
分析物の検出および/または特徴付けのための、セクレチンナノポアの使用。
[70]
前記セクレチンナノポアが修飾セクレチンナノポアである、上記[69]に記載の使用。
[71]
前記修飾セクレチンナノポアが、上記[1]~[25]および[39]~[42]のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアである、上記[70]に記載の使用。
[72]
試料中の分析物の有無を検出し、かつ/または試料中の分析物を特徴付ける方法であって、膜中に配置されたセクレチンナノポアを前記試料と接触させることと、前記膜にわたって電圧勾配を印加することと、前記ナノポアを通るイオン電流フローを検出することと、を含む、方法。
[73]
前記セクレチンナノポアが修飾セクレチンナノポアである、上記[72]に記載の方法。
[74]
前記修飾セクレチンナノポアが、上記[1]~[25]および[39]~[42]のいずれか一項に記載の修飾セクレチンナノポアである、上記[73]に記載の使用。
Claims (16)
- 試料中の分析物の有無を検出し、かつ/または試料中の分析物を特徴付ける方法であって、前記方法は、
膜中に配置されたセクレチンナノポアを前記試料と接触させることと、前記膜にわたって電圧勾配を印加することと、前記ナノポアを通るイオン電流フローを検出することと、を含み、
ここで、前記セクレチンナノポアは、1つ以上の荷電改変アミノ酸修飾を含む修飾セクレチンナノポアであり、前記1つ以上の荷電改変修飾は、中性アミノ酸または正に荷電したアミノ酸での負に荷電したアミノ酸の置換を含み、
前記修飾セクレチンナノポアは、修飾GspDであり、
前記修飾セクレチンナノポアは、配列番号34に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含み、ここで、
(i)D117もしくはT118~T139のアミノ酸の全部もしくは一部が欠失もしくは置換され、K122、D126、R133、およびE135のうちの1つ以上が荷電していないアミノ酸で置換され、ならびに/またはD117、T118、T139、およびK140のうちの1つ以上がPで置換されている;かつ/または
(ii)F218がより小さいアミノ酸で置換され、N213および/またはN214がより小さいアミノ酸で置換され、D215が荷電していないアミノ酸で置換され、G199およびG227がそれぞれ独立して未修飾であるかまたはAもしくはVで置換されている;かつ/または
(iii)前記セクレチンナノポアの内腔からのセクレチンサブユニットポリペプチドが、
- Y125-GSG-R133またはY125-SGS-R133、
- F218A、
- D215S、
- N213G/N214S、
- N213S/N214G、または
- N213G/N214S/D215Sを含む、方法。 - 前記修飾セクレチンナノポアが、シス開口部とトランス開口部との間で前記膜を通って延在する内腔を画定する内腔表面を含み、前記内腔表面が1つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項1に記載の方法。
- - 前記シス開口部が、60Å~120Åの範囲の直径を有する;および/または
- 前記トランス開口部が、40Å~100Åの範囲の直径を有する;および/または
- 前記修飾セクレチンナノポアが、約7.5Å~25Åの直径を有する狭窄部を含む、請求項2に記載の方法。 - 前記荷電改変修飾が、正に荷電したアミノ酸での負に荷電したアミノ酸の置換である、請求項1に記載の方法。
- 前記修飾セクレチンナノポアが、疎水性アミノ酸での中性アミノ酸の置換を含む1つ以上のアミノ酸修飾をさらに含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- (i)前記GspDがキャップゲートを含まない、および/または
(ii)前記GspDの中央ゲートが、アミノ酸をより小さな側基を有するアミノ酸で置換するように、かつ/または負に荷電したアミノ酸を中性アミノ酸もしくは正に荷電したアミノ酸で置換するように修飾されている、
請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。 - 複数の修飾セクレチンナノポアサブユニットポリペプチドを含む、修飾セクレチンナノポアであって、
前記修飾セクレチンナノポアは、修飾GspDであり、
前記修飾セクレチンナノポアは、配列番号34に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含み、ここで、
(i)D117もしくはT118~T139のアミノ酸の全部もしくは一部が欠失もしくは置換され、K122、D126、R133、およびE135のうちの1つ以上が荷電していないアミノ酸で置換され、ならびに/またはD117、T118、T139、およびK140のうちの1つ以上がPで置換されている;かつ/または
(ii)F218がより小さいアミノ酸で置換され、N213および/またはN214がより小さいアミノ酸で置換され、D215が荷電していないアミノ酸で置換され、G199およびG227がそれぞれ独立して未修飾であるかまたはAもしくはVで置換されている;かつ/または
(iii)前記セクレチンナノポアの内腔からのセクレチンサブユニットポリペプチドが、
- Y125-GSG-R133またはY125-SGS-R133、
- F218A、
- D215S、
- N213G/N214S、
- N213S/N214G、または
- N213G/N214S/D215Sを含む、修飾セクレチンナノポア。 - 請求項7に記載の修飾セクレチンナノポアをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
- 修飾セクレチンナノポアをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドであって、
前記修飾セクレチンナノポアは、修飾GspDであり、
前記修飾セクレチンナノポアは、配列番号34に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含み、ここで、
(i)D117もしくはT118~T139のアミノ酸の全部もしくは一部が欠失もしくは置換され、K122、D126、R133、およびE135のうちの1つ以上が荷電していないアミノ酸で置換され、ならびに/またはD117、T118、T139、およびK140のうちの1つ以上がPで置換されている;かつ/または
(ii)F218がより小さいアミノ酸で置換され、N213および/またはN214がより小さいアミノ酸で置換され、D215が荷電していないアミノ酸で置換され、G199およびG227がそれぞれ独立して未修飾であるかまたはAもしくはVで置換されている;かつ/または
(iii)前記セクレチンナノポアの内腔からのセクレチンサブユニットポリペプチドが、
- Y125-GSG-R133またはY125-SGS-R133、
- F218A、
- D215S、
- N213G/N214S、
- N213S/N214G、または
- N213G/N214S/D215Sを含む、ポリヌクレオチド。 - 修飾セクレチンナノポアを含む膜が内部に配置された水溶液を収容するチャンバを含む装置であって、前記修飾セクレチンナノポアがシス開口部とトランス開口部との間で前記膜を通って延在する内腔を画定する内腔表面を含み、
前記修飾セクレチンナノポアは、修飾GspDであり、
前記修飾セクレチンナノポアは、配列番号34に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含み、ここで、
(i)D117もしくはT118~T139のアミノ酸の全部もしくは一部が欠失もしくは置換され、K122、D126、R133、およびE135のうちの1つ以上が荷電していないアミノ酸で置換され、ならびに/またはD117、T118、T139、およびK140のうちの1つ以上がPで置換されている;かつ/または
(ii)F218がより小さいアミノ酸で置換され、N213および/またはN214がより小さいアミノ酸で置換され、D215が荷電していないアミノ酸で置換され、G199およびG227がそれぞれ独立して未修飾であるかまたはAもしくはVで置換されている;かつ/または
(iii)前記セクレチンナノポアの内腔からのセクレチンサブユニットポリペプチドが、
- Y125-GSG-R133またはY125-SGS-R133、
- F218A、
- D215S、
- N213G/N214S、
- N213S/N214G、または
- N213G/N214S/D215Sを含む、装置。 - 前記水溶液中に存在する分析物をさらに含む、請求項10に記載の装置。
- 前記分析物がポリヌクレオチドである、請求項11に記載の装置。
- 前記ポリヌクレオチドに結合したポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含む、請求項12に記載の装置。
- 前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、ヘリカーゼ、エキソヌクレアーゼ、またはポリメラーゼである、請求項13に記載の装置。
- 前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記ナノポアの前記シス開口部またはトランス開口部と接触または共有結合している、請求項13に記載の装置。
- 分析物の検出および/または特徴付けのための、修飾セクレチンナノポアの使用であって、
前記修飾セクレチンナノポアは、修飾GspDであり、
前記修飾セクレチンナノポアは、配列番号34に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するセクレチンドメインを含み、ここで、
(i)D117もしくはT118~T139のアミノ酸の全部もしくは一部が欠失もしくは置換され、K122、D126、R133、およびE135のうちの1つ以上が荷電していないアミノ酸で置換され、ならびに/またはD117、T118、T139、およびK140のうちの1つ以上がPで置換されている;かつ/または
(ii)F218がより小さいアミノ酸で置換され、N213および/またはN214がより小さいアミノ酸で置換され、D215が荷電していないアミノ酸で置換され、G199およびG227がそれぞれ独立して未修飾であるかまたはAもしくはVで置換されている;かつ/または
(iii)前記セクレチンナノポアの内腔からのセクレチンサブユニットポリペプチドが、
- Y125-GSG-R133またはY125-SGS-R133、
- F218A、
- D215S、
- N213G/N214S、
- N213S/N214G、または
- N213G/N214S/D215Sを含む、使用。
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