JP7237586B2 - 修飾ナノポア、それを含む組成物およびその使用 - Google Patents
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Description
この出願は、2015年12月8日に出願された米国仮出願第62/264,709号の米国特許法第119(e)条に基づく利益を主張し、この仮出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の一態様は、修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドを提供する。修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドは、その配列が参照ClyAアミノ酸配列とは異なっているポリペプチドである。修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドのアミノ酸配列は、(i)cis開口部形成アミノ酸配列、(ii)中間部形成アミノ酸配列、および(iii)trans開口部形成アミノ酸配列を含む。cis開口部形成アミノ酸配列は、修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドが他のサブユニットポリペプチドと相互作用して、膜にナノポアを形成するときの、ナノポアのcis開口部の部位を形成するアミノ酸配列の一部である。中間部形成アミノ酸配列は、修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドが他のサブユニットポリペプチドと相互作用して膜にナノポアを形成するときのナノポアの中間部の部位を形成するアミノ酸配列の部分である。trans開口部形成アミノ酸配列は、修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドが他のサブユニットポリペプチドと相互作用して、膜にナノポアを形成するときのナノポアのtrans開口部の部位を形成するアミノ酸配列の部分である。ClyAナノポアのcis部分、中間部およびtrans部分に対応するClyAアミノ酸配列の部分を同定する方法は、当技術分野で公知であり、実施例にも記載されている。例えば、部分が膜に埋め込まれたナノポアは、例えば、Humphrey et al., "VMD: Visual Molecular Dynamics" J. Mol. Graphics (1996) 14: 33-38に記載のVMD、および例えばPhillips et al., "Scalable Molecular Dynamics with NAMD" J. Comput. Chem. (2005) 26: 1781-1802に記載のNAMDを使用して、公知のClyA構造からホモロジーモデリングによって構築することができる。例えば、図1Aを参照。
本明細書において、本明細書に記載される修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドのいずれか1つをコードするポリヌクレオチド配列も提供される。
本開示の一態様は、例えば、修飾ClyAナノポアへの負に荷電したポリマー(例えば、DNAまたはRNAなどのポリヌクレオチド)の捕捉および/または修飾ClyAナノポアを通じた負に荷電したポリマーの移行を可能にする修飾ClyAナノポアを特色とする。修飾ClyAナノポアは、第1の開口部と、中間部と、第2の開口部と、第1の開口部から中間部を通じて第2の開口部に延びる内腔とを含み、ここで第1の開口部の内腔表面は第1の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、中間部の内腔表面は第2の正に荷電したアミノ酸の置換を含む。第2の開口部の内腔表面は負に帯電したくびれを画定する。第1の正に荷電したアミノ酸の置換および第2の荷電アミノ酸の置換は、上記の「修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチド」の項目に詳細に記載されている。
同一の修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドを含むホモ多量体ナノポアも本明細書で提供される。ホモ多量体ナノポアは、本明細書に記載の修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドのいずれかの実施形態を含みうる。ホモ多量体ナノポアは、ポリヌクレオチドを特徴付けるために、例えばシーケンシングのために、および/または一本鎖ポリヌクレオチド対二本鎖ポリヌクレオチドの存在もしくは非存在を検出するために使用することができる。本明細書に記載のホモ多量体ナノポアは、上記に説明した利点のいずれかを有しうる。
少なくとも1つの修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドを含むヘテロ多量体ナノポアも本明細書で提供される。ヘテロ多量体ナノポアは、ポリヌクレオチドを特徴付けるために、例えばシーケンシングのために、および/または一本鎖ポリヌクレオチド対二本鎖ポリヌクレオチドの存在もしくは非存在を検出するために、使用することができる。ヘテロ多量体ナノポアは、当技術分野で公知の方法(例えば、Protein Sci. 2002 Jul; 11(7):1813-24)を使用して作製することができる。
本開示の別の態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法を提供する。方法は、(a)約50mMから約1Mの低イオン強度溶液に、本明細書に記載のいずれかの実施形態による修飾ClyAナノポアと、膜とを供給するステップであり、ここで修飾ClyAナノポアは膜に存在する、ステップと、(b)ステップ(a)の低イオン強度溶液に標的ポリヌクレオチドを添加するステップと、(c)ナノポアにわたり電位を印加する間に、修飾ClyAナノポアを流れるイオン流を測定するステップであり、ここでイオン流の測定は、標的ポリヌクレオチドの1つまたは複数の特徴の指標となる、ステップとを含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、低イオン強度溶液のcis側に添加される。
ポリヌクレオチド、例えば核酸は、2つ以上のヌクレオチドを含む巨大分子である。ポリヌクレオチドまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組合せを含みうる。ヌクレオチドは、天然のものであっても人工的なものであってもよい。ポリヌクレオチドにおける1つまたは複数のヌクレオチドは、酸化またはメチル化されてもよい。ポリヌクレオチドにおける1つまたは複数のヌクレオチドは、損傷していてもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、ピリミジン二量体を含みうる。そのような二量体は、通常、紫外線による損傷と関連しており、皮膚の黒色腫の主因である。ポリヌクレオチドにおける1つまたは複数のヌクレオチドは、例えば、標識またはタグで修飾されていてもよい。適切な標識は、以下に記載されている。ポリヌクレオチドは、1つまたは複数のスペーサーを含んでもよい。
各分析物は、通常、任意の適切な試料中に存在する。方法は、分析物を含有することが既知のまたは分析物を含有する疑いのある2つ以上の試料に対して実施してもよい。代替的に、方法は、試料中の存在が既知のまたは予測される2つ以上の分析物の同一性を確認するために、2つ以上の試料に対して実施されてもよい。一部の実施形態では、方法は、一本鎖ポリヌクレオチドから二本鎖ポリヌクレオチドを区別するために、試料に対して実施してもよい。
方法は、ポリヌクレオチドの2つ、3つ、4つ、または5つ以上の特徴を測定することを含んでもよい。1つまたは複数の特徴は、好ましくは(i)ポリヌクレオチドの長さ、(ii)ポリヌクレオチドの同一性、(iii)ポリヌクレオチドの配列、(iv)ポリヌクレオチドの二次構造、および(v)ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される。(i)から(v)の任意の組合せ、例えば、{i}、{ii}、{iii}、{iv}、{v}、{i,ii}、{i,iii}、{i,iv}、{i,v}、{ii,iii}、{ii,iv}、{ii,v}、{iii,iv}、{iii,v}、{iv,v}、{i,ii,iii}、{i,ii,iv}、{i,ii,v}、{i,iii,iv}、{i,iii,v}、{i,iv,v}、{ii,iii,iv}、{ii,iii,v}、{ii,iv,v}、{iii,iv,v}、{i,ii,iii,iv}、{i,ii,iii,v}、{i,ii,iv,v}、{i,iii,iv,v}、{ii,iii,iv,v}または{i,ii,iii,iv,v}が、本明細書に記載の方法に従って測定されうる。上記の組合せのいずれかを含め、(i)から(v)の様々な組合せが、第1のポリヌクレオチドに対して、第2のポリヌクレオチドと比較して測定されてもよい。
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための方法は、ポリヌクレオチド結合タンパク質が標的ポリヌクレオチドに結合し、修飾ClyAナノポアを通じた標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、ポリヌクレオチド結合タンパク質を低イオン強度溶液に添加するステップを含むことができる。
一実施形態では、方法は、
(a)ポリヌクレオチドに、ポリヌクレオチドに結合する1つまたは複数のヘリカーゼと1つまたは複数の分子ブレーキとを供給するステップと、
(b)1つまたは複数のヘリカーゼと1つまたは複数の分子ブレーキとが一緒になり、両方ともポリヌクレオチドのポアを通じた移動を制御するように、膜に存在する修飾ClyAナノポアを含む低イオン強度溶液に、ポリヌクレオチドを添加し、ポアにわたり電位を印加するステップと、
(c)ナノポアにわたり電位を印加する間、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときの修飾ClyAナノポアを流れるイオン流を測定するステップであり、ここでイオン流の測定は、ポリヌクレオチドの1つまたは複数の特徴の指標であり、それによってポリヌクレオチドが特徴付けられる、ステップとを含む。この種の方法は、国際出願番号PCT/GB2014/052737に詳細に説明されている。
本明細書に記載の修飾ClyAナノポアは、膜に存在しうる。ポリヌクレオチドを特徴付ける方法では、ポリヌクレオチドは、通常、膜にある修飾ClyAナノポアと接触する。任意の膜が使用されうる。適切な膜は、当技術分野で周知である。膜は、好ましくは、両親媒性層である。両親媒性層は、親水性および親油性特性の両方を有する、リン脂質などの両親媒性分子から形成される層である。両親媒性分子は、合成されたものでも天然に存在するものであってもよい。単層を形成する非天然両親媒性物質および両親媒性物質は、当技術分野において公知であり、例えば、ブロックコポリマー(Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450)が挙げられる。ブロックコポリマーは、一緒に重合化される2つ以上のモノマーサブユニットが単一のポリマー鎖を生成するポリマー材料である。ブロックコポリマーは、通常、各モノマーサブユニットが寄与する特性を有する。しかしながら、ブロックコポリマーは、個々のサブユニットから形成されるポリマーが有しない固有の特性を有しうる。ブロックコポリマーは、モノマーサブユニットの1つが疎水性または親油性である一方、他のサブユニットが水溶性媒体にいるとき親水性であるように、改変されていてもよい。この場合に、ブロックコポリマーは、両親媒性特性を有することができ、生体膜を模倣する構造を形成しうる。ブロックコポリマーは、ジブロック(2つのモノマーサブユニットからなる)でありうるが、また、両親媒性物質(amphipiles)のように挙動する、より複雑な構成を形成するために、2つを超えるモノマーサブユニットから構築されてもよい。コポリマーは、トリブロック、テトラブロックまたはペンタブロックコポリマーでありうる。膜は、好ましくは、トリブロックコポリマー膜である。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、二本鎖でありうる。ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、方法は、接触ステップの前に、ポリヌクレオチドの一端にヘアピンアダプターを連結するステップをさらに含んでもよい。次いでポリヌクレオチドの二本鎖は、ポリヌクレオチドが本明細書に記載される修飾ClyAナノポアと接触するまたは相互作用するときまたはその前に分離されてもよい。二本鎖は、ポアを通じたポリヌクレオチドの移動が、ポリヌクレオチド結合タンパク質、例えばヘリカーゼまたは分子ブレーキによって制御されるときに分離されてもよい。このことは、国際出願番号PCT/GB2012/051786(国際公開第2013/014451号パンフレットとして公開)に記載されている。このように二本鎖構築物の両方の鎖を結びつけ、調べることは、特徴付けの効率および精度を向上させる。
好ましい実施形態では、標的二本鎖ポリヌクレオチドは一端にヘアピンループアダプターを有し、方法は、ポリヌクレオチドの両方の鎖がポアを通じて移動するように、ポリヌクレオチドと本明細書に記載のいずれか1つの修飾ClyAナノポアとを接触させるステップと、ポリヌクレオチドの両方の鎖がポアに対して移動するとき1つまたは複数の測定を行うステップであり、ここで測定は、ポリヌクレオチドの鎖の1つまたは複数の特徴の指標であり、それによって標的二本鎖ポリヌクレオチドを特徴付ける、ステップとを含む。上記に説明した実施形態のいずれかは、同様に、本実施形態に適用される。
接触ステップの前に、好ましくは、方法は、ポア内を優先的に通過するリーダー配列を、ポリヌクレオチドに結合させるステップを含む。リーダー配列は、本明細書に記載のいずれの方法も促進させる。リーダー配列は、本明細書に記載の修飾ClyAナノポアのいずれか1つを優先的に通過し、それによってナノポアを通じたポリヌクレオチドの移動を促進させるように設計される。またリーダー配列を使用して、ポリヌクレオチドを上記に説明した1つまたは複数のアンカーに連結させてもよい。
特徴付けの前に、標的ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと、ポリメラーゼおよび遊離ヌクレオチドの集団とを、ポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して修飾ポリヌクレオチドを形成する条件下で接触させることによって修飾されてもよく、ここでポリメラーゼは、修飾ポリヌクレオチドを形成するとき、標的ポリヌクレオチドの1つまたは複数のヌクレオチド種を異なるヌクレオチド種と置き換える。次いで修飾ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに結合された1つまたは複数のヘリカーゼおよびポリヌクレオチドに結合された1つまたは複数の分子ブレーキを含んでもよい。この種の修飾は、国際出願番号PCT/GB2015/050483に記載されている。本明細書に説明のいずれかのポリメラーゼが使用されうる。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼがヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み入れるときに放出される標識された種を検出することによって特徴付けられる。ポリメラーゼはポリヌクレオチドを鋳型として使用する。標識された種はそれぞれ各ヌクレオチドに対して特異的である。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の修飾ClyAナノポア、ポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドと、ポリメラーゼによってヌクレオチドがポリヌクレオチドに添加されたときにリン酸標識された種が順次放出されるように接触され、ここでリン酸種はそれぞれのヌクレオチドに対して特異的な標識を含有する。ポリメラーゼは、上記に説明したポリメラーゼのいずれであってもよい。リン酸標識された種は、ポアを使用して検出され、それによってポリヌクレオチドが特徴付けされる。この種の方法は、欧州出願番号13187149.3(欧州特許出願公開第2682460号明細書として公開)に開示されている。上記に説明した実施形態のいずれも、本方法に同様に適用される。
本開示の別の態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットも提供する。キットは、本明細書に記載のいずれか1つの修飾ClyAナノポアおよび膜の成分を含む。膜は、好ましくは成分から形成されている。ポアは、好ましくは膜に存在する。キットは、両親媒性層またはトリブロックコポリマー膜などの上記に開示した膜のいずれかの成分を含みうる。
本明細書に記載の別の態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための装置も提供する。装置は、複数の本明細書に記載される修飾ClyAナノポアと、複数の膜とを含む。一部の実施形態では、複数の修飾ClyAナノポアは、複数の膜に存在する。一部の実施形態では、修飾ClyAナノポアの数と膜の数は等しい。一実施形態では、単一の修飾ClyAナノポアが、それぞれの膜に存在する。
生理学的イオン強度でのDNA移行を可能にするナノポアの正確なナノスケール改変
生物学における重要なプロセスの多くには、ナノメートルスケールのポアを通じたバイオポリマーの移行が関与しており、例えば、核ポアを横切る核酸輸送、膜チャネルを通じたタンパク質移行、および標的細胞へのウイルスDNAの注入などがある。さらに隔離膜に埋め込まれた生物学的および人工的ナノポアは、このプロセスを調査するための有用なツールを提供し、迅速なDNAまたはタンパク質シーケンシング、単一分子DNAシーケンシングおよび分析、ならびにバイオマーカーセンシングにおける適用を見出しうる。ナノポアを横切るDNA移行の機構が、特に調査されてきた。いくつかのポータルバクテリオファージタンパク質の結晶構造は、DNA詰め込みおよび注入の間に、dsDNAが、正電荷の環で飾られた強い負の表面を有する狭いナノポア(約3.5nm)を横切って移行することを明らかにした。ナノポアの負に帯電した内側表面は、負に荷電したDNAのスライディングを容易にすることが提唱されており、一方で正電荷の役割は、このプロセスを促進することと考えられている。この実施例では、生理学的イオン強度で、ポータルタンパク質と同じ折り畳み、大きさおよび全体的内部電荷を有するClyAナノポアを横切るDNAの電気泳動的移行が、正電荷の2つの環がナノポアの広い入り口および中間部で改変されている場合にのみ観察することができることが見出される。驚いたことに、ナノポアの強い負に帯電した3.3nmの内部くびれは、修飾を必要としなかった。この知見は、正電荷の改変が、狭いくびれを通じたDNA移行のためのエントロピーおよび静電障壁克服のために、DNAを整列させるために重要であることを示す。理論に制限されることは望まないが、負電荷密度を有する狭いナノポアを通じて移行するために、DNA分子は配向される必要がある。
DNAを捕捉するためのClyAナノポアの改変
ClyA-AS(図1、パネルA;図11、パネルA)は、平面脂質二重層におけるその有利な特性のために選択された、チフス菌(Salmonella typhi)由来の細胞溶解素Aの改変バージョンであり、ssDNAまたはdsDNAの移行が、2.0Mを超えるNaClイオン強度でのみ観察される。おそらく、低イオン強度ではナノポア内部の強い負の静電電位(図11、パネルB)がDNA進入および移行を防止し、一方で高イオン強度ではナノポア表面の電荷が効果的に遮蔽される。生理学的イオン強度でのナノポアによるDNAの捕捉を誘導するために、ClyA-ASナノポアの内部電荷を修飾した(表1および2ならびに図1、パネルA;図11、パネルA)。ClyAバリアントは、時折、開口ポアコンダクタンス(ゲーティング)の一時的な減少を示した。ゲーティングの測定値として、典型的ナノポアを30秒のタイムスパンで開口のままとする印加電圧として定義されるゲーティング電圧(VG)(表1)を使用した。修飾ナノポアを通じたDNAの移行は、1μMの90量体3’-ビオチン化ssDNA分子(図1、パネルA;表3)、次いで等モル濃度のその相補鎖(図1、パネルB;表3)、そして最後にニュートラアビジン(1.2μM、モノマー)を添加することによって、VGで試験した。
ロタキサンは、2つのストッパーによりロックされたスレッドを取り囲む大環状環によって形成されたダンベル形状分子である。この実施例では、2つのナノポア/DNAロタキサンを150mMのNaCl溶液中で形成し、ナノポアを通じたssDNAおよびdsDNAの移行を立証した。第1のロタキサンは、100マーの5’-ビオチン化ssDNA分子を、cisコンパートメントに添加する最初のスレッド(2a、表3)として使用して形成した。第2のロタキサンは、31塩基の3’ビオチンオーバーハングで延長した3’-ビオチン化59塩基対dsDNA分子(1a/1c、表3)を使用して形成した。ナノポアの反対側に、2aまたは1a/1cのオーバーハングにハイブリダイズするように設計されたそれぞれ別のビオチン化ssDNA分子2b(50マー、5’-ビオチン化)または1d(31マー、3’-ビオチン化)を添加することによって、ロタキサンをロックした。cisおよびtrans溶液の両方が、ビオチンと複合体化してナノポアを横切るDNA鎖の全移行を防止するニュートラアビジン(NA、0.3μM)を含有していた。
イベント間時間τonの逆数である捕捉率kon(表7、+70mV、1μMのDNA)は、ssDNAおよびdsDNAの両方が、溶液のデバイ長(λD)と共に増加した(図3、パネルB~C;図13、パネルA~B)。しかしながら、dsDNA捕捉率はλDと共に直線的に増加し(図13、パネルA)、一方でssDNA捕捉率はλDと共に指数的に増加した(図13、パネルB)。したがって、これにより、dsDNAおよびssDNAについて異なる捕捉機構が示される。cis側に添加されたdsDNA移行の頻度は溶液のデバイ長と共に直線的に増加し(+70mV、図3A、7および8)、DNAとナノポアとの間の静電相互作用がDNA進入および移行のために重要であることが示された。固体ナノポアを用いて以前に報告されているようにDNA封鎖ナノポアの残留電流は、溶液のイオン強度が減少するにつれて増加した(例えば、2.5MのNaClで0.78±0.09から150mMのNaClで0.92±0.02へ)。興味深いことに、DNA封鎖のIRESと溶液のデバイ長との間の直線関係が明らかになった(図3、パネルB~C)。ニュートラアビジンと複合体化したdsDNAでは、残留電流が、遊離のDNA移行の間より約10%低く、ニュートラアビジンが、おそらくはナノポア内腔との相互作用によって、封鎖の全体的なイオン電流に寄与していることが示された。
150mMのNaCl溶液および負の印加電位下(最大-100mV)では、1μMのssDNAまたはdsDNAのClyA-RRのcisおよびtransコンパートメントへの添加はDNA封鎖を誘導せず、DNAがナノポアのtrans入り口からナノポアに入ることができないことが示された(図4、パネルA)。正の印加バイアス下では、電流封鎖が約+50mVよりも高い電位で現れ、ナノポアのcis側からのssDNAの移行について電圧閾値が存在することが示唆された。しかしながら、transコンパートメントからのDNAの進入(図4、パネルB)および移行(図9)が1MのNaCl溶液で観察され、150mMのNaClでのtransコンパートメントからの移行を防止するエネルギー障壁が、本質的に静電的であることを示した。
正確なナノポア改変は、生理学的イオン強度でのDNA移行を支援する
この実施例では、ClyAナノポアを、生理学的イオン強度でDNAの電気泳動的移行が可能となるように改変した。DNA移行は、2組の正電荷をClyAナノポアの入口および中間部に導入したときに観察された(図11、パネルA)。驚いたことに、DNA移行について最も高いエントロピーおよび静電障壁を示すナノポアのtrans側入口(図11、パネルA~B)では、修飾を必要としなかった。さらに、ClyAのtrans側入口の電荷への広範囲の再モデル化(表1~2)にもかかわらず、DNA移行は、ナノポアの広い方のcis側入口から開始したときにのみ観察することができた。さらに、ClyA-RRナノポアを通じたdsDNA移行の頻度は、溶液のデバイ長と共に増加し(図13、パネルA)、dsDNAとClyA-RRのcis側入口との好ましい静電相互作用が、DNAとナノポアくびれとの好ましくない静電反発力を上回ることを示した。dsDNAの剛性が、試験したイオン強度の範囲にわたって顕著に変化していないことに留意されたい。さらに、イオン強度が低下するときの電気浸透流の増加は、電気浸透流がDNA進入および移行と対向するものであることから、DNA移行の頻度増加を説明することはできない。したがって、これらのデータは、ナノポアのcis内腔が、ナノポアのくびれを通じたDNAの移行を開始するために重要であることを示す。
ClyAは、円筒形のcis内腔(5.5nmの直径および10nmの長さ)とそれに続く、より小さな負に荷電したtrans型くびれ(3.3nmの直径および3.0nmの長さ、図1)によって近似することができ、このくびれは、DNA移行のための主な電気泳動およびエントロピー障壁に対向すると予測される。驚いたことに、ClyAナノポアを通じたDNAの移行が、一組の正電荷をナノポア(ClyA-RR)のcis内腔に添加したときに観察されたが、ナノポアのくびれは何ら修飾を必要としなかった。ClyAのtrans入り口への広範囲の修飾(表2)にもかかわらず、DNA移行は、ナノポアの広い方のcis側から開始したときにのみ観察される場合があり、ナノポアのcis内腔がナノポアを通じたDNAの移行を開始するために重要であることが示唆された。ClyA-RRナノポアを通じた二本鎖DNAの移行の頻度は、溶液のデバイ長と共に直線的に増加し(図3、パネルA)、dsDNAとClyA-RRにおける改変電荷との静電相互作用は、移行プロセスに対向するのではなく、むしろ好ましいことが示された。生理学的イオン強度でのtrans型くびれを通じたdsDNAの移行が、dsDNA鎖がナノポアのcis内腔によって予め整列されたときに達成されるというモデルが提唱される(図5、パネルA)。この概念では、dsDNAは、最初にcis側入口で電荷と相互作用し、次いでポアの内腔に入り、内腔でナノポアの中間部のアルギニン残基とさらに相互作用する(図1、パネルA)。これらの静電相互作用は、DNAのリン酸基を「把持」し、DNAがcis溶液へ戻って出ていくのを防止する。この構成において、dsDNAは、電気泳動力が最も強いtrans型くびれに入るように整列され、これによりナノポアを横切るDNAの円滑な移行が可能となる(図5、パネルA)。
異なる塩濃度でのDNA移行実験は、dsDNAおよびssDNAについて2つの異なる捕捉機構を示した(それぞれ図13、パネルA~B、および図14、パネルA~B)。dsDNAの挙動は、拡散律速捕捉プロセスと一致する。これは、この実験で使用するdsDNAがその持続長(150bp)より短く、剛性の一様な荷電ロッドとして挙動することによる。捕捉半径内(0.5nmのλDについてナノポア中心から約50nm)では、電場がDNAをポアに向かって引きつけ、一端がポア入口に当たるように電場線に沿って整列させる(図14、パネルA、i)。ポア内に入ると、改変された電荷がDNAと相互作用し、cis溶液へと引き戻されるのを防止する(図14、パネルA、ii~iv)。したがって、DNA捕捉の動力学は、電気泳動に由来する単純な誘引電位での拡散粒子の動力学と近似されうる。この場合、dsDNAの電気泳動移動度は、溶液のデバイ長と比例し、対応するドリフト拡散式は、下記でさらに詳細に記載されるように、正確に解明することができる。ClyAナノポアの幾何学的形状を、円筒の長さl=13nmおよび捕捉直径d=6nm(図11、パネルA)で近似することで、捕捉頻度を、以下:
kon~14λD(s nm μM)-1
によって推定することができる。これは、λDについての実験データ(高塩濃度、図13、パネルA)と非常に良く一致する。何らフィッティングパラメータが使用されていないので、これは顕著なことである。ただし、ClyAの幾何学的形状は完全な円筒から著しく逸脱しているため、ポアのパラメータの選択は、ある程度任意であることから、この比較にはいくらか注意が必要である。低塩濃度(0.15MのNaCl、λD=0.8nm)では、捕捉率は、上記式によって予測されるよりも高い(図13、パネルA)。同様に、モデルで考慮されていないClyA-RR入口での正電荷は、低塩濃度で捕捉を促進する一方、高塩濃度ではこれらの電荷がより有効に遮蔽される。
興味深いことに、ClyAナノポアを通じたDNAの移行を可能にする修飾は、生物学的機能がDNAに沿ってスライディングすることであるタンパク質においても観察される。バクテリオファージでは、DNAは、整列し、同様の寸法、化学量論、内部表面電荷、およびClyAと同様の内部構造サイズを有するポータルタンパク質にDNAを押し込むタンパク質に詰め込むことによって、前駆型キャプシドに転送される。負の内部表面電荷が、ポータルタンパク質を横切るDNAの平滑な移行のために重要であるようであり、その理由は、負の内部表面電荷が、DNAを包囲し、DNAに沿ってスライディングする、β-クランプタンパク質などの他のタンパク質で観察されるからである。またポータルタンパク質およびβ-クランプタンパク質は正に荷電した環を有し、この環は、移行するDNAの負荷電リン酸骨格との相互作用によって、ゲノムDNAパッケージングに直接的な役割を果たすことが提唱されている。ClyAナノポアを通じたDNAの電気泳動的移行が、正電荷残基の2つの環がナノポアのcis入り口および中間部に導入され、狭い負に帯電したくびれを通じた移行のためにDNAを整列させるときに観察することができた。そのような相互作用がない場合、つまりtrans側からの通過では、DNA移行は観察できなかった。したがって、本明細書に提示される結果は、接続タンパク質における正電荷のそのような環がキャプシドを出て感染細胞へ入るDNAの排出を開始するために重要でありうることを示す。
DNAはIntegrated DNA Technologies(IDT)から購入した。ニュートラアビジンはThermo Fisherから取得し、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンはAvanti Polar Lipidsから取得した。β-ドデシルマルトシド(DDM)は、GLYCON Biochemicals GmbHから購入した。酵素はFermentasから購入し、全ての他の材料は、特に明記しない限り、Sigmaから購入した。
ClyA-AS遺伝子への単一点突然変異を、「メガプライマー」方法を使用して実施した。典型的に、2つのPCRサイクルを実施して、新たなDNA構築物を調製した。第1のPCR反応では、プラスミドDNAは、2つのプライマーで増幅した:フォワードプライマーは、塩基置換を保有する20~30塩基長のオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーはT7プロモーターまたはT7ターミネーターのいずれかであった。膜貫通領域での変異について、リバースプライマーは、タンパク質配列の中間のストレッチに相補的な25マーのオリゴであった(表3)。メガプライマー(200~300bp)を含有するPCR産物をアガロースゲル(2%アガロース/TAEおよびクリスタルバイオレット)に装填し、メガプライマーを切り出し、PCR quick精製キット(QIAGEN)を使用して精製した。5μLの精製されたメガプライマーを、2%アガロース/TAEゲルに装填して純度を確認し、5~10μLのメガプライマーを、第2のPCR反応のために使用した。次いで第2のPCR産物を、最初にDpnI(1~2時間、37℃、高速消化DpnI、Fermenthas)で消化してClyA-AS鋳型DNAを除去し、次いで約1μLを、エレクトロコンピテント細胞E.cloni(登録商標)EXPRESS BL21(DE3)(製造元)を用いての形質転換のために使用した。
dsDNA1を、1a、3’-ビオチン化ssDNA分子(表3)を20%過剰の相補的ssDNA1b(表3)とインキュベートすることにより形成した。温度を1分間95℃にし、次いで室温まで段階的に下げた。70℃の推定アニーリング温度付近では、温度を21℃へ2℃ステップで下げた。各ステップは1分間継続した。次いで、DNAを、過剰のssDNAから、アガロースビーズに単量体アビジンを固定化したビオチン結合カラム(Thermo Scientific Pierce)を使用して、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。次いでdsDNAを、製造業者のプロトコルに従って、ビオチンブロッキング/溶出緩衝液で溶出した。溶出画分を濃縮し、PCR quick精製キット(QIAGEN)を使用してさらに精製した。典型的に、0.2μg/mLのDNA濃度が取得された。dsDNAの大きさおよび純度を、TAE緩衝液中の2%アガロースゲルを使用して検査し、分光学的に定量した。精製dsDNAを、1mMのEDTAの存在下、-20℃で保存した。1a:1cを、3’-ビオチン化ssDNA分子(1a、表3)を等モル濃度の1cとインキュベートすることによって形成した。温度を1分間95℃にし、次いで、室温まで段階的に下げた。70℃の推定アニーリング温度付近では、温度を2℃ステップで下げ、各ステップは、1分間維持した。
人工平面脂質二重層を上記のように調製した。特に明記しない場合、信号は、10kHzのBesselフィルターで処理した後、50kHzのサンプリングレートで収集した。脂質二重層は、1~2μlのペンタン中の1,2-ジフィタノイルsn-グリセロ-3-ホスホコリンの10%溶液でTeflonフィルム(Goodfellow、UK)の小さな開口部(約100μm)を前処理することによって形成した。電位は、寒天ブリッジ(2.5MのNaCl緩衝液中の3%w/v低融点アガロース)に沈めたAg/AgCl電極を使用して印加した。印加電位は、装置のtransコンパートメントに接続された作用電極の電位を指す。ClyAナノポア溶液(0.01~0.1ng/mL)を、接地電極に接続されたcisコンパートメントに添加した。単一ポアの挿入後、過剰のタンパク質を数サイクルの灌流によって除去した。電気的記録は0.15~2.5MのNaCl、15mMのTris HCl、pH8.0中で、22℃で実施した。0.15MのNaCl中で、2kHzのローパスBesselフィルターを適用し、10kHzサンプリングレートを使用してデータを記録した。より高い塩濃度で、データを50kHzでサンプリングし、一方、ローパスBesselフィルターを10kHzに設定した。0.3および0.5MでのNaCl電流トレースを、4kHzのBesselデジタルフィルターで取得後フィルタリングした。電流封鎖イベントは、Clampfit software(Molecular devices)の「単一チャネル検索」関数を使用し、0.05msのデータ収集閾値を使用して個々に収集した。IOおよびIB値は、それぞれ開口および封鎖ポア電流の全点ヒストグラムへのGaussianフィッティングから計算した。DNA移行滞留時間τoffを、封鎖ポア電流イベント(toff)のイベントヒストグラムから単一指数標準フィットにより計算した。イベント間時間τonは、封鎖ポア電流イベント間のイベント間時間(ton)の対数ヒストグラムから指数対数確率フィットを使用して計算した。誤差は、少なくとも3回の独立した繰り返しの平均値からの標準偏差を示し、その回数は「n」で示している。
ClyAナノポアについての透過率は、150mMのNaCl trans、1MのNaCl cisの非対称塩条件での逆電位の測定によって計算した。タンパク質ナノポアをcisチャンバーに添加し、単一チャネルを対称条件(cisおよびtrans溶液の両方で150mMのNaCl、15mMのTris HCl、pH7.5)で最初に特徴付けした。電極の均衡を取った後、cisにおける電解質濃度を、5MのNaClストック溶液のアリコートをcisコンパートメントに添加することによって1Mへ増加させた。cis溶液(150mMのNaCl)と同じ緩衝液を使用して、cis側への添加と同じ体積を添加することによって、transチャンバーの体積を調節した。ゼロ電流を取得するために使用する電位である逆電位(Vr、表3)は、電流-電圧(IV)曲線(表6)によって取得した。イオン選択性(PNa+/PCl)は、ゴールドマン・ホジキン・カッツ(GHK)式を使用してVrから計算した。両方のGHK式により、ClyAナノポアについて観察されたVrの正の値は、ポアを通じた陽イオンの優先的移動を示し、ポアが陽性選択的チャネルであることを示す。cisチャンバーを接地し、2.5MのNaClを含有する2.5%アガロースブリッジを備えたAg/AgCl電極を使用して全ての実験を実施した。
アプローチは、GrosbergおよびRabinによって開発されたアプローチに関する。ClyAナノポア膜は、直径dの円筒孔を有する厚さlの平面誘電体表面として記載する。ClyAポアについての特徴的距離は、l=13nmおよびd=6nmである。ΔVを使用して膜のcis側とtrans側間の電位差を表すと、cis側の電位は
ssDNA捕捉の議論は、障壁律速プロセスについてRowghanian et al.(Phys. Rev. E (2013) 87: 042723)により発展されたアプローチによって鼓舞される。今回のケースは、拡散律速の場合よりはるかに複雑であり、理論はほとんど確立されていない。モデルは、ポア入口からの一端の距離である単一の「反応」座標γを使用するドリフト拡散式に基づく。ポアから十分に遠いため、ssDNAは、式(1)によって記載される誘引的電気泳動力のみを受ける。距離≦Rg(ここでRgは回転平衡半径である)のポアの周辺では、エントロピー起源の追加的な反発力が存在する:ssDNAコイルは、端部がポア入口に近づくように強制されるとき、配置エントロピーを減少させる。鎖が十分に長い場合、エントロピー反発が静電引力を上回り、障壁を生じる(図19)。
ΔFb=a-bλD (17)
ここでa、b>0であり、(15)と一緒になって、実験で観察されたλDに対するkonの指数的成長を説明する。
本明細書に開示された特色の全ては、任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書で開示された各特色は、同じ、同等または類似の目的を果たす代替の特色によって置き換えられてもよい。したがって、特に断らない限り、開示される各特色は、同等または類似の特色の一般的な系列の一例としてのみ開示される。上記の説明から、当業者は、本開示の本質的な特徴を、本開示の精神および範囲から逸脱することなく容易に確認することができ、種々の用途および条件に適合させるために、本開示の種々の変更および修正を行うことができる。したがって、他の実施形態も、特許請求の範囲内である。
いくつかの本発明の実施形態を本明細書に記載および例示してきたが、当業者は、機能を実施するならびに/あるいは結果および/または本明細書に記載の1つもしくは複数の効果を得るために種々の他の手段および/または構造を容易に想定し、そのような変形および/または修正の各々は、本明細書に記載した本発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般的に、当業者は、本明細書に記載の全てのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示を意図していること、ならびに実際のパラメータ、寸法、材料、および/または構成が、本発明の教示が使用される特定の用途に依存することを、容易に理解する。当業者は、本明細書に記載された特定の本発明の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または通例にすぎない実験を使用して確認することができる。したがって、前述の実施形態が単に一例として提示されており、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、本発明の実施形態が、具体的に説明した以外の方法で実施され請求されうることが理解される。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載の個々の特色、システム、物品、材料、キット、および/または方法に向けられている。さらに、そのような特色、システム、物品、材料、キット、および/または方法の2つ以上の任意の組合せが、そのような特色、システム、物品、材料、キット、および/または方法が互いに矛盾しない場合、本開示の発明の範囲内に含まれる。
また、本発明は以下を提供する。
[1]
cis開口部、中間部、およびtrans開口部を含む修飾ClyAナノポアであって、前記cis開口部の内部表面は第1の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記中間部の内部表面は第2の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記trans開口部は負に帯電したくびれを含む、修飾ClyAナノポア。
[2]
前記第1の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記修飾ClyAナノポアへのデオキシリボ核酸の捕捉を可能にするように前記cis開口部に配置されている、上記[1]に記載の修飾ClyAナノポア。
[3]
前記第2の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記修飾ClyAナノポアを通じた前記デオキシリボ核酸の移行を可能にするように前記中間部に配置されている、上記[2]記載の修飾ClyAナノポア。
[4]
前記第1および第2の正に荷電したアミノ酸の置換がそれぞれアルギニンを含む、上記[1]~[3]のいずれかに記載の修飾ClyAナノポア。
[5]
前記第1の正に荷電したアミノ酸の置換が、ClyA-ASのアミノ酸配列のS110R変異に対応する、上記[1]~[4]のいずれかに記載の修飾ClyAナノポア。
[6]
前記第2の正に荷電したアミノ酸の置換が、ClyA-ASのアミノ酸配列のD64R変異に対応する、上記[1]~[5]のいずれかに記載の修飾ClyAナノポア。
[7]
12量体ポアである、上記[1]~[6]のいずれかに記載の修飾ClyAナノポア。
[8]
上記[1]~[7]のいずれかに記載の修飾ClyAナノポアを含む組成物。
[9]
人工膜をさらに含み、前記修飾ClyAナノポアが前記人工膜に存在する、上記[8]に記載の組成物。
[10]
低イオン強度溶液をさらに含む、上記[8]または[9]に記載の組成物。
[11]
前記低イオン強度溶液が、約50mMから約1Mのイオン強度を有する塩溶液である、上記[10]に記載の組成物。
[12]
前記イオン強度が約150mMである、上記[11]に記載の組成物。
[13]
前記塩溶液が塩化ナトリウム(NaCl)を含む、上記[11]または[12]に記載の組成物。
[14]
ClyAナノポアを通じてDNAを移行する方法であって、
a.低イオン強度溶液に、上記[1]~[13]のいずれかに記載の修飾ClyAナノポアと人工膜とを供給するステップであり、ここで前記修飾ClyAナノポアは、前記修飾ClyAナノポアのcis開口部が前記低イオン強度溶液のcis側に存在し、前記修飾ClyAナノポアのtrans開口部が前記低イオン強度溶液のtrans側に存在するように、前記人工膜に存在する、ステップと、
b.前記低イオン強度溶液の前記cis側にDNAを供給するステップと、
c.前記修飾ClyAナノポアにわたり電位を印加して、前記DNAを、前記修飾ClyAナノポアを通じて前記cis側から前記trans側へ移行させるステップと
を含む、方法。
[15]
前記低イオン強度溶液が、約150mMから約300mMのイオン強度を有する塩溶液である、上記[14に記載の方法。
[16]
前記イオン強度が約150mMである、上記[15]に記載の方法。
[17]
前記塩溶液が塩化ナトリウム(NaCl)を含む、上記[15]または[16]に記載の方法。
[18]
前記DNAが一本鎖DNAである、上記[14]~[17]のいずれかに記載の方法。
[19]
前記DNAが二本鎖DNAである、上記[14]~[17]のいずれかに記載の方法。
[20]
DNAシーケンシングのために使用される、上記[14]~[19]のいずれかに記載の方法。
[21]
配列番号1(野生型ClyAのアミノ酸配列に対応)または配列番号2(ClyA-ASのアミノ酸配列に対応)に示すアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドであって、前記アミノ酸配列は配列番号1または配列番号2の106~78の範囲内の位置に第1の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、配列番号1または配列番号2の41~74の範囲内の位置に第2の正に荷電したアミノ酸の置換を含む、修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチド。
[22]
配列番号1または配列番号2の1~32位のアミノ酸が正味の負電荷をもたらす、上記[21]に記載の修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチド。
[23]
前記第1の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号1または配列番号2の110位に配置されている、上記[21]または[22]に記載の修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチド。
[24]
前記第2の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号1または配列番号2の64位に配置されている、上記[21]~[23]のいずれかに記載の修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチド。
[25]
前記第1および第2の正に荷電したアミノ酸の置換がそれぞれ独立してアルギニン、ヒスチジンまたはリジンを含む、上記[21]~[24]のいずれかに記載の修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチド。
[26]
上記[21]~[25]のいずれかに記載の修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
[27]
複数の、上記[21]~[25]のいずれかに記載の修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドを含むホモ多量体修飾ClyAナノポア。
[28]
12~14個の前記修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドを含む、上記[27]に記載のホモ多量体修飾ClyAナノポア。
[29]
前記修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドの第1の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記ホモ多量体修飾ClyAナノポアの第1の開口部に曝露された溶液内の負に荷電したポリマーの捕捉を可能にするように、前記第1の開口部に配置されている、上記[27]または[28]に記載のホモ多量体修飾ClyAナノポア。
[30]
前記修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドの第2の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記ナノポアを通じた前記負に荷電したポリマーの移行を可能にするように、前記ホモ多量体修飾ClyAナノポアの中間部に配置されている、上記[29]に記載のホモ多量体修飾ClyAナノポア。
[31]
少なくとも1つの、上記[21]~[25]のいずれかに記載の修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドを含むヘテロ多量体修飾ClyAナノポア。
[32]
前記少なくとも1つの修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドを含む、12~14個のClyAナノポアサブユニットポリペプチドを含む、上記[31]に記載のヘテロ多量体修飾ClyAナノポア。
[33]
前記修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドの第1の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記ヘテロ多量体修飾ClyAナノポアの第1の開口部に曝露された溶液内の負に荷電したポリマーの捕捉を可能にするように、前記第1の開口部に配置されている、上記[31]または[32]に記載のヘテロ多量体修飾ClyAナノポア。
[34]
前記修飾ClyAナノポアサブユニットポリペプチドの第2の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記ナノポアを通じた前記負に荷電したポリマーの移行を可能にするように、前記ヘテロ多量体修飾ClyAナノポアの中間部に配置されている、上記[33]に記載のヘテロ多量体修飾ClyAナノポア。
[35]
第1の開口部と、中間部と、第2の開口部と、前記第1の開口部から前記中間部を通じて前記第2の開口部に延びる内腔とを含む修飾ClyAナノポアであって、前記第1の開口部の内腔表面は第1の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記中間部の内腔表面は第2の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記第2の開口部の内腔表面は負に帯電したくびれを画定する、修飾ClyAナノポア。
[36]
前記第1の正に荷電したアミノ酸の置換から前記第2の正に荷電したアミノ酸の置換までの前記内腔内の距離が0.5nmから10nmの範囲である、上記[35]に記載の修飾ClyAナノポア。
[37]
配列番号1または配列番号2に示すアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含む、上記[35]または[36]に記載の修飾ClyAナノポア。
[38]
配列番号1または配列番号2に示すアミノ酸配列と比較して、前記第1および第2の正に荷電したアミノ酸の置換を含む最大10個の置換を有するサブユニットポリペプチドを含む、上記[35]または[36]に記載の修飾ClyAナノポア。
[39]
前記第1の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号1または配列番号2のアミノ酸110、106、114、121、122、129、85、78、268、267、265および258からなる群から選択されるアミノ酸の置換である、上記[35]~[38]のいずれかに記載の修飾ClyAナノポア。
[40]
前記第2の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号1または配列番号2のアミノ酸74、71、64、53、161、158、46、42、41からなる群から選択されるアミノ酸の置換である、上記[35]~[39]のいずれかに記載の修飾ClyAナノポア。
[41]
第1の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記第1の開口部に曝露された溶液内の負に荷電したポリマーの捕捉を可能にするように、前記第1の開口部に配置されている、上記[35]~[40]のいずれかに記載の修飾ClyAナノポア。
[42]
前記第2の正に荷電したアミノ酸の置換が、ポアの前記内腔を通じた前記負に荷電したポリマーの移行を可能にするように、前記中間部に配置されている、上記[41]に記載の修飾ClyAナノポア。
[43]
前記負に荷電したポリマーが核酸である、上記[41]または[42]に記載の修飾ClyAナノポア。
[44]
前記核酸がデオキシリボ核酸である、上記[43]に記載の修飾ClyAナノポア。
[45]
前記デオキシリボ核酸が二本鎖である、上記[44]に記載の修飾ClyAナノポア。
[46]
前記デオキシリボ核酸が一本鎖である、上記[44]に記載の修飾ClyAナノポア。
[47]
12量体ポアである、上記[35]~[46]のいずれかに記載の修飾ClyAナノポア。
[48]
13マーのポアである、上記[35]~[46]のいずれかに記載の修飾ClyAナノポア。
[49]
上記[27]~[48]のいずれかに記載の少なくとも1つの修飾ClyAナノポアを含む組成物。
[50]
膜をさらに含み、前記修飾ClyAナノポアが前記膜に存在する、上記[49]に記載の組成物。
[51]
ポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含む、上記[49]または[50]に記載の組成物。
[52]
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記修飾ClyAナノポアに結合している、上記[51]に記載の組成物。
[53]
低イオン強度溶液をさらに含む、上記[49]~[52]のいずれかに記載の組成物。
[54]
前記低イオン強度溶液が、約150mMから約300mMのイオン強度を有する塩溶液である、上記[52]に記載の組成物。
[55]
前記塩溶液が塩化ナトリウム(NaCl)を含む、上記[52]または[53]に記載の組成物。
[56]
標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
(a)約150mMから約300mMの低イオン強度溶液に、上記[27]~[48]のいずれかに記載の修飾ClyAナノポアと膜とを供給するステップであり、ここで前記修飾ClyAナノポアは前記膜に存在する、ステップと、
(b)ステップ(a)の前記低イオン強度溶液に前記標的ポリヌクレオチドを添加するステップと、
(c)前記ナノポアにわたり電位を印加する間に、前記修飾ClyAナノポアを流れるイオン流を測定するステップであり、ここでイオン流の測定は、前記標的ポリヌクレオチドの1つまたは複数の特徴の指標となる、ステップと
を含む、方法。
[57]
前記1つまたは複数の特徴が、(i)前記標的ポリヌクレオチドの長さ、(ii)前記標的ポリヌクレオチドの同一性、(iii)前記標的ポリヌクレオチドの配列、(iv)前記標的ポリヌクレオチドの二次構造、ならびに(v)前記標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、およびそれによる前記標的ポリヌクレオチドの特徴付けから選択される、上記[56]に記載の方法。
[58]
ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記標的ポリヌクレオチドに結合し、前記修飾ClyAナノポアを通じた前記標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、前記ポリヌクレオチド結合タンパク質をステップ(b)の前記低イオン強度溶液に添加するステップをさらに含む、上記[56]または[57]に記載の方法。
[59]
前記標的ポリヌクレオチドが一本鎖DNAである、上記[56]~[58]のいずれかに記載の方法。
[60]
前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖DNAである、上記[56]~[58]のいずれかに記載の方法。
[61]
前記イオン流の測定が、電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定または電界効果トランジスタ(FET)測定を含む、上記[56]~[60]のいずれかに記載の方法。
[62]
前記低イオン強度溶液が塩化ナトリウムを含む、上記[56]~[61]のいずれかに記載の方法。
104 中間部
106 第2の開口部
108 内腔
110 膜
112 負に帯電したくびれ
Claims (12)
- cis開口部、中間部、およびtrans開口部を含む修飾細胞溶解素A(ClyA)ナノポアであって、前記cis開口部の内部表面は第1の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記中間部の内部表面は第2の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記trans開口部は負に帯電したくびれを含み、
前記第1の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号1または配列番号2のE106、S110、D114、D121、D122、E129、E85、E78、D268、D267、D265、またはE258に位置し、および/または配列番号1または配列番号2の78~106の範囲内の位置にあり、
前記第2の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号1または配列番号2のD74、D71、D64、E53、E161、D158、E46、E42、D41に対応する1つまたは複数の位置における、負に荷電したアミノ酸の正に荷電したアミノ酸での置換に対応する、修飾ClyAナノポア。 - 前記第1および第2の正に荷電したアミノ酸の置換がそれぞれアルギニンを含む、請求項1に記載の修飾ClyAナノポア。
- 前記第1の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号2のアミノ酸配列のS110R変異に対応する、および/または、
前記第2の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号2のアミノ酸配列のD64R変異に対応する、請求項1または請求項2に記載の修飾ClyAナノポア。 - 12量体ポアである、請求項1~3のいずれか一項に記載の修飾ClyAナノポア。
- ClyAナノポアを通じてDNAを移行する方法であって、
a.150mM~300mMの低イオン強度溶液に、請求項1~4のいずれか一項に記載の修飾ClyAナノポアと人工膜とを供給するステップであり、ここで前記修飾ClyAナノポアは、前記修飾ClyAナノポアのcis開口部が前記低イオン強度溶液のcis側に存在し、前記修飾ClyAナノポアのtrans開口部が前記低イオン強度溶液のtrans側に存在するように、前記人工膜に存在する、ステップと、
b.前記低イオン強度溶液の前記cis側にDNAを供給するステップと、
c.前記修飾ClyAナノポアにわたり電位を印加して、前記DNAを、前記修飾ClyAナノポアを通じて前記cis側から前記trans側へ移行させるステップと
を含む、方法。 - 請求項1~4のいずれか一項に記載の修飾ClyAナノポアのサブユニットポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- 複数の、請求項1~4のいずれか一項に記載の修飾ClyAナノポアのサブユニットポリペプチドを含むホモ多量体修飾ClyAナノポア。
- 少なくとも1つの、請求項1~4のいずれか一項に記載の修飾ClyAナノポアのサブユニットポリペプチドを含むヘテロ多量体修飾ClyAナノポア。
- 配列番号1または配列番号2に示すアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含む、請求項1に記載の修飾ClyAナノポア。
- 配列番号1または配列番号2に示すアミノ酸配列と比較して、前記第1および第2の正に荷電したアミノ酸の置換を含む最大10個の置換を有するサブユニットポリペプチドを含む、請求項1に記載の修飾ClyAナノポア。
- 請求項1~4および7~10のいずれか一項に記載の少なくとも1つの修飾ClyAナノポアを含む組成物。
- 標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
(a)150mMから300mMの低イオン強度溶液に、請求項1~4および7~10のいずれか一項に記載の修飾ClyAナノポアと膜とを供給するステップであり、ここで前記修飾ClyAナノポアは前記膜に存在する、ステップと、
(b)ステップ(a)の前記低イオン強度溶液に前記標的ポリヌクレオチドを添加するステップと、
(c)前記ナノポアにわたり電位を印加する間に、前記修飾ClyAナノポアを流れるイオン流を測定するステップであり、ここでイオン流の測定は、前記標的ポリヌクレオチドの1つまたは複数の特徴の指標となる、ステップと
を含む、方法。
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