KR101963918B1 - 커플링 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 분석물의 존재, 부재 또는 특성을 결정하는 신규 방법에 관한 것이다. 분석물이 막에 커플링된다. 또한 본 발명은 핵산 서열분석에 관한 것이다.

Description

커플링 방법 {COUPLING METHOD}
본 발명은 분석물의 존재, 부재 또는 특성을 결정하는 신규 방법에 관한 것이다. 분석물이 막에 커플링(coupling)된다. 또한 본 발명은 핵산 서열분석에 관한 것이다.
현재, 광범위한 용도에 걸쳐 신속하고 저렴한 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열분석 기술이 요구된다. 기존의 기술은 느리고 고가인데, 이는 주로 다량의 핵산을 생산하기 위한 증폭 기술에 의존하고, 신호 검출을 위해 다량의 전문 형광 화학물질을 필요로 하기 때문이다.
나노포어(nanopore)는 중합체 및 다양한 소형 분자에 대한 직접적인 전기 바이오센서로서의 잠재력이 크다. 특히, 최근에는 잠재적인 DNA 서열분석 기술로서 나노포어에 초점이 맞춰졌다. DNA 서열분석을 위한 2가지 방법이 제안되었다; 엑소뉴클레아제(exonuclease)에 의해 염기가 폴리뉴클레오티드로부터 진행성으로 절단된 후, 나노포어에 의해 개별적으로 확인되는 '엑소뉴클레아제 서열분석', 및 단일 DNA 가닥이 포어를 통과하고, 뉴클레오티드가 직접적으로 확인되는 '가닥 서열분석'. 가닥 서열분석은 나노포어를 통과하는 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하기 위해 DNA 취급 효소를 사용하는 것을 수반할 수 있다.
나노포어를 가로질러 전위가 적용되는 경우에, 뉴클레오티드와 같은 분석물이 특정 기간 동안 배럴(barrel) 내에 일시적으로 존재할 때 전류 흐름이 하락한다. 분석물의 나노포어 검출은 공지된 사인 및 기간의 전류 차단을 제공한다. 그 후, 단일 포어에 대한 단위 시간 당 차단 이벤트의 횟수에 의해 분석물의 농도를 결정할 수 있다.
DNA 서열분석과 같은 나노포어 용도에 대해, 용액으로부터의 분석물의 효율적인 포착이 요구된다. 예를 들어, DNA 서열분석에서 사용된 DNA 취급 효소에 충분히 높은 듀티 사이클(duty cycle)을 제공하여 효율적인 서열분석을 수득하기 위해, 현재의 것이 종료되자마자 새로운 폴리뉴클레오티드가 결합되도록 효소와 폴리뉴클레오티드 간의 상호작용의 횟수가 최대일 필요가 있다. 따라서, DNA 서열분석에서, 효소가 1개를 프로세싱하자마자, 다음 것이 곧 이용가능하여 결합되도록, 폴리뉴클레오티드가 가능한 한 높은 농도로 있는 것이 바람직하다. 폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA, 예를 들어, 후생유전학용 암 세포 샘플로부터의 DNA의 농도가 제한되고 있기 때문에, 이는 특정 문제가 된다. 샘플이 묽을수록, 제1 폴리뉴클레오티드에 결합하는 것이 너무 제한적이어서 실현가능하지 않은 지점까지, 서열분석 실행(run) 사이가 길어진다.
나노포어 검출의 한계가 다양한 분석물에 대해 추정되었다. 단백질 나노포어 (용혈소)에 의한 단일 가닥 DNA (ssDNA)의 92-뉴클레오티드 합성 조각의 포착은 3.0±0.2 s-1 uM-1의 빈도인 것으로 결정되었다 (문헌 [Maglia, Restrepo et al. 2008, Proc Natl Acad Sci USA 105(50): 19720-5]). 용혈소 배럴에 입구에 양성 전하의 고리를 첨가하는 것에 의해 포착이 ~10배 증가될 수 있었다 (23.0±2 s-1 uM-1). 이를 고려하면, 1 uM의 92-뉴클레오티드 ssDNA는 1 ㎖의 시스(cis) 챔버 부피를 가정하여 단일 채널 기록 당 요구되는 31 ug의 DNA와 등가이다. 현재, 시장에서 선도적인 인간 혈액으로부터의 게놈 DNA 정제 키트 (퀴아젠(Qiagen)의 팍스진 혈액 DNA 키트(PAXgene Blood DNA Kit))는 8.5 ㎖의 인간 전혈로부터 150 - 500 ug의 게놈의 예상 수율을 제공한다. 따라서, 분석물 검출에서의 이러한 개시된 증가는 초민감 검출 및 전달에 요구되는 단계 변화에 여전히 못 미친다.
발명의 개요
본 발명가들은 관련 검출기가 존재하는 막에 분석물을 커플링시키는 것에 의한 매우 낮은 농도의 분석물 전달을 뜻밖에 입증하였다. 이는 검출되기 위해 요구되는 분석물의 양을 수십 배만큼 저하시킨다. 필요한 분석물의 양이 감소되는 정도는 예측될 수 없었다.
특히, 본 발명가들은 기존에 보고된 것보다 ~40배만큼의 단일 가닥 DNA의 포착에서의 증가를 뜻밖에 보고한다. 검출기 및 분석물 양쪽 모두가 동일한 평면 상에 있음에 따라, 양쪽 분자의 확산이 3차원보다는 2차원이기 때문에 초 당 ~103 M s-1 더 많은 상호작용이 발생한다. 이는 차세대 서열분석 시스템과 같은 진단 장치에 대한 주요 관심사인 샘플 제조 요건에 극적인 영향을 미친다.
또한, 분석물을 막에 커플링시키는 것은 다양한 나노포어-효소 서열분석 용도에 장점을 부가하였다. 엑소뉴클레아제 서열분석에서, DNA 분석물이 도입될 때 포어가 영구적으로 또는 일시적으로 차단되어 개별적인 뉴클레오티드들의 검출을 방지할 수 있다. DNA 분석물의 한쪽 단부가, 예를 들어 막에 커플링 또는 테더링(tethering)되는 것에 의해, 포어로부터 멀리 배치될 때, 놀랍게도 이러한 일시적이거나 영구적인 차단이 더 이상 관찰되지 않는다는 것이 발견되었다. 막에 커플링시키는 것에 의해 DNA의 한쪽 단부를 차지함으로써, 이는 또한 검출기에 비해 분석물 농도를 효과적으로 증가시키는 작용을 하고, 따라서 서열분석 시스템의 듀티 사이클을 증가시키는 작용을 한다. 이는 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
따라서, 본 발명은 (a) 분석물을 막에 커플링시키는 단계 및 (b) 분석물이 막 내에 존재하는 검출기와 상호작용하게 함으로써 분석물의 존재, 부재 또는 특성을 결정하는 단계를 포함하는, 분석물의 존재, 부재 또는 특성을 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 하기를 또한 제공한다:
- (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 막에 커플링시키는 단계;
(b) 표적 폴리뉴클레오티드가 막 내에 존재하는 검출기와 상호작용하게 하고, 이때 검출기가 막횡단 포어 및 엑소뉴클레아제를 포함하여, 엑소뉴클레아제가 표적 폴리뉴클레오티드의 한쪽 단부로부터 개별적인 뉴클레오티드를 소화시키도록 하는 단계;
(c) 뉴클레오티드가 포어와 상호작용하게 하는 단계;
(d) 상호작용 동안 포어를 통과하는 전류를 측정함으로써 뉴클레오티드의 신원(identity)을 결정하는 단계; 및
(e) 표적 폴리뉴클레오티드의 동일한 단부에서 단계 (b) 내지 (d)를 반복함으로써 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 단계
를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드인 분석물을 서열분석하는 방법,
- (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 막에 커플링시키는 단계;
(b) 표적 폴리뉴클레오티드가 막 내에 존재하는 검출기와 상호작용하게 하고, 이때 검출기가 막횡단 포어를 포함하여, 표적 폴리뉴클레오티드가 포어를 통해 이동하도록 하는 단계; 및
(c) 포어와 관련되어 표적 폴리뉴클레오티드가 이동할 때 포어를 통과하는 전류를 측정함으로써 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 단계
를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드인 분석물을 서열분석하는 방법;
- (a) 막횡단 포어, (b) 폴리뉴클레오티드 결합 단백질 및 (c) 표적 폴리뉴클레오티드를 막에 커플링시키는 수단을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드인 분석물을 서열분석하기 위한 키트; 및
- (a) 막, (b) 막 내의 다수의 막횡단 포어, (c) 다수의 폴리뉴클레오티드 결합 단백질 및 (d) 막에 커플링된 다수의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드인 분석물을 서열분석하기 위한 기구.
도면 설명
도 1은 분석물의 나노포어 센싱(sensing)을 나타낸다. A)는 나노포어를 나타내고, 이때 전류 흐름의 방향이 회색 화살표로 지시된다. 예상 전류 트레이스(trace)가 하기에서 제시된다. B)는 분석물이 포어를 통해 전치되고 있는 나노포어를 나타낸다. 분석물 이동 방향이 화살표 1로 지시되고, 전류 흐름 방향이 회색 화살표로 지시된다. 예상 전류 트레이스가 하기에 제시되고, 이는 분석물이 포어를 통해 전치됨에 따라 어떻게 전류가 변하는지를 나타낸다.
도 2는 DNA 나노포어 상호작용을 테더링하는 방법을 나타낸다. 섹션 A 및 B는 일시적으로 테더링된 ssDNA, 및 이러한 ssDNA가 포어를 통해 전치됨에 따라 어떻게 전류 트레이스가 변하는지를 나타낸다. 섹션 C 및 D는 안정적으로 테더링된 ssDNA, 및 이러한 ssDNA가 포어에 포착됨에 따라 어떻게 전류 트레이스가 변하는지를 나타낸다.
도 3은 DNA-효소 복합체의 포착, 그 후의 DNA 및 효소의 해리, 및 이어지는 DNA 탈혼성화(de-hybridisation)를 나타낸다.
도 4는 실시예 2에 대한 실험 설정을 나타낸다. (1) 물질의 농도가 높은 나노몰 범위 (400 nM DNA가 사용되고, 800 nN 효소가 사용됨)인, 용액 내의 프라이머/주형 DNA 분석물 (A - 상부) 및 (2) 물질의 양이 나노몰 미만 (1 nM DNA가 사용되고 5 nN 효소가 사용됨)인, 테더링된 시스템 (B - 하부) 간의 비교.
도 5는 KF의 부재 하에서의 테더링되지 않은 분석물 (DNA)에 대한 나노포어의 상부에서의 KF 결합 시간을 나타낸다 (DNA 농도 = 400 nM).
도 6은 KF의 존재 하에서의 테더링되지 않은 분석물 (DNA)에 대한 나노포어의 상부에서의 KF 결합 시간을 나타낸다 (DNA 농도 = 400 nM, KF 농도 = 800 nM). KF 결합은 1-100 ms였다.
도 7은 KF의 부재 하에서의 테더링된 분석물 (DNA)에 대한 나노포어의 상부에서의 KF 결합 시간을 나타낸다 (DNA 농도 = 1 nM).
도 8은 KF의 존재 하에서의 테더링된 분석물 (DNA)에 대한 나노포어의 상부에서의 KF 결합 시간을 나타낸다 (DNA 농도 = 1 nM, KF 농도 = 5 nM). KF 결합은 0.1-10 s였다.
도 9는 일시적으로 테더링된 dsDNA의 Phi29 DNA 폴리머라제-매개 언지핑(unzipping) 이벤트의 예를 나타낸다. 개방된 포어 수준으로부터의 전류 하락은 DNA:단백질 복합체를 포착하는 것에 의해 야기된 차단인 것으로 생각된다. 수준들 간에 급속하게 변하고 나서 최종적으로는 개방된 포어 수준으로 돌아가기 전에, 이러한 포착된 복합체는 ~5초 동안 나노포어 상에 머물러서 일정한 전류 수준을 제공한 후, 간다. 이는 언지핑이 시작되기 전의 휴지인 것으로 생각되고, 단일한 A가 판독기 헤드(head)를 지나 이동하여 전류 변동을 제공한다. 듀플렉스(duplex)가 완전히 언지핑되면, 표적 가닥이 전치되고, 프라이머 및 폴리머라제가 해리되어, 전류가 개방된 포어 수준으로 돌아간다.
도 10은 용액 dsDNA의 Phi29 DNA 폴리머라제-매개 언지핑 이벤트의 예를 나타낸다. 개방된 포어 수준으로부터의 전류 하락은 DNA:단백질 복합체를 포착하는 것에 의해 야기된 차단인 것으로 생각된다. 수준들 간에 급속하게 변하고 나서 최종적으로는 개방된 포어 수준으로 돌아가기 전에, 이러한 포착된 복합체는 ~12초 동안 나노포어 상에 머물러서 일정한 전류 수준을 제공한다. 이는 언지핑이 시작되기 전의 휴지인 것으로 생각되고, 단일한 A가 판독기 헤드를 지나 이동하여 전류 변동을 제공한다. 듀플렉스가 완전히 언지핑되면, 표적 가닥이 전치되고, 프라이머 및 폴리머라제가 해리되어, 전류가 개방된 포어 수준으로 돌아간다.
도 11은 테더링되지 않은 dsDNA 분석물에 대한 1회의 언지핑 실행으로부터의 이벤트 순서의 예를 나타낸다. 관찰된 수준의 숫자, 뿐만 아니라 이들에 대한 수준 및 기간이 테더링된 실험과 대체로 일치한다.
도 12는 테더링된 dsDNA 분석물에 대한 1회의 언지핑 실행으로부터의 이벤트 순서의 예를 나타낸다. 관찰된 수준의 숫자, 뿐만 아니라 이들에 대한 수준 및 기간이 용액 (테더링되지 않은) DNA 실험과 대체로 일치한다.
도 13은 게놈 DNA로부터의 테더링된 가닥 서열분석 분석물의 플라스미드 지도를 나타낸다. PhiX 174 게놈 DNA에 상보적이도록 프라이머가 디자인되었다. 모두에 대해 동일한 센스(sense) 프라이머가 사용되었고, 이는 상보성 영역 이전의 4개의 무염기(abasic) 부위가 이어지는 5'-50폴리T 영역을 함유하였다. 안티센스(antisense) 프라이머에 대한 혼성화 부위는 원하는 단편 크기에 따라 다양하였다. 각각의 안티센스 프라이머는 5'-콜레스테롤 기를 함유하였다.
도 14는 게놈 DNA로부터의 테더링된 가닥 서열분석 분석물의 PCR 생성을 나타낸다. PhiX 174 게놈 DNA에 상보적이도록 프라이머가 디자인되었다. 모두에 대해 동일한 센스 프라이머가 사용되었고, 이는 상보성 영역 이전의 4개의 무염기 부위가 이어지는 5'-50폴리T 영역을 함유하였다. 안티센스 프라이머에 대한 혼성화 부위는 원하는 단편 크기에 따라 다양하였다. 각각의 안티센스 프라이머는 5'-콜레스테롤 기를 함유하였다. 센스 가닥의 5'에 대한 50폴리T 영역의 존재를 확증하기 위해, 단편들을 5'-3' 단일 가닥 특이적 RecJ 엑소뉴클레아제 (NEB)로 소화시키고, 이를 겔 상에서 분석하였다. 레인 1은 50nt ssDNA, 235 bp dsDNA만 함유한다. 레인 2는 50nt ssDNA, 5'-3' 단일 가닥 특이적 RecJ 엑소뉴클레아제 (NEB)로 절단된 235 bp dsDNA를 함유한다. 레인 3은 50nt ssDNA, 400 bp dsDNA만 함유한다. 레인 4는 50nt ssDNA, 5'-3' 단일 가닥 특이적 RecJ 엑소뉴클레아제 (NEB)로 절단된 400 bp dsDNA를 함유한다. 레인 5는 50nt ssDNA, 835 bp dsDNA만 함유한다. 레인 6은 50nt ssDNA, 5'-3' 단일 가닥 특이적 RecJ 엑소뉴클레아제 (NEB)로 절단된 835 bp dsDNA를 함유한다.
도 15는 800 bp PhiX 174 증폭 단편으로부터의 언지핑 이벤트를 나타낸다. 이러한 800 bp 서열은 제시된 플라스미드 지도 내의 지점 1과 3 사이의 서열에 상응한다.
도 16은 200 bp PhiX 174 증폭 단편으로부터의 언지핑 이벤트를 나타낸다. 이러한 200 bp 서열은 제시된 플라스미드 지도 내의 지점 1과 2 사이의 서열에 상응한다. 이러한 200량체가 도 15에 제시된 800량체 서열에 대해 정렬되고, 이때 0점이 선두이고, 갭(gap) 페널티가 추적된다 (즉, 어느 곳에서든 자유롭게 시작되지만, "내부" 갭은 페널티를 받는다). 예상대로, 200량체 섹션은 800량체의 앞부분과 정렬된다.
도 17은 고체 상태 나노포어에 대한 분석물 테더링 체계를 나타낸다. A)는 변형 표면 내로의 테더링을 나타낸다 (층 내의 테더링). B)는 변형 표면으로의 테더링을 나타낸다 (표면과의 상호작용). C)는 변형 표면 상의 지질 단층으로의 테더링을 나타낸다. D)는 변형 표면 상의 지질 이중층으로의 테더링을 나타낸다.
도 18은 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 지질 막에 커플링시키는 방법을 나타낸다. A)는 dsDNA 분석물과 상호작용하는 테더링된 단일한 dsDNA 결합 단백질을 나타낸다. B)는 단일 dsDNA 분석물과 상호작용하는 테더링된 다중 dsDNA 결합 단백질을 나타낸다. C)는 dsDNA 분석물과 상호작용하는 테더링된 단일한 화학기를 나타낸다.
도 19는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 분석물을 지질 막에 커플링시키는 방법을 나타낸다. A)는 ssDNA와 상호작용하는 테더링된 단일한 ssDNA 결합 단백질을 나타낸다. B)는 단일 ssDNA와 상호작용하는 테더링된 다중 ssDNA 결합 단백질을 나타낸다. C)는 ssDNA와 상호작용하는 테더링된 단일한 화학기를 나타낸다.
도 20은 DNA를 막에 커플링시키는 dsDNA 결합 단백질을 이용하여 나노포어를 통한 DNA 이동을 제어하기 위해 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 사용하는 한 방식의 개략도를 나타낸다. A) 테더링된 dsDNA 결합 단백질을 사용하여 DNA 분석물 (dsDNA 영역에 부착된 ssDNA 리더(leader) (회색 영역)로 이루어짐)이 막에 커플링되어, 막 표면에서의 농도 강화를 초래한다. 폴리뉴클레오티드 이동을 제어할 수 있는 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 시스 구획에 부가되고, 여기에서 4 bp 오버행(overhang)에 결합한다. B) 인가된 전압 하에, DNA 분석물이 DNA 상의 5' 리더 섹션 (회색 영역)을 통해 나노포어에 의해 포착된다. C) 인가된 역장 하에, 결합된 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 포어의 상부와 접촉하고 추가적인 미제어 전치를 방지할 때까지 DNA가 포어 내로 잡아당겨진다. 이러한 프로세스에서, 안티센스 가닥이 DNA 가닥으로부터 벗겨지고, 따라서 가닥으로부터의 dsDNA 결합 단백질의 탈착이 초래된다. D) 적합한 보조인자의 존재 하에, 포어의 상부 상의 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 DNA를 따라 이동하고, 포어를 통한 DNA의 전치를 제어한다. 3' → 5' 방향으로 DNA를 따라서 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 이동하는 것은 관통된 DNA를 인가된 장에 거슬러 다시 시스 구획으로 포어 밖으로 잡아당긴다. 나노포어를 통과하는 마지막 DNA 섹션은 5'-리더이다. 화살표는 DNA 이동 방향을 가리킨다.
도 21은 혼성화된 테더(tether)를 사용하여 나노포어를 통한 DNA 이동을 제어하기 위해 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 사용하는 한 방식의 개략도를 나타낸다. A) 혼성화된 테더를 사용하여 DNA 분석물 (dsDNA 영역에 부착된 ssDNA 리더 (회색 영역)로 이루어짐)이 막에 커플링되어, 막 표면에서의 농도 강화를 초래한다. DNA 이동을 제어할 수 있는 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 시스 구획에 부가되고, 여기에서 4 bp 오버행에 결합한다. B) 인가된 전압 하에, DNA 분석물이 DNA 상의 5' 리더 섹션 (회색 영역)을 통해 나노포어에 의해 포착된다. C) 인가된 역장 하에, 결합된 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 포어의 상부와 접촉하고 추가적인 미제어 전치를 방지할 때까지 DNA가 포어 내로 잡아당겨진다. 이러한 프로세스에서, 막에 테더링된 폴리뉴클레오티드 (점선)가 서열분석될 것 (회색 리더 영역이 있는 흑색 가닥)으로부터 벗겨진다. D) 적합한 보조인자의 존재 하에, 포어의 상부 상의 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 DNA를 따라 이동하고, 포어를 통한 DNA의 전치를 제어한다. 3' → 5' 방향으로 DNA를 따라서 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 이동하는 것은 관통된 DNA를 인가된 장에 거슬러 다시 시스 구획으로 포어 밖으로 잡아당긴다. 나노포어를 통과하는 마지막 DNA 섹션은 5'-리더이다. 화살표는 DNA 이동 방향을 가리킨다.
도 22는 혼성화된 테더를 사용하여 나노포어를 통한 DNA 이동을 제어하기 위해 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 사용하는 한 방식의 개략도를 나타낸다. A) 혼성화된 테더를 사용하여 DNA 분석물 (ssDNA 테더 (점선)에 혼성화된 ssDNA (회색으로 제시된 리더 서열이 있는 흑색 선)이 막에 커플링되어, 막 표면에서의 농도 강화를 초래한다. DNA 이동을 제어할 수 있는 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 시스 구획에 부가되고, 여기에서 4 bp 오버행에 결합한다. B) 인가된 전압 하에, DNA 분석물이 DNA 상의 5' 리더 섹션 (회색 영역)을 통해 나노포어에 의해 포착된다. C) 인가된 역장 하에, 결합된 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 포어의 상부와 접촉하고 추가적인 미제어 전치를 방지할 때까지 DNA가 포어 내로 잡아당겨진다. 이러한 프로세스에서, 막에 테더링된 가닥 (점선)이 서열분석될 ssDNA (회색 리더 영역이 있는 흑색 가닥)으로부터 벗겨진다. D) 적합한 보조인자의 존재 하에, 포어의 상부 상의 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 DNA를 따라 이동하고, 포어를 통한 DNA의 전치를 제어한다. 3' → 5' 방향으로 DNA를 따라서 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 이동하는 것은 관통된 DNA를 인가된 장에 거슬러 다시 시스 구획으로 포어 밖으로 잡아당긴다. 나노포어를 통과하는 마지막 DNA 섹션은 5'-리더이다. 화살표는 DNA 이동 방향을 가리킨다.
도 23은 마이크로RNA 검출에 사용될 수 있는 프로브(probe)를 막에 테더링시키는 여러 방법을 나타낸다. A) 프로브가 막에 영구적으로 테더링될 수 있다. 이러한 예에서, 마이크로RNA에 혼성화하는 프로브 영역은 프로브의 중앙에 있다. 프로브를 확인하는데 사용되는, 프로브의 바코드 영역 (점이 찍힌 영역)은 테더에 대해 가닥의 반대쪽 단부에 위치한다. Bi) 및 ii) 프로브가 내부 혼성화에 의해 막에 일시적으로 테더링될 수 있다. 이러한 예에서, 마이크로RNA에 혼성화하는 프로브 영역이 가닥의 한쪽 단부에 부착된다. 프로브를 확인하는데 사용되는, 프로브의 바코드 영역 (점이 찍힌 영역)은 바로 테더 위쪽 및 마이크로RNA 혼성화 영역 아래에 위치한다. Bii)에서, 프로브에 대한 테더의 혼성화 영역은 Bi)와 비교하여 이의 결합 방향이 반전된다. Ci) 및 ii) 프로브가 프로브의 한쪽 단부에 대한 혼성화에 의해 막에 일시적으로 테더링될 수 있다. 이러한 예에서, 마이크로RNA에 혼성화하는 프로브 영역은 가닥의 중앙에 위치한다. 마이크로RNA의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용되는 바코드 영역 (점이 찍힌 영역)은 테더에 대한 프로브의 반대쪽 단부에서 마이크로RNA 혼성화 영역 아래에 위치한다. Cii)에서, 프로브에 대한 테더의 혼성화 영역은 Ci)와 비교하여 이의 결합 방향이 반전된다.
서열 목록 설명
서열 1은 NNN-RRK 돌연변이체 MspA 단량체를 코딩하는 코돈-최적화 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 2 ("B1"으로도 지칭됨)는 성숙 형태의 MspA 단량체의 NNN-RRK 돌연변이체의 아미노산 서열을 나타낸다. 이러한 돌연변이체는 신호 서열이 없고, 하기의 돌연변이를 포함한다: D90N, D91N, D93N, D118R, D134R 및 E139K. 이러한 돌연변이들은 MspA 포어를 통한 DNA 전이를 허용한다.
서열 3은 α-용혈소-M111R (α-HL-R)의 한 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 4는 α-HL-R의 한 서브유닛을 코딩하는 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 5는 Phi29 DNA 폴리머라제를 코딩하는 코돈-최적화 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 6은 Phi29 DNA 폴리머라제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 7은 이. 콜라이(E. coli)로부터의 sbcB 유전자로부터 유래된 코돈-최적화 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이는 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I 효소 (EcoExo I)를 코딩한다.
서열 8은 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I 효소 (EcoExo I)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 9는 이. 콜라이로부터의 xthA 유전자의 코돈-최적화 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이는 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소를 코딩한다.
서열 10은 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소의 아미노산 서열을 나타낸다. 이러한 효소는 3' - 5' 방향의 이중 가닥 DNA (dsDNA)의 한쪽 가닥으로부터의 5' 모노포스페이트 뉴클레오시드의 분배성(distributive) 소화를 수행한다. 가닥 상에서의 효소 개시는 뉴클레오티드 약 4개의 5' 오배행을 필요로 한다.
서열 11은 티. 써모필루스(T. thermophilus)로부터의 recJ 유전자의 코돈-최적화 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이는 티. 써모필루스로부터의 RecJ 효소 (TthRecJ-cd)를 코딩한다.
서열 12는 티. 써모필루스로부터의 RecJ 효소 (TthRecJ-cd)의 아미노산 서열을 나타낸다. 이러한 효소는 5' - 3' 방향의 ssDNA로부터의 5' 모노포스페이트 뉴클레오시드의 진행성(processive) 소화를 수행한다. 가닥 상에서의 효소 개시는 뉴클레오티드 4개 이상을 필요로 한다.
서열 13은 박테리오파지 람다 exo (redX) 유전자로부터 유래된 코돈-최적화 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이는 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제를 코딩한다.
서열 14는 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제의 아미노산 서열을 나타낸다. 이러한 서열은 삼량체로 조립되는 3개의 동일한 서브유닛 중 하나이다. 이러한 효소는 5'-3' 방향의 dsDNA의 한쪽 가닥으로부터의 뉴클레오티드의 고도로 진행성인 소화를 수행한다 (http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0262.asp). 가닥 상에서의 효소 개시는 우선적으로 5' 포스페이트가 있는 뉴클레오티드 약 4개의 5' 오버행을 필요로 한다.
서열 15 내지 17은 성숙 형태의 MspB, C 및 D 돌연변이체 각각의 아미노산 서열을 나타낸다. 성숙 형태에는 신호 서열이 없다.
서열 18 내지 32는 실시예에서 사용된 서열을 나타낸다.
서열 33은 α-HL-Q의 한 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 34는 α-HL-Q의 한 서브유닛의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 35는 α-HL-E287C-QC-D5FLAGH6의 한 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 36은 α-HL-E287C-QC-D5FLAGH6의 한 서브유닛의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 37은 α-용혈소-E111N/K147N (α-HL-NN; 문헌 [Stoddart et al., PNAS, 2009; 106(19): 7702-7707])의 한 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 38은 α-HL-NN의 한 서브유닛의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 39는 실시예 5에서 사용된 서열을 나타낸다.
서열 40 및 41은 실시예 6에서 사용된 서열을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
개시된 생성물 및 방법의 여러 용도가 업계에서의 특정 요구에 맞춰질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본원에서 사용된 전문 용어는 단지 본 발명의 특정 실시양태를 기술하기 위한 것이고, 제한적인 것으로 의도되지 않는다는 것을 또한 이해하여야 한다.
또한, 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 경우에, 단수형 형태 "a", "an", 및 "the"는 문맥적으로 명확하게 달리 지시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "분석물"에 대한 언급은 2개 이상의 분석물을 포함하고, "검출기"에 대한 언급은 2개 이상의 이같은 검출기를 포함하며, "포어"에 대한 언급은 2개 이상의 이같은 포어를 포함하고, "핵산 서열"에 대한 언급은 2개 이상의 이같은 서열을 포함하는 것 등이다.
본원에서 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 상기이든 하기이든, 이에 의해 전문이 참고로 포함된다.
본 발명의 방법
본 발명은 분석물의 존재, 부재 또는 특성을 결정하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 분석물을 막에 커플링시키는 단계 및 분석물이 막 내에 존재하는 검출기와 상호작용하게 하는 단계를 포함한다. 이에 의해 분석물의 존재, 부재 또는 특성이 결정된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 분석물을 막에 커플링시키는 단계 및 (b) 분석물이 막 내에 존재하는 검출기와 상호작용하게 함으로써 분석물의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 분석물의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다.
상기 논의된 바와 같이, 분석물을 검출기를 함유하는 막에 커플링시키는 것은 필요한 분석물의 양을 여러 차수만큼 저하시킨다. 당연히 이러한 방법은 낮은 농도로 존재하는 분석물을 검출하는데 유리하다. 바람직하게는, 이러한 방법은 분석물이 약 0.001 pM 내지 약 1 nM, 예컨대 0.01 pM 미만, 0.1 pM 미만, 1 pM 미만, 10 pM 미만 또는 100 pM 미만의 농도로 존재할 때 분석물의 존재 또는 특성이 결정되게 한다.
본 발명의 방법은 핵산 서열분석에 특히 유리한데, 이는 상기 논의된 바와 같이 소량의 정제된 핵산만이 인간 혈액으로부터 수득될 수 있기 때문이다. 바람직하게는, 이러한 방법은 약 0.001 pM 내지 약 1 nM, 예컨대 0.01 pM 미만, 0.1 pM 미만, 1 pM 미만, 10 pM 미만 또는 100 pM 미만의 농도로 존재하는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 추정하는 것을 허용하거나 또는 이의 서열분석을 허용한다.
폴리뉴클레오티드의 한쪽 단부를 막에 (심지어 임시적으로) 커플링시키는 것은 이러한 단부가 나노포어-기반 서열분석 프로세스를 방해하는 것이 방지될 것임을 또한 의미한다. 이는 본 발명의 엑소뉴클레아제 서열분석 방법을 참조로 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
본 발명의 방법은 분석물, 예컨대 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 특성을 결정 또는 측정하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 분석물, 예컨대 폴리뉴클레오티드의 2가지, 3가지, 4가지 또는 5가지 또는 이를 초과하는 특성을 결정 또는 측정하는 것을 수반할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대해, 하나 이상의 특성은 바람직하게는 (i) 표적 폴리뉴클레오티드의 길이, (ii) 표적 폴리뉴클레오티드의 신원, (iii) 표적 폴리뉴클레오티드의 서열, (iv) 표적 폴리뉴클레오티드의 2차 구조 및 (v) 표적 폴리뉴클레오티드가 변형되었는지 또는 그렇지 않은지 여부로부터 선택된다. (i) 내지 (v)의 임의의 조합이 본 발명에 따라 결정 또는 측정될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 방법은 폴리뉴클레오티드의 서열을 추정하는 것 또는 이를 서열분석하는 것을 포함한다.
분석물
분석물은 임의의 물질일 수 있다. 적절한 분석물에는 금속 이온, 무기 염, 중합체, 예컨대 중합체성 산 또는 염기, 염료, 표백제, 제약, 진단제, 유흥 약물, 폭약 및 환경 오염물질이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
분석물은 세포로부터 분비되는 분석물일 수 있다. 별법으로, 분석물이 세포 내부에 존재하는 분석물일 수 있어서, 본 발명이 수행될 수 있기 전에 분석물이 세포로부터 추출되어야 한다.
분석물은 바람직하게는 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드이다. 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 천연 발생 또는 비-천연 발생일 수 있다. 폴리펩티드 또는 단백질은 내부에 합성 또는 변형 아미노산을 포함할 수 있다. 아미노산에 대한 다수의 상이한 유형의 변형이 업계에 공지되어 있다. 본 발명의 목적을 위해, 분석물이 업계에서 이용가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있음을 이해하여야 한다.
단백질은 효소, 항체, 호르몬, 성장 인자 또는 성장 조절 단백질, 예컨대 시토카인일 수 있다. 시토카인은 인터류킨, 바람직하게는 IFN-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 또는 IL-13, 인터페론, 바람직하게는 IL-γ 또는 기타 시토카인 예컨대 TNF-α로부터 선택될 수 있다. 단백질은 박테리아 단백질, 진균 단백질, 바이러스 단백질 또는 기생충-유래 단백질일 수 있다. 포어 또는 채널과 접촉되기 전에, 단백질이 폴리펩티드 사슬을 형성하도록 언폴딩(unfolding)될 수 있다.
분석물은 가장 바람직하게는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 핵산이다. 하기에서 더욱 상세하게 폴리뉴클레오티드가 논의된다. 폴리뉴클레오티드는 이의 5' 단부 또는 3' 단부에서 또는 가닥을 따라 있는 하나 이상의 중간 지점에서 커플링될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 하기 논의된 바와 같이 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 원형일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 앱타머(aptamer), 마이크로RNA에 혼성화하는 프로브, 또는 마이크로RNA 자체일 수 있다 (문헌 [Wang, Y. et al, Nature Nanotechnology, 2011, 6, 668-674]).
분석물이 마이크로RNA에 혼성화하는 프로브인 경우에, 프로브가 막에 영구적으로 (도 23A) 또는 일시적으로 (도 23 B 및 C) 커플링될 수 있다. 프로브 자체가 막에 직접적으로 커플링되도록 개조될 수 있거나, 또는 막에 커플링되도록 개조된 상보적 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있다. 분석물은 프로브에 혼성화된 마이크로RNA의 복합체일 수 있고, 이때 프로브에는 이를 명확하게 확인될 수 있게 하는 독특한 서열 또는 바코드가 있다.
분석물이 앱타머인 경우, 앱타머가 막에 영구적으로 또는 일시적으로 커플링될 수 있다. 앱타머 자체가 막에 직접적으로 커플링되도록 개조될 수 있거나, 또는 막에 커플링되도록 개조된 상보적 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있다. 앱타머가 단백질 분석물에 결합 또는 미결합될 수 있고, 앱타머를 검출하는 궁극적인 목적은 앱타머가 결합된 단백질 분석물의 존재, 부재 또는 특성를 검출하는 것일 수 있다.
분석물은 임의의 적절한 샘플 내에 존재한다. 전형적으로 본 발명은 분석물을 함유하는 것으로 공지되었거나 이를 함유하는 것으로 생각되는 샘플 상에서 수행된다. 신원 미상인 하나 이상의 분석물을 함유하는 샘플 상에서 본 발명이 수행될 수 있다. 별법으로, 샘플 내의 존재가 공지되어 있거나 예상되는 하나 이상의 분석물의 신원을 확증하기 위해 샘플 상에서 본 발명이 수행될 수 있다.
샘플은 생물학적 샘플일 수 있다. 임의의 생물 또는 미생물로부터 수득되거나 추출된 샘플 상에서 시험관 내에서 본 발명이 수행될 수 있다. 생물 또는 미생물은은 전형적으로는 시생대, 원핵생물 또는 진핵생물이고, 전형적으로는 5계 중 하나에 속한다: 식물계, 동물계, 균계, 원핵생물계 및 원생생물계. 임의의 바이러스로부터 수득되거나 추출된 샘플 상에서 시험관 내에서 본 발명이 수행될 수 있다. 바람직하게는 샘플은 유체 샘플이다. 전형적으로 샘플은 환자의 체액을 포함한다. 샘플은 소변, 림프, 타액, 점액 또는 양수일 수 있지만, 바람직하게는 혈액, 혈장 또는 혈청이다. 전형적으로, 샘플은 인간 기원이지만, 별법으로 샘플이 또 다른 포유동물로부터 예컨대 말, 소, 양 또는 돼지와 같이 상업적으로 사육되는 동물로부터의 것일 수 있거나 또는 별법으로 고양이 또는 개와 같은 애완동물로부터의 것일 수 있다. 별법으로, 상업 작물, 예컨대 곡물, 콩, 과일 또는 채소, 예를 들어, 밀, 보리, 귀리, 캐놀라, 옥수수, 대두, 벼, 바나나, 사과, 토마토, 감자, 포도, 담배, 강낭콩, 렌즈콩, 사탕수수, 코코아, 면으로부터 식물 기원의 샘플이 전형적으로 수득된다.
샘플은 비-생물학적 샘플일 수 있다. 비-생물학적 샘플은 바람직하게는 유체 샘플이다. 비-생물학적 샘플의 예로는 수술용 유체, 물 예컨대 식수, 해수 또는 강물, 및 실험실 테스트용 시약이 포함된다.
전형적으로는, 예를 들어 원심분리에 의해 또는 원치 않는 분자 또는 세포, 예컨대 적혈구를 여과해내는 막을 통과시키는 것에 의해, 검정되기 전에 샘플이 프로세싱된다. 취득 시 바로 샘플을 측정할 수 있다. 또한 전형적으로 샘플이 검정법 전에, 바람직하게는 -70℃ 미만에서, 보관될 수 있다.
막
임의의 막이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 적절한 막이 업계에 주지되어 있다. 바람직하게는 막은 친양쪽성 층이다. 친양쪽성 층은 친수성 및 친지성 성질 양쪽 모두를 지니는 친양쪽성 분자, 예컨대 인지질로부터 형성된 층이다. 친양쪽성 분자는 합성 또는 천연 발생일 수 있다. 비-천연 발생 친양쪽성 물질 및 단층을 형성하는 친양쪽성 물질이 업계에 주지되어 있고, 예를 들어, 블록 공중합체가 이에 포함된다 (문헌 [Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450]). 블록 공중합체는 2개 이상의 단량체 서브유닛이 함께 중합되어 단일 중합체 사슬을 형성하고 있는 중합체성 물질이다. 전형적으로 블록 공중합체는 각각의 단량체 서브유닛이 기여하는 성질이 있다. 그러나, 블록 공중합체는 개별적인 서브유닛으로부터 형성된 중합체가 보유하지 않는 독특한 성질이 있을 수 있다. 수성 매질 내에 있을 때 단량체 서브유닛 중 하나는 소수성 (즉, 친지성)인 한편, 다른 서브유닛(들)은 친수성이도록 블록 공중합체가 조작될 수 있다. 이러한 경우에, 블록 공중합체는 친양쪽성 성질을 보유할 수 있고, 생물학적 막을 모방하는 구조를 형성할 수 있다. 블록 공중합체는 2블록 (2개의 단량체 서브유닛으로 이루어짐)일 수 있지만, 또한 2개를 초과하는 단량체 서브유닛으로부터 구축되어, 친양쪽성 물질로서 거동하는 더욱 복잡한 배열을 형성할 수도 있다. 공중합체는 3블록, 4블록 또는 5블록 공중합체일 수 있다.
원시세균 2극성 테트라에테르 지질은 지질이 단층 막을 형성하도록 구축된 천연 발생 지질이다. 일반적으로 이러한 지질은 가혹한 생물학적 환경에서 생존하는 극한미생물(extremophile), 호열균(thermophiles), 호염균(halophile) 및 호산균(acidophile)에서 발견된다. 이들의 안정성은 최종 이중층의 융합 성질로부터 유래되는 것으로 여겨진다. 일반적인 친수성-소수성-친수성 모티프가 있는 3블록 중합체를 생성시키는 것에 의해 이러한 생물학적 실체를 모방하는 블록 공중합체 물질을 구축하기가 수월하다. 이러한 물질은 지질 이중층과 유사하게 거동하고 소포에서 층상 막까지의 광범위한 상 거동을 포함하는 단량체성 막을 형성할 수 있다. 이러한 3블록 공중합체로부터 형성된 막은 생물학적 지질 막에 비해 여러 장점을 보유한다. 이러한 3블록 공중합체가 합성되기 때문에, 막을 형성하는데, 그리고 포어 및 기타 단백질과 상호작용하는데 요구되는 올바른 사슬 길이 및 성질을 제공하도록 정확한 구축이 주의 깊게 제어될 수 있다.
지질 하위물질로 분류되지 않는 서브유닛으로부터 블록 공중합체가 또한 구축될 수 있다; 예를 들어 소수성 중합체가 실록산 또는 기타 비-탄화수소 기반 단량체로부터 제조될 수 있다. 블록 공중합체의 친수성 하위 섹션은 낮은 단백질 결합 성질을 또한 보유할 수 있고, 이는 미가공 생물학적 샘플에 노출될 때 고도로 저항성인 막이 형성되게 한다. 이러한 머리 기 단위는 비-고전적 지질 머리 기로부터 또한 유래될 수 있다.
3블록 공중합체 막은 생물학적 지질 막과 비교하여 기계적 및 환경적 안정성이 또한 증가될 수 있고, 예를 들어, 작업 온도 또는 pH 범위가 훨씬 더 높을 수 있다. 블록 공중합체의 합성 성질은 중합체 기반 막을 광범위한 용도에 맞춤화하는 플랫폼을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 분석물을 3블록 공중합체를 포함하는 막에 커플링시키고, 임의로는 이때 커플링을 용이하게 하도록 막이 변형되는 단계, 및 (b) 분석물이 막 내에 존재하는 검출기와 상호작용하게 함으로써 분석물의 존재, 부재 또는 특성를 결정하는 단계를 포함하는, 분석물의 존재, 부재 또는 특성을 결정하는 방법을 제공한다. 상기 논의된 바와 같이, 3블록 공중합체는 3가지 상이한 단량체 서브유닛으로부터 형성된 중합체이다.
분석물의 커플링을 용이하게 하도록 친양쪽성 분자가 화학적으로 변형되거나 관능화될 수 있다.
친양쪽성 층은 단층 또는 이중층일 수 있다. 전형적으로는 친양쪽성 층은 평면이다. 친양쪽성 층이 곡선일 수 있다.
전형적으로 친양쪽성 막은 천연적으로 이동성이어서, 본질적으로는 지질 확산 속도가 약 10-8 cm s-1인 2차원 유체로서 작용한다. 이는 검출기 및 커플링된 분석물이 전형적으로 친양쪽성 막 내에서 이동할 수 있다는 것을 의미한다.
막은 바람직하게는 지질 이중층이다. 지질 이중층은 세포막의 모델이고, 광범위한 실험 연구를 위한 우수한 플랫폼으로서의 역할을 한다. 예를 들어, 지질 이중층이 단일 채널 기록에 의한 막 단백질의 시험관내 연구에 사용될 수 있다. 별법으로, 지질 이중층이 광범위한 물질의 존재를 검출하기 위한 바이오센서로서 사용될 수 있다. 지질 이중층은 임의의 지질 이중층일 수 있다. 적절한 지질 이중층에는 평면형 지질 이중층, 지지형 이중층 또는 리포솜이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 지질 이중층은 바람직하게는 평면형 지질 이중층이다. 적절한 지질 이중층이 국제 출원 번호 PCT/GB08/000563 (WO 2008/102121로 공개됨), 국제 출원 번호 PCT/GB08/004127 (WO 2009/077734로 공개됨) 및 국제 출원 번호 PCT/GB2006/001057 (WO 2006/100484로 공개됨)에 개시되어 있다.
지질 이중층을 형성시키는 방법이 업계에 공지되어 있다. 적절한 방법이 실시예에서 개시된다. 지질 이중층은 지질 단층이 수성 용액/공기 계면에 대해 수직인 구멍의 어느 한쪽 측면을 지나 수성 용액/공기 계면 상에 보유되는 문헌 [Montal and Mueller, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1972; 69: 3561-3566]의 방법에 의해 통상적으로 형성된다. 먼저 지질을 유기 용매에 용해시킨 후 용매 액적이 구멍의 어느 한쪽 상의 수성 용액의 표면 상에서 증발하게 함으로써, 일반적으로 지질이 수성 전해질 용액의 표면 상에 부가된다. 유기 용매가 증발되면, 이중층이 형성될 때까지 구멍의 어느 한쪽 상의 용액/공기 계면이 구멍을 지나 물리적으로 위아래로 이동된다. 평면형 지질 이중층이 막 내의 구멍을 가로질러 또는 개구부를 가로질러 오목부(recess) 내로 형성될 수 있다.
단백질 포어 삽입에 적절한 양호한 품질의 지질 이중층을 형성시키는 비용-효과적이고 비교적 수월한 방법이기 때문에 몬탈(Montal) & 뮐러(Mueller)의 방법은 대중적이다. 기타 통상적인 이중층 형성 방법에는 팁-담금(tip-dipping), 이중층 페인팅, 및 리포솜 이중층의 패치-클램핑(patch-clamping)이 포함된다.
팁-담금 이중층 형성은 지질 단층을 보유하는 테스트 용액의 표면으로 구멍 표면 (예를 들어, 피펫 팁)을 접촉시키는 것을 수반한다. 또 다시, 유기 용매에 용해된 지질의 액적을 용액 표면에서 증발하게 함으로써 먼저 지질 단층이 용액/공기 계면에서 생성된다. 그 후, 이중층이 랭뮤어-쉐퍼(Langmuir-Schaefer) 프로세스에 의해 형성되고, 용액 표면에 대해 구멍을 이동하도록 기계적인 오토메이션을 필요로 한다.
페인트 이중층에 대해서는, 수성 테스트 용액 내에 함침된 구멍에 직접적으로 유기 용매에 용해된 지질의 액적이 적용된다. 페인트브러시 또는 등가물을 사용하여 지질 용액이 구멍 너머로 얇게 확산된다. 용매가 박층화되는 것이 지질 이중층의 형성을 초래한다. 그러나, 이중층으로부터의 완전한 용매 제거가 어렵고, 결과적으로 이러한 방법으로 형성된 이중층은 덜 안정적이고, 전기화학 측정 동안 노이즈(noise) 경향이 더 크다.
패치-클램핑은 생물학적 세포 막의 연구에서 통상적으로 사용된다. 세포 막이 흡인에 의해 피펫의 단부에 클램핑되고, 막의 패치가 구멍 너머로 부착되게 된다. 리포솜을 클램핑하고, 그 후 리포솜이 파열되어 피펫의 구멍 너머로 지질 이중층 실링(sealing)을 남기는 것에 의해 지질 이중층을 생산하기 위해 이러한 방법이 개조되었다. 이러한 방법은 안정적이고, 거대하며, 단층인 리포솜, 및 유리 표면이 있는 물질 내의 소형 구멍의 제작을 필요로 한다.
초음파처리, 추출 또는 모자파리(Mozafari) 방법 (문헌 [Colas et al. (2007) Micron 38:841-847])에 의해 리포솜이 형성될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 국제 출원 번호 PCT/GB08/004127 (WO 2009/077734로 공개됨)에 기술된 바와 같이 지질 이중층이 형성된다. 유리하게는, 이러한 방법에서, 지질 이중층이 건조 지질로부터 형성된다. 가장 바람직한 실시양태에서, WO2009/077734 (PCT/GB08/004127)에 기술된 바와 같이 개구부를 가로질러 지질 이중층이 형성된다.
지질 이중층은 2개의 반대되는 지질 층으로부터 형성된다. 2개의 지질 층은 이들의 소수성 꼬리 기가 서로를 향하여 소수성 내부를 형성하도록 배열된다. 지질의 친수성 머리 기는 이중층의 각각의 측면 상에서 수성 환경을 향해 밖으로 향한다. 액체 불규칙 상 (유체 층상), 액체 규칙 상, 고체 규칙 상 (층상 겔 상, 상호교차 겔 상) 및 평면형 이중층 결정 (층상 서브-겔(sub-gel) 상, 층상 결정질 상)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 지질 상 내에 이중층이 존재할 수 있다.
지질 이중층을 형성하는 임의의 지질 조성물을 사용할 수 있다. 원하는 성질, 예컨대 표면 전하, 막 단백질을 지지하는 능력, 패킹(packing) 밀도 또는 기계적 성질이 있는 지질 이중층이 형성되도록 지질 조성물이 선택된다. 지질 조성물은 하나 이상의 상이한 지질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지질 조성물은 100가지까지의 지질을 함유할 수 있다. 바람직하게는 지질 조성물은 1가지 내지 10가지의 지질을 함유한다. 지질 조성물은 천연 발생 지질 및/또는 인공 지질을 포함할 수 있다.
전형적으로 지질은 머리 기, 계면 모이어티(moiety), 및 동일하거나 상이할 수 있는 2개의 소수성 꼬리 기를 포함한다. 적절한 머리 기에는 중성 머리 기, 예컨대 디아실글리세리드 (DG) 및 세라마이드 (CM); 쯔비터이온성 머리 기, 예컨대 포스파티딜콜린 (PC), 포스파티딜에탄올아민 (PE) 및 스핑고미엘린 (SM); 음성 전하를 띠는 머리 기, 예컨대 포스파티딜글리세롤 (PG); 포스파티딜세린 (PS), 포스파티딜이노시톨 (PI), 포스파트산 (PA) 및 카르디올리핀 (CA); 및 양성 전하를 띠는 머리 기, 예컨대 트리메틸암모늄-프로판 (TAP)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 적절한 계면 모이어티에는 천연 발생 계면 모이어티, 예컨대 글리세롤-기반 또는 세라마이드-기반 모이어티가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 적절한 소수성 꼬리 기에는 포화 탄화수소 사슬, 예컨대 라우르산 (n-도데카놀산), 미리스트산 (n-테트라데카논산), 팔미트산 (n-헥사데칸산), 스테아르산 (n-옥타데칸산) 및 아라키드산 (n-에이코사노산); 불포화 탄화수소 사슬, 예컨대 올레산 (시스-9-옥타데칸산); 및 분지형 탄화수소 사슬, 예컨대 피타노일이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 불포화 탄화수소 사슬 내의 사슬 길이 및 이중 결합의 위치 및 개수가 변할 수 있다. 분지형 탄화수소 사슬 내의 사슬 길이 및 분지, 예컨대 메틸 기의 위치 및 개수가 변할 수 있다. 소수성 꼬리 기가 에테르 또는 에스테르로서 계면 모이어티에 연결될 수 있다.
지질이 화학적으로 변형될 수도 있다. 지질의 머리 기 또는 꼬리 기가 화학적으로 변형될 수 있다. 머리 기가 화학적으로 변형된 적절한 지질에는 PEG-변형 지질, 예컨대 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]; 관능화된 PEG 지질, 예컨대 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3 포스포에탄올아민-N-[비오티닐(폴리에탈렌 글리콜)2000]; 및 접합용으로 변형된 지질, 예컨대 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(숙시닐) 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(비오티닐)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 꼬리 기가 화학적으로 변형된 적절한 지질에는 중합가능한 지질, 예컨대 1,2-비스(10,12-트리코사디이노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린; 플루오르화 지질, 예컨대 1-팔미토일-2-(16-플루오로팔미토일)-sn-글리세로-3-포스포콜린; 중수소화 지질, 예컨대 1,2-디팔미토일-D62-sn-글리세로-3-포스포콜린; 및 에테르가 연결된 지질, 예컨대 1,2-디-O-피타닐-sn-글리세로-3-포스포콜린이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 분석물의 커플링을 용이하게 하기 위해 지질이 화학적으로 변형되거나 또는 관능화될 수 있다.
친양쪽성 층, 예를 들어 지질 조성물은 이러한 층의 성질에 영향을 미칠 하나 이상의 첨가제를 전형적으로 포함한다. 적절한 첨가제에는 지방산, 예컨대 팔미트산, 미리스트산 및 올레산; 지방 알콜, 예컨대 팔미틱 알콜, 미리스틱 알콜 및 올레익 알콜; 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 에르고스테롤, 라노스테롤, 시토스테롤 및 스티그마스테롤; 리소인지질, 예컨대 1-아실-2-히드록시-sn- 글리세로-3-포스포콜린; 및 세라마이드가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 막은 고체 상태 층이다. 고체 상태 층은 이의 기원이 생물학적이지 않다. 달리 말하면, 고체 상태 층은 생물학적 환경 예컨대 생물 또는 세포, 또는 생물학적으로 입수가능한 구조의 합성에 의해 제작된 버전으로부터 유래 또는 단리되지 않는다. 마이크로전자 물질, 절연 물질 예컨대 Si3N4, A1203, 및 SiO, 유기 및 무기 중합체 예컨대 폴리아미드, 플라스틱 예컨대 테프론(Teflon)® 또는 엘라스토머(elastomer) 예컨대 2-성분 부가-경화 실리콘 고무, 및 유리를 포함하지만 이에 한정되지 않는 유기 및 무기 물질 양쪽으로부터 고체 상태 층이 형성될 수 있다. 그래핀으로부터 고체 상태 층이 형성될 수 있다. 적절한 그래핀 층이 국제 출원 번호 PCT/US2008/010637 (WO 2009/035647로 공개됨)에 개시되어 있다.
커플링
임의의 공지된 방법을 사용하여 분석물을 막에 커플링시킬 수 있다. 막이 친양쪽성 층, 예컨대 지질 이중층인 경우, 바람직하게는 분석물이 막 내에 존재하는 폴리펩티드 또는 막 내에 존재하는 소수성 앵커(anchor)를 통해 막에 커플링된다. 소수성 앵커는 바람직하게는 지질, 지방산, 스테롤, 탄소 나노튜브(nanotube), 폴리펩티드, 단백질 또는 아미노산, 예를 들어 콜레스테롤, 팔미테이트 또는 토코페롤이다. 바람직한 실시양태에서, 분석물이 검출기를 통해 막에 커플링되지 않는다.
분석물을 직접적으로 또는 하나 이상의 링커를 통해 막에 커플링시키는 것을 용이하게 하도록 막의 성분, 예컨대 친양쪽성 분자 또는 지질이 화학적으로 변형되거나 관능화될 수 있다. 적절한 화학적 변형 및 막 성분의 적절한 관능화 방식의 예가 하기에서 더욱 상세하게 기술된다. 임의 비율의 막 성분, 예를 들어 0.01％ 이상, 0.1％ 이상, 1％ 이상, 10％ 이상, 25％ 이상, 50％ 이상 또는 100％이 관능화될 수 있다.
분석물이 막에 직접적으로 커플링될 수 있다. 1개 이상, 예컨대 2개, 3개, 4개 또는 이를 초과하는 개수의 지점에서 분석물이 막에 직접적으로 커플링될 수 있다.
바람직하게는 링커를 통해 분석물이 막에 커플링된다. 1개 이상, 예컨대 2개, 3개, 4개 또는 이를 초과하는 개수의 링커를 통해 분석물이 막에 커플링될 수 있다. 1개의 링커가 1개를 초과하는 분석물, 예컨대 2개, 3개, 4개 또는 이를 초과하는 개수의 분석물을 막에 커플링시킬 수 있다.
분석물은 하나 이상의 지점에서 직접적으로, 그리고 하나 이상의 링커를 통해 막에 커플링될 수 있다.
바람직한 링커에는 중합체, 예컨대 폴리뉴클레오티드, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 다당류 및 폴리펩티드가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 링커는 선형, 분지형 또는 원형일 수 있다. 예를 들어, 링커는 원형 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 분석물 자체가 폴리뉴클레오티드인 경우, 이는 이러한 원형 폴리뉴클레오티드 상의 상보적인 서열에 혼성화될 수 있다.
관능화된 링커 및 이들이 분자를 커플링시킬 수 있는 방식이 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 말레이미드 기로 관능화된 링커는 단백질 내의 시스테인 잔기와 반응하여 이에 부착될 것이다. 본 발명의 정황에서, 단백질은 막 내에 존재할 수 있거나, 분석물 자체일 수 있거나, 또는 분석물에 결합하는데 사용될 수 있다. 이는 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
"자물쇠 & 열쇠(lock & key)" 배열을 사용하여 분석물의 가교를 피할 수 있다. 각각의 링커의 한쪽 단부만 함께 반응하여 더 긴 링커를 형성할 수 있고, 각각의 링커의 다른 쪽 단부는 개별적으로 분석물 또는 막과 반응한다. 이같은 링커가 국제 출원 번호 PCT/GB10/000132 (WO 2010/086602로 공개됨)에 기술되어 있다.
하기 논의되는 서열분석 실시양태에서 링커 사용이 선호된다. 폴리뉴클레오티드 분석물이 영구적으로 막에 직접적으로 커플링되면, 서열분석 실행이 막과 검출기 사이의 거리로 인해 폴리뉴클레오티드의 단부까지 계속될 수 없음에 따라 일부 서열 데이터가 손실될 것이다. 링커가 사용되면, 폴리뉴클레오티드 분석물이 끝까지 프로세싱될 수 있다. 커플링은 영구적이거나 안정적일 수 있다. 달리 말하면, 커플링은 분석물이 방법 동안 막에 커플링되어 남아 있도록 하는 것일 수 있다. 커플링은 일시적일 수 있다. 달리 말하면, 커플링은 분석물의 커플링이 방법 동안 막으로부터 탈착되도록 하는 것일 수 있다. 특정 용도, 예컨대 앱타머 검출를 위해, 커플링의 일시적인 성질이 선호된다. 영구적이거나 안정적인 링커가 폴리뉴클레오티드의 5' 또는 3' 단부에 직접적으로 부착되고, 링커가 이중층과 나노포어의 채널 또는 폴리뉴클레오티드 결합 단백질의 활성 부위 사이의 거리보다 짧으면, 서열분석 실행이 폴리뉴클레오티드의 단부까지 계속될 수 없음에 따라 일부 서열 데이터가 손실될 것이다. 커플링이 일시적이면, 커플링된 단부가 무작위로 이중층으로부터 자유롭게 되었을 때, 폴리뉴클레오티드가 끝까지 프로세싱될 수 있다. 막과 영구적/안정적 또는 일시적 연결을 형성하는 화학 기가 하기에서 더욱 상세하게 논의된다. 콜레스테롤 또는 지방산 사슬을 사용하여 친양쪽성 층 또는 지질 이중층에 분석물이 일시적으로 커플링될 수 있다. 탄소 원자 6개 내지 30개 길이의 임의의 지방산 사슬, 예컨대 헥사데칸산이 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 분석물, 예컨대 핵산이 친양쪽성 층 예컨대 지질 이중층에 커플링된다. 핵산을 합성 지질 이중층에 커플링하는 것이 다양한 상이한 테더링 전략으로 기존에 수행되었다. 이들이 하기 표 3에서 요약된다.
Figure 112013117531264-pct00001
합성 반응에서 변형된 포스포르아미디트를 사용하여 합성 폴리뉴클레오티드 분석물 또는 링커가 관능화될 수 있고, 이는 적절한 커플링 모이어티, 예컨대 콜레스테롤, 토코페롤 또는 팔미테이트의 직접적인 부가에 대해서, 뿐만 아니라 반응성 기, 예컨대 티올, 콜레스테롤, 지질 및 비오틴 기에 대해서 쉽게 호환성이다. 이러한 상이한 부착 화학은 표적 폴리뉴클레오티드의 부착을 위한 한 벌의 선택권을 제공한다. 각각의 상이한 변형 기가 폴리뉴클레오티드를 약간씩 상이한 방식으로 테더링시키고, 커플링이 항상 영구적이지는 않아서, 이중층에 대한 분석물의 상이한 체류 시간을 제공한다. 일시적인 커플링의 장점이 상기에 논의되어 있다.
상보적인 반응성 기 또는 테더가 표적 폴리뉴클레오티드에 부가될 수 있는 한 폴리뉴클레오티드를 링커 또는 관능화된 막에 커플링시키는 것이 다수의 다른 수단에 의해 달성될 수도 있다. 반응성 기를 DNA의 한쪽 단부에 부가하는 것이 기존에 보고되었다. T4 폴리뉴클레오티드 키나제(kinase) 및 ATPγS를 사용하여 ssDNA 또는 dsDNA의 5'에 티올 기가 부가될 수 있다 (문헌 [Grant, G. P. and P. Z. Qin (2007). "A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acids Res 35(10): e77]). T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 γ-[2-아지도에틸]-ATP 또는 γ-[6-아지도헥실]-ATP를 사용하여 ssDNA 또는 dsDNA의 5'-포스페이트에 아지드 기가 부가될 수 있다. 티올 또는 클릭(Click) 화학을 사용하여, 티올, 아이오도아세트아미드 OPSS 또는 말레이미드 기 (티올에 대해 반응성) 또는 또는 DIBO (디벤조시클로옥스틴) 또는 알킨 기 (아지드에 대해 반응성)를 함유하는 테더가 분석물에 공유결합으로 부착될 수 있다. 변형된 올리고뉴클레오티드를 ssDNA의 3'에 혼입시키도록 말단 트랜스퍼라제(transferase)를 사용하여 더욱 다양한 화학 기 선택물, 예컨대 비오틴, 티올 및 플루오로포어가 부가될 수 있다 (문헌 [Kumar, A., P. Tchen, et al. (1988). "Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyl transferase." Anal Biochem 169(2): 376-82)]. 하기의 실시예 3은 어떻게 DNA를 스트렙타비딘/비오틴을 사용하여 지질 이중층에 커플링시킬 수 있는지를 기술한다. 임의의 다른 분석물에 스트렙타비딘/비오틴 커플링이 사용될 수 있다. 적절하게 변형된 뉴클레오티드와 함께 말단 트랜스퍼라제를 사용하여 테더가 표적 폴리뉴클레오티드에 직접적으로 부가될 수 있는 것이 또한 가능할 수 있다 (예를 들어, 콜레스테롤 또는 팔미테이트).
별법으로, 부착이 혼성화를 통해 달성될 수 있도록, 반응성 기 또는 테더가 이중층 내에 이미 커플링된 것에 대해 상보적인 짧은 폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA 조각의 부가인 것으로 간주될 수 있다. 이러한 경우에, 반응성 기는 단일 가닥 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 반응성 기가 단일 가닥 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분석물에 결찰될 수 있다. T4 RNA 리가제(ligase) I을 사용하여 짧은 ssDNA 조각의 결찰이 보고되어 있다 (문헌 [Troutt, A. B., M. G. McHeyzer-Williams, et al. (1992). "Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 89(20): 9823-5]). 별법으로, ssDNA 또는 dsDNA가 천연 분석물 dsDNA에 결찰될 수 있고, 그 후 2개의 가닥이 열 또는 화학 변성에 의해 분리될 수 있다. 천연 dsDNA에 대해, ssDNA 조각을 듀플렉스의 한쪽 또는 양쪽 단부에, 또는 dsDNA를 한쪽 또는 양쪽 단부에 부가하는 것이 가능하다. 단일 가닥 핵산을 천연 DNA에 부가하기 위해, 이는 단일 가닥 핵산의 다른 영역에 대한 결찰과 같이 T4 RNA 리가제 I을 사용하여 달성될 수 있다. dsDNA를 천연 듀플렉스 DNA에 부가하기 위해서는, 결찰이 "평활(blunt)-말단"일 수 있고, 이때 천연 DNA 및 어댑터 각각 상에 상보적인 3' dA / dT 꼬리가 있거나 (콘카테머(concatemer) 또는 이량체 형성을 방지하기 위해 다수의 샘플 프렙(prep) 용도에 대해 일상적으로 행해지는 바와 같음), 또는 천연 DNA의 제한 소화 및 호환성 어댑터의 결찰에 의해 생성된 "점착성-단부"을 사용할 수 있다. 그 후, 듀플렉스가 용융되면, 각각의 단일 가닥에 ssDNA가 결찰에 사용되었으면 5' 또는 3' 변형이, dsDNA가 결찰에 사용되었으면 5' 단부, 3' 단부 또는 양쪽 모두에서의 변형이 있을 것이다. 폴리뉴클레오티드가 합성 가닥이면, 폴리뉴클레오티드의 화학적 합성 동안에 커플링 화학이 혼입될 수 있다. 예를 들어, 반응성 기가 부착되어 있는 프라이머를 사용하여 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다.
아데닐화 핵산 (AppDNA)은 아데노신-모노포스페이트가 핵산의 5'-포스페이트에 부착되는 결찰 반응에서의 중간체이다. 다양한 키트, 예컨대 NEB의 5' DNA 아데닐화 키트가 이러한 중간체의 생성을 위해 입수가능하다. 변형된 뉴클레오티드 트리포스페이트를 반응에서 ATP로 치환함으로써, 반응성 기 (예컨대 티올, 아민, 비오틴, 아지드 등)를 DNA의 5'에 부가하는 것이 가능할 것이다. 적절하게 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 콜레스테롤 또는 팔미테이트)와 함께 5' DNA 아데닐화 키트를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드에 테더가 직접적으로 부가되는 것이 또한 가능할 수 있다.
게놈 DNA의 절편들의 증폭을 위한 통상적인 기술은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용하는 것이다. 여기에서, 2개의 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, DNA의 동일한 절편의 다수의 카피가 생성될 수 있고, 이때 각각의 카피에 대해 듀플렉스 내의 각각의 가닥의 5'이 합성 폴리뉴클레오티드일 것이다. 안티센스 프라이머를 사용함으로써, 폴리머라제를 사용하는 것에 의해 단일 또는 다중 뉴클레오티드가 단일 또는 이중 가닥 DNA의 3' 단부에 부가될 수 있다. 사용될 수 있는 폴리머라제의 예로는 말단 트랜스퍼라제, 클레나우(Klenow) 및 이. 콜라이 폴리(A) 폴리머라제가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 변형된 뉴클레오티드 트리포스페이트를 반응에서 ATP로 치환함으로써, 반응성 기, 예컨대 콜레스테롤, 티올, 아민, 아지드, 비오틴 또는 지질이 DNA 내로 혼입될 수 있다. 따라서, 증폭된 표적 DNA의 각각의 카피는 커플링을 위한 반응성 기를 함유할 것이다.
이상적으로는, 분석물을 관능화해야 하지 않으면서 분석물이 막에 커플링된다. 이는 결합 기, 예컨대 폴리뉴클레오티드 결합 단백질 또는 화학 기를 막에 앵커링(anchoring)하고 결합 기가 분석물과 상호작용하게 함으로써, 또는 막을 관능화함으로써 달성될 수 있다. 결합 기는 본원에 기술된 방법 중 임의의 것에 의해 막에 커플링될 수 있다. 특히, 하나 이상의 링커, 예컨대 말레이미드 관능화 링커를 사용하여 결합 기가 막에 커플링될 수 있다.
이러한 실시양태에서, 분석물은 전형적으로 RNA, DNA, PNA, TNA 또는 LNA이고, 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 이러한 실시양태는 게놈 DNA 분석물에 특히 적절하다.
결합 기는 단일 또는 이중 가닥 핵산, 분석물 내의 특정 뉴클레오티드 서열 또는 분석물 내의 변형 뉴클레오티드의 패턴, 또는 폴리뉴클레오티드 상에 존재하는 임의의 기타 리간드와 상호작용하는 임의의 기일 수 있다.
적절한 결합 단백질에는 이. 콜라이 단일 가닥 결합 단백질, P5 단일 가닥 결합 단백질, T4 gp32 단일 가닥 결합 단백질, TOPO V dsDNA 결합 영역, 인간 히스톤 단백질, 이. 콜라이 HU DNA 결합 단백질 및 기타 고세균, 원핵생물 또는 진핵생물 단일- 또는 이중-가닥 핵산 결합 단백질 (하기에 열거된 것들이 포함됨)이 포함된다.
특정 뉴클레오티드 서열은 전사 인자, 리보솜, 엔도뉴클레아제(endonuclease), 토포이소머라제(topoisomerase) 또는 복제 개시 인자가 인식하는 서열일 수 있다. 변형된 뉴클레오티드의 패턴은 손상 또는 메틸화 패턴일 수 있다.
화학 기는 폴리뉴클레오티드 분석물에 삽입되거나 또는 이와 상호작용하는 임의의 기일 수 있다. 이러한 기는 정전기, 수소 결합 또는 반 데르 발스 상호작용을 통해 폴리뉴클레오티드 분석물에 삽입되거나 또는 이와 상호작용할 수 있다. 이같은 기에는 리신 단량체, 폴리-리신 (이는 ssDNA 또는 dsDNA와 상호작용할 것이다), 에티듐 브로마이드 (이는 dsDNA와 상호작용할 것이다), 유니버설(universal) 염기 또는 유니버설 뉴클레오티드 (이는 임의의 폴리뉴클레오티드 분석물과 혼성화할 수 있다) 및 오스뮴 착물 (이는 메틸화 염기와 반응할 수 있다)이 포함된다. 따라서, 막에 부착된 하나 이상의 유니버설 뉴클레오티드를 사용하여 폴리뉴클레오티드 분석물이 막에 커플링될 수 있다. 하나 이상의 링커를 사용하여 각각의 유니버설 뉴클레오티드 잔기가 막에 부착될 수 있다. 유니버설 염기의 예로는 이노신, 3-니트로피롤, 5-니트로인돌, 4-니트로인돌, 6-니트로인돌, 3,4-디히드로-피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온 (dP), 2-디메틸아미노메틸렌아미노-6-메톡시아미노퓨린 (dK), 데옥시 이노신, 데옥시 네뷸라린이 포함된다.
이러한 실시양태에서, 막 성분의 1％ 이상, 10％ 이상, 25％ 이상, 50％ 이상 또는 100％가 관능화될 수 있다.
결합 기가 단백질인 경우, 예를 들어, 이미 단백질에 막과 호환성인 외부의 소수성 영역이 있다면, 추가적인 관능화 없이 막에 직접적으로 앵커링시킬 수 있다. 이같은 단백질의 예로는 막횡단 단백질이 포함된다. 별법으로, 막과 호환성인 소수성 영역이 유전학적으로 융합되어 단백질이 발현될 수 있다. 이같은 소수성 단백질 영역이 업계에 공지되어 있다.
바람직하게는 결합 기가 분석물과 혼합된 후에 막과 접촉되지만, 결합 기가 막과 접촉되고 이어서 분석물과 접촉될 수 있다.
또 다른 측면에서, 특정 결합 기가 이를 인식할 수 있도록, 분석물이 상기 기술된 방법을 사용하여 관능화될 수 있다. 구체적으로, 분석물이 리간드 예컨대 비오틴 (스트렙타비딘에 결합하기 위해), 아밀로스 (말토스 결합 단백질 또는 융합 단백질에 결합하기 위해), Ni-NTA (폴리-히스티딘 또는 폴리-히스티딘 태그(tag)가 부착된 단백질에 결합하기 위해), 또는 펩티드 (예컨대 항원)으로 관능화될 수 있다.
추가적인 측면에 따르면, 분석물이 폴리뉴클레오티드 어댑터에 결합되었을 때 폴리뉴클레오티드 분석물을 막에 커플링시키는데 결합 기가 사용될 수 있다. 구체적으로, 검출기 예컨대 나노포어 내로 우선적으로 관통하도록 디자인된 리더 서열을 포함하는 어댑터에 분석물이 결합한다. 이같은 리더 서열은 단독중합체성 폴리뉴클레오티드 또는 무염기 영역을 포함할 수 있다. 전형적으로 어댑터는 링커에 혼성화하도록, 그리고 분석물에 결찰되거나 이에 혼성화되도록 디자인된다. 이는 검출기에 진입하기 위해 분석물과 어댑터 사이의 경쟁을 일으킨다. 링커가 결합기를 포함하면, 어댑터에 비교하여 분석물의 길이가 더 긴 것은 여러 링커가 분석물에 동시에 결합할 수 있고, 따라서 어댑터에 비교하여 분석물의 농도를 증가시킨다는 것을 의미한다.
폴리뉴클레오티드를 친양쪽성 층, 예컨대 지질 이중층에 커플링시키기 위한 상기 논의된 방법 중 임의의 것이 당연히 다른 분석물 및 막 조합에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이 지질 이중층에 커플링된다. 이같은 분석물의 화학적 부착을 위한 다양한 방법이 이용가능하다. 화학적 부착에서 사용되는 분자의 예는 EDC (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드)이다. 시판되는 키트 (써모 피어서(Thermo Pierce), 파트(Part) 번호 22980)를 사용하여 반응성 기를 DNA의 5'에 부가할 수도 있다. 적절한 방법에는 히스티딘 잔기 및 Ni-NTA를 사용하는 일시적인 친화력 부착, 뿐만 아니라 반응성 시스테인, 리신 또는 비-천연 아미노산에 의한 더욱 강건한 공유결합 부착이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
검출기
검출기는 분석물의 존재, 부재 또는 특성에 응답하여 판독가능한 신호를 제공하는 임의의 구조일 수 있다. 검출기는 분석물의 존재 또는 부재에 응답하여 판독가능한 신호를 제공하는 임의의 구조일 수 있다. 적절한 검출기가 업계에 공지되어 있다. 이는 막횡단 포어, 터널링(tunnelling) 전극, 고전적인 전극, 나노튜브, FET (장-효과 트랜지스터) 및 광학 검출기, 예컨대 원자간력 현미경 (AFM) 및 주사 터널링 현미경 (STM)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
바람직한 실시양태에서, 검출기는 전기적 수단을 사용하여 분석물을 검출한다. 문헌 [Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7], [Lieberman KR et al, J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72], 및 국제 출원 WO-2000/28312에 기술된 바와 같이 표준 단일 채널 기록 설비를 사용하여 전기적 측정이 이루어질 수 있다. 별법으로, 예를 들어 국제 출원 WO-2009/077734 및 국제 출원 WO-2011/067559에 기술된 바와 같이, 다중 채널 시스템을 사용하여 전기 측정이 이루어질 수 있다.
다른 바람직한 실시양태에서, 검출기는 형광 수단을 사용하여 분석물을 검출하지 않는다.
검출기는 바람직하게는 막횡단 포어를 포함한다. 막횡단 포어는 인가된 전위에 의해 구동된 수화 이온이 막의 한쪽 측면에서 막의 다른쪽 측면으로 유동하게 하는 구조이다.
막횡단 포어는 바람직하게는 막횡단 단백질 포어이다. 막횡단 단백질 포어는 수화 이온, 예컨대 분석물이 막의 한쪽 측면에서 막의 다른쪽 측면으로 유동하게 하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 집단이다. 본 발명에서, 막횡단 단백질 포어는 인가된 전위에 의해 구동된 수화 이온이 막의 한쪽 측면에서 다른 쪽으로 유동하게 하는 포어를 형성할 수 있다. 바람직하게는, 막횡단 단백질 포어는 분석물 예컨대 뉴클레오티드가 막, 예컨대 지질 이중층의 한쪽 측면에서 다른 쪽으로 유동하게 한다. 바람직하게는, 막횡단 단백질 포어는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA가 포어를 지나 이동하게 한다.
막횡단 단백질 포어는 단량체 또는 올리고머일 수 있다. 바람직하게는, 포어는 여러 개의 반복되는 서브유닛, 예컨대 6개, 7개 또는 8개의 서브유닛으로 이루어진다. 더욱 바람직하게는, 포어는 7량체 또는 8량체 포어이다.
전형적으로는 막횡단 단백질 포어는 이온이 이를 통과하여 유동할 수 있는 배럴 또는 채널을 포함한다. 포어의 서브유닛들은 전형적으로 중심 축을 둘러싸고, 가닥들을 막횡단 β 배럴 또는 채널 또는 막횡단 α-나선 다발 또는 채널에 제공한다.
전형적으로, 막횡단 단백질 포어의 배럴 또는 채널은 분석물, 예컨대 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산과의 상호작용을 용이하게 하는 아미노산을 포함한다. 이러한 아미노산들은 바람직하게는 배럴 또는 채널의 협착부 근처에 위치한다. 전형적으로 막횡단 단백질 포어는 하나 이상의 양성으로 하전된 아미노산, 예컨대 아르기닌, 리신 또는 히스티딘, 또는 방향족 아미노산, 예컨대 타이로신 또는 트립토판을 포함한다. 전형적으로 이러한 아미노산들은 포어와 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 간의 상호작용을 용이하게 한다. 어댑터로 뉴클레오티드 검출이 용이해질 수 있다. 이는 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 막횡단 단백질 포어는 β-배럴 포어 또는 α-나선 다발 포어로부터 유래될 수 있다. β-배럴 포어는 β-가닥으로부터 형성된 배럴 또는 채널을 포함한다. 적절한 β-배럴 포어에는 β-독소, 예컨대 α-용혈소, 탄저병 독소 및 류코시딘, 및 박테리아의 외막 단백질/포린(porin), 예컨대 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 포린 (Msp), 예를 들어 MspA, MspB, MspC 또는 MspD, 외막 포린 F (OmpF), 외막 포린 G (OmpG), 외막 포스포리파제(phospholipase) A 및 네이세리아(Neisseria) 오토트랜스포터(autotransporter) 지질단백질 (NalP)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. α-나선 다발 포어는 α-나선으로부터 형성된 배럴 또는 채널을 포함한다. 적절한 α-나선 다발 포어에는 내막 단백질 및 α 외막 단백질, 예컨대 WZA 및 ClyA 독소가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 막횡단 포어는 Msp로부터 또는 α-용혈소 (α-HL)로부터 유래될 수 있다.
가닥 서열분석을 위해, 바람직하게는 막횡단 단백질 포어는 Msp로부터, 바람직하게는 MspA로부터 유래된다. 이같은 포어는 올리고머성일 수 있고, 전형적으로는 Msp로부터 유래된 7개, 8개, 9개 또는 10개의 단량체를 포함한다. 포어는 동일한 단량체들을 포함하는 Msp로부터 유래된 동종-올리고머성 포어일 수 있다. 별법으로, 포어는 서로 상이한 하나 이상의 단량체를 포함하는 Msp로부터 유래된 이종-올리고머성 포어일 수 있다. 포어는 Msp로부터 유래된 2개 이상의 공유결합으로 부착된 단량체를 포함하는 구축물을 하나 이상 포함할 수도 있다. 적절한 포어가 국제 출원 번호 PCT/GB2012/050301 (미국 가출원 번호 61/441,718을 우선권으로 청구함)에 개시되어 있다. 바람직하게는, 포어는 MspA 또는 이의 호모로그(homolog) 또는 파라로그(paralog)로부터 유래된다.
Msp로부터 유래된 단량체는 서열 2에 제시된 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 서열 2는 MspA 단량체의 NNN-RRK 돌연변이체이다. 이는 하기의 돌연변이를 포함한다: D90N, D91N, D93N, D118R, D134R 및 E139K. 서열 2의 변이체는 아미노산 서열이 서열 2의 것과 다르고 포어를 형성하는 능력을 유지하는 폴리펩티드이다. 변이체가 포어를 형성하는 능력을 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 검정할 수 있다. 예를 들어, 다른 적합한 서브유닛과 함께 변이체가 지질 이중층 내로 삽입될 수 있고, 올리고머화되어 포어를 형성하는 이의 능력을 결정할 수 있다. 서브유닛을 막, 예컨대 지질 이중층 내로 삽입하는 방법들이 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 지질 이중층 내로 확산되고, 지질 이중층에 결합하고 기능성 상태로 조립되는 것에 의해 삽입되도록, 서브유닛들을 정제된 형태로 지질 이중층을 함유하는 용액 내에 현탁시킬 수 있다. 별법으로, 문헌 [M.A. Holden, H. Bayley. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6502-6503] 및 국제 출원 번호 PCT/GB2006/001057 (WO 2006/100484로 공개됨)에 기술된 "픽 & 플레이스(pick & place)" 방법을 사용하여 서브유닛들을 막 내로 직접적으로 삽입할 수 있다.
바람직한 변이체가 국제 출원 번호 PCT/GB2012/050301 (미국 가출원 번호 61/441,718을 우선권으로 청구함)에 개시되어 있다. 특히 바람직한 변이체에는 하기의 치환(들)을 포함하는 것들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다: L88N; L88S; L88Q; L88T; D90S; D90Q; D90Y; I105L; I105S; Q126R; G75S; G77S; G75S, G77S, L88N 및 Q126R; G75S, G77S, L88N, D90Q 및 Q126R; D90Q 및 Q126R; L88N, D90Q 및 Q126R; L88S 및 D90Q; L88N 및 D90Q; E59R; G75Q; G75N; G75S; G75T; G77Q; G77N; G77S; G77T; I78L; S81N; T83N; N86S; N86T; I87F; I87V; I87L; L88N; L88S; L88Y; L88F; L88V; L88Q; L88T; I89F; I89V; I89L; N90S; N90Q; N90L; N90Y; N91S; N91Q; N91L; N91M; N91I; N91A; N91V; N91G; G92A; G92S; N93S; N93A; N93T; I94L; T95V; A96R; A96D; A96V; A96N; A96S; A96T; P97S; P98S; F99S; G100S; L101F; N102K; N102S; N102T; S103A; S103Q; S103N; S103G; S103T; V104I; I105Y; I105L; I105A; I105Q; I105N; I105S; I105T; T106F; T106I; T106V; T106S; N108P; N108S; D90Q 및 I105A; D90S 및 G92S; L88T 및 D90S; I87Q 및 D90S; I89Y 및 D90S; L88N 및 I89F; L88N 및 I89Y; D90S 및 G92A; D90S 및 I94N; D90S 및 V104I; L88D 및 I105K; L88N 및 Q126R; L88N, D90Q 및 D91R; L88N, D90Q 및 D91S; L88N, D90Q 및 I105V; D90Q, D93S 및 I105A; N91Y; N90Y 및 N91G; N90G 및 N91Y; N90G 및 N91G; I05G; N90R; N91R; N90R 및 N91R; N90K; N91K; N90K 및 N91K; N90Q 및 N91G; N90G 및 N91Q; N90Q 및 N91Q; R118N; N91C; N90C; N90W; N91W; N90K; N91K; N90R; N91R; N90S 및 N91S; N90Y 및 I105A; N90G 및 I105A; N90Q 및 I105A; N90S 및 I105A; L88A 및 I105A; L88S 및 I105S; L88N 및 I105N; N90G 및 N93G; N90G; N93G; N90G 및 N91A; I105K; I105R; I105V; I105P; I105W; L88R; L88A; L88G; L88N; N90R 및 I105A; N90S 및 I105A; L88A 및 I105A; L88S 및 I105S; L88N 및 I105N; L88C; S103C; 및 I105C.
상기 논의된 특정 돌연변이에 더하여, 변이체가 다른 돌연변이를 포함할 수 있다. 서열 2의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐, 바람직하게는 변이체는 아미노산 서열 동일성을 기초로 이러한 서열에 대해 적어도 50％ 상동성일 것이다. 더욱 바람직하게는, 변이체는 전체 서열에 걸쳐 서열 2의 아미노산 서열에 대해 아미노산 동일성을 기초로 적어도 55％, 적어도 60％, 적어도 65％, 적어도 70％, 적어도 75％, 적어도 80％, 적어도 85％, 적어도 90％, 더욱 바람직하게는 적어도 95％, 97％ 또는 99％ 상동성일 수 있다. 100개 이상, 예를 들어 125개, 150개, 175개 또는 200개 또는 이를 초과하는 개수의 연속적인 아미노산의 신장물에 걸쳐 아미노산 동일성이 적어도 80％, 예를 들어 적어도 85％, 90％ 또는 95％일 수 있다 ("강한 상동성").
업계에서의 표준 방법을 사용하여 상동성을 결정할 수 있다. 예를 들어, UWGCG 패키지는 상동성을 계산하는데 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공하고, 예를 들어, 이는 이의 디폴트 설정으로 사용된다 (문헌 [Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395]). 예를 들어 문헌 [Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300]; [Altschul, S.F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10]에 기술된 바와 같이, PILEUP 및 BLAST 알고리즘을 사용하여 상동성을 계산하거나 또는 서열들을 정렬할 수 있다 (예컨대, 등가의 잔기들 또는 상응하는 서열들을 확인함 (전형적으로는 이들의 디폴트 설정을 기초로 함)). BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 입수가능하다.
서열 2는 MspA 단량체의 NNN-RRK 돌연변이체이다. 변이체는 MspA와 비교하여 MspB, C 또는 D 단량체 내에서의 돌연변이 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 성숙 형태의 MspB, C 및 D가 서열 15 내지 17에서 제시된다. 특히, 변이체는 MspB 내에 존재하는 하기의 치환을 포함할 수 있다: A138P. 변이체는 MspC 내에 존재하는 하기의 치환 중 하나 이상을 포함할 수 있다: A96G, N102E 및 A138P. 변이체는MspD 내에 존재하는 하기의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다: G1 결실, L2V, E5Q, L8V, D13G, W21A, D22E, K47T, I49H, I68V, D91G, A96Q, N102D, S103T, V104I, S136K 및 G141A. 변이체는 Msp B, C 및 D로부터의 돌연변이 및 치환 중 하나 이상의 조합을 포함할 수 있다.
예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 30개의 치환까지, 상기 논의된 것들에 더하여 아미노산 치환이 서열 2의 아미노산 서열에 이루어질 수 있다. 보존적 치환은 아미노산을 유사한 화학 구조, 유사한 화학 성질 또는 유사한 측쇄 부피의 다른 아미노산으로 교체한다. 도입된 아미노산은 자신이 교체하는 아미노산과 극성, 친수성, 소수성, 염기성, 산성, 중성, 또는 전하가 유사할 수 있다. 별법으로, 보존적 치환은 방향족 또는 지방족인 또 다른 아미노산을 기존의 방향족 또는 지방족 아미노산 대신에 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 교환은 업계에 주지되어 있고, 하기 표 4에 정의된 바와 같은 20개의 주요 아미노산의 성질에 따라 선택될 수 있다. 아미노산들의 극성이 유사한 경우, 이는 표 5의 아미노산 측쇄에 대한 소수친수성(hydropathy) 스케일을 참고로 또한 결정될 수 있다.
Figure 112013117531264-pct00002
Figure 112013117531264-pct00003
서열 2의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기가 상기 기술된 폴리펩티드로부터 추가적으로 결실될 수 있다. 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 30개 또는 이를 초과하는 개수까지의 잔기가 결실될 수 있다.
변이체는 서열 2의 단편을 포함할 수 있다. 이같은 단편은 포어 형성 활성을 유지한다. 단편은 길이가 적어도 아미노산 50개, 100개, 150개 또는 200개일 수 있다. 이같은 단편이 포어를 생산하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는 단편은 서열 2의 포어 형성 도메인을 포함한다. 단편은 서열 2의 잔기 88, 90, 91, 105, 118 및 134 중 하나를 포함하여야 한다. 전형적으로, 단편은 서열 2의 잔기 88, 90, 91, 105, 118 및 134 모두를 포함한다.
하나 이상의 아미노산이 별법적으로 또는 추가적으로 상기 기술된 폴리펩티드에 부가될 수 있다. 확장은 서열 2 또는 이의 폴리펩티드 변이체 또는 단편의 아미노산 서열의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에서 제공될 수 있다. 확장은 꽤 짧을 수 있고, 예를 들어, 아미노산 1개 내지 10개의 길이이다. 별법으로, 확장이 더 길 수 있고, 예를 들어 아미노산 50개 또는 100개까지일 수 있다. 캐리어(carrier) 단백질이 본 발명에 따른 아미노산 서열에 융합될 수 있다. 기타 융합 단백질이 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
상기 논의된 바와 같이, 변이체는 서열 2의 것과 아미노산 서열이 다르고 이의 포어 형성 능력을 유지하는 폴리펩티드이다. 변이체는 포어 형성을 담당하는 서열 2의 영역을 전형적으로 함유한다. β-배럴을 함유하는 Msp의 포어 형성 능력은 각각의 서브유닛 내의 β-시트에 의해 제공된다. 서열 2의 변이체는 β-시트를 형성하는 서열 2 내의 영역을 전형적으로 포함한다. 생성된 변이체가 포어를 형성하는 능력을 유지하는 한, β-시트를 형성하는 서열 2의 영역에 하나 이상의 변형이 이루어질 수 있다. 바람직하게는 서열 2의 변이체는 이의 α-나선 및/또는 루프 영역 내에 하나 이상의 변형, 예컨대 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.
예를 들어 히스티딘 잔기 (hist 태그), 아스파르트산 잔기 (asp 태그), 스트렙타비딘 태그 또는 플래그(flag) 태그의 부가에 의해, 또는 세포로부터의 분비를 촉진하는 신호 서열의 부가에 의해 (폴리펩티드가 이같은 서열을 천연적으로 함유하지 않는 경우), Msp로부터 유래된 단량체가 이의 확인 또는 정제를 보조하기 위해 변형될 수 있다. 유전학적 태그를 도입하는 별법은 태그를 포어 상의 천연 또는 조작 위치 상에서 화학적으로 반응시키는 것이다. 이의 예는 겔-시프트 시약을 포어의 외부 상에 조작된 시스테인에 반응시키는 것일 것이다. 이는 용혈소 이종-올리고머들을 분리하기 위한 방법으로서 입증되었다 (문헌 [Chem Biol. 1997 Jul;4(7):497-505]).
Msp로부터 유래된 단량체가 표식 표지로 표지될 수 있다. 표식 표지는 포어가 검출되게 하는 임의의 적절한 표지일 수 있다. 적절한 표지에는 형광 분자, 방사성 동위원소, 예를 들어 125I, 35S, 효소, 항체, 항원, 폴리뉴클레오티드 및 리간드 예컨대 비오틴이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
D-아미노산을 사용하여 Msp로부터 유래된 단량체가 생산될 수도 있다. 예를 들어, Msp로부터 유래된 단량체가 L-아미노산 및 D-아미노산의 혼합물을 포함할 수 있다. 이는 이같은 단백질 또는 펩티드를 생산하기 위한 업계에서 통상적이다.
Msp로부터 유래된 단량체는 뉴클레오티드 구별을 용이하게 하는 하나 이상의 특이적 변형을 함유한다. Msp로부터 유래된 단량체는 다른 비-특이적 변형을 함유할 수도 있고, 단 이들은 포어 형성을 방해하지 않는다. 다수의 비-특이적 측쇄 변형이 업계에 공지되어 있고, Msp로부터 유래된 단량체의 측쇄에 이루어질 수 있다. 이같은 변형에는, 예를 들어, 알데히드와의 반응에 이어지는 NaBH4로의 환원에 의한 아미노산의 환원성 알킬화, 메틸아세트이미데이트로의 아미딘화, 또는 아세트산 무수물로의 아실화가 포함된다.
업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 Msp로부터 유래된 단량체가 생산될 수 있다. 합성에 의해 또는 재조합 수단에 의해 Msp로부터 유래된 단량체가 제조될 수 있다. 예를 들어, 시험관내 번역 및 전사 (IVTT)에 의해 포어가 합성될 수 있다. 포어를 생산하는 적절한 방법이 국제 출원 번호 PCT/GB09/001690 (WO 2010/004273으로 공개됨), PCT/GB09/001679 (WO 2010/004265로 공개됨) 또는 PCT/GB10/000133 (WO 2010/086603으로 공개됨)에 논의되어 있다. 포어를 막 내로 삽입하는 방법이 하기에서 논의된다.
엑소뉴클레아제 서열분석을 위해, 막횡단 단백질 포어는 바람직하게는 α-용혈소 (α-HL)로부터 유래된다. 야생형 α-HL 포어는 7개의 동일한 단량체 또는 서브유닛으로 형성된다 (즉, 이는 7량체성이다). α-용혈소 M113R의 한 단량체 또는 서브유닛의 서열이 서열 4에서 제시된다. 바람직하게는 막횡단 단백질 포어는 7개의 단량체를 포함하고, 이들 각각은 서열 4에 제시된 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 서열 4의 아미노산 1, 7 내지 21, 31 내지 34, 45 내지 51, 63 내지 66, 72, 92 내지 97, 104 내지 111, 124 내지 136, 149 내지 153, 160 내지 164, 173 내지 206, 210 내지 213, 217, 218, 223 내지 228, 236 내지 242, 262 내지 265, 272 내지 274, 287 내지 290 및 294가 루프 영역을 형성한다. 서열 4의 잔기 113 및 147은 α-HL의 배럴 또는 채널의 협착부 부분을 형성한다.
이같은 실시양태에서, 각각 서열 4에 제시된 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 7개의 단백질 또는 단량체를 포함하는 포어가 본 발명의 방법에서 바람직하게 사용된다. 7개의 단백질은 동일할 수 있거나 (동종7량체), 또는 상이할 수 있다 (이종7량체).
서열 4의 변이체는 서열 4의 것과 아미노산 서열이 상이하고 이의 포어 형성 능력을 유지하는 단백질이다. 변이체가 포어를 형성하는 능력을 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 검정할 수 있다. 예를 들어, 다른 적합한 서브유닛과 함께 변이체가 지질 이중층 내로 삽입될 수 있고, 올리고머화되어 포어를 형성하는 이의 능력을 결정할 수 있다. 서브유닛을 막, 예컨대 지질 이중층 내로 삽입하는 방법들이 업계에 공지되어 있다. 적절한 방법이 상기에서 논의된다.
변이체는 핵산 결합 단백질에 대한 공유결합 부착 또는 이와의 상호작용을 용이하게 하는 변형을 포함할 수 있다. 바람직하게는 변이체는 핵산 결합 단백질에 대한 부착을 용이하게 하는 하나 이상의 반응성 시스테인 잔기를 포함한다. 예를 들어, 변이체는 서열 4의 위치 8, 9, 17, 18, 19, 44, 45, 50, 51, 237, 239 및 287 중 하나 이상 및/또는 아미노 또는 카르복시 말단에 시스테인을 포함할 수 있다. 바람직한 변이체는 시스테인으로의 서열 4의 위치 8, 9, 17, 237, 239 및 287의 잔기의 치환 (A8C, T9C, N17C, K237C, S239C 또는 E287C)을 포함한다. 바람직하게는, 변이체는 국제 출원 번호 PCT/GB09/001690 (WO 2010/004273으로 공개됨), PCT/GB09/001679 (WO 2010/004265로 공개됨) 또는 PCT/GB10/000133 (WO 2010/086603으로 공개됨)에 기술된 변이체 중 어느 하나이다.
변이체는 뉴클레오티드와의 임의의 상호작용을 용이하게 하거나 또는 하기 논의된 바와 같은 분자 어댑터의 배향을 용이하게 하는 변형을 또한 포함할 수 있다. 변이체는 분자 어댑터의 공유결합 부착을 용이하게 하는 변형을 또한 함유할 수 있다.
특히, 변이체는 바람직하게는 서열 4의 위치 139에 글루타민을 함유한다. 변이체는 바람직하게는 서열 4의 위치 119, 121 또는 135에 시스테인이 있다. 서열 4의 변이체는 위치 113에서 야생형 메티오닌이 재도입되어 있을 수 있다.
바람직한 서열 4의 변이체에는 위치 113의 메티오닌 (R113M), 위치 135의 시스테인 (L135C) 및 위치 139의 글루타민 (N139Q)이 있다. 다른 바람직한 서열 4의 변이체에는 위치 113의 메티오닌 (R113M) 및 위치 139의 글루타민 (N139Q)이 있다. 한 이같은 변이체가 서열 34에서 제시된다. 엑소뉴클레아제 서열분석에서 사용하기 위한 바람직한 막횡단 단백질 포어는 (a) 위치 113의 메티오닌 (R113M), 위치 135의 시스테인 (L135C) 및 위치 139의 글루타민 (N139Q)이 있는 서열 4의 변이체를 포함하는 단량체 1개 및 (b) 위치 113의 메티오닌 (R113M) 및 위치 139의 글루타민 (N139Q)이 있는 서열 4의 변이체를 각각 포함하는 단량체 6개를 포함한다. 바람직하게는, (b)에서의 단량체 6개 각각이 서열 34에 제시된 서열을 포함한다.
변이체는 생물, 예를 들어, 스타필로쿠쿠스(Staphylococcus) 박테리아가 천연적으로 발현하는 천연 발생 변이체일 수 있다. 별법으로, 시험관 내에서 또는 재조합적으로 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)와 같은 박테리아에 의해 변이체가 발현될 수 있다. 재조합 기술에 의해 생산된 비-천연 발생 변이체가 변이체에 또한 포함된다. 서열 4의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐, 변이체는 아미노산 동일성을 기초로 이러한 서열에 대해 적어도 50％ 상동성일 것이다. 더욱 바람직하게는, 변이체 폴리펩티드는 전체 서열에 걸쳐 서열 4의 아미노산 서열에 대해 아미노산 동일성을 기초로 적어도 55％, 적어도 60％, 적어도 65％, 적어도 70％, 적어도 75％, 적어도 80％, 적어도 85％, 적어도 90％, 더욱 바람직하게는 적어도 95％, 97％ 또는 99％ 상동성일 수 있다. 200개 이상, 예를 들어 230개, 250개, 270개 또는 280개 또는 이를 초과하는 개수의 연속적인 아미노산의 신장물에 걸쳐 아미노산 동일성이 적어도 80％, 예를 들어 적어도 85％, 90％ 또는 95％일 수 있다 ("강한 상동성"). 상기 논의된 바와 같이 상동성을 결정할 수 있다.
예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 30개의 치환까지, 상기 논의된 것들에 더하여 아미노산 치환이 서열 4의 아미노산 서열에 이루어질 수 있다. 보존적 치환이 상기 논의된 바와 같이 이루어질 수 있다.
서열 4의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기가 상기 기술된 폴리펩티드로부터 추가적으로 결실될 수 있다. 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 30개 또는 이를 초과하는 개수까지의 잔기가 결실될 수 있다.
변이체는 서열 4의 단편일 수 있다. 이같은 단편은 포어 형성 활성을 유지한다. 단편은 길이가 적어도 아미노산 50개, 100개, 200개 또는 250개일 수 있다. 바람직하게는 단편은 서열 4의 포어 형성 도메인을 포함한다. 전형적으로, 단편은 서열 4의 잔기 119, 121, 135. 113 및 139를 포함한다.
하나 이상의 아미노산이 별법적으로 또는 추가적으로 상기 기술된 폴리펩티드에 부가될 수 있다. 확장은 서열 4 또는 이의 변이체 또는 단편의 아미노산 서열의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에서 제공될 수 있다. 확장은 꽤 짧을 수 있고, 예를 들어, 아미노산 1개 내지 10개의 길이이다. 별법으로, 확장이 더 길 수 있고, 예를 들어 아미노산 50개 또는 100개까지일 수 있다. 캐리어 단백질이 서브유닛 또는 변이체에 융합될 수 있다.
하나 이상의 아미노산이 별법적으로 또는 추가적으로 상기 기술된 폴리펩티드에 부가될 수 있다. 확장은 서열 4 또는 이의 변이체 또는 단편의 아미노산 서열의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에서 제공될 수 있다. 확장은 꽤 짧을 수 있고, 예를 들어, 아미노산 1개 내지 10개의 길이이다. 별법으로, 확장이 더 길 수 있고, 예를 들어 아미노산 50개 또는 100개까지일 수 있다. 캐리어 단백질이 포어 또는 변이체에 융합될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 서열 4의 변이체는 서열 4의 것과 아미노산 서열이 다르고 이의 포어 형성 능력을 유지하는 서브유닛이다. 변이체는 포어 형성을 담당하는 서열 4의 영역을 전형적으로 함유한다. β-배럴을 함유하는 α-HL의 포어 형성 능력은 각각의 서브유닛 내의 β-가닥에 의해 제공된다. 서열 4의 변이체는 β-가닥을 형성하는 서열 4 내의 영역을 전형적으로 포함한다. β-가닥을 형성하는 서열 4의 아미노산이 상기에서 논의된다. 생성된 변이체가 포어를 형성하는 능력을 유지하는 한, β-가닥을 형성하는 서열 4의 영역에 하나 이상의 변형이 이루어질 수 있다. 서열 4의 β-가닥 영역에 이루어질 수 있는 특정 변형이 상기에서 논의된다.
바람직하게는 서열 4의 변이체는 이의 α-나선 및/또는 루프 영역 내에 하나 이상의 변형, 예컨대 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. α-나선 및 루프를 형성하는 아미노산이 상기에서 논의된다.
변이체는 상기 논의된 바와 같이 이의 확인 또는 정제를 보조하도록 변형될 수 있다.
엑소뉴클레아제 서열분석에서 사용하기 위한 특히 바람직한 포어는 1개의 서열 36에 제시된 서브유닛 (즉 α-HL-E287C-QC-D5FLAGH6) 및 6개의 서열 34에 제시된 서브유닛 (즉 α-HL-Q)을 포함한다.
Msp로부터 유래된 포어에 관하여 상기 논의된 바와 같이 α-HL로부터 유래된 포어를 제조할 수 있다.
일부 실시양태에서, 막횡단 단백질 포어가 화학적으로 변형된다. 임의의 방식으로 임의의 부위에서 포어가 화학적으로 변형될 수 있다. 하나 이상의 시스테인에 분자가 부착되는 것 (시스테인 연결), 하나 이상의 리신에 분자가 부착되는 것, 하나 이상의 비-천연 아미노산에 분자가 부착되는 것, 에피토프의 효소 변형, 또는 말단 변형에 의해 막횡단 단백질 포어가 바람직하게 화학적으로 변형된다. 이같은 변형을 수행하는 적절한 방법이 업계에 주지되어 있다. 임의의 분자의 부착에 의해 막횡단 단백질 포어가 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 염료 또는 형광단의 부착에 의해 포어가 화학적으로 변형될 수 있다.
포어 내의 임의 개수의 단량체가 화학적으로 변형될 수 있다. 바람직하게는 1개 이상, 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 단량체가 상기 논의된 바와 같이 화학적으로 변형된다.
일부 실시양태에서, 막횡단 단백질 포어는 분석물 검출을 용이하게 하는 분자 어댑터를 포함한다. 엑소뉴클레아제 서열분석에서 사용하기 위한 포어는 전형적으로 분자 어댑터를 포함한다.
분자 어댑터는 포어와 분석물 사이의 상호작용을 매개함으로써 분석물 검출을 직접적으로 용이하게 할 수 있다. 이같은 실시양태에서, 어댑터의 존재는 포어 및 분석물의 주객 화학(host-guest chemistry)을 개선하고, 이에 의해 포어가 분석물을 검출하는 능력을 개선한다. 주객 화학의 원리는 업계에 주지되어 있다. 어댑터는 포어와 분석물의 상호작용을 개선하는 포어의 물리적 또는 화학적 성질에 대한 효과가 있다. 어댑터는 포어의 배럴 또는 채널의 전하를 변경시킬 수 있거나, 또는 특이적으로 분석물과 상호작용하거나 이에 결합함으로써 분석물과 포어의 상호작용을 용이하게 할 수 있다.
다른 실시양태에서, 분자 어댑터는 분석물의 프로세싱으로부터 형성된 생성물, 예컨대 단편과 포어 사이의 상호작용을 매개함으로써 분석물 검출을 간접적으로 용이하게 한다. 예를 들어, 엑소뉴클레아제 서열분석을 위해, 분자 어댑터는 포어와 폴리뉴클레오티드 분석물로부터 소화된 개별적인 뉴클레오티드들 사이의 상호작용을 용이하게 한다. 이같은 실시양태에서, 어댑터의 존재는 포어와 개별적인 뉴클레오티드들의 주객 화학을 개선하고, 이에 의해 포어가 개별적인 뉴클레오티드들을 검출하는 능력을 개선한다. 어댑터는 포어와 개별적인 뉴클레오티드들의 상호작용을 개선하는 포어의 물리적 또는 화학적 성질에 대한 효과가 있다. 어댑터는 포어의 배럴 또는 채널의 전하를 변경시킬 수 있거나, 또는 특이적으로 개별적인 뉴클레오티드들과 상호작용하거나 이에 결합함으로써 이들과 포어의 상호작용을 용이하게 할 수 있다.
분자 어댑터는 바람직하게는 고리형 분자 예컨대 시클로덱스트린, 혼성화할 수 있는 종, DNA 결합제 또는 인터킬레이터(interchelator), 펩티드 또는 펩티드 유사체, 합성 중합체, 평면형 방향족 분자, 양성으로 하전된 소형 분자, 또는 수소 결합할 수 있는 소형 분자이다.
어댑터는 고리형일 수 있다. 바람직하게는 고리형 어댑터는 포어와 대칭성이 동일하다. Msp는 전형적으로 중심축 주변에 8개의 서브유닛이 있기 때문에, 포어가 Msp로부터 유래되면 어댑터는 바람직하게는 대칭성이 8겹이다. α-HL은 전형적으로 중심축 주변에 7개의 서브유닛이 있기 때문에, 포어가 α-HL로부터 유래되면 어댑터는 바람직하게는 대칭성이 7겹이다. 이는 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
어댑터는 전형적으로 주객 화학을 통해 분석물과 상호작용한다. 전형적으로 어댑터는 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 상호작용할 수 있다. 어댑터는 분석물, 예컨대 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 화학 기를 포함한다. 바람직하게는 하나 이상의 화학 기는 비-공유결합 상호작용, 예컨대 소수성 상호작용, 수소 결합, 반 데르 발스 힘, π-양이온 상호작용 및/또는 정전기력에 의해 분석물, 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 상호작용한다. 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 화학 기는 바람직하게는 양성으로 하전된다. 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 화학 기는 더욱 바람직하게는 아미노 기를 포함한다. 1차, 2차 또는 3차 탄소 원자에 아미노 기가 부착될 수 있다. 더욱 더 바람직하게는 어댑터는 아미노 기의 고리, 예컨대 6개, 7개 또는 8개 아미노 기의 고리를 포함한다. 가장 바람직하게는 어댑터는 7개 또는 8개 아미노 기의 고리를 포함한다. 양성자화 아미노 기의 고리가 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 내의 음성으로 하전된 포스페이트 기와 상호작용할 수 있다.
어댑터를 포어 내에 정확하게 위치시키는 것이 어댑터와 포어 사이의 주객 화학에 의해 용이해질 수 있다. 바람직하게는, 어댑터는 포어 내의 하나 이상의 아미노산과 상호작용할 수 있는 하나 이상의 화학 기를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 어댑터는 비-공유결합 상호작용, 예컨대 소수성 상호작용, 수소 결합, 반 데르 발스 힘, π-양이온 상호작용 및/또는 정전기력에 의해 포어 내의 하나 이상의 아미노산과 상호작용할 수 있는 하나 이상의 화학 기를 포함한다. 포어 내의 하나 이상의 아미노산과 상호작용할 수 있는 화학 기는 전형적으로는 히드록실 또는 아민이다 1차, 2차 또는 3차 탄소 원자에 히드록실 기가 부착될 수 있다. 히드록실 기는 포어 내의 하전되지 않은 아미노산과 수소 결합을 형성할 수 있다. 포어와 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 간의 상호작용을 용이하게 하는 임의의 어댑터가 사용될 수 있다.
적절한 어댑터에는 시클로덱스트린, 고리형 펩티드 및 쿠쿠르비투릴이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 어댑터는 시클로덱스트린 또는 이의 유도체이다. 시클로덱스트린 또는 이의 유도체는 문헌 [Eliseev, A. V., and Schneider, H-J. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116, 6081-6088]에 개시된 것들 중 임의의 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 어댑터는 헵타키스-6-아미노-β-시클로덱스트린 (am7-βCD), 6-모노데옥시-6-모노아미노-β-시클로덱스트린 (am1-βCD) 또는 헵타키스-(6-데옥시-6-구아니디노)-시클로덱스트린 (gu7-βCD)이다. gu7-βCD 내의 구아니디노 기는 am7-βCD 내의 1차 아민보다 pKa가 훨씬 더 높아서, 더 양성으로 하전된다. 이러한 gu7-βCD 어댑터는 포어 내의 뉴클레오티드의 체류 시간을 증가시키는데, 측정된 잔류 전류의 정확도를 증가시키는데, 뿐만 아니라 높은 온도 또는 낮은 데이터 취득 속도에서 염기 검출 속도를 증가시키는데 사용될 수 있다.
하기에 더욱 상세하게 논의되는 바와 같은 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 가교제가 사용되면, 어댑터는 바람직하게는 헵타키스(6-데옥시-6-아미노)-6-N-모노(2-피리딜)디티오프로파노일-β-시클로덱스트린 (am6amPDP1-βCD)이다.
더욱 적절한 어댑터에는 8개의 당 단위를 포함하는 (따라서 8겹 대칭성이 있는) γ-시클로덱스트린이 포함된다. γ-시클로덱스트린은 링커 분자를 함유할 수 있거나, 또는 상기 논의된 β-시클로덱스트린 예에서 사용된 변형된 당 단위를 모두 또는 이보다 많이 함유하도록 변형될 수 있다.
바람직하게는 분자 어댑터가 포어에 공유결합으로 부착된다. 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 어댑터가 포어에 공유결합으로 부착될 수 있다. 전형적으로 어댑터는 화학적 연결을 통해 부착된다. 분자 어댑터가 시스테인 연결을 통해 부착되면, 바람직하게는 하나 이상의 시스테인이 치환에 의해 돌연변이체 내로 도입되어 있다. 상기 논의된 바와 같이, Msp로부터 유래된 단량체는 위치 88, 90, 91, 103 및 105 중 하나 이상에 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 시스테인 중 하나 이상, 예컨대 2개, 3개, 4개 또는 5개에 분자 어댑터를 부착시키는 것에 의해 포어 내의 각각의 단량체가 화학적으로 변형될 수 있다. 별법으로, 다른 위치에서 도입된 하나 이상의 시스테인에 분자를 부착시키는 것에 의해 단량체가 화학적으로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 분자 어댑터는 서열 2의 위치 90, 91 및 103 중 하나 이상에서 부착된다.
α-HL로부터 유래된 포어에 대해, 포어의 배럴 또는 채널 내의 어댑터의 정확한 배향 및 포어에 어댑터를 공유결합으로 부착하는 것이 포어에 대한 특이적 변형을 사용하여 용이해질 수 있다. 특히, 바람직하게는 포어의 모든 서브유닛에 서열 2의 위치 139에 글루타민이 있다. 포어의 서브유닛들 중 하나 이상에 서열 2의 위치 113에 아르기닌이 있을 수 있다. 포어에 분자 어댑터를 부착하는 것을 용이하게 하도록 포어의 서브유닛들 중 하나 이상에 서열 2의 위치 119, 121 또는 135에 시스테인이 있을 수 있다.
인접 잔기의 변형에 의해 시스테인 잔기의 반응성이 강화될 수 있다. 예를 들어, 측면에 있는 아르기닌, 히스티딘 또는 리신 잔기의 염기성 기가 시스테인 티올 기의 pKa를 더욱 반응성인 S- 기의 것으로 변화시킬 것이다. 티올 보호기 예컨대 dTNB에 의해 시스테인 잔기의 반응성이 보호될 수 있다. 링커가 부착되기 전에 포어의 하나 이상의 시스테인 잔기와 이를 반응시킬 수 있다.
분자 (이러한 분자로 포어가 화학적으로 변형됨)는 국제 출원 번호 PCT/GB09/001690 (WO 2010/004273으로 공개됨), PCT/GB09/001679 (WO 2010/004265로 공개됨) 또는 PCT/GB10/000133 (WO 2010/086603으로 공개됨)에 개시된 바와 같이 링커를 통해 부착될 수 있거나 또는 포어에 직접적으로 부착될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 검출기는 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 포함한다. 이는 본 발명의 방법을 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 서열분석하는데 사용할 수 있게 한다. 하기에서 폴리뉴클레오티드가 정의된다. 폴리뉴클레오티드 결합 단백질의 예로는 핵산 취급 효소, 예컨대 뉴클레아제(nuclease), 폴리머라제, 토포이소머라제, 리가제 및 헬리카제(helicase), 및 비-촉매성 결합 단백질 예컨대 SCOP (단백질의 구조적 분류(Structural Classification of Proteins))에 의해 핵산-결합 단백질 수퍼패밀리 (50249) 하에 분류된 것들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 국제 출원 번호 PCT/GB10/000133 (WO 2010/086603으로 공개됨)에 기술된 바와 같이 시스테인 잔기를 제거하고/하거나 교체하도록 변형된다. 바람직한 폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 Phi29 폴리머라제로부터 유래된다. 이러한 단백질은 바람직하게는 서열 6에 제시된 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. 이는 하기에서 더욱 상세하게 논의된다. 본 발명에서 사용하기 위한 다른 바람직한 폴리뉴클레오티드 결합 단백질에는 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I (서열 8), 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소 (서열 10), 티. 써모필루스로부터의 RecJ (서열 12) 및 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제 (서열 14) 및 이들의 변이체가 포함된다. 서열 14의 3개의 동일한 서브유닛이 상호작용하여 3량체 엑소뉴클레아제를 형성한다. 변이체는 바람직하게는 막 단백질에 대한 부착을 용이하게 하도록 변형되고, 국제 출원 번호 PCT/GB09/001679 (WO 2010/004265로 공개됨) 또는 PCT/GB10/000133 (WO 2010/086603으로 공개됨)에 논의된 것들 중 임의의 것일 수 있다. 단백질은 국제 출원 번호 PCT/GB10/000133 (WO 2010/086603으로 공개됨)에 기술된 서열 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 및 50, 또는 이러한 국제 출원에서 논의된 이의 변이체 중 임의의 것일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 임의의 방식으로 포어에 부착될 수 있고, 바람직하게는 국제 출원 번호 PCT/GB09/001679 (WO 2010/004265로 공개됨) 또는 PCT/GB10/000133 (WO 2010/086603으로 공개됨)에 기술된 바와 같이 부착된다.
바람직하게는 검출기는 막횡단 단백질 포어에 더하여 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 포함한다. 이같은 검출기는 본 발명의 서열분석 방법에서 사용될 수 있는 모듈형 서열분석 시스템을 형성한다. 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 포어에 부착될 수 있지만, 반드시 그러하지는 않다.
엑소뉴클레아제 서열분석에서, 표적 폴리뉴클레오티드가 검출기 내에 존재하는 엑소뉴클레아제와 상호작용하게 된다. 전형적으로 엑소뉴클레아제는 검출기 내의 포어에 부착된다. 가닥 서열분석에서는, 전형적으로 검출기가 포어에 더하여 폴리머라제를 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드는 검출기 내에 존재하는 폴리머라제, 예컨대 Phi29 폴리머라제와 상호작용하게 된다. 전형적으로, 폴리머라제 및 포어가 함께 부착되지는 않지만, 함께 검출기를 형성한다.
엑소뉴클레아제 서열분석을 위해, 바람직하게는 엑소뉴클레아제가 막횡단 단백질 포어에 공유결합으로 부착된다. 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 엑소뉴클레아제가 포어에 공유결합으로 부착될 수 있다. 포어 및 단백질이 화학적으로 융합될 수 있거나 또는 유전학적으로 융합될 수 있다. 전체 구축물이 단일 폴리뉴클레오티드 서열로부터 발현되면, 포어 및 엑소뉴클레아제가 유전학적으로 융합된다. 엑소뉴클레아제에 포어를 유전학적으로 융합시키는 것이 국제 출원 번호 PCT/GB09/001679 (WO 2010/004265로 공개됨)에 논의되어 있다.
엑소뉴클레아제가 시스테인 연결을 통해 포어에 부착되면, 바람직하게는 하나 이상의 시스테인이 치환에 의해 포어에 도입되어 있다. Msp로부터 유래된 포어는 당연히 위치 10 내지 15, 51 내지 60, 136 내지 139 및 168 내지 172 중 하나 이상에 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 위치들은 상동체들 간에 보존성이 낮은 루프 영역 내에 존재하고, 이는 돌연변이 또는 삽입이 허용될 수 있음을 가리킨다. 따라서, 이들이 엑소뉴클레아제를 부착시키는데 적절하다. 상기 기술된 바와 같은 변형에 의해 시스테인 잔기의 반응성이 강화될 수 있다.
엑소뉴클레아제는 포어에 직접적으로 또는 하나 이상의 링커를 통해 부착될 수 있다. 국제 출원 번호 PCT/GB10/000132 (WO 2010/086602로 공개됨)에 기술된 혼성화 링커를 사용하여 엑소뉴클레아제가 포어에 부착될 수 있다. 별법으로, 펩티드 링커가 사용될 수 있다. 펩티드 링커는 아미노산 서열이다. 전형적으로, 펩티드 링커의 길이, 유연성 및 친수성은 링커가 포어 및 엑소뉴클레아제의 기능을 방해하지 않도록 디자인된다. 바람직한 유연한 펩티드 링커는 2개 내지 20개, 예컨대 4개, 6개, 8개, 10개 또는 16개의 세린 및/또는 글리신 아미노산의 신장물이다. 더욱 바람직한 유연한 링커에는 (SG)1, (SG)2, (SG)3, (SG)4, (SG)5 및 (SG)8 [식 중, S는 세린이고, G는 글리신이다]가 포함된다. 바람직한 강성 링커는 2개 내지 30개, 예컨대 4개, 6개, 8개, 16개 또는 24개의 프롤린 아미노산의 신축물이다. 더욱 바람직한 강성 링커에는 (P)12 [식 중, P는 프롤린이다]가 포함된다.
검출기는 분자 어댑터 및 엑소뉴클레아제로 화학적으로 변형된 막횡단 단백질 포어를 포함할 수 있다. 이같은 검출기는 엑소뉴클레아제 서열분석에 유용하다.
엑소뉴클레아제 서열분석을 위해, 가장 바람직한 검출기는 (a) α-HL로부터 유래된 포어, (b) 포어에 공유결합으로 부착된 엑소뉴클레아제 및 (c) 시클로덱스트린 또는 이의 유도체를 포함한다. 이러한 바람직한 실시양태에서, 포어는 바람직하게는 1개의 서열 36에 제시된 서브유닛 (즉 α-HL-E287C-QC-D5FLAGH6) 및 6개의 서열 34에 제시된 서브유닛 (즉 α-HL-Q)을 포함한다. 엑소뉴클레아제는 바람직하게는 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I (서열 8) 또는 이의 변이체이다. 시클로덱스트린의 유도체는 바람직하게는 헵타키스-6-아미노-β-시클로덱스트린 (am7-βCD), 6-모노데옥시-6-모노아미노-β-시클로덱스트린 (am1-βCD) 또는 헵타키스-(6-데옥시-6-구아니디노)-시클로덱스트린 (gu7-βCD)이다.
가닥 서열분석을 위해, 바람직한 검출기는 (a) Msp로부터 유래된 포어 및 (b) Phi29 폴리머라제를 포함한다. 포어 및 폴리머라제는 함께 부착되지 않는다. 이러한 바람직한 실시양태는 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
검출기는 개별적인 검출기 또는 단일 검출기로서 존재할 수 있다. 별법으로, 검출기는 2개 이상의 검출기의 상동성 또는 이종성 집단 내에 존재할 수 있다.
폴리뉴클레오티드
폴리뉴클레오티드, 예컨대 핵산은 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 거대분자이다. 단백질이 결합한 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 임의의 뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 천연 발생이거나 또는 인공일 수 있다. 뉴클레오티드는 산화 또는 메틸화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 뉴클레오티드가 손상될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드가 피리미딘 이량체를 포함할 수 있다. 이같은 이량체는 전형적으로 자외선에 의한 손상과 연관되고, 피부 흑색종의 주요 원인이다.
뉴클레오티드는 전형적으로 핵염기, 당 및 하나 이상의 포스페이트 기를 함유한다. 핵염기는 전형적으로 헤테로고리형이다. 핵염기에는 퓨린 및 피리미딘, 더욱 구체적으로는 ?닌, 구아닌, 티민, 우라실 및 사이토신이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 당은 전형적으로 펜토스 당이다. 뉴클레오티드 당에는 리보스 및 데옥시리보스가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 뉴클레오티드는 전형적으로 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드는 전형적으로 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트를 함유한다. 포스페티으는 뉴클레오티드의 5' 또는 3' 측면 상에 부착될 수 있다
뉴클레오티드에는 아데노신 모노포스페이트 (AMP), 아데노신 디포스페이트 (ADP), 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 구아노신 모노포스페이트 (GMP), 구아노신 디포스페이트 (GDP), 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 티미딘 모노포스페이트 (TMP), 티미딘 디포스페이트 (TDP), 티미딘 트리포스페이트 (TTP), 우리딘 모노포스페이트 (UMP), 우리딘 디포스페이트 (UDP), 우리딘 트리포스페이트 (UTP), 사이티딘 모노포스페이트 (CMP), 사이티딘 디포스페이트 (CDP), 사이티딘 트리포스페이트 (CTP), 고리형 아데노신 모노포스페이트 (cAMP), 고리형 구아노신 모노포스페이트 (cGMP), 데옥시아데노신 모노포스페이트 (dAMP), 데옥시아데노신 디포스페이트 (dADP), 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 모노포스페이트 (dGMP), 데옥시구아노신 디포스페이트 (dGDP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시티미딘 모노포스페이트 (dTMP), 데옥시티미딘 디포스페이트 (dTDP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP), 데옥시우리딘 모노포스페이트 (dUMP), 데옥시우리딘 디포스페이트 (dUDP), 데옥시우리딘 트리포스페이트 (dUTP), 데옥시사이티딘 모노포스페이트 (dCMP), 데옥시사이티딘 디포스페이트 (dCDP) 및 데옥시사이티딘 트리포스페이트 (dCTP)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 뉴클레오티드는 바람직하게는 AMP, TMP, GMP, CMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP 또는 dCMP로부터 선택된다.
뉴클레오티드가 당 및 하나 이상의 포스페이트 기를 함유할 수 있다 (즉, 핵염기가 결여됨).
폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드들은 임의의 방식으로 서로 부착될 수 있다. 전형적으로 뉴클레오티드들은 핵산에서와 같이 이들의 당 및 포스페이트 기에 의해 부착된다. 뉴클레오티드들은 피리미딘 이량체에서와 같이 이들의 핵염기를 통해 연결될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 바람직하게는 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분이 이중 가닥이다. 단일 가닥 폴리뉴클레오티드에 하나 이상의 프라이머가 혼성화되어 있을 수 있고, 따라서 단일 가닥 폴리뉴클레오티드가 하나 이상의 짧은 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 영역을 포함할 수 있다. 프라이머는 표적 폴리뉴클레오티드와 동일한 유형의 폴리뉴클레오티드일 수 있거나, 또는 상이한 유형의 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 핵산, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 업계에 공지된 임의의 합성 핵산, 예컨대 펩티드 핵산 (PNA), 글리세롤 핵산 (GNA), 트레오스 핵산 (TNA), 잠금 핵산 (LNA), 또는 뉴클레오티드 측쇄가 있는 기타 합성 중합체일 수 있다. 단백질이 결합한 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 단일 가닥, 예컨대 cDNA, RNA, GNA, TNA 또는 LNA이다. 단백질이 결합한 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 이중 가닥, 예컨대 DNA이다. 단백질이 결합하기 전에 이중 가닥 DNA가 단일 가닥으로 해리되는 한, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드에 결합하는 단백질이 이중 가닥 DNA를 서열분석하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 가닥 서열분석 방법이 사용되는 경우, 일반적으로는 1개의 가닥만 서열분석되지만, 전형적으로 폴리뉴클레오티드 분석물은 이중 가닥인 부분을 함유한다. 프라이머/주형 설정에서, 전형적으로 주형 가닥이 서열분석된다 (즉, 포어 내로의 5' 관통). 임의의 경우에, 가닥 서열분석을 위해, 바람직하게는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 리더 서열을 포함한다. 리더 서열은 임의의 길이일 수 있지만, 전형적으로는 뉴클레오티드 27개 내지 150개의 길이, 예컨대 뉴클레오티드 50개 내지 150개의 길이이다. 단일 가닥 폴리뉴클레오티드의 섹션을 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 부가하는 것은 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 화학적 또는 효소적 결찰이 행해질 수 있다. 또한, 에피센터(Epicentre)에 의한 넥스테라(Nextera) 방법이 적절하다. 본 발명가들은 일반적인 바와 같이 게놈 DNA의 표적 영역의 시작부에 대한 상보적인 섹션을 함유하지만, 추가적으로 50 폴리T 섹션이 이어지는 센스 프라이머를 사용하는 PCR 방법을 개발하였다. 폴리머라제가 폴리T 섹션 반대쪽의 상보적인 가닥을 확장시키고 이에 의해 평활 말단 PCR 생성물이 생성되는 것 (정상적인 바와 같음)을 방지하지 위해, 4개의 무염기 부위가 폴리T 섹션과 상보적인 프라이밍 섹션 사이에 부가되었다. 이러한 무염기 부위들은 폴리머라제가 이러한 영역 너머로 확장되는 것을 방지할 것이고, 따라서 폴리T 섹션이 각각의 증폭된 카피 상에서 5' 단일 가닥 DNA로서 남아있을 것이다.
나노포어 센싱
검출기가 포어를 포함하면, 바람직하게는 본 발명의 방법은 분석물이 검출기와 상호작용하게 하는 단계 및 상호작용 동안 포어를 통과하는 전류를 측정함으로써 분석물의 존재 또는 부재 또는 특성을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 분석물에 대해 특이적인 방식으로 전류가 포어를 통과하여 흐르면 (즉, 분석물과 연관된 독특한 전류가 포어를 통해 흐르는 것으로 검출되면), 분석물이 존재한다. 전류가 분석물에 대해 특이적인 방식으로 포어를 통하여 흐르지 않으면, 분석물이 부재한다. 유사하게, 상호작용 동안 포어를 통해 흐르는 전류를 사용하여 분석물의 특성을 결정할 수 있다.
따라서 본 발명은 분석물의 나노포어 센싱을 수반한다. 본 발명은 포어를 통과하는 전류에 대한 분석물의 상이한 효과를 기초로 유사한 구조의 분석물들을 구별하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 샘플 내의 특정 분석물의 농도를 측정하는데 또한 사용될 수 있다.
본 발명은 대량 센싱 용도에서 다수의 포어 또는 수천 개의 포어를 사용하는 센서에서 또한 사용될 수 있다.
포어가 막 내로 삽입된 임의의 적절한 막 (예컨대 친양쪽성 층 또는 지질 이중층) 시스템을 사용하여 방법을 수행할 수 있다. 전형적으로, (i) 포어를 포함하는 인공 막 (예컨대 친양쪽성 층 또는 지질 이중층), (ii) 포어를 포함하는 단리된 천연 발생 지질 이중층, 또는 (iii) 포어가 내부에 삽입된 세포를 사용하여 방법이 수행된다. 바람직하게는, 인공 막 (예컨대 친양쪽성 층 또는 지질 이중층)을 사용하여 방법이 수행된다. 막은 포어에 더하여 다른 막횡단 및/또는 막내 단백질, 뿐만 아니라 다른 분자를 포함할 수 있다. 적절한 기구 및 조건이 본 발명의 서열분석 실시양태를 참조로 하기에서 논의된다. 본 발명의 방법은 전형적으로 시험관 내에서 수행된다.
분석물과 포어 사이의 상호작용 동안, 분석물이 포어를 통해 흐르는 전류에 이러한 분석물에 대해 특이적인 방식으로 영향을 미친다. 예를 들어, 특정 분석물이 포어를 통해 흐르는 전류를 특정 평균 기간 동안 특정 정도로 감소시킬 것이다. 달리 말하면, 포어를 통해 흐르는 전류 흐름이 특정 분석물에 대해 독특하다. 포어를 통해 흐르는 전류에 대해 특정 분석물이 지니는 효과를 결정하기 위해 대조군 실험이 수행될 수 있다. 그 후, 샘플 내의 특정 분석물을 확인하기 위해, 특정 분석물이 샘플 내에 존재하는지 여부를 결정하기 위해, 또는 분석물의 특성을 결정하기 위해, 테스트 샘플 상에 본 발명의 방법을 수행하는 것으로부터의 결과를 이같은 대조군 실험으로부터 유래된 것과 비교할 수 있다. 포어를 통해 흐르는 전류가 특정 분석물을 가리키는 방식으로 영향을 받는 빈도를 사용하여 샘플 내의 이러한 분석물의 농도를 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 서열분석하는 방법
본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드인 분석물의 서열을 추정하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드인 분석물을 서열분석하는 방법을 또한 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 거대분자이다. 뉴클레오티드는 메틸화, 산화 및 손상 뉴클레오티드를 포함하여 상기 논의된 것들 중 임의의 것일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 상기 논의된 것들 중 임의의 것일 수 있고, 바람직하게는 핵산이다.
막횡단 단백질 포어를 사용하여 유사한 구조의 뉴클레오티드들을 포어를 통과하는 전류에 대한 이들의 상이한 효과를 기초로 구별할 수 있기 때문에 이러한 방법들이 가능하다. 개별적인 뉴클레오티드들이 이들이 포어와 상호작용할 때의 이들의 전류 진폭으로부터 단일 분자 수준에서 확인될 수 있다. 뉴클레오티드에 대해 특이적인 방식으로 전류가 포어를 통해 흐르면 (즉, 뉴클레오티드와 연관된 독특한 전류가 포어를 통해 흐르는 것으로 검출되면), 뉴클레오티드가 포어 내에 존재한다 (개별적으로 또는 폴리뉴클레오티드의 일부로서). 표적 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드들의 연속적인 확인은 폴리뉴클레오티드의 서열이 결정되게 한다.
한 실시양태에서, 방법은 (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 막에 커플링시키는 단계; (b) 표적 폴리뉴클레오티드가 막 내에 존재하는 검출기와 상호작용하게 하고, 이때 검출기가 막횡단 포어 및 엑소뉴클레아제를 포함하여, 엑소뉴클레아제가 표적 폴리뉴클레오티드의 한쪽 단부로부터 개별적인 뉴클레오티드를 소화시키도록 하는 단계; (c) 뉴클레오티드가 포어와 상호작용하게 하는 단계; (d) 상호작용 동안 포어를 통과하는 전류를 측정함으로써 뉴클레오티드의 신원을 결정하는 단계; 및 (e) 표적 폴리뉴클레오티드의 동일한 단부에서 단계 (b) 내지 (d)를 반복함으로써 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 막에 커플링시키는 단계; (b) 표적 폴리뉴클레오티드가 막 내에 존재하는 검출기와 상호작용하게 하고, 이때 검출기가 막횡단 포어, 포어와 하나 이상의 뉴클레오티드 간의 상호작용을 용이하게 하는 분자 어댑터, 및 엑소뉴클레아제를 포함하여, 엑소뉴클레아제가 표적 폴리뉴클레오티드의 한쪽 단부로부터 개별적인 뉴클레오티드를 소화시키도록 하는 단계; (c) 뉴클레오티드가 어댑터와 상호작용하게 하는 단계; (d) 상호작용 동안 포어를 통과하는 전류를 측정함으로써 뉴클레오티드의 신원을 결정하는 단계; 및 (e) 표적 폴리뉴클레오티드의 동일한 단부에서 단계 (b) 내지 (d)를 반복함으로써 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 따라서, 방법은 표적 폴리뉴클레오티드를 서열분석하기 위해 연속적인 방식으로 표적 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드들의 일부를 나노포어 센싱하는 것을 수반한다. 개별적인 뉴클레오티드들이 상기 및 하기에서 기술된다. 이것이 엑소뉴클레아제 서열분석이다.
또 다른 실시양태에서, 방법은 (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 막에 커플링시키는 단계; (b) 표적 폴리뉴클레오티드가 막 내에 존재하는 검출기와 상호작용하게 하고, 이때 검출기가 막횡단 포어를 포함하여, 표적 폴리뉴클레오티드가 포어를 통해 이동하도록 하는 단계; 및 (c) 포어와 관련되어 표적 폴리뉴클레오티드가 이동할 때 포어를 통과하는 전류를 측정함으로써 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 막에 커플링시키는 단계; (b) 표적 폴리뉴클레오티드가 막 내에 존재하는 검출기와 상호작용하게 하고, 이때 검출기가 막횡단 단백질 포어 및 폴리뉴클레오티드 결합 단백질, 바람직하게는 폴리머라제를 포함하여, 이러한 단백질이 포어를 통한 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하고, 표적 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드들의 일부분이 포어와 상호작용하도록 하는 단계; 및 (c) 각각의 상호 작용 동안 포어를 통과하는 전류를 측정함으로써 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 따라서, 방법은 표적 폴리뉴클레오티드를 서열분석하기 위해 뉴클레오티드들이 개별적으로 배럴 또는 채널을 통과할 때 표적 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드들의 일부를 나노포어 센싱하는 것을 수반한다. 이것이 가닥 서열분석이다.
이러한 본 발명의 방법들은 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 핵산의 서열분석에 특히 적절한데, 이는 핵산 서열을 막에 커플링하는 것이 요구되는 폴리뉴클레오티드의 양을 수십 배만큼 저하시키기 때문이다. 본 발명을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드가 서열분석될 수 있는 농도가 상기에서 논의된다.
이러한 방법을 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드 전체가 또는 이의 일부분만이 서열분석될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 길이는 뉴클레오티드 10개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 150개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 300개 이상, 400개 이상 또는 500개 이상일 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 길이는 뉴클레오티드 1000개 이상 또는 뉴클레오티드5000개 이상일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 천연 발생 또는 인공일 수 있다. 예를 들어, 제작된 올리고뉴클레오티드의 서열을 확인하는데 방법이 사용될 수 있다. 전형적으로는 시험관 내에서 방법이 수행된다.
뉴클레오티드 (표적 폴리뉴클레오티드로부터 소화되었거나 또는 폴리뉴클레오티드 내에 존재함)는 막의 어느 한쪽 측면 상에서 포어와 상호작용할 수 있다. 뉴클레오티드는 임의의 방식으로 임의의 부위에서 포어와 상호작용할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 바람직하게는 뉴클레오티드들은 어댑터를 통해 또는 어댑터와 함께 포어에 가역적으로 결합한다. 가장 바람직하게는, 뉴클레오티드들은 이들이 막을 가로질러 포어를 통과할 때 어댑터를 통해 또는 어댑터와 함께 포어에 가역적으로 결합한다. 또한 뉴클레오티드들은 이들이 막을 가로질러 포어를 통과할 때 어댑터를 통해 또는 어댑터와 함께 포어의 배럴 또는 채널에 가역적으로 결합할 수 있다.
뉴클레오티드와 포어 사이의 상호작용 동안, 뉴클레오티드가 이러한 뉴클레오티드에 특이적인 방식으로 포어를 통해 흐르는 전류에 영향을 미친다. 예를 들어, 특정 뉴클레오티드가 포어를 통해 흐르는 전류를 특정 평균 기간 동안 특정 정도로 감소시킬 것이다. 달리 말하면, 포어를 통해 흐르는 전류 흐름이 특정 뉴클레오티드에 대해 독특하다. 포어를 통해 흐르는 전류에 대해 특정 뉴클레오티드가 지니는 효과를 결정하기 위해 대조군 실험이 수행될 수 있다. 그 후, 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하기 위해, 테스트 샘플 상에 본 발명의 방법을 수행하는 것으로부터의 결과를 이같은 대조군 실험으로부터 유래된 것과 비교할 수 있다.
포어가 막 내에 존재하거나 막 내로 삽입된 임의의 적절한 막/포어 시스템을 사용하여 서열분석 방법을 수행할 수 있다. 전형적으로는, 천연 발생 또는 합성 지질을 포함하는 막을 사용하여 방법이 수행된다. 전형적으로는 시험관 내에서 막이 형성된다. 바람직하게는, 포어를 포함하는 단리된 천연 발생 막, 또는 포어를 발현하는 세포를 사용하여 방법이 수행되지 않는다. 바람직하게는, 인공 막을 사용하여 방법이 수행된다. 막은 포어에 더하여 다른 막횡단 및/또는 막내 단백질, 뿐만 아니라 다른 분자를 포함할 수 있다.
막은 이온, 뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 흐름에 대한 장벽을 형성한다. 막은 바람직하게는 친양쪽성 층 예컨대 지질 이중층이다. 본 발명에 따라 사용하기에 적절한 지질 이중층이 상기에서 기술된다.
본 발명의 서열분석 방법은 전형적으로는 시험관 내에서 수행된다.
포어가 막 내에 존재하거나 막 내로 삽입된 막/포어 시스템을 연구하기에 적절한 임의의 기구를 사용하여 서열분석 방법을 수행할 수 있다. 나노포어 센싱에 적절한 임의의 기구를 사용하여 방법을 수행할 수 있다. 예를 들어, 기구는 수성 용액을 포함하는 챔버, 및 챔버를 2개의 섹션으로 분리하는 장벽을 포함한다. 장벽에는 포어를 함유하는 막이 형성되어 있는 구멍이 있다. 분석물은 챔버의 2개의 섹션 중 어느 한 쪽에서 막에 커플링될 수 있다.
국제 출원 번호 PCT/GB08/000562에 기술된 기구를 사용하여 서열분석 방법이 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 뉴클레오티드와의 상호작용 동안 또는 표적 폴리뉴클레오티드가 포어와 관련되어 이동할 때 포어를 통과하는 전류를 측정하는 것을 수반한다. 따라서, 기구는 전위를 인가할 수 있고 막 및 포어를 가로지르는 전기 신호를 측정할 수 있는 전기 회로를 또한 포함한다. 패치 클램프 또는 전압 클램프를 사용하여 방법이 수행될 수 있다. 바람직하게는, 방법은 전압 클램프의 사용을 수반한다.
본 발명의 서열분석 방법은 뉴클레오티드와의 상호작용 동안 또는 표적 폴리뉴클레오티드가 포어와 관련되어 이동할 때 포어를 통과하는 전류를 측정하는 것을 수반한다. 막횡단 단백질 포어를 통한 이온 전류를 측정하기 위한 적절한 조건이 업계에 공지되어 있고, 실시예에서 개시된다. 전형적으로는, 막 및 포어를 가로질러 인가된 접압으로 방법이 수행된다. 사용된 전압은 전형적으로 -400 mV 내지 +400 mV이다. 바람직하게는, 사용된 전압은 하한이 -400 mV, -300 mV, -200 mV, -150 mV, -100 mV, -50 mV, -20 mV 및 0 mV로부터 선택되고 상한이 +10 mV, + 20 mV, +50 mV, +100 mV, +150 mV, +200 mV, +300 mV 및 +400 mV로부터 독립적으로 선택되는 범위 내이다. 사용된 전압은 더욱 바람직하게는 100 mV 내지 240 mV의 범위이고, 가장 바람직하게는 160 mV 내지 240 mV의 범위이다. 증가된 인가 전위를 사용함으로써 포어에 의한 상이한 뉴클레오티드들 간의 구별을 증가시키는 것이 가능하다.
전형적으로는, 임의의 알칼리 금속 클로라이드 염의 존재 하에 서열분석 방법이 수행된다. 상기 논의된 예시적인 기구에서, 염은 챔버 내의 수성 용액 내에 존재한다. 염화칼륨 (KCl), 염화나트륨 (NaCl) 또는 염화세슘 (CsCl)이 전형적으로 사용된다. KCl이 바람직하다. 전형적으로, 염 농도는 0.1 내지 2.5 M, 0.3 내지 1.9 M, 0.5 내지 1.8 M, 0.7 내지 1.7 M, 0.9 내지 1.6 M 또는 1 M 내지 1.4 M이다. 염 농도는 바람직하게는 150 mM 내지 1 M이다. 높은 염 농도는 높은 신호 대 잡음 비를 제공하고, 전류가 정상적인 전류 변동의 배경값에 대해 확인될 뉴클레오티드의 존재를 가리키게 한다. 폴리뉴클레오티드를 서열분석할 때와 같이, 뉴클레오티드 검출이 효소의 존재 하에 수행된다면 더 낮은 염 농도가 사용될 수 있다. 이는 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
전형적으로는, 완충제의 존재 하에 방법이 수행된다. 상기 논의된 예시적인 기구에서, 완충제는 챔버 내의 수성 용액 내에 존재한다. 임의의 완충제가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 한 적절한 완충제는 트리스-HCl 완충제이다. 전형적으로는 4.0 내지 12.0, 4.5 내지 10.0, 5.0 내지 9.0, 5.5 내지 8.8, 6.0 내지 8.7 또는 7.0 내지 8.8, 또는 7.5 내지 8.5의 pH에서 방법이 수행된다. 사용된 pH는 바람직하게는 약 7.5이다.
전형적으로는, 0℃ 내지 100℃, 15℃ 내지 95℃, 16℃ 내지 90℃, 17℃ 내지 85℃, 18℃ 내지 80℃, 19℃ 내지 70℃, 또는 20℃ 내지 60℃에서 방법이 수행된다. 실온에서 방법이 수행될 수 있다. 바람직하게는, 효소 기능을 지지하는 온도, 예컨대 약 37℃에서 방법이 수행된다.
상기 언급된 바와 같이, 온도가 증가되면 낮은 염 농도에서 양호한 뉴클레오티드 구별이 달성될 수 있다. 용액 온도를 증가시키는 것에 더하여, 효소 활성에 적절한 조건을 유지하면서 용액의 전도도를 증가시키는데 사용될 수 있는 다수의 다른 전략이 있다. 한 이같은 전략은 지질 이중층을 사용하여, 효소 측면 상의 염의 낮은 염 농도 및 반대쪽 측면 상의 더 높은 농도인 2개의 상이한 염 용액 농도를 분리하는 것이다. 이러한 접근법의 한 예는 막의 시스 측면 상의 200 mM의 KCl, 및 트랜스(trans) 챔버 내의 500 mM KCl을 사용하는 것이다. 이러한 조건에서, 포어를 통한 전도도는 정상 조건 하의 400 mM KCl와 대략적으로 등가일 것으로 예측되고, 시스 측면 상에 놓이면 효소는 200 mM만 경험한다. 비대칭 염 조건을 사용하는 것의 또 다른 가능한 이점은 포어를 가로질러 유도된 삼투 구배이다. 물의 이러한 순흐름을 사용하여 뉴클레오티드를 검출을 위해 포어 내로 끌어당길 수 있다. 중성 삼투물질, 예컨대 수크로스, 글리세롤 또는 PEG를 사용하여 유사한 효과가 달성될 수 있다. 또 다른 가능성은 KCl 수준이 비교적 낮은 용액을 사용하고 효소 활성에 대해 덜 파괴적인 추가적인 전하 운반 종에 의존하는 것이다.
폴리뉴클레오티드가 벌크 용액 내에 있는 동안 결합 단백질 또는 엑소뉴클레아제에 의해 작용되는 것을 방지하기 위해, 분석되는 표적 폴리뉴클레오티드가 공지된 보호 화학과 조합될 수 있다. 그 후, 포어가 보호 화학을 제거하는데 사용될 수 있다. 이는 인가된 전위 하에 포어, 결합 단백질 또는 효소에 의해 혼성화되지 않는 보호기를 사용함으로써 달성될 수 있거나 (WO 2008/124107), 또는 포어에 근접하게 유지될 때 결합 단백질 또는 효소에 의해 제거되는 보호 화학을 사용함으로써 달성될 수 있다 (문헌 [J Am Chem Soc. 2010 Dec 22;132(50):17961-72]).
엑소뉴클레아제 서열분석
한 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드인 분석물을 서열분석하는 방법은 표적 폴리뉴클레오티드를 엑소뉴클레아제 효소와 상호작용하게 하는 것을 포함한다. 상기 논의된 엑소뉴클레아제 효소 중 임의의 것이 방법에서 사용될 수 있다. 엑소뉴클레아제는 표적 폴리뉴클레오티드의 한쪽 단부로부터 개별적인 뉴클레오티드들을 방출시킨다. 상기 논의된 바와 같이 이러한 효소가 포어에 공유결합으로 부착될 수 있다.
개별적인 뉴클레오티드는 단일 뉴클레오티드이다. 개별적인 뉴클레오티드는 또 다른 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드 결합에 의해 결합되지 않은 것이다. 뉴클레오티드 결합은 뉴클레오티드의 포스페이트 기 중 하나가 또 다른 뉴클레오티드의 당 기에 결합되는 것을 수반한다. 전형적으로, 개별적인 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1000개 이상 또는 5000개 이상의 또 다른 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드 결합에 의해 결합되지 않은 것이다. 예를 들어, 개별적인 뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA 가닥으로부터 소화되었다. 개별적인 뉴클레오티드는 상기 논의된 것들 중 임의의 것일 수 있다.
엑소뉴클레아제는 전형적으로 폴리뉴클레오티드의 한쪽 단부 상에 걸려서, 이러한 단부로부터 한번에 1개의 뉴클레오티드씩 폴리뉴클레오티드를 소화시키는 효소이다. 엑소뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드를 5' → 3' 방향 또는 3' → 5' 방향으로 소화시킬 수 있다. 엑소뉴클레아제가 결합하는 폴리뉴클레오티드의 단부는 사용된 효소의 선택을 통해 및/또는 업계에 공지된 방법을 사용하여 전형적으로 결정된다. 엑소뉴클레아제가 폴리뉴클레오티드의 특정 단부에 결합하는 것을 방지하거나 또는 용이하게 하기 위해 폴리뉴클레오티드의 어느 한쪽 단부의 히드록실 기 또는 캡(cap) 구조가 전형적으로 사용될 수 있다.
방법은 상기 논의된 바와 같이 뉴클레오티드의 일부분의 확인을 허용하는 속도로 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드의 단부로부터 소화되도록 폴리뉴클레오티드가 엑소뉴클레아제와 상호작용하게 하는 것을 수반한다. 이를 행하는 방법이 업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 에드만(Edman) 분해가 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 확인될 수 있도록 단일 아미노산을 폴리펩티드의 단부로부터 연속적으로 소화시키는데 사용된다. 유사한 방법이 본 발명에서 사용될 수 있다.
엑소뉴클레아제가 기능하는 속도는 전형적으로 야생형 엑소뉴클레아제의 최적 속도보다 느리다. 서열분석 방법에서의 엑소뉴클레아제 활성의 적절한 속도는 초 당 0.5개 내지 1000개의 뉴클레오티드, 초 당 0.6개 내지 500개의 뉴클레오티드, 초 당 0.7개 내지 200개의 뉴클레오티드, 초 당 0.8개 내지 100개의 뉴클레오티드, 초 당 0.9개 내지 50개의 뉴클레오티드 또는 초 당 1개 내지 20개 또는 10개의 뉴클레오티드의 소화를 수반한다. 속도는 바람직하게는 초 당 1개, 10개, 100개, 500개 또는 1000개의 뉴클레오티드이다. 다양한 방식으로 엑소뉴클레아제 활성의 적절한 속도가 달성될 수 있다. 예를 들어, 활성의 최적 속도가 감소된 변이체 엑소뉴클레아제가 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 발명의 엑소뉴클레아제 서열분석 방법은 필요한 폴리뉴클레오티드의 양에서의 감소를 넘어서는 추가적인 장점이 있다. 본 발명가들은 용액 내의 단일 가닥 DNA를 전위 하에 엑소뉴클레아제-나노포어 ("X-포어")/막 시스템에 제시하는 것을 연구하였다. DNA 분석물이 시스템 내로 도입되는 경우, 포어가 영구적으로 또는 일시적으로 차단되어, 개별적인 뉴클레오티드들의 검출을 방지할 수 있다. 예를 들어 막에 커플링시키는 것에 의해 DNA 분석물의 한쪽 단부가 포어에서 떨어져 국소화되는 경우, 이러한 차단이 더 이상 관찰되지 않는다는 것이 뜻밖에 발견되었다. 이는 분석물과 동일한 평면 내에 존재하는 것의 증가된 효과적인 농도로 인해 효소에 대한 잠재적인 DNA 관통 이벤트의 횟수를 또한 증가시킨다. 이는 분석물 간의 결합 시간을 저하시키고 서열분석 처리량을 증가시키는 작용을 한다.
가닥 서열분석
가닥 서열분석은 포어를 통한 폴리뉴클레오티드의 제어형 단계식 전치를 수반한다. 폴리뉴클레오티드는 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 거대분자이다. 단백질이 결합한 폴리뉴클레오티드는 임의의 뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 상기 논의된 것들 중 임의의 것일 수 있다.
본 발명의 가닥 서열분석 방법은 전형적으로 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 사용하여 포어를 통한 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어한다. 이같은 단백질의 예가 상기에서 제공된다. 폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 취급 효소이다. 폴리뉴클레오티드 취급 효소는 폴리뉴클레오티드와 상호작용할 수 있고 이의 1가지 이상의 성질을 변형시킬 수 있는 폴리펩티드이다. 이러한 효소는 개별적인 뉴클레오티드들 또는 뉴클레오티드들의 더 짧은 사슬, 예컨대 디- 또는 트리뉴클레오티드를 형성하도록 폴리뉴클레오티드를 절단함으로써 폴리뉴클레오티드를 변형시킬 수 있다. 이러한 효소는 폴리뉴클레오티드를 특정 위치로 배향시키거나 이동시킴으로서 폴리뉴클레오티드를 변형시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드 취급 효소는 표적 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있고 포어를 통한 이의 이동을 제어할 수 있는 한 효소 활성을 나타낼 필요가 없다. 예를 들어, 이러한 효소는 이의 효소 활성을 제거하도록 변형될 수 있거나, 또는 효소로서 작용하는 것을 방지하는 조건 하에 사용될 수 있다. 이같은 조건이 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
폴리뉴클레오티드 취급 효소는 바람직하게는 핵산분해성(nucleolytic) 효소로부터 유래된다. 효소 구축에서 사용된 폴리뉴클레오티드 취급 효소는 더욱 바람직하게는 효소 분류 (EC) 군 3.1.11, 3.1.13, 3.1.14, 3.1.15, 3.1.16, 3.1.21, 3.1.22, 3.1.25, 3.1.26, 3.1.27, 3.1.30 및 3.1.31 중 어느 하나의 구성원으로부터 유래된다. 이러한 효소는 국제 출원 번호 PCT/GB10/000133 (WO 2010/086603으로 공개됨)에 개시된 것들 중 임의의 것일 수 있다.
바람직한 효소는 폴리머라제, 엑소뉴클레아제, 헬리카제, 트랜스로카제(translocase) 및 토포이소머라제, 예컨대 자이라제(gyrase)이다. 적절한 효소에는 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I (서열 8), 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소 (서열 10), 티. 써모필루스로부터의 RecJ (서열 12) 및 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제 (서열 14) 및 이들의 변이체가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 서열 14에 제시된 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 서브유닛 3개가 상호작용하여 삼량체 엑소뉴클레아제를 형성한다. 가장 바람직하게는 효소는 Phi29 DNA 폴리머라제로부터 유래된다. Phi29 폴리머라제로부터 유래된 효소는 서열 6에 제시된 또는 이의 변이체를 포함한다.
한 실시양태에 따르면, 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 막에 커플링 또는 테더링되고, 분석물 폴리뉴클레오티드에 결합하는 것 및 그 후 포어를 통한 분석물의 전치를 제어하는 것 양쪽 모두가 가능하다. 이러한 실시양태에서, 분석물 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 통해 막에 커플링될 수 있다. 분석물 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 결합 단백질 양쪽 모두가 막에 커플링될 수 있고, 바람직하게는 커플링 방법이 상이하다. 폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 바람직하게는 헬리카제이다.
서열 6, 8, 10, 12 또는 14의 변이체는 아미노산 서열이 서열 6, 8, 10, 12 또는 14의 것과 다르고 폴리뉴클레오티드 결합 능력을 유지하는 효소이다. 변이체는 폴리뉴클레오티드의 결합을 용이하게 하고/하거나 높은 염 농도 및/또는 실온에서의 이의 활성을 용이하게 하는 변형을 포함할 수 있다.
서열 6, 8, 10, 12 또는 14의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐, 바람직하게는 변이체는 아미노산 동일성을 기초로 이러한 서열에 대해 적어도 50％ 상동성일 것이다. 더욱 바람직하게는, 변이체 폴리펩티드는 전체 서열에 걸쳐 서열 6, 8, 10, 12 또는 14의 아미노산 서열에 대해 아미노산 동일성을 기초로 적어도 55％, 적어도 60％, 적어도 65％, 적어도 70％, 적어도 75％, 적어도 80％, 적어도 85％, 적어도 90％, 더욱 바람직하게는 적어도 95％, 97％ 또는 99％ 상동성일 수 있다. 200개 이상, 예를 들어 230개, 250개, 270개 또는 280개 또는 이를 초과하는 개수의 연속적인 아미노산의 신장물에 걸쳐 아미노산 동일성이 적어도 80％, 예를 들어 적어도 85％, 90％ 또는 95％일 수 있다 ("강한 상동성"). 상동성은 상기 기술된 바와 같이 결정된다. 변이체는 서열 2와 관련하여 상기 논의된 방식 중 임의의 방식으로 야생형 서열과 상이할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이 효소가 포어에 공유결합으로 부착될 수 있다.
뉴클레오티드가 포어의 센싱 모이어티에 도달하는 시리즈에서 무질서에 대한 가능성이 없기 때문에 효소가 개별적인 뉴클레오티드 서열 분석에 대한 것과 같이 포어 내강에 근접할 것이 요구되지 않는다.
가닥 DNA 서열분석을 위한 2가지 전략은 전위를 인가하여 또는 인가된 전위에 거슬러 DNA를 나노포어를 통해 전치시키는 것이다 (시스 → 트랜스 및 트랜스 → 시스 양쪽 모두). 가닥 서열분석을 위한 가장 유리한 메커니즘 중 하나는 인가된 전위 하의 나노포어를 통한 단일 가닥 DNA의 제어형 전치이다. 이중 가닥 DNA 상에서 점진적으로 또는 진행성으로 작용하는 엑소뉴클레아제가 인가된 전위 하에 나머지 단일 가닥이 관통하여 공급되도록 포어의 시스 측면 상에서, 또는 역전위 하에 트랜스 측면 상에서 사용될 수 있다. 마찬가지로, 이중 가닥 DNA를 푸는 헬리카제가 유사한 방식으로 또한 사용될 수 있다. 인가된 전위에 거스르는 가닥 전치를 필요로 하는 서열분석 용도에 대한 가능성도 존재하지만, 먼저 역전위 또는 전위 부재 하에 DNA가 효소에 의해 "포획"되어야 한다. 그 후, 결합 후에 전위가 돌아오면, 가닥이 시스 → 트랜스로 포어를 통과할 것이고, 연장된 형상으로 전류 흐름에 의해 유지될 것이다. 단일 가닥 DNA 엑소뉴클레아제 또는 단일 가닥 DNA 의존적 폴리머라제가 조금 전에 전치된 단일 가닥을 인가된 전위에 거슬러 트랜스 → 시스로 제어형 단계식 방식으로 포어를 통해 도로 잡아 당기는 분자 모터로서 작용할 수 있다. 별법으로, 단일 가닥 DNA 의존적 폴리머라제가 포어를 통한 폴리뉴클레오티의 이동을 느리게 하는 분자 브레이크로서 작용할 수 있다.
가장 바람직한 실시양태에서, 가닥 서열분석은 Msp 및 Phi29 DNA 폴리머라제로부터 유래된 포어를 사용하여 수행된다. 방법은 (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 막에 커플링시키는 단계; (b) 표적 폴리뉴클레오티드가 막 내의 검출기와 상호작용하게 하고, 이러한 검출기가 Msp 및 Phi29 DNA 폴리머라제로부터 유래된 포어를 포함하여, 폴리머라제가 포어를 통한 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하도록 하는 단계; 및 (c) 포어와 관련되어 표적 폴리뉴클레오티드가 이동할 때 포어를 통과하는 전류를 측정함으로써 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 단계를 포함할 수 있고, 이때 단계 (b) 및 (c)는 전압이 포어를 가로질러 인가되면서 수행된다. 방법은 (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 막에 커플링시키는 단계; (b) 표적 폴리뉴클레오티드가 막 내의 검출기와 상호작용하게 하고, 이러한 검출기가 Msp 및 Phi29 DNA 폴리머라제로부터 유래된 포어를 포함하여, 폴리머라제가 포어를 통한 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하고, 표적 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드들의 일부분이 포어와 상호작용하도록 하는 단계; 및 (c) 각각의 상호작용 동안 포어를 통과하는 전류를 측정함으로써 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 단계를 포함할 수 있고, 이때 단계 (b) 및 (c)는 전압이 포어를 가로질러 인가되면서 수행된다. 표적 폴리뉴클레오티드가 Phi29 DNA 폴리머라제 및 Msp로부터 유래된 포어와 접촉될 때, 표적 폴리뉴클레오티드는 Phi29 DNA 폴리머라제와의 복합체를 먼저 형성한다. 포어를 가로질러 전압이 인가될 때, 표적 폴리뉴클레오티드/Phi29 DNA 폴리머라제 복합체가 포어와의 복합체를 형성하고, 포어를 통한 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어한다.
이러한 Msp/Phi29 실시양태는 3가지의 예상 밖의 장점이 있다. 첫째, 상업적으로 실행가능하지만 효과적인 서열분석을 허용하는 속도로 표적 폴리뉴클레오티드가 포어를 통해 이동한다. 표적 폴리뉴클레오티드는 용혈소 포어를 통해 이동하는 것보다 더 신속하게 Msp 포어를 통해 이동한다. 둘째, 폴리뉴클레오티드가 포어를 통해 이동할 때 증가된 전류 범위가 관찰되어, 서열이 더욱 쉽게 결정되게 한다. 셋째, 감소된 전류 변동이 특정 포어 및 폴리머라제가 함께 사용될 때 관찰됨으로써, 신호-대-잡음 비를 증가시킨다.
상기 기술된 임의의 폴리뉴클레오티드를 서열분석할 수 있다. 바람직하게는 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분이 이중 가닥이다.
포어는 상기 논의된 포어 중 임의의 것일 수 있다. 포어는 서열 2에 제시된 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 단량체 8개를 포함할 수 있다.
야생형 Phi29 DNA 폴리머라제는 폴리머라제 및 엑소뉴클레아제 활성이 있다. 이는 올바른 조건 하에 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 언지핑할 수도 있다. 따라서, 이러한 효소는 3가지 방식으로 작용할 수 있다. 이는 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
Phi29 DNA 폴리머라제는 서열 6에 제시된 서열 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 서열 6의 변이체는 아미노산 서열이 서열 6의 것과 다르고 폴리뉴클레오티드 결합 활성을 유지하는 효소이다. 변이체는 하기 논의된 3가지 방식 중 하나 이상으로 작용할 수 있어야 한다. 바람직하게는, 변이체는 3가지 방식 모두로 작용한다. 변이체는 폴리뉴클레오티드의 취급을 용이하게 하고/하거나 높은 염 농도 미치/또는 실온에서의 이의 활성을 용이하게 하는 변형을 포함할 수 있다.
서열 6의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐, 바람직하게는 변이체는 아미노산 동일성을 기초로 이러한 서열에 대해 적어도 40％ 상동성일 것이다. 더욱 바람직하게는, 변이체 폴리펩티드는 전체 서열에 걸쳐 서열 4의 아미노산 서열에 대해 아미노산 동일성을 기초로 적어도 50％, 적어도 55％, 적어도 60％, 적어도 65％, 적어도 70％, 적어도 75％, 적어도 80％, 적어도 85％, 적어도 90％, 더욱 바람직하게는 적어도 95％, 97％ 또는 99％ 상동성일 수 있다. 200개 이상, 예를 들어 230개, 250개, 270개 또는 280개 또는 이를 초과하는 개수의 연속적인 아미노산의 신장물에 걸쳐 아미노산 동일성이 적어도 80％, 예를 들어 적어도 85％, 90％ 또는 95％일 수 있다 ("강한 상동성"). 상동성은 상기 기술된 바와 같이 결정된다. 변이체는 서열 2와 관련하여 상기 논의된 방식 중 임의의 방식으로 야생형 서열과 상이할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이 효소가 포어에 공유결합으로 부착될 수 있다.
상기 논의된 시스템, 기구 또는 조건 중 임의의 것이 이러한 바람직한 실시양태에 따라 사용될 수 있다. 염 농도는 전형적으로 0.15 M 내지 0.6 M이다. 염은 바람직하게는 KCl이다.
Phi29 DNA 폴리머라제의 3가지 양식을 기초로 하는 3가지 바람직한 방식 중 하나로 방법이 수행될 수 있다. 각각의 방식은 서열을 교정(proof-reading)하는 방법을 포함한다. 첫째로, Phi29 DNA 폴리머라제를 폴리머라제로 사용하여 방법이 바람직하게 수행된다. 이러한 실시양태에서, 폴리머라제가 인가된 전압으로부터 생성된 전기장에 거슬러 표적 폴리뉴클레오티드를 포어를 통해 이동시키도록 유리 뉴클레오티드 및 효소 보조인자의 존재 하에 단계 (b) 및 (c)가 수행된다. 표적 폴리뉴클레오티드는 5' →3 ' 방향으로 이동한다. 유리 뉴클레오티드는 하나 이상의 상기 논의된 개별적인 뉴클레오티드들 중 임의의 것일 수 있다. 효소 보조인자는 Phi29 DNA 폴리머라제가 폴리머라제 또는 엑소뉴클레아제로서 기능하게 하는 인자이다. 효소 보조인자는 바람직하게는 2가 금속 양이온이다. 2가 금속 양이온은 바람직하게는 Mg2 +, Mn2 +, Ca2 + 또는 Co2 +이다. 가장 바람직하게는 효소 보조인자는 Mg2+이다. 바람직하게는 방법은 (d) 폴리머라제가 인가된 전압으로부터 생성된 전기장으로 (즉, 3' → 5' 방향으로) 표적 폴리뉴클레오티드를 포어를 통해 이동시키고 표적 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드들의 일부분이 포어와 상호작용하도록 유리 뉴클레오티드를 제거하는 단계 및 (e) 각각의 상호작용 동안 포어를 통과하는 전류를 측정함으로써 단계 (c)에서 수득된 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 교정하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 단계 (d) 및 (e) 또한 전압이 포어를 가로질러 인가되면서 수행된다.
둘째로, Phi29 DNA 폴리머라제를 엑소뉴클레아제로 사용하여 방법이 바람직하게 수행된다. 이러한 실시양태에서, 폴리머라제가 인가된 전압으로부터 생성된 전기장으로 표적 폴리뉴클레오티드를 포어를 통해 이동시키도록 유리 뉴클레오티드의 부재 및 효소 보조인자의 존재 하에 단계 (b) 및 (c)가 수행된다. 표적 폴리뉴클레오티드는 3' → 5' 방향으로 이동한다. 바람직하게는 방법은 (d) 폴리머라제가 인가된 전압으로부터 생성된 전기장을 거슬러 (즉, 5' → 3' 방향으로) 표적 폴리뉴클레오티드를 포어를 통해 이동시키고 표적 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드들의 일부분이 포어와 상호작용하도록 유리 뉴클레오티드를 첨가하는 단계 및 (e) 각각의 상호작용 동안 포어를 통과하는 전류를 측정함으로써 단계 (c)에서 수득된 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 교정하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 단계 (d) 및 (e) 또한 전압이 포어를 가로질러 인가되면서 수행된다.
셋째로, Phi29 DNA 폴리머라제를 언지핑 양식으로 사용하여 방법이 바람직하게 수행된다. 이러한 실시양태에서, 폴리머라제가 인가된 전압으로부터 생성된 전기장으로 표적 폴리뉴클레오티드가 포어를 통해 이동하는 것 (언지핑됨에 따라)을 제어하도록 유리 뉴클레오티드의 부재 및 효소 보조인자의 부재 하에 단계 (b) 및 (c)가 수행된다. 이러한 실시양태에서, 폴리머라제는 표적 폴리뉴클레오티드가 인가된 전압의 영향 하에 너무 빠르게 포어를 통해 이동하는 것을 방지하는 브레이크로서의 작용을 한다. 바람직하게는 방법은 (d) 표적 폴리뉴클레오티드가 단계 (b) 및 (c)에서의 방향과 반대 방향으로 포어를 통해 이동하고 (즉, 다시 어닐링(annealing)됨에 따라), 표적 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드들의 일부분이 포어와 상호작용하도록, 포어를 가로질러 인가된 전압을 낮추는 단계 및 (e) 각각의 상호작용 동안 포어를 통과하는 전류를 측정함으로써 단계 (c)에서 수득된 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 교정하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 단계 (d) 및 (e) 또한 전압이 포어를 가로질러 인가되면서 수행된다.
키트
본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드인 분석물을 서열분석하기 위한 키트를 또한 제공한다. 이러한 키트는 (a) 막횡단 포어, 예컨대 막횡단 단백질 포어, (b) 폴리뉴클레오티드 결합 단백질 및 (c) 표적 폴리뉴클레오티드를 막에 커플링시키는 수단을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 엑소뉴클레아제이고, 키트는 포어와 표적 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 간의 상호작용을 용이하게 하는 분자 어댑터를 추가로 포함한다. 이같은 키트가 엑소뉴클레아제 서열분석에 사용될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 키트는 막 성분, 예컨대 지질 이중층을 형성하는데 필요한 인지질을 포함한다.
표적 폴리뉴클레오티드를 막에 커플링시키는 수단은 바람직하게는 반응성 기를 포함한다. 적절한 기에는 티올, 콜레스테롤, 지질 및 비오틴 기가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 방법과 관련하여 상기 논의된 실시양태 중 임의의 것이 본 발명의 키트에 동등하게 적용될 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 언급된 실시양태 중 임의의 것이 수행될 수 있게 하는 하나 이상의 다른 시약 또는 기기를 추가적으로 포함할 수 있다. 이같은 시약 또는 기기에는 하기의 것 중 하나 이상이 포함된다: 적절한 완충제(들) (수성 용액), 대상으로부터 샘플을 수득하는 수단 (예컨대 바늘을 포함하는 기기 또는 용기), 폴리뉴클레오티드를 증폭 및/또는 발현시키는 수단, 상기 정의된 바와 같은 막, 또는 전압 또는 패치 클램프 기구. 유체 샘플에 시약이 재현탁되도록, 시약이 건조 상태로 키트 내에 존재할 수 있다. 임의로, 키트는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있게 하는 설명서 또는 방법이 어떤 환자를 위해 사용될 수 있는지에 관한 상세사항을 또한 포함할 수 있다. 키트는 뉴클레오티드를 임의로 포함할 수 있다.
기구
본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드인 분석물을 서열분석하기 위한 기구를 또한 제공한다. 이러한 기구는 (a) 막, (b) 막 내의 다수의 막횡단 포어, (c) 다수의 폴리뉴클레오티드 결합 단백질 및 (d) 막에 커플링된 다수의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다수의 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 막 내에 있을 수 있다. 기구는 분석물 분석을 위한 임의의 통상적인 기구, 예컨대 어레이(array) 또는 칩(chip)일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 엑소뉴클레아제이고, 기구는 포어와 표적 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 간의 상호작용을 용이하게 하는 분자 어댑터를 포함한다. 이같은 기구가 엑소뉴클레아제 서열분석에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법과 관련하여 상기 논의된 실시양태 중 임의의 것이 본 발명의 키트에 동등하게 적용될 수 있다. 바람직하게는 기구는
막 및 다수의 포어를 지지할 수 있으며 포어 및 단백질을 사용하여 폴리뉴클레오티드 서열분석을 수행하도록 작동가능할 수 있는 센서 장치; 및
서열분석을 수행하기 위한 물질을 보유하기 위한 하나 이상의 저장소
를 포함한다.
바람직하게는 기구는
막 및 다수의 포어를 지지할 수 있으며 포어 및 단백질을 사용하여 폴리뉴클레오티드 서열분석을 수행하도록 작동가능할 수 있는 센서 장치;
서열분석을 수행하기 위한 물질을 보유하기 위한 하나 이상의 저장소;
하나 이상의 저장소로부터 센서 장치로 물질을 제어가능하게 공급하도록 구성된 유체공학 시스템; 및
각각의 샘플을 수용하기 위한 하나 이상, 예컨대 다수의 용기
를 포함하며, 유체공학 시스템은 하나 이상의 용기로부터 센서 장치로 샘플을 선택적으로 공급하도록 구성되어 있다. 기구는 국제 출원 번호 번호 PCT/GB08/004127 (WO 2009/077734로 공개됨), PCT/GB10/000789 (WO 2010/122293으로 공개됨), 국제 출원 번호 PCT/GB10/002206 (아직 공개되지 않음) 또는 국제 출원 번호 PCT/US99/25679 (WO 00/28312로 공개됨)에 기술된 것들 중 임의의 것일 수 있다.
하기의 실시예들은 본 발명을 예시한다:
1. 실시예 1 - 엑소뉴클레아제 서열분석
1.1 물질 및 방법
1.1.1 물질 및 올리고뉴클레오티드
올리고뉴클레오티드를 ADTBio 또는 IDTDNA에서 구입하였다. 정확한 서열 및 변형에 대한 상세사항을 하기 표에서 확인할 수 있다 (서열 18 내지 21).
Figure 112013117531264-pct00004
이. 콜라이에서 발현된 재조합 스트렙타비딘을 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) (S0677)에서 구입하였다. 합성 지질 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (16:0 4ME PC) 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-캡 비오티닐 (16:0 캡 비오티닐 PE)을 아반티 폴리 리피드(Avanti Polar Lipids)에서 구입하였다.
1.1.2 단일-치환 스트렙타비딘의 HPLC 정제
1 uM의 5'-비오틴 변형 DNA를 25 mM 트리스HCl, 400 mM KCl, 10 mM MgCl2, pH 7.5 내의 10 uM의 스트렙타비딘과 혼합하고, 30분 동안 22℃에서 인큐베이션하였다. 단일-치환 Strep:DNA 접합체를 2원성 펌프, 23℃에서 유지된 칼럼 오븐, UV 검출기 + 13 ul 유동 셀이 있는 애질런트(Agilent) 1200 분석용 LC 시스템을 사용하여 분리하였고, 이때 샘플 구획 및 분획 양쪽 모두 4℃에서 유지되었다. 칼럼은 1 ㎖/분으로 러닝(running)된 애질런트의 바이오모노리스(BioMonolith) QA였고, 샘플은 100 mM 트리스 pH 8.5 내의 30 mM - 1.1 M NaCl 구배 상에서 분리되었다. 정제된 단일-치환 Strep:DNA 접합체의 정량을 표준 곡선을 생성시키는 일련의 DNA 표준물을 사용하여 겔 전기영동 후에 농도측정을 사용하여 수행하였다.
1.1.3 평면형 지질 이중층으로부터의 단일 채널 기록
100％ 16:0 4ME PC 또는 95％ 16:0 4ME PC, 5％ 16:0 캡 비오티닐 PE의 2개의 단층의 병치에 의해 이중층이 형성되었다. 이중층은 테프론 필름 (25 ㎛ 두께, 펜실베이니아주 말번의 굿펠로우(Goodfellow)) 내의 60-150 ㎛ 직경 구멍을 가로질러 형성되었고, 이는 각각 부피가 1 ㎖인 2개의 완충제 구획 (시스 및 트랜스)으로 챔버를 나눴다. 높은 저항의 씰(seal) (≥10 GΩ)이 관찰될 때까지 각각의 구획 내의 완충제 수준을 연속적으로 상승시키는 것에 의해 구멍을 가로질러 이중층이 형성되었다. 달리 언급되지 않는 한, 그라운드(ground)에 연결된 시스 구획에 DNA 및 단백질이 첨가되었다. 증폭기의 헤드-스테이지(head-stage)에 연결된 트랜스 구획에는 시약이 첨가되지 않았다. 달리 언급되지 않는 한, 25 mM 트리스HCl, 400 mM KCl, 10 mM MgCl2, pH 7.5에서 22 ℃에서 실험을 수행하였다.
1.2 결과
1.2.1 테더링된 분석물의 단일 분자 검출
용액 내에서 자유로운 단일 가닥 DNA의 나노포어 검출 속도를 초 당 나노포어를 통한 DNA 전치 (이벤트)의 횟수를 측정함으로써 결정할 수 있다. 디지털 기록에서의 상징적인 일시적인 전류 차단에 의해 DNA 전치를 확인할 수 있다. 테더링된 분석물에 대해, DNA가, 예컨대 콜레스테롤 기를 통해, 이중층에 일시적으로만 테더링되었으면 상호작용의 횟수를 유사하게 계산할 수 있다. DNA의 자유로운 단부가 나오노어에 진입함에 따라, 이는 테더링된 단부가 이중층으로부터 자유로워지고 따라서 분자가 전치될 수 있을 때까지 배럴 내에 존재할 것이다 (도 2A 및 2B). 테더링이 더욱 안정적이면, 차단이 영구적일 것이다 (도 2C 및 2D).
콜레스테롤 변형 폴리A 및 폴리C (각각 ONLA0682 및 ONLA0683)의 50％ 혼합물을 10, 100 및 1000 pM 최종 농도에서 검정하여, 이벤트 속도 및 체류 시간에 대한 Chol-DNA의 효과를 확립하였다 (하기 표). 이를 유리 단일 가닥 DNA에 대한 이벤트 속도와 비교하였다.
Figure 112013117531264-pct00005
모든 농도에서 전압으로 속도가 상승하였고 (상기 표), 물론 더 높은 농도에서 이벤트 속도가 더 높았다. 더 낮은 농도 및 전압에서는, 이벤트 속도가 또한 너무 낮아서 실제로 의미있는 것으로 간주될 수 없었다. 즉, 전부는 아니더라도 대부분의 이러한 조건에서의 이벤트는 단지 우발적인 거짓-양성일 수 있다. 그러나, 더 높은 전류 수준에서 유의한 숫자의 DNA 이벤트가 겨우 10 pM의 DNA로 나타난다는 것이 다소 놀랍다. DNA 농도가 100배 이상 더 낮음에도 불구하고, 콜레스테롤 변형 DNA로 이벤트 속도가 훨씬 더 높았다. 더 높은 전류 수준 (≥160 mV)에서, 유의한 숫자의 DNA 이벤트가 겨우 10 pM의 DNA로 여전히 나타난다는 것과 이러한 DNA 이벤트가 100 nM의 미변형 ssDNA와 유사한 빈도로 발생한다는 것이 다소 놀랍다. DNA 테더링이 DNA 분석물의 검출을 30-40배 만큼 개선하는 것으로 추정될 수 있다. 특정 용도에 대해, 테더링의 일시적인 성질이 바람직할 수 있다. 안정적인 테더링 분자가 DNA의 5' 또는 3'-단부에 직접적으로 부착되었으면, 이중층과 효소 활성 부위 사이의 거리로 인해 서열분석 실행이 DNA의 단부까지 계속될 수 없기 때문에 일부 서열 데이터가 손실될 것이다. 테더링이 더욱 일시적이면, 테더링된 단부가 무작위로 이중층으로부터 자유로워졌을 때 효소가 DNA를 끝까지 프로세싱할 수 있다.
1.3 결론
여기에서 본 발명가들은 약 30-40배 만큼 분석물에 대한 나노포어 검출기의 검출 효율을 개선할 가능성을 입증하였다. 신속한 포어 차단은 이러한 테더링된 분석물이 여전히 용액으로부터의 단백질 및 이중층 내의 단백질 (예컨대 각각 효소 또는 나노포어 구축물) 양쪽 모두에 이용가능하고, 따라서 포어 자체 또는 나노포어-효소 구축물로의 전달 메커니즘으로서의 가능성이 있다는 것을 시사한다.
분석물을 지질 이중층에 부착시키는 다양한 수단이 입수가능하고, 대부분은 ssDNA의 테더링에 대해 보고되었는데, 이는 관능성 화학이 올리고뉴클레오티드 합성 동안 쉽게 혼입될 수 있기 때문이다. 바람직한 수단에서, 비오틴으로 변형된 ddNTP가 말단 트랜스퍼라제를 사용하여 ssDNA의 3'-단부로 혼입될 수 있다. 스트렙타비딘과 혼합함으로써, 분석물 DNA가 1-5％ 비오틴 PE를 함유하는 지질 이중층 내의 단일 포어에 첨가될 수 있고, 여기에서 테더링될 것이다. 별법으로 서열이 공지되어 있으면, 친지성이도록 한쪽 단부에서 이미 변형된 상보적인 합성 DNA에 DNA가 혼성화될 수 있다.
분석물을 테더링하는 것의 또 다른 장점은 DNA의 한쪽 단부가 제어된다는 것이다. 한쪽 단부가 근접부 (상기 경우에는 이는 이중층임)에서 유지되면 DNA가 포어를 신속하게 차단할 것임을 상기에서 볼 수 있다. DNA 취급 효소, 예컨대 엑소뉴클레아제가 나노포어에 부착되면, 이는 DNA의 한쪽 단부에 결합하여 이를 다시 포어로 국소화시킬 것이며, 따라서 다른 쪽 단부가 신속하게 차단할 것이다. 그러나 DNA가 고정되면, 효소가 한쪽 단부에 결합했을 때 이제 양쪽이 점유되고, 포어에 이용가능하지 않다.
분석물 요구가 낮은 DNA 서열분석을 필요로 하는 것은 후생유전학을 위한 단일 세포 서열분석과 같은 용도를 위한 것이고, 또한 낮은 부피의 생물학적 샘플로부터의 스크리닝을 위한 것이다. 현재의 일루미나(Illumina)의 게놈(Genome) 분석기 시스템은 서열분석 라이브러리 프렙용으로 100 ng 내지 1 ug DNA를 필요로 한다. 나노포어 서열분석을 위한 단일한 128 채널 칩은 증폭을 필요로 하지 않으면서 ~0.5 ng DNA를 사용할 수 있다; 10 pM 농도에서 1000량체 단편 생성 및 판독 길이를 기초로 함.
2. 실시예 2 - 가닥 서열분석
엑소뉴클레아제 서열분석을 위해 ssDNA를 지질 막에 부착시키는 작업에 더하여, 이러한 기술이 가닥 서열분석 접근법에 또한 적합할 수 있다. 가닥 서열분석에서, 폴리뉴클레오티드 가닥의 일부분이 인가된 전위 하에 나노포어를 관통한다. 가닥은 전형적으로 DNA 또는 RNA, 예를 들어 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA이다. 바람직하게는, 가닥은 단일 가닥 DNA (ssDNA)이다. 가닥 내에 포함된 염기 잔기가 나노포어와 상호작용하고, 각각의 잔기의 특성인 신호가 생성된다. 가닥이 구멍을 통해 이동하여, 신호에 변동을 야기한다. 신호를 사용하여 DNA 가닥의 서열을 추론할 수 있다.
가닥 서열분석의 한 실시양태는 지질 막에 매립된 단백질 포어를 사용한다. 전극이 지질 막의 어느 한쪽 측면에서 전해질 내에 놓이고, 시스템을 가로질러 전위가 인가된다. 전위 하에, 폴리뉴클레오티드가 포어를 통해 전치된다. 단백질 포어를 통한 전류를 측정할 수 있고, 이를 사용하여 염기가 포어의 막횡단 배럴을 통과할 때 염기를 인식할 수 있다. 전형적으로, 단백질 포어는 박테리아 막 단백질, 예컨대 포린 또는 독소일 것이다. 바람직하게는, 포어는 용혈소, 그라미시딘(gramicidin) 또는 MspA이다.
DNA가 포어를 통해 전치되는 속도가 너무 빨라서 각각의 염기가 정확하게 확인되게 하지 않을 수 있고, 따라서 전치를 느리게 하는 것이 바람직할 수 있다. DNA 가닥의 전치를 느리게 하는 한 방법은 DNA 취급 단백질, 예컨대 DNA 폴리머라제를 사용하는 것이다. DNA 취급 단백질이, 예를 들어 공유 결합에 의해, 직접적으로 또는 링커 기를 통해 포어에 부착될 수 있다. 전형적으로, DNA 취급 단백질은 엑소뉴클레아제 서열분석 용도를 위해 포어에 부착된다. 통상적으로, 가닥 서열분석 용도를 위해서는, DNA 취급 단백질이 포어에 부착되지 않는다.
가닥 서열분석 접근법을 위해, 나노포어의 상부에서의 결합 시간이 매우 긴 DNA 취급 단백질이 있는 것이 바람직하다. 긴 결합 시간은 다수의 뉴클레오티드가 DNA 취급 단백질을 통해, 그리고 따라서 나노포어를 통해 프로세싱되게 한다. 폴리머라제에 대해, 전형적인 프로세싱 속도는 초당 뉴클레오티드 약 20개일 수 있다. 10분의 결합 시간은 12,000개의 뉴클레오티드의 이동을 허용할 것이다. 1분의 결합 시간은 120개의 뉴클레오티드가 프로세싱되게 할 것이다.
이러한 접근법을 사용하여, 긴 결합 시간은 판독 길이에 또한 관련된다. 현재, 뉴클레오티드 약 100개의 판독 길이가 기존의 기술에 필적하는데 충분할 것이지만, 더 긴 판독 길이, 예를 들어, 뉴클레오티드 200개, 500개 또는 1000개의 판독 길이가 바람직하다. 바람직한 판독 길이는 적어도 5000개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 10000개 또는 50000개의 뉴클레오티드이다. 긴 판독 길이의 한가지 장점은 서열분석 정보를 분석하는데 필요한 생물정보학의 복잡성을 크게 감소시킨다는 것이다.
전형적으로, DNA 취급 단백질은 DNA 폴리머라제이다. 바람직한 DNA 취급 단백질에는 Phi29 DNA 폴리머라제가 포함된다.
2.1 물질 및 방법
100％ DPhPC 또는 99％ DPhPC, 1％ 16:0 캡 비오티닐 PE의 2개의 단층의 병치에 의해 이중층이 형성되었다. 이중층은 테프론 필름 (25 ㎛ 두께, 펜실베이니아주 말번의 굿펠로우) 내의 60-150 ㎛ 직경 구멍을 가로질러 형성되었고, 이는 각각 부피가 1 ㎖인 2개의 완충제 구획 (시스 및 트랜스)으로 챔버를 나눴다. 높은 저항의 씰 (≥10 GΩ)이 관찰될 때까지 각각의 구획 내의 완충제 수준을 연속적으로 상승시키는 것에 의해 구멍을 가로질러 이중층이 형성되었다. 달리 언급되지 않는 한, 그라운드에 연결된 시스 구획에 DNA 및 단백질이 첨가되었다. 증폭기의 헤드-스테이지에 연결된 트랜스 구획에는 시약이 첨가되지 않았다. 400 mM KCl, 25 mM 트리스HCl, 10 uM EDTA, pH 7.5로 실험을 수행하였다. 사용된 용혈소 돌연변이체는 HL-(E111N/K147N)7 (서열 38)이었다.
1 uM의 5'-비오틴 변형 DNA (가닥DNA1)를 25 mM 트리스HCl, 400 mM KCl, 10 mM MgCl2, pH 7.5 내의 10 uM의 스트렙타비딘과 혼합하고, 30분 동안 22℃에서 인큐베이션하였다. 단일-치환 Strep:DNA 접합체를 2원성 펌프, 23℃에서 유지된 칼럼 오븐, UV 검출기 + 13 ul 유동 셀이 있는 애질런트 1200 분석용 LC 시스템을 사용하여 분리하였고, 이때 샘플 구획 및 분획 양쪽 모두 4℃에서 유지되었다. 칼럼은 1 ㎖/분으로 러닝된 애질런트의 바이오모노리스 QA였고, 샘플은 100 mM 트리스 pH 8.5 내의 30 mM - 1.1 M NaCl 구배 상에서 분리되었다. 정제된 단일-치환 Strep:DNA 접합체의 정량을 표준 곡선을 생성시키는 일련의 DNA 표준물을 사용하여 겔 전기영동 후에 농도측정을 사용하여 수행하였다. 가닥DNA3를 형성시키기 위해, PCR 가열 블록 상에서 10분 동안 50℃에서 가열함으로써 DNA-스트렙타비딘 복합체를 5× 과량의 가닥DNA2와 혼성화시켰다. 2℃/분의 속도로 온도를 23℃로 감소시켰다.
막 테더링 실행을 위해, 99％ DPhPC, 1％ 16:0캡 비오티닐 PE로 이중층을 형성시켰다. 이중층이 형성되었으면, 1 nM의 가닥DNA3를 시스 챔버에 첨가하고, 잘 혼합하였다. +180 mV에서 5분 동안 대조군 섹션을 기록하여, 나노포어에 대한 DNA 결합 이벤트를 수득하였다. 대조군 섹션을 기록한 후, 5 nM의 KF (엑소(exo) 마이너스) (NEB)를 첨가하고, +180 mV에서 5분 동안 신호를 기록하였다.
분석물이 용액 내에 있는 실행을 위해, 100％ DPhPC로 이중층이 형성되었다. 가닥DNA4 및 가닥DNA5를 등몰 농도로 혼성화시킴으로써 가닥DNA6이 생산되었다. 10분 동안 PCR 블록 상에서 50℃로 가열한 후, 2℃/분으로 23℃로 냉각함으로써 혼성화가 수행되었다. 이중층이 형성되었으면, 400 nM의 가닥DNA6를 시스 챔버에 첨가하고, 잘 혼합하였다. +180 mV에서 5분 동안 대조군 섹션을 기록하여, 나노포어에 대한 DNA 결합 이벤트를 수득하였다. 대조군 섹션을 기록한 후, 800 nM의 KF (엑소 마이너스) (NEB)를 첨가하고, +180 mV에서 5분 동안 신호를 기록하였다.
개방된 포어 수준을 시각적으로 추정하였고, DNA 전치 이벤트는 포어 수준보다 약 5 시그마 낮게 정해진 역치 미만으로 데이터가 하락했을 때인 것으로 정의되었다 (이때, 시그마는 잡음의 표준 편차이다). 이벤트 검출을 수행하기 전에 임의의 명백한 인공물을 데이터에서 수동으로 제거하였다. pA 단위의 각각의 이벤트의 평균 전류 수준 (수직 축) 대 초 단위의 이벤트 길이 (수평 축)가 도면에서 제시된다. 이벤트 길이가 밀리세컨드 미만 내지 10초 정도 범위이기 때문에, 수평 축이 로그 눈금을 사용하여 디스플레이된다는 것을 주지한다. 4가지 경우 모두에서, 수많은 매우 짧은 이벤트 (1 ms 미만)가 또한 있었고, 이들은 제외되었다. 이는 이들의 전류 수준이 신뢰할 수 있게 추정되기에는 이들이 너무 짧기 때문이고, 이들이 제시된 상이한 조건들을 구별하는 역할을 하지 않기 때문이다.
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2.2 결과
DNA 취급 단백질이 전위 인가 하에 DNA를 유지하는 이의 능력에 대해 평가되게 하는 실험을 고안하였다. 이러한 실험에서, DNA-효소 복합체가 나노포어 내로 잡아당겨져서, 특징적인 전류 수준을 초래한다. DNA-효소 복합체가 해리될 때, DNA가 나노포어 내로 더 깊게 잡아당겨져서, 제2 전류 수준을 초래한다. 그 후, DNA가 나노포어를 통해 완전히 전치되어, 개방된 포어를 초래하고 시스템을 이의 원래 상태로 재설정한다. 이러한 프로세스의 다중 반복에 걸쳐 효소가 결합된 상태의 기간을 시험함으로써 DNA-효소 결합의 동역학을 평가할 수 있다 (도 3).
최근 작업에서, 폴리머라제가 DNA 가닥의 전치를 제어하는데 사용되었다. 이같은 실험을 실행시키기 위해, DNA 농도는 나노포어에 의해 포착되도록 이상적으로는 100-1000 nM이다. 효소가 DNA에 결합할 때, 효소 농도가 DNA와 유사한 몰농도이거나 또는 DNA보다 과량인 것이 바람직하다. 많은 비율의 DNA (바람직하게는 모든 DNA)가 효소-DNA 복합체를 형성하는 것을 확실하게 하기 위해 효소 농도가 DNA 농도의 2배로 사용되는 것이 통상적이다. 이는 필요한 물질의 양에 대한 수요를 높게 한다. 따라서, 더 적은 DNA 및 이에 따른 더 적은 효소를 사용하는 시스템이 있는 것이 바람직하다.
이를 달성하는 한 방법은 DNA를 지질 막에 테더링하는 것이다. 제시된 바와 같이, DNA와 막 사이의 상호작용을 강화함으로써 DNA 삽입 속도가 크게 증가될 수 있다. 이는 1,000배 내지 10,000배 더 적은 물질을 사용하여 DNA가 용액 내에서 유리 상태일 때의 것에 필적하는 속도를 일으킬 수 있다. 더 낮은 농도의 DNA를 사용함으로써, 사용된 효소의 농도가 크게 감소될 수 있다 (도 4 참조).
적절한 DNA 취급 단백질은 클레나우 단편 (KF)이다 (문헌 [N. A. Wilson, R. Abu-Schmays, B. Gyarfas, H. Wang, K. R. Lieberman, M. Akeson and W. B. Dunbar (2009). Electronic Control of DNA Polymerase Binding and Unbinding to Single DNA Molecules. ACS Nano 3, 995-1003]). 클레나우 단편은 이. 콜라이로부터의 DNA 폴리머라제 I이 프로테아제(protease) 서브틸리신에 의해 효소적으로 절단될 때 생산되는 대형 단백질 단편이다. 이는 5'-3' 폴리머라제 활성 및 선행 뉴클레오티드의 제거 및 교정을 위한 3' → 5' 엑소뉴클레아제 활성을 유지하지만, 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성은 상실된다. 나머지 3' → 5' 엑소뉴클레아제 활성을 제거하도록 KF가 또한 유전자 조작될 수 있다. 이러한 DNA 취급 단백질은 전형적으로 단일 가닥 DNA와 이중 가닥 DNA 사이의 계면 (프라이머/주형 접합부)에서 DNA에 결합하고, 뉴클레오티드 부가를 통해 DNA 가닥의 복제를 촉매할 수 있다. 클레나우 단편은 가닥 서열분석 접근법용으로 조사되었지만, 전위 인가에 의해 나노포어의 상부에서 잡아당겨질 때 결합 시간이 1-100 ms인 것으로 확인되었다.
본 발명가들은 상기 제시된 바와 같은 막에 테더링된 분석물 설정에서 KF를 스크리닝하였다 (도 4). DNA가 용액 내에 있을 때, KF-DNA 복합체의 결합 시간은 1-100 ms였다 (도 5 및 6) (공개된 결과 (참조 문헌 [Wilson/Akeson 2009])와 유사함). 이는 너무 짧아서 가닥 서열분석 방법용으로 유용하지 않은데, 100 ms 기간은 소수의 뉴클레오티드만이 판독되게 할 것이기 때문이다. 그러나, DNA가 지질 막에 테더링된 경우에, 결합 시간이 0.1-10 s로 증가하였다 (도 7 및 8).
2.3 결론
포어의 상부 상에서의 효소-DNA 복합체의 기간은 하전된 DNA 가닥 상에서 작용하는 인가된 전기장으로부터의 힘의 함수이다. 단백질이 이러한 힘에 저항하는 능력이 복합체가 포어의 상부 상에서 원래 대로 남아 있는 시간의 길이를 결정한다. 테더링된 DNA에 대한 더 긴 체류 시간은 지질 막을 가로질러 확산될 때 포어 내의 가닥 상에 추가적인 힘을 인가하는 이동성 지질 분자로 인한 것일 수 있다. 이러한 힘은 인가된 장에 의해 인가된 힘을 무효로 하고, KF가 겪는 순력이 감소된다. 이러한 설정은 높은 장이 제공하는 장점으로부터 이득을 얻지만 (예를 들어, 더 높은 신호 대 잡음, 더 빠른 DNA 포착), 여전히 포어의 상부에서 DNA 취급 단백질의 결합 시간이 길게 한다.
테더링 접근법은 나노포어의 상부에서 효소 거동을 제어하는 또 다른 수단을 제공한다. 이러한 개념을 탐구하기 위한 다수의 가능성이 있다. 막의 조성을 다르게 하거나 물리적 파라미터, 예컨대 온도를 변화시킴으로써, 지질 이중층 내의 테더링된 분자의 확산 속도를 변화시키고, 이에 따라 DNA-효소 복합체가 나노포어에서 경험하는 힘을 변화시키는 것이 가능할 것이다. 엑소뉴클레아제 서열분석의 실시양태에서, 막 유동성을 증가시키는 것이 엑소뉴클레아제에 대한 폴리뉴클레오티드의 입수가능성을 증가시킬 수 있다. 콜레스테롤과 같은 작용제를 첨가함으로써 막 유동성이 변화될 수 있다. 또한, 유사한 효과를 일으키도록 테더링된 분석물의 확산 속도를 제어하기 위해 테더링제의 성질이 변화될 수 있다. 대형 종, 예컨대 단백질에 대한 테더링은 소형 분자 예컨대 지질에 대한 테더링과 비교하여 더 느린 확산 속도를 산출할 가능성이 높다. 폴리뉴클레오티드와 복합체를 이루고 나노포어 내로 끌어당겨졌을 때의 효소 속도가 나노포어를 가로질러 인가된 장에 영향을 받을 것으로 나타났다. 분석물 테더링으로부터의 확산력이 포어 상의 효소가 경험하는 순력을 감소시킬 가능성이 높다. 본 발명가들은 인가된 전위로부터의 힘을 분석물 테더링으로부터의 확산력과 조합함으로써 중합체 이동 속도를 제어할 수 있을 것으로 예상한다. 이러한 효과의 또 다른 잠재적인 용도는 DNA 취급 단백질을 사용하지 않으면서 포어를 통한 가닥 속도를 제어하는 것이다. 인간된 전위에 의해 인가된 힘이 막의 확산에 의해 매칭(matching)될 수 있다.
3. 실시예 3 - 추가적인 가닥 서열분석
최근 연구에서, Phi29 DNA 폴리머라제가 α-용혈소를 통한 DNA 가닥의 전치를 제어하는데 사용되었다 (문헌 [Akeson et al., 2010, J Am Chem Soc. 2010 Dec 22;132(50):17961-72]). Phi29를 분자 모터로 사용하여 나노포어를 통한 DNA 가닥의 제어형 이동의 2가지 양식이 보고되었고, 양쪽 방법 모두 5'-오버행 듀플렉스 상의 이중/단일 가닥 DNA 접합부에서의 이의 작용에 의존한다. 이동은 질의되는 가닥에 반대로 혼성화된 프라이밍 가닥으로부터의 중합에 의해 또는 프라이밍 가닥이 질의되는 가닥으로부터 순차적으로 탈혼성화되어 점점 더 많은 표적 서열 (이전에 듀플렉스 DNA였음)이 드러나는 언지핑 방법에 의해 발생할 수 있다.
3.1 물질 및 방법
단일 가닥 DNA에 대해 제시된 바와 같이, 예를 들어 비오틴:스트렙타비딘 각각의 콜레스테롤로, 더 긴 기간의 테더링 또는 이중층과의 일시적인 상호작용을 나타내는 가닥이 생성되도록 테더링 모이어티가 변할 수 있다. dsDNA 분석물에 대해, 효소가 분석물을 완전히 언지핑하게 할 수 있고, 다음에 대비하여 나노포어를 깨끗이 하도록, 일시적인 결합 거동을 나타내는 듀플렉스 DNA 분석물이 가닥 서열분석에 더욱 적절할 것으로 고려될 수 있다.
표적 가닥 (ONLA1346) 상에 3'의 콜레스테롤 기 및 5'의 단일 A를 함유하는 폴리C 확장부를 함유한 상보적인 올리고 (각각 65 nt 및 31 nt의 ONLA1346 및 ONLA1347)를 디자인하였다. 혼성화될 때, 표적 가닥이 5' 먼저 나노포어 내로 관통되어 포착될 수 있도록 이러한 올리고들은 34 nt 5' 오버행이 있는 31 bp의 DNA 듀플렉스를 제공한다. 그 후, 나노포어의 판독기 헤드를 통한 폴리C 배경 내의 단일 A의 이동을 관찰함으로써 언지핑을 추적할 수 있다. 테더링되지 않은 분석물과의 비교를 위해, 서열 면에서 표적 가닥과 동일하지만 콜레스테롤 기가 없는 가닥 (ONLA1049)을 디자인하였다.
Phi29 DNA 폴리머라제와 함께 돌연변이체 MspA-NNNRRK 포어 (ONLP2726)를 사용하여 단일 채널 기록을 수행하였다. 단일 채널을 수득하였고, 시스 완충제에 10 ㎖의 신선한 완충제 (400 mM KCl, 10 mM HEPES pH 8.0)를 관류시켜 단일 채널 삽입의 기회를 최소화하였다. 5분 후, 대조군 섹션 DNA를 테더링 실험 및 비-테더링 실험 각각에 대해 0.5 nM 또는 100 nM로 첨가하였다. DNA 첨가 후 다수의 짧은 기간 이벤트 (~10 ms)가 관찰되었고, 이는 듀플렉스 DNA가 나노포어에 의해 포착되는 것 및 프라이머가 포어의 힘에 의해 주형으로부터 벗겨지는 것으로 제안된다. 5분 후, 또다시 테더링 실험 및 비-테더링 실험 각각에 대해 10 nM 또는 200 nM를 제공하도록 Phi29 DNA 폴리머라제를 시스 챔버에 첨가하였다.
사용된 올리고뉴클레오티드:
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3.2 결과
Phi29 DNA 폴리머라제 첨가 후, DNA:단백질 복합체의 포착인 것으로 제안되는 다수의 장기간 이벤트가 양쪽 실험에서 관찰되었다. 이러한 이벤트들은 단계들 사이의 진동 전에 일정 수준에서 짧은 체류 시간을 나타내는데, 이는 언지핑의 개시 및 A가 포어의 판독기 헤드를 통해 이동하기 시작할 때 발생하는 것으로 생각된다. 이의 예가 테더링 실험 (도 9) 및 비-테더링 실험 (도 10) 양쪽 모두에 대해 도 12 및 11에서 제시된다.
테더링된 DNA 및 용액 DNA 이벤트 양쪽에 대한 모든 언지핑 이벤트의 분석은 관찰된 상태의 숫자에 대한 광범위하게 구성적인 패턴, 각각의 상태에 대한 평균 대 체류 시간 및 각각에 대한 평균 대 표준 편차를 나타낸다 (비-테더링에 대한 도 11 및 테더링에 대한 도 12).
콜레스테롤의 위치는 표적 가닥의 3'에 있는 것으로 고정되지 않고, 주형 또는 프라이머 가닥의 5' 또는 헤어핀 내로 변할 수 있다. 효소가 단일 가닥 DNA와 이중 가닥 DNA 사이의 접합부인 프라이머 가닥의 3'에 놓여 있는 것이 필요하기 때문에, 이는 테더링에 적절한 부위가 아닌 것으로 생각되지만, 이는 실험적으로 실증되지 않았다.
올리고뉴클레오티드의 화학적 합성 동안 부착 화학이 혼입될 수 있는 합성 가닥의 경우에 테더링 방법이 잘 작용하는 한편, 이를 게놈 DNA로부터 유래된 샘플에 적용하는 것은 더욱 어렵다. 게놈 DNA 섹션의 증폭을 위한 통상적인 기술은 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하는 것이다. 이때, 2개의 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 DNA의 동일한 섹션의 다수의 카피가 생성될 수 있고, 이러한 경우 각각의 카피에 대해 듀플렉스 내의 각각의 가닥의 5'이 합성 올리고일 것이다. 5' 콜레스테롤 기가 있는 안티센스 프라이머를 사용함으로써, 증폭된 표적 DNA의 각각의 카피가 테더링을 위한 콜레스테롤 기를 함유할 것이다. PCR에 의해 생성된 분석물의 유일한 문제점은 이것이 평활 말단이거나 또는 단일 3'-A 오버행을 함유하고, 이들 중 어느 것도 가닥 서열분석을 위한 나노포어 내로의 관통에 적절하지 않다는 것이다. 단일 가닥 DNA의 섹션을 듀플렉스 DNA의 5'에 부가하는 것은 쉽게 가능하지 않다. 화학적 또는 효소적 결찰이 행해질 수 있지만, 어느 것도 고도로 효율적이지 않고, 또한 추가적인 하류 반응 및 정제 단계를 필요로 한다. 일반적인 바와 같이 게놈 DNA의 표적 영역의 시작부에 대한 상보적인 섹션을 함유하지만, 추가적으로 50 폴리T 섹션이 이어지는 센스 프라이머를 사용하는 PCR 방법이 개발되었다. 폴리머라제가 폴리T 섹션 반대쪽의 상보적인 가닥을 확장시켜 정상적인 바와 같은 평활 말단 PCR 생성물이 생성되는 것을 방지하지 위해, 4개의 무염기 부위가 폴리T 섹션과 상보적인 프라이밍 섹션 사이에 부가되었다. 이러한 무염기 부위들은 폴리머라제가 이러한 영역 너머로 확장되는 것을 방지할 것이고, 따라서 폴리T 섹션이 각각의 증폭된 카피 상에서 5' 단일 가닥 DNA로서 남아있을 것이다 (도 13 및 14).
이러한 PCR 방법이 5' 리더 폴리T 섹션을 부착하는 효율적인 방식이지만, 부착 화학을 혼입하기 위한 다른 방법, 예컨대 말단 트랜스퍼라제를 사용하여 3'에 부가하는 것 또는 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 ATPγS를 통해 반응성 티올을 화학적 커플링을 위해 5'에 부가하는 것이 가능하다. 그러나, 이러한 방법들은 가닥 서열분석에 적절한 형태의 테더링된 분석물의 생성을 허용하고, 이때 크기, 예컨대 판독 길이에 대한 유일한 제한은 PCR에 의해 부과되는 것이다 (~20 kb).
임의의 언지핑 이벤트를 관찰하기 위해, 상기 기술된 바와 같이, 그러나 이러한 게놈 DNA-증폭 단편을 사용하여 단일 채널 기록을 수행하였다 (도 15 및 16). 자발적으로 진행되고 또한 그 후 종료된 여러 언지핑 이벤트가 관찰되어, 듀플렉스 DNA의 완전한 언지핑을 시사하였다.
용액으로부터 가닥 서열분석을 위해 DNA:단백질 복합체를 포착하기 위한 허용가능한 이벤트 속도를 관찰하기 위해, 100 nM DNA 및 200 nM Phi29 DNA 폴리머라제가 요구된다. 800 bp 단편에 대해, 상기 사용된 바와 같이 1 ㎖ 챔버 부피를 가정하면 이는 실험 당 ~50 ug의 dsDNA와 등가이다. 테더링된 dsDNA 분석물을 사용하면, 0.1 nM DNA 및 10 nM Phi29 DNA 폴리머라제를 사용하여 동일한 허용가능한 이벤트 속도를 충족시킬 수 있고, 이를 능가할 수 있다. 800 bp 단편에 대해, 상기 사용된 바와 같이 1 ㎖ 챔버 부피를 가정하면 이는 실험 당 ~50 ng의 dsDNA와 등가이다.
4. 실시예 4 - 고체 상태 서열분석
지질 막으로의 테더링에 대한 상기에서 입증된 장점이 고체 상태 나노포어 실험에 또한 확장될 수 있다. 나노포어가 고체 상태 물질에서 생산될 수 있고, 생물학적 나노포어와 유사한 방식으로 이용될 수 있다. 이의 사용 및 제작이 다른 곳에 잘 기록되어 있다 (WO 00/79257; WO 00/78668; 문헌 [Dekker C, Nat Nanotechnol. 2007 Apr;2(4):209-15]; 및 [Schloss JA, et al., Nat Biotechnol. 2008 Oct;26(10):1146-53]).
고체 상태 물질, 예컨대 질화규소 내의 나노포어는 포어로서 생물학적 채널에 비해 장점을 제공한다. 고체 상태 물질은 지질 막보다 훨씬 덜 취약하다. 고체 상태 물질 내의 나노포어는 공장에서 형성될 수 있고, 원위치에서 종종 형성되는 생물학적 막과 달리 저장 기간이 길다. 또한, 고체 상태 나노포어를 이용한 최근의 발전은 독특한 성질이 있는 그래핀과 같은 매우 얇은 물질이 사용되게 한다 (문헌 [Golovchenko J, et al., Nature. 2010 Sep 9;467(7312):190-3]; [Drndic M, et al., Nano Lett. 2010 Aug 11;10(8):2915-21]; 및 [Dekker C, et al., Nano Lett. 2010 Aug 11;10(8):3163-7]). 그래핀 내의 나노포어가 또한 제안되었다 (문헌 [Postma, 2008, Rapid Sequencing of Individual DNA Molecules in Graphene Nanogaps]).
고체 상태 막의 추가적인 실시양태는 나노포어 내에 매립된 2개 이상의 전극 사이의 터널링 전류를 사용하는 것이다. 분석물이 포어를 통과함에 따라 (막횡단 전위에 의해 구동됨), 분석물이 전극 사이의 터널링 전류를 촉진한다. 이러한 전류를 사용하여 분석물의 신원을 검출할 수 있다 ([Schloss, 상기 문헌]; 미국 7,253,434; 및 WO 2008/092760).
나노포어에 대한 별법적인 방법은 고체 상태 물질 내의 나노갭(nanogap)을 센서로서 사용하는 것이다 (문헌 [Chen et al., Materials Today, 2010, 13(11): 28-41]).
고체 상태 나노포어 실험이 지질 막에 대해 상기 기술된 장점으로부터 이익을 얻을 수 있다. 2가지 막 유형 간의 주요 차이는 친양쪽성 막은 종종 천연적으로 이동성이어서, 본질적으로 ~10-8 cm s-1의 지질 확산 속도로 2차원 유체로서 작용하는 한편, 질화규소와 같은 물질 내의 막은 고체라는 것이다. 분석물을 정적 양식으로 표면에 테더링하는 것에 대한 장점이 있을 수 있지만, 다중 분석물 분자가 검출기와 상호작용할 수 있도록 분석물이 막을 가로질러 이동할 수 있는 것이 바람직하다.
분석물을 고체 상태 막에 테더링하는데 사용될 수 있는 다수의 체계가 있다 (도 17). 첫 번째 접근법은 분석물과 변형되지 않은 막, 예컨대 Si3N4의 천연 상호작용에 의존할 것이다. 그러나, 이는 표면 상의 분석물의 확산 속도에 대한 제어를 거의 제공하지 않는다. 따라서, 원하는 상호작용을 제공하도록 표면, 분석물, 또는 표면 및 분석물 양쪽 모두를 변형시키는 것이 바람직하다.
고체 상태 물질을 화학적으로 변형시키는 방법이 업계에 주지되어 있다. 용액에서의 자가-조립을 통해 또는 인가된 전압 하에 나노포어를 통해 반응성 종을 구동시킴으로써 고체 상태 나노포어가 또한 화학적으로 변형될 수 있다 (WO 2009/020682).
처음 2개의 체계는 화학적으로 변형된 막을 사용하여, 분석물이 층과 일시적으로 상호작용할 수 있는 표면이 생산된다 (도 17A, B).
첫 번째 체계에서는, 분석물의 테더링 기가 자신을 변형된 층 내로 매립한다 (도 17A). 장쇄 알칸이 표면에 부착될 수 있고, 콜레스테롤 또는 알칸과 같은 테더링 기가 사용될 것이다. 클로로-헥사데실-디메틸실란 (또는 유사물) 및 WO 2009/020682에 기술된 방법을 사용함으로써 표면 변형이 달성될 수 있다.
두 번째 체계에서는, 테더링 분석물이 층 내로 매립되지 않고, 표면 상에 존재한다. 이는 첫 번째 체계에서와 같이 소수성을 사용하여 달성될 수 있다. 또한, 분석물이 표면에 결합하는 것이 정전기, 수소 결합 또는 반 데르 발스 상호작용에 의해 매개되는 유사한 방법이 구상될 수도 있다.
세 번째 체계는 단백질 나노포어와 함께 사용된 막과 가장 유사하다. 이러한 실시양태에서, 지질 단층을 지지하도록 고체 상태 막이 변형된다 (도 17C). 이러한 접근법은 지질 막 테더링에 대해 상기 제시된 예의 장점을 모두 지닌다. 콜레스테롤 앵커 또는 부착을 사용하여, 지질 머리 기를 통해, 또는 막 내의 수용체를 통해 테더링이 달성될 수 있다. 고체 표면 상에 이중층 또는 단층을 형성시키는 방법이 업계에 주지되어 있다 (문헌 [Duran RS, et al., Langmuir. 2007 Mar 13;23(6):2924-7]; 및 [Cremer PS, et al., Surface Science Reports. 2006; 61:429-444]). 표면이 소수성으로 만들어진 경우, 용액 내에서 지질 소포로부터 지질 단층이 자발적으로 형성될 수 있다. 플라즈마 처리 (예컨대 CH4) 또는 화학적 방법, 예컨대 클로로-실란 화학 (WO 2009/020682), 및 금-티올 커플링 (문헌 [Duran, 상기 문헌]; 및 [Cremer, 상기 문헌])가 포함되는 다수의 방식으로 표면이 소수성으로 만들어질 수 있다.
분석물을 막에 테더링시키는 네 번째 체계는 고체 상태 막을 지질 이중층에 대한 지지체로서 사용하는 것이다 (도 17D). 이러한 실시양태에서, 검출기 요소는 고체 상태 막 내의 나노포어이다. 이러한 접근법은 지질 막 테더링에 대해 상기 제시된 예의 장점을 모두 지닌다. 표면이 친수성이게 되면, 지질 이중층이 표면 상에서 자가-조립될 것이다 - 유리 표면 상에서 형성된 이중층에 대해 통상적인 효과 (문헌 [Cremer, 상기 문헌]). 상기의 모든 예에 대해, 고체 상태 나노포어가 폴리뉴클레오티드 결합 단백질과 조합되어 검출기를 형성할 수 있다.
실시예 5
이러한 실시예는 3-블록 공중합체 내에 매립된 MspA 나노포어에 노출되었을 때 테더링되지 않은 DNA에 대해 어떻게 헬리카제-제어 DNA 이동이 관찰되지 않았는지를 기술한다. 칩에는 128개의 웰 + 백금 전극 및 30 ㎛ 구멍이 있고, 이때 백금 공통 전극이 캡에 부착된다.
오일 내의 50 ㎎/㎖ 3-블록 공중합체 (TBCP 6-33-6, OH-PMOXA-(PEG 링커)-PDMS-(PEG 링커)-PMOXA-OH, 폴리머 소스(Polymer Source) 제품 ID: P3691B-MOXZDMSMOXZ)의 용액 혼합물로 단층이 형성되었다. 그 후, 나노포어 (MS-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)8)를 완충제 내의 칩에 첨가하였다. 칩이 형성되었으면, 오직 칩의 상부 (시스 측면)을 가로질러서 시약이 첨가되었다.
625 mM 염화나트륨, 25 mM 페리시안화칼륨, 75 mM 페로시안화칼륨, 100 mM HEPES, pH 8.0 (완충제 1)으로 실험을 수행하였다. 사용된 MspA 돌연변이체는 MS-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)8이었다. 이러한 실험에서 사용된 DNA 서열은 이중-가닥 400량체 가닥이었다 (서열 39가 센스 가닥의 서열을 나타낸다).
Figure 112013117531264-pct00008
오일 내의 50 ㎎/㎖ 3-블록 공중합체 (TBCP 6-33-6, OH-PMOXA-(PEG 링커)-PDMS-(PEG 링커)-PMOXA-OH, 폴리머 소스 제품 ID: P3691B-MOXZDMSMOXZ) 및 칩 상에 미리 삽입된 나노포어 (MS-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)8)로 단층이 형성되었다. 그 후, 칩을 블레이드(blade) 내로 삽입하고, 용액을 수동으로 피펫으로 제거하고 다시 삽입하였다. 다음으로, 1.5 nM DNA (센스 가닥 서열, 서열 39), 500 nM 헬리카제, 10 mM MgCl2 및 1 mM ATP를 150 ㎕의 완충제 1에 첨가하였다. 그 후, 용액을 칩을 가로질러 캡 내의 침니(chimney)를 통해 피펫팅하고, 나노포어로 확산되도록 두었다. 나노포어에서의 헬리카제 이벤트를 수득하기 위해, 5분 마다 전위를 0 mV, 그 후 -50 mV로 플리핑(flipping)하면서, 1시간 동안 +120 mV에서 데이터를 기록하였다.
3-블록 공중합체 (TBCP 6-33-6, OH-PMOXA-(PEG 링커)-PDMS-(PEG 링커)-PMOXA-OH, 폴리머 소스 제품 ID: P3691B-MOXZDMSMOXZ) 내에 삽입된 MS-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)8 나노포어를 통한 테더링되지 않은 DNA (센스 가닥 서열, 서열 39)에 대한 헬리카제-제어 DNA 이동이 검출되지 않았다. 테스트된 조건 하에 포어가 차단되는 것으로 관찰되었지만, 헬리카제-제어 DNA 이동은 나타나지 않았다.
실시예 6
이러한 실시예는 3-블록 공중합체 내에 매립된 MspA 나노포어에 노출되었을 때 테더링된 DNA에 대해 어떻게 헬리카제-제어 DNA 이동이 관찰되었는지를 기술한다. 칩에는 128개의 웰 + 백금 전극 및 30 ㎛ 구멍이 있고, 이때 백금 공통 전극이 캡에 부착된다.
오일 내의 50 ㎎/㎖ 3-블록 공중합체 (TBCP 6-33-6, OH-PMOXA-(PEG 링커)-PDMS-(PEG 링커)-PMOXA-OH, 폴리머 소스 제품 ID: P3691B-MOXZDMSMOXZ)의 용액 혼합물로 단층이 형성되었다. 그 후, 나노포어 (MS-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)8)를 완충제 내의 칩에 첨가하였다. 칩이 형성되었으면, 오직 칩의 상부 (시스 측면)을 가로질러서 시약이 첨가되었다.
625 mM 염화나트륨, 25 mM 페리시안화칼륨, 75 mM 페로시안화칼륨, 100 mM HEPES, pH 8.0 (완충제 1)으로 실험을 수행하였다. 사용된 MspA 돌연변이체는 MS-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)8이었다. 이러한 실험에서 사용된 DNA 서열은 이중-가닥 400량체 DNA (서열 40이 센스 가닥의 서열을 나타냄) 및 서열 40의 일부분에 혼성화할 수 있는, 3' 단부에 콜레스테롤이 부착되어 있는 짧은 상보적 DNA 가닥 (서열 41)으로 이루어진다.
Figure 112013117531264-pct00009
오일 내의 50 ㎎/㎖ 3-블록 공중합체 (TBCP 6-33-6, OH-PMOXA-(PEG 링커)-PDMS-(PEG 링커)-PMOXA-OH, 폴리머 소스 제품 ID: P3691B-MOXZDMSMOXZ) 및 칩 상에 미리 삽입된 나노포어로 단층이 형성되었다. 그 후, 칩을 블레이드 내로 삽입하고, 용액을 수동으로 피펫으로 제거하고 다시 삽입하였다. 다음으로, 1.5 nM DNA (서열 40의 센스 가닥 서열 및 서열 41의 짧은 상보적 테더 가닥), 500 nM 헬리카제, 10 mM MgCl2 및 1 mM ATP를 150 ㎕의 완충제 1에 첨가하였다. 그 후, 용액을 칩을 가로질러 캡 내의 침니를 통해 피펫팅하고, 나노포어로 확산되도록 두었다. 나노포어에서의 헬리카제-제어 DNA 이동을 수득하기 위해, 5분 마다 전위를 0 mV, 그 후 -50 mV로 플리핑하면서, 1시간 동안 +120 mV에서 데이터를 기록하였다.
3-블록 공중합체 (TBCP 6-33-6, OH-PMOXA-(PEG 링커)-PDMS-(PEG 링커)-PMOXA-OH, 폴리머 소스 제품 ID: P3691B-MOXZDMSMOXZ) 내에 삽입된 MS-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)8 나노포어를 통한 테더링된 DNA (서열 40의 센스 가닥 서열 및 서열 41의 짧은 상보적 테더 가닥)의 헬리카제-제어 전치가 검출되었다. 12개의 헬리카제-제어 DNA 이동이 1회의 5분 양성 사이클 과정 동안 검출되었다. 헬리카제-제어 DNA 이동 간의 중앙값 시간은 0.5초였다. 따라서, DNA를 3-블록 공중합체에 테더링하는 것에 의해, 테더링되지 않은 DNA를 사용하는 유사한 실험 (실시예 5)에서는 검출되지 않은 헬리카제-제어 DNA 이동을 관찰하는 것이 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> Oxford Nanopore Technologies Limited <120> Coupling Method <130> N.112486C <150> 61/490,860 <151> 2011-05-27 <150> 61/599,246 <151> 2012-02-15 <160> 41 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 558 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Mycobacterium smegmatis porin A mutant (D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K) <400> 1 atgggtctgg ataatgaact gagcctggtg gacggtcaag atcgtaccct gacggtgcaa 60 caatgggata cctttctgaa tggcgttttt ccgctggatc gtaatcgcct gacccgtgaa 120 tggtttcatt ccggtcgcgc aaaatatatc gtcgcaggcc cgggtgctga cgaattcgaa 180 ggcacgctgg aactgggtta tcagattggc tttccgtggt cactgggcgt tggtatcaac 240 ttctcgtaca ccacgccgaa tattctgatc aacaatggta acattaccgc accgccgttt 300 ggcctgaaca gcgtgattac gccgaacctg tttccgggtg ttagcatctc tgcccgtctg 360 ggcaatggtc cgggcattca agaagtggca acctttagtg tgcgcgtttc cggcgctaaa 420 ggcggtgtcg cggtgtctaa cgcccacggt accgttacgg gcgcggccgg cggtgtcctg 480 ctgcgtccgt tcgcgcgcct gattgcctct accggcgaca gcgttacgac ctatggcgaa 540 ccgtggaata tgaactaa 558 <210> 2 <211> 184 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mycobacterium smegmatis porin A mutant (D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K) <400> 2 Gly Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Asp Arg Thr Leu 1 5 10 15 Thr Val Gln Gln Trp Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Phe Pro Leu Asp 20 25 30 Arg Asn Arg Leu Thr Arg Glu Trp Phe His Ser Gly Arg Ala Lys Tyr 35 40 45 Ile Val Ala Gly Pro Gly Ala Asp Glu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu 50 55 60 Gly Tyr Gln Ile Gly Phe Pro Trp Ser Leu Gly Val Gly Ile Asn Phe 65 70 75 80 Ser Tyr Thr Thr Pro Asn Ile Leu Ile Asn Asn Gly Asn Ile Thr Ala 85 90 95 Pro Pro Phe Gly Leu Asn Ser Val Ile Thr Pro Asn Leu Phe Pro Gly 100 105 110 Val Ser Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Gly Pro Gly Ile Gln Glu Val 115 120 125 Ala Thr Phe Ser Val Arg Val Ser Gly Ala Lys Gly Gly Val Ala Val 130 135 140 Ser Asn Ala His Gly Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu 145 150 155 160 Arg Pro Phe Ala Arg Leu Ile Ala Ser Thr Gly Asp Ser Val Thr Thr 165 170 175 Tyr Gly Glu Pro Trp Asn Met Asn 180 <210> 3 <211> 882 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> alpha-hemolysin mutant (M111R) <400> 3 atggcagatt ctgatattaa tattaaaacc ggtactacag atattggaag caatactaca 60 gtaaaaacag gtgatttagt cacttatgat aaagaaaatg gcatgcacaa aaaagtattt 120 tatagtttta tcgatgataa aaatcacaat aaaaaactgc tagttattag aacaaaaggt 180 accattgctg gtcaatatag agtttatagc gaagaaggtg ctaacaaaag tggtttagcc 240 tggccttcag cctttaaggt acagttgcaa ctacctgata atgaagtagc tcaaatatct 300 gattactatc caagaaattc gattgataca aaagagtata ggagtacttt aacttatgga 360 ttcaacggta atgttactgg tgatgataca ggaaaaattg gcggccttat tggtgcaaat 420 gtttcgattg gtcatacact gaaatatgtt caacctgatt tcaaaacaat tttagagagc 480 ccaactgata aaaaagtagg ctggaaagtg atatttaaca atatggtgaa tcaaaattgg 540 ggaccatacg atcgagattc ttggaacccg gtatatggca atcaactttt catgaaaact 600 agaaatggtt ctatgaaagc agcagataac ttccttgatc ctaacaaagc aagttctcta 660 ttatcttcag ggttttcacc agacttcgct acagttatta ctatggatag aaaagcatcc 720 aaacaacaaa caaatataga tgtaatatac gaacgagttc gtgatgatta ccaattgcat 780 tggacttcaa caaattggaa aggtaccaat actaaagata aatggacaga tcgttcttca 840 gaaagatata aaatcgattg ggaaaaagaa gaaatgacaa at 882 <210> 4 <211> 293 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> alpha-hemolysin mutant (M111R) <400> 4 Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser 1 5 10 15 Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn 20 25 30 Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His 35 40 45 Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln 50 55 60 Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp 65 70 75 80 Pro Ser Ala Phe Lys Val Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val Ala 85 90 95 Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Glu Tyr 100 105 110 Arg Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp Asp 115 120 125 Thr Gly Lys Ile Gly Gly Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser Ile Gly His 130 135 140 Thr Leu Lys Tyr Val Gln Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Ser Pro 145 150 155 160 Thr Asp Lys Lys Val Gly Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn Met Val Asn 165 170 175 Gln Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro Val Tyr Gly 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Met Lys Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala Asp 195 200 205 Asn Phe Leu Asp Pro Asn Lys Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly Phe 210 215 220 Ser Pro Asp Phe Ala Thr Val Ile Thr Met Asp Arg Lys Ala Ser Lys 225 230 235 240 Gln Gln Thr Asn Ile Asp Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg Asp Asp Tyr 245 250 255 Gln Leu His Trp Thr Ser Thr Asn Trp Lys Gly Thr Asn Thr Lys Asp 260 265 270 Lys Trp Thr Asp Arg Ser Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu Lys 275 280 285 Glu Glu Met Thr Asn 290 <210> 5 <211> 1830 <212> DNA <213> bacteriophage phi AR29 <400> 5 atgaaacaca tgccgcgtaa aatgtatagc tgcgcgtttg aaaccacgac caaagtggaa 60 gattgtcgcg tttgggccta tggctacatg aacatcgaag atcattctga atacaaaatc 120 ggtaacagtc tggatgaatt tatggcatgg gtgctgaaag ttcaggcgga tctgtacttc 180 cacaacctga aatttgatgg cgcattcatt atcaactggc tggaacgtaa tggctttaaa 240 tggagcgcgg atggtctgcc gaacacgtat aataccatta tctctcgtat gggccagtgg 300 tatatgattg atatctgcct gggctacaaa ggtaaacgca aaattcatac cgtgatctat 360 gatagcctga aaaaactgcc gtttccggtg aagaaaattg cgaaagattt caaactgacg 420 gttctgaaag gcgatattga ttatcacaaa gaacgtccgg ttggttacaa aatcaccccg 480 gaagaatacg catacatcaa aaacgatatc cagatcatcg cagaagcgct gctgattcag 540 tttaaacagg gcctggatcg catgaccgcg ggcagtgata gcctgaaagg tttcaaagat 600 atcatcacga ccaaaaaatt caaaaaagtg ttcccgacgc tgagcctggg tctggataaa 660 gaagttcgtt atgcctaccg cggcggtttt acctggctga acgatcgttt caaagaaaaa 720 gaaattggcg agggtatggt gtttgatgtt aatagtctgt atccggcaca gatgtacagc 780 cgcctgctgc cgtatggcga accgatcgtg ttcgagggta aatatgtttg ggatgaagat 840 tacccgctgc atattcagca catccgttgt gaatttgaac tgaaagaagg ctatattccg 900 accattcaga tcaaacgtag tcgcttctat aagggtaacg aatacctgaa aagctctggc 960 ggtgaaatcg cggatctgtg gctgagtaac gtggatctgg aactgatgaa agaacactac 1020 gatctgtaca acgttgaata catcagcggc ctgaaattta aagccacgac cggtctgttc 1080 aaagatttca tcgataaatg gacctacatc aaaacgacct ctgaaggcgc gattaaacag 1140 ctggccaaac tgatgctgaa cagcctgtat ggcaaattcg cctctaatcc ggatgtgacc 1200 ggtaaagttc cgtacctgaa agaaaatggc gcactgggtt ttcgcctggg cgaagaagaa 1260 acgaaagatc cggtgtatac cccgatgggt gttttcatta cggcctgggc acgttacacg 1320 accatcaccg cggcccaggc atgctatgat cgcattatct actgtgatac cgattctatt 1380 catctgacgg gcaccgaaat cccggatgtg attaaagata tcgttgatcc gaaaaaactg 1440 ggttattggg cccacgaaag tacgtttaaa cgtgcaaaat acctgcgcca gaaaacctac 1500 atccaggata tctacatgaa agaagtggat ggcaaactgg ttgaaggttc tccggatgat 1560 tacaccgata tcaaattcag tgtgaaatgc gccggcatga cggataaaat caaaaaagaa 1620 gtgaccttcg aaaacttcaa agttggtttc agccgcaaaa tgaaaccgaa accggtgcag 1680 gttccgggcg gtgtggttct ggtggatgat acgtttacca ttaaatctgg cggtagtgcg 1740 tggagccatc cgcagttcga aaaaggcggt ggctctggtg gcggttctgg cggtagtgcc 1800 tggagccacc cgcagtttga aaaataataa 1830 <210> 6 <211> 608 <212> PRT <213> bacteriophage phi AR29 <400> 6 Met Lys His Met Pro Arg Lys Met Tyr Ser Cys Ala Phe Glu Thr Thr 1 5 10 15 Thr Lys Val Glu Asp Cys Arg Val Trp Ala Tyr Gly Tyr Met Asn Ile 20 25 30 Glu Asp His Ser Glu Tyr Lys Ile Gly Asn Ser Leu Asp Glu Phe Met 35 40 45 Ala Trp Val Leu Lys Val Gln Ala Asp Leu Tyr Phe His Asn Leu Lys 50 55 60 Phe Asp Gly Ala Phe Ile Ile Asn Trp Leu Glu Arg Asn Gly Phe Lys 65 70 75 80 Trp Ser Ala Asp Gly Leu Pro Asn Thr Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Arg 85 90 95 Met Gly Gln Trp Tyr Met Ile Asp Ile Cys Leu Gly Tyr Lys Gly Lys 100 105 110 Arg Lys Ile His Thr Val Ile Tyr Asp Ser Leu Lys Lys Leu Pro Phe 115 120 125 Pro Val Lys Lys Ile Ala Lys Asp Phe Lys Leu Thr Val Leu Lys Gly 130 135 140 Asp Ile Asp Tyr His Lys Glu Arg Pro Val Gly Tyr Lys Ile Thr Pro 145 150 155 160 Glu Glu Tyr Ala Tyr Ile Lys Asn Asp Ile Gln Ile Ile Ala Glu Ala 165 170 175 Leu Leu Ile Gln Phe Lys Gln Gly Leu Asp Arg Met Thr Ala Gly Ser 180 185 190 Asp Ser Leu Lys Gly Phe Lys Asp Ile Ile Thr Thr Lys Lys Phe Lys 195 200 205 Lys Val Phe Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Asp Lys Glu Val Arg Tyr 210 215 220 Ala Tyr Arg Gly Gly Phe Thr Trp Leu Asn Asp Arg Phe Lys Glu Lys 225 230 235 240 Glu Ile Gly Glu Gly Met Val Phe Asp Val Asn Ser Leu Tyr Pro Ala 245 250 255 Gln Met Tyr Ser Arg Leu Leu Pro Tyr Gly Glu Pro Ile Val Phe Glu 260 265 270 Gly Lys Tyr Val Trp Asp Glu Asp Tyr Pro Leu His Ile Gln His Ile 275 280 285 Arg Cys Glu Phe Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Thr Ile Gln Ile 290 295 300 Lys Arg Ser Arg Phe Tyr Lys Gly Asn Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Gly 305 310 315 320 Gly Glu Ile Ala Asp Leu Trp Leu Ser Asn Val Asp Leu Glu Leu Met 325 330 335 Lys Glu His Tyr Asp Leu Tyr Asn Val Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Lys 340 345 350 Phe Lys Ala Thr Thr Gly Leu Phe Lys Asp Phe Ile Asp Lys Trp Thr 355 360 365 Tyr Ile Lys Thr Thr Ser Glu Gly Ala Ile Lys Gln Leu Ala Lys Leu 370 375 380 Met Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Val Thr 385 390 395 400 Gly Lys Val Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe Arg Leu 405 410 415 Gly Glu Glu Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Pro Met Gly Val Phe 420 425 430 Ile Thr Ala Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys 435 440 445 Tyr Asp Arg Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly 450 455 460 Thr Glu Ile Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Lys Lys Leu 465 470 475 480 Gly Tyr Trp Ala His Glu Ser Thr Phe Lys Arg Ala Lys Tyr Leu Arg 485 490 495 Gln Lys Thr Tyr Ile Gln Asp Ile Tyr Met Lys Glu Val Asp Gly Lys 500 505 510 Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Ile Lys Phe Ser Val 515 520 525 Lys Cys Ala Gly Met Thr Asp Lys Ile Lys Lys Glu Val Thr Phe Glu 530 535 540 Asn Phe Lys Val Gly Phe Ser Arg Lys Met Lys Pro Lys Pro Val Gln 545 550 555 560 Val Pro Gly Gly Val Val Leu Val Asp Asp Thr Phe Thr Ile Lys Ser 565 570 575 Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser 580 585 590 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 595 600 605 <210> 7 <211> 1458 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 7 atgatgaacg atggcaaaca gcagagcacc ttcctgtttc atgattatga aaccttcggt 60 acccatccgg ccctggatcg tccggcgcag tttgcggcca ttcgcaccga tagcgaattc 120 aatgtgattg gcgaaccgga agtgttttat tgcaaaccgg ccgatgatta tctgccgcag 180 ccgggtgcgg tgctgattac cggtattacc ccgcaggaag cgcgcgcgaa aggtgaaaac 240 gaagcggcgt ttgccgcgcg cattcatagc ctgtttaccg tgccgaaaac ctgcattctg 300 ggctataaca atgtgcgctt cgatgatgaa gttacccgta atatctttta tcgtaacttt 360 tatgatccgt atgcgtggag ctggcagcat gataacagcc gttgggatct gctggatgtg 420 atgcgcgcgt gctatgcgct gcgcccggaa ggcattaatt ggccggaaaa cgatgatggc 480 ctgccgagct ttcgtctgga acatctgacc aaagccaacg gcattgaaca tagcaatgcc 540 catgatgcga tggccgatgt ttatgcgacc attgcgatgg cgaaactggt taaaacccgt 600 cagccgcgcc tgtttgatta tctgtttacc caccgtaaca aacacaaact gatggcgctg 660 attgatgttc cgcagatgaa accgctggtg catgtgagcg gcatgtttgg cgcctggcgc 720 ggcaacacca gctgggtggc cccgctggcc tggcacccgg aaaatcgtaa cgccgtgatt 780 atggttgatc tggccggtga tattagcccg ctgctggaac tggatagcga taccctgcgt 840 gaacgcctgt ataccgccaa aaccgatctg ggcgataatg ccgccgtgcc ggtgaaactg 900 gttcacatta acaaatgccc ggtgctggcc caggcgaaca ccctgcgccc ggaagatgcg 960 gatcgtctgg gtattaatcg ccagcattgt ctggataatc tgaaaatcct gcgtgaaaac 1020 ccgcaggtgc gtgaaaaagt ggtggcgatc ttcgcggaag cggaaccgtt caccccgagc 1080 gataacgtgg atgcgcagct gtataacggc ttctttagcg atgccgatcg cgcggcgatg 1140 aaaatcgttc tggaaaccga accgcgcaat ctgccggcgc tggatattac ctttgttgat 1200 aaacgtattg aaaaactgct gtttaattat cgtgcgcgca attttccggg taccctggat 1260 tatgccgaac agcagcgttg gctggaacat cgtcgtcagg ttttcacccc ggaatttctg 1320 cagggttatg cggatgaact gcagatgctg gttcagcagt atgccgatga taaagaaaaa 1380 gtggcgctgc tgaaagcgct gtggcagtat gcggaagaaa tcgtttctgg ctctggtcac 1440 catcatcatc accactaa 1458 <210> 8 <211> 485 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 8 Met Met Asn Asp Gly Lys Gln Gln Ser Thr Phe Leu Phe His Asp Tyr 1 5 10 15 Glu Thr Phe Gly Thr His Pro Ala Leu Asp Arg Pro Ala Gln Phe Ala 20 25 30 Ala Ile Arg Thr Asp Ser Glu Phe Asn Val Ile Gly Glu Pro Glu Val 35 40 45 Phe Tyr Cys Lys Pro Ala Asp Asp Tyr Leu Pro Gln Pro Gly Ala Val 50 55 60 Leu Ile Thr Gly 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Leu Arg Glu Arg Leu Tyr Thr Ala Lys Thr 275 280 285 Asp Leu Gly Asp Asn Ala Ala Val Pro Val Lys Leu Val His Ile Asn 290 295 300 Lys Cys Pro Val Leu Ala Gln Ala Asn Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ala 305 310 315 320 Asp Arg Leu Gly Ile Asn Arg Gln His Cys Leu Asp Asn Leu Lys Ile 325 330 335 Leu Arg Glu Asn Pro Gln Val Arg Glu Lys Val Val Ala Ile Phe Ala 340 345 350 Glu Ala Glu Pro Phe Thr Pro Ser Asp Asn Val Asp Ala Gln Leu Tyr 355 360 365 Asn Gly Phe Phe Ser Asp Ala Asp Arg Ala Ala Met Lys Ile Val Leu 370 375 380 Glu Thr Glu Pro Arg Asn Leu Pro Ala Leu Asp Ile Thr Phe Val Asp 385 390 395 400 Lys Arg Ile Glu Lys Leu Leu Phe Asn Tyr Arg Ala Arg Asn Phe Pro 405 410 415 Gly Thr Leu Asp Tyr Ala Glu Gln Gln Arg Trp Leu Glu His Arg Arg 420 425 430 Gln Val Phe Thr Pro Glu Phe Leu Gln Gly Tyr Ala Asp Glu Leu Gln 435 440 445 Met Leu Val Gln Gln Tyr Ala Asp Asp Lys Glu Lys Val Ala Leu Leu 450 455 460 Lys Ala Leu Trp Gln Tyr Ala Glu Glu Ile Val Ser Gly Ser Gly His 465 470 475 480 His His His His His 485 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<220> <223> Sequence used in the examples <400> 24 aacccccaaa aacccccaaa aacccccaaa aacccccaaa aacccccaaa aacccccaaa 60 aacccccaaa aacccccata gagacaagaa taacgaagta 100 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence used in the examples <400> 25 tacttcgtta ttcttgtctc tat 23 <210> 26 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence used in the examples <400> 26 cccccccccc cccccacccc cccccccccc ccccctattc tgtttatgtt tcttgtttgt 60 tagcc 65 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence used in the examples <400> 27 ggctaacaaa caagaaacat aaacagaata g 31 <210> 28 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence used in the examples <400> 28 cccccccccc cccccacccc cccccccccc ccccctattc tgtttatgtt tcttgtttgt 60 tagcc 65 <210> 29 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence used in the examples <220> <221> misc_feature <222> (51)..(54) <223> n = abasic nucleotide <400> 29 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt nnnnggttgt 60 ttctgttggt gctgatattg c 81 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence used in examples <400> 30 gttagaccaa accatgaaac caacata 27 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence used in examples <400> 31 gaccgcctcc aaacaattta gaca 24 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence used in the examples <400> 32 ggcaatctct ttctgattgt ccag 24 <210> 33 <211> 885 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence for one subunit of alpha-HL-Q <400> 33 atggcagatt ctgatattaa tattaaaacc ggtactacag atattggaag caatactaca 60 gtaaaaacag gtgatttagt cacttatgat aaagaaaatg gcatgcacaa aaaagtattt 120 tatagtttta tcgatgataa aaatcacaat aaaaaactgc tagttattag aacaaaaggt 180 accattgctg gtcaatatag agtttatagc gaagaaggtg ctaacaaaag tggtttagcc 240 tggccttcag cctttaaggt acagttgcaa ctacctgata atgaagtagc tcaaatatct 300 gattactatc caagaaattc gattgataca aaagagtata tgagtacttt aacttatgga 360 ttcaacggta atgttactgg tgatgataca ggaaaaattg gcggccttat tggtgcacaa 420 gtttcgattg gtcatacact gaaatatgtt caacctgatt tcaaaacaat tttagagagc 480 ccaactgata aaaaagtagg ctggaaagtg atatttaaca atatggtgaa tcaaaattgg 540 ggaccatacg atcgagattc ttggaacccg gtatatggca atcaactttt catgaaaact 600 agaaatggtt ctatgaaagc agcagataac ttccttgatc ctaacaaagc aagttctcta 660 ttatcttcag ggttttcacc agacttcgct acagttatta ctatggatag aaaagcatcc 720 aaacaacaaa caaatataga tgtaatatac gaacgagttc gtgatgatta ccaattgcat 780 tggacttcaa caaattggaa aggtaccaat actaaagata aatggacaga tcgttcttca 840 gaaagatata aaatcgattg ggaaaaagaa gaaatgacaa attaa 885 <210> 34 <211> 293 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protein sequence for one subunit of alpha-HL-Q <400> 34 Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser 1 5 10 15 Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn 20 25 30 Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His 35 40 45 Asn Lys Lys Leu 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Gly Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser Ile Gly His 130 135 140 Thr Leu Asn Tyr Val Gln Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Ser Pro 145 150 155 160 Thr Asp Lys Lys Val Gly Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn Met Val Asn 165 170 175 Gln Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro Val Tyr Gly 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Met Lys Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala Asp 195 200 205 Asn Phe Leu Asp Pro Asn Lys Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly Phe 210 215 220 Ser Pro Asp Phe Ala Thr Val Ile Thr Met Asp Arg Lys Ala Ser Lys 225 230 235 240 Gln Gln Thr Asn Ile Asp Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg Asp Asp Tyr 245 250 255 Gln Leu His Trp Thr Ser Thr Asn Trp Lys Gly Thr Asn Thr Lys Asp 260 265 270 Lys Trp Thr Asp Arg Ser Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu Lys 275 280 285 Glu Glu Met Thr Asn 290 <210> 39 <211> 518 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence used in the examples <400> 39 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ggttgtttct 60 gttggtgctg atattgcgct ccactaaagg gccgattgac 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Claims (31)

  1. (a) 분석물을 막에 커플링시키며, 여기서 분석물은 막 내에 존재하는 검출기를 통해 막에 커플링되지 않는 것인 단계, 및 (b) 분석물이 막 내에 존재하는 검출기와 상호작용하게 함으로써 분석물의 존재, 부재 또는 특성을 결정하는 단계를 포함하는, 분석물의 존재, 부재 또는 특성을 결정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 막이 친양쪽성 층 또는 고체 상태 층인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 막이 지질 이중층인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 분석물이 0.001 pM 내지 1 nM의 농도로 존재하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 분석물이 100 pM 미만의 농도로 존재하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 분석물이 10 pM 미만의 농도로 존재하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 분석물이 1 pM 미만의 농도로 존재하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 분석물이 0.1 pM 미만의 농도로 존재하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 분석물이 0.01 pM 미만의 농도로 존재하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 분석물을 폴리펩티드 또는 소수성 앵커(anchor)를 통해 막에 커플링시키는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 소수성 앵커가 지질, 지방산, 스테롤, 탄소 나노튜브 또는 아미노산인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 분석물을 링커를 통해 막에 커플링시키는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 분석물을 막에 일시적으로 또는 영구적으로 커플링시키는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 검출기가 전기 수단을 통해 분석물을 검출하는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 검출기가 막횡단 포어(pore)를 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 막횡단 포어가 막횡단 단백질 포어인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 막횡단 단백질 포어가 Msp 또는 α-용혈소 (α-HL)로부터 유래되는 것인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 포어가 분석물 검출을 용이하게 하는 분자 어댑터를 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 검출기가 폴리뉴클레오티드 결합 단백질, 임의로 엑소뉴클레아제 또는 폴리머라제를 포함하는 것인 방법.
  20. 제15항에 있어서,
    (a) 분석물이 검출기와 상호작용하게 하는 단계; 및
    (b) 상호작용 동안 포어를 통과하는 전류를 측정함으로써 분석물의 존재, 부재 또는 특성을 결정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 분석물을 확인하기 위한 방법.
  22. 제1항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 추정하거나 또는 표적 폴리뉴클레오티드를 서열분석하기 위한 방법.
  23. 제22항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드를 소화시켜 단편을 제공하는 것을 포함하고, 이러한 단편이 검출되는 것인 방법.
  24. (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 막에 커플링시키는 단계;
    (b) 표적 폴리뉴클레오티드가 막 내에 존재하는 검출기와 상호작용하게 하고, 이때 검출기가 막횡단 포어 및 엑소뉴클레아제를 포함하여, 엑소뉴클레아제가 표적 폴리뉴클레오티드의 한쪽 단부로부터 개별적인 뉴클레오티드를 소화시키도록 하는 단계;
    (c) 뉴클레오티드가 포어와 상호작용하게 하는 단계;
    (d) 상호작용 동안 포어를 통과하는 전류를 측정함으로써 뉴클레오티드의 신원(identity)을 결정하는 단계; 및
    (e) 표적 폴리뉴클레오티드의 동일한 단부에서 단계 (b) 내지 (d)를 반복함으로써 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드인 분석물을 서열분석하는 방법.
  25. (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 막에 커플링시키는 단계;
    (b) 표적 폴리뉴클레오티드가 막 내에 존재하는 검출기와 상호작용하게 하고, 이때 검출기가 막횡단 포어를 포함하여, 표적 폴리뉴클레오티드가 포어를 통해 이동하도록 하는 단계; 및
    (c) 포어와 관련되어 표적 폴리뉴클레오티드가 이동할 때 포어를 통과하는 전류를 측정함으로써 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드인 분석물을 서열분석하는 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    (a) 표적 폴리뉴클레오티드를 막에 커플링시키는 단계;
    (b) 표적 폴리뉴클레오티드가 막 내에 존재하는 검출기와 상호작용하게 하고, 이때 검출기가 막횡단 포어 및 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 포함하여, 이러한 단백질이 포어를 통한 표적 폴리뉴클레오티드의 이동을 제어하고, 표적 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드가 포어와 상호작용하도록 하는 단계; 및
    (c) 포어와 관련되어 표적 폴리뉴클레오티드가 이동할 때 포어를 통과하는 전류를 측정함으로써 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  27. (a) 막횡단 포어, (b) 폴리뉴클레오티드 결합 단백질 및 (c) 표적 폴리뉴클레오티드를 막에 커플링시키는 수단을 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드인 분석물을 서열분석하기 위한 키트.
  28. 제27항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 엑소뉴클레아제이고, 포어와 표적 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 간의 상호작용을 용이하게 하는 분자 어댑터를 추가로 포함하는 키트.
  29. (a) 막, (b) 막 내의 다수의 막횡단 포어, (c) 다수의 폴리뉴클레오티드 결합 단백질 및 (d) 막에 커플링된 다수의 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드인 분석물을 서열분석하기 위한 기구.
  30. 제29항에 있어서,
    막 및 다수의 포어를 지지할 수 있으며 포어를 사용하여 폴리뉴클레오티드 서열분석을 수행하도록 작동가능할 수 있는 센서 장치; 및
    서열분석을 수행하기 위한 물질을 보유하기 위한 하나 이상의 저장소
    를 포함하는 기구.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서,
    막 및 다수의 포어를 지지할 수 있으며 포어를 사용하여 폴리뉴클레오티드 서열분석을 수행하도록 작동가능할 수 있는 센서 장치;
    서열분석을 수행하기 위한 물질을 보유하기 위한 하나 이상의 저장소;
    하나 이상의 저장소로부터 센서 장치로 물질을 제어가능하게 공급하도록 구성된 유체공학 시스템; 및
    각각의 샘플을 수용하기 위한 하나 이상의 용기
    를 포함하며, 유체공학 시스템은 하나 이상의 용기로부터 센서 장치로 샘플을 선택적으로 공급하도록 구성되어 있는 것인 기구.
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