BR112013030529A2 - método para determinar a presença, ausência ou características de um analito, método e aparelho para sequenciamento de um analito que é um polinucleotídeo alvo, e, kit. - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA DETERMINAR A PRESENÇA, AUSÊNCIA OU CARACTERÍSTICAS DE UM ANALITO, MÉTODO E APARELHO PARA SEQUENCIAMENTO DE UM ANALITO QUE É UM POLINUCLEOTÍDEO ALVO, E, KIT A invenção refere-se a um novo método de determinar a presença, ausência ou características de um analito. O analito é ligado a uma membrana. A invenção também refere-se ao sequenciamento de ácido nucleico.

Description

1 / 106 “MÉTODO PARA DETERMINAR A PRESENÇA, AUSÊNCIA OU CARACTERÍSTICAS DE UM ANALITO, MÉTODO E APARELHO

PARA SEQUENCIAMENTO DE UM ANALITO QUE É UM POLINUCLEOTÍDEO ALVO, E, KIT” Campo da invenção A invenção refere-se a um novo método de determinar a presença, ausência ou características de um analito. O analito é ligado a uma membrana. A invenção também refere-se ao sequenciamento de ácido nucleico. Fundamentos da invenção Existe correntemente uma necessidade quanto a tecnologias de sequenciamento de ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA) rápidas e baratas através de uma ampla faixa de aplicações. As tecnologias existentes são lentas e caras principalmente porque contam com técnicas de amplificação para produzir volumes grandes de ácido nucleico e requerem uma alta quantidade de produtos químicos fluorescentes especiais para a detecção de sinal. Os nanoporos têm enorme potencial como biossensores diretos, elétricos para os polímeros e uma variedade de moléculas pequenas. Em particular, foco recente foi dado aos nanoporos como uma tecnologia de sequenciamento de DNA potencial. Dois métodos para o sequenciamento DNA foram propostos; ‘Sequenciamento de Exonuclease’, onde as bases são processivamente clivadas do polinucleotídeo por uma exonuclease e são depois individualmente identificados pelo nanoporo e também ‘Sequenciamento de Filamento’, onde um único filamento de DNA é passado através do poro e os nucleotídeos são diretamente identificados. O Sequenciamento de Filamento pode envolver o uso de uma enzima de tratamento de DNA para controlar o movimento do polinucleotídeo através do nanoporo.

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Quando um potencial é aplicado através de um nanoporo, existe uma queda no fluxo de corrente quando um analito, tal como um nucleotídeo, reside transitoriamente no tubo por um certo período de tempo.

A detecção de nanoporo do analito dá um bloqueio de corrente de assinatura e duração conhecidos. a concentração de um analito pode ser depois determinada pelo número de eventos de bloqueio por tempo unitário para um único poro.

Para aplicações de nanoporo, tal como Sequenciamento de DNA, a captura eficiente de analito da solução é requerida.

Por exemplo, de modo a dar a enzima de tratamento de DNA usada no Sequenciamento de DNA um ciclo de trabalho suficientemente alto para se obter sequenciamento eficiente, o número de interações entre enzima e polinucleotídeo precisa ser máximo, de modo que um novo polinucleotídeo seja ligado tão logo o atual esteja acabado.

Portanto, no Sequenciamento de DNA, é preferido ter o polinucleotídeo em concentração tão alta quanto possível de modo que, tão logo uma enzima termine o seu processamento, a seguinte esteja prontamente disponível para ser ligada.

Isto se torna um problema particular visto que a concentração de polinucleotídeo, tal como DNA, torna-se limitante, por exemplo, o DNA de amostras de célula cancerosa para epigenética.

Quanto mais diluída a amostra mais tempo entre as rodadas de sequenciamento, até o ponto onde a ligação do primeiro polinucleotídeo é tão limitante que é impraticável.

Os limites da detecção de nanoporo foram estimados para vários analitos.

A captura de um pedaço sintético de 92 nucleotídeos de DNA de filamento único (ssDNA) por um nanoporo de proteína (hemolisina) foi determinada estar em uma frequência de 3,0 ± 0,2 s-1 μM-1 (Maglia, Restrepo et al. 2008, Proc Natl Acad Sci U S A 105(50): 19720-5). A captura pode ser aumentada ~10 vezes pela adição de um anel de cargas positivas na entrada para o tubo de hemolisina (23,0 ± 2 s-1 μM-1). Para colocar isto no contexto, 1

3 / 106 μM de ssDNA de 92 nucleotídeo é equivalente a 31 μg de DNA requeridos por registro de canal único, assumindo um volume de câmara cis de 1 ml.

O kit de purificação de DNA genômico que domina o mercado a partir de sangue humano (Kit PAXgene Blood DNA da Qiagen) correntemente dá rendimentos esperados entre 150 e 500 μg de genômico a partir de 8,5 ml de sangue integral humano.

Portanto, este aumento divulgado na detecção de analito está ainda bem fora da mudança de etapa requerida para a detecção e liberação ultrassensíveis.

Sumário da invenção Surpreendentemente foi demonstrada liberação de analito de concentração ultra baixa pela ligação do analito a uma membrana na qual o detector relevante está presente.

Isto diminui em várias ordens de magnitude a quantidade de analito requerido de modo a ser detectado.

O grau ao qual a quantidade de analito necessário é reduzida pode não ter sido prognosticada.

Em particular, surpreendentemente foi relatado um aumento na captura de DNA de filamento único em ~4 ordens de magnitude em relação à anteriormente relatada.

Visto que tanto o detector quanto o analito estão agora no mesmo plano, então ~103 M s-1 mais interações ocorrem por segundo, visto que a difusão de ambas as moléculas está em duas dimensões ao invés de três dimensões.

Isto tem implicações dramáticas sobre as exigências de preparação de amostra que são de interesse chave para dispositivos de diagnóstico tais como sistemas de sequenciamento da próxima geração.

Além disso, ligar o analito a uma membrana tem vantagens adicionais para várias aplicações de sequenciamento de nanoporo-enzima.

No Sequenciamento de Exonuclease, quando o analito de DNA é introduzido o poro pode tornar-se bloqueado permanente ou temporariamente, impedindo a detecção de nucleotídeos individuais.

Quando uma extremidade do analito de DNA está localizada fora do poro, por exemplo pela ligação ou amarrado à membrana, surpreendentemente foi descoberto que este bloqueio temporário

4 / 106 ou permanente não é mais observado.

Pela ocupação de uma extremidade do DNA pela ligação do mesmo à membrana também atua para aumentar eficazmente a concentração de analito no detector e assim aumentando o ciclo de trabalho dos sistemas de sequenciamento.

Isto é debatido em mais detalhes abaixo.

Consequentemente, a invenção fornece um método para determinar a presença, ausência ou características de um analito, que compreende (a) ligar o analito a uma membrana e (b) deixar o analito interagir com um detector presente na membrana e determinar deste modo a presença, ausência ou características do analito.

A invenção também fornece: - um método de sequenciamento de um analito que é um polinucleotídeo alvo, que compreende: (a) ligar o polinucleotídeo alvo a uma membrana; (b) deixar o polinucleotídeo alvo interagir com um detector presente na membrana, em que o detector compreende um poro de transmembrana e uma exonuclease, de modo que a exonuclease digira um nucleotídeo individual de uma extremidade do polinucleotídeo alvo; (c) deixar o nucleotídeo interagir com o poro; (d) medir a corrente que passa através do poro durante a interação e determinar deste modo a identidade do nucleotídeo; e (e) repetir as etapas (b) a (d) na mesma extremidade do polinucleotídeo alvo e determinar deste modo a sequência do polinucleotídeo alvo; - um método de sequenciamento de um analito que é um polinucleotídeo alvo, que compreende: (a) ligar o polinucleotídeo alvo a uma membrana; (b) deixar o polinucleotídeo alvo interagir com um detector presente

5 / 106 na membrana, em que o detector compreende um poro de transmembrana, de modo que o polinucleotídeo alvo mova-se através do poro; e (c) medir a corrente que passa através do poro conforme o polinucleotídeo alvo se move com relação ao poro e determinar deste modo a sequência do polinucleotídeo alvo; - um kit para o sequenciamento de um analito que é um polinucleotídeo alvo que compreende (a) um poro de transmembrana, (b) uma proteína que liga polinucleotídeo e (c) meios para ligar o polinucleotídeo alvo a uma membrana; e - um aparelho para o sequenciamento de um analito que é um polinucleotídeo alvo, que compreende (a) uma membrana, (b) uma pluralidade de poros de transmembrana na membrana, (c) uma pluralidade de proteínas que ligam polinucleotídeo e (d) uma pluralidade de polinucleotídeos alvo ligados à membrana.

Descrição das Figuras A Fig. 1 mostra a absorção pelo nanoporo de um analito.

A) Mostra um nanoporo com a direção do fluxo de corrente indicada pelas setas cinzas.

Um traço de corrente prognosticado é mostrado abaixo.

B) Mostra um nanoporo com um analito que se transloca através do poro.

A direção do movimento do analito é indicada pela seta 1 e a direção do fluxo de corrente pelas setas cinza.

Um traço de corrente prognosticado é mostrado abaixo que mostra como a corrente muda conforme o analito se desloca através do poro.

A Fig. 2 mostra um método para amarrar interações de DNA nanoporo.

As seções A e B mostram ssDNA amarrado transitoriamente e como o traço de corrente muda conforme o ssDNA se desloca através do poro.

As seções C e D mostram ssDNA estavelmente amarrado e como o traço de corrente muda conforme o ssDNA é capturado pelo poro.

A Fig. 3 mostra a captura de um complexo de enzima DNA,

6 / 106 seguido pela dissociação do DNA e da enzima, e a desibridização do DNA subsequente. A Fig. 4 mostra a configuração experimental para o Exemplo

2. A comparação entre (1) um analito iniciador/padrão de DNA em solução (A - topo) onde as concentrações de material estão na faixa nanomolar alta (400 nM de DNA usados e 800 nN de enzima usados) e (2) um sistema amarrado (B - fundo) onde a quantidade de material é subnanomolar (1 nM de DNA usado e 5 nN de enzima usados). A Fig. 5 mostra os tempos de ligação de KF no topo do nanoporo para o analito (DNA) não amarrado na ausência de KF (concentração de DNA = 400 nM). A Fig. 6 mostra os tempos de ligação de KF no topo do nanoporo para o analito (DNA) não amarrado na presença de KF (concentração de DNA = 400 nM, concentração de KF = 800 nM). A ligação de KF foi de 1 a 100 ms. A Fig. 7 mostra os tempos de ligação de KF no topo do nanoporo para o analito (DNA) amarrado na ausência de KF (concentração de DNA = 1 nM). A Fig. 8 mostra os tempos de ligação de KF no topo do nanoporo para o analito (DNA) amarrado na presença de KF (concentração de DNA = 1 nM, concentração de KF = 5 nM). A ligação de KF foi de 0,1 a 10 s. A Fig. 9 mostra um exemplo de um evento de descompactação mediada pela Phi29 DNA polimerase de dsDNA transitoriamente amarrado. A queda na corrente do nível de poro aberto é considerado ser um bloqueio causado pela captura de um complexo de DNA:proteína. Este complexo capturado reside no nanoporo por ~5 segundos dando um nível de corrente constante antes de mudar rapidamente entre os níveis e depois finalmente retornando para o nível de poro aberto. Isto é considerado ser uma pausa antes que a descompactação seja iniciada e um único A se mova através da ponta

7 / 106 leitora dando assim a oscilação na corrente.

Quando o duplex foi totalmente descompactado o filamento alvo se desloca, o iniciador e a polimerase se dissociam e assim a corrente retorna para o nível de poro aberto.

A Fig. 10 mostra um exemplo de um evento de descompactação mediado pela Phi29 DNA polimerase de dsDNA em solução.

A queda na corrente do nível de poro aberto é considerada ser um bloqueio causado pela captura de um complexo de DNA:proteína.

Este complexo capturado reside no nanoporo por ~12 segundos dando um nível de corrente constante antes de mudar rapidamente entre os níveis e depois finalmente retornando ao nível de poro aberto.

Isto é considerado ser uma pausa antes que a descompactação seja iniciada e conforme o único A se move através da ponta leitora dando assim a oscilação na corrente.

Quando o duplex foi totalmente descompactado o filamento alvo se desloca, o iniciador e a polimerase se dissociam e assim a corrente retorna para o nível de poro aberto.

A Fig. 11 mostra um exemplo de sequências de evento de uma rodada descompactada para analito de dsDNA não amarrado.

O número de níveis observado assim como o nível e duração para estes são amplamente compatíveis com os experimentos amarrados.

A Fig. 12 mostra um exemplo de sequências de evento de uma rodada descompactada para analito de dsDNA amarrado.

O número de níveis observado assim como o nível e duração para estes são amplamente compatíveis com os experimentos com DNA em solução (não amarrado). A Fig. 13 mostra um mapa de plasmídeo de analitos amarrados do Sequenciamento de Filamento do DNA genômico.

Os iniciadores foram designados complementares ao DNA genômico PhiX 174. O mesmo iniciador de sentido foi usado para todos e conteve uma região 5’-50poliT seguida por 4 sítios abásicos antes da região complementar.

Os sítios de hibridização para os iniciadores de antissentido foram variados de acordo com o tamanho de

8 / 106 fragmento desejado.

Cada iniciador de antissentido conteve um grupo 5’- colesterol.

A Fig. 14 mostra a geração de PCR de analitos amarrados do Sequenciamento de Filamento do DNA genômico.

Os iniciadores foram planejados complementar ao DNA genômico PhiX 174. O mesmo iniciador de sentido foi usado para todos e contiveram uma região 5’-50poliT seguido pelos 4 sítios abásicos antes da região complementar.

Os sítios de hibridização para os iniciadores de anti-sentido foram variados de acordo com o tamanho de fragmento desejado.

Cada iniciador de anti-sentido contiveram um grupo 5’-colesterol.

Para confirmar a presença da região 50poliT em 5’ do filamento de sentido, fragmentos foram digeridos com a RecJ exonuclease 5’- 3’ específica de filamento único (NEB) e isto foi analisado em um gel.

A linha 1 contém ssDNA de 50 nt, dsDNA de 235 pares de base apenas.

A linha 2 contém ssDNA de 50 nt, dsDNA de 235 pares de base que foi digerido com a RecJ exonuclease 5’-3’ específica de filamento único (NEB). A linha 3 contém ssDNA de 50nt, dsDNA de 400 pares de base apenas.

A linha 4 contém ssDNA de 50 nt, dsDNA de 400 pares de base que foi digerido com a RecJ exonuclease 5’-3’ específica de filamento único (NEB). A linha 5 contém ssDNA de 50 nt, dsDNA de 835 pares de base apenas.

A linha 6 contém ssDNA de 50 nt, dsDNA de 835 pares de base que foi digerido com a RecJ exonuclease 5’-3’ específica de filamento único (NEB). A Fig. 15 mostra eventos de descompactação do fragmento PhiX 174 amplificado de 800 pares de base.

Esta sequência de 800 pares de base corresponde à sequência entre os pontos 1 e 3 no mapa de plasmídeo mostrado.

A Fig. 16 mostra eventos de descompactação do fragmento PhiX 174 amplificado de 200 pares de base.

Esta sequência de 200 pares de base corresponde à sequência entre os pontos 1 e 2 no mapa de plasmídeo mostrado.

A sequência de 200mer é alinhada contra a sequência de 800mer

9 / 106 mostrada na Fig. 15 com penalidades de intervalo condutora e rasto zero (isto é, é livre para iniciar em qualquer lugar, mas intervalos “internos” são penalizados). Como esperado, as seções de 200mer alinham-se com a parte frontal dos 800mer.

A Fig. 17 mostra esquemas que amarram analito para nanoporos no estado sólido.

A) Mostra amarração em uma superfície modificada (amarração em uma camada). B) Mostra amarração a uma superfície modificada (interação com a superfície). C) Mostra amarração a uma monocamada de lipídeo em uma superfície modificada.

D) Mostra amarração a uma bicamada de lipídeo em uma superfície modificada.

A Fig. 18 mostra métodos para ligar polinucleotídeos de filamento duplo a uma membrana de lipídeo.

A) Mostra uma única proteína de ligação de dsDNA amarrada que interage com analito de dsDNA.

B) Mostra proteínas de ligação de dsDNA múltiplas amarradas que interagem com um único analito de dsDNA.

C) Mostra um único grupo químico amarrado que interage com analito de dsDNA.

A Fig. 19 mostra métodos para ligar analitos de polinucleotídeo de filamento único às membranas de lipídeo.

A) Mostra uma única proteína de ligação de ssDNA amarrada que interage com ssDNA.

B) Mostra proteínas de ligação de ssDNA múltiplas amarradas que interagem com um único ssDNA.

C) Mostra um único grupo químico amarrado que interage com ssDNA.

A Fig. 20 mostra um esquemático de uma via de usar uma proteína que liga polinucleotídeo para controlar o movimento do DNA através de um nanoporo que utiliza uma proteína de ligação de dsDNA para ligar o DNA à membrana.

A) Um analito de DNA (que consiste de um líder de ssDNA (região cinza) ligado a uma região de dsDNA) é ligado à membrana usando uma proteína de ligação de dsDNA amarrada, que resulta em um realce da concentração na superfície da membrana.

Uma proteína que liga

10 / 106 polinucleotídeo capaz de controlar o movimento de polinucleotídeo é adicionada ao compartimento cis onde a mesma se liga à projeção de 4 pares de base.

B) Sob uma voltagem aplicada, o analito de DNA é capturado pelo nanoporo via a seção 5’ líder (região cinza) no DNA.

C) Sob a força do campo aplicado o DNA é puxado para dentro do poro até que a proteína de ligação de polinucleotídeo ligada contacte o topo do poro e impeça outro deslocamento descontrolado.

Neste processo o filamento de anti-sentido é removido do filamento de DNA, portanto, resultando no descolamento da proteína de ligação de dsDNA do filamento.

D) Na presença de cofatores apropriados, a proteína de ligação de polinucleotídeo no topo do poro se move ao longo do DNA e controla o deslocamento do DNA através do poro.

O movimento da proteína de ligação de polinucleotídeo, ao longo do DNA em uma direção de 3’ para 5’, puxa o DNA amarrado para fora do poro contra o campo aplicado de volta para o compartimento cis.

A última seção de DNA a passar através do nanoporo é a 5’-líder.

A seta indica a direção do movimento do DNA.

A Fig. 21 mostra um esquemático de um modo de usar uma proteína que liga polinucleotídeo para controlar o movimento DNA através de um nanoporo que utiliza uma amarra hibridizada.

A) Um analito de DNA (que consiste de um líder de ssDNA (região cinza) ligado a uma região de dsDNA) é ligado à membrana usando uma amarra hibridizada, resultando em um realce da concentração na superfície da membrana.

Uma proteína que liga polinucleotídeo capaz de controlar o movimento do DNA é adicionado ao compartimento cis onde o mesmo se liga à projeção de 4 pares de base.

B) Sob uma voltagem aplicada, o analito de DNA é capturado pelo nanoporo por intermédio da seção 5’ líder (região cinza) no DNA.

C) Sob a força do campo aplicado o DNA é puxado para dentro do poro até que a proteína de ligação de polinucleotídeo ligada contacte o topo do poro e impeça outro deslocamento descontrolado.

Neste processo o polinucleotídeo que é

11 / 106 amarrado à membrana (linha pontilhada) é removido para ser sequenciado (filamento preto com região líder cinza). D) Na presença de cofatores apropriados, a proteína de ligação de polinucleotídeo no topo do poro se move ao longo do DNA e controla o deslocamento do DNA através do poro.

O movimento da proteína de ligação de polinucleotídeo, ao longo do DNA em uma direção de 3’ para 5’, puxa o DNA amarrado para fora do poro contra o campo aplicado de volta para o compartimento cis.

A última seção de DNA a passar através do nanoporo é a 5’-líder.

A seta indica a direção do movimento de DNA.

A Fig. 22 mostra um esquemático de uma via de usar uma proteína que liga polinucleotídeo para controlar o movimento do DNA através de um nanoporo que utiliza uma amarração hibridizada.

A) Um analito de DNA (que consiste de ssDNA (linha preta com a sequência líder mostrada em cinza) hibridizada a uma amarração de ssDNA (linha tracejada)) é ligada à membrana usando uma amarração hibridizada, que resulta em um realce da concentração na superfície da membrana.

Uma proteína que liga polinucleotídeo capaz de controlar o movimento do DNA é adicionada ao compartimento cis onde a mesma se liga à projeção de 4 pares de base.

B) Sob uma voltagem aplicada, o analito de DNA é capturado pelo nanoporo por intermédio da seção 5’ líder (região cinza) no DNA.

C) Sob a força do campo aplicado o DNA é puxado para dentro do poro até que a proteína de ligação de polinucleotídeo ligada contacte o topo do poro e impeça outro deslocamento descontrolado.

Neste processo o filamento que é amarrado à membrana (linha tracejada) é removido do filamento de ssDNA a ser sequenciado (filamento preto com região líder cinza). D) Na presença de cofatores apropriados, a proteína de ligação de polinucleotídeo no topo do poro se move ao longo do DNA e controla o deslocamento do DNA através do poro.

O movimento da proteína de ligação de polinucleotídeo, ao longo do DNA em uma direção de 3’ a 5’, puxa o DNA amarrado para fora do poro

12 / 106 contra o campo aplicado de volta para o compartimento cis.

A última seção de DNA a passar através do nanoporo é a 5’-líder.

A seta indica a direção do movimento do DNA.

A Fig. 23 mostra vários métodos de amarração de uma sonda, que pode ser utilizada para a detecção de microRNA, em uma membrana.

A) A sonda pode ser permanentemente amarrada à membrana.

Neste caso a região da sonda que hibridiza ao microRNA está no centro da sonda.

A região com código de barras (região pontilhada) da sonda, que é usada para identificar a sonda, está localizada na extremidade oposta do filamento em relação à amarração.

Bi e ii) A sonda pode ser transitoriamente amarrada à membrana pela hibridização interna.

Neste exemplo a região da sonda que hibridiza com o microRNA está ligada a uma extremidade do filamento.

A região com o código de barras (região pontilhada), que é usada para identificar a sonda, está localizada diretamente acima da amarração e abaixo da região de hibridização de microRNA.

Em Bii) a região de hibridização da amarração à sonda é invertida na sua direção de ligação em comparação com Bi). Ci e ii) A sonda pode ser transitoriamente amarrada à membrana pela hibridização a uma extremidade da sonda.

Neste exemplo a região da sonda que hibridiza ao microRNA está localizada no centro do filamento.

A região com o código de barras (região pontilhada), que é usada para detectar a presença ou ausência do microRNA, está localizada abaixo da região de hibridização de microRNA no lado oposto da sonda em relação à amarração.

Em Cii) a região de hibridização da amarração à sonda é invertida na sua direção de ligação em comparação com Ci). Descrição da Listagem de Sequência A SEQ ID NO: 1 mostra a sequência de polinucleotídeo otimizada no códon que codifica o monômero MspA do mutante NNN-RRK.

A SEQ ID NO: 2 (também aludida como “B1”) mostra a sequência de aminoácido da forma madura do mutante NNN-RRK do

13 / 106 monômero MspA.

O mutante carece da sequência de sinal e inclui as mutações que seguem: D90N, D91N, D93N, D118R, D134R e E139K.

Estas mutações permitem a transição do DNA através do poro de MspA.

A SEQ ID NO: 3 mostra a sequência de polinucleotídeo que codifica uma subunidade de α-hemolisina-M111R (α-HL-R). A SEQ ID NO: 4 mostra a sequência de aminoácido de uma subunidade de α-HL-R.

A SEQ ID NO: 5 mostra a sequência de polinucleotídeo otimizada no códon que codifica a Phi29 DNA polimerase.

A SEQ ID NO: 6 mostra a sequência de aminoácido da Phi29 DNA polimerase.

A SEQ ID NO: 7 mostra a sequência de polinucleotídeo otimizada no códon derivada do gene sbcB da E. coli.

A mesma codifica a enzima da exonuclease I (EcoExo I) da E. coli.

A SEQ ID NO: 8 mostra a sequência de aminoácido da enzima da exonuclease I (EcoExo I) da E. coli.

A SEQ ID NO: 9 mostra a sequência de polinucleotídeo otimizada no códon derivada do gene xthA da E. coli.

A mesma codifica a enzima da exonuclease III da E. coli.

A SEQ ID NO: 10 mostra a sequência de aminoácido da enzima da exonuclease III da E. coli.

Esta enzima realiza a digestão distributiva da 5’ monofosfato nucleosídeos de um filamento de DNA de filamento duplo (dsDNA) em uma direção de 3’ para 5’. O início da enzima em um filamento requer uma projeção 5’ de aproximadamente 4 nucleotídeos.

A SEQ ID NO: 11 mostra a sequência de polinucleotídeo otimizada no códon derivada do gene recJ de T. thermophilus.

A mesma codifica a enzima RecJ de T. thermophilus (TthRecJ-cd). A SEQ ID NO: 12 mostra a sequência de aminoácido da enzima RecJ de T. thermophilus (TthRecJ-cd). Esta enzima realiza a digestão

14 / 106 processiva de 5’ monofosfato nucleosídeos de ssDNA em uma direção de 5’ para 3’. O início da enzima em um filamento requer pelo menos 4 nucleotídeos.

A SEQ ID NO: 13 mostra a sequência de polinucleotídeo otimizada no códon derivada do gene exo do bacteriófago lambda (rede). A mesma codifica a exonuclease do bacteriófago lambda.

A SEQ ID NO: 14 mostra a sequência de aminoácido da exonuclease do bacteriófago lambda.

A sequência é uma das três subunidades idênticas que se montam em um trímero.

A enzima realiza a digestão altamente processiva de nucleotídeos de um filamento de dsDNA, em uma direção de 5’ a 3’ (http://www.neb.com/nebecomm/ products/productM0262.asp). O início da enzima em um filamento preferencialmente requer uma projeção 5’ de aproximadamente 4 nucleotídeos com um 5’ fosfato.

As SEQ ID NOs: 15 a 17 mostram a sequência de aminoácidos das formas maduras dos mutantes MspB, C e D respectivamente.

As formas maduras carecem da sequência de sinal.

As SEQ ID NOs: 18 a 32 mostram as sequências usadas nos Exemplos.

A SEQ ID NO: 33 mostra a sequência de polinucleotídeo que codifica uma subunidade de α-HL-Q.

A SEQ ID NO: 34 mostra a sequência de aminoácido de uma subunidade de α-HL-Q.

A SEQ ID NO: 35 mostra a sequência de polinucleotídeo que codifica uma subunidade de α-HL-E287C-QC-D5FLAGH6. A SEQ ID NO: 36 mostra a sequência de aminoácido de uma subunidade de α-HL-E287C-QC-D5FLAGH6. A SEQ ID NO: 37 mostra a sequência de polinucleotídeo que codifica uma subunidade de α-hemolisina-E111N/K147N (α-HL-NN;

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Stoddart et al., PNAS, 2009; 106(19): 7702-7707). A SEQ ID NO: 38 mostra a sequência de aminoácido de uma subunidade de α-HL-NN.

A SEQ ID NO: 39 mostra a sequência usada no Exemplo 5. As SEQ ID NOs: 40 e 41 mostram as sequências usadas no Exemplo 6. Descrição detalhada da invenção Deve ser entendido que aplicações diferentes dos produtos e métodos divulgados podem ser adaptadas para as necessidades específicas na técnica.

Também deve ser entendido que a terminologia aqui usada é apenas para o propósito de descrever as formas de realização particulares da invenção, não deve ser pretendida como limitação.

Além disso, como usadas neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, e “o”, “a” incluem referendos plurais a menos que o conteúdo claramente dite de outro modo.

Assim, por exemplo, referência a “um analito” inclui dois ou mais analitos, referência a “um detector” inclui dois ou mais de tais detectores, referência a “um poro” inclui dois ou mais de tais poros, referência a “uma sequência de ácido nucleico” inclui duas ou mais de tais sequências, e seus semelhantes.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados, seja acima ou abaixo, são por meio deste incorporados por referência em sua totalidade.

Métodos da invenção A invenção fornece um método para determinar a presença, ausência ou características de um analito.

O método compreende ligar o analito a uma membrana e deixar o analito interagir com um detector presente na membrana.

A presença, ausência ou características do analito é deste modo determinada.

Em uma forma de realização, a invenção fornece um método para determinar a presença ou ausência de um analito, que compreende (a)

16 / 106 ligar o analito a uma membrana e (b) deixar o analito interagir com um detector presente na membrana e determinar deste modo a presença ou ausência do analito.

Como debatido acima, ligar o analito a uma membrana que contenha o detector diminui em várias ordens de magnitude a quantidade de analito requerido.

O método é naturalmente vantajoso para detectar analitos que estão presentes em concentrações baixas.

O método preferivelmente permite que a presença ou características do analito sejam determinadas quando o analito está presente em uma concentração de cerca de 0,001 pM a cerca de 1 nM, tal como menos do que 0,01 pM, menos do que 0,1 pM, menos do que 1 pM, menos do que 10 pM ou menos do que 100 pM.

O método da invenção é particularmente vantajoso para o sequenciamento de ácido nucleico porque, como debatido acima, apenas pequenas quantidades de ácido nucleico purificado podem ser obtidas a partir do sangue humano.

O método preferivelmente permite estimar a sequência de, ou permite o sequenciamento de, um polinucleotídeo alvo que esteja presente em uma concentração de cerca de 0,001 pM a cerca de 1 nM, tal como menos do que 0,01 pM, menos do que 0,1 pM, menos do que 1 pM, menos do que 10 pM ou menos do que 100 pM.

Ligar uma extremidade de um polinucleotídeo à membrana (mesmo que temporariamente) também significa que a extremidade será impedida de interferir com o processo de sequenciamento com base em nanoporo.

Isto é debatido em mais detalhes abaixo com referência ao método de Sequenciamento de exonuclease da invenção.

O método da invenção pode compreender determinar ou medir uma ou mais características de um analito, tal como um polinucleotídeo.

O método pode envolver determinar ou medir duas, três, quatro ou cinco ou mais características do analito, tais como um polinucleotídeo.

Para os polinucleotídeos, a uma ou mais características são preferivelmente

17 / 106 selecionadas de (i) o comprimento do polinucleotídeo alvo, (ii) a identidade do polinucleotídeo alvo, (iii) a sequência do polinucleotídeo alvo, (iv) a estrutura secundária do polinucleotídeo alvo e (v) se o polinucleotídeo alvo é modificado ou não.

Qualquer combinação de (i) a (v) pode ser determinada ou medida de acordo com a invenção.

O método preferivelmente compreende estimar a sequência ou sequenciamento de um polinucleotídeo.

Analito O analito pode ser qualquer substância.

Os analitos adequados incluem, mas não são limitados a, íons metálicos, sais inorgânicos, polímeros, tais como um ácido ou base poliméricos, corantes, branqueadores, produtos farmacêuticos, agentes de diagnóstico, drogas recreativas, explosivos e poluente ambientais.

O analito pode ser um analito que é secretado das células.

Alternativamente, o analito pode ser um analito que está presente dentro das células de modo que o analito deva ser extraído das células antes que a invenção possa ser realizada.

O analito é preferivelmente um aminoácido, peptídeo, polipeptídeo, uma proteína ou um polinucleotídeo.

O aminoácido, peptídeo, polipeptídeo ou proteína podem ser de ocorrência natural ou de ocorrência não natural.

O polipeptídeo ou proteína podem incluir dentro deles aminoácidos sintéticos ou modificados.

Vários tipos diferentes de modificação para os aminoácidos são conhecidos na técnica.

Para os propósitos da invenção, deve ser entendido que o analito pode ser modificado por qualquer método disponível na técnica.

A proteína pode ser uma enzima, anticorpo, hormônio, fator de crescimento ou proteína reguladora do crescimento, tal como uma citocina.

A citocina pode ser selecionada de uma interleucina, preferivelmente IFN-1, IL- 2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 ou IL-13, um interferon, preferivelmente IL- γ ou outras citocinas tais como TNF-α.

A proteína pode ser uma proteína

18 / 106 bacteriana, proteína fúngica, proteína viral ou proteína derivada de parasita.

Antes que seja contactada com o poro ou canal, a proteína pode ser desdobrada para formar uma cadeia de polipeptídeo.

O analito é mais preferivelmente um polinucleotídeo, tal como um ácido nucleico.

Os polinucleotídeos são debatidos em mais detalhes abaixo.

Um polinucleotídeo pode ser ligado à membrana na sua extremidade 5’ ou extremidade 3’ ou em um ou mais pontos intermediários ao longo do filamento.

O polinucleotídeo pode ser de filamento único ou de filamento duplo como debatido abaixo.

O polinucleotídeo pode ser circular.

O polinucleotídeo pode ser um aptâmero, um sonda que hibridiza ao microRNA ou o próprio microRNA (Wang, Y. et al, Nature Nanotechnology, 2011, 6, 668-674). Quando o analito é uma sonda que hibridiza ao microRNA, a sonda pode ser ligada permanente (Fig. 23A) ou transitoriamente (Fig. 23 B e C) à membrana.

A própria sonda pode ser adaptada para ligar-se diretamente à membrana ou pode hibridizar a um polinucleotídeo complementar que tenha sido adaptado para ligar-se à membrana.

O analito pode ser um complexo de microRNA hibridizado a uma sonda onde a sonda tem sequências ou códigos de barras distintivos que possibilitem que a mesma seja identificada de modo inequívoco.

Quando o analito é um aptâmero, o aptâmero pode ser ligado permanente ou transitoriamente à membrana.

O próprio aptâmero pode ser adaptado para ligar-se diretamente à membrana ou pode hibridizar a um polinucleotídeo complementar que tenha sido adaptado para ligar-se à membrana.

O aptâmero pode ser ligado ou não ligado a um analito de proteína e o propósito final de detectar o aptâmero pode ser detectar a presença, ausência ou características de um analito de proteína à qual o mesmo se liga.

O analito está presente em qualquer amostra adequada.

A invenção é tipicamente realizada em uma amostra que é conhecida conter ou

19 / 106 suspeita de conter o analito.

A invenção pode ser realizada em uma amostra que contenha um ou mais analitos cuja identidade seja desconhecida.

Alternativamente, a invenção pode ser realizada em uma amostra para confirmar a identidade de um ou mais analitos cuja presença na amostra seja conhecida ou esperada.

A amostra pode ser uma amostra biológica.

A invenção pode ser realizada in vitro em uma amostra obtida de ou extraída de qualquer organismo ou micro-organismo.

O organismo ou micro-organismo é tipicamente arqueano, procariótico ou eucariótico e tipicamente pertence a um dos cinco reinos: vegetal, animal, fúngico, monera e protista.

A invenção pode ser realizada in vitro em uma amostra obtida de ou extraída de qualquer vírus.

A amostra é preferivelmente uma amostra fluida.

A amostra tipicamente compreende um fluido corporal do paciente.

A amostra pode ser urina, linfa, saliva, muco ou fluido amniótico mas é preferivelmente sangue, plasma ou soro.

Tipicamente, a amostra é humana em origem, mas alternativamente pode ser de um outro animal mamífero tal como de animais de fazenda comerciais tais como cavalos, gado, ovelha ou porcos ou alternativamente podem ser animais de estimação tais como gatos ou cães.

Alternativamente uma amostra de origem vegetal é tipicamente obtida de uma safra comercial, tal como um cereal, legume, fruta ou vegetal, por exemplo trigo, cevada, aveias, canola, milho, soja, arroz, bananas, maçãs, tomates, batatas, uvas, tabaco, feijões, lentilhas, cana de açúcar, cacau, algodão.

A amostra pode ser uma amostra não biológica.

A amostra não biológica é preferivelmente uma amostra fluida.

Os exemplos de uma amostra não biológica incluem fluidos cirúrgicos, água tal como água de beber, água do mar ou água de rio, e reagentes para testes de laboratório.

A amostra é tipicamente processada antes de ser ensaiada, por exemplo pela centrifugação ou pela passagem através de uma membrana que filtra moléculas ou células indesejadas, tais como células sanguíneas

20 / 106 vermelhas.

A amostra pode ser medida imediatamente ao ser coletada.

A amostra também pode ser tipicamente armazenada antes do ensaio, preferivelmente abaixo de -70 °C.

Membrana Qualquer membrana pode ser usada de acordo com a invenção.

As membranas adequadas são bem conhecidas na técnica.

A membrana é preferivelmente uma camada anfifílica.

Uma camada anfifílica é uma camada formada de moléculas anfifílicas, tais como fosfolipídeos, que têm propriedades tanto hidrofílicas quanto lipofílicas.

As moléculas anfifílicas podem ser sintéticas ou de ocorrência natural.

Os anfífilos de ocorrência não natural e anfífilos que formam uma monocamada são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, copolímeros de bloco (Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450). Os copolímeros de bloco são materiais poliméricos em que duas ou mais subunidades monoméricas que são polimerizados juntos para criar uma única cadeia polimérica.

Copolímeros de bloco tipicamente têm propriedades que são contribuídas por cada subunidade monomérica.

Entretanto, um copolímero de bloco pode ter propriedades únicas que os polímeros formados a partir de subunidades individuais não possuem.

Os copolímeros de bloco podem ser engendrados de modo que uma das subunidades monoméricas seja hidrofóbica (isto é, lipofílica), enquanto que a(s) outra(s) subunidade(s) é/são hidrofílica(s) enquanto em meio aquoso.

Neste caso, o copolímero de bloco pode possuir propriedades anfifílicas e pode formar uma estrutura que imita uma membrana biológica.

O copolímero de bloco pode ser um dibloco (que consiste de duas subunidades monoméricas), mas também pode ser construída de mais do que duas subunidades monoméricas para formar arranjos mais complexos que se comportam como anfífilos.

O copolímero pode ser um tribloco, tetrabloco ou copolímero de pentabloco.

Os lipídeos de tetraéter bipolares arqueobacterianos são de

21 / 106 lipídeos de ocorrência natural que são construídos de modo que o lipídeo forme uma membrana de monocamada.

Estes lipídeos são no geral encontrados em extremófilos que sobrevivem em ambientes biológicos severos, termófilos, halófilos e acidófilos.

Acredita-se que a sua estabilidade derive da natureza fundida da bicamada final.

É fácil construir materiais de copolímero de bloco que imitem estas entidades biológicas pela criação de um polímero de tribloco que tenha o motivo geral hidrofílico-hidrofóbico- hidrofílico.

Este material pode formar membranas monoméricas que se comportam de modo similar às bicamadas de lipídeo e abrangem uma faixa de comportamentos de fase de vesículas através das membranas laminares.

As membranas formadas a partir destes copolímeros de tribloco retêm diversas vantagens em relação às membranas biológicas de lipídeo.

Porque o copolímero de tribloco é sintetizado, a construção exata pode ser cuidadosamente controlada para fornecer os comprimentos de cadeia corretos e propriedades requeridas para formar membranas e interagir com os poros e outras proteínas.

Os copolímeros de bloco também podem ser construídos a partir de subunidades que não são classificadas como submateriais de lipídeo; por exemplo um polímero hidrofóbico pode ser fabricado a partir de siloxano ou outros monômeros não fundamentados em hidrocarboneto.

A subseção hidrofílica de copolímero de bloco também pode possuir propriedades de ligação de proteína baixa, que permite a criação de uma membrana que é altamente resistente quando exposta às amostras biológicas brutas.

Esta unidade de grupo de ponta também pode ser derivada de grupos de ponta de lipídeo não clássicos.

As membranas de copolímero de tribloco também têm estabilidade mecânica e ambiental aumentada comparada com membranas biológicas de lipídeos, por exemplo uma temperatura operacional ou faixa de pH muito mais altas.

A natureza sintética dos copolímeros de bloco fornece

22 / 106 uma plataforma para customizar as membranas com base em polímero para uma ampla faixa de aplicações.

Em uma forma de realização preferida, a invenção fornece um método para determinar a presença, ausência ou características de um analito, que compreende (a) ligar o analito a uma membrana que compreende um copolímero de tribloco, opcionalmente em que a membrana é modificada para facilitar a ligação, e (b) deixar o analito interagir com um detector presente na membrana e determinar deste modo a presença, ausência ou características do analito.

Como debatido acima, um copolímero de tribloco é um polímero formado de três subunidades monoméricas diferentes.

As moléculas anfifílicas podem ser quimicamente modificadas ou funcionalizadas para facilitar a ligação do analito.

A camada anfifílica pode ser uma monocamada ou uma bicamada.

A camada anfifílica é tipicamente planar.

A camada anfifílica pode ser curva.

As membranas anfifílicas são de modo típico naturalmente móveis, atuando essencialmente como dois fluidos dimensionais com taxas de difusão de lipídeo de aproximadamente 10-8 cm s-1. Isto significa que o detector e o analito ligado podem tipicamente mover-se dentro de uma membrana anfifílica.

A membrana é preferivelmente uma bicamada de lipídeo.

As bicamadas de lipídeo são modelos de membranas celulares e servem como plataformas excelentes para uma faixa de estudos experimentais.

Por exemplo, as bicamadas de lipídeo podem ser usadas para a investigação in vitro de proteínas de membrana pelo registro de canal único.

Alternativamente, as bicamadas de lipídeo podem ser usadas como biossensores para detectar a presença de uma faixa de substâncias.

A bicamada de lipídeo pode ser qualquer bicamada de lipídeo.

As bicamadas de lipídeo adequadas incluem, mas não são limitadas a, uma bicamada de lipídeo

23 / 106 planar, uma bicamada sustentada ou um lipossoma.

A bicamada de lipídeo é preferivelmente uma bicamada de lipídeo planar.

As bicamadas de lipídeo adequadas são divulgadas no Pedido Internacional No.

PCT/GB08/000563 (publicado como WO 2008/102121), Pedido Internacional No.

PCT/GB08/004127 (publicado como WO 2009/077734) e Pedido Internacional No.

PCT/GB2006/001057 (publicado como WO 2006/100484). Os métodos para formar bicamadas de lipídeo são conhecidos na técnica.

Os métodos adequados são divulgados no Exemplo.

As bicamadas de lipídeo são habitualmente formadas pelo método de Montal e Mueller (Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA., 1972; 69: 3561-3566), em que uma monocamada de lipídeo que é transportada na interface da solução aquosa/ar passa cada lado de uma abertura que é perpendicular a esta interface.

O lipídeo é normalmente adicionado à superfície de uma solução eletrolítica aquosa dissolvendo-a primeiro em um solvente orgânico e depois que deixa uma gota do solvente evaporar na superfície da solução aquosa em cada lado da abertura.

Uma vez que o solvente orgânico tenha evaporado, as interfaces solução/ar em cada lado da abertura são fisicamente movidas para cima e para baixo passando a abertura até que uma bicamada seja formada.

As bicamadas de lipídeo planares podem ser formadas através de uma abertura em uma membrana ou através de uma abertura em um recesso.

O método de Montal & Mueller é popular porque é um método barato e relativamente fácil de formar bicamadas de lipídeo de boa qualidade que sejam adequadas para a inserção de proteína em poro.

Outros métodos comuns de formação de bicamada incluem imersão de ponta, bicamadas pintadas e patch-clamp de bicamadas de lipossoma.

A formação de bicamada com imersão de ponta acarreta necessariamente tocar a superfície da abertura (por exemplo, com uma ponta de pipeta) sobre a superfície de uma solução de teste que está transportando uma monocamada de lipídeo.

Mais uma vez, a monocamada de lipídeo é

24 / 106 primeiro gerada na interface da solução/ar que deixa-se uma gota de lipídeo dissolvido em solvente orgânico evaporar na superfície da solução.

A bicamada é depois formada pelo processo de Langmuir-Schaefer e requer automação mecânica para mover a abertura relativa à superfície da solução.

Para bicamadas pintadas, um gota de lipídeo dissolvida em solvente orgânico é aplicada diretamente à abertura, que é submergida em uma solução de teste aquosa.

A solução de lipídeo é espalhada finamente na abertura usando um pincel ou um equivalente.

O adelgaçamento do solvente resulta na formação de uma bicamada de lipídeo.

Entretanto, a remoção completa do solvente da bicamada é difícil e consequentemente a bicamada formada por este método é menos estável e mais propensa a ruído durante a medição eletroquímica.

O patch-clamp é habitualmente usado no estudo de membranas celulares biológicas.

A membrana celular é presa na extremidade de uma pipeta pela sucção e um pedaço da membrana fica ligada na abertura.

O método foi adaptado para produzir bicamadas de lipídeo pela grampeamento de lipossomas que depois estouram para deixar uma bicamada de lipídeo selando a abertura da pipeta.

O método requer lipossomas estáveis, gigantes e unilamelares e a fabricação de pequenas aberturas nos materiais tendo uma superfície de vidro.

Os lipossomas podem ser formados pela sonificação, extrusão ou o método de Mozafari (Colas et al. (2007) Micron 38: 841-847). Em uma forma de realização preferida, a bicamada de lipídeo é formada como descrito no Pedido Internacional No.

PCT/GB08/004127 (publicado como WO 2009/077734). Vantajosamente neste método, a bicamada de lipídeo é formada a partir de lipídeos secos.

Em uma forma de realização mais preferida, a bicamada de lipídeo é formada através de uma abertura como descrita na WO2009/077734 (PCT/GB08/004127). Uma bicamada de lipídeo é formada de duas camadas opostas

25 / 106 de lipídeos.

As duas camadas de lipídeos são dispostas de modo que os seus grupos de cauda hidrofóbica estejam de frente uma para a outra para formar um interior hidrofóbico.

Os grupos de ponta hidrofílica dos lipídeos virados para o lado de fora do ambiente aquoso em cada lado da bicamada.

A bicamada pode estar presente em várias fases de lipídeo incluindo, mas não limitado à fase desordenada líquida (lamelar fluídico), fase ordenada líquida, fase ordenada sólida (fase de gel lamelar, fase de gel interdigitada) e cristais de bicamada planar (fase de subgel lamelar, fase cristalina lamelar). Qualquer composição de lipídeo que forme uma bicamada de lipídeo pode ser usada.

A composição de lipídeo é escolhida de modo que uma bicamada de lipídeo tendo as propriedades requeridas, tais como carga de superfície, capacidade para sustentar proteínas de membrana, densidade de empacotamento ou propriedades mecânicas, seja formada.

A composição de lipídeo pode compreender um ou mais lipídeos diferentes.

Por exemplo, a composição de lipídeo pode conter até 100 lipídeos.

A composição de lipídeo preferivelmente contém de 1 a 10 lipídeos.

A composição de lipídeo pode compreender lipídeos de ocorrência natural e/ou lipídeos artificiais.

Os lipídeos tipicamente compreendem um grupo de ponta, uma porção interfacial e dois grupos de cauda hidrofóbica que podem ser os mesmos ou diferentes.

Os grupos de ponta adequados incluem, mas não são limitados a, grupos de ponta neutros, tais como diacilglicerídeos (DG) e ceramidas (CM); grupos de ponta zuiteriônicos, tais como fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) e esfingomielina (SM); grupos de ponta negativamente carregados, tais como fosfatidilglicerol (PG); fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PI), ácido fosfatídico (PA) e cardiolipina (CA); e grupos de ponta positivamente carregados, tais como trimetilamônio-propano (TAP). As porções interfaciais adequadas incluem, mas não são limitados às porções interfaciais de ocorrência natural, tais como porções com base em glicerol ou com base em ceramida.

Os grupos de cauda hidrofóbica adequados

26 / 106 incluem, mas não são limitados a, cadeias de hidrocarboneto saturadas, tais como ácido láurico (ácido n-dodecanólico), ácido mirístico (ácido n- tetradeconônico), ácido palmítico (ácido n-hexadecanóico), ácido esteárico (n-Octadecanóico) e araquídico (n-Eicosanóico); cadeias de hidrocarboneto insaturadas, tais como ácido oléico (cis-9-Octadecanóico); e cadeias de hidrocarboneto ramificadas, tais como fitanoíla.

O comprimento da cadeia e a posição e número das ligações duplas nas cadeias de hidrocarboneto insaturadas podem variar.

O comprimento das cadeias e a posição e número das ramificações, tais como grupos metila, nas cadeias de hidrocarboneto ramificadas podem variar.

Os grupos de cauda hidrofóbica podem ser ligados à porção interfacial como um éter ou um éster.

Os lipídeos também podem ser quimicamente modificados.

O grupo de ponta ou o grupo de cauda dos lipídeos podem ser quimicamente modificados.

Os lipídeos adequados cujos grupos de ponta foram quimicamente modificados incluem, mas não são limitados a, lipídeos modificados com PEG, tais como 1,2-Diacil-sn-Glicero-3-Fosfoetanolamina- N-[Metóxi(Polietileno glicol)-2000]; Lipídeos de PEG funcionalizados, tais como 1,2-Distearoil-sn-Glicero-3 Fosfoetanolamina-N-[Biotinil(Polietileno glicol)2000]; e lipídeos modificados para conjugação, tais como 1,2-Dioleoil- sn-Glicero-3-Fosfoetanolamina-N-(succinila) e 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3- Fosfoetanolamina-N-(Biotinila). Os lipídeos adequados cujos grupos de cauda foram quimicamente modificados incluem, mas não são limitados a, lipídeos polimerizáveis, tais como 1,2-bis(10,12-tricosadiinoil)-sn-Glicero-3- Fosfocolina; lipídeos fluorados, tais como 1-Palmitoil-2-(16-Fluoropalmitoil)- sn-Glicero-3-Fosfocolina; lipídeos deuterados, tais como 1,2-Dipalmitoil- D62-sn-Glicero-3-Fosfocolina; e lipídeos ligados a éter, tais como 1,2-Di-O- fitanil-sn-Glicero-3-Fosfocolina.

Os lipídeos podem ser quimicamente modificados ou funcionalizados para facilitar a ligação do analito.

A camada anfifílica, por exemplo a composição de lipídeo,

27 / 106 tipicamente compreende um ou mais aditivos que afetarão as propriedades da camada.

Os aditivos adequados incluem, mas não são limitados a, ácidos graxos, tais como ácido palmítico, ácido mirístico e ácido oléico; álcoois graxos, tais como álcool palmítico, álcool mirístico e álcool oléico; esteróis, tais como colesterol, ergosterol, lanosterol, sitosterol e estigmasterol; lisofosfolipídeos, tais como 1-Acil-2-Hidróxi-sn-Glicero-3-Fosfocolina; e ceramidas.

Em uma outra forma de realização preferida, a membrana é uma camada no estado sólido.

Uma camada no estado sólido não é de origem biológica.

Em outras palavras, uma camada no estado sólido não é derivada de ou isolada de um ambiente biológico tal como um organismo ou célula, ou uma versão sinteticamente fabricada de uma estrutura biologicamente disponível.

As camadas de estado sólido podem ser formadas a partir de materiais tanto orgânicos quanto inorgânicos incluindo, mas não limitados a, materiais microeletrônicos, materiais isolantes tais como Si3N4, Al2O3, e SiO, polímeros orgânicos e inorgânicos tais como poliamida, plásticos tais como Teflon® ou elastômeros tais como borracha de silicone de cura de adição de dois componentes, e vidros.

A camada no estado sólido pode ser formada a partir de grafeno.

As camadas de grafeno adequadas são divulgadas no Pedido Internacional No.

PCT/US2008/010637 (publicado como WO 2009/035647). Ligação O analito pode ser ligado à membrana usando qualquer método conhecido.

Se a membrana é uma camada anfifílica, tal como uma bicamada de lipídeo, o analito é preferivelmente ligado à membrana via um polipeptídeo presente na membrana ou uma âncora hidrofóbica presente na membrana.

A âncora hidrofóbica é preferivelmente um lipídeo, ácido graxo, esterol, nanotubo de carbono, polipeptídeo, proteína ou aminoácido, por exemplo colesterol, palmitato ou tocoferol.

Em formas de realização preferidas, o

28 / 106 analito não é ligado à membrana por intermédio do detector.

Os componentes da membrana, tais como as moléculas ou lipídeos anfifílicos, podem ser quimicamente modificados ou funcionalizados para facilitar a ligação do analito à membrana diretamente ou via um ou mais ligantes.

Os exemplos de modificações químicas adequadas e modos adequados de funcionalização os componentes da membrana são debatidos em mais detalhes abaixo.

Qualquer proporção dos componentes de membrana pode ser funcionalizada, por exemplo pelo menos 0,01 %, pelo menos 0,1 %, pelo menos 1 %, pelo menos 10 %, pelo menos 25 %, pelo menos 50 % ou 100 %. O analito pode ser ligado diretamente à membrana.

O analito pode ser ligado diretamente à membrana em um ou mais, tal como 2, 3, 4 ou mais, pontos.

O analito é preferivelmente ligado à membrana via um ligante.

O analito pode ser ligado à membrana via um ou mais, tal como 2, 3, 4 ou mais, ligantes.

Um ligante pode ligar mais do que um, tal como 2, 3, 4 ou mais, analitos à membrana.

O analito pode ser ligado à membrana diretamente em um ou mais pontos e via um ou mais ligantes.

Os ligantes preferidos incluem, mas não são limitados a, polímeros, tais como polinucleotídeos, polietileno glicóis (PEGs), polissacarídeos e polipeptídeos.

Estes ligantes podem ser lineares, ramificados ou circulares.

Por exemplo, o ligante pode ser um polinucleotídeo circular.

Se o analito é por si só um polinucleotídeo, o mesmo pode hibridizar a uma sequência complementar no ligante de polinucleotídeo circular.

Os ligantes funcionalizados e os modos em que eles podem ligar moléculas são conhecidos na técnica.

Por exemplo, ligantes funcionalizados com grupos maleimida reagirão com e ligar-se-ão aos resíduos de cisteína nas proteínas.

No contexto desta invenção, a proteína

29 / 106 pode estar presente na membrana, pode ser o próprio analito ou pode ser usada para ligar ao analito.

Isto é debatido em mais detalhes abaixo.

A reticulação de analitos pode ser evitada usando um arranjo de “fechadura e chave”. Apenas uma extremidade de cada ligante pode reagir juntos para formar um ligante mais longo e as outras extremidades do ligante cada uma reage com o analito ou membrana respectivamente.

Tais ligantes são descritos no Pedido Internacional No.

PCT/GB10/000132 (publicado como WO 2010/086602). O uso de um ligante é preferido nas formas de realização de sequenciamento debatidas abaixo.

Se um analito de polinucleotídeo é de modo permanente ligado diretamente à membrana, então algum dado de sequência será perdido visto que a rodada de sequenciamento não pode continuar até a extremidade do polinucleotídeo devido à distância entre a membrana e o detector.

Se um ligante é usado, então o analito de polinucleotídeo pode ser processado até a conclusão.

A ligação pode ser permanente ou estável.

Em outras palavras, a ligação pode ser tal que o analito permaneça ligado à membrana durante o método.

A ligação pode ser transitória.

Em outras palavras, a ligação pode ser tal que o analito se separa da membrana durante o método.

Para certas aplicações, tais como detecção de aptâmero, a natureza transitória da ligação é preferida.

Se um ligante permanente ou estável é ligado diretamente à extremidade 5’ ou 3’ de um polinucleotídeo e o ligante é mais curto do que a distância entre a bicamada e o canal do nanoporo ou a proteína de ligação do sítio ativo do polinucleotídeo, então alguns dados de sequência serão perdidos visto que a rodada de sequenciamento não pode continuar até a extremidade do polinucleotídeo.

Se a ligação é transitória, então quando a extremidade ligada aleatoriamente se tornam livres da bicamada, depois o polinucleotídeo pode ser processado até a conclusão.

Grupos químicos que formam ligações permanentes/estáveis ou transitórias com a membrana são debatidos em mais detalhes abaixo.

O

30 / 106 analito pode ser transitoriamente ligado a uma camada anfifílica ou bicamada de lipídeo usando colesterol ou uma cadeia de acila graxa.

Qualquer cadeia de acila graxa tendo um comprimento de 6 a 30 átomos de carbono, tal como o ácido hexadecanóico, pode ser usada.

Em formas de realização preferidas, um analito de polinucleotídeo, tal como um ácido nucleico, é ligado a um camada anfifílica tal como uma bicamada de lipídeo.

A ligação de ácidos nucleicos às bicamadas de lipídeo sintéticas foi anteriormente realizada com várias estratégias de amarração diferentes.

Estas estão resumidas na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3 Grupo de ligação Tipo de ligação Referência Tiol Estável Yoshina-Ishii, C. e S.

G.

Boxer (2003). “Arrays of mobile tethered vesicles on supported lipides bilayer.” J Am Chem Soc 125(13): 3696-7. Biotina Estável Nikolov, V., R.

Lipowsky, et al. (2007). “Behavior of giant vesicles with anchored DNA molecules.” Biophys J 92(12): 4356-68 Colestrol Transitória Pfeiffer, I. e F.

Hook (2004). “Bivalent cholesterol- based coupling of oligonucletides to lipid membrane assemblies.” J Am Chem Soc 126(33): 10224-5 Tensoativo (por Estável van Lengerich, B., R.

J.

Rawle, et al. “Covalent exemplo, Lipídeo, attachment of lipid vesicles to a fluid-supported Palmitato, etc) bilayer allows observation of DNA-mediated vesicle interations.” Langmuir 26(11): 8666-72

Analitos ou ligantes de polinucleotídeo sintéticos podem ser funcionalizados usando uma fosforamidita modificada na reação de síntese, que é facilmente compatível para a adição direta de porções de ligação adequadas, tais como colesterol, tocoferol ou palmitato, assim como para grupos reativos, tais como grupos tiol, colesterol, lipídeo e biotina.

Estas químicas de ligação diferentes dão um grupo de opções para a ligação aos polinucleotídeos alvo.

Cada grupo de modificação diferente amarra o polinucleotídeo em um modo levemente diferente e a ligação nem sempre é permanente dando assim tempos de residência diferentes para o analito à bicamada.

As vantagens de ligação transitória são debatidas acima.

A ligação de polinucleotídeos a um ligante ou a uma membrana funcionalizada também pode ser obtida por vários outros meios

31 / 106 contanto que um grupo reativo complementar ou uma amarração possam ser adicionados ao polinucleotídeo alvo.

A adição de grupos reativos a cada extremidade de DNA foi relatados anteriormente.

Um grupo tiol pode ser adicionado à 5’ de ssDNA ou dsDNA usando T4 polinucleotídeo cinase e ATPγS (Grant, G.

P. e P.

Z.

Qin (2007). “A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5’ terminus of nucleic acids.” Nucleic Acids Res 35(10): e77). Um grupo azida pode ser adicionado ao 5’-fosfato de ssDNA ou dsDNA usando T4 polinucleotídeo cinase e γ-[2-Azidoetil]-ATP ou γ-[6- Azidohexil]-ATP.

Usando tiol ou a química Click uma amarração, que contém um grupo tiol, iodoacetamida OPSS ou maleimida (reativos para tióis) ou um DIBO (dibenzociclooxtina) ou grupo alquino (reativo para azidas), pode ser covalentemente ligado ao analito.

Uma seleção mais diversa de grupos químicos, tais como biotina, tióis e fluoróforos, pode ser adicionada usando a transferase de terminal para incorporar oligonucleotídeos modificados à 3’ de ssDNA (Kumar, A., P.

Tchen, et al. (1988). “Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotides probes with terminal deoxynucleotidil transferase.” Anal Biochem 169(2): 376-82). O Exemplo 3 abaixo descreve como o DNA pode ser ligado a uma bicamada de lipídeo usando estreptavidina/biotina.

A ligação de estreptavidina/biotina pode ser usada para qualquer outro analito.

Também pode ser possível que amarrações possam ser diretamente adicionadas aos polinucleotídeos alvo usando a transferase de terminal com nucleotídeos adequadamente modificados (por exemplo, colesterol ou palmitato). Alternativamente, o grupo reativo ou amarração pode ser considerado ser a adição de um pedaço curto de polinucleotídeo, tal como DNA, complementar a um já ligado à bicamada, de modo que a ligação pode ser obtida por intermédio da hibridização.

Neste caso, o grupo reativo pode ser um polinucleotídeo de filamento único ou filamento duplo.

O grupo reativo pode ser ligado a um analito de polinucleotídeo de filamento único ou

32 / 106 filamento duplo.

A ligação de pedaços curtos de ssDNA foram relatadas usando a T4 RNA ligase I (Troutt, A.

B., M. G.

McHeyzer-Williams, et al. (1992). “Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity.” Proc Natl Acad Sci U S A 89(20): 9823-5). Alternatively, ssDNA ou dsDNA podem ser ligados ao dsDNA do analito nativo e depois os dois filamentos separados pela desnaturação térmica ou química.

Ao dsDNA nativo, é possível adicionar um pedaço de ssDNA a uma ou a ambas das extremidades do duplex, ou dsDNA a uma ou a ambas extremidades.

Quanto à adição de ácido nucleicos de filamento único ao DNA nativo isto pode ser obtido usando T4 RNA ligase I como para a ligação a outras regiões de ácidos nucleicos de filamento único.

Para a adição de dsDNA ao DNA duplex nativo depois a ligação pode ser “terminada de modo abrupto”, com as caudas 3’ dA/dT complementares no DNA nativo e adaptador respectivamente (como é rotineiramente feito para muitas aplicações de preparação de amostra para prevenir a formação de concatêmero ou dímero) ou usando “extremidades pegajosas” geradas pela digestão de restrição do DNA nativo e ligação de adaptadores compatíveis.

Depois, quando o duplex é fundido, cada filamento único terá uma modificação em 5’ ou 3’ se ssDNA foi usado para a ligação ou uma modificação na extremidade 5’, na extremidade 3’ ou ambas se dsDNA foi usado para a ligação.

Se o polinucleotídeo é um filamento sintético, a química de ligação pode ser incorporada durante a síntese química do polinucleotídeo.

Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser sintetizado usando um iniciador tendo um grupo reativo ligado a ele.

Os ácidos nucleicos adenilados (AppDNA) são intermediários nas reações de ligação, onde um monofosfato de adenosina é ligado ao 5’- fosfato do ácido nucleico.

Vários kits estão disponíveis para a geração deste intermediário, tal como o Kit de Adenilação 5’ DNA da NEB.

Pela substituição de ATP na reação por um trifosfato de nucleotídeo modificado,

33 / 106 então a adição de grupos reativos (tais como tióis, aminas, biotina, azidas, etc) à 5’ de DNA deve ser possível.

Também pode ser possível que as amarrações podem ser diretamente adicionadas aos polinucleotídeos alvo usando um kit de adenilação de 5’ DNA com nucleotídeos adequadamente modificado (por exemplo, colesterol ou palmitato). Uma técnica comum para a amplificação de seções de DNA genômico é usar a reação da cadeia da polimerase (PCR). Aqui, usar dois iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos, várias cópias da mesma seção de DNA podem ser geradas, onde para cada cópia a 5’ de cada filamento no duplex será um polinucleotídeo sintético.

Pelo uso de um iniciador de anti- sentido nucleotídeos únicos ou múltiplos podem ser adicionados à extremidade 3’ de DNA de filamento único ou duplo pela utilização de uma polimerase.

Os exemplos de polimerases que podem ser usados incluem, mas não são limitados a, Transferase de Terminal, Klenow e Poli(a) polimerase de E. coli). Pela substituição de ATP na reação por um trifosfato de nucleotídeo modificado então grupos reativos, tais como um colesterol, tiol, amina, azida, biotina ou lipídeo, podem ser incorporados no DNA.

Portanto, cada cópia do DNA amplificado alvo conterá um grupo reativo para ligação.

Idealmente, o analito é ligado à membrana sem ter que funcionalizar o analito.

Isto pode ser obtido pelo ancoramento de um grupo de ligação, tal como uma proteína que liga polinucleotídeo ou um grupo químico, à membrana e deixando o grupo de ligação interagir com o analito ou pela funcionalização da membrana.

O grupo de ligação pode ser ligado à membrana por qualquer um do métodos aqui descritos.

Em particular, o grupo de ligação pode ser ligado à membrana usando um ou mais ligantes, tais como ligantes funcionalizados em maleimida.

Nesta forma de realização, o analito é tipicamente RNA, DNA, PNA, TNA ou LNA e pode ser de filamento duplo ou único.

Esta forma de realização é particularmente adaptada para analitos de DNA genômicos.

34 / 106

O grupo de ligação pode ser qualquer grupo que interage com ácidos nucleicos de filamento único ou duplo, sequências de nucleotídeo específicas dentro do analito ou padrões de nucleotídeos modificados dentro do analito, ou qualquer outro ligando que esteja presente no polinucleotídeo.

As proteínas de ligação adequadas incluem a proteína que liga o filamento único da E. coli, proteína que liga filamento único P5, proteína que liga filamento único T4 gp32, a região de ligação de topoV dsDNA, proteínas da histona humana, proteína que liga HU DNA da E. coli e outras proteínas que ligam ácido nucleico de arquea, procariótico ou eucariótico de filamento único ou duplo, incluindo aquelas listadas abaixo.

As sequências de nucleotídeo específicas podem ser sequências reconhecidas pelos fatores de transcrição, ribossomas, endonucleases, topoisomerases ou fatores de início de replicação.

Os padrões de nucleotídeos modificados podem ser padrões de metilação ou dano.

O grupo químico pode ser qualquer grupo que intercale com ou interaja com um analito de polinucleotídeo.

O grupo pode intercalar ou interagir com o analito de polinucleotídeo por intermédio das interações eletrostáticas, de ligação de hidrogênio ou de Van der Waals.

Tais grupos incluem um monômero de lisina, poli-lisina (que interagirá com ssDNA ou dsDNA), brometo de etídio (que intercalará com dsDNA), bases universais ou nucleotídeos universais (que podem hibridizar com qualquer analito de polinucleotídeo) e complexos de ósmio (que podem reagir com bases metiladas). Um analito de polinucleotídeo pode portanto ser ligado à membrana usando um ou mais nucleotídeos universais ligados à membrana.

Cada resíduo de nucleotídeo universal pode ser ligado à membrana usando um ou mais ligantes.

Os exemplos de bases universais incluem inosina, 3- nitropirrol, 5-nitroindol, 4-nitroindol, 6-nitroindol, 3,4-di-hidro-pirimido[4,5- c][1,2]oxazin-7-ona (dP), 2-dimetilaminometilenoamino-6- metiloxiaminopurina (dK), desóxi inosina, desóxi nebularina.

35 / 106

Nesta forma de realização pelo menos 1 %, pelo menos 10 %, pelo menos 25 %, pelo menos 50 % ou 100 % dos componentes de membrana podem ser funcionalizados.

Onde o grupo de ligação é uma proteína, o mesmo pode ser capaz de ancorar diretamente dentro da membrana sem funcionalização adicional, por exemplo se o mesmo já tem uma região hidrofóbica externa que seja compatível com a membrana.

Os exemplos de tais proteínas incluem proteínas de transmembrana.

Alternativamente a proteína pode ser expressada com uma região hidrofóbica geneticamente fundida que é compatível com a membrana.

Tais regiões de proteína hidrofóbica são conhecidas na técnica.

O grupo de ligação é preferivelmente misturado com o analito antes do contato com a membrana, mas o grupo de ligação pode ser contactado com a membrana e subsequentemente contactado com o analito.

Em um outro aspecto o analito pode ser funcionalizado, usando os métodos descritos acima, de modo que o mesmo possa ser reconhecido por um grupo de ligação específico.

Especificamente o analito pode ser funcionalizado com um ligando tal como biotina (para ligar-se à estreptavidina), amilose (para ligar-se à proteína que liga maltose ou uma proteína de fusão), Ni-NTA (para ligar-se à poli-histidina ou proteínas alvejadas pela poli-histidina) ou um peptídeo (tal como um antígeno), De acordo com um outro aspecto, o grupo de ligação pode ser usado para ligar analito de polinucleotídeo à membrana quando o analito está ligado a um adaptador de polinucleotídeo.

Especificamente o analito liga-se a um adaptador que compreende uma sequência líder designada para preferencialmente inserir dentro de um detector tal como um nanoporo.

Uma tal sequência líder pode compreender um polinucleotídeo homopolimérico ou uma região abásica.

O adaptador tipicamente é planejado para hibridizar a um ligante e ligar-se ou hibridizar ao analito.

Isto cria competição entre o analito e o adaptador para entrar no detector.

Se o ligante compreende um grupo de

36 / 106 ligação, o comprimento do analito maior comparado ao adaptador significa que vários ligantes podem ligar-se ao analito simultaneamente, aumentando assim a concentração de analito em relação àquela do adaptador.

Qualquer um dos métodos debatidos acima para ligar polinucleotídeos às camadas anfifílicas, tais como bicamadas de lipídeo, pode ser naturalmente aplicado a outras combinações de analito e membrana.

Em algumas formas de realização, um aminoácido, peptídeo, polipeptídeo ou proteína são ligados a uma bicamada de lipídeo.

Várias metodologias para a ligação química de tais analitos estão disponíveis.

Um exemplo de uma molécula usada na ligação química é EDC (cloridrato de 1-etil-3-[3- dimetilaminopropil]carbodiimida). Os grupos reativos também podem ser adicionados à 5’ do DNA usando kits comercialmente disponíveis (Thermo Pierce, Peça No. 22980). Os métodos adequados incluem, mas não são limitados a, ligação de afinidade transitória usando resíduos de histidina e Ni- NTA, assim como ligações covalentes mais robustas pelas cisteínas, lisinas ou aminoácidos não naturais reativos.

Detector O detector pode ser qualquer estrutura que forneça um sinal legível em resposta à presença, à ausência ou às características do analito.

O detector pode ser qualquer estrutura que forneça um sinal legível em resposta à presença ou à ausência do analito.

Os detectores adequados são conhecidos na técnica.

Eles incluem, mas não são limitados a poros de transmembrana, eletrodos de tunelamento, eletrodos de classe, nanotubos, FETs (transistores de efeito de campo) e detectores ópticos, tais como microscópios de força atômica (AFMs) e microscópios de tunelamento de varredura (STMs). Em formas de realização preferidas, o detector detecta o analito usando meios elétricos.

As medições elétricas podem ser feitas usando equipamento de registro de canal único padrão como descrito em Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12; 106(19): 7702-7, Lieberman KR et al, J Am

37 / 106

Chem Soc. 2010; 132(50): 17961-72, e Pedido Internacional WO- 2000/28312. Alternativamente, as medições elétricas podem ser feitas usando um sistema de multicanal, por exemplo como descrito no Pedido Internacional WO-2009/077734 e Pedido Internacional WO-2011/067559. Em outras formas de realização preferidas, o detector não detecta o analito usando meios fluorescentes.

O detector preferivelmente compreende um poro de transmembrana.

Um poro de transmembrana é uma estrutura que permite que os íons hidratados acionados por um potencial aplicado fluam de um lado da membrana para o outro lado da membrana.

O poro de transmembrana é preferivelmente um poro de proteína de transmembrana.

Um poro de proteína de transmembrana é um polipeptídeo ou uma coleção de polipeptídeos que permitem que íons hidratados, tais como o analito, fluam de um lado de uma membrana para o outro lado da membrana.

Na presente invenção, o poro de proteína de transmembrana é capaz de formar um poro que permite que íons hidratados acionados por um potencial aplicado fluam de um lado da membrana para o outro.

O poro de proteína de transmembrana preferivelmente permite que o analito tal como nucleotídeos fluam de um lado da membrana, tal como uma bicamada de lipídeo, para o outro.

O poro de proteína de transmembrana preferivelmente permite que um polinucleotídeo ou ácido nucleico, tal como DNA ou RNA, se movam através do poro.

O poro de proteína de transmembrana pode ser um monômero ou um oligômero.

O poro é preferivelmente fabricado de várias subunidades de repetição, tais como 6, 7 ou 8 subunidades.

O poro é mais preferivelmente um poro heptamérico ou octamérico.

O poro de proteína de transmembrana tipicamente compreende um tubo ou canal através do qual os íons podem fluir.

As subunidades do poro tipicamente circundam um eixo central e contribuem com filamentos para um

38 / 106 tubo ou canal β de transmembrana ou um feixe ou canal de hélice α de transmembrana.

O tubo ou canal do poro de proteína de transmembrana tipicamente compreendem aminoácidos que facilitam a interação com o analito, tais como nucleotídeos, polinucleotídeos ou ácidos nucleicos.

Estes aminoácidos estão preferivelmente localizados próximos a uma constrição do tubo ou canal.

O poro de proteína de transmembrana tipicamente compreende um ou mais aminoácidos positivamente carregados, tais como arginina, lisina ou histidina, ou aminoácidos aromáticos, tais como tirosina ou triptofano.

Estes aminoácidos tipicamente facilitam a interação entre o poro e os nucleotídeos, polinucleotídeos ou ácidos nucleicos.

A detecção de nucleotídeo pode ser facilitada com um adaptador.

Isto é debatido em mais detalhes abaixo.

Os poros de proteína de transmembrana para o uso de acordo com a invenção podem ser derivados de poros de tubo β ou poros de feixe de hélice α.

Os poros de tubo β compreendem um tubo ou canal que é formado a partir de filamentos β.

Os poros de tubo β adequados incluem, mas não são limitados a, toxinas β, tais como hemolisina α, toxina de antrax e leucocidinas, e proteínas de membrana esterna/porinas de bactérias, tais como porina de Mycobacterium smegmatis (Msp), por exemplo MspA, MspB, MspC ou MspD, porina F de membrana externa (OmpF), porina G de membrana externa (OmpG), fosfolipase A de membrana externa e lipoproteína autotransportadora de Neisseria (NalP). Os poros de feixe de hélice α compreendem um tubo ou canal que é formado de hélices α.

Os poros de feixe de hélice α adequados incluem, mas não são limitados a, proteínas de membrana interna e proteínas de membrana externa α, tais como as toxinas WZA e ClyA.

O poro de transmembrana pode ser derivado de Msp ou de α- hemolisina (α-HL). Para o sequenciamento de filamento, o poro de proteína de

39 / 106 transmembrana é preferivelmente derivado de Msp, preferivelmente de MspA.

Um tal poro será oligomérico e tipicamente compreende 7, 8, 9 ou 10 monômeros derivados de Msp.

O poro pode ser um derivado de poro homo- oligomérico de Msp que compreende monômeros idênticos.

Alternativamente, o poro pode ser um poro hetero-oligomérico derivado de Msp que compreende pelo menos um monômero que difere dos outros.

O poro também pode compreender uma ou mais construções que compreendem dois ou mais monômeros covalentemente ligados derivados de Msp.

Os poros adequados são divulgados no Pedido Internacional No.

PCT/GB2012/050301 (que reivindica a prioridade do Pedido Provisório US No. 61/441.718). Preferivelmente o poro é derivado de MspA ou um homólogo ou parálogo do mesmo.

Um monômero derivado de Msp compreende a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma.

A SEQ ID NO: 2 é o mutante NNN-RRK do monômero MspA.

O mesmo inclui as mutações que seguem: D90N, D91N, D93N, D118R, D134R e E139K.

Uma variante da SEQ ID NO: 2 é um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácido que varia daquela da SEQ ID NO: 2 e que retém a sua capacidade para formar um poro.

A capacidade de uma variante para formar um poro pode ser ensaiada usando qualquer método conhecido na técnica.

Por exemplo, a variante pode ser inserida dentro de uma bicamada de lipídeo junto com outras subunidades apropriadas e a sua capacidade para oligomerizar para formar um poro pode ser determinada.

Os métodos são conhecidos na técnica para inserir subunidades dentro das membranas, tais como as bicamadas de lipídeo.

Por exemplo, as subunidades podem ser colocadas em suspensão em uma forma purificada em uma solução que contém uma bicamada de lipídeo de modo que a mesma se difunda para a bicamada de lipídeo e é inserido pela ligação à bicamada de lipídeo e montagem dentro de um estado funcional.

Alternativamente, as subunidades podem ser diretamente inseridas dentro da

40 / 106 membrana usando o método de “pick and place” descrito em M.

A.

Holden, H.

Bailey.

J.

Am.

Chem.

Soc. 2005, 127, 6502-6503 e Pedido Internacional No.

PCT/GB2006/001057 (publicado como a WO 2006/100484). As variantes preferidas são divulgadas no Pedido Internacional No.

PCT/GB2012/050301 (que reivindica prioridade do Pedido Provisório US No. 61/441.718). As variantes particularmente preferidas incluem, mas não são limitadas a, aquelas que compreendem a(s) substituição(ões) que seguem: L88N; L88S; L88Q; L88T; D90S; D90Q; D90Y; I105L; I105S; Q126R; G75S; G77S; G75S, G77S, L88N e Q126R; G75S, G77S, L88N, D90Q e Q126R; D90Q e Q126R; L88N, D90Q e Q126R; L88S e D90Q; L88N e D90Q; E59R; G75Q; G75N; G75S; G75T; G77Q; G77N; G77S; G77T; I78L; S81N; T83N; N86S; N86T; I87F; I87V; I87L; L88N; L88S; L88Y; L88F; L88V; L88Q; L88T; I89F; I89V; I89L; N90S; N90Q; N90L; N90Y; N91S; N91Q; N91L; N91M; N91I; N91A; N91V; N91G; G92A; G92S; N93S; N93A; N93T; I94L; T95V; A96R; A96D; A96V; A96N; A96S; A96T; P97S; P98S; F99S; G100S; L101F; N102K; N102S; N102T; S103A; S103Q; S103N; S103G; S103T; V104I; I105Y; I105L; I105A; I105Q; I105N; I105S; I105T; T106F; T106I; T106V; T106S; N108P; N108S; D90Q e I105A; D90S e G92S; L88T e D90S; I87Q e D90S; I89Y e D90S; L88N e I89F; L88N e I89Y; D90S e G92A; D90S e I94N; D90S e V104I; L88D e I105K; L88N e Q126R; L88N, D90Q e D91R; L88N, D90Q e D91S; L88N, D90Q e I105V; D90Q, D93S e I105A; N91Y; N90Y e N91G; N90G e N91Y; N90G e N91G; I05G; N90R; N91R; N90R e N91R; N90K; N91K; N90K e N91K; N90Q e N91G; N90G e N91Q; N90Q e N91Q; R118N; N91C; N90C; N90W; N91W; N90K; N91K; N90R; N91R; N90S e N91S; N90Y e I105A; N90G e I105A; N90Q e I105A; N90S e I105A; L88A e I105A; L88S e I105S; L88N e I105N; N90G e N93G; N90G; N93G; N90G e N91A; I105K; I105R; I105V; I105P; I105W; L88R; L88A; L88G; L88N; N90R e I105A; N90S e I105A; L88A e I105A; L88S e I105S; L88N e I105N; L88C; S103C; e I105C.

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Além das mutações específicas debatidas acima, a variante pode incluir outras mutações.

No comprimento inteiro da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, uma variante preferivelmente será pelo menos 50 % homóloga com esta sequência com base na identidade de aminoácido.

Mais preferivelmente, a variante pode ser de pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % e mais preferivelmente pelo menos 95 %, 97 % ou 99 % homólogas com base na identidade de aminoácido com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 em relação à sequência inteira.

Pode haver pelo menos 80 %, por exemplo pelo menos 85 %, 90 % ou 95 %, de identidade de aminoácido em relação a um trecho de 100 ou mais, por exemplo 125, 150, 175 ou 200 ou mais, aminoácidos contíguos (“homologia difícil”). Os métodos padrão na técnica podem ser usados para determinar homologia.

Por exemplo o Pacote UWGCG fornece o programa BESTFIT que pode ser usada para calcular homologia, por exemplo usada nos seus ajustes de default (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395). Os algoritmos PILEUP e BLAST podem ser usados para calcular homologia ou alinhamento de sequências (tal como identificando resíduos equivalentes ou sequências correspondentes (tipicamente nos seus ajustes de default)), por exemplo como descrito em Altschul S.

F. (1993) J Mol Evol 36: 290-300; Altschul, S.

F et al (1990) J Mol Biol 215: 403-10. O software para realizar análises de BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/). A SEQ ID NO: 2 é o mutante NNN-RRK do monômero MspA.

A variante pode compreender qualquer uma das mutações nos monômeros MspB, C ou D comparados com MspA.

As formas maduras de MspB, C e D são mostradas nas SEQ ID NOs: 15 a 17. Em particular, a variante pode compreender a substituição que segue presente em MspB:

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A138P.

A variante pode compreender uma ou mais das substituições que seguem presentes em MspC: A96G, N102E e A138P.

A variante pode compreender uma ou mais das mutações que seguem presentes em MspD: Deleção de G1, L2V, E5Q, L8V, D13G, W21A, D22E, K47T, I49H, I68V, D91G, A96Q, N102D, S103T, V104I, S136K e G141A.

A variante pode compreender combinações de uma ou mais das mutações e substituições de Msp B, C e D.

As substituições de aminoácido podem ser feitas à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 além daquelas debatidas acima, por exemplo até 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 ou 30 substituições.

As substituições conservativas substituem aminoácidos com outros aminoácidos de estrutura química similar, propriedades químicas similares ou volume de cadeia lateral similar.

Os aminoácidos introduzidos podem ter polaridade similar, hidrofilicidade, hidrofobicidade, basicidade, acidez, neutralidade ou carga aos aminoácidos que elas substituem.

Alternativamente, a substituição conservativa pode introduzir um outro aminoácido que é aromático ou alifático no lugar de um aminoácido aromático ou alifático pré-existente.

As mudanças de aminoácido conservativas são bem conhecidas na técnica e podem ser selecionadas de acordo com as propriedades dos 20 aminoácidos principais como definido na Tabela 4 abaixo.

Onde os aminoácidos têm polaridade similar, isto também pode ser determinado por referência à escala de hidropatia para as cadeias laterais de aminoácido na Tabela 5. Tabela 4 - Propriedades químicas dos aminoácidos Ala alifático, hidrofóbico, neutro Met hidrofóbico, neutro Cys polar, hidrofóbico, neutro Asn polar, hidrofílico, neutro Asp polar, hidrofílico, carregado (-) Pro hidrofóbico, neutro Glu polar, hidrofílico, carregado (-) Gln polar, hidrofílico, neutro Phe aromático, hidrofóbico, neutro Arg polar, hidrofílico, carregado (+) Gly alifático, neutro Ser polar, hidrofílico, neutro His aromático, polar, hidrofílico, Thr polar, hidrofílico, neutro carregado (+) Ile alifático, hidrofóbico, neutro Val alifático, hidrofóbico, neutro Lys polar, hidrofílico, carregado(+) Trp aromático, hidrofóbico, neutro Leu alifático, hidrofóbico, neutro Tyr aromático, polar, hidrofóbico

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Tabela 5 - Escala de Hidropatia Cadeia Lateral Hidropatia Ile 4,5 Val 4,2 Leu 3,8 Phe 2,8 Cys 2,5 Met 1,9 Ala 1,8 Gly -0,4 Thr -0,7 Ser -0,8 Trp -0,9 Tyr -1,3 Pro -1,6 His -3,2 Glu -3,5 Gln -3,5 Asp -3,5 Asn -3,5 Lys -3,9 Arg -4,5

Um ou mais resíduos de aminoácido da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 podem ser adicionalmente deletados dos polipeptídeos descritos acima.

Até 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 ou 30 resíduos podem ser deletados, ou mais.

As variantes podem incluir fragmentos da SEQ ID NO: 2. Tais fragmentos retêm atividade que forma poro.

Os fragmentos podem ser de pelo menos 50, 100, 150 ou 200 aminoácidos no comprimento.

Tais fragmentos podem ser usados para produzir os poros.

Um fragmento preferivelmente compreende o domínio que forma poro da SEQ ID NO: 2. Os fragmentos devem incluir um dos resíduos 88, 90, 91, 105, 118 e 134 da SEQ ID NO: 2. Tipicamente, os fragmentos incluem todos os resíduos 88, 90, 91, 105, 118 e 134 da SEQ ID NO: 2. Um ou mais aminoácidos podem ser alternativa ou

44 / 106 adicionalmente adicionados aos polipeptídeos descritos acima.

Uma extensão pode ser fornecida no terminal amino ou terminal carbóxi da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 ou variante de polipeptídeo ou fragmento do mesmo.

A extensão pode ser muito curta, por exemplo de 1 a 10 aminoácidos no comprimento.

Alternativamente, a extensão pode ser mais longa, por exemplo até 50 ou 100 aminoácidos.

Uma proteína carregadora pode ser fundida a uma sequência de aminoácido de acordo com a invenção.

Outras proteínas de fusão são debatidas em mais detalhes abaixo.

Como debatido acima, uma variante é um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácido que varia daquela da SEQ ID NO: 2 e que retém a sua capacidade para formar um poro.

Uma variante tipicamente contém as regiões da SEQ ID NO: 2 que são responsáveis pela formação de poro.

A capacidade de formação de poro de Msp, que contém um tubo β, é fornecida pelas folhas β em cada subunidade.

Uma variante da SEQ ID NO: 2 tipicamente compreende as regiões na SEQ ID NO: 2 que formam folhas β.

Uma ou mais modificações podem ser feitas às regiões da SEQ ID NO: 2 que formam folhas β contanto que a variante resultante retenha a sua capacidade para formar um poro.

Uma variante da SEQ ID NO: 2 preferivelmente inclui uma ou mais modificações, tais como substituições, adições ou deleções, dentro das suas hélices α e/ou regiões de alça.

Os monômeros derivados de Msp podem ser modificados para ajudar na sua identificação ou purificação, por exemplo pela adição de resíduos de histidina (uma etiqueta hist), resíduos do ácido aspártico (uma etiqueta asp), uma etiqueta de estraptavidina ou uma etiqueta sinalizadora, ou pela adição de uma sequência de sinal para promover a sua secreção a partir de uma célula onde o polipeptídeo não contém naturalmente uma tal sequência.

Uma alternativa para introduzir uma etiqueta genética é reagir quimicamente uma etiqueta em uma posição nativa ou engendrada no poro.

Um exemplo disto seria reagir um reagente que muda para gel com uma

45 / 106 cisteína engendrada fora do poro.

Isto foi demonstrado como um método para separar hetero-oligômeros de hemolisina (Chem Biol.

Jul 1997; 4(7): 497- 505). O monômero derivado de Msp pode ser rotulado com uma etiqueta reveladora.

A etiqueta reveladora pode ser qualquer etiqueta adequada que permite que o poro seja detectado.

As etiquetas adequadas incluem, mas não são limitados a, moléculas fluorescentes, radioisótopos, por 125 exemplo, I, 35S, enzimas, anticorpos, antígenos, polinucleotídeos e ligantes tais como biotina.

O monômero derivado de Msp também pode ser produzido usando D-aminoácidos.

Por exemplo, o monômero derivado de Msp pode compreender uma mistura de L-aminoácidos e D-aminoácidos.

Isto é convencional na técnica para produzir tais proteínas ou peptídeos.

O monômero derivado de Msp contém uma ou mais modificações específicas para facilitar a descriminação de nucleotídeo.

O monômero derivado de Msp também pode conter outras modificações não específicas contanto que elas não interfiram com a formação de poro.

Várias modificações de cadeia lateral não específica são conhecidas na técnica e podem ser feitas às cadeias laterais do monômero derivado de Msp.

Tais modificações incluem, por exemplo, a alquilação redutiva de aminoácidos pela reação com um aldeído seguida pela redução com NaBH4, amidinação com metilacetimidato ou acilação com anidrido acético.

O monômero derivado de Msp pode ser produzido usando métodos padrão conhecidos na técnica.

O monômero derivado de Msp pode ser fabricado sinteticamente ou por meios recombinantes.

Por exemplo, o poro pode ser sintetizado pela tradução e transcrição in vitro (IVTT). Os métodos adequados para produzir poros são debatido nos Pedidos Internacionais Nos.

PCT/GB09/001690 (publicado como WO 2010/004273), PCT/GB09/001679 (publicado como WO 2010/004265) ou

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PCT/GB10/000133 (publicado como WO 2010/086603). Os métodos para inserir poros em membranas são debatidos abaixo.

Para o Sequenciamento da Exonuclease, o poro de proteína de transmembrana é preferivelmente derivado de α-hemolisina (α-HL). O poro de α-HL tipo selvagem é formado de sete monômeros ou subunidades idênticos (isto é, ele é heptamérico). A sequência de um monômero ou subunidade de α-hemolisina M113R é mostrada na SEQ ID NO: 4. O poro de proteína de transmembrana preferivelmente compreende sete monômeros cada um compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma variante da mesma.

Os aminoácidos 1, de 7 a 21, de 31 a 34, de 45 a 51, de 63 a 66, 72, de 92 a 97, de 104 a 111, de 124 a 136, de 149 a 153, de 160 a 164, de 173 a 206, de 210 a 213, 217, 218, de 223 a 228, de 236 a 242, de 262 a 265, de 272 a 274, de 287 a 290 e 294 da SEQ ID NO: 4 formam regiões de alça.

Os resíduos 113 e 147 da SEQ ID NO: 4 formam parte de uma constrição do tubo ou canal de α-HL.

Em tais formas de realização, um poro que compreende sete proteínas ou monômeros cada um compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma variante da mesma são preferivelmente usadas no método da invenção.

As sete proteínas podem ser as mesmas (homoheptâmero) ou diferentes (heteroheptâmero). Uma variante da SEQ ID NO: 4 é uma proteína que tem uma sequência de aminoácido que varia daquela da SEQ ID NO: 4 e que retém a sua capacidade de formação de poro.

A capacidade de uma variante para formar um poro pode ser ensaiada usando qualquer método conhecido na técnica.

Por exemplo, a variante pode ser inserida dentro de uma bicamada de lipídeo junto com outras subunidades apropriadas e a sua capacidade para oligomerizar para formar um poro pode ser determinada.

Os métodos são conhecidos na técnica para inserir subunidades dentro de membranas, tais como bicamadas de lipídeo.

Os métodos adequados são debatidos acima.

47 / 106 A variante pode incluir modificações que facilitam a ligação covalente a ou interação com uma proteína que liga ácido nucleico. A variante preferivelmente compreende um ou mais resíduos de cisteína reativos que facilitam a ligação à proteína que liga ácido nucleico. Por exemplo, a variante pode incluir uma cisteína em uma ou mais das posições 8, 9, 17, 18, 19, 44, 45, 50, 51, 237, 239 e 287 e/ou no terminal amino ou carbóxi da SEQ ID NO:

4. As variantes preferidas compreendem uma substituição do resíduo nas posições 8, 9, 17, 237, 239 e 287 da SEQ ID NO: 4 com cisteína (A8C, T9C, N17C, K237C, S239C ou E287C). A variante é preferivelmente qualquer uma das variantes descritas no Pedido Internacional No. PCT/GB09/001690 (publicado como WO 2010/004273), PCT/GB09/001679 (publicado como WO 2010/004265) ou PCT/GB10/000133 (publicado como WO 2010/086603). A variante também pode incluir modificações que facilitam qualquer interação com nucleotídeos ou facilitam a orientação de um adaptador molecular como debatido abaixo. A variante também pode conter modificações que facilitam a ligação covalente de um adaptador molecular. Em particular, a variante preferivelmente contém uma glutamina na posição 139 da SEQ ID NO: 4. A variante preferivelmente tem uma cisteína na posição 119, 121 ou 135 da SEQ ID NO: 4. Uma variante da SEQ ID NO: 4 pode ter a metionina do tipo selvagem reintroduzida na posição 113. As variantes preferidas da SEQ ID NO: 4 têm uma metionina na posição 113 (R113M), uma cisteína na posição 135 (L135C) e uma glutamina na posição 139 (N139Q). Outras variantes preferidas da SEQ ID NO: 4 têm uma metionina na posição 113 (R113M) e uma glutamina na posição 139 (N139Q). Uma tal variante é mostrada na SEQ ID NO: 34. Um poro de proteína de transmembrana preferido para o uso no Sequenciamento de Exonuclease compreende (a) um monômero que compreende uma variante

48 / 106 da SEQ ID NO: 4 tendo uma metionina na posição 113 (R113M), uma cisteína na posição 135 (L135C) e uma glutamina na posição 139 (N139Q) e (b) seis monômeros cada um compreendendo uma variante da SEQ ID NO: 4 tendo uma metionina na posição 113 (R113M) e uma glutamina na posição 139 (N139Q). Os seis monômeros em (b) cada um preferivelmente compreende a sequência mostrada na SEQ ID NO: 34. A variante pode ser uma variante de ocorrência natural que é expressada naturalmente por um organismo, por exemplo por uma bactéria Staphilococcus.

Alternativamente, a variante pode ser expressada in vitro ou recombinantemente por uma bactéria tal como Escherichia coli.

As variantes também incluem variantes de ocorrência não natural produzidas pela tecnologia recombinante.

No comprimento inteiro da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, uma variante preferivelmente será pelo menos 50 % homóloga a esta sequência com base na identidade de aminoácido.

Mais preferivelmente, o polipeptídeo variante pode ser pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % e mais preferivelmente pelo menos 95 %, 97 % ou 99 % homólogo com base na identidade de aminoácido com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 na sequência inteira.

Pode ter pelo menos 80 %, por exemplo pelo menos 85 %, 90 % ou 95 %, de identidade de aminoácido em relação a um trecho de 200 ou mais, por exemplo 230, 250, 270 ou 280 ou mais, aminoácidos contíguos (“homologia difícil”). A homologia pode ser determinada como debatido acima.

As substituições de aminoácido podem ser feitas à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 além daquelas debatidas acima, por exemplo até 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 ou 30 substituições.

As substituições conservativas podem ser feitas como debatido acima.

Um ou mais resíduos de aminoácido da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 podem ser adicionalmente deletados dos

49 / 106 polipeptídeos descritos acima.

Até 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 ou 30 resíduos podem ser deletados, ou mais.

As variantes podem ser fragmentos da SEQ ID NO: 4. Tais fragmentos retêm a atividade que forma poro.

Os fragmentos podem ser de pelo menos 50, 100, 200 ou 250 aminoácidos no comprimento.

Um fragmento preferivelmente compreende o domínio que forma poro da SEQ ID NO: 4. Os fragmentos tipicamente incluem os resíduos 119, 121, 135, 113 e 139 da SEQ ID NO: 4. Um ou mais aminoácidos podem ser alternativa ou adicionalmente adicionados aos polipeptídeos descritos acima.

Uma extensão pode ser fornecida no terminal amino ou terminal carbóxi da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 ou uma variante ou fragmento da mesma.

A extensão pode ser muito curta, por exemplo de 1 a 10 aminoácidos no comprimento.

Alternativamente, a extensão pode ser mais longa, por exemplo até 50 ou 100 aminoácidos.

Uma proteína carregadora pode ser fundida a uma subunidade ou variante.

Um ou mais aminoácidos podem ser alternativa ou adicionalmente adicionados aos polipeptídeos descritos acima.

Uma extensão pode ser fornecida no terminal amino ou terminal carbóxi da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 ou uma variante ou fragmento do mesmo.

A extensão pode ser muito curta, por exemplo de 1 a 10 aminoácidos no comprimento.

Alternativamente, a extensão pode ser mais longa, por exemplo até 50 ou 100 aminoácidos.

Uma proteína carregadora pode ser fundida a um poro ou variante.

Como debatido acima, uma variante da SEQ ID NO: 4 é uma subunidade que tem uma sequência de aminoácido que varia daquela da SEQ ID NO: 4 e que retém a sua capacidade para formar um poro.

Uma variante tipicamente contém as regiões da SEQ ID NO: 4 que são responsáveis pela formação de poro.

A capacidade de formação de poro de α-HL, que contém

50 / 106 um tubo β, é fornecida pelos filamentos β em cada subunidade.

Uma variante da SEQ ID NO: 4 tipicamente compreende as regiões na SEQ ID NO: 4 que formam filamentos β.

Os aminoácidos da SEQ ID NO: 4 que formam filamentos β são debatidos acima.

Uma ou mais modificações podem ser feitas às regiões da SEQ ID NO: 4 que forma filamentos β contanto que a variante resultante retenha a sua capacidade para formar um poro.

As modificações específicas que podem ser feitas às regiões de filamento β da SEQ ID NO: 4 são debatidas acima.

Uma variante da SEQ ID NO: 4 preferivelmente inclui uma ou mais modificações, tais como substituições, adições ou deleções, dentro das suas hélices α e/ou regiões de alça.

Os aminoácidos que formam hélices α e alças são debatidos acima.

A variante pode ser modificada para ajudar na sua identificação ou purificação como debatido acima.

Um poro particularmente preferido para o uso no Sequenciamento de Exonuclease compreende uma subunidade mostrada na SEQ ID NO: 36 (isto é, α-HL-E287C-QC-D5FLAGH6) e seis subunidades mostradas na SEQ ID NO: 34 (isto é, α-HL-Q). Os poros derivados de α-HL podem ser fabricados como debatido acima com referência aos poros derivados de Msp.

Em algumas formas de realização, o poro de proteína de transmembrana é quimicamente modificado.

O poro pode ser quimicamente modificado em qualquer modo e em qualquer sítio.

O poro de proteína de transmembrana é de modo preferível quimicamente modificado pela ligação de uma molécula a uma ou mais cisteínas (ligação de cisteína), ligação de uma molécula a uma ou mais lisinas, ligação de uma molécula a um ou mais aminoácidos não naturais, modificação enzimática de um epítopo ou modificação de um terminal.

Os métodos adequados para realizar tais modificações são bem conhecidos na técnica.

O poro de proteína de

51 / 106 transmembrana pode ser quimicamente modificado pela ligação de qualquer molécula.

Por exemplo, o poro pode ser quimicamente modificado pela ligação de um corante ou um fluoróforo.

Qualquer número dos monômeros no poro pode ser quimicamente modificado.

Um ou mais, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, dos monômeros são de modo preferível quimicamente modificados como debatido acima.

Em algumas formas de realização, o poro de proteína de transmembrana compreende um adaptador molecular que facilita a detecção do analito.

Os poros para o uso no Sequenciamento de Exonuclease tipicamente compreendem um adaptador molecular.

O adaptador molecular pode diretamente facilitar a detecção do analito pela mediação de uma interação entre o poro e o analito.

Em tais formas de realização, a presença do adaptador melhora a química do hospedeiro-hóspede do poro e do analito e deste modo melhora a capacidade do poro para detectar o analito.

Os princípios da química do hospedeiro- hóspede são bem conhecidos na técnica.

O adaptador tem um efeito sobre as propriedades físicas ou químicas do poro que melhora a sua interação com o analito.

O adaptador pode alterar a carga do tubo ou canal do poro ou especificamente interage com ou se liga ao analito facilitando deste modo a sua interação com o poro.

Em outras formas de realização, o adaptador molecular indiretamente facilita a detecção do analito pela mediação de uma interação entre o poro e um produto, tal como um fragmento, formado a partir do processamento do analito.

Por exemplo, para o Sequenciamento de Exonuclease, o adaptador molecular facilita uma interação entre o poro e nucleotídeos individuais digeridos do analito de polinucleotídeo.

Em tais formas de realização, a presença do adaptador melhora a química do hospedeiro-hóspede do poro e os nucleotídeos individuais e deste modo

52 / 106 melhora a capacidade do poro para detectar os nucleotídeos individuais.

O adaptador tem um efeito sobre as propriedades físicas ou químicas do poro que melhoram a sua interação com os nucleotídeos individuais.

O adaptador pode alterar a carga do tubo ou canal do poro ou especificamente interagir com ou ligar-se aos nucleotídeos individuais facilitando deste modo a sua interação com o poro.

O adaptador molecular é preferivelmente uma molécula cíclica tal como uma ciclodextrinaa, uma espécie que é capaz de hibridização, um ligante ou interquelante de DNA, um peptídeo ou análogo de peptídeo, um polímero sintético, uma molécula planar aromática, uma molécula pequena positivamente carregada ou uma molécula pequena capaz de ligar hidrogênio.

O adaptador pode ser cíclico.

Um adaptador cíclico preferivelmente tem a mesma simetria como o poro.

O adaptador preferivelmente tem simetria de oito vezes se o poro é derivado de Msp visto que Msp tipicamente tem oito subunidades em torno de um eixo central.

O adaptador preferivelmente tem simetria de sete vezes se o poro é derivado de α-HL visto que α-HL tipicamente tem sete subunidades em torno de um eixo central.

Isto é debatido em mais detalhes abaixo.

O adaptador tipicamente interage com o analito por intermédio da química do hospedeiro-hóspede.

O adaptador é tipicamente capaz de interagir com um nucleotídeo ou polinucleotídeo.

O adaptador compreende um ou mais grupos químicos que são capazes de interagir com o analito, tal como o nucleotídeo ou polinucleotídeo.

O um ou mais grupos químicos preferivelmente interagem com o analito, nucleotídeo ou polinucleotídeo pelas interações não covalentes, tais como interações hidrofóbicas, de ligação de hidrogênio, forças de Van der Waal, interações de cátion π e/ou forças eletrostáticas.

O um ou mais grupos químicos que são capazes de interagir com o nucleotídeo ou polinucleotídeo são preferivelmente positivamente carregados.

O um ou mais grupos químicos que são capazes de interagir com

53 / 106 o nucleotídeo ou polinucleotídeo mais preferivelmente compreendem grupos amino.

Os grupos amino podem ser ligados aos átomos de carbono primários, secundários ou terciários.

O adaptador ainda mais preferivelmente compreende um anel de grupos amino, tais como um anel de 6, 7 ou 8 grupos amino.

O adaptador mais preferivelmente compreende um anel de sete ou oito grupos amino.

Um anel de grupos amino protonados pode interagir com grupos fosfato negativamente carregados no nucleotídeo ou polinucleotídeo.

O posicionamento correto do adaptador dentro do poro pode ser facilitado pela química do hospedeiro-hóspede entre o adaptador e o poro.

O adaptador preferivelmente compreende um ou mais grupos químicos que são capazes de interagir com um ou mais aminoácidos no poro.

O adaptador mais preferivelmente compreende um ou mais grupos químicos que são capazes de interagir com um ou mais aminoácidos no poro por intermédio das interações não covalentes, tais como interações hidrofóbicas, de ligação de hidrogênio, forças de Van der Waal, interações de cátion π e/ou forças eletrostáticas.

Os grupos químicos que são capazes de interagir com um ou mais aminoácidos no poro são tipicamente hidroxilas ou aminas.

Os grupos hidroxila podem ser ligados aos átomos de carbono primários, secundários ou terciários.

Os grupos hidroxila podem formar ligações de hidrogênio com aminoácidos não carregados no poro.

Qualquer adaptador que facilite a interação entre o poro e o nucleotídeo ou polinucleotídeo pode ser usado.

Os adaptadores adequados incluem, mas não são limitados a, ciclodextrinaas, peptídeos cíclico e cucurbiturilas.

O adaptador é preferivelmente uma ciclodextrinaa ou um derivado do mesmo.

A ciclodextrinaa ou derivado da mesma podem ser qualquer um daqueles divulgados em Eliseev, A.

V., e Schneider, H-J. (1994) J.

Am.

Chem.

Soc. 116, 6081-6088. O adaptador é mais preferivelmente heptacis-6-amino-β- ciclodextrinaa (am7-βCD), 6-monodesóxi-6-monoamino-β-ciclodextrina (am1- βCD) ou heptacis-(6-desóxi-6-guanidino)-ciclodextrina (gu7-βCD). O grupo

54 / 106 guanidino em gu7-βCD tem um pKa muito mais alto do que as aminas primárias em am7-βCD e assim mais positivamente carregados. este adaptador gu7-βCD pode ser usado para aumentar o tempo de residência do nucleotídeo no poro, para aumentar a precisão da corrente residual medida, assim como para aumentar a taxa de detecção base em altas temperaturas ou taxas de aquisição de dados baixa.

Se um reticulador de 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidila (SPDP) é usado como debatido em mais detalhes abaixo, o adaptador é preferivelmente heptacis(6-desóxi-6-amino)-6-N-mono(2- piridil)ditiopropanoil-β-ciclodextrina (am6amPDP1-βCD). Os adaptadores mais adequados incluem γ-ciclodextrinas, que compreendem 8 unidades de açúcar (e portanto têm simetria de oito vezes). A γ-ciclodextrina pode conter uma molécula ligante ou pode ser modificada para compreender todas ou mais das unidades de açúcar modificadas usadas nos exemplos de β-ciclodextrina debatidos acima.

O adaptador molecular é de modo preferível covalentemente ligado ao poro.

O adaptador pode ser covalentemente ligado ao poro usando qualquer método conhecido na técnica.

O adaptador é tipicamente ligado por intermédio da ligação química.

Se o adaptador molecular é ligado por intermédio da ligação de cisteína, a uma ou mais cisteínas foram preferivelmente introduzidas ao mutante pela substituição.

Como debatido acima, os monômeros derivados de Msp podem compreender um resíduo de cisteína em uma ou mais das posições 88, 90, 91, 103 e 105. Cada monômero no poro pode ser quimicamente modificado pela ligação de um adaptador molecular a um ou mais, tais como 2, 3, 4 ou 5, destas cisteínas.

Alternativamente, o monômero pode ser quimicamente modificado pela ligação de uma molécula a uma ou mais cisteínas introduzidas em outras posições.

O adaptador molecular é preferivelmente ligado a uma ou mais das posições 90, 91 e 103 da SEQ ID NO: 2.

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Para os poros derivados de α-HL, a orientação correta do adaptador dentro do tubo ou canal do poro e a ligação covalente do adaptador ao poro pode ser facilitado usando modificações específicas para o poro.

Em particular, cada subunidade do poro preferivelmente tem a glutamina na posição 139 da SEQ ID NO: 2. Uma ou mais das subunidades do poro podem ter uma arginina na posição 113 da SEQ ID NO: 2. Uma ou mais das subunidades do poro podem ter uma cisteína na posição 119, 121 ou 135 da SEQ ID NO: 2 para facilitar a ligação do adaptador molecular ao poro.

A reatividade dos resíduos de cisteína podem ser realçadas pela modificação dos resíduos adjacentes.

Por exemplo, os grupos básicos de resíduos flanqueadores de arginina, histidina ou lisina mudarão o pKa das cisteínas do grupo tiol para aquelas do grupo S- mais reativas.

A reatividade dos resíduos de cisteína pode ser protegida pelos grupos protetivos de tiol tais como dTNB.

Estes podem ser reagidos com um ou mais resíduos de cisteína do poro antes que um ligante seja ligado.

A molécula (com a qual o poro é quimicamente modificado) pode ser ligada diretamente ao poro ou ligada via um ligante como divulgado nos Pedidos Internacionais Nos.

PCT/GB09/001690 (publicado como WO 2010/004273), PCT/GB09/001679 (publicado como WO 2010/004265) ou PCT/GB10/000133 (publicado como WO 2010/086603). Em uma forma de realização preferida, o detector compreende uma proteína que liga polinucleotídeo.

Isto permite que o método da invenção seja usado para sequenciar polinucleotídeos ou ácidos nucleicos.

Os polinucleotídeos são definidos abaixo.

Os exemplos de proteínas que ligam polinucleotídeo incluem, mas não são limitados a, enzimas que tratam ácido nucleico, tais como nucleases, polimerases, topoisomerases, ligases e helicases, e não proteínas de ligação catalítica tais como aquelas classificadas pela SCOP (Structural Classification of Proteins) sob a superfamília da proteína que liga ácido nucleico (50249). A proteína de ligação de

56 / 106 polinucleotídeo é preferivelmente modificada para remover e/ou substituir resíduos de cisteína como descrito no Pedido Internacional No.

PCT/GB10/000133 (publicado como WO 2010/086603). Uma proteína de ligação de polinucleotídeo preferida é derivada da Phi29 polimerase.

A proteína preferivelmente compreende a sequência mostrada na SEQ ID NO: 6 ou uma variante da mesma.

Isto é debatido em mais detalhes abaixo.

Outras proteínas que ligam polinucleotídeo preferidas para o uso na invenção incluem exonuclease I da E. coli (SEQ ID NO: 8), enzima da exonuclease III da E. coli (SEQ ID NO: 10), RecJ da T. thermophilus (SEQ ID NO: 12) e exonuclease de bacteriófago lambda (SEQ ID NO: 14) e variantes das mesmas.

Três subunidades idênticas da SEQ ID NO: 14 interagem para formar uma exonuclease trimérica.

A variante é preferivelmente modificada para facilitar a ligação à proteína de membrana e pode ser qualquer uma daquelas debatidas no Pedido Internacional No.

PCT/GB09/001679 (publicado como WO 2010/004265) ou PCT/GB10/000133 (publicado como WO 2010/086603). A proteína pode ser qualquer uma das SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 e 50 descritas no Pedido Internacional No.

PCT/GB10/000133 (publicado como WO 2010/086603) ou uma variante das mesmas debatidas neste Pedido Internacional.

A proteína de ligação de polinucleotídeo pode ser ligada ao poro em qualquer maneira e é preferivelmente ligada como descrito no Pedido Internacional No.

PCT/GB09/001679 (publicado como WO 2010/004265) ou PCT/GB10/000133 (publicado como WO 2010/086603). O detector preferivelmente compreende uma proteína que liga polinucleotídeo além de um poro de proteína de transmembrana.

Tais detectores formam sistemas de sequenciamento modular que podem ser usados nos métodos de sequenciamento da invenção.

A proteína de ligação de polinucleotídeo pode estar ligada ao poro, mas não é obrigada a ser.

No Sequenciamento de Exonuclease, o polinucleotídeo alvo é

57 / 106 deixado interagir com uma exonuclease presente no detector.

A exonuclease é tipicamente ligada ao poro no detector.

No Sequenciamento de Filamento, o detector tipicamente compreende uma polimerase além do poro.

O polinucleotídeo alvo é deixado interagir com a polimerase, tal como a Phi29 polimerase, presente no detector.

A polimerase e o poro tipicamente não são ligados juntos, mas juntos formam o detector.

Para o Sequenciamento de Exonuclease, a exonuclease é de modo preferível covalentemente ligada ao poro de proteína de transmembrana.

A exonuclease pode ser covalentemente ligada ao poro usando qualquer método conhecido na técnica.

O poro e a proteína podem ser quimicamente fundidos ou geneticamente fundidos.

O poro e a exonuclease são geneticamente fundidos se a construção inteira for expressada a partir de uma única sequência de polinucleotídeo.

A fusão genética de um poro a uma exonuclease é debatida no Pedido Internacional No.

PCT/GB09/001679 (publicado como WO 2010/004265). Se a exonuclease é ligada ao poro por intermédio da ligação de cisteína, a uma ou mais cisteínas foram preferivelmente introduzidas ao poro pela substituição.

Os poros derivados de Msp podem naturalmente compreender resíduos de cisteína em uma ou mais das posições de 10 a 15, de 51 a 60, de 136 a 139 e de 168 a 172. Estas posições estão presentes nas regiões de alça que têm conservação baixa entre os homólogos indicando que as mutações ou inserções podem ser toleradas.

Elas são portanto adequadas para ligar uma exonuclease.

A reatividade dos resíduos de cisteína pode ser realçada pela modificação como descrito acima.

A exonuclease pode ser ligada diretamente ao poro ou via um ou mais ligantes.

A exonuclease pode ser ligada ao poro usando os ligantes de hibridização descritos no Pedido Internacional No.

PCT/GB10/000132 (publicado como WO 2010/086602). Alternativamente, os ligantes de peptídeo podem ser usados.

Os ligantes de peptídeo são sequências de

58 / 106 aminoácido.

O comprimento, flexibilidade e hidrofilicidade do ligante de peptídeo são tipicamente designadas de modo que o mesmo não perturbe as funções do poro e a exonuclease.

Os ligantes de peptídeo flexíveis preferidos são trechos de 2 a 20, tais como 4, 6, 8, 10 ou 16, aminoácidos de serina e/ou glicina.

Os ligantes flexíveis mais preferidos incluem (SG)1, (SG)2, (SG)3, (SG)4, (SG)5 e (SG)8 em que S é serina e G é glicina.

Os ligantes rígidos preferidos são trechos de 2 a 30, tal como 4, 6, 8, 16 ou 24, aminoácidos de prolina.

Os ligantes rígidos mais preferidos incluem (P)12 em que P é prolina.

O detector pode compreender um poro de proteína de transmembrana quimicamente modificado com um adaptador molecular e uma exonuclease.

Tais detectores são úteis para o Sequenciamento de Exonuclease.

Para o Sequenciamento de Exonuclease, o detector mais preferido compreende (a) um poro derivado de α-HL, (b) uma exonuclease covalentemente ligada ao poro e (c) uma ciclodextrina ou um derivado da mesma.

Nesta forma de realização preferida, o poro preferivelmente compreende uma subunidade mostrada na SEQ ID NO: 36 (isto é, α-HL- E287C-QC-D5FLAGH6) e seis subunidades mostradas na SEQ ID NO: 34 (isto é, α-HL-Q). A exonuclease é preferivelmente a exonuclease I da E. coli (SEQ ID NO: 8) ou uma variante da mesma.

O derivado de ciclodextrina é preferivelmente heptacis-6-amino-β-ciclodextrina (am7-βCD), 6-monodesóxi- 6-monoamino-β-ciclodextrina (am1-βCD) ou heptacis-(6-desóxi-6- guanidino)-ciclodextrina (gu7-βCD). Para o sequenciamento de filamento, um detector preferido compreende (a) um poro derivado de Msp e (b) uma Phi29 polimerase.

O poro e a polimerase não são ligados juntos.

Esta forma de realização preferida é debatida em mais detalhes abaixo.

O detector pode estar presente como um detector individual ou único.

Alternativamente, o detector pode estar presente em uma população

59 / 106 homóloga ou heteróloga de dois ou mais detectores.

Polinucleotídeo Um polinucleotídeo, tal como um ácido nucleico, é uma macromolécula que compreende dois ou mais nucleotídeos.

O polinucleotídeo ou ácido nucleico ligado pela proteína pode compreender qualquer combinação de qualquer nucleotídeo.

Os nucleotídeos podem ser de ocorrência natural ou artificial.

O nucleotídeo pode ser oxidado ou metilado.

Um ou mais nucleotídeos no polinucleotídeo podem ser danificados.

Por exemplo, o polinucleotídeo pode compreender um dímero de pirimidina.

Tais dímeros estão tipicamente associados com o dano pela luz ultravioleta e são a causa primária de melanomas de pele.

Um nucleotídeo tipicamente contém uma nucleobase, um açúcar e pelo menos um grupo fosfato.

A nucleobase é tipicamente heterocíclica.

As nucleobases incluem, mas não são limitadas a, purinas e pirimidinas e mais especificamente adenina, guanina, timina, uracila e citosina.

O açúcar é tipicamente um açúcar de pentose.

Os açúcares de nucleotídeo incluem, mas não são limitados a, ribose e desoxirribose.

O nucleotídeo é tipicamente um ribonucleotídeo ou desoxirribonucleotídeo.

O nucleotídeo tipicamente contém um monofosfato, difosfato ou trifosfato.

Os fosfatos podem ser ligados no lado 5’ ou 3’ de um nucleotídeo.

Os nucleotídeos incluem, mas não são limitados a, monofosfato de adenosina (AMP), difosfato de adenosina (ADP), trifosfato de adenosina (ATP), monofosfato de guanosina (GMP), difosfato de guanosina (GDP), trifosfato de guanosina (GTP), monofosfato de timidina (TMP), difosfato de timidina (TDP), trifosfato de timidina (TTP), monofosfato de uridina (UMP), difosfato de uridina (UDP), trifosfato de uridina (UTP), monofosfato de citidina (CMP), difosfato de citidina (CDP), trifosfato de citidina (CTP), monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), monofosfato de guanosina cíclico (cGMP), monofosfato de desoxiadenosina (dAMP),

60 / 106 difosfato de desoxiadenosina (dADP), trifosfato de desoxiadenosina (dATP), monofosfato de desoxiguanosina (dGMP), difosfato de desoxiguanosina (dGDP), trifosfato de desoxiguanosina (dGTP), monofosfato de desoxitimidina (dTMP), difosfato de desoxitimidina (dTDP), trifosfato de desoxitimidina (dTTP), monofosfato de desoxiuridina (dUMP), difosfato de desoxiuridina (dUDP), trifosfato de desoxiuridina (dUTP), monofosfato de desoxicitidina (dCMP), difosfato de desoxicitidina (dCDP) e trifosfato de desoxicitidina (dCTP). Os nucleotídeos são preferivelmente selecionados de AMP, TMP, GMP, CMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP ou dCMP.

Um nucleotídeo pode conter um açúcar e pelo menos um grupo fosfato (isto é, carece de uma nucleobase). Os nucleotídeos no polinucleotídeo podem estar ligados entre si em qualquer maneira.

Os nucleotídeos são tipicamente ligados pelo açúcar e grupos fosfato como nos ácidos nucleicos.

Os nucleotídeos podem ser conectados por intermédio das suas nucleobases como nos dímeros de pirimidina.

O polinucleotídeo pode ser de filamento único ou de filamento duplo.

Pelo menos uma porção do polinucleotídeo é preferivelmente de filamento duplo.

Um polinucleotídeo de filamento único pode ter um ou mais iniciadores hibridizados a ele e consequentemente compreender uma ou mais regiões curtas de polinucleotídeo de filamento duplo.

Os iniciadores podem ser do mesmo tipo de polinucleotídeo como o polinucleotídeo alvo ou pode ser um tipo diferente de polinucleotídeo.

O polinucleotídeo pode ser um ácido nucleico, tal como ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA). O polinucleotídeo pode ser qualquer ácido nucleico sintético conhecido na técnica, tal como ácido nucleico de peptídeo (PNA), ácido nucleico de glicerol (GNA), ácido nucleico de treose (TNA), ácido nucleico travado (LNA) ou outros polímeros sintéticos com cadeias laterais de nucleotídeo.

O polinucleotídeo ligado pela

61 / 106 proteína é preferivelmente de filamento único, tal como cDNA, RNA, GNA, TNA ou LNA.

O polinucleotídeo ligado pela proteína é preferivelmente de filamento duplo, tal como DNA.

As proteínas que ligam polinucleotídeos de filamento único podem ser usados para sequenciar DNA de filamento duplo contanto que o DNA de filamento duplo esteja dissociado em um filamento único antes que o mesmo seja ligado pela proteína.

Se o método de Sequenciamento de Filamento da invenção é usado o analito de polinucleotídeo tipicamente contém uma porção que é de filamento duplo embora no geral apenas um filamento seja sequenciado.

Em um iniciador/configuração padrão, o filamento padrão é tipicamente sequenciado (isto é, 5’ passando no poro). Em qualquer caso, para o sequenciamento de filamento, um polinucleotídeo de filamento duplo preferivelmente compreende uma sequência líder de filamento único.

A sequência líder pode ser de qualquer comprimento, mas é tipicamente de 27 a 150 nucleotídeos no comprimento, tal como de 50 a 150 nucleotídeos no comprimento.

A adição de seções de polinucleotídeo de filamento único a um polinucleotídeo de filamento duplo pode ser realizada de vários modos.

Uma ligação química ou enzimática pode ser feita.

Além disso, o método Nextera pela Epicentre é adequado.

Foi desenvolvido um método de PCR usando um iniciador de sentido que, como usual contém uma seção complementar para o início da região alvo de DNA genômico, mas foi adicionalmente precedido com uma seção de 50 poliT.

Para prevenir a polimerase de estender o filamento complementar oposto à seção de poliT e deste modo criar um produto de PCR de extremidade abrupta (como é normal), quatro sítios abásicos foram adicionados entre a seção poliT e a seção de imprimação complementar.

Estes sítios abásicos impedirão a polimerase de se estender além desta região e assim a seção poliT permanecerá como 5’ DNA de filamento único em cada uma das cópias amplificadas.

62 / 106

Absorção pelo nanoporo Se o detector compreende um poro, o método da invenção preferivelmente compreende ainda deixar o analito interagir com o detector e medir a corrente que passa através do poro durante a interação e determinar deste modo a presença ou ausência ou características do analito.

O analito está presente se a corrente flui através do poro em uma maneira específica para o analito (isto é, se uma corrente distintiva associada com o analito é detectada fluindo através do poro). O analito está ausente se a corrente não flui através do poro em um maneira específica para o analito.

Similarmente, as características do analito podem ser determinadas usando a corrente que flui através do poro durante a interação.

A invenção portanto envolve a absorção pelo nanoporo de um analito.

A invenção pode ser usada para diferenciar analitos de estrutura similar com base nos diferentes efeitos que eles têm sobre a corrente que passa através do poro.

A invenção também pode ser usada para medir a concentração de um analito particular em uma amostra.

A invenção também podem ser usada em um sensor que usa muitos ou milhares de poros em aplicações de absorção em massa.

O método pode ser realizado usando qualquer sistema de membrana adequado (tal como uma camada anfifílica ou uma bicamada de lipídeo) em que um poro é inserido dentro de uma membrana.

O método é tipicamente realizado usando (i) uma membrana artificial (tal como uma camada anfifílica ou uma bicamada de lipídeo) que compreende um poro, (ii) uma bicamada de lipídeo isolado, de ocorrência natural que compreende um poro, ou (iii) uma célula tendo um poro inserido nela.

O método é preferivelmente realizado usando uma membrana artificial (tal como uma camada anfifílica ou uma bicamada de lipídeo). A membrana pode compreender outras proteínas de transmembrana e/ou intramembrana assim como outras moléculas além do poro.

O aparelho e as condições adequados

63 / 106 são debatidos abaixo com referência às formas de realização de sequenciamento da invenção.

O método da invenção é tipicamente realizado in vitro.

Durante a interação entre o analito e o poro, o analito afeta a corrente que flui através do poro em um maneira específica para aquele analito.

Por exemplo, um analito particular reduzirá a corrente que flui através do poro para um período de tempo médio particular e a um grau particular.

Em outras palavras, a corrente que flui através do poro é distintiva para um analito particular.

Os experimentos de controle podem ser realizados para determinar o efeito que um analito particular tem sobre a corrente que flui através do poro.

Os resultados de realizar o método da invenção sobre uma amostra de teste pode ser depois comparados com aqueles derivados de um tal experimento de controle de modo a identificar um analito particular na amostra, determinar se um analito particular está presente na amostra ou determinar as características do analito.

A frequência na qual a corrente que flui através do poro é afetada em um maneira indicativa de um analito particular pode ser usada para determinar a concentração deste analito na amostra.

Métodos de sequenciamento de polinucleotídeos A presente invenção também fornece métodos de estimar a sequência de um analito que é um polinucleotídeo alvo.

A presente invenção também fornece métodos de sequenciamento de um analito que é um polinucleotídeo alvo.

Um polinucleotídeo é uma macromolécula que compreende dois ou mais nucleotídeos.

Os nucleotídeos podem ser qualquer um daqueles debatidos acima, incluindo nucleotídeos metilados, oxidados e danificados.

O polinucleotídeo pode ser qualquer um daqueles debatidos acima e é preferivelmente um ácido nucleico.

Estes métodos são possíveis porque o poro das proteínas de transmembrana pode ser usado para diferenciar nucleotídeos de estrutura

64 / 106 similar com base nos efeitos diferentes que eles têm sobre a corrente que passa através do poro.

Nucleotídeos individuais podem ser identificados ao nível de molécula única a partir da sua amplitude de corrente quando eles interagem com o poro.

O nucleotídeo está presente no poro (individualmente ou como parte de um polinucleotídeo) se a corrente flui através do poro em uma maneira específica para o nucleotídeo (isto é, se uma corrente distintiva associada com o nucleotídeo é detectada fluindo através do poro). A identificação sucessiva dos nucleotídeos em um polinucleotídeo alvo permite que a sequência do polinucleotídeo seja determinada.

Em uma forma de realização, o método compreende (a) ligar o polinucleotídeo alvo a uma membrana; (b) deixar o polinucleotídeo alvo interagir com um detector presente na membrana, em que o detector compreende um poro de transmembrana e uma exonuclease, de modo que a exonuclease digira um nucleotídeo individual de uma extremidade do polinucleotídeo alvo; (c) deixar o nucleotídeo interagir com o poro; (d) medir a corrente que passa através do poro durante a interação e determinar deste modo a identidade do nucleotídeo; e (e) repetir as etapas de (b) a (d) na mesma extremidade do polinucleotídeo alvo e determinar deste modo a sequência do polinucleotídeo alvo.

Em uma outra forma de realização, o método compreende (a) ligar o polinucleotídeo alvo a uma membrana; (b) deixar o polinucleotídeo alvo interagir com um detector presente na membrana, em que o detector compreende um poro de proteína de transmembrana, um adaptador molecular que facilita uma interação entre o poro e um ou mais nucleotídeos e uma exonuclease, de modo que a exonuclease digira um nucleotídeo individual de uma extremidade do polinucleotídeo alvo; (c) deixar o nucleotídeo interagir com o adaptador; (d) medir a corrente que passa através do poro durante a interação e determinar deste modo a identidade do nucleotídeo; e (e) repetir as etapas de (b) a (d) na mesma extremidade do polinucleotídeo alvo e determinar deste modo a

65 / 106 sequência do polinucleotídeo alvo.

Consequentemente, o método envolve a absorção pelo nanoporo de uma proporção dos nucleotídeos em um polinucleotídeo alvo em uma maneira sucessiva de modo a sequenciar o polinucleotídeo alvo.

Os nucleotídeos individuais são descritos acima e abaixo.

Isto é o Sequenciamento de Exonuclease.

Em uma outra forma de realização, o método compreende: (a) ligar o polinucleotídeo alvo a uma membrana; (b) deixar o polinucleotídeo alvo interagir com um detector presente na membrana, em que o detector compreende um poro de transmembrana, de modo que o polinucleotídeo alvo mova-se através do poro; e (c) medir a corrente que passa através do poro conforme o polinucleotídeo alvo se move com relação ao poro e determinar deste modo a sequência do polinucleotídeo alvo.

Em uma outra forma de realização, o método compreende (a) ligar o polinucleotídeo alvo a uma membrana; (b) deixar o polinucleotídeo alvo interagir com um detector presente na membrana, em que o detector compreende um poro de proteína de transmembrana e uma proteína que liga polinucleotídeo, preferivelmente uma polimerase, de modo que a proteína controle o movimento do polinucleotídeo alvo através do poro e uma proporção dos nucleotídeos no polinucleotídeo alvo interaja com o poro; e (c) medir a corrente que passa através do poro durante cada interação e determinar deste modo a sequência do polinucleotídeo alvo.

Consequentemente, o método envolve a absorção pelo nanoporo de uma proporção dos nucleotídeos em um polinucleotídeo alvo conforme os nucleotídeos individualmente passam através do tubo ou canal de modo a sequenciar o polinucleotídeo alvo.

Isto é o Sequenciamento de Filamento.

Estes métodos da invenção são particularmente adaptados para o sequenciamento de polinucleotídeos alvo, tais como ácidos nucleicos, porque a ligação das sequências de ácido nucleico à membrana diminui em várias ordens de magnitude a quantidade de polinucleotídeo requerido.

As

66 / 106 concentrações nas quais os polinucleotídeos alvo podem ser sequenciados usando a invenção são debatidos acima.

O todo ou apenas parte do polinucleotídeo alvo pode ser sequenciados usando este método.

O polinucleotídeo pode ser de qualquer comprimento.

Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser de pelo menos 10, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, pelo menos 400 ou pelo menos 500 nucleotídeos no comprimento.

O polinucleotídeo pode ser de 1000 ou mais nucleotídeos ou 5000 ou mais nucleotídeos no comprimento.

O polinucleotídeo pode ser de ocorrência natural ou artificial.

Por exemplo, o método pode ser usado para verificar a sequência de um oligonucleotídeo fabricado.

Os métodos são tipicamente realizados in vitro.

Os nucleotídeos (digeridos a partir do polinucleotídeo alvo ou presentes no polinucleotídeo) podem interagir com o poro em cada lado da membrana.

Os nucleotídeos podem interagir com o poro em qualquer maneira e em qualquer sítio.

Como debatido acima, os nucleotídeos preferivelmente reversivelmente se ligam ao poro por intermédio da ou em conjunção com o adaptador.

Os nucleotídeos de modo mais preferível reversivelmente se ligam ao poro por intermédio do ou em conjunção com o adaptador conforme eles passam através do poro através da membrana.

Os nucleotídeos também podem reversivelmente ligar ao tubo ou canal do poro por intermédio do ou em conjunção com o adaptador conforme eles passam através do poro através da membrana.

Durante a interação entre um nucleotídeo e o poro, o nucleotídeo afeta a corrente que flui através do poro em uma maneira específica para este nucleotídeo.

Por exemplo, um nucleotídeo particular reduzirá a corrente que flui através do poro por um período de tempo médio particular e a um grau particular.

Em outras palavras, a corrente que flui através do poro é distintiva para um nucleotídeo particular.

Os experimentos

67 / 106 de controle podem ser realizados para determinar o efeito que um nucleotídeo particular tem sobre a corrente que flui através do poro.

Os resultados de realizar o método da invenção em uma amostra de teste podem ser depois comparados com aqueles derivados de um tal experimento de controle de modo a determinar a sequência do polinucleotídeo alvo.

Os métodos de sequenciamento podem ser realizados usando qualquer sistema de membrana/poro adequado em que um poro está presente na ou inserido em uma membrana.

Os métodos são tipicamente realizados usando uma membrana que compreende lipídeos de ocorrência natural ou sintéticos.

A membrana é tipicamente formada in vitro.

Os métodos preferivelmente não são realizados usando uma membrana isolada, de ocorrência natural que compreende um poro, ou uma célula que expressa um poro.

Os métodos são preferivelmente realizados usando uma membrana artificial.

A membrana pode compreender outras proteínas de transmembrana e/ou intramembrana assim como outras moléculas além do poro.

A membrana forma uma barreira para o fluxo de íons, nucleotídeos e polinucleotídeos.

A membrana é preferivelmente uma camada anfifílica tal como uma bicamada de lipídeo.

As bicamadas de lipídeo adequadas para o uso de acordo com a invenção são descritas acima.

Os métodos de sequenciamento da invenção são tipicamente realizados in vitro.

Os métodos de sequenciamento podem ser realizados usando qualquer aparelho que é adequado para investigar um sistema de membrana/poro em que um poro está presente em ou inserido dentro de uma membrana.

O método pode ser realizado usando qualquer aparelho que seja adequado para a absorção pelo nanoporo.

Por exemplo, o aparelho compreende uma câmara que compreende uma solução aquosa e uma barreira que separa a câmara em duas seções.

A barreira tem uma abertura em que a membrana que contém o poro é formada.

O analito pode ser ligado à

68 / 106 membrana em cada uma das duas seções da câmara.

Os métodos de sequenciamento podem ser realizados usando o aparelho descrito no Pedido Internacional No.

PCT/GB08/ 000562. Os métodos da invenção envolvem medir a corrente que passa através do poro durante a interação com o nucleotídeo ou conforme o polinucleotídeo alvo se move com relação ao poro.

Portanto o aparelho também compreende um circuito elétrico capaz de aplicar um potencial e medir um sinal elétrico através da membrana e poro.

Os métodos podem ser realizados usando um patch-clamp ou um grampeamento de voltagem.

Os métodos preferivelmente envolvem o uso de um grampeamento de voltagem.

Os métodos de sequenciamento da invenção envolvem a medição de uma corrente que passa através do poro durante a interação com o nucleotídeo ou conforme o polinucleotídeo alvo se move com relação ao poro.

As condições adequadas para medir correntes iônicas através dos poros de proteína de transmembrana são conhecidos na técnica e divulgadas no Exemplo.

O método é tipicamente realizado com uma voltagem aplicada através da membrana e poro.

A voltagem usada é tipicamente de -400 mV a +400 mV.

A voltagem usada está preferivelmente em uma faixa tendo um limite mais baixo selecionado de -400 mV, -300 mV, -200 mV, -150 mV, - 100 mV, -50 mV, -20 mV e 0 mV e um limite superior independentemente selecionado de +10 mV, +20 mV, +50 mV, +100 mV, +150 mV, +200 mV, +300 mV e +400 mV.

A voltagem usada está mais preferivelmente na faixa de 100 mV a 240 mV e o mais preferivelmente na faixa de 160 mV a 240 mV.

É possível aumentar a discriminação entre nucleotídeos diferentes por um poro pelo uso de um potencial aplicado aumentado.

Os métodos de sequenciamento são tipicamente realizados na presença de qualquer sal de cloreto de metal alcalino.

No aparelho exemplar debatido acima, o sal está presente na solução aquosa na câmara.

Cloreto de potássio (KCl), cloreto de sódio (NaCl) ou cloreto de césio (CsCl) são

69 / 106 tipicamente usados.

KCl é preferido.

A concentração de sal é tipicamente de 0,1 a 2,5 M, de 0,3 a 1,9 M, de 0,5 a 1,8 M, de 0,7 a 1,7 M, de 0,9 a 1,6 M ou de 1 M a 1,4 M.

A concentração de sal é preferivelmente de 150 mM a 1 M.

As concentrações de sal altas fornecem uma razão de sinal para ruído alta e permite que as correntes indicativas da presença de um nucleotídeo sejam identificadas contra o fundo de flutuações de corrente normais.

As concentrações de sal mais baixas podem ser usadas se a detecção de nucleotídeo for realizada na presença de uma enzima, tal como quando do sequenciamento de polinucleotídeos.

Isto é debatido em mais detalhes abaixo.

Os métodos são tipicamente realizados na presença de um tampão.

No aparelho exemplar debatido acima, o tampão está presente na solução aquosa na câmara.

Qualquer tampão pode ser usado no método da invenção.

Um tampão adequado é tampão de Tris-HCl.

Os métodos são tipicamente realizados em um pH de 4,0 a 12,0, de 4,5 a 10,0, de 5,0 a 9,0, de 5,5 a 8,8, de 6,0 a 8,7 ou de 7,0 a 8,8 ou de 7,5 a 8,5. O pH usado é preferivelmente de cerca de 7,5. Os métodos são tipicamente realizados de 0°C a 100°C, de 15°C a 95°C, de 16°C a 90°C, de 17°C a 85°C, de 18°C a 80°C, de 19°C a 70°C, ou de 20°C a 60°C.

Os métodos podem ser realizados na temperatura ambiente.

Os métodos são preferivelmente realizados em uma temperatura que sustente a função de enzima, tal como de cerca de 37°C.

Como mencionado acima, boa discriminação de nucleotídeo pode ser obtida em concentrações de sal baixas se a temperatura for aumentada.

Além de aumentar a temperatura da solução, existem várias outras estratégias que podem ser utilizadas para aumentar a condutância da solução, enquanto se mantém condições que sejam adequadas para a atividade da enzima.

Uma tal estratégia é usar a bicamada de lipídeo para dividir duas concentrações diferentes de solução salina, uma concentração de sal baixa de sal no lado da enzima e uma concentração mais alta no lado oposto.

Um

70 / 106 exemplo deste método é usar 200 mM de KCl no lado cis da membrana e 500 mM de KCl na câmara trans.

Nestas condições, a condutância através do poro é esperada ser aproximadamente equivalente a 400 mM de KCl sob condições normais, e a enzima apenas experiencia 200 mM se colocada no lado cis.

Um outro benefício possível de usar condições salinas assimétricas é o gradiente osmótico induzido através do poro.

Este fluxo líquido de água pode ser usado para empurrar nucleotídeos para dentro do poro para detecção.

Um efeito similar pode ser obtido usando um osmólito neutro, tal como sacarose, glicerol ou PEG.

Uma outra possibilidade é usar uma solução com níveis relativamente baixos de KCl e contar com uma espécie que carregue carga adicional que seja menos capaz de ser rompida para a atividade da enzima.

O polinucleotídeo alvo que é analisado pode ser combinado com as químicas de proteção conhecidas para proteger o polinucleotídeo de atuar na proteína de ligação ou exonuclease enquanto na solução volumosa.

O poro pode ser depois usado para remover a química de proteção.

Isto pode ser obtido pelo uso de grupos de proteção que não são hibridizados pelo poro, proteína de ligação ou enzima sob um potencial aplicado (WO 2008/124107) ou pelo uso das químicas de proteção que são removidos pela proteína de ligação ou enzima quando mantidas em proximidade imediata ao poro (J Am Chem Soc. 22 de dez de 2010; 132(50): 17961-72). Sequenciamento de Exonuclease Em uma forma de realização, o método de sequenciar um analito que é um polinucleotídeo alvo envolve deixar o polinucleotídeo alvo interagir com uma enzima de exonuclease.

Qualquer uma das enzimas de exonuclease debatidas acima podem ser usadas no método.

A exonuclease libera nucleotídeos individuais de uma extremidade do polinucleotídeo alvo.

A enzima pode ser covalentemente ligada ao poro como debatido acima.

Um nucleotídeo individual é um nucleotídeo único.

Um nucleotídeo individual é um que não é ligado a um outro nucleotídeo ou

71 / 106 polinucleotídeo por uma ligação de nucleotídeo.

Uma ligação de nucleotídeo envolve um dos grupos fosfato de um nucleotídeo sendo ligado ao grupo de açúcar de um outro nucleotídeo.

Um nucleotídeo individual é tipicamente um que não é ligado por uma ligação de nucleotídeo a um outro polinucleotídeo de pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 500, pelo menos 1000 ou pelo menos 5000 nucleotídeos.

Por exemplo, o nucleotídeo individual foi digerido a partir de um polinucleotídeo alvo, tal como um filamento de DNA ou RNA.

O nucleotídeo individual pode ser qualquer um daqueles debatidos acima.

As exonucleases são enzimas que tipicamente agarram-se a uma extremidade de um polinucleotídeo e digerem o polinucleotídeo um nucleotídeo por vez daquela extremidade.

A exonuclease pode digerir o polinucleotídeo na direção de 5’ a 3’ ou na direção de 3’ a 5’. A extremidade do polinucleotídeo à qual a exonuclease se liga é tipicamente determinada através da escolha da enzima usada e/ou usando métodos conhecidos na técnica.

Grupos hidroxila ou estruturas de capuz em cada extremidade do polinucleotídeo podem ser tipicamente usados para impedir ou facilitar a ligação da exonuclease a uma extremidade particular do polinucleotídeo.

O método envolve deixar o polinucleotídeo interagir com a exonuclease de modo que os nucleotídeos sejam digeridos a partir da extremidade do polinucleotídeo em uma taxa que permite a identificação de uma proporção de nucleotídeos como debatido acima.

Os métodos para realizar isto são bem conhecidos na técnica.

Por exemplo, a degradação de Edman é usada para digerir sucessivamente aminoácidos únicos a partir da extremidade de polipeptídeo de modo que eles possam ser identificados usando a Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC). Um método homólogo pode ser usado na presente invenção.

A taxa na qual a exonuclease funciona é tipicamente mais lenta do que a taxa ideal de uma exonuclease do tipo selvagem.

Uma taxa

72 / 106 adequada de atividade da exonuclease no método de sequenciamento envolve a digestão de 0,5 a 1000 nucleotídeos por segundo, de 0,6 a 500 nucleotídeos por segundo, de 0,7 a 200 nucleotídeos por segundo, de 0,8 a 100 nucleotídeos por segundo, de 0,9 a 50 nucleotídeos por segundo ou de 1 a 20 ou 10 nucleotídeos por segundo.

A taxa é preferivelmente de 1, 10, 100, 500 ou 1000 nucleotídeos por segundo.

Uma taxa adequada de atividade de exonuclease pode ser obtida em vários modos.

Por exemplo, exonucleases variantes com uma taxa ideal reduzida de atividade pode ser usada de acordo com a invenção.

Os métodos de Sequenciamento de Exonuclease da invenção têm vantagens adicionais além da redução na quantidade de polinucleotídeo necessária.

Foi estudada a apresentação do DNA de filamento único em solução a um sistema de exonuclease-Nanoporo (“X-Poro”)/membrana sob potencial.

Quando o analito de DNA é introduzido dentro do sistema, o poro pode tornar-se bloqueado permanente ou temporariamente, impedindo a detecção de nucleotídeos individuais.

Quando uma extremidade do analito de DNA está localizado longe do poro, por exemplo pela ligação à membrana, surpreendentemente foi descoberto que este bloqueio não é mais observado.

Ele também aumenta o número de eventos de passagem de DNA potenciais para a enzima devido à concentração eficaz aumentada de estar no mesmo plano como o analito.

Isto atua para diminuir o tempo de ligação entre os analitos e aumenta o rendimento de sequenciamento.

Sequenciamento de Filamento O Sequenciamento de Filamento envolve o deslocamento controlado e escalonado de polinucleotídeos através de um poro.

Um polinucleotídeo é uma macromolécula que compreende dois ou mais nucleotídeos.

O polinucleotídeo ligado pela proteína pode compreender qualquer combinação de qualquer nucleotídeo.

Os nucleotídeos podem ser qualquer um daqueles debatidos acima.

73 / 106 O método de Sequenciamento de Filamento da invenção tipicamente usa uma proteína que liga polinucleotídeo para controlar o movimento do polinucleotídeo alvo através do poro. Os exemplos de tais proteínas são dadas acima. A proteína de ligação de polinucleotídeo é preferivelmente uma enzima de tratamento de polinucleotídeo. Uma enzima de tratamento de polinucleotídeo é um polipeptídeo que é capaz de interagir com e modificar pelo menos uma propriedade de um polinucleotídeo. A enzima pode modificar o polinucleotídeo clivando-o para formar nucleotídeos individuais ou cadeias mais curtas de nucleotídeos, tais como di- ou trinucleotídeos. A enzima pode modificar o polinucleotídeo orientando-o ou movendo-o para uma posição específica. A enzima de tratamento de polinucleotídeo não precisa demonstrar atividade enzimática contanto que a mesma seja capaz de ligar o polinucleotídeo alvo e controlar o seu movimento através do poro. Por exemplo, a enzima pode ser modificada para remover a sua atividade enzimática ou pode ser usada sob condições que o impeçam de atuar como uma enzima. Tais condições são debatidas em mais detalhes abaixo. A enzima de tratamento de polinucleotídeo é preferivelmente derivada de uma enzima nucleolítica. A enzima de tratamento de polinucleotídeo usada na construção da enzima é mais preferivelmente derivada de um membro de qualquer um dos grupos de Classificação de Enzima (EC) 3.1.11, 3.1.13, 3.1.14, 3.1.15, 3.1.16, 3.1.21, 3.1.22, 3.1.25,

3.1.26, 3.1.27, 3.1.30 e 3.1.31. A enzima pode ser qualquer uma daquelas divulgadas no Pedido Internacional No. PCT/GB10/000133 (publicado como WO 2010/086603). As enzimas preferidas são polimerases, exonucleases, helicases, translocases e topoisomerases, tais como girases. As enzimas adequadas incluem, mas não são limitadas a, exonuclease I da E. coli (SEQ ID NO: 8), enzima da exonuclease III da E. coli (SEQ ID NO: 10), RecJ da T.

74 / 106 thermophilus (SEQ ID NO: 12) e exonuclease de bacteriófago lambda (SEQ ID NO: 14) e variantes do mesmo.

Três subunidades que compreendem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 14 ou uma variante do mesmo interagem para formar uma exonuclease trimérica.

A enzima é mais preferivelmente derivada da Phi29 DNA polimerase.

Um derivado de enzima da Phi29 polimerase compreende a sequência mostrada na SEQ ID NO: 6 ou uma variante da mesma.

De acordo com uma forma de realização a proteína de ligação de polinucleotídeo é ligada ou amarrada à membrana e é capaz tanto de ligar ao polinucleotídeo do analito quanto depois controlar o deslocamento do analito através do poro.

Nesta forma de realização, o polinucleotídeo de analito pode ser ligado à membrana por intermédio da a proteína de ligação de polinucleotídeo.

O polinucleotídeo de analito e a proteína de ligação de polinucleotídeo podem ser ambos ligados à membrana, preferivelmente por métodos de ligação diferentes.

A proteína de ligação de polinucleotídeo é preferivelmente uma helicase.

Uma variante das SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12 ou 14 é uma enzima que tem uma sequência de aminoácido que varia daquela das SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12 ou 14 e que retém a capacidade de ligação de polinucleotídeo.

A variante pode incluir modificações que facilitam a ligação do polinucleotídeo e/ou facilitam a sua atividade em concentrações de sal alto e/ou temperatura ambiente.

No comprimento inteiro da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 ou 14, uma variante preferivelmente será pelo menos 50 % homólogas a esta sequência com base na identidade de aminoácido.

Mais preferivelmente, o polipeptídeo variante pode ser pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % e mais preferivelmente pelo menos 95 %, 97 % ou 99 % homólogas com base na identidade de

75 / 106 aminoácido com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 ou 14 na sequência inteira.

Pode ter pelo menos 80 %, por exemplo pelo menos 85 %, 90 % ou 95 %, de identidade de aminoácido em relação a um trecho de 200 ou mais, por exemplo 230, 250, 270 ou 280 ou mais, aminoácidos contíguos (“homologia difícil”). A homologia é determinada como descrito acima.

A variante pode diferir da sequência do tipo selvagem em qualquer um dos modos debatidos acima com referência à SEQ ID NO: 2. A enzima pode ser covalentemente ligada ao poro como debatido acima.

A enzima não é requerida estar em um proximidade tão imediata ao lúmen do poro como para o sequenciamento de nucleotídeo individual visto que não existe nenhum potencial para perturbar nas séries em que os nucleotídeos atingem a porção de absorção do poro.

As duas estratégias para o sequenciamento de DNA de filamento são o deslocamento do DNA através do nanoporo, tanto de cis para trans quanto de trans para cis, com ou contra um potencial aplicado.

Um dos mecanismos mais vantajosos para o Sequenciamento de Filamento é o deslocamento controlado de DNA de filamento único através do nanoporo sob um potencial aplicado.

As exonucleases que atuam progressiva ou processivamente sobre o DNA de filamento duplo pode ser usada no lado cis do poro para alimentar o filamento único remanescente através sob um potencial aplicado ou no lado trans sob um potencial reverso.

Do mesmo modo, uma helicase que desenrola o DNA de filamento duplo também pode ser usado em uma maneira similar.

Existem também possibilidades para o sequenciamento de aplicações que requerem deslocamento de filamento contra um potencial aplicado, mas o DNA deve ser primeiro “capturado” pela enzima sob um potencial reverso ou nenhum.

Com o potencial depois comutado de volta para o que segue a ligação do filamento passará de cis para trans através do poro e será mantida em uma conformação prolongada pelo fluxo de corrente.

As exonucleases de DNA de filamento único ou

76 / 106 polimerases dependentes de DNA de filamento único podem atuar como motores moleculares para empurrar o filamento único recentemente translocalizado de volta através do poro em uma maneira escalonadamente controlada, de trans para cis, contra o potencial aplicado.

Alternativamente, as polimerases dependentes de DNA de filamento único podem atuar como freio molecular que diminui a velocidade do movimento de um polinucleotídeo através do poro.

Na maioria das formas de realização preferidas, o Sequenciamento de Filamento é realizado usando um poro derivado de Msp e uma Phi29 DNA polimerase.

O método pode compreender (a) ligar o polinucleotídeo alvo a uma membrana; (b) deixar o polinucleotídeo alvo interagir com um detector na membrana, detector este que compreende um poro derivado de Msp e uma Phi29 DNA polimerase, de modo que a polimerase controle o movimento do polinucleotídeo alvo através do poro; e (c) medir a corrente que passa através do poro conforme o polinucleotídeo alvo se move com relação ao poro e determinar deste modo a sequência do polinucleotídeo alvo, em que as etapas (b) e (c) são realizadas com uma voltagem aplicada através do poro.

O método pode compreender (a) ligar o polinucleotídeo alvo a uma membrana; (b) deixar o polinucleotídeo alvo interagir com um detector na membrana, detector este que compreende um poro derivado de Msp e uma Phi29 DNA polimerase, de modo que a polimerase controle o movimento do polinucleotídeo alvo através do poro e uma proporção dos nucleotídeos no polinucleotídeo alvo interage com o poro; e (c) medir a corrente que passa através do poro durante cada interação e determinar deste modo a sequência do polinucleotídeo alvo, em que as etapas (b) e (c) são realizadas com uma voltagem aplicada através do poro.

Quando o polinucleotídeo alvo é contactado com uma Phi29 DNA polimerase e um poro derivado de Msp, o polinucleotídeo alvo primeiramente forma um complexo com a Phi29 DNA polimerase.

Quando a voltagem é aplicada através do poro,

77 / 106 o complexo de polinucleotídeo alvo/Phi29 DNA polimerase forma um complexo com o poro e controla o movimento do polinucleotídeo alvo através do poro.

Estas formas de realização Msp/Phi29 têm três vantagens inesperadas.

Primeiro, o polinucleotídeo alvo move-se através do poro em uma taxa que é comercialmente viável enquanto permite sequenciamento eficaz.

O polinucleotídeo alvo move-se através do poro de Msp mais rapidamente do que o faz através de um poro de hemolisina.

Segundo, uma faixa de corrente aumentada é observada conforme o polinucleotídeo se move através do poro deixando a sequência ser determinada mais facilmente.

Terceiro, uma variação de corrente diminuída é observada quando o poro específico e a polimerase são usados juntos aumentando deste modo a razão de sinal para ruído.

Qualquer polinucleotídeo descrito acima pode ser sequenciado.

Pelo menos uma porção do polinucleotídeo é preferivelmente de filamento duplo.

O poro pode ser qualquer um dos poros debatidos acima.

O poro pode compreender oito monômeros que compreendem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma.

A Phi29 DNA polimerase do tipo selvagem tem atividade de polimerase e exonuclease.

A mesma também pode descompactar polinucleotídeos de filamento duplo sob as condições corretas.

Consequentemente, a enzima pode funcionar em três modos.

Isto é debatido em mais detalhes abaixo.

A Phi29 DNA polimerase pode compreender a sequência mostrada na SEQ ID NO: 6 ou uma variante da mesma.

Uma variante da SEQ ID NO: 6 é uma enzima que tem uma sequência de aminoácido que varia aquela da SEQ ID NO: 6 e que retém a atividade de ligação de polinucleotídeo.

A variante deve funcionar em pelo menos um dos três modos

78 / 106 debatidos abaixo.

Preferivelmente, a variante funciona em todos os três modos. a variante pode incluir modificações que facilitem o tratamento do polinucleotídeo e/ou facilitem a sua atividade em concentrações de sal alto e/ou temperatura ambiente.

No comprimento inteiro da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6, uma variante preferivelmente será pelo menos 40 % homóloga a aquela sequência com base na identidade de aminoácido.

Mais preferivelmente, o polipeptídeo variante pode ser pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % e mais preferivelmente pelo menos 95 %, 97 % ou 99 % homólogo com base na identidade de aminoácido com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 na sequência inteira.

Pode ter pelo menos 80 %, por exemplo pelo menos 85 %, 90 % ou 95 %, de identidade de aminoácido em relação a um trecho de 200 ou mais, por exemplo 230, 250, 270 ou 280 ou mais, aminoácidos contíguos (“homologia difícil”). A homologia é determinada como descrita acima.

A variante pode diferir da sequência do tipo selvagem em qualquer um dos modos debatidos acima com referência à SEQ ID NO: 2. A enzima pode ser covalentemente ligada ao poro como debatido acima.

Qualquer um dos sistemas, aparelho ou condições debatidos acima podem ser usados de acordo com esta forma de realização preferida.

A concentração de sal é tipicamente de 0,15 M a 0,6 M.

O sal é preferivelmente KCl.

O método pode ser realizado em um dos três modos preferidos com base nos três modos da Phi29 DNA polimerase.

Cada modo inclui um método de checar a sequência.

Primeiro, o método é preferivelmente realizado usando a Phi29 DNA polimerase como uma polimerase.

Nesta forma de realização, as etapas (b) e (c) são realizadas na presença de nucleotídeos livres e um cofator de enzima de modo que a polimerase mova o polinucleotídeo

79 / 106 alvo através do poro contra o campo que resulta da voltagem aplicada.

O polinucleotídeo alvo move-se na direção de 5’ para 3’. Os nucleotídeos livres podem ser um ou mais de qualquer um dos nucleotídeos individuais debatidos acima.

O cofator de enzima é um fator que permite que a Phi29 DNA polimerase funcione como uma polimerase ou uma exonuclease.

O cofator de enzima é preferivelmente um cátion de metal bivalente.

O cátion de metal bivalente é preferivelmente Mg2+, Mn2+, Ca2+ ou Co2+. O cofator de enzima é mais preferivelmente Mg2+. O método preferivelmente compreende ainda (d) remover os nucleotídeos livres de modo que a polimerase mova o polinucleotídeo alvo através do poro com o campo que resulta da voltagem aplicada (isto é, na direção 3’ e 5’) e uma proporção dos nucleotídeos no polinucleotídeo alvo interage com o poro e (e) medir a corrente que passa através do poro durante cada interação e deste modo checar a sequência do polinucleotídeo alvo obtida na etapa (c), em que as etapas (d) e (e) também são realizadas com uma voltagem aplicada através do poro.

Segundo, o método é preferivelmente realizado usando a Phi29 DNA polimerase como uma exonuclease.

Nesta forma de realização, em que as etapas (b) e (c) são realizadas na ausência de nucleotídeos livres e a presença de um cofator de enzima de modo que a polimerase mova o polinucleotídeo alvo através do poro com o campo que resulta da voltagem aplicada.

O polinucleotídeo alvo move-se na direção de 3’ para 5’. O método preferivelmente compreende ainda (d) adicionar nucleotídeos livres de modo que a polimerase mova o polinucleotídeo alvo através do poro contra o campo que resulta da voltagem aplicada (isto é, na direção de 5’ para 3’) e uma proporção dos nucleotídeos no polinucleotídeo alvo interaja com o poro e (e) medir a corrente que passa através do poro durante cada interação e deste modo checar a sequência do polinucleotídeo alvo obtida na etapa (c), em que as etapas (d) e (e) também são realizadas com uma voltagem aplicada através do poro.

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Terceiro, o método é preferivelmente realizado usando a Phi29 DNA polimerase no modo de descompactação.

Nesta forma de realização, as etapas (b) e (c) são realizadas na ausência de nucleotídeos livres e a ausência de um cofator de enzima de modo que a polimerase controla o movimento do polinucleotídeo alvo através do poro com o campo que resulta da voltagem aplicada (visto que está descompactado). Nesta forma de realização, a polimerase atua como um freio impedindo o polinucleotídeo alvo de mover-se através do poro muito rapidamente sob a influência da voltagem aplicada.

O método preferivelmente compreende ainda (d) diminuir a voltagem aplicada através do poro de modo que o polinucleotídeo alvo se mova através do poro na direção oposta àquela nas etapas (b) e (c) (isto é, conforme o mesmo se recoze) e uma proporção dos nucleotídeos no polinucleotídeo alvo interage com o poro e (e) medir a corrente que passa através do poro durante cada interação e deste modo checar a sequência do polinucleotídeo alvo obtida na etapa (c), em que as etapas (d) e (e) também são realizadas com uma voltagem aplicada através do poro.

Kits A presente invenção também fornece kits para o sequenciamento de um analito que é um polinucleotídeo alvo.

O kit compreende (a) um poro de transmembrana, tal como um poro de proteína de transmembrana, (b) uma proteína que liga polinucleotídeo e (c) meios para ligar o polinucleotídeo alvo a uma membrana.

Em uma forma de realização preferida, a proteína de ligação de polinucleotídeo é uma exonuclease e o kit compreende ainda um adaptador molecular que facilita uma interação entre o poro e um ou mais nucleotídeos no polinucleotídeo alvo.

Um tal kit pode ser usado para o Sequenciamento de Exonuclease.

Em uma outra forma de realização preferida, o kit compreende os componentes de uma membrana, tal como os fosfolipídeos necessários para formar uma bicamada de lipídeo.

Os meios para ligar o polinucleotídeo alvo a uma membrana

81 / 106 preferivelmente compreendem um grupo reativo.

Os grupos adequados incluem, mas não são limitados a, grupos tiol, colesterol, lipídeo e biotina.

Qualquer uma das formas de realização debatidas acima com referência aos métodos da invenção são igualmente aplicáveis aos kits da invenção.

Os kits da invenção podem adicionalmente compreender um ou mais outros reagentes ou instrumentos que possibilitem que qualquer uma das formas de realização mencionadas acima seja realizada.

Tais reagentes ou instrumentos incluem um ou mais dos que seguem: tampão(ões) adequado(s) (soluções aquosas), meios para se obter uma amostra de um indivíduo (tal como um vaso ou um instrumento que compreenda uma agulha), meios para amplificar e/ou expressar polinucleotídeos, uma membrana como definida acima ou aparelho de grampeamento de voltagem ou contato.

Os reagentes podem estar presentes no kit em um estado seco de modo que uma amostra fluida recoloque os reagentes em suspensão.

O kit também pode, opcionalmente, compreender instruções para possibilitar que o kit seja usado no método da invenção ou detalhes que se refiram para qual dos pacientes o método pode ser usado.

O kit pode, opcionalmente, compreender nucleotídeos.

Aparelho A invenção também fornece um aparelho para o sequenciamento de um analito que seja um polinucleotídeo alvo.

O aparelho compreende (a) uma membrana, (b) uma pluralidade de poros de transmembrana na membrana, (c) uma pluralidade de proteínas que ligam polinucleotídeo e (d) uma pluralidade de polinucleotídeos alvo ligados à membrana.

A pluralidade de proteínas que ligam polinucleotídeo pode estar na membrana.

O aparelho pode ser qualquer aparelho convencional para a análise de analito, tal como um arranjo ou um chip.

Em uma forma de realização preferida, a proteína de ligação de polinucleotídeo é uma exonuclease e o aparelho compreende um adaptador molecular que facilita

82 / 106 uma interação entre o poro e um ou mais nucleotídeos no polinucleotídeo alvo. Um tal aparelho pode ser usado para o Sequenciamento de Exonuclease. Qualquer uma das formas de realização debatidas acima com referência aos métodos da invenção são igualmente aplicáveis aos kits da invenção. O aparelho preferivelmente compreende: um dispositivo sensor que seja capaz de sustentar a membrana e a pluralidade de poros e ser operável para realizar o sequenciamento de polinucleotídeo usando os poros e as proteínas; e pelo menos um reservatório para conter o material para realizar o sequenciamento. O aparelho preferivelmente compreende: um dispositivo sensor que é capaz de sustentar a membrana e a pluralidade de poros e ser operável para realizar o sequenciamento de polinucleotídeo usando os poros e as proteínas; pelo menos um reservatório para conter material para realizar o sequenciamento; um sistema fluídico configurado para fornecer de modo controlável material do pelo menos um reservatório para o dispositivo sensor; e um ou mais, tais como uma pluralidade, de recipientes para receber as respectivas amostras, o sistema fluídico sendo configurado para suprir as amostras seletivamente a partir do um ou mais recipientes para o dispositivo sensor. O aparelho pode ser qualquer um daqueles descritos no Pedido Internacional No. PCT/GB08/004127 (publicado como WO 2009/077734), PCT/GB10/000789 (publicado como WO 2010/122293), Pedido Internacional No. PCT/GB10/002206 (ainda não publicado) ou Pedido Internacional No. PCT/US99/25679 (publicado como WO 00/28312). Os Exemplos que seguem ilustram a invenção:

1. Exemplo 1 - Sequenciamento de Exonuclease

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1.1 Materiais e Métodos

1.1.1 Materiais e Oligonucleotídeos Os oligonucleotídeos foram adquiridos da ADTBio ou IDTDNA. Os detalhes das sequências e modificações exatas podem ser encontrados na Tabela abaixo (SEQ ID NOs 18 a 21). Modificação Comp. SEQ Código do Nome Sequência 5’ Interna 3’ (nt) ID NO: Forn.

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT ONLA ATDBio Chol-TEG - - 70 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 18 0692 A8691

TTTTTTTTTTTTTTTTTT

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA ONLA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA ATDBio Chol-TEG - - 70 19 0682 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA A887

AAAA

CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC ONLA ATDBio Chol-TEG - - 70 CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC 20 0683 A8874

CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT ONLA Estrep- IDT - - 70 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 18 0693 Btn:ssDNA 60739014

TTTTTTTTTTTTTTTTTT

TGTGTTCTATGTCTTATTCTTACTT ONLA Estrep- IDT - - 70 CGTTATTCTTGTCTCTATTCTGTTT 21 0694 Btn:ssDNA 60739013

ATGTTTCTTGTTTGTTAGCA TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

ONLA IDT - - - 70 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 18 0706 60692267

TTTTTTTTTTTTTTTTTT A Estreptavidina Recombinante, expressada na E. coli, foi adquirida da Sigma Aldrich (S0677). Os lipídeos sintéticos 1,2-difitanoil-sn- glicero-3-fosfocolina (16:0 4ME PC) e 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina-N-cap biotinila (16:0 Cap Biotinila PE) foram adquridos da Avanti Polar Lipids.

1.1.2 Purificação pela HPLC de Estreptavidina Mono-Substituída 1 μM de DNA modificado com 5’-biotina foi misturado com μM de estreptavidina em 25 mM de Tris.HCl, 400 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, pH 7,5 e incubados por 30 min a 22°C. Conjugados de Estrep:DNA mono-substituídos foram separados usando um sistema Agilent 1200 analytical LC que compreende uma bomba binária, forno de coluna mantida a 23°C, detector de UV com célula de fluxo de 13 μl, com tanto o compartimento de amostra quanto as frações mantidas a 4°C. A coluna foi uma Agilent BioMonolith QA conduzida a 1 ml min-1, e as amostras foram separadas em um gradiente de 30 mM - 1,1 M de NaCl em 100 mM de Tris pH 8,5. A quantificação de conjugados de Estrep:DNA mono-substituídos

84 / 106 purificados foi realizada usando a densitometria a seguir da eletroforese em gel usando uma série de padrões de DNA para criar uma curva padrão.

1.1.3 Registros de Canal Único de Bicamada Planar de Lipídeos As bicamadas foram formadas pela aposição de duas monocamadas de 100 % de 16:0 4ME PC ou 95 % de 16:0 4ME PC, 5 % de 16:0 Cap Biotinila PE. As bicamadas foram formadas através de uma abertura de 60 a 150 μm de diâmetro em película de Teflon (25 μm de espessura da Goodfellow, Malvern, PA), que dividiu uma câmara em dois compartimentos tampão (cis e trans) cada um com um volume de 1 ml. As bicamadas foram formadas através da abertura pela elevação consecutivamente do nível de tampão em cada compartimento até que um selo de alta resistência fosse observado (≥10 GΩ). A menos que de outro modo estabelecido, o DNA e a proteína foram adicionados ao compartimento cis, que foi conectado ao fundo. Nenhum reagente foi adicionado ao compartimento trans, que foi conectado ao estágio de ponta do amplificador. A menos que de outro modo estabelecido, os experimentos foram realizados em 25 mM de Tris.HCl, 400 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, pH 7,5, a 22°C.

1.2 Resultados

1.2.1 Detecção de Molécula Única de Analitos Amarrados As taxas de detecção de nanoporo para DNA de filamento único livre em solução podem ser determinadas pela medição do número de translocações de DNA (eventos) através do nanoporo por segundo. Um deslocamento de DNA pode ser identificado por uma bloqueio de corrente de assinatura transitória no registro digital. Para os analitos amarrados o número de interações similarmente pode ser calculado contanto que o DNA esteja apenas transitoriamente amarrado à bicamada, tal como via um grupo de colesterol. Conforme a extremidade livre do DNA entra no nanoporo o mesmo residirá no tubo até que a extremidade amarrada torne-se livre da bicamada e assim a molécula possa translocar (Fig. 2A e 2B). Se a amarração

85 / 106 é mais estável então o bloco será permanente (Fig. 2C e 2D). Uma mistura de 50 % de PoliA e PoliC modificados com colesterol (ONLA0682 e ONLA0683 respectivamente) foram ensaiados a 10, 100 e 1000 pM de concentração final para estabelecer o efeito de Col-DNA na taxa de evento e tempo de residência (Tabela abaixo). Isto foi comparado com a taxa de evento para o DNA de filamento único livre.

Analito Livre Analito Amarrado 100 nM 10 pM 100 pM 1000 pM Taxa de 120 mV 0,01 0,015 0,045 2,5 Evento 160 mV 0,74 0,15 1,05 26

As taxas de aumento com a voltagem em todas as concentrações (Tabela acima) e naturalmente as taxas de evento são mais altas nas concentrações mais altas.

Nas concentrações e voltagens mais baixas as taxas de evento são muito baixas para de fato serem consideradas significativas.

Isto é, é provável que a maior parte, se não todos, dos eventos nestas condições sejam apenas o falso-positivo ocasional.

É entretanto um tanto surpreendente que em níveis de corrente mais altos um número significante de eventos de DNA sejam observados com apenas 10 pM de DNA.

A despeito da concentração de DNA que é pelo menos 100 vezes mais baixa, as taxas de evento são muito mais altas com DNA modificado com colesterol.

É um tanto surpreendente que nos níveis de corrente mais altas (≥ 160 mV) um número significante de eventos de DNA sejam ainda observados com apenas 10 pM de DNA e estes eventos de DNA ocorrem em uma frequência similar a 100 nM de ssDNA não modificado.

Pode ser estimado que a amarração do DNA melhora a detecção do analito de DNA em 3 a 4 ordens de magnitude.

Para certas aplicações a natureza transitória da amarração seria preferida.

Se uma molécula de amarração estável fosse ligada diretamente às extremidades 5’ ou 3’ do DNA então alguns dados de sequência seria perdido visto que a rodada de sequenciamento não poderia continuar até a extremidade do DNA, devido à distância entre a bicamada e o sítio de

86 / 106 enzimas ativas. Se a amarração é mais transitória então quando a extremidade amarrada aleatoriamente se torna livre da bicamada então a enzima pode processar o DNA até a conclusão.

1.3 Conclusões Foi demonstrado aqui o potencial para melhorar a eficiência de detecção de um detector de nanoporo quanto a um analito em aproximadamente 3 a 4 ordens de magnitude. O bloqueio de poro rápido sugere que este analito amarrado está ainda disponível para proteínas tanto da solução quanto na bicamada (tal como uma enzima ou uma construção de nanoporo respectivamente) e assim tem o potencial como um mecanismo de liberação ao próprio poro ou a uma construção de nanoporo-enzima. Várias meios de ligação de analito à bicamada de lipídeo estão disponíveis e a maior parte foi reportada quanto à amarração de ssDNA, visto que a química funcional pode ser facilmente incorporada durante a síntese de oligonucleotídeo. No meio preferido um ddNTP modificado com uma biotina pode ser incorporada à extremidade 3’ de ssDNA usando a transferase de terminal. Pela mistura com estreptavidina o DNA do analito pode ser depois adicionado a um único poro em uma bicamada de lipídeo que contenha de 1 a % de Biotina PE onde o mesmo ficará amarrado. Alternativamente se a sequência é conhecida então o DNA pode ser hibridizado ao DNA sintético complementar já modificado em uma extremidade para ser lipofílico. Uma outra vantagem da amarração do analito é que você tem controle sobre uma extremidade do DNA. Pode ser observado acima que o DNA rapidamente bloqueará o poro se uma extremidade é mantida em proximidade imediata, no caso acima está é a bicamada. Se uma enzima de tratamento de DNA, tal como uma exonuclease, é ligada ao nanoporo então a mesma ligar-se-á a uma extremidade do DNA e mais uma vez localizá-lo-á ao poro e assim a outra extremidade rapidamente bloqueará. Se o DNA é imobilizado entretanto então quando a enzima se liga a uma extremidade

87 / 106 então ambas são agora ocupadas e indisponíveis para o poro. A necessidade quanto à exigência de analito baixo o sequenciamento de DNA é para aplicações tais como sequenciamento de célula única para epigenéticos e também triagem de amostras biológicas de baixo volume. O sistema do analisador Illumina Genome corrente requer 100 ng a 1 μg de DNA para um biblioteca prep. de sequenciamento. Um único chip de 128 canais para o sequenciamento de nanoporo usaria ~0,5 ng de DNA sem a necessidade quanto à amplificação; com base na geração de fragmento de 1000mer e comprimento de leitura na concentração de 10 pM.

2. Exemplo 2 - Sequenciamento de Filamento Além do trabalho para ligar ssDNA à membrana de lipídeo para o Sequenciamento de Exonuclease, a técnica também podem ser adaptada a um método de Sequenciamento de Filamento. No Sequenciamento de Filamento, uma porção de um filamento de polinucleotídeo é amarrada através do nanoporo sob um potencial aplicado. O filamento é tipicamente DNA ou RNA, por exemplo de DNA de filamento único ou filamento duplo. Preferivelmente o filamento é DNA de filamento único (ssDNA). Os resíduos de base compreendidos no filamento interagem com o nanoporo e um sinal é gerado que é característico de cada resíduo. O filamento é movido através do poro, causando variação para o sinal. O sinal pode ser usado para inferir a sequência do filamento de DNA. Uma forma de realização do Sequenciamento de Filamento usa um poro de proteína embutido em uma membrana de lipídeo. Eletrodos são colocados em cada lado da membrana de lipídeo em um eletrólito e um potencial é aplicado através do sistema. Sob o potencial o polinucleotídeo se desloca para o poro. A corrente através do poro de proteína pode ser medida e usada para reconhecer bases conforme elas passam através do tubo de transmembrana do poro. Tipicamente o poro de proteína será uma proteína de membrana bacteriana, tal como uma porina ou uma toxina. Preferivelmente o

88 / 106 poro é uma hemolisina, uma gramicidina ou um MspA.

A taxa na qual o DNA se desloca através de um poro pode ser muito rápida para permitir a identificação precisa de cada base, portanto pode ser desejável diminuir a velocidade do deslocamento.

Um método para diminuir a velocidade do deslocamento de um filamento de DNA é usar uma proteína de tratamento de DNA, tal como uma DNA polimerase.

A proteína de tratamento de DNA pode ser ligada ao poro, por exemplo pela ligação covalente, diretamente ou via grupos ligantes.

Tipicamente a proteína de tratamento do DNA é ligada ao poro para aplicações de Sequenciamento de Exonuclease.

Habitualmente para o sequenciamento de aplicações de filamento a proteína de tratamento DNA não é ligada ao poro.

Para um método de Sequenciamento de Filamento, é desejável ter uma proteína de tratamento de DNA que tenha um tempo de ligação muito longo no topo do nanoporo.

Um tempo de ligação longo permite que muitos nucleotídeos sejam processados através da proteína de tratamento de DNA e assim através do nanoporo.

Para uma polimerase, uma taxa típica de processamento pode estar em torno de 20 nucleotídeos por segundo.

Um tempo de ligação de 10 minutos permitiria o movimento de 12.000 nucleotídeos.

Um tempo de ligação de um minuto permitiria que 120 nucleotídeos fossem processados.

Usando este método, um tempo de ligação longo também está relacionado com o comprimento da leitura.

Correntemente, um comprimento de leitura em torno de 100 nucleotídeos seria suficiente para as tecnologias existentes rivais, embora comprimentos de leitura mais longos fossem desejáveis, por exemplo um comprimento de leitura de 200, 500 ou 1000 nucleotídeos.

Os comprimentos de leitura preferidos são de pelo menos 5000 nucleotídeos, mais preferivelmente 10000 ou 50000 nucleotídeos.

Uma vantagem de um comprimento de leitura longo é que ele reduz enormemente a complexidade da bioinformática necessária para analisar a informação de

89 / 106 sequenciamento. Tipicamente uma proteína de tratamento de DNA é uma DNA polimerase. As proteínas de tratamento de DNA preferidas incluem a Phi29 DNA polimerase.

2.1 Materiais e Métodos As bicamadas foram formadas pela aposição de duas monocamadas de 100 % de DPhPC ou 99 % de DPhPC, 1 % de 16: 0 Cap Biotinila PE. As bicamadas foram formadas através de uma abertura de 60 a 150 μm de diâmetro em película de Teflon (25 μm de espessura da Goodfellow, Malvern, PA), que dividiu uma câmara em dois compartimentos de tampão (cis e trans) cada um com um volume de 1 ml. As bicamadas foram formadas através da abertura pela elevação consecutiva do nível de tampão em cada compartimento até que um selo de alta resistência fosse observado (≥10 GΩ). A menos que de outro modo estabelecido, o DNA e proteína foram adicionados ao compartimento cis, que foi conectado à terra. Nenhum reagente foi adicionado ao compartimento trans, que foi conectado ao estágio de ponta do amplificador. Os experimentos foram realizados com 400 mM de KCl, 25 mM de Tris.HCl, 10 μM de EDTA, pH 7,5. O mutante de hemolisina usado foi HL-(E111N/K147N)7 (SEQ ID NO: 38). 1 μM de DNA modificado com 5’-biotina (StrandDNA1) foi misturado com 10 μM de estreptavidina em 25 mM de Tris.HCl, 400 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, pH 7,5 e incubados por 30 min a 22°C. Conjugados de Estrep:DNA mono-substituídos foram separados usando um sistema Agilent 1200 analytical LC que compreende uma bomba binária, forno de coluna mantido a 23°C, detector de UV com célula de fluxo de 13 μl, com tanto o compartimento de amostra quanto as frações mantidos a 4°C. A coluna foi uma Agilent BioMonolith QA conduzida em 1 ml min-1, e as amostras foram separadas em um gradiente de 30 mM - 1,1 M de NaCl em 100 mM de Tris pH 8,5. A quantificação de conjugados de Estrep:DNA

90 / 106 mono-substituídos purificados foi realizada usando densitometria a seguir da eletroforese em gel usando uma série de padrões de DNA para criar uma curva padrão.

Para formar StrandDNA3, o complexo de DNA-estreptavidina foi hibridizado com um excesso de 5x de StrandDNA2 pelo aquecimento a 50°C por 10 minutos em um bloco de aquecimento de PCR.

A temperatura foi reduzida para 23°C em uma taxa de 2 graus por minuto.

Para as rodadas de amarração de membrana, a bicamada foi formada com 99 % de DPhPC, 1 % de 16:0Cap Biotinila PE.

Uma vez que a bicamada foi formada, 1 nM de StrandDNA3 foi adicionado à câmara cis e bem misturado.

Uma seção de controle foi registrada por 5 minutos a +180 mV para se obter eventos de ligação de DNA ao nanoporo.

Depois que a seção de controle foi registrada, 5 nM de KF (exo negativo) (NEB) foi adicionado e o sinal foi registrado por 5 minutos a +180 mV.

Para as rodadas onde o analito está em solução, a bicamada foi formada com 100 % de DPhPC.

StrandDNA6 foi produzido pela hibridização do StrandDNA4 e StrandDNA5 em concentrações equimolares.

A hibridização foi realizada pelo aquecimento até 50°C em um bloco de PCR por 10 minutos, depois de esfriar a 23ºC a 2ºC /min.

Uma vez que a bicamada é formada, 400 nM de StrandDNA6 foi adicionado à câmara cis e bem misturada.

Uma seção de controle foi registrada por 5 minutos a +180 mV para se obter eventos de ligação de DNA ao nanoporo.

Depois que a seção de controle foi registrada, 800 nM de KF (exo negativo) (NEB) foi adicionado e o sinal foi registrado por 5 minutos a +180 mV.

O nível de poro aberto foi visualmente estimado, e os eventos de deslocamento de DNA foram definidos ser ocasiões quando os dados caíram abaixo de um limiar colocado em cerca de 5 sigmas abaixo do nível do poro (onde sigma é o desvio padrão do ruído). Qualquer artefato óbvio foi manualmente removido dos dados antes que a detecção do evento fosse realizada.

Está mostrado nas figuras o nível de corrente médio de cada evento

91 / 106 em pA (eixo vertical) vs a duração do evento em segundos (eixo horizontal). Observe que o eixo horizontal é demonstrado usando uma escala logarítmica, visto que a duração de evento varia de menos do que um milissegundo a tanto quanto 10 segundos. Em todos os quatro casos houve também numerosos eventos muito curtos (menores do que 1 ms) que foram excluídos. Isto é porque eles são muito curtos para que os seus níveis de corrente fossem confiavelmente estimados, e porque eles não servem para distinguir entre as condições diferentes mostradas. StrandDNA1: 5’-Biotina-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTACGACCTGC ATGAGAATGC-3’ (SEQ ID NO: 22) StrandDNA2: 5’-CTCACCTATCCTTCCACTCACCCCCCAAAAAACCCC CCAAAAAACCCCCCAAAAAAGCATTCTCATGCAGGTCGTAGCC-3’ (SEQ ID NO: 23) StrandDNA3: StrandDNA1 hibridizado ao StrandDNA2 (SEQ ID NO’s: 22 e 23) StrandDNA4: 5’-AACCCCCAAAAACCCCCAAAAACCCCCAAAAACCC

CCAAAAACCCCCAAAAACCCCCAAAAACCCCCAAAAACCCCCATA GAGACAAGAATAACGAAGTA-3’ (SEQ ID NO: 24) StrandDNA5: 5’-TACTTCGTTATTCTTGTCTCTAT-3 (SEQ ID NO: 25) StrandDNA6: StrandDNA4 hibridizado ao StrandDNA5 (SEQ ID NO’s: 24 e 25)

2.2 Resultados Um experimento foi desenvolvido que permite que uma proteína de tratamento de DNA seja avaliada quanto à sua capacidade para firmar-se no DNA sob a aplicação de um potencial. Neste experimento, um complexo de enzima DNA é puxado para dentro do nanoporo resultando em um nível de corrente característico. Quando o complexo de enzima DNA dissocia-se, o DNA é puxado mais profundamente para dentro do nanoporo

92 / 106 resultando em um segundo nível de corrente.

O DNA depois completamente se desloca através do nanoporo, resultando em um poro aberto e reinicializando o sistema ao seu estado original.

As cinéticas da ligação do DNA-enzima pode ser avaliada pelo exame da duração do estado ligado à enzima durante repetições múltiplas deste processo (Fig. 3). Em trabalho recente, uma polimerase foi usada para controlar o deslocamento de um filamento de DNA.

Para rodar um tal experimento, a concentração do DNA é idealmente de 100 a 1000 nM para ser capturado pelo nanoporo.

Conforme a enzima se liga ao DNA, é preferível para a concentração de enzima estar em uma molaridade similar ao DNA, ou em excesso em relação ao DNA.

È comum para as concentrações de enzima a serem usadas dobrar a concentração de DNA para garantir que uma proporção grande (preferivelmente todo) do DNA forme um complexo de enzima-DNA.

Isto coloca uma alta demanda sobre a quantidade de material requerido.

È portanto desejável ter um sistema que use menos DNA e consequentemente, menos enzima.

Um método de se obter isto é amarrar o DNA à membrana de lipídeo.

Como apresentado, a taxa de inserção de DNA pode ser enormemente aumentada pelo realce da interação entre DNA e membrana.

Isto pode produzir taxas que são comparáveis àquelas quando o DNA está livre em solução, mas usando 1.000 a 10.000 vezes menos material.

Pelo uso de uma concentração mais baixa de DNA, a concentração de enzima usada pode ser enormemente reduzida (ver a Fig. 4). Uma proteína de tratamento de DNA adequada é o Fragmento Klenow (KF) (N.

A.

Wilson, R.

Abu-Schmays, B.

Gyarfas, H.

Wang, K.

R.

Lieberman, M.

Akeson e W.

B.

Dunbar (2009). Electronic Control of DNA Polymerase Binding and Unbinding to Single DNA Molecules.

ACS Nano 3, 995-1003). O fragmento Klenow é um fragmento de proteína grande produzido quando a DNA polimerase I de E. coli é enzimaticamente clivada

93 / 106 pela protease subtilisina. O mesmo retém a atividade de 5’-3’ polimerase e a atividade de 3’ → 5’ exonuclease para a remoção de nucleotídeos pré- codificados e à prova de leitura, mas perde a sua atividade de 5’ → 3’ exonuclease. O KF também pode ser geneticamente engendrado para remover a atividade de 3’ → 5’ exonuclease remanescente. Esta proteína de tratamento de DNA tipicamente se liga ao DNA na interface entre DNA de filamento único e de filamento duplo (iniciador/junção padrão) e pode catalisar a replicação do filamento de DNA através da adição de nucleotídeos. O fragmento Klenow foi investigado para os métodos de Sequenciamento de Filamento mas foi descoberto ter tempos de ligação de 1 a 100 ms quando puxado no topo de um nanoporo pela aplicação de um potencial. Foi triado o KF em uma configuração de analito amarrado à membrana como mostrada acima (Fig. 4). Quando o DNA está em solução, o tempo de ligação do complexo KF-DNA é de 1 a 100 ms (Fig. 5 e 6) (similar aos resultados publicados (ref Wilson/Akeson 2009)). Isto é muito curto para ser útil para um método de Sequenciamento de Filamento visto que uma duração de 100 ms apenas permitiria que uns poucos nucleotídeos fossem lidos. Entretanto, quando o DNA é amarrado à membrana de lipídeo, o tempo de ligação aumenta para 0,1 a 10 s (Figs. 7 e 8).

2.3 Conclusões A duração do complexo de enzima-DNA no topo do poro é uma função da força do campo aplicado que atua sobre o filamento de DNA carregado. A capacidade da proteína para resistir a esta força determina a duração de tempo que o complexo permanece intacto no topo do poro. O tempo de residência mais longo para o DNA amarrado pode ser devido às moléculas de lipídeo móveis que aplicam uma força adicional sobre o filamento no poro conforme o mesmo se difunde através da membrana de lipídeo. Esta força neutraliza a força aplicada pelo campo aplicado e a força líquida que o KF experiencia é reduzida. Esta configuração beneficia-se das

94 / 106 vantagens que um campo alto oferece (por exemplo, quanto mais alto o sinal para ruído, mais rápida a captura do DNA), mas ainda permite que a proteína de tratamento de DNA tenha um tempo de ligação longo no topo do poro. O método da amarração oferece um outro meio para controlar o comportamento da enzima no topo do nanoporo. Existem muitas possibilidades para explorar este conceito. Pela variação da composição da membrana, ou mudança de um parâmetro físico, tal como temperatura, seria possível mudar a taxa de difusão da molécula amarrado na bicamada de lipídeo, e consequentemente, a força que o complexo de enzima DNA experiencia no nanoporo. Na forma de realização do Sequenciamento de Exonuclease, aumentar a fluidez da membrana pode aumentar a disponibilidade de polinucleotídeo para a exonuclease. A fluidez da membrana pode ser mudada pela adição de agentes tais como colesterol. Além disso, a natureza do agente de amarração pode ser mudada para controlar a taxa de difusão do analito amarrado para produzir um efeito similar. É provável que a amarração a uma espécie grande, tal como uma proteína produziria uma taxa de difusão mais lenta comparada com a amarração a uma molécula pequena tal como um lipídeo. Foi mostrado que a taxa de enzima quando é complexada com polinucleotídeo e puxada para dentro do nanoporo será afetada pelo campo aplicado através do nanoporo. É provável que a força difusional da amarração do analito reduzirá a força líquida que a enzima no poro experiencia. Foi previsto que pode-se controlar a taxa de movimento do polímero pela combinação da força de um potencial aplicado com a força difusional da amarração do analito. Um outro uso potencial deste efeito é controlar a velocidade do filamento através do poro sem o uso de uma proteína de tratamento de DNA. A força aplicada pelo potencial aplicado pode ser igualada pela força difusional da membrana.

3. Exemplo 3 - Mais Sequenciamento de Filamento Em trabalho recente, a Phi29 DNA polimerase foi usada para

95 / 106 controlar o deslocamento de um filamento de DNA através de α-hemolisina (Akeson et al., 2010, J Am Chem Soc. 22 de dez de 2010; 132(50): 17961-

72.). Dois modos de movimento controlado de um filamento de DNA através de um nanoporo foram relatados usando Phi29 como um motor molecular, ambos os métodos contam com a sua ação na junção do DNA de filamento duplo/único em um duplex de projeção 5’. O movimento pode ocorrer pela polimerização do filamento de imprimação que é hibridizado oposto ao filamento a ser interrogado ou por um método de descompactação onde o filamento de imprimação é sequencialmente não hibridizado a partir do filamento a ser interrogado para revelar cada vez mais da sequência alvo que foi anteriormente DNA duplex.

3.1 Materiais e Métodos Como apresentado para o DNA de filamento único, a porção de amarração pode ser variada para gerar filamentos que demonstram uma interação transitória com a bicamada ou uma amarração de duração mais longa, por exemplo com colesterol de biotina:estreptavidina respectivamente. Para os analitos de dsDNA seria considerado que analitos de DNA duplex que demonstram comportamento de ligação transitória seriam mais adequados para o sequenciamento de Filamento assim como para permitir que a enzima descompactasse completamente o analito e desimpedisse o nanoporo pronto para o seguinte. Oligos Complementares (ONLA1346 e ONLA1347, 65 nt e 31 nt respectivamente) foram designados que contivessem no filamento alvo (ONLA1346) um grupo colesterol na 3’ e uma extensão poliC que contivesse um único A na 5’. Quando hibridizados estes Oligos dão um DNA duplex de 31 pares de base com uma projeção 5’ de 34 nt de modo que o filamento alvo possa ser movido para dentro e capturado pelo nanoporo 5’ primeiro. A descompactação pode ser depois rastreado observando-se no movimento do único A, no fundo de poliC, através da ponta leitora do nanoporo. Para

96 / 106 comparação com analitos não amarrados um filamento idêntico em sequência ao filamento alvo foi designado mas que careceu do grupo de colesterol (ONLA1049). Registros de canal único foram realizados usando um poro mutante MspA-NNNRRK (ONLP2726) em combinação com Phi29 DNA polimerase. Um único canal foi obtido e o tampão cis perfundido com 10 ml de tampão fresco (400 mM de KCl, 10 mM de HEPES pH 8,0) para minimizar a chance de inserção de canal único. Depois de uma seção de controle de 5 minutos o DNA foi adicionado a 0,5 nM ou 100 nM, para os experimentos amarrados e não amarrados respectivamente. Vários eventos de curta duração (~10 ms) foram observados depois da adição de DNA que são propostos serem o DNA duplex que é capturado pelo nanoporo e o iniciador que é removido do padrão pela força do poro. Depois de 5 min a Phi29 DNA polimerase foi adicionada à câmara cis para dar 10 nM ou 200 nM, mais uma vez respectivamente para os experimentos amarrados e não amarrados. Oligonucleotídeos usados: ONLA1346

CCCCCCCCCCCCCCCACCCCCCCCCCCCCCCCCCCTATTCTGTTTAT GTTTCTTGTTTGTTAGCC-Col (SEQ ID NO: 26) ONLA1347 GGCTAACAAACAAGAAACATAAACAGAATAG (SEQ ID NO: 27) ONLA1049

CCCCCCCCCCCCCCCACCCCCCCCCCCCCCCCCCCTATTCTGTTTAT GTTTCTTGTTTGTTAGCC (SEQ ID NO: 28) PoliT-50mer_XXXX_Sentido

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTX XXXGGTTGTTTCTGTTGGTGCTGATATTGC (SEQ ID NO: 29) PhiX 235bp Anti-sentido Col-GTTAGACCAAACCATGAAACCAAC ATA (SEQ ID NO: 30)

97 / 106 PhiX 400bp Anti-sentido Col-GACCGCCTCCAAACAATTTAGACA (SEQ ID NO: 31) PhiX 822bp Anti-sentido Col-GGCAATCTCTTTCTGATTGTCCAG (SEQ ID NO: 32)

3.2 Resultados Depois da adição da Phi29 DNA polimerase vários eventos de duração longa foram observados em ambos os experimentos que são propostos ser complexos de capture do DNA:proteína. Estes eventos mostram um curto tempo de residência em um nível constante antes de oscilar entre os estados, que são considerados ocorrer na iniciação da descompactação e o A começando a se mover através da ponta leitora do poro. Um exemplo disto é mostrado nas Figs. 12 e 11 tanto para os experimentos amarrados (Fig. 9) quanto para os não amarrados (Fig. 10). A análise de todos os eventos de descompactação para os eventos de DNA tanto amarrados quanto em solução mostram um padrão amplamente constituinte para o número de estados observados, a média vs tempo de residência para cada estado e a média vs desvio padrão para cada um (Fig. 11 para não amarrado e Fig. 12 para amarrado). A posição do colesterol não é ajustada como estando na 3’ do filamento alvo e pode ser variada para a 5’ do padrão ou filamento iniciador ou dentro de um grampo de cabelo. Devido à exigência quanto a enzima para ajustar em 3’ do filamento iniciador, a junção entre DNA de filamento único e duplo é considerado este não é um sítio adequado para amarrar, entretanto isto não foi demonstrado experimentalmente. Embora o método de amarração funcione bem para filamentos sintéticos, onde a química de ligação pode ser incorporada durante a síntese química do oligonucleotídeo, aplicá-lo para amostras derivadas do DNA genômico é mais desafiador. Uma técnica comum para a amplificação de seções de DNA genômico é usando a reação da cadeia da polimerase. Aqui

98 / 106 usando dois iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos várias cópias da mesma seção de DNA pode ser gerada, onde para cada cópia a 5’ de cada filamento no duplex será o oligo sintético.

Pelo uso de um iniciador de anti-sentido que tem um grupo 5’ colesterol cada cópia do DNA alvo amplificado conterá um grupo colesterol para amarrar.

O único problema com o analito gerado pela PCR é que o mesmo é terminado de forma abrupta ou contém uma única projeção 3’-A, nenhuma das quais é adequada para amarrar em um nanoporo para o Sequenciamento de Filamento.

A adição de seções de DNA de filamento único à 5’ do DNA duplex não é facilmente possível.

Uma ligação química ou enzimática pode ser feita mas nenhuma é altamente eficiente e também requer reações e etapas de purificação a jusante adicionais.

Um método de PCR foi desenvolvido usando um iniciador de sentido que como é usual conteve uma seção complementar para o início da região alvo do DNA genômico mas foi adicionalmente prosseguida com uma Seção 50 poliT.

Para impedir a polimerase de estender o filamento complementar oposto à seção poliT, para criar um produto de PCR de extremidade abrupta como é normal, quatro sítios abásicos foram adicionados entre a Seção poliT e a seção de imprimação complementar.

Estes sítios abásicos impedirão a polimerase de estender-se além desta região e assim a seção poliT permanecerá como DNA 5’ de filamento único em cada uma das cópias amplificadas (Figs. 13 e 14). Embora este método de PCR seja um modo eficiente de ligar a seção 5’ líder poliT, outros métodos para incorporar a química de ligação são possíveis entretanto, tais como usando a transferase de terminal para adicionar à 3’ ou por intermédio da T4 polinucleotídeo cinase e ATPγS para adicionar um tiol reativo à 5’ para ligação química.

Entretanto, este método permite a geração de analitos amarrados em uma forma adequada para o Sequenciamento de Filamento onde a única limitação no tamanho, e como tal o comprimento de leitura, é que impõe pela PCR (~20 kb). Os registros de canal único foram realizados como descrito

99 / 106 acima mas usando estes fragmentos de DNA genômico amplificados de modo a observar qualquer evento de descompactação (Figs. 15 e 16). Vários eventos de descompactação foram observados que progrediram e também depois saíram da sua própria concordância, sugerindo assim a descompactação completa do DNA duplex. De modo a observar uma taxa de evento aceitável para complexos de captura de DNA:proteína para o Sequenciamento de Filamento a partir de solução depois que 100 nM de DNA e 200 nM de Phi29 DNA polimerase são requeridos. Para o fragmento de 800 pares de base isto é equivalente a ~50 μg de dsDNA por experimento, assumindo o volume de câmara de 1 ml como usado acima. Usando analitos de dsDNA amarrados a mesma taxa de evento aceitável pode ser satisfeita e excedida usando 0,1 nM de DNA e 10 nM de Phi29 DNA polimerase. Para o fragmento de 800 pares de base isto é equivalente a ~50 ng de dsDNA por experimento, assumindo o volume de câmara de 1 ml como usado acima.

4. Exemplo 4 - Sequenciamento de Estado Sólido As vantagens demonstradas acima para amarrar uma membrana de lipídeo também podem ser estendida aos experimentos de nanoporo em estado sólido. Os nanoporos podem ser produzidos em materiais no estado sólido e utilizada em uma maneira similar aos nanoporos biológicos. O seu uso e fabricação foram bem documentados em outro lugar (WO 00/79257; WO 00/78668; Dekker C, Nat Nanotechnol. Abril de 2007; 2(4): 209-15; e Schloss JA, et al., Nat Biotechnol. Out de 2008; 26(10): 1146- 53). Os nanoporos em materiais de estado sólido, tais como nitreto de silício oferece vantagens em relação aos canais biológicos como os poros. Os materiais de estado sólido são muito menos frágeis do que as membranas de lipídeo. Os nanoporos em material no estado sólido podem ser formados em uma fábrica e ter uma vida de prateleira longa, diferente das membranas

100 / 106 biológicas que são frequentemente formadas in situ.

Avanços recentes com nanoporos em estado sólido também permitem que materiais muito finos tais como grafeno sejam usados que têm propriedades únicas (Golovchenko J, et al., Nature. 2010 9 de Set; 467(7312): 190-3; Drndić M, et al., Nano Lett. 11 de agosto de 2010; 10(8): 2915-21; e Dekker C, et al., Nano Lett. 11 de agosto de 2010; 10(8): 3163-7). Nanointervalos no grafeno também foram propostos (Postma, 2008, Rapid Sequencing of Individual DNA Molecules in Graphene Nanogaps). Uma outra forma de realização de membranas no estado sólido é usar uma corrente de tunelamento entre dois ou mais eletrodos embutidos no nanoporo.

Conforme um analito passa através do poro (acionado por um potencial de trans membrana), o analito facilita uma corrente de tunelamento entre o eletrodo.

Esta corrente pode ser usada para detectar a identidade do analito (Schloss supra; US 7.253.434; e WO 2008/092760). Um método alternativo para os nanoporos é usar nanointervalos em materiais no estado sólido como sensores (Chen et al., Materials Today, 2010, 13(11): 28-41). Os experimentos de nanoporo em estado sólido podem se beneficiar das vantagens descritas acima para as membranas de lipídeo.

Uma diferença chave entre os dois tipos de membrana é que as membranas anfifílicas de modo frequente são naturalmente móveis, atuando essencialmente como um fluido bidimensional com taxas de difusão de lipídeo de ~10-8 cm s-1, enquanto que as membranas em materiais como o nitreto de silício são sólidos.

Embora possa haver vantagens para a amarração de um analito a uma superfície em uma maneira estática, é desejável para o analito ser capaz de mover-se através de com membrana de modo que moléculas de analito múltiplas possam interagir com o detector.

Existem vários esquemas que podem ser utilizados para a amarração de um analito a uma membrana de estado sólido (Fig. 17). O

101 / 106 primeiro método seria contar com a interação natural do analito com uma membrana não modificada, tal como Si3N4. Entretanto, isto fornece muito pouco controle em relação à taxa de difusão do analito sobre a superfície.

É portanto preferível modificar a superfície, o analito, ou tanto a superfície quanto o analito para fornecer a interação desejada.

Métodos para modificar quimicamente os materiais no estado sólido são bem conhecidos na técnica.

Os nanoporos no estado sólido também foram quimicamente modificados, através da automontagem em solução ou pelo acionamento das espécies reativas através do nanoporo sob um potencial aplicado (WO 2009/020682). Os primeiros dois esquemas usam uma membrana quimicamente modificada para produzir uma superfície onde o analito pode transitoriamente interagir com a camada (Fig. 17A, B). No primeiro esquema, a amarração do grupo do analito embute a si mesmo dentro da camada modificada (Fig. 17A). Um alcano de cadeia longa pode ser ligado à superfície e um grupo de amarração tal como colesterol ou um alcano seriam usados.

A modificação da superfície pode ser obtida pelo uso de um cloro-hexadecil-dimetilsilano (ou similar) e os métodos descritos na WO 2009/020682. No segundo esquema, o analito de amarração não embutiu dentro da camada, mas reside na superfície.

Isto pode ser obtido usando hidrofóbica como no primeiro esquema.

Além disso, métodos similares também podem ser considerados onde a ligação do analito à superfície é mediada pelas interações eletrostáticas, de ligação de hidrogênio ou Van der Waals.

O terceiro esquema é o mais similar às membranas usadas com nanoporos de proteína.

Nesta forma de realização, a membrana de estado sólido é modificada para sustentar uma monocamada de lipídeo (Fig. 17C). Este método tem todos os benefícios dos exemplos apresentados acima para a

102 / 106 amarração de membrana de lipídeo.

A amarração pode ser obtida usando-se uma âncora ou ligação de colesterol, por intermédio dos grupos de ponta de lipídeo, ou através de um receptor na membrana.

Os métodos para formar bicamadas ou monocamadas nas superfícies sólidas são bem conhecidos na técnica (Duran RS, et al., Langmuir. 13 de março de 2007; 23(6): 2924-7; e Cremer PS, et al., Surface Science Reports. 2006; 61: 429-444). Quando a superfície é feita hidrofóbica, uma monocamada de lipídeo pode ser formada espontaneamente a partir de vesículas de lipídeo em solução.

A superfície pode ser feita hidrofóbica em vários modos, incluindo tratamentos de plasma (tais como CH4) ou métodos químicos, tais como a química de cloro-silano (WO 2009/020682), e ligação de ouro-tiol (Duran supra; e Cremer supra). Um quarto esquema para amarrar analitos às membranas é usar uma membrana de estado sólido como um suporte para uma bicamada de lipídeo (Fig. 17D). Nesta forma de realização, o elemento detector é a membrana de nanoporo no estado sólido.

Este método tem todos os benefícios dos exemplos apresentados acima para a amarração da membrana de lipídeo.

Se a superfície é tornada hidrofílica, as bicamadas de lipídeo se auto montarão na superfície - um efeito que é comum para as bicamadas formadas nas superfícies de vidro (Cremer supra). Para todos os exemplos acima, o nanoporo no estado sólido pode ser combinado com uma proteína que liga polinucleotídeo para formar o detector.

Exemplo 5 Este Exemplo descreve como o movimento do DNA controlado pela helicase não foi observado para o DNA não amarrado quando exposto a um nanoporo de MspA embutido em um copolímero de tribloco.

O chip tem 128 reservatórios com eletrodos de platina e uma abertura de 30 μm com um eletrodo comum de platina ligado à tampa.

As monocamadas foram formadas com uma mistura de solução de 50 mg/ml de copolímero de tribloco (TBCP 6-33-6, OH-PMOXA-

103 / 106 (ligante de PEG)-PDMS-(Ligante de PEG)-PMOXA-OH, Polymer Source Product ID: P3691B-MOXZDMSMOXZ) em óleo. O nanoporo (MS- (G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/ D134R/E139K)8) foi depois adicionado ao chip no tampão. Os reagentes foram apenas adicionados através do topo do chip (lado cis) uma vez que o chip foi formado. O experimento foi realizado com 625 mM de cloreto de sódio, mM de ferricianeto de potássio, 75 mM de ferrocianeto de potássio, 100 mM de HEPES, pH 8,0 (tampão 1). O mutante MspA usado foi MS- (G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/ D134R/E139K)8. A sequência de DNA usada neste experimento foi um filamento de 400mer de filamento duplo (a SEQ ID NO: 39 mostra a sequência do filamento de sentido). SEQ ID NO: 39 -

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTG GTTGTTTCTGTTGGTGCTGATATTGCGCTCCACTAAAGGGCCGATT GACCCGGTGGTACCTTGGTTGTTTCTGTTGGTGCTGATATTGCTTTT GATGCCGACCCTAAATTTTTTGCCTGTTTGGTTCGCTTTGAGTCTTC TTCGGTTCCGACTACCCTCCCGACTGCCTATGATGTTTATCCTTTGG ATGGTCGCCATGATGGTGGTTATTATACCGTCAAGGACTGTGTGAC TATTGACGTCCTTCCCCGTACGCCGGGCAATAATGTTTATGTTGGT TTCATGGTTTGGTCTAACTTTACCGCTACTAAATGCCGCGGATTGG TTTCGCTGAATCAGGTTATTAAAGAGATTATTTGTCTCCAGCCACT TAAGTGAGGTGATTTATGTTTGGTGCTATTGCTGGCGGTATTGCTT CTGCTCTTGCTGGTGGCGCCATGTCTAAATTGTTTGGAGGCGGTCG

AGCT A monocamada foi formada com 50 mg/ml de copolímero de tribloco (TBCP 6-33-6, OH-PMOXA-(Ligante de PEG)-PDMS-(Ligante de PEG)-PMOXA-OH, Polymer Source Product ID: P3691B- MOXZDMSMOXZ) em óleo e nanoporos (MS-(G75S/G77S/L88N/

104 / 106

D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)8) pré-inserido no chip.

O chip foi depois inserido dentro da lâmina e a solução manualmente removida pela pipeta e reinserida.

Em seguida 1,5 nM de DNA (sequência de filamento de sentido SEQ ID NO: 39), 500 nM de helicase, 10 mM de MgCl2 e 1 mM de ATP foram adicionados a 150 μl de tampão 1. A solução foi depois pipetada através do chip através da chaminé na tampa e deixada difundir para o nanoporo.

Os dados foram registrados por 1 hora a +120 mV, com um movimento potencial para 0 mV e depois -50 mV a cada 5 minutos, para se obter eventos de helicase no nanoporo.

O movimento do DNA controlado pela helicase para DNA não amarrado (sequência de filamento de sentido SEQ ID NO: 39) através de um nanoporo MS-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/ D118R/Q126R/D134R/E139K)8 inserido em um copolímero de tribloco (TBCP 6-33-6, OH-PMOXA-(Ligante de PEG)-PDMS-(Ligante de PEG)- PMOXA-OH, Polymer Source Product ID: P3691B-MOXZDMSMOXZ) não foi detectado.

O poro foi observado bloquear sob as condições testadas mas nenhum movimento de DNA controlado pela helicase foi mencionado.

Exemplo 6 Este Exemplo descreve como movimento de DNA controlado pela helicase foi observado para o DNA amarrado quando exposto a um nanoporo de MspA embutido em um copolímero de tribloco.

O chip tem 128 reservatórios com eletrodos de platina e uma abertura de 30 μm com um eletrodo comum de platina ligado à tampa.

As monocamadas foram formadas com uma mistura de solução de 50 mg/ml de copolímero de tribloco (TBCP 6-33-6, OH-PMOXA- (Ligante de PEG)-PDMS-(Ligante de PEG)-PMOXA-OH, Polymer Source Product ID: P3691B-MOXZDMSMOXZ) em óleo.

O nanoporo (MS- (G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/ D134R/E139K)8) foi depois adicionado ao chip no tampão.

Os reagentes foram apenas adicionados

105 / 106 através do topo do chip (lado cis) uma vez que o chip foi formado. O experimento foi realizado com 625 mM de cloreto de sódio, mM de ferricianeto de potássio, 75 mM de ferrocianeto de potássio, 100 mM de HEPES, pH 8,0 (tampão 1). O mutante de MspA usado foi MS- (G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/ D134R/E139K)8. A sequência de DNA usada neste experimento consiste de DNA de 400mer de filamento duplo (a SEQ ID NO: 40 mostra a sequência do filamento de sentido) e um filamento complementar curto de DNA com um colesterol ligado à extremidade 3’ (SEQ ID NO: 41) que pode hibridizar a uma porção da SEQ ID NO: 40. SEQ ID NO: 40

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTG GTTGTTTCTGTTGGTGCTGATATTGCGCTCCACTAAAGGGCCGATT GACGCTCCACTAAAGGGCCGATTGACCCGGTTGTTTCTGTTGGTGC TGATATTGCTTTTGATGCCGACCCTAAATTTTTTGCCTGTTTGGTTC GCTTTGAGTCTTCTTCGGTTCCGACTACCCTCCCGACTGCCTATGAT GTTTATCCTTTGGATGGTCGCCATGATGGTGGTTATTATACCGTCA AGGACTGTGTGACTATTGACGTCCTTCCCCGTACGCCGGGCAATAA TGTTTATGTTGGTTTCATGGTTTGGTCTAACTTTACCGCTACTAAAT GCCGCGGATTGGTTTCGCTGAATCAGGTTATTAAAGAGATTATTTG TCTCCAGCCACTTAAGTGAGGTGATTTATGTTTGGTGCTATTGCTG GCGGTATTGCTTCTGCTCTTGCTGGTGGCGCCATGTCTAAATTGTTT

GGAGGCGGTCGAGCT SEQ ID NO: 41

AGCGACTAACAAACACAATCTGATGGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTT/3 ColTEG/ A monocamada foi formada com 50 mg/ml de copolímero de tribloco (TBCP 6-33-6, OH-PMOXA-(Ligante de PEG)-PDMS-(Ligante de PEG)-PMOXA-OH, Polymer Source Product ID: P3691B-

106 / 106

MOXZDMSMOXZ) em óleo e nanoporos pré-inseridos no chip.

O chip foi depois inserido na lâmina e a solução manualmente removida pela pipeta e reinserida.

Em seguida 1,5 nM de DNA (sequência de filamento de sentido da SEQ ID NO: 40 e filamento SEQ ID NO: 41), 500 nM helicase, 10 mM MgCl2 e 1 mM ATP foi adicionado de amarração complementar curta para 150 μl de tampão 1. A solução foi depois pipetada através do chip através da chaminé na tampa e deixada difundir no nanoporo.

Os dados foram registrados por 1 hora a +120 mV, com um movimento potencial para 0 mV e depois -50 mV a cada 5 minutos, para se obter movimento de DNA controlado pela helicase através do nanoporo.

O deslocamento controlado pela helicase de DNA amarrado (sequência de filamento de sentido da SEQ ID NO: 40 e filamento de amarração complementar curto da SEQ ID NO: 41) através de um nanoporo MS-(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D93N/D118R/Q126R/D134R/E139K)8 inserido em um copolímero de tribloco (TBCP 6-33-6, OH-PMOXA-(Ligante de PEG)-PDMS-(Ligante de PEG)-PMOXA-OH, Polymer Source Product ID: P3691B-MOXZDMSMOXZ) foi detectado.

Doze movimentos de DNA controlados pela helicase foram detectados durante o curso de 1 ciclo positivo de 5 minutos.

O tempo médio entre movimentos de DNA controlados pela helicase foi de 0,5 segundo.

Portanto, pela amarração do DNA ao copolímero de tribloco é possível observar o movimento de DNA controlado pela helicase que não foi detectado em um experimento similar usando DNA não amarrado (exemplo 5).

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para determinar a presença, ausência ou características de um analito, caracterizado pelo fato de que compreende (a) ligar o analito a uma membrana, em que o analito não está ligado à membrana via um detector presente na membrana e (b) deixar o analito interagir com um detector presente na membrana e determinar, deste modo, a presença, ausência ou características do analito.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a membrana é uma camada anfifílica ou uma camada no estado sólido.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o analito está presente em uma concentração de cerca de 0,001 pM a cerca de 1 nM, tal como menos do que 0,01 pM, menos do que 0,1 pM, menos do que 1 pM, menos do que 10 pM ou menos do que 100 pM.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o analito é ligado à membrana via um polipeptídeo ou uma âncora hidrofóbica.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a âncora hidrofóbica é um lipídeo, ácido graxo, esterol, nanotubo de carbono ou aminoácido.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o analito é ligado à membrana via um ligante.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o detector compreende um poro transmembrana ou um poro de proteína transmembrana.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o poro de proteína de transmembrana é derivado de Msp ou α- hemolisina (α-HL).

9. Método de acordo com as reivindicações 7 ou 8,

caracterizado pelo fato de que o método compreende: (a) deixar o analito interagir com o detector; e (b) medir a corrente que passa através do poro durante a interação e determinar, deste modo, a presença, ausência ou características do analito.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o método é para (a) identificar o analito ou (b) estimar a sequência de, ou sequenciar um polinucleotídeo alvo.

11. Método para sequenciamento de um analito que é um polinucleotídeo alvo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) realizar o método como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, em que o detector compreende um poro transmembrana, tal que o polinucleotídeo alvo se move através do poro; e (b) medir a corrente que passa através do poro conforme o polinucleotídeo alvo se move com relação ao poro e determinar, deste modo, a sequência do polinucleotídeo alvo.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o método compreende: (a) ligar o polinucleotídeo alvo a uma membrana; (b) deixar o polinucleotídeo alvo interagir com um detector presente na membrana, em que o detector compreende um poro transmembrana e uma proteína que liga polinucleotídeo, tal que a proteína controla o movimento do polinucleotídeo alvo através do poro e nucleotídeos no polinucleotídeo alvo interajam com o poro; e (c) medir a corrente que passa através do poro conforme o polinucleotídeo alvo se move com relação ao poro e determinar, deste modo, a sequência do polinucleotídeo alvo.

13. Kit para sequenciamento de um analito que é um polinucleotídeo alvo, caracterizado pelo fato de que compreende (a) um poro de transmembrana, (b) uma proteína que liga polinucleotídeo e (c) meios para ligar o polinucleotídeo alvo a uma membrana.

14. Aparelho para sequenciamento de um analito que é um polinucleotídeo alvo, caracterizado pelo fato de que compreende (a) uma membrana, (b) uma pluralidade de poros de transmembrana na membrana, (c) uma pluralidade de proteínas que ligam polinucleotídeo e (d) uma pluralidade de polinucleotídeos alvo ligados à membrana.

15. Aparelho de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o aparelho de análise compreende: um dispositivo sensor que é capaz de sustentar a membrana e a pluralidade de poros e ser operável para realizar o sequenciamento de polinucleotídeo usando os poros; e pelo menos um reservatório para conter o material para realizar o sequenciamento.