CN113227772A - 用于生物标志物检测的单分子电子多重纳米孔免疫测定 - Google Patents

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詹姆斯·J·拉索
谢尔盖·卡拉奇科夫
陶传娟
希夫·库玛
伊琳娜·莫罗佐娃
李晓旭
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Abstract

本申请公开了用于使用专门设计的纳米孔与离子电流读数联用，利用抗体或其它蛋白质结合分子和纳米孔可检测标签来检测化合物(分析物)以提供单分子电子检测解决方案，从而为多重化和定量提供独特机会的新型发明性方法、设备和所需分子。

Description

用于生物标志物检测的单分子电子多重纳米孔免疫测定
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年7月23日提交的美国临时申请第62/701,990号的权益，所述美国临时申请的全部内容在此通过引用并入。
在此整个申请中，引用了各种出版物和专利。这些参考文献的完整引文可以在紧接在权利要求之前的说明书结尾处找到。这些出版物和专利的公开内容通过全文引用的方式特此并入本申请中，以更全面地描述本发明所属领域的现状。
背景技术
从组织活检或非侵入性地(例如，从血液和尿液)检测蛋白质、碳水化合物、核酸、小分子和其它化合物(特别是被视为癌症和其它疾病的生物标志物的那些)的能力变得越来越重要。这些生物标志物可以随时间推移在个体中进行跟踪以试图在早期阶段诊断疾病、在不同组织、个体或群体中进行比较并且在治疗之前、期间和之后进行检查。U.S.2016/0041179 A1,Ju等人描述了一种用于利用抗体或其它蛋白质结合分子和纳米孔可检测标签来检测化合物(分析物)的新型方法。纳米孔的使用与离子电流读数联用提供了一种单分子电子检测解决方案，从而为多重化和定量提供了独特的机会。后者比包含ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射免疫测定)和蛋白质阵列的当前免疫学方法更灵敏并且比利用质谱(MS)读数的方法(将样品直接应用于MS或串联MS或者在初始2-D凝胶分离、ICAT或其它程序后进行MS)更便宜。除了使用抗体来对抗原化合物进行检测和定量之外，所述方法还可以被适配成鉴定配体-受体和其它蛋白质-蛋白质相互作用以及各种其它分子相互作用。因此，例如，系统将具有同时监测DNA和蛋白质两者或其它生物标志物的灵活性。
U.S.2016/0041179 A1的焦点部分地在于使用各种方法将纳米孔可检测标签与特定分析物(抗原或其它分子)连接。整体方法描述如下：(1)捕获抗体、亲和体(affibody)或对特定分析物(化合物)具有特异性的其它抗体模拟物、适配体或配体与纳米孔阵列中的各个膜嵌入式纳米孔结合(或离纳米孔阵列中的各个膜嵌入式纳米孔非常近地结合)；(2)带标签化合物在电解质溶液中流过纳米孔阵列并与特异性抗体结合；并且(3)跨膜施加电压后，获得电流记录，从而允许鉴定与含有特定纳米孔的孔缔合的化合物。在一些实施例中，标签通过可裂解连接子连接。与不同化合物连接的不同标签将引发不同的电流阻断，从而允许在单分子水平上在同一纳米孔阵列上确定多种化合物。利用足够数目的纳米孔，可以获得定量或半定量结果。(参见描述了此方法的原理的U.S.2016/0041179 A1)。
本申请包括使用单分子电子纳米孔平台来检测生物标志物、其它生物分子、抗原、抗体和各种分子相互作用的若干新颖实施例。若干实例涉及使用带标签第二抗体(检测抗体)，所述带标签第二抗体可以与和初始捕获抗体相同的分析物上的不同位点结合或者与捕获抗体所吸引的原始分子的结合配偶体结合。
发明内容
本发明提供了一种用于检测样品中所关注化合物的存在的方法，所述方法包括：
a)将用于所述所关注化合物的捕获化合物或所述捕获化合物的多个拷贝与纳米孔结合或结合在纳米孔附近；
b)将所述纳米孔插入电阻屏障中；
c)在允许所述所关注化合物与所述捕获化合物连接的条件下，使所述捕获化合物或所述捕获化合物的所述多个拷贝与含有所述所关注化合物的所述样品接触；
d)在允许带标签化合物与所述所关注化合物连接的条件下，使所述所关注化合物与所述带标签化合物或所述带标签化合物的多个拷贝接触，其中所述带标签化合物包括至少一个标签；
e)使所述纳米孔与电解质溶液接触并跨所述电阻屏障施加电压；以及
f)测量由所述带标签化合物的至少一个标签进入所述纳米孔引起的跨所述孔的电子信号变化，
由此检测所述所关注化合物的存在。
本发明提供了一种检测样品中所关注化合物的存在的方法，所述方法包括：
a)在允许供所述所关注化合物连接的捕获化合物的多个拷贝的磁珠与纳米孔连接或连接在纳米孔附近的条件下，使所述纳米孔与所述磁珠和用于通过结合化合物1将所述磁珠与所述纳米孔连接或连接在所述纳米孔附近的结合化合物2接触，其中所述结合化合物1与所述纳米孔连接或连接在所述纳米孔附近；
b)将所述纳米孔插入电阻屏障中；
c)在允许所述所关注化合物与所述捕获化合物结合的条件下，使所述珠上的所述捕获化合物与含有所述所关注化合物的样品接触；
d)在允许带标签化合物与所述所关注化合物连接的条件下，使所述所关注化合物与所述带标签化合物接触，其中所述带标签化合物包括至少一个标签；
e)使所述纳米孔与电解质溶液接触并跨所述电阻屏障施加电压；以及
f)测量由所述带标签化合物的至少一个标签进入所述纳米孔引起的跨所述孔的电子信号变化，
由此检测所述所关注化合物的存在。
本发明提供了一种用于确定样品中多种不同所关注化合物的存在和/或相对数量的方法，所述方法包括：
a)使多个纳米孔与多种不同捕获化合物接触，
其中每种类型的捕获化合物与所述样品中不同类型的所关注化合物结合，
所述接触是在使得每种捕获化合物与所述多个纳米孔之一结合或结合在所述多个纳米孔之一附近的条件下；
b)将所述多个纳米孔插入电阻屏障中；
c)在允许每种所关注化合物与捕获化合物结合的条件下，使所述多种不同捕获化合物与所述样品接触，所述样品包括所述多种不同所关注化合物；
d)使所述多种不同所关注化合物与多种不同带标签化合物接触，
其中每种类型的带标签化合物与不同类型的所关注化合物结合，
其中每种类型的带标签化合物包括至少一个标签，
其中每种类型的带标签化合物包括与每种其它类型的带标签化合物不同的类型的标签，
其中每种类型的带标签化合物的身份与标签的类型相关，
所述接触是在使得每种带标签化合物与所关注化合物结合的条件下；
e)使所述多个纳米孔与电解质溶液接触并跨所述电阻屏障施加电压；
f)测量由所述带标签化合物中的每种带标签化合物的至少一个标签进入所述纳米孔引起的跨所述多个纳米孔中的每个纳米孔的电子信号变化；以及
g)任选地比较如此被纳米孔检测到的每种类型的标签的相对数；
由此确定所述样品中所述多种不同所关注化合物的存在和/或相对数量。
本发明提供了一种用于确定样品中多种不同所关注化合物的存在和/或相对数量的方法，所述方法包括：
a)使多个纳米孔与多种不同捕获化合物接触，
其中每种类型的捕获化合物与所述样品中不同类型的所关注化合物结合，
其中每种类型的捕获化合物包括至少一个标签，
其中每种类型的捕获化合物包括与每种其它类型的捕获化合物不同的类型的标签，
其中每种类型的捕获化合物的身份与标签的类型相关，
所述接触是在使得每种捕获化合物与多个纳米孔之一结合或结合在多个纳米孔之一附近的条件下；
b)将所述多个纳米孔插入电阻屏障中；
c)使多个纳米孔与电解质溶液接触并跨所述电阻屏障施加电压；
d)测量由所述捕获化合物中的每种捕获化合物的至少一个标签进入纳米孔引起的跨多个纳米孔中的每个纳米孔的电子信号变化，由此确定连接在每个纳米孔附近或与每个纳米孔连接的所述捕获化合物的身份；
e)使所述多种不同捕获化合物与所述样品接触，所述样品包括所述多种不同所关注化合物，
其中每种所关注化合物具有相同类型的标签与其连接，
所述接触是在允许每种所关注化合物与捕获化合物结合的条件下；
f)使多个纳米孔与电解质溶液接触并跨所述电阻屏障施加电压；
g)测量由所述所关注化合物中的每种所关注化合物的所述标签进入纳米孔引起的跨多个纳米孔中的每个纳米孔的电子信号变化；以及
h)任选地比较被纳米孔检测到的标签的相对数；
由此确定所述样品中所述多种不同所关注化合物的存在和/或相对数量。
本发明提供了一种用于确定生物分子的分子相互作用的方法，所述方法包括：
a)将所述生物分子或所述生物分子的多个拷贝与纳米孔连接或连接在纳米孔附近；
b)将所述纳米孔插入电阻屏障中；
c)在使得所述生物分子和推定的相互作用化合物相互作用的条件下，使所述生物分子与含有所述推定的相互作用化合物的样品接触，并且任选地执行交联步骤以结合所述生物分子和所述推定的相互作用化合物；
d)在允许带标签化合物与所述推定的相互作用化合物结合的条件下，使所述推定的相互作用化合物与所述带标签化合物接触，其中所述带标签化合物包括至少一个标签；
e)使所述纳米孔与电解质溶液接触并跨所述电阻屏障施加电压；以及
f)测量由所述带标签化合物的至少一个标签进入所述纳米孔引起的跨所述孔的电子信号变化，
由此检测生物分子的所述分子相互作用。
附图说明
图1：用于通过纳米孔传感来检测蛋白质的基本方案。(1)将捕获抗体(在本文中被称为第一抗体或抗体1)与嵌入膜中的纳米孔偶联。靶蛋白(在本文中也被称为抗原或分析物)被抗体捕获。(2)含有纳米孔可区分标签的第二纳米标签检测抗体(在本文中也被称为带标签第二抗体或带标签抗体2)与靶蛋白结合。当跨膜施加电压时，标签进入纳米孔的通道，并且特定于标签的所得离子电流阻断指示捕获并且因此指示靶蛋白的鉴定。在此基本方案的变化中，抗体可以被抗体模拟物置换，并且靶标可以是非蛋白质分子。尽管这里示出了单个捕获抗体，但捕获抗体或小抗体模拟物的多个拷贝可以与纳米孔连接或连接在纳米孔附近。
图2：α-溶血素纳米孔(αHL)和捕获抗体(Ab)通过两种蛋白质上的巯基的狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)缀合。按照U.S.9,890,426B2中描述的用于将αHL与DNA聚合酶缀合的方法，αHL蛋白也可以与抗体分子连接。在这种情况下，使用两种蛋白质中的半胱氨酸。在αHL的情况下，将蛋白质工程化为在期望的位置具有单个半胱氨酸。在抗体分子的情况下，用还原剂裂解半胱氨酸之间的二硫键的预先处理使SH基团暴露。两个连接子各自在一端具有马来酰亚胺以用于与相应蛋白质中的SH基团连接。第一连接子的相对端具有四嗪部分，并且第二连接子的相对端具有反式环辛烯(TCO)部分。四嗪和TCO通过快速狄尔斯-阿尔德反应发生反应以将αHL与Ab缀合。在可选方法中，任一连接子上的马来酰亚胺可以用琥珀酰亚胺酯置换以用于与相应蛋白质的N端处或赖氨酸中的氨基连接。马来酰亚胺基团也可以被氨基置换以用于与羧基(例如，在抗体分子上的碳水化合物氧化后)连接或者被生物素置换以用于通过生物素-链霉亲和素相互作用进行缀合。除了芳香族肼与芳香族醛之间发生缀合之外，
Figure BDA0002986534650000051
(
Figure BDA0002986534650000052
生物技术有限公司(
Figure BDA0002986534650000053
Biotechnologies))缀合策略是类似的(方案可从
Figure BDA0002986534650000054
生物技术有限公司获得)。
图3：具有可用结合位点的捕获和检测抗体的结构。捕获抗体与检测抗体之间的差异在于抗原结合位点。对于给定的靶分子，将选择捕获抗体和检测抗体以与不同表位结合。替代性地，捕获抗体和检测抗体可以相同，但与靶分子上的多个表位结合，使得每个捕获抗体和检测抗体将以随机方式与靶分子上的不同表位子集结合。在基本方案中，捕获抗体将与纳米孔缀合，并且检测抗体将与靶标特异性纳米标签连接。在实施例中，仅一个捕获抗体将与每个纳米孔结合，并且仅一个标签将与每个检测抗体结合。通常的连接位点包含四个亚基的N端处的氨基和整个抗体中的赖氨酸残基上的伯胺，但这是随机过程并且可以产生多个连接。在二硫键(示出为连接铰链区中的重链的平行线)还原之后，所得SH键提供较少的随机位置以用于缀合。在重链的恒定区中也存在碳水化合物基团，所述碳水化合物基团还可以提供定向位点以用于缀合。
图4A：抗体(Ab)和纳米孔可检测标签通过Ab上的巯基和标签上的氨基的狄尔斯-阿尔德缀合。如图2所描述的，在此程序中，抗体(在此实施例中为第二抗体或检测抗体)通过半胱氨酸SH基团与含马来酰亚胺连接子连接。通过末端氨基将纳米孔可检测标签与以琥珀酰亚胺酯结尾的第二连接子连接。第一连接子和第二连接子的相对端分别具有四嗪部分和反式环辛烯(TCO)部分。四嗪和TCO通过快速狄尔斯-阿尔德反应发生反应以将标签与Ab缀合。在可选方法中，第一连接子上的马来酰亚胺可以用琥珀酰亚胺酯置换以用于与抗体分子的N端处或赖氨酸中的氨基连接。马来酰亚胺基团也可以被氨基置换以用于与羧基(例如，在抗体分子上的碳水化合物氧化后)连接或者被生物素置换以用于通过生物素-链霉亲和素相互作用进行缀合。除了芳香族肼与芳香族醛之间发生缀合之外，
Figure BDA0002986534650000061
(
Figure BDA0002986534650000062
生物技术有限公司)缀合策略是类似的。
图4B：磺基-SMCC 4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯用于将氨基封端标签与抗体上的半胱氨酸基团缀合的用途。sSMCC连接子的一端的上磺基琥珀酰亚胺酯与寡核苷酸标签上的5'氨基反应。连接子的相对侧上的马来酰亚胺然后可以与检测(第二)抗体中的半胱氨酸残基上的-SH基团反应，所述基团在此卡通图中示出为灰色椭圆形。
图5：使用纳米孔感测来检测蛋白质-蛋白质相互作用。在此实施例中，将纳米孔与针对诱饵蛋白的抗体缀合并在纳米孔传感器之上插入膜中。接下来，使含有推定的相互作用蛋白的样品流过芯片，并且诱饵蛋白与其相互作用配偶体由诱饵抗体捕获。如果需要，可以包含交联步骤以维持诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。接下来，各自带有不同的可区分的纳米孔可检测标签的针对推定的靶蛋白的抗体在电解质溶液中流过芯片。在跨膜施加电压后，标签进入纳米孔的通道，并且测量离子电流。指示给定标签的电流阻断签名将揭示诱饵蛋白与所述特定靶蛋白之间的结合。利用足够大的阵列，将可以确定不同靶分子与诱饵蛋白缔合的频率。除了蛋白质-蛋白质相互作用外，这种方法还可以用于检测蛋白质-DNA、蛋白质-RNA和许多其它分子相互作用，只要抗体、抗体模拟物或其它识别分子可用于诱饵蛋白和靶蛋白两者。虽然这里示出有单个诱饵蛋白，但可以将诱饵蛋白的多个拷贝与纳米孔连接。
图6：具有不同独特标签的纳米孔电流读数。用30个核苷酸长的寡核苷酸主链(T)合成标签，其中在某些位置进行修饰以减小(dSp)或扩大(荧光素-dT(FldT))这些位点处的主链的横截面。具有较高比例的狭窄延伸的纳米孔具有最高电流(相对于开放通道电流的最小离子电流阻断)，而具有最宽横截面的纳米孔具有最低电流(最大离子电流阻断)(Fuller等人2016)。
图7：用于纳米孔检测的标签的实例。这些标签含有30个脱氧胸苷(T)核苷酸(左上图)、被两个荧光素化T'中断的28个T'(FldT，右上图)、被8个(左下图)或3个(右下图)无碱基(dSp)残基中断的22个T'。纳米孔中的最大离子电流阻断将利用带有FldT位点、其次是T30、然后是dSp3的标签获得，并且最低电流阻断将利用含dSp8标签获得(Fuller等人2016)。
图8：用于纳米孔感测的标签的实例。标签可以具有各种主链，例如，寡核苷酸、PEG、精胺、烷烃、无碱基位点(前两行中示出的实例)、替代性碱基和大小类似的取代基(第三行和第四行中示出的实例)以及与碱基连接的不同染料或其它大体积取代基(第四行中的荧光素-dT；最后一行中示出的其它示例荧光染料)。
图9：捕获抗体装饰的磁珠用于捞出所关注生物标志物的用途。在此实施例中，将镶嵌有抗体的磁珠与样品混合以捕获靶生物标志物。收集珠并将其直接或通过化学连接子(如生物素等结合化合物1与如链霉亲和素等结合化合物2之间的相互作用)与插入脂质膜中的纳米孔缀合。带标签检测抗体的随后结合允许确定生物标志物在阵列上的给定位置处。此方法被设计成提高灵敏度。
图10A：使用捕获抗原对带标签血清抗体的纳米孔检测。在此实施例中，使用标准标记程序将血清中的如抗体等蛋白质与纳米孔可检测标签缀合。使用与纳米孔连接的抗原来从血清样品中捕获带标签抗体。跨膜施加电压梯度以捕获标签，并且记录电流。其特异性标签信号的识别将揭示血清样品中所关注抗体的存在。虽然这里示出为单个抗原，但可以将多个抗原拷贝与纳米孔连接。
图10B：使用链霉亲和素捕获对血清抗体的纳米孔检测。在此实施例中，使用标准程序将血清抗体与纳米孔可检测标签缀合，并且将这些血清抗体的抗原生物素化。使用与纳米孔连接的链霉亲和素分子通过生物素-链霉亲和素相互作用来捕获生物素化抗原。接下来，将带标签血清抗体与纳米孔上的复合物结合。跨膜施加电压梯度以在纳米孔通道中捕获标签，并且记录电流。其特异性标签信号的识别将揭示所关注抗体的存在。生物素和链霉亲和素的放置可以颠倒。
图10C：使用抗地高辛抗体捕获对血清抗体的纳米孔检测。在此实施例中，使用标准程序将血清抗体与纳米孔可检测标签缀合，并且用地高辛将这些血清抗体的抗原衍生化。使用与纳米孔连接的抗地高辛抗体分子通过地高辛-抗地高辛相互作用来捕获地高辛标记的抗原。接下来，将带标签血清抗体与纳米孔上的复合物结合。跨膜施加电压梯度以在纳米孔通道中捕获标签，并且记录电流。其特异性标签信号的识别将揭示所关注抗体的存在。生物素和链霉亲和素的放置可以颠倒。
图11A：使用捕获抗原和带标签二级抗体对血清抗体的纳米孔检测。在此实施例中，将抗原与纳米孔结合并且用于捕获特异性血清抗体。接下来，使带标签二级抗体(针对捕获的抗体的Fc部分提出的抗体)流过纳米孔芯片。跨膜施加电压梯度以捕获标签，并且记录电流。其特异性标签信号的识别将揭示血清样品中所关注抗体的存在。虽然这里示出为单个抗原，但可以将多个抗原拷贝与纳米孔连接。
图11B：使用血清抗体与标签之间的生物素-链霉亲和素相互作用对血清抗体的纳米孔检测。在此实施例中，将血清抗体生物素化，并且将链霉亲和素与纳米孔可检测标签连接。使用标准程序将可以由血清抗体识别的抗原与纳米孔连接。此抗原将捕获生物素化的血清抗体。接下来，利用带标签链霉亲和素的温育将标签与纳米孔上的复合物连接。跨膜施加电压梯度以在纳米孔通道中捕获标签，并且记录电流。其特异性标签信号的识别将揭示所关注抗体的存在。生物素和链霉亲和素的放置可以颠倒。
图11C：使用血清抗体与标签之间的地高辛-抗地高辛抗体相互作用对血清抗体的纳米孔检测。在此实施例中，利用地高辛来衍生化血清抗体，并且将抗地高辛抗体与纳米孔可检测标签连接。使用标准程序将可以由血清抗体识别的抗原与纳米孔连接。此抗原将捕获地高辛衍生化的血清抗体。接下来，利用带标签抗地高辛抗体的温育将标签与纳米孔上的复合物连接。跨膜施加电压梯度以在纳米孔通道中捕获标签，并且记录电流。其特异性标签信号的识别将揭示所关注抗体的存在。生物素和链霉亲和素的放置可以颠倒。
图12：使用与纳米孔连接的病毒颗粒和针对病毒外壳蛋白的带标签一级抗体对血清抗体的纳米孔检测。在此方法中，将包含任何病毒抗体的血清中的蛋白质与纳米孔可检测标签缀合。通过化学连接子例如通过生物素-链霉亲和素相互作用将纳米孔与病毒颗粒或病毒颗粒片段缀合。将由于电流或先前的病毒感染而针对病毒外壳蛋白提出的带标签血清抗体吸引到纳米孔上的病毒颗粒。这些抗体的揭示归功于纳米孔标签的存在，当在跨膜施加电压后标签在纳米孔通道中被捕获时，所述纳米孔标签产生离子电流阻断。
图13：使用与纳米孔连接的病毒颗粒以及带标签二级抗体对血清抗体的纳米孔检测。在图12示出的方案的此替代性方案中，血清中的蛋白质未被加标签；相反，将纳米孔可检测标签与针对血清抗体的Fc部分提出的二级抗体缀合。通过化学连接子例如通过生物素与链霉亲和素之间的相互作用将纳米孔与和纳米孔连接的病毒颗粒或病毒颗粒片段缀合。将由于电流或先前的病毒感染而针对病毒外壳蛋白提出的血清抗体吸引到纳米孔上的病毒颗粒。这些抗体的揭示归功于二级抗体上纳米孔标签的存在，当在跨膜施加电压后标签在纳米孔通道中被捕获时，所述纳米孔标签产生离子电流阻断。
图14：病毒抗原装饰的磁珠用于捞出由于病毒感染而存在于血清或其它样品中的抗病毒抗体的用途。在此实施例中，使用镶嵌有病毒蛋白的磁珠来捕获血清中的抗体。在通过如生物素等结合化合物1和如链霉亲和素等结合化合物2之间的相互作用将复合物与纳米孔化学连接后，使用针对捕获的抗体的Fc部分的带标签二级抗体(例如，山羊-抗兔抗体)来确定抗病毒抗体的存在。方法具有提高灵敏度的潜力。
图15：使用捕获抗体和带标签检测抗体对血清中的抗原-抗体复合物的纳米孔检测。在此实施例中，将捕获抗体与纳米孔结合并且用于捕获特异性血清抗原-抗体复合物。接下来，使带标签二级抗体(针对复合物中的捕获的抗体的Fc部分提出的抗体)流过纳米孔芯片。跨膜施加电压梯度以捕获标签，并且记录电流。标签信号的识别将揭示血清样品中所关注抗原-抗体复合物的存在。可以通过使用含有捕获抗体簇的磁珠来进一步修饰此方法，以进一步提高灵敏度。尽管这里示出了单个捕获抗体，但可以将捕获抗体或小抗体模拟物的多个拷贝与纳米孔连接。
图16：使用纳米孔阵列对靶蛋白的多重化和定量。图1所示的方案的实例，其中针对不同标靶的捕获抗体以相等的比例跨纳米孔阵列分布在随机位置；这些位置在实验开始时是未知的(A)。在与其靶标和其它分子的混合物一起流入样品中(B)后，使针对不同靶标的等摩尔纳米标签检测抗体混合物流到阵列上(C)。这些带标签抗体将与靶标结合，所述靶标已经根据其在样品中的比率与捕获抗体结合。跨膜施加电压将允许由与阵列上的每个位置相关联的单个纳米孔捕获标签，并且由与每个纳米孔相邻的迹线中的跌落的不同深度展示的所得阻断电流将确定在每个位置处捕获哪个靶蛋白(D)，所述不同深度指示不同标签。利用足够大的阵列，仅通过对显示每个阻断电流的位置数进行计数，就可以确定样品中靶蛋白的比率。应注意，当靶标不与捕获抗体结合时，由于不存在相关联标签，因此获得了开放通道电流。
图17：用于将纳米孔标签与抗体或其它分子连接的可裂解连接子。这里示出了可以安装在将标签与检测抗体或其它检测分子连接的连接子中的可裂解基团的五个实例，以及可以用于在保持蛋白质完整的同时在这些位置处裂解连接子的化学剂。
图18：在此实施例中，通过可裂解连接子将针对特异性靶分子的捕获抗体与特异性纳米孔标签连接。跨膜施加电压梯度以捕获标签，并且记录电流。标签信号的识别将揭示在阵列的所述位置处存在哪个捕获抗体。将标签裂解，并且使用此抗体来从血清或其它来源捕获特异性靶分子。用不同于捕获抗体上的特异性标签的一般纳米孔标签来预先标记血清中的不同靶分子的分类。再次跨膜施加电压梯度以捕获新的标签，并且记录电流。初始电流记录指示哪个抗体存在并且因此哪个靶分子可以结合，并且第二电流指示所述靶分子的实际结合。跨芯片对这种组合事件进行计数将揭示血清中的不同靶分子的相对数量。(如果未裂解抗体上的标签，则跨膜施加脉冲电压将导致第二记录是一系列特异性标签和一般标签读数两者。)
图19：可裂解三官能连接子NHS酯-偶氮TCO/PEG3-马来酰亚胺的合成。首先将TCO与Fmoc保护的赖氨酸偶联，所述Fmoc保护的赖氨酸可以通过羧酸活化和酰胺键形成进一步与偶氮连接子偶联。去除Fmoc基团允许利用马来酰亚胺NHS酯再进行一个偶联步骤。偶氮连接子酸的后续活化提供了NHS酯-偶氮TCO/PEG3-马来酰亚胺。
图20：纳米孔-捕获抗体-可裂解标签缀合物的制备。使在图19中合成的可裂解三官能连接子NHS酯-偶氮TCO/PEG3-马来酰亚胺与氨基标签反应，从而产生标签-偶氮TCO/PEG3-马来酰亚胺缀合物，通过TCO-四嗪添加，所述缀合物可以容易与四嗪修饰的捕获抗体反应。通过硫醇-烯添加使所得标签-偶氮捕获抗体-马来酰亚胺缀合物进一步与α-溶血素-SH反应，从而提供了纳米孔可裂解标签-捕获抗体缀合物，其中标签可以通过连二亚硫酸钠处理时的偶氮还原和裂解来去除。
具体实施方式
本发明提供了一种用于检测样品中所关注化合物的存在的方法，所述方法包括：
a)将用于所述所关注化合物的捕获化合物或所述捕获化合物的多个拷贝与纳米孔结合或结合在纳米孔附近；
b)将所述纳米孔插入电阻屏障中；
c)在允许所述所关注化合物与所述捕获化合物连接的条件下，使所述捕获化合物或所述捕获化合物的所述多个拷贝与含有所述所关注化合物的所述样品接触；
d)在允许带标签化合物与所述所关注化合物连接的条件下，使所述所关注化合物与所述带标签化合物或所述带标签化合物的多个拷贝接触，其中所述带标签化合物包括至少一个标签；
e)使所述纳米孔与电解质溶液接触并跨所述电阻屏障施加电压；以及
f)测量由所述带标签化合物的至少一个标签进入所述纳米孔引起的跨所述孔的电子信号变化，
由此检测所述所关注化合物的存在。
在本发明的实施例中，步骤c)发生在步骤a)之前。在本发明的实施例中，步骤d)发生在步骤c)之前。在本发明的实施例中，步骤b)发生在步骤a)之前。
本发明提供了一种检测样品中所关注化合物的存在的方法，所述方法包括：
a)在允许供所述所关注化合物连接的捕获化合物的多个拷贝的磁珠与纳米孔连接或连接在纳米孔附近的条件下，使所述纳米孔与所述磁珠和用于通过结合化合物1将所述磁珠与所述纳米孔连接或连接在所述纳米孔附近的结合化合物2接触，其中所述结合化合物1与所述纳米孔连接或连接在所述纳米孔附近；
b)将所述纳米孔插入电阻屏障中；
c)在允许所述所关注化合物与所述捕获化合物结合的条件下，使所述珠上的所述捕获化合物与含有所述所关注化合物的样品接触；
d)在允许带标签化合物与所述所关注化合物连接的条件下，使所述所关注化合物与所述带标签化合物接触，其中所述带标签化合物包括至少一个标签；
e)使所述纳米孔与电解质溶液接触并跨所述电阻屏障施加电压；以及
f)测量由所述带标签化合物的至少一个标签进入所述纳米孔引起的跨所述孔的电子信号变化，
由此检测所述所关注化合物的存在。
在本发明的实施例中，步骤c)发生在步骤a)之前。在本发明的实施例中，步骤d)发生在步骤c)之前。在本发明的实施例中，步骤b)发生在步骤a)之前。
本发明提供了一种用于确定样品中多种不同所关注化合物的存在和/或相对数量的方法，所述方法包括：
a)使多个纳米孔与多种不同捕获化合物接触，
其中每种类型的捕获化合物与所述样品中不同类型的所关注化合物结合，
所述接触是在使得每种捕获化合物与所述多个纳米孔之一结合或结合在所述多个纳米孔之一附近的条件下；
b)将所述多个纳米孔插入电阻屏障中；
c)在允许每种所关注化合物与捕获化合物结合的条件下，使所述多种不同捕获化合物与所述样品接触，所述样品包括所述多种不同所关注化合物；
d)使所述多种不同所关注化合物与多种不同带标签化合物接触，
其中每种类型的带标签化合物与不同类型的所关注化合物结合，
其中每种类型的带标签化合物包括至少一个标签，
其中每种类型的带标签化合物包括与每种其它类型的带标签化合物不同的类型的标签，
其中每种类型的带标签化合物的身份与标签的类型相关，
所述接触是在使得每种带标签化合物与所关注化合物结合的条件下；
e)使所述多个纳米孔与电解质溶液接触并跨所述电阻屏障施加电压；
f)测量由所述带标签化合物中的每种带标签化合物的至少一个标签进入所述纳米孔引起的跨所述多个纳米孔中的每个纳米孔的电子信号变化；以及
g)任选地比较如此被纳米孔检测到的每种类型的标签的相对数；
由此确定所述样品中所述多种不同所关注化合物的存在和/或相对数量。
本发明提供了一种用于确定样品中多种不同所关注化合物的存在和/或相对数量的方法，所述方法包括：
a)使多个纳米孔与多种不同捕获化合物接触，
其中每种类型的捕获化合物与所述样品中不同类型的所关注化合物结合，
其中每种类型的捕获化合物包括至少一个标签，
其中每种类型的捕获化合物包括与每种其它类型的捕获化合物不同的类型的标签，
其中每种类型的捕获化合物的身份与标签的类型相关，
所述接触是在使得每种捕获化合物与多个纳米孔之一结合或结合在多个纳米孔之一附近的条件下；
b)将多个纳米孔插入电阻屏障中；
c)使多个纳米孔与电解质溶液接触并跨所述电阻屏障施加电压；
d)测量由所述捕获化合物中的每种捕获化合物的至少一个标签进入纳米孔引起的跨多个纳米孔中的每个纳米孔的电子信号变化，由此确定连接在每个纳米孔附近或与每个纳米孔连接的所述捕获化合物的身份；
e)使所述多种不同捕获化合物与所述样品接触，所述样品包括所述多种不同所关注化合物，
其中每种所关注化合物具有相同类型的标签与其连接，
所述接触是在允许每种所关注化合物与捕获化合物结合的条件下；
f)使多个纳米孔与电解质溶液接触并跨所述电阻屏障施加电压；
g)测量由所述所关注化合物中的每种所关注化合物的所述标签进入纳米孔引起的跨多个纳米孔中的每个纳米孔的电子信号变化；以及
h)任选地比较被纳米孔检测到的标签的相对数；
由此确定所述样品中所述多种不同所关注化合物的存在和/或相对数量。
在本发明的实施例中，步骤b)发生在步骤a)之前。
在本发明的实施例中，与所述捕获化合物的连接的所述标签在步骤d)之后被裂解。
在本发明的实施例中，所述捕获化合物或所述捕获化合物的所述多个拷贝与所述纳米孔连接。在本发明的实施例中，所述捕获化合物或所述捕获化合物的所述多个拷贝连接在所述纳米孔附近。在本发明的实施例中，所述捕获化合物是抗体。在本发明的实施例中，所述捕获化合物是抗体模拟物。在本发明的实施例中，所述抗体模拟物是亲和体、亲合体(avibody)、affimer、纳米钳(nanoclamp)、药剂或有机小分子中的一种。
在本发明的实施例中，所述带标签化合物是抗体。在本发明的实施例中，所述带标签化合物是抗体模拟物。在本发明的实施例中，所述抗体模拟物是亲和体、亲合体、affimer、纳米钳、药剂或有机小分子中的一种。
在本发明的实施例中，所述一种或多种所关注化合物是抗原。在本发明的实施例中，所述抗原是生物标志物、蛋白质、脂质、碳水化合物、DNA、糖蛋白、脂蛋白、病毒颗粒或其它复合分子中的一种。
本发明提供了一种用于确定生物分子的分子相互作用的方法，所述方法包括：
a)将所述生物分子或所述生物分子的多个拷贝与纳米孔连接或连接在纳米孔附近；
b)将所述纳米孔插入电阻屏障中；
c)在使得所述生物分子和推定的相互作用化合物相互作用的条件下，使所述生物分子与含有所述推定的相互作用化合物的样品接触，并且任选地执行交联步骤以结合所述生物分子和所述推定的相互作用化合物；
d)在允许带标签化合物与所述推定的相互作用化合物结合的条件下，使所述推定的相互作用化合物与所述带标签化合物接触，其中所述带标签化合物包括至少一个标签；
e)使所述纳米孔与电解质溶液接触并跨所述电阻屏障施加电压；以及
f)测量由所述带标签化合物的至少一个标签进入所述纳米孔引起的跨所述孔的电子信号变化，
由此检测生物分子的所述分子相互作用。
在本发明的实施例中，步骤b)发生在步骤a)之前。
在本发明的实施例中，所述生物分子通过柔性连接子与所纳米孔连接。
在本发明的实施例中，所述标签通过可裂解连接子与所述带标签化合物连接，并且所述标签是在步骤d)之后从所述带标签化合物裂解的。
在本发明的实施例中，所述生物分子是生物标志物、蛋白质、脂质、碳水化合物、DNA、糖蛋白、脂蛋白、病毒颗粒或其它复合分子中的一种。
在本发明的实施例中，所述推定的相互作用分子是生物标志物、蛋白质、脂质、碳水化合物、DNA、糖蛋白、脂蛋白、病毒颗粒或其它复合分子中的一种。
在本发明的实施例中，所述带标签化合物是生物标志物、蛋白质、脂质、碳水化合物、DNA、糖蛋白、脂蛋白、病毒颗粒或其它复合分子中的一种。
在本文所描述的方法的实施例中，所述一个或多个标签包括聚合物分子。在本发明的实施例中，所述聚合物分子是聚合物，所述聚合物包括PEG、烷烃、肽、多肽、多核苷酸或其任何组合中的一种或多种。在本发明的实施例中，所述标签进一步包括扩大或减小所述纳米孔内的所述标签的直径的修饰。在本发明的实施例中，所述标签进一步包括改变所述标签的电荷的修饰。在本发明的实施例中，所述标签包括以下中的一种或多种：dSP、C3、Cn、PEG、吡咯烷、精胺、亚精胺、硝基吡咯、硝基吲哚、水粉蕈素、苯并咪唑、苯、7-脱氮杂嘌呤、经5取代的嘧啶、荧光素-dT、荧光素、罗丹明、ROX、花青染料或其任何组合。
在本文所描述的方法的实施例中，所述纳米孔是固态纳米孔，其中步骤b)发生在步骤a)之前，或者其中步骤b)被省略。在本文所描述的方法的实施例中，所述纳米孔是固态纳米孔，在此情况下，所述捕获化合物在第一步骤中与所述纳米孔连接或连接在所述纳米孔附近。在本发明的实施例中，所述电阻屏障包括石墨烯、二硫化钼或氮化硅。
在本文所描述的方法的实施例中，所述纳米孔包括生物纳米孔。在本发明的实施例中，所述纳米孔是α-溶血素。在本发明的实施例中，所述纳米孔是α-溶血素、MspA或OmpG或FraC或气单胞菌溶素或β-桶类其它跨膜孔复合物或其它类跨膜孔复合物。在本发明的实施例中，所述电阻屏障是脂质双层。
在本发明的实施例中，所述纳米孔是杂交蛋白质-固态纳米孔。
在本发明的实施例中，所述纳米孔包括集成电子传感器。
如本文所用并且除非另有说明，否则以下术语中的每个术语均应具有下文所阐述的定义。
“抗体”应包含但不限于：(a)包括两条重链和两条轻链并识别抗原的免疫球蛋白分子；(b)多克隆或单克隆免疫球蛋白分子；以及(c)其单价或二价片段。免疫球蛋白分子可以衍生自任何通常已知的类别，包含但不限于IgA、分泌性IgA、IgG、IgE和IgM。IgG亚类是本领域技术人员众所周知的并且包含但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。抗体可以是天然存在的和非天然存在的两者。此外，抗体包含嵌合抗体、全合成抗体、单链抗体以及其片段。抗体可以是人的或非人的。抗体片段包含但不限于Fab片段、Fv片段和其它抗原结合片段。
“纳米孔”包含例如包括以下的结构：(a)由物理屏障隔开的第一隔室和第二隔室，所述屏障具有直径例如为约1到10nm的至少一个孔；以及(b)用于跨屏障施加电场的构件，使得如DNA、核苷酸、核苷酸类似物或标签等带电分子可以从第一隔室穿过孔进入第二隔室。纳米孔理想地进一步包括用于测量穿过其屏障的分子的电子签名的构件。纳米孔屏障可以是合成的或部分地天然存在的。屏障可以包含例如其中具有α-溶血素、如孔蛋白等寡聚蛋白通道以及合成肽的脂质双层等。屏障还可以包含具有尺寸合适的一个或多个孔的无机板。在本文中，有时等效地使用“纳米孔”、“纳米孔屏障”和纳米孔屏障中的“孔”。应理解，纳米孔的电场可以是可调整的。还应理解，如DNA、核苷酸、核苷酸类似物或标签等带电分子不需要从第一隔室穿过孔到达第二隔室以产生电子签名。此类电子签名可以通过分子在孔内的定位来产生。
纳米孔装置在本领域中是已知的，并且纳米孔和采用纳米孔的方法在以下中公开：美国专利第7,005,264号；第7,846,738号；第6,617,113号；第6,746,594号；第6,673,615号；第6,627,067号；第6,464,842号；第6,362,002号；第6,267,872号；第6,015,714号；第5,795,782号；以及美国公开第2004/0121525号、第2003/0104428号和第2003/0104428号，所述文献中的每一个通过全文引用的方式特此并入。
通过施加电场(例如，施加的电压)穿过孔的分子的“阻断签名”应包含例如分子标签穿过孔的持续时间以及在所述穿过期间观察到的电流幅度。设想了分子的阻断签名，并且所述阻断签名可以是例如通过施加电场供分子穿过孔的电流(例如，pA)对时间的绘图。替代性地，对于不穿过孔的分子，也可确定阻断签名。还设想了此类分子的阻断签名，并且所述阻断签名可以是例如供分子进入孔或与孔相邻地通过的电流(例如，pA)对时间的绘图。在本文中，有时等效地使用“阻断签名”、“阻断信号”和“电子签名”。在本文中，有时等效地使用“电压”和“电场”。
构建了作为易位时间对阻断电流的绘图的特定事件图。此特定事件图(也称为阻断签名)用于基于如易位电流、易位持续时间以及其在图中的对应分散度等特征参数通过单通道记录技术来区分分子。
如本文所用，“标签”或“标签部分”是能够产生可用纳米孔检测到的独特阻断签名的任何化学基团或分子。在一些情况下，标签包括以下中的一种或多种：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、荧光化合物、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、多核苷酸、核苷酸单磷酸、核苷酸二磷酸、核苷酸多磷酸、脂肪酸、芳香酸、未取代的醇或硫醇、用一个或多个卤素取代的醇或硫醇、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合。
如本文所用，除非另有说明，否则与参考分子的标签部分不同或可区分的标签部分意味着标签部分具有与其它/所参考标签部分的化学结构不同的化学结构。标签部分与所参考分子的标签部分不同或可区分还可以意味着标签部分具有与其它/所参考标签部分的阻断签名不同的阻断签名。
如本文所用，“定位”在孔内的标签是位于孔内部或与孔相邻的标签。定位在孔内的标签不一定穿过孔或将孔易位。
如本文所用，“蛋白质”化合物意指由氨基酸形成的任何生物聚合物，如肽、蛋白质、抗体、抗原或其片段或一部分。此类化合物可以是天然存在的或非天然存在的。
如本文所用，“烷基”包含具有规定数目的碳原子的支链饱和脂肪族烃基和直链饱和脂肪族烃基两者并且可以是未经取代的或经取代的。因此，如“C1-Cn烷基”中的C1-Cn包含具有1个、2个、...、n-1个或n个碳的呈直链或支链布置的基团。例如，“C1-C5烷基”包含具有1个、2个、3个、4个或5个碳的呈直链或支链布置的基团并且具体地包含甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基和戊基。
如本文所用，术语“烯基”是指含有至少1个碳-碳双键的直链或支链非芳香族烃基，并且至多最大可能数目的非芳香族碳-碳双键可以存在并且可以是未经取代的或经取代的。例如，“C2-C5烯基”意指分别具有2个、3个、4个或5个碳原子和至多1个、2个、3个或4个碳-碳双键的烯基。烯基包含乙烯基、丙烯基和丁烯基。
术语“炔基”是指含有至少1个碳-碳三键的直链或支链烃基，并且至多最大可能数目的非芳香族碳-碳三键可以存在并且可以是未经取代的或经取代的。因此，“C2-C5炔基”意指具有2个或3个碳原子和1个碳-碳三键或具有4个或5个碳原子和至多2个碳-碳三键的炔基。炔基包含乙炔基、丙炔基和丁炔基。
术语“经取代的”是指如上所述的如烷基或烃基等官能团，其中所含有的到氢原子的至少一个键被到非氢或非碳原子的键置换，条件是维持正常的化合价并且一个或多个取代产生稳定的化合物。经取代的基团还包含其中到一个或多个碳或一个或多个氢的一个或多个键被到杂原子的一个或多个键(包含双键或三键)置换的基团。取代基的非限制性实例包含上述官能团以及例如N例如以便形成-CN。
应当理解的是，在本发明的化合物上的取代基和取代模式可以由本领域普通技术人员选择，以提供化学上稳定并且可以通过本领域已知的技术以及下文列出的那些方法从容易获得的原料中容易地合成的化合物。如果取代基本身被多于一个基团取代，则应当理解的是，这些多个基团可以是在同一个碳上或者是在不同的碳上，只要结果是得到稳定的结构。
在选择本发明的化合物时，本领域普通技术人员将认识到，各种取代基即R1、R2等应按照化学结构连接性的众所周知的原理进行选择。
在本文所描绘的化合物结构中，通常不示出除核糖和脱氧核糖上的氢原子之外的氢原子。然而，应理解的是，在所表示的碳原子上存在足够的氢原子以满足八偶体规则。
在提供值范围的情况下，除非上下文另外明确规定，否则应当理解，介于所述范围的上限与下限之间的值的每个中间整数(除非上下文另外明确规定，否则以及值的每个中间整数的十分之一)以及所陈述范围中的任何其它所陈述的值或中间值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在更小的范围中并且也涵盖在本发明内，这受制于所陈述的范围中的任何明确排除的限值。在所陈述的范围包含限值中的一者或两者的情况下，排除那些被包含限值中的(i)任一者或(ii)两者的范围也包含在本发明中。
术语第一(first)抗体和第二(second)抗体(第一(1st)抗体和第二(2nd)抗体；抗体1和抗体2；捕获抗体和检测抗体)的使用不等同于一级抗体和二级抗体，除了实例8之外，所述一级抗体和所述二级抗体通常不适用于本文中公开的方法。二级抗体是针对一级抗体提出的抗体，所述一级抗体进而针对所关注抗原提出。在本主题申请中，第一抗体和第二抗体均是针对相同抗原蛋白或其它分子或针对两个相互作用的分子提出的。
靶标、靶分子、抗原、抗原分子和生物标志物在本文件中可互换使用。实施例8和12是例外，其中靶标是抗体或抗原-抗体复合物，而不仅仅是抗原。应当理解，一些所关注抗原可以不被确立为生物标志物，并且一些生物标志物可以不是抗原性的，但是可以具有可以在此方法中使用的结合配偶体。分析物是有时用于指靶分子的另外的术语。
在本文中，术语复合分子被认为包含如脂蛋白或糖蛋白等任何分子化合物或者包含但不限于蛋白质复合物和完整病毒体的复合物。
本文中公开的本发明的一些实施例包含可以对与和初始抗体相同的分析物上的不同表位结合的第二抗体(检测抗体)加标签。
本文所描述的各种要素的所有组合都在本发明的范围内。本文所描述的各种要素的所有子组合也都在本发明的范围内。
通过参考接下来的实验细节将更好地理解本发明，但是本领域技术人员将容易理解，如下文的权利要求中更全面地描述的，详述的具体实验仅仅是对本发明的说明。
实验细节和讨论
作为一般情况，如图1中概述的并且在实例7中更全面地描述的，程序将是如下：(1)捕获抗体、亲合体或对特定分析物(化合物)具有特异性的其它抗体模拟物、适配体或配体将与纳米孔阵列中的各个膜嵌入式纳米孔结合(或离纳米孔阵列中的各个膜嵌入式纳米孔非常近地结合)；(2)含有待鉴定分析物的样品将流过纳米孔阵列并与特异性捕获抗体或抗体模拟物结合；(3)在抗体夹心技术的版本中，带标签第二抗体(或亲合体或对特定分析物(化合物)具有特异性的其它抗体模拟物、适配体或配体)将在电解质溶液中流过纳米孔阵列并与分析物上的不同位点结合；并且(4)在跨膜施加电压后，将获得电流记录，从而允许鉴定与含有特定纳米孔的孔缔合的化合物。所述概念可以进一步扩展为这样的形式：其中在溶液相中执行与结合生物标志物有关的反应步骤(1-3)，并且然后将富集的纳米孔-抗体-生物标志物标签抗体复合物施加到纳米孔阵列并在单分子水平上进行评估。
与针对不用分析物的第二抗体连接的不同标签将引发不同的电流阻断，从而允许在同一纳米孔阵列上确定多个靶标。利用足够数目的纳米孔，可以获得定量或半定量结果(图1)。
U.S.2016/0041179 A1,Ju等人描述了特异性标签与特定分析物(所关注化合物)的共价连接。这一加标签是在使分析物流过芯片之前进行的。在本文公开的新型方法中，结合针对相同靶标的捕获抗体使用带标签第二抗体(检测抗体)，从而产生用于通过纳米孔进行单分子检测的灵活方法，从而允许各种多重化和定量策略。只要多种(或甚至相同)抗体可用于在不同表位处与之结合的蛋白质生物标志物，就不需要特殊的样品制备。与抗体与表面的结合可能会降低抗体结合抗原的能力的蛋白质阵列不同，第一抗体通过柔性连接子与纳米孔连接应保留第一抗体与其抗原结合的能力。此外，所得复合物应易于被带标签第二抗体接近。本文公开的本发明保留了基于纳米孔的方法的所有优点，包含：(1)单分子电子读数，从而产生了快速速度和高准确度；(2)高通量，这是由于在许多纳米孔上的读取的平行化；(3)多重化，这是基于能够容易地区分多个标签并利用多个流动池；(4)能够对蛋白质生物标志物水平进行定量，这是由于输出的数字性质(基本上是对大量纳米孔上的电子读数进行计数)；以及(5)小仪器尺寸和成本。与基于荧光标签的免疫检测方法相比，所述方法可以提供基本上更高的灵敏度和动态范围。
以上一般方法的变化可以包含通常通过柔性连接子将多个捕获抗体或小抗体模拟物(例如，亲和体、Avibodies(TM)、affimer、纳米钳)与纳米孔连接或连接在纳米孔附近以及使用检测抗体上的标签的多个拷贝。
实例1：将捕获抗体与纳米孔连接。在原始方法和新方法中，将捕获抗体(第一抗体或抗体1)与纳米孔连接是相同的。本领域技术人员将了解用于利用如赖氨酸或半胱氨酸等关键氨基酸残基来衍生化抗体的若干种方法。这些连接可以涉及同双功能试剂或异双功能试剂或双连接子系统，如可从
Figure BDA0002986534650000181
生物技术有限公司获得的系统(
Figure BDA0002986534650000182
试剂)或涉及狄尔斯-阿尔德反应的系统(参见下文)。其它可能性包含掺入了SpyCatcher/SpyTag相互作用配偶体的融合蛋白的生成(Zakeri等人2012)。在一个实施例中，免疫球蛋白(Ig)的Fc部分与纳米孔结合，使得Fab'2部分自由地与抗原反应。连接子分子的末端上的NHS酯或异硫氰酸酯基团的存在将允许其与抗体的N端氨基或赖氨酸上的伯氨基连接。虽然Fc部分和Fab部分中均存在赖氨酸，但这种简单的方法会生成较大比例的可接受连接。第二种可能性是与Ig分子的铰链区中的半胱氨酸残基连接。连接子上马来酰亚胺或碘乙酰胺的存在将允许其与半胱氨酸上的SH基团连接，这将需要还原连接两个半胱氨酸的二硫键。这将影响Ig的两个大亚基与彼此的结合。尽管这可能会稍微降低结合的整体亲合力，但它是最简单且更具位点定向性的替代性方案之一。另一个有吸引力的可能性是将胺或酰肼修饰的连接子与Fc恒定结构域上存在的高碘酸盐氧化的碳水化合物基团缀合，然后用氢硼化物还原所得的希夫碱(Schiff base)。其它缀合可能性包含点击化学(例如，炔烃-叠氮化物)反应和生物素-链霉亲和素相互作用。先前已经报告了用于将DNA聚合酶与α-溶血素(αHL)纳米孔连接的狄尔斯-阿尔德异双功能缀合策略(U.S.2016/0041179 A1)，并且抗体与这些纳米孔的连接将遵循相同的方法(图2)。实施上述缀合策略利用已经生成的α-溶血素突变蛋白，其中已将单一半胱氨酸引入七个孔亚基中的一个或多个孔亚基上的特定位置处，从而使其对马来酰亚胺和其它巯基反应性部分具有特异性反应性。最后，可以执行基于将正交氨基酸类似物掺入蛋白质中的定向连接策略。无论使用的具体方法如何，目标都是将特异性抗体的单个或仅几个拷贝与纳米孔阵列中的每个纳米孔连接。(关于捕获抗体的结构和缀合位点，参见图3的左上图。)本文公开了这样的替代性策略：其中使用含有相同捕获抗体的簇的珠来增加靶标捕获的可能性(例如，图9)。
可以使用各种蛋白纳米孔和固态纳米孔。尽管在通过合成研究进行测序时使用了包含各种突变形式的α-溶血素纳米孔(U.S.2018/0073071 A1、U.S.9,890,426 B2、U.S.2015/0368710 A1、U.S.2015/0111759 A1、U.S.8,889,348 B2、U.S.2013/0264207 A1、Kumar(2012)、Fuller (2016)和Stranges(2016))，但可以使用其它蛋白纳米孔如MspA(Derrington等人2010)、OmpG(Sanganna Gari等人2019)、FraC(Huang等人2019)、气单胞菌溶素(Wang等人2018)、炭疽保护性抗原(Jiang等人2015)、其它β-桶跨膜孔(Heuck等人2001)和各种商业定制的纳米孔、其突变体和衍生物。
对于这些，可以利用上述大多数连接和缀合化学。其它选择包含基于石墨烯(Merchant和Drndic 2012)、MoS2(Graf等人2019)、Si3N4(Rollings等人2012)和其它材料(Shi等人2017)的固态纳米孔、杂交蛋白质-固态纳米孔(Hall等人2010)以及具有集成电子传感器的纳米孔(Rosenstein等人2012)。在这些情况下，可以使用其中许多与上述相同并且均在本领域中众所周知的各种衍生化和偶联策略。在一些实施例中，第一抗体可以不直接与纳米孔连接，而是连接在附近(参见下文的实例10)。抗体的多个拷贝可以与纳米孔连接或连接在纳米孔附近。
最后，可以用纳米孔可检测标签对第一抗体或与之相关联的纳米孔进行特异性加标签，使得即使在结合的生物标志物不存在的情况下，所述第一抗体和所述纳米孔的身份也可以随后以复杂的多重化形式在纳米孔阵列上被识别。在许多方法益处中，此实施方案提供了直接测量复杂分析物混合物中特异性生物标志物的不存在。结合可以通过凝胶移位测定来评估。此方法在下文的实例11中更详细地描述，在所述实例中，所述方法被描述成用于靶分子的多重检测。
实例2：将标签与第二抗体(检测抗体)连接。第二抗体将与纳米孔可检测标签连接。已经报告了具有从正(顺式侧)到负(反式侧)的跨膜电压梯度的基于聚(乙烯)乙二醇(PEG)的标签(U.S.2015/0111759 A1和Kumar(2012))。最近，已经报告了具有需要反向电压极性(顺式侧为负并且反式侧为正)的带负电荷的多核苷酸主链的标签(U.S.2013/0264207A1、Fuller(2016)和Stranges(2015))。寡核苷酸将用末端胺修饰以用于与含NHS酯的连接子(关于用于将这种连接子与检测抗体连接的两种不同方法，参见图4A和4B)连接，但是用于连接子连接的标签的各种其它修饰也是众所周知的。第二抗体上的连接位置将与前面段落中描述的用于将连接子与第一抗体连接的连接位置相同。尽管使用了特定的方法，但目标将是将单个标签(或标签的几个拷贝以增加信号检测的可能性)与每个检测抗体连接。(关于检测抗体的结构和缀合位点，参见图3右上图。)
再次，如上文在实例1中提及的，可以用纳米孔可检测标签对第一抗体或与之相关联的纳米孔进行特异性标记，使得即使在结合的生物标志物不存在的情况下，所述第一抗体或所述纳米孔的身份也可以随后以复杂的多重化形式在纳米孔阵列上被识别。在许多方法益处中，此实施方案提供了直接测量复杂分析物混合物中特异性生物标志物的不存在。标签与第二抗体的结合可以通过凝胶移位测定和/或使用标签中包含的荧光标记来评估，所述荧光标记优选地在与氨基修饰相反的一端处。
实例3：抗体的替代性方案。尽管抗体是用于与各种靶标(抗原)结合的最常用且可能是最易理解的分子，但是最近，包含亲和体(Lofblom等人2010)、AvibodiesTM(avipep私人有限公司(avipep Pty Ltd))、affimer(Tiede等人2017)、纳米钳(Suderman等人2017)和各种其它有机小分子的各种抗体模拟物已被生产出来，其中许多已被开发为药剂。另外，可以使用由抗体片段组成的融合蛋白代替完整抗体。
实例4：靶抗原(分析物)的类型。尽管最典型的抗原将是蛋白质分子，并且许多蛋白质确实已被鉴定为生物标志物，但抗原可以包含各种其它小分子或大分子，包含脂质、碳水化合物、DNA或者如糖蛋白或脂蛋白等复合分子或者如病毒颗粒等更大的复合物，从而再次主要集中于用于癌症和其它疾病的生物标志物，所述其它疾病包含但不限于感染过程。除了病理学之外，还可以利用合适的生物标志物鉴定和监测其它生理和疾病前状态，包含妊娠、衰老、药物反应等。特别关注的样品将是血液、尿液和用于非侵入性诊断的其它流体，但也将包含组织活检或适当保存的档案尸检材料。
实例5：蛋白质-蛋白质和其它分子相互作用。除了抗原-抗体(或抗体模拟物)相互作用之外，所述方法还可以用于鉴定其它分子相互作用。生物学中的关键分子相互作用包含蛋白质之间的相互作用、蛋白质-DNA相互作用和蛋白质-RNA相互作用、小分子和辅酶因子与大分子的结合如药物-酶相互作用和药物-受体相互作用以及许多其它相互作用(Vidal等人2011)。用于识别这些相互作用的经典生化和遗传方法有许多缺点。例如，对于蛋白质-蛋白质相互作用，凝胶移位测定可以检查给定诱饵蛋白的蛋白质相互作用。所述方法限于一次一种诱饵蛋白。类似地，酵母双杂交和有关方法可以鉴定用作诱饵的特定蛋白的靶标。虽然原则上可以设计使用多种诱饵蛋白的蛋白质芯片，但很难将这些表面结合蛋白维持在可以识别其天然配偶体蛋白的形式，并且与已经存在许多Ab的基于抗体的蛋白质芯片不同的是，必须针对每种诱饵蛋白专门开发这些蛋白质芯片。这里，诱饵蛋白(或其它相互作用分子)将通过柔性连接子以使得诱饵蛋白保留其结构和结合性质的方式与纳米孔连接。
因此，本文公开了一种用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的方法，其中捕获抗体(抗体1)对诱饵蛋白具有特异性，并且带标签检测抗体(抗体2)对诱饵的潜在靶蛋白具有特异性。在此方案中，如图5所展示的，执行以下一系列步骤：(1)将抗体1与纳米孔缀合或缀合在纳米孔附近，所述纳米孔已经或随后插入膜中；(2)将含有推定的相互作用蛋白的样品添加到芯片以结合诱饵蛋白和任何相关联蛋白(可以在添加到芯片之前或之后执行交联步骤以维持这些蛋白质-蛋白质相互作用)；(3)将对推定的靶蛋白具有特异性的带标签抗体2(如果抗体1没有直接与孔(例如，与表面或膜)连接，则通过可裂解连接子连接；如果抗体1直接与纳米孔连接，则通过不可裂解连接子连接)在电解质溶液中添加到芯片；(4)如果需要，则执行标签的裂解；并且(5)跨膜施加电压并记录离子电流；用于标签的预期信号(离子电流阻断)的鉴定指示了靶标与诱饵的结合。
如上文所提及的，所述概念可以进一步扩展为这样的形式：其中在溶液相中执行与将诱饵和靶标与纳米孔复合物和合适的抗体结合有关的反应步骤(1-3)，并且然后将富集的纳米孔-抗体-诱饵-靶标标签抗体复合物施加到纳米孔阵列并在单分子水平上进行评估。在施加到阵列之前，可以通过凝胶移位测定或使用荧光标记来评估复合物的形成。
虽然图5中示出了单个捕获抗体分子，但可以将多个捕获抗体或小抗体模拟物与纳米孔结合，以增加捕获的机会并因此增加灵敏度。
实例6：标签的性质。标签通常是聚合物分子，当跨纳米孔所插入的膜施加给定电压时，所述聚合物分子穿透纳米孔的通道以将离子电流降低到限定的程度。为此目的已开发了各种聚合物(U.S.2018/0073071 A1、U.S.2015/0368710 A1、U.S.2017/0058335 A1和WO 2016/154215 A1)。实例包括含有PEG、烷烃、肽/多肽和多核苷酸主链或其组合的聚合物。这些聚合物进而可以通过各种方式被修饰，以扩大或减小其在通道的关键位置的直径、具有更大的负或更大的正总电荷或局部电荷、具有更多或更少极性或者针对纳米孔具有亲和性质。已经提出了此类标签的许多实例(U.S.2018/0073071 A1、U.S.2015/0368710 A1和WO 2016/154215 A1)。图6示出了可以利用进入孔中的不同标签获得的离子电流读数的分离。图7和8示出了标签的实例，其中许多标签已经合成并且在其它地方进行了报告(Kumar(2012)、Fuller(2016)和Stranges(2016))。
实例7：用于使用各自针对蛋白质的不同部分的抗体1和抗体2进行基于纳米孔的蛋白质感测的基本方案。在图1中呈现的示例性方法中：(1)将抗体1(捕获抗体)标记的纳米孔插入芯片上的膜中，理想地在阵列上每个传感器一个纳米孔；(2)接下来，将芯片与样品中存在的抗原一起温育；(3)然后，通常将芯片与带标签抗体2(检测抗体)在电解质溶液中一起温育；(4)最后，跨膜施加电压并测量所得的离子电流：指示标签进入纳米孔通道的持续电流阻断将指示抗原与复合物的结合。必要时在温育之间进行洗涤以从先前的温育中去除未结合的分子，这可能会抑制后续步骤或与后续步骤竞争。可以根据用于区分离子电流水平的期望条件关于特定离子和其浓度在宽范围内调整电解质溶液。虽然可以使用单纳米孔设置(例如，Axopatch、EBS)来执行测试实验，但已经开发了纳米孔阵列(Fuller等人2016)并且所述纳米孔阵列是系统的进一步优化所期望的并且是多重化和数字定量所必需的。
相同的抗体可以用作捕获抗体和检测抗体两者，只要其可以与抗原上的不同位置(例如，识别抗原上的多个表位的多克隆抗体)结合。
此基本方法可以以这样的形式执行：其中在溶液相中例如在合适的微流体装置中执行与将生物标志物与纳米孔缀合的抗体1和带标签抗体2结合有关的反应步骤，并且然后将富集的纳米孔-抗体-生物标志物标签抗体复合物施加到纳米孔阵列并在单分子水平上进行评估。
在一些应用中，可以有利的是在磁珠上执行纳米孔抗体-抗原结合和洗涤步骤的微流体反应(例如，如Ng等人(2018)中所述)，但随后从珠上裂解下纳米孔复合物并在芯片上对其进行检测。如在先前实例中所述，将富集的纳米孔-抗体-生物标志物标签抗体复合物施加到纳米孔阵列并在单分子水平上进行评估。在这种情况下，纳米孔复合物将通过可裂解连接子如图17所呈现的那些与顺磁性颗粒拴系。
在图1所展示的方法中，单个捕获抗体(抗体1)示出为与纳米孔连接。如果需要，则可以将多个捕获抗体或小抗体模拟物(例如，亲和体、亲合体、affimer等)与纳米孔连接，从而增加靶标捕获的可能性，如果靶标以低丰度存在，则这将是有利的，并且需要更高的灵敏度。
在实例7的示例性实施例中，捕获抗体和检测抗体可以是针对包括MUC-1、癌胚抗原、CA-125和如HER2等雌激素受体的乳腺癌生物标志物(Gam 2012；Mueller等人2018)。
可以用来进一步增强方法的灵敏度的替代性方法(图9)将是使用通过生物素-链霉亲和素、地高辛-抗地高辛或前面描述的任何替代性缀合方法与纳米孔连接的镶嵌有捕获抗体的纳米级磁珠。在这种情况下，珠将用于从血清或其它样品中捕获抗原生物标志物靶标。珠还将在表面上具有化学取代基以用于与纳米孔结合或结合在纳米孔附近(各种化学相互作用配偶体(包含但不限于上文提及的那些)可用于缀合)。将纳米孔结合的复合物插入纳米孔阵列芯片上的脂质膜中，每个传感器(电极)位置一个纳米孔。接下来，将芯片与对所关注生物标志物具有特异性的带标签检测抗体一起温育。这将导致在跨膜施加电压后鉴定结合的生物标志物并且捕获纳米孔通道中的纳米孔可区分标签并产生标签特异性离子电流阻断。使用磁珠的优点将是增强的灵敏度，因为由于珠上存在许多捕获抗体，所以结合生物标志物的机会均增加，并且结合检测抗体的机会也增加，从而增加了通过纳米孔进行标签捕获的可能性。
捕获抗体与珠的连接以及珠与纳米孔的连接。在优选实施例中，将氨基衍生化的磁珠与马来酰亚胺NHS酯和生物素NHS酯两者一起以合适的比率温育，使得珠将与马来酰亚胺和生物素两者以10∶1或更高的比率衍生化。与抗体的后续缀合反应将通过硫醇-烯反应产生捕获抗体结合的珠，其中珠上共存有少量生物素。生物素将用作结合化合物(结合化合物1)以通过生物素链霉亲和素相互作用将捕获抗体装饰的珠与带有链霉亲和素(结合化合物2)的纳米孔连接。然后将具有镶嵌有捕获抗体的珠的所得纳米孔插入脂质膜中，并且遵循前一段落所述的程序，以便以高灵敏度检测所关注化合物。
实例8：血清或组织中的抗体的检测。在感染性疾病研究中，通常高度期望快速检测针对病毒、细菌或其它病原体的循环抗体以进行早期诊断，因为生长和鉴定感染原通常可能会需要几天的时间并且在某些情况下可能是不可能的。最近已经描述了将新型ELISA方法用于此类目的的实例(Ng等人(2018))。类似地，本文所述的单分子纳米孔系统可以容易地被适配成用于所述目的并且将在测定患者的几种潜在的感染原时特别有用。在最简单的场景中，所关注抗原(例如，病毒上的外壳蛋白、细菌细胞的免疫原性组分)可以通过上文所概述的任何方法(图10A)与纳米孔连接或连接在纳米孔附近，所述方法包含使用生物素-链霉亲和素(图10B)相互作用或地高辛-抗地高辛抗体(图10C)相互作用。因此，抗原本身将用作捕获试剂(图10A、10B和10C)。结合柔性连接子，此连接方法将进一步增加结合亲和力、减少分子拥挤并增加后续结合步骤的可及性。接下来，将向芯片添加具有推定抗体的血清。将对包含任何血清Ig的几乎所有血清蛋白加标签，在这种情况下，结合的抗体将具有可以在纳米孔中被立即检测到的标签。为了选择所关注血清Ig从而降低复杂性，在替代性策略中，可以使用针对捕获的抗体的带纳米孔标签的二级抗体，所述带纳米孔标签的二级抗体是针对Fc部分的并且在不同物种提出的(例如，山羊-抗人抗体(二级抗体))(图11A)或者在所关注抗体已被充分表征的情况下是抗独特型抗体，所述抗独特型抗体进一步提高特异性并允许在同一纳米孔阵列芯片上针对不同血清抗体进行多重化。收集带标签二级抗Fc或抗独特型抗体避免血清加标签步骤并降低成本。作为二级抗体的替代性方案，蛋白A或G可以用于与一级抗体结合。可以使用血清抗体与二级抗体之间的相互作用分子，如生物素-链霉亲和素(图11B)或地高辛-抗地高辛抗体(图11C)。结合柔性连接子，此连接方法将进一步增加结合亲和力、减少分子拥挤并增加后续结合步骤的可及性。
如上文所提及的，为了提高针对病毒或其它抗体捕获的灵敏度，可以使用胺-NHS或各种其它反应性将病毒颗粒(Ricks等人2019)或片段与纳米孔连接。由于病毒颗粒或甚至病毒颗粒片段上有病毒外壳蛋白的许多拷贝，因此这提供了用于血清抗体的结合的许多位点。在一种方法中，病毒抗体可以被预先加标签(非特异性地)(图12)，并且在第二种方法中，血清抗体可以不加标签，而标签将存在在针对这些一级抗体的Fc部分提出的二级抗体上(图13)。
如实例12中所述，此方法可以被适配成用于通过用对抗原具有特异性的可裂解标签预先标记与纳米孔结合的病毒颗粒或病毒蛋白来对一种类型或多种类型的病毒抗体进行定量。在由于捕获此标签而检测到信号以鉴定在覆盖纳米孔阵列的特定传感器的给定纳米孔上存在哪种病毒抗原后，如图18中那样裂解标签。然后将纳米孔阵列芯片与血清一起温育以捕获非特异性地加标签的病毒抗体(图12)或未加标签的病毒抗体、然后是非特异性地加标签的二级抗体(图13)，并且检测非特异性标签信号。因此，初始标签限定可以在阵列上的所述位置处检测到的病毒抗体，并且第二标签指示所述抗体是否确实存在。
作为所述方法的具体实施方案的实例，将在微流体站中使用被杀死的风疹(Rubella)(德国麻疹(German measles))或麻疹(Rubeola)(麻疹)病毒颗粒涂覆的纳米孔或用风疹或麻疹抗原衍生化的纳米孔来捕获血液样品中的有关带标签抗体。将样品在补充有4％BSA和0.1％Tetronic 90R4的PBS中稀释、暴露于涂覆有病毒颗粒或抗原的纳米孔并在微流体装置中用PBS/Tetronic 90R4洗涤四次。如图9所示，洗涤后可以检测到抗体。为了进行多重化，衍生化的纳米孔还将带有对风疹或麻疹病毒具有特异性的可裂解纳米孔标签。在裂解并检测标签以确定在纳米孔阵列的每个位置处存在哪个抗原后(标签可以直接与纳米孔或纳米孔上的抗原连接)，将芯片与标记有非特异性标签的血清抗体(如图12中)在PBS/BSA/Tetronic 90R4中或未标记的血清抗体、随后是与非特异性标签缀合的二级抗体(如图13中)均在PBS/BSA/Tetronic 90R4中一起温育，以揭示血清样品中病毒抗体的存在/不存在和滴度。病毒颗粒与纳米孔的连接是使用上述标准方法或通过氨基酸的位点特异性诱变来完成的(Chatterjiee等人2004)。
此方法还可以掺入镶嵌有病毒蛋白的磁珠(图14)(Ng等人(2018))。在这种情况下，将具有病毒蛋白簇的珠与血液或其它样品混合，作为捕获给定病毒蛋白的抗体的多个拷贝的方法。磁珠还将在其表面上具有化学取代基以用于与纳米孔结合或结合在纳米孔附近。将所得复合物插入纳米孔阵列上的膜中，每个传感器位置一个纳米孔。最后，将阵列与靶向初始抗体的二级抗体一起温育并用对所关注标靶具有特异性的纳米孔可检测标签进行标记。跨膜施加电压将允许捕获标签并基于所得的电流阻断信号确定所关注病毒(或其它)抗体的存在。此方法的优点在于，考虑到磁珠上的大量抗原(病毒)蛋白，即使血清中浓度很低的抗体也将很可能被检测到。由于使用了这种夹心方法，因此将结合多个带标签二级抗体，从而也增加了标签进入纳米孔通道以产生期望的签名的可能性。显然，通过使用带有来自不同病毒的蛋白质的不同珠，可以使用同一芯片在同一芯片上以高灵敏度检测不同的病毒靶标。进一步地，通过将珠或抗原上的病毒特异性标签与二级抗体上的非特异性标签混合，可以完成定量或半定量多重化。实例7中描述了捕获抗体连接的珠的制备以及其与纳米孔的连接。
与本文所述的更一般的方法更接近的用于检测自身免疫和其它疾病过程期间血清中常见的抗原-抗体复合物的上述方法的另一种变化涉及使用与纳米孔连接或连接在纳米孔附近的捕获抗体和检测抗体两者(图15)。此捕获抗体将从血清中拉出潜在的抗原-抗体复合物。随后，针对抗原-抗体复合物中的抗体提出的带标签抗Fc或抗独特型抗体将流过芯片，并且标签依赖性离子电流阻断事件将揭示血清中抗原-抗体复合物的存在。此变化可以任选地包含使用抗体涂覆的捕获珠以进一步增加灵敏度。而且，可以使用抗原作为捕获剂，代替使用与纳米孔连接或连接在纳米孔附近的抗体作为捕获试剂以从血清中拉出抗原-抗体复合物。在这种情况下，在结合抗体-抗原复合物之后，将使用针对血清抗原的带标签第二抗体进行检测。
如果抗原或捕获抗体连接在纳米孔附近而不是与纳米孔连接，则标签将通过可裂解连接子与检测抗体连接，以允许释放的标签到达纳米孔通道。如果需要，可以用抗体模拟物置换捕获抗体和检测抗体。抗体模拟物通常基本上比抗体分子更小。可以利用这一点以通过将抗体模拟物的多个拷贝通常通过柔性连接子与纳米孔连接或连接在纳米孔附近来增加捕获的可能性并因此增加灵敏度。
最后，如上所述，可以直接在纳米孔阵列上或在微流体芯片中的溶液中执行免疫检测反应并且然后将其插入阵列的膜中以进行检测。
实例9：靶分子的多重化和定量。根据定义，假设单个纳米孔被插入每个传感器上方的膜中，则纳米孔离子电流测量是在单分子水平上。在将不同的抗体(针对不同的靶生物标志物)与不同的纳米孔连接的情况下，假设捕获抗体或检测抗体与除了期望的抗原之外的抗原无交叉反应性，则可以设置系统以用于多重化、定量或两者。例如，使用覆盖芯片的不同部分的单独流动池，可以将具有不同捕获抗体(针对特异性靶生物标志物)的纳米孔放置在每个流动池中，从而导致芯片的单独区各自具有其自己的捕获抗体。随后将相同样品添加到每个流动池，使得样品中的特异性抗原将与特异性捕获抗体连接。在第三步骤中，可以将带标签检测抗体添加到所有流动池或仅添加到含有针对相同抗原蛋白或其它抗原的捕获抗体的流动池。在单独流动池的情况下，每个检测抗体可以用相同标签进行标记。
在图16所展示的用于最大化对抗原比率进行定量的能力的替代性方案中，捕获抗体结合的纳米孔(每个用于不同的靶生物标志物)的等摩尔混合物可以流过整个芯片。然后，含有抗原以及各自具有独特标签的带标签检测抗体(针对靶生物标志物的同一集合)的等摩尔混合物的样品将流过芯片。由于这一基于纳米孔的方法是单分子的(数字的)，因此可以通过简单地对报告合适的标签的传感器的数目进行计数来进行定量。假设捕获抗体-纳米孔以相同的效率插入膜中，并且抗体针对其各自的抗原靶标具有相同的亲和力，则此方法将是高度定量的。因此，如果1000个传感器显示指示标签1的电流，100个传感器显示指示标签2的电流，并且10个传感器显示指示标签3的电流，则可以以合理的置信度水平假设样品所含的抗原生物标志物靶标1、2和3的比率为100:10:1。如果这些假设中的一些假设不正确，则可以相应地对系统进行校准。例如，如果一些抗体具有更高的亲和力，则其在抗体混合物中的部分将成比例地减少。
所有多重化方法的重要考虑因素在于，即使在两个不同的步骤中仅使用4个可区分标签，也可以揭示高达16个不同的特征(例如，4种分析物在4种不同组织中或同一组织的4种不同功能状态或发育状态中的表示)。
实例10：抗体连接在纳米孔附近并且可裂解连接子介于标签与第二抗体之间的替代性方案：上述方法的一种变化包括将抗体连接在纳米孔附近而不是直接与纳米孔连接。例如，如果微制造的孔将传感器和相关联的膜分离，则可以使用传统的表面缀合技术将捕获抗体直接与孔的表面连接。例如，可以用各种反应性基团(氨基、NHS酯或羧酸、炔烃、四嗪、生物素等)对表面进行修饰，并且用配偶体反应性基团(羧基、氨基、叠氮化物、TCO、链霉亲和素等)对抗体进行修饰。偶联将在本领域众所周知的条件下完成。替代性地，可以利用磷脂、人工脂质聚合物或经修饰的脂质之间的反应以及抗体上相关联的反应化学部分直接将捕获抗体与膜连接。在任一种情况下，在与抗原和如前所述被加标签的检测抗体一起温育后，标签在所得表面或膜-捕获抗体-抗原-检测抗体-标签复合物中的位置极不可能足够接近以到达并延伸到纳米孔通道中。为了克服此障碍，可以通过可裂解连接子将标签与第二抗体连接。裂解后，标签被提供足够的时间以借助于电场被吸入纳米孔通道中并穿过纳米孔通道。这可能需要不同浓度的电解质以及与在基本方案中相比更高的电压。
因此，此替代性方案的步骤如下：(1)将已经含有嵌入式纳米孔的衍生化芯片或膜表面与适当地衍生化的捕获抗体一起温育；(2)将芯片与含抗原样品一起温育；(3)与可裂解地加标签的检测抗体在电解质溶液中温育；(4)用合适的化学剂或其它裂解剂裂解可裂解连接子以释放标签；以及(5)跨膜施加电压并测量所得的离子电流：指示标签进入纳米孔通道的瞬时离子电流阻断将指示靶抗原与复合物的结合。
与基本方案一样，将根据需要在步骤之间进行洗涤步骤以去除先前未结合的或未缀合的分子。为了大大提高标签被纳米孔捕获的可能性，可以使用相同捕获抗体的许多拷贝来装饰纳米孔附近的表面或膜，或者可以将捕获抗体聚集在与表面连接的珠上。在这些情形下同样重要的是具有快速感测，因为标签将以高速度(大约为纳秒到数百纳秒，这取决于例如标签的性质、缓冲液的离子组成和施加的电压)穿过纳米孔通道。
已经描述了可以置于连接子中的各种可裂解基团，对于所述可裂解基团中的每个可裂解基团，存在特异性和蛋白质相容性裂解剂。已经描述了涉及利用纳米孔进行生物标志物感测的实例(US 2016/0041179 A1)，其中已经设计了可裂解连接子并将其置于各种分子中以用于各种各样的目的，所述目的包含使用荧光标签和锚定物通过合成进行测序(U.S.2016/0090621 A1)、将生物素与引物连接以用于富集三元复合物(U.S.62/643,633)等。重要的是，应避免经受还原剂的裂解的巯基或其它基团，因为这些基团可以影响免疫球蛋白(抗体)亚基，从而潜在地改变其结合性质，使得所述基团不再以足够的亲和力与抗原结合。其它含胱氨酸(连接的半胱氨酸)的蛋白质可以类似地受还原试剂影响。图17包含可裂解连接子的实例，所述可裂解连接子可以用于将标签与抗体或其它分子连接以用于本文所述的方案。
实例11：用于检测多个靶分子的另外的方法：在此变化中(图18)，将特异性标签与针对给定靶分子的捕获抗体连接。将不同的特异性标签与针对不同靶分子的捕获抗体连接。带纳米孔标签的捕获抗体缀合物流过阵列，其中带有不同的带标签捕获抗体的纳米孔将以大约其在溶液中的比率随机插入芯片上的不同位点中的膜中。通过可裂解连接子将标签与捕获抗体连接(可裂解基团的实例在图17中呈现)。跨膜施加电压。在每个位置处获得记录以确立哪些捕获抗体与阵列中的每个位置相关联后，按先前所描述的那样裂解标签(U.S.2016/0041179 A1)。样品中存在的用通用纳米孔可检测标签(不同于与捕获抗体连接的特异性纳米孔可检测标签中的任何一个纳米孔可检测标签)预先标记的分离的抗原生物标志物流过芯片并与合适的捕获抗体结合。再次跨膜施加电压并获得新的电流读数。由于通用抗原标签而导致的阻断电流的存在指示抗原结合。由于从第一次记录中已经知道哪个捕获抗体存在于芯片上的所述位置，因此可以确定已结合的特异性抗原。因此，在由于第一次记录而存在的特异性捕获抗体已知的阵列上的每个位置处，第二次记录指示抗原的结合，并且对所有此类情况(同时存在特异性标签和一般标签电流)进行计数指示样品中不同抗原的相对数量。替代性方法(未展示)将是在捕获抗体上使用不可裂解的标签。在这种情况下，抗原与其一般标签的后续结合将导致在跨膜重复施加电压(脉冲)的情况下一般标签和特异性标签竞争进入纳米孔的通道中。与仅具有特异性标签电流阻断的初始记录形成对比，由于特异性标签和一般标签，因此给定孔的电流迹线将呈现为阻断的混合。因此，此变化将呈现为从特异性标签阻断切换到特异性标签阻断和一般标签阻断的混合，而不是从特异性标签阻断切换到一般标签阻断。
具有捕获抗体和可裂解标签的纳米孔的制备在图19和20中展示。首先，合成可裂解三官能连接子NHS酯-偶氮TCO/PEG3-马来酰亚胺(图19)。首先将TCO与Fmoc保护的赖氨酸偶联，所述Fmoc保护的赖氨酸可以通过羧酸活化和酰胺键形成进一步与偶氮连接子偶联。去除Fmoc基团允许利用马来酰亚胺NHS酯再进行一个偶联步骤。偶氮连接子酸的后续活化提供了NHS酯-偶氮TCO/PEG3-马来酰亚胺。接下来，制备纳米孔-捕获抗体-可裂解标签缀合物(图20)。使以上可裂解三官能连接子NHS酯-偶氮TCO/PEG3-马来酰亚胺与氨基标签反应，从而产生标签-偶氮TCO/PEG3-马来酰亚胺缀合物，通过TCO-四嗪添加，所述缀合物可以容易地与四嗪修饰的捕获抗体反应。通过硫醇-烯添加使所得标签-偶氮捕获抗体-马来酰亚胺缀合物进一步与α-溶血素-SH反应，从而提供了纳米孔可裂解标签-捕获抗体缀合物，其中标签可以通过连二亚硫酸钠处理时的偶氮还原和裂解来去除。
这种形式是灵活的并且因此将不限于检测给定芯片上的特定种类的靶分子(蛋白质、核酸、小分子等)。例如，通过使用抗体、适配体(Lakhin等人2013)或其它分子的合适组合来特异性结合这些生物标志物，同时检测蛋白质和DNA生物标志物将是可行的。
在实例11的示例性实施例中，捕获抗体和检测抗体可以是针对包括PSA、MUC-1、癌胚抗原、CA-125和雌激素受体的大量癌症标志物(Gam 2012；Mueller等人2018)。
实例12：用于检测多个病毒抗体的方法：正如可以使用可裂解标签和具有可裂解标签的多种捕获抗体来多重化靶分子一样(实例11)，可以使用可裂解标签和病毒抗原作为捕获试剂来检测血清中的多种类型的病毒抗体。在这种情况下，此方法可以被适配成用于通过用对抗原具有特异性的可裂解标签预先标记与纳米孔结合(通过类似于描述的用于将抗体或珠与纳米孔连接的方法)的病毒颗粒或病毒蛋白来对一种类型或多种类型的病毒抗体进行定量。然后将具有连接的带标签抗原的纳米孔插入膜中，在阵列芯片上每个传感器一个所述纳米孔。在跨膜施加电压后，标签将被其各自的纳米孔捕获，以生成特异性离子电流阻断信号。这将揭示在每个位置中哪个抗原与纳米孔连接。在第一检测步骤之后，将标签裂解。然后将纳米孔阵列芯片与血清或血清蛋白提取物一起温育以捕获病毒抗体，所述病毒抗体是如图12中的非特异性地加标签的病毒抗体或者是如图13中其后为非特异性地加标签的二级抗体的未加标签病毒抗体。再次跨膜施加电压并且检测到非特异性标签信号。在此步骤中检测到信号将揭示病毒抗体的存在，此纳米孔对所述病毒抗体具有特异性，如通过初始标签检测所确定的。也可以设想这样的版本：其中第一标签不与纳米孔上的抗原连接，而是与如孔表面或膜等纳米孔附近的位置连接，但是在这种情况下，初始标签将在流过纳米孔时裂解并被瞬时地检测到。
实例13：样品多重化：在实例9和11中，描述了抗原的多重化和定量。但是，还可以发展此方案以比较同一芯片上的多个样品。在最简单的版本中，执行实例7的基本方案，其中抗体1(捕获抗体)与纳米孔和带标签抗体2(检测抗体)连接，但是将来自不同组织、治疗或患者的样品等量地装载到单独的流动池中。
先前已经描述了涉及对每个样品中的任何或所有蛋白质或其它抗原靶标进行一般化加标签的方法，每个样品具有可以在纳米孔中区分的不同标签(U.S.2016/0041179A1)。在这种情况下，没有带标签检测抗体。将单个捕获抗体与阵列中的所有纳米孔连接，并且然后将差异性地加标签的样品的等摩尔混合物添加到芯片。
本文公开了此方法的变化，所述变化将样品和抗原多重化组合。在此方法中，将对给定的抗原靶标具有特异性的捕获抗体与纳米孔连接或连接在纳米孔附近。使用大量此类抗体用于不同的所关注抗原，其中一个将偶然与每个纳米孔结合。接下来，将一组若干个样品以相等的量混合在一起并且添加到芯片，所述一组若干个样品各自标记有与样品中存在的大量蛋白质或其它靶标结合的独特可裂解标签。裂解后，穿过阵列上的每个位置处的纳米孔通道的可归因于此标签的电流确定衍生出所连接抗原的样品。接下来，将对具有独特可区分纳米孔标签的给定抗原具有特异性的检测抗体添加到阵列。使用大量此类差异性地加标签的特异性抗体并以等摩尔量将其施加到芯片，所述等摩尔量根据预先确定的抗体亲和力在需要时进行调整。取决于捕获抗体1是直接与纳米孔连接还是与纳米孔附近的表面连接，样品检测抗体2上的标签可以分别是不可裂解的或可裂解的。与此第二组标签相关联的离子电流将确定在阵列上的每个纳米孔位置处结合的特异性抗原。
在示例性实施例中，有5个样品(A-E)和5个所关注抗原(M-Q)。可裂解标签A、B、C、D和E将分别用于标记样品A、B、C、D和E。由于这些可裂解标签被裂解并穿过纳米孔，因此针对抗原M、N、O、P和Q的检测抗体也可以分别用可裂解标签A、B、C、D和E标记。在第一组记录中，将确定衍生出结合的抗原的样品，并且在第二组记录中，将确定结合了哪个实际抗原。利用足够数目的纳米孔，可以确定对每个样品中的每个抗原的比率的定量。与所有以上方案一样，可以用抗体模拟物、相互作用的蛋白质配偶体(配体或受体等)置换抗体，并且靶标可以是蛋白质或其它分子例如任何所关注生物标志物。

Claims (41)

1.一种用于检测样品中所关注化合物的存在的方法，所述方法包括：
a)将用于所述所关注化合物的捕获化合物或所述捕获化合物的多个拷贝与纳米孔结合或结合在纳米孔附近；
b)将所述纳米孔插入电阻屏障中；
c)在允许所述所关注化合物与所述捕获化合物连接的条件下，使所述捕获化合物或所述捕获化合物的所述多个拷贝与含有所述所关注化合物的所述样品接触；
d)在允许带标签化合物与所述所关注化合物连接的条件下，使所述所关注化合物与所述带标签化合物或所述带标签化合物的多个拷贝接触，其中所述带标签化合物包括至少一个标签；
e)使所述纳米孔与电解质溶液接触并跨所述电阻屏障施加电压；以及
f)测量由所述带标签化合物的至少一个标签进入所述纳米孔引起的跨所述孔的电子信号变化，
由此检测所述所关注化合物的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)发生在步骤a)之前。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤d)发生在步骤c)之前。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中步骤b)发生在步骤a)之前。
5.一种用于检测样品中所关注化合物的存在的方法，所述方法包括：
a)在允许供所述所关注化合物连接的捕获化合物的多个拷贝的磁珠与纳米孔连接或连接在纳米孔附近的条件下，使所述纳米孔与所述磁珠和用于通过结合化合物1将所述磁珠与所述纳米孔连接或连接在所述纳米孔附近的结合化合物2接触，其中所述结合化合物1与所述纳米孔连接或连接在所述纳米孔附近；
b)将所述纳米孔插入电阻屏障中；
c)在允许所述所关注化合物与所述捕获化合物结合的条件下，使所述珠上的所述捕获化合物与含有所述所关注化合物的样品接触；
d)在允许带标签化合物与所述所关注化合物连接的条件下，使所述所关注化合物与所述带标签化合物接触，其中所述带标签化合物包括至少一个标签；
e)使所述纳米孔与电解质溶液接触并跨所述电阻屏障施加电压；以及
f)测量由所述带标签化合物的至少一个标签进入所述纳米孔引起的跨所述孔的电子信号变化，
由此检测所述所关注化合物的存在。
6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤c)发生在步骤a)之前。
7.根据权利要求5到6中任一项所述的方法，其中，步骤d)发生在步骤c)之前。
8.根据权利要求5到7中任一项所述的方法，其中步骤b)发生在步骤a)之前。
9.一种用于确定样品中多种不同所关注化合物的存在和/或相对数量的方法，所述方法包括：
a)使多个纳米孔与多种不同捕获化合物接触，
其中每种类型的捕获化合物与所述样品中不同类型的所关注化合物结合，
所述接触是在使得每种捕获化合物与所述多个纳米孔之一结合或结合在所述多个纳米孔之一附近的条件下；
b)将所述多个纳米孔插入电阻屏障中；
c)在允许每种所关注化合物与捕获化合物结合的条件下，使所述多种不同捕获化合物与所述样品接触，所述样品包括所述多种不同所关注化合物；
d)使所述多种不同所关注化合物与多种不同带标签化合物接触，
其中每种类型的带标签化合物与不同类型的所关注化合物结合，
其中每种类型的带标签化合物包括至少一个标签，
其中每种类型的带标签化合物包括与每种其它类型的带标签化合物不同的类型的标签，
其中每种类型的带标签化合物的身份与标签的类型相关，
所述接触是在使得每种带标签化合物与所关注化合物结合的条件下；
e)使所述多个纳米孔与电解质溶液接触并跨所述电阻屏障施加电压；
f)测量由所述带标签化合物中的每种带标签化合物的至少一个标签进入所述纳米孔引起的跨所述多个纳米孔中的每个纳米孔的电子信号变化；以及
g)任选地比较如此被纳米孔检测到的每种类型的标签的相对数；
由此确定所述样品中所述多种不同所关注化合物的存在和/或相对数量。
10.一种用于确定样品中多种不同所关注化合物的存在和/或相对数量的方法，所述方法包括：
a)使多个纳米孔与多种不同捕获化合物接触，
其中每种类型的捕获化合物与所述样品中不同类型的所关注化合物结合，
其中每种类型的捕获化合物包括至少一个标签，
其中每种类型的捕获化合物包括与每种其它类型的捕获化合物不同的类型的标签，
其中每种类型的捕获化合物的身份与标签的类型相关，
所述接触是在使得每种捕获化合物与多个纳米孔之一结合或结合在多个纳米孔之一附近的条件下；
b)将多个纳米孔插入电阻屏障中；
c)使多个纳米孔与电解质溶液接触并跨所述电阻屏障施加电压；
d)测量由所述捕获化合物中的每种捕获化合物的至少一个标签进入纳米孔引起的跨多个纳米孔中的每个纳米孔的电子信号变化，由此确定连接在每个纳米孔附近或与每个纳米孔连接的所述捕获化合物的身份；
e)使所述多种不同捕获化合物与所述样品接触，所述样品包括所述多种不同所关注化合物，
其中每种所关注化合物具有相同类型的标签与其连接，
所述接触是在允许每种所关注化合物与捕获化合物结合的条件下；
f)使多个纳米孔与电解质溶液接触并跨所述电阻屏障施加电压；
g)测量由所述所关注化合物中的每种所关注化合物的所述标签进入纳米孔引起的跨多个纳米孔中的每个纳米孔的电子信号变化；以及
h)任选地比较被纳米孔检测到的标签的相对数；
由此确定所述样品中所述多种不同所关注化合物的存在和/或相对数量。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中步骤b)发生在步骤a)之前。
12.根据权利要求10所述的方法，其中与所述捕获化合物连接的所述标签在步骤d)之后被裂解。
13.根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中所述捕获化合物或所述捕获化合物的所述多个拷贝与所述纳米孔连接。
14.根据权利要求1到12中任一项所述的方法，其中所述捕获化合物或所述捕获化合物的所述多个拷贝连接在所述纳米孔附近。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的方法，其中所述捕获化合物是抗体。
16.根据权利要求1到14中任一项所述的方法，其中所述捕获化合物是抗体模拟物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述抗体模拟物是亲和体(affibody)、亲合体(avibody)、affimer、纳米钳(nanoclamp)、药剂或有机小分子中的一种。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的方法，其中所述带标签化合物是抗体。
19.根据权利要求1到17中任一项所述的方法，其中所述带标签化合物是抗体模拟物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述抗体模拟物是亲和体、亲合体、affimer、纳米钳、药剂或有机小分子中的一种。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的方法，其中所述一种或多种所关注化合物是抗原。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述抗原是生物标志物、蛋白质、脂质、碳水化合物、DNA、糖蛋白、脂蛋白、病毒颗粒或其它复合分子中的一种。
23.一种用于确定生物分子的分子相互作用的方法，所述方法包括：
a)将所述生物分子或所述生物分子的多个拷贝与纳米孔连接或连接在纳米孔附近；
b)将所述纳米孔插入电阻屏障中；
c)在使得所述生物分子和推定的相互作用化合物相互作用的条件下，使所述生物分子与含有所述推定的相互作用化合物的样品接触，并且任选地执行交联步骤以结合所述生物分子和所述推定的相互作用化合物；
d)在允许带标签化合物与所述推定的相互作用化合物结合的条件下，使所述推定的相互作用化合物与所述带标签化合物接触，其中所述带标签化合物包括至少一个标签；
e)使所述纳米孔与电解质溶液接触并跨所述电阻屏障施加电压；以及
f)测量由所述带标签化合物的至少一个标签进入所述纳米孔引起的跨所述孔的电子信号变化，
由此检测生物分子的所述分子相互作用。
24.根据权利要求23所述的方法，其中步骤b)发生在步骤a)之前。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述生物分子通过柔性连接子与所述纳米孔连接。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述标签通过可裂解连接子与所述带标签化合物连接，并且所述标签是在步骤d)之后从所述带标签化合物裂解的。
27.根据权利要求23到26中任一项所述的方法，其中所述生物分子是生物标志物、蛋白质、脂质、碳水化合物、DNA、糖蛋白、脂蛋白或如病毒颗粒等其它复合分子中的一种。
28.根据权利要求23到27中任一项所述的方法，其中所述推定的相互作用分子是生物标志物、蛋白质、脂质、碳水化合物、DNA、糖蛋白、脂蛋白、病毒颗粒或其它复合分子中的一种。
29.根据权利要求1到28中任一项所述的方法，其中所述带标签化合物是生物标志物、蛋白质、脂质、碳水化合物、DNA、糖蛋白、脂蛋白、病毒颗粒或其它复合分子中的一种。
30.根据权利要求1到29中任一项所述的方法，其中所述一个或多个标签包括聚合物分子。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述聚合物分子是聚合物，所述聚合物包括PEG、烷烃、肽、多肽、多核苷酸或其任何组合中的一种或多种。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述标签进一步包括扩大或减小所述纳米孔内的所述标签的直径的修饰。
33.根据权利要求29到32中任一项所述的方法，其中所述标签进一步包括改变所述标签的电荷的修饰。
34.根据权利要求29到33中任一项所述的方法，其中所述标签包括以下中的一种或多种：dSP、C3、Cn、PEG、吡咯烷、精胺、亚精胺、硝基吡咯、硝基吲哚、水粉蕈素、苯并咪唑、苯、7-脱氮杂嘌呤、经5取代的嘧啶、荧光素-dT、荧光素、罗丹明、ROX、花青染料或其任何组合。
35.根据权利要求1到34中任一项所述的方法，其中所述纳米孔是固态纳米孔，并且其中步骤b)发生在步骤a)之前。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述电阻屏障包括石墨烯、二硫化钼或氮化硅。
37.根据权利要求1到34中任一项所述的方法，其中所述纳米孔包括生物纳米孔。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述纳米孔是α-溶血素、MspA或OmpG或FraC或气单胞菌溶素或β-桶类其它跨膜孔复合物或其它类跨膜孔复合物。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述电阻屏障是脂质双层。
40.根据权利要求1到34中任一项所述的方法，其中所述纳米孔是杂交蛋白质-固态纳米孔。
41.根据权利要求1到40中任一项所述的方法，其中所述纳米孔包括集成电子传感器。
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