JP6986270B2 - Dna、rnaおよび他の生体分子によるナノ細孔の通過を制御するための方法およびシステム - Google Patents
Dna、rnaおよび他の生体分子によるナノ細孔の通過を制御するための方法およびシステム Download PDFInfo
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Description
本開示は一般に、ナノ細孔を通る、DNA(デオキシリボ核酸)、RNA(リボ核酸)およびタンパク質、ならびに他の生体分子などの分子を検出、特性評価および/またはシーケンシングできるように、それらの移動を制御する方法に関する。
基本原理は、一本鎖DNA(ssDNA)を例として使用して、図1に示されている。ナノ細孔(500)は、ナノ細孔チップ(501)の一部である。スキャンプレート(510)は、ナノ細孔チップに対して平行となるように取り付けられる。ナノ細孔チップおよびスキャンプレートの両方は、その離隔距離(571)を制御できる解析ステージ(570)に連結されている。解析ステージは、好適に選択された自動化高精度直線運動ステージである。ナノ細孔チップは、バッファボリュームを、ナノ細孔の反対側にあるシス(650)側およびトランス(651)側のバッファボリュームに機械的に分割する。シス側バッファボリューム(buffer volume)およびトランス側バッファボリュームは、ナノ細孔基板によって流体的および電気的に絶縁され、ナノ細孔の通路のみを通して連通されている。電気バイアス源(530)は、ナノ細孔にかかる電圧を維持する。
・ナノ細孔を通るDNAの進行速度は、張力を受けて伸びているとき、すなわちピンと張っているときに、より良く制御される。
・DNAが特定のレベルの張力を受けるように維持することにより、ブラウン運動に起因する動きの揺らぎが低減される。Lu et al(2011)によれば、DNAがナノ細孔を自由に通るとき、ブラウン運動の力は、約4kBT/aのオーダーである。ここで、kBはボルツマン定数であり、Tはバッファ温度(単位:ケルビン)であり、aはDNA塩基対の間隔である。ssDNAの場合、完全に伸びているとき、aは約0.7nmである。室温(約22℃)では、ブラウン運動の力は、約23pNに達し得る。しかしながら、DNAがナノ細孔に留められている(張力を受けて伸びている)とき(Lu et al,2015)、ブラウン運動の力は、kBT/Lsのオーダーであり、Lsは、DNAのクーン長である。ssDNAの場合、Lsは約1.5nmである。したがって、ssDNAが張力を受けて伸びていて、ナノ細孔が横方向の動きを制限しているとき、塩基検知に影響するブラウン運動の力は、約3pNである。正確な塩基検知のためには、ナノ細孔の電気力(=DNA内張力)は、3pNよりはるかに大きい(例えば、10倍より大きい)必要がある。より大きいほど良いが、DNAの付着の結合力より小さい必要がある。
上記のように、ナノ細孔を通るDNAの制御された動きは、ナノ細孔とスキャンプレートとの間の離隔距離(571)によって決定される。離隔距離の制御は、それらの要素の間の振動を最低限に抑えることによって、および、十分に高精度な動き制御を有する解析ステージを実装することによって達成される。
・ナノ細孔とスキャンプレートとの間の機械的経路は可能な限り短くする必要がある。小型アセンブリが利用できる。
・ナノ細孔とスキャンプレートとの間の機械的接続は、可能な限り堅い、または、剛性が高い必要がある。このことは、堅い材料から厚みのあるコンポーネントを作ることを意味する。
・機構は、外部の振動およびノイズから絶縁される必要がある。原子間力顕微鏡検査および干渉法において使用されているものと同様の標準的な受動および能動振動防止方法を利用できる。
・その作動装置は、堅い、または、剛性が高い必要がある。上で列挙された振動制御手段を損なってはならない。
・DNA塩基検知の場合は、約0.1nmから約1nmのサブナノメートル(サブnm)の分解能、または、基本単位の間隔距離がより大きい分子の場合、1nmから10nmのナノメートルの分解能など、十分な高精度を有する必要がある。
振動を最低限に抑えるための1つの手法は、ナノ細孔およびスキャンプレートを、図2に概略的に描かれているものなどの小型サブアセンブリ(579)に組み立てることである。スキャンプレート(510)およびナノ細孔チップ(501)は、これらを押し離す圧縮要素(576)の外向きの弾性力(大きい垂直の矢印で示される)によって、離れた状態で保持される。圧縮要素(576)は、チャンバの周囲に液体シールも提供し得て、または、独立した内側のシールが利用され得る。独立のシールが含まれる場合、圧縮要素(576)は、ウェーブスプリングまたは湾曲マウントなど、非シーリングタイプであり得る。
スキャンプレートおよびナノ細孔チップは、DNAシーケンシングに必要な解析ステージ/解析アクチュエータの動きに加えて、それらの相対位置の調節を必要とし得る。これらの調節は、サンプルローディング、または、解析ステージの動きの延長に必要であり得る。また、これらは、後の章に記載されている、特定のシーケンシングプロトコルを実装するために必要であり得る。
時折、整列手順中に、スキャンプレートをナノ細孔チップに近接した位置へ移動させる必要がある。シーケンシング手順を実行する前に、解析ステージまたはアクチュエータの位置を較正する必要があり得て、これにより、最小離隔距離および座標、すなわち、スキャンプレートとナノ細孔チップ表面との間のもっとも近い接点に対応する、位置決めシステムドライバにおける数値位置が分かる。この位置は、数ミクロンの正確度で分かる必要がある。
ナノ細孔を通るDNA転位の高精度機械的制御のための、本開示に記載されている方法は、非限定的な例として、合成ナノ細孔(図5のa、Si3N4細孔、グラフェン細孔、MoS2(二硫化モリブデン)細孔、および、他の任意の固相ナノ細孔など)、または、生体ナノ細孔(図5のbおよびc、α‐ヘモリシン細孔およびMspA細孔など)のいずれか、または、さらには合成細孔および生体細孔の組み合わせなど、任意の種類のナノ細孔に適用される。ナノ細孔は、合成細孔(図6のaおよびb)または生体細孔(図6のc)のいずれかと一体化した塩基検知装置を有し得る。塩基検知装置は、基板の内部かつナノ細孔の位置(図6のa)にあるか、または、ナノ細孔の周辺(図6のb)のいずれかにある。
一実施形態において、DNA分子は、リンカ分子を用いて、または、リンカ分子を用いず、スキャンプレートに付着させることができる。もっとも単純な手段は、DNAをスキャンプレート表面上にランダムに付着させ(図8のa)、次に、反復的シーケンシングのための領域走査パターンで、スキャンプレートまたはナノ細孔基板を横方向に移動させることである。ナノ細孔チップ上のナノ細孔は、バッファウェル製造および電気測定の離隔要件に起因して、近すぎる距離に配置することができない。ナノ細孔は、互いに干渉しないように、互いに対して十分に間隔を空ける必要がある。一実施形態において、ナノ細孔間隔は、100μm、または、さらには1mmを超え、走査ピッチはシーケンシングサイクルあたり数μm以下であり、すべての標的DNA分子をシーケンシングするためには、ナノ細孔間の空間を走査するのに時間がかかりすぎることがあり得る。この問題に対する解決法として、ナノ細孔アレイチップ上の各ナノ細孔に対応する、例えば数μm以下の、非常に小さいパターンのある領域(511)のみにDNA分子を付着させることができる(図8のbを参照)。このようにして、走査領域が減少し、すべてまたは大部分のDNA分子のシーケンシングをより短い時間で完了できる。パターンのある付着は、パターンのある領域とナノ細孔との間の高精度の整列(μmの正確度)を必要とし得る。これは、現代の製造および計測を用いて容易に実行できる。
平坦なスキャンプレートの利用は例示的な実施形態であるが、ウェルおよびDNAの付着のいくつかの構成では、マイクロピラーがスキャンプレートの面上に含まれている必要がある(図9および図10)。マイクロピラー(512、513)とは、スキャンプレートから突出し、ナノ細孔の間隔および横方向の配置(パターン)と一致する延長部である。これらは、付着によって作られるか、または、スキャンプレートの連続部分として、もしくは、様々な微細加工手段によって形成され得る。マイクロピラーは、DNAの付着(または接触)場所をスキャンプレートから外方向へ延長する。これはいくつかの理由から行われる。
・マイクロピラーは、DNA付着部位の上に間隙を追加することによって、より大きい流体流路を提供できる。このことは、スキャンプレートおよびナノ細孔チップが近づけられ、DNA付着部位とナノ細孔チップとの間の空間が制限されているときに重要であり得る。流体流路を増加させることによって、流体の流速が低下し、離隔距離が近くなるように動く間に増加した圧力を低下させる。
・マイクロピラーは、DNA付着部位とのより良い流体接触を提供する。マイクロピラーの先端部が比較的狭い場合、DNA付着部位は、より多くの流れを受ける。また、マイクロピラーは、混合の促進を助ける横方向の流れに対して障害を追加する。
・DNAの付着部をマイクロピラーの先端部に配置することで、DNAのより集中的な付着を可能にする。これにより、シーケンシング処理をより効率的にできる。なぜなら、DNAがナノ細孔とより容易に係合することを可能にし得るからである。
・絶縁されたウェルがナノ細孔のシス側上に含まれる場合、マイクロピラーは、電気的絶縁を維持しながら、バッファで充填された個別のウェル内にDNAの付着部を延長できる(図10のbおよび図10のd)。このことは、各マイクロピラーが他のマイクロピラーから電気的に絶縁されていることを必要とする。これは、図10のd(514、535)に示されているものなどの、対応するナノ細孔を通過するDNAを検知するためにマイクロピラー内部に配置された電気プローブと組み合わせされ得る。これらの配置において、ナノ細孔アレイのシス側は、電気的に絶縁されたウェル(653)に分割される。
[概要]
シーケンシング手順は、説明の目的のために、2つのフェーズに分割することができる。
シーケンシング:センサから記録しながら、ナノ細孔を通してDNAをゆっくり引き込む。必要に応じて、方向転換および繰り返しを行う。
DNAは、可撓リンカ分子を一端に追加し、リンカ分子をスキャンプレートまたはマイクロピラーに付着させることによって、長くすることができる。この実施形態は、DNAの全長をシーケンシングしながら、スキャンプレート上の付着位置と、ナノ細孔位置との間の位置ずれをある程度許容する。また、スキャンプレートおよびナノ細孔チップが接触していない状態で、DNAがナノ細孔と係合することを可能にする。
スキャンプレートおよびナノ細孔チップ表面は、互いに実質的に平行である。DNAがナノ細孔に係合するのに十分なリーチを有するには、これらのDNA付着表面(すなわち、スキャンプレート、鈍いマイクロピラーの表面、または、尖ったマイクロピラーの先端部)は、典型的には数ミクロン以内に近づけられる必要がある。DNAは、最適化などの理由により、様々なパターンでスキャンプレートに付着させることができる。これらの配置は、ナノ細孔チップに対する、スキャンプレートの横方向の必要な位置決めを決定する(図8および図9は、これらの配置のいくつかを示している)。
1)尖ったマイクロピラーが使用される場合(512)、マイクロピラーの先端部は、合理的な誤差許容範囲内(いくつかの実施形態では、通常、数ナノメートルから数マイクロメートル)でナノ細孔アレイ位置に一致するように、横方向に位置決めされる必要がある。必要な許容範囲は、任意の横方向の位置ずれ(609)を補償できる可撓リンカ(602)の長さによって決定される。DNAがリンカ無しでスキャンプレートに直接付着される場合、横方向の位置ずれは、サンプルDNAのうち、どれほどの長さの部分がシーケンシングから除外されても許容されるかによって決定される(図9のa)。長いDNA断片の場合、数千塩基が除外されても許容可能であり得る。
2)DNAの付着は、ナノ細孔チップ上のナノ細孔パターンに一致する、スキャンプレートの面上におけるパターンの場所に制限することができる(図8のb)。この「マッチングパターン」の手法では、横方向の位置決めによって、可撓リンカがナノ細孔に届くことができる範囲内で、DNAパターンを対応するナノ細孔パターンに対して整列させる必要がある。図9のbのように、平底マイクロピラー(513)を使用するスキャンプレートにDNAが付着する場合、同様に、近くへの整列を実行する必要がある。
3)DNAの付着は、スキャンプレート全体にわたって均一に行われ得る(図8のa)。これは、すべてのDNAを走査するために、および、繰り返しの走査を最低限に抑えるために、有用な手法であり得る。ナノ細孔と直接的に整列された場所にあるDNAは、もっとも近いため、そのナノ細孔に係合される可能性が常にもっとも大きい。各DNA配列が記録された後、スキャンプレートおよびナノ細孔チップの整列が新しい場所にシフトできる場合、その新しい場所におけるDNAは、ナノ細孔に入りやすい。X軸およびY軸の横方向調節を使用して系統的に位置変更を行うことにより、X軸およびY軸のオフセットの小さい領域を網羅できる。ナノ細孔アレイの横方向の間隔に対応する寸法を有する領域をサンプリングすることにより、スキャンプレート上のすべてのDNAを等しい確率でシーケンシングできる。
一実施形態において、シスおよびトランス側の容器(650および651)は、一般に、導電性の塩のバッファ(例えば、1M KCl 10mM Hepesバッファ、pH8)で充填されている(図1を参照)。使用されるバッファの種類は、解析される分子、細孔表面の化学的性質、および、塩基検知要件に大きく依存する。いくつかの実施形態において、トランス側容器は、異なるpHまたは塩濃度、EDTAまたはミネラルの追加、界面活性剤など、異なる条件または組成を有する異なるバッファで充填される必要がある。いくつかの実施形態において、トランス側容器は、標的分子が化学的に修飾されることなく通過することを可能にするゲルまたは他の物質で充填される必要がある。ナノ細孔バイアス電圧(530)が、シス側容器およびトランス側容器に配置された2つのAg/AgCl電極を通して、ナノ細孔チップ(501)に印加される。いくつかの塩基検知方法では、ナノ細孔チップが複数のナノ細孔を有する場合、これらの電極のうち少なくとも1つは、各ナノ細孔に固有である必要がある。バッファのイオン含有量は、導電性を有するのに十分であるが、ナノ細孔電圧バイアスからの電場はナノ細孔の外側にある程度拡がり、近くの荷電DNAを引く。
いくつかの実施形態において、必要な正確度を実現するためには、DNAは複数回シーケンシングされる必要があり得る。一般的な方式は、DNAをナノ細孔から完全に引き出し、次に、再びナノ細孔に挿入することを複数回行うことによって、DNA全体の塩基検知を記録することである。ナノ細孔のアレイの場合、異なる長さを有する多くのDNA断片が同時にシーケンシングされる必要がある。各シーケンシングの実行中、いくつかのDNA断片は、他よりはるかに早く完了するであろう。時折、挿入プロセス中に、いくつかのDNAは、細孔の中に入ることができず、シーケンシングの繰り返しに失敗することがあり得る。
1.ナノ細孔に係合し、完全に挿入されているDNAから開始する。
2.繰り返し対象であるDNAの第1部分(例えば1000塩基)をナノ細孔から引き出す。
3.1000塩基を再びナノ細孔に完全に挿入する。
4.2000塩基のDNAを引き出す。第1の1000塩基は既に細孔の検知点を3回通過しているが、一方で、第2の1000塩基は、繰り返し対象となる新しい区画である。
5.新しい1000塩基の区画を細孔に再び挿入し、次に、追加の1000塩基と共に引き出す。
また、本開示は、調節可能磁石および磁気ビードを使用して、ナノ細孔に対してDNAを自動整列するための方法を提供する。DNAの整列とは、ナノ細孔チップの表面に対して直角な、実質的な直線状となるように、および、解析ステージの動き方向と一致するように、DNAをナノ細孔から引き離すことを意味する。これにより、解析ステージの動きの方向に沿って、ナノ細孔に直接一致するスキャンプレートの場所にDNAの端が配置され(または、付着したリンカの端が配置され)、その結果、それはナノ細孔からまっすぐに引き離される。このDNAの整列は、伸びたDNAがナノ細孔を(中または外のいずれかへ)通過する長さが、ステージが移動する距離と厳密に等しくなることを確実にする。DNAがランダムに付着される場合のように、付着場所が位置ずれしている場合、速度は、離隔距離の関数として変化し、DNAをスキャンプレートに結合または保持するのに必要な力は、より大きくなる。
磁石の目的は、ナノ細孔のシス側にあるDNAまたはリンカの端をスキャンプレートに向かって引くことである。したがって、ナノ細孔チップとスキャンプレートとの間の空間において、磁場が有効である必要がある。磁気ビードなどの磁性材料の塊に作用する磁石の力
整列手順にはいくつかのバリエーションがあるが、それらはすべて、磁気ビードの何らかのバリエーションを利用する。ビードは超常磁性であり得て、すなわち、磁場の存在下で磁化できるが、磁場が消失したとき、その磁性を失う。ビードは、ナノ細孔へ向かうDNAの移動を妨げることを回避するために、可能な限り小さく、かつ軽い必要があるが、ビードがナノ細孔に入ることを防止するために、および、標的DNA分子を保持して動かすのに十分な磁力を発生させるほど十分な磁気成分を有するようにするために、十分に大きい必要がある。一実施形態において、サイズ範囲は約200nmから3μmである。別の実施形態において、サイズ範囲は約50nmから約10μmである。いくつかの実施形態において、サイズ範囲は約10nmから50μmである。必要なビードサイズは、必要な力の量によって決定される。第1章で説明された、スキャンプレートに対するDNA/リンカ分子の付着と同様に、可撓リンカ分子は共有結合または非共有結合を介して磁気ビードに付着され得る。
整列は、いくつかの異なるDNAおよび磁気ビードの調製を用いて実行され得る。これらの調製は、図13に示されている。この図において、λ‐DNA(一本鎖または二本鎖)または同様の線状ポリマーをリンカ分子として使用することを想定している。
可撓リンカ分子(605)は、一端で磁気ビード(620)に付着し、ナノ細孔の入口より大きい、肥大したリンカノード(601)を通してサンプルDNA(600)に連結する(図13のa)。リンカノードは、DNAがナノ細孔を通って転位するとき、ブレーキまたはストッパとして機能する。リンカノードは、タンパク質、または可撓リンカ分子をサンプルDNAに付着させることができる他の手段(603)を指す。リンカノードは、非磁気ビードまたは巨大タンパク質複合体(抗体、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、またはアビジンなど)、または、巨大ポリマー球、または他の分子であり得て、シーケンシング緩衝液において非荷電性または弱荷電性であることが望ましい。いくつかの実施形態において、リンカノードは、ナノ細孔入口より少なくとも2倍大きい必要がある。
1.ナノ細孔アレイのシス側のチャンバが、(上記のように)磁気ビードで標識されたDNAを含むバッファ溶液で充填される。
2.負に荷電したDNAをナノ細孔に引き込むために、ナノ細孔バイアス電圧がかけられる(図14のa)。DNA(600)の自由端はナノ細孔(500)に入る。これは、ナノ細孔の開孔電流をモニタリングすることによって検出できる。DNA分子のナノ細孔への進入は、ナノ細孔に入ることができないリンカノードによって停止される。また、適切に選択されたリンカノードは、他のDNAがナノ細孔に入ることを阻害できる。
3.いくつかの標識されたDNAサンプルは、ナノ細孔に収まらず、ナノ細孔チップ表面上に、または、シス側バッファ容器内に、散在したままになる。ナノ細孔内部の標識されたDNAを「係合されている」と呼び、一方、細孔の外側にある標識されたDNAを「係合されていない」と呼ぶ。干渉が懸念される場合、係合されているDNAのシーケンシング中、係合されていないDNAをシス側容器から除去することが望ましいことがあり得る。これは、磁場が印加される前に実行される洗浄段階によって達成できる。未使用DNAは保管容器内に隔離でき、次回のシーケンシング処理のために、切り替え可能な磁石によって保持または解放され得る。
4.スキャンプレート(510)は、ナノ細孔表面の比較的近くに移動されるが、その間隙は、もっとも長いリンカ分子の長さより十分に大きい。Fmを、磁気ビードに作用する磁力、Fesを、係合されていないDNAに作用する電気力、Felを、係合されているDNAに作用する電気力として想定する。Felの大きさはFesより数オーダー大きいので、調節可能磁石(520)を作動させ、ゼロまたは非常に弱い磁場から開始し、Fes<<Fm<<Fel(<<は、左辺が右辺よりはるかに小さいことを意味する)となるように、徐々に磁場強度を増加させる(図14のb)。磁力は、残っているすべての係合されていないDNAをスキャンプレートへ引き寄せるのに十分であるが、非常に強い電気力によって保持されている、係合されているDNAをナノ細孔から引き出すには不十分である。係合されているDNAに連結している磁気ビード(620)は、リンカノードビード(603)のまっすぐ上に浮遊し、DNAと完全に整列し、したがって、対応するナノ細孔と完全に整列する(図14のbを参照)。5.次に、スキャンプレートはさらに下げられ、係合されているDNAに対応するすべての磁気ビードが、その真上にあるスキャンプレートに接触することを可能にする。すべての磁気ビード(620)が接触した後、磁場を増加させ、係合されているDNAに作用する電気力Felよりはるかに大きい磁力Fmを作る(Fm>>Fel)。磁気ビード(620)は、スキャンプレート(510)にしっかりと接した状態で引かれ、その結果、磁気ビードは、スキャンプレート(510)の動きを高精度で追跡する(図14のc)。スキャンプレート(またはナノ細孔基板)を高精度で制御された速度で動かすことによって、DNAを必要に応じて何度も細孔に出入りさせながらシーケンシングできる。DNAのシーケンシング後、磁力をオフにしてからオンにすることにより、標識されたDNAを解放および再混合、または循環し、バッファ交換または追加のサンプル処理無しで、短時間で別の回のシーケンシングを開始する。磁場がオフになった後もいくつかの磁気ビードが残存磁化を有し、スキャンプレート表面に付着したままであり得るいくつかの状況において、磁気ビードを引き離すために、ナノ細孔のトランス側に、副調節可能磁石が配置され得ることに留意されたい。副磁石は、主磁石よりはるかに弱くて良い。代替的に、ゆるく付着した磁気ビードを除去するために、誘電力、流体せん断力などの他の手段を使用できる。
6.代替的に、ビードとスキャンプレート表面との間のしっかりした接触を保証するために、最初の接触で、磁気ビードをスキャンプレートに化学的に結合させることができる。それにより、ビードひいてはリンカ分子、および、付着したDNAは、スキャンプレートの移動に合わせて高精度で動くことができる。このことは、例えば、より小さい磁気ビードを使用する必要がある場合など、必要な最大磁力について妥協が生じるいくつかの特殊な場合において必要とされ得る。
磁気ビード(620)には、ライゲーションまたは他の手段によってサンプルDNA(600)に連結される可撓リンカ分子(606)が付着する(図13のb)。可撓リンカ分子は、サンプルDNAと同一種類であり、付着は、単一の連続的な一本鎖分子が結果として生じるような方式である。したがって、連続する分子全体は、リンカとサンプルDNAとの間の移行部での妨害を生じさせることなく、ナノ細孔を通ることができる。標識されたDNAは、以下のように構築される。
[磁気ビード]+[可撓リンカ分子][ライゲーション][DNAサンプル]
1.ナノ細孔アレイのシス側のチャンバが、(上記のように)磁気ビードで標識されたDNAを含むバッファ溶液で充填される。
2.サンプルDNA(600)をナノ細孔に引き入れるために、ナノ細孔バイアス電圧がかけられる(図15のa)。DNAの自由端がナノ細孔に入る。これは、ナノ細孔開孔電流をモニタリングすることによって検出できる。ナノ細孔へのDNA分子の進入は、ナノ細孔を通ることができない磁気ビード(620)の位置で初めて停止する。ssDNAサンプル(600)および可撓リンカ(606)のほぼ全体は、両方ともナノ細孔を通ってトランス側に出る(図15のb)。
3.いくつかの標識されたDNAサンプルは、ナノ細孔に収まらず、ナノ細孔チップ表面上に、または、シス側バッファ容器内に、散在したままになる。ナノ細孔内部の標識されたDNAを「係合されている」と呼び、一方、細孔の外側にある標識されたDNAを「係合されていない」と呼ぶ。干渉が懸念される場合、係合されているDNAのシーケンシング中、係合されていないDNAをシス側容器から除去することが望ましいことがあり得る。これは、磁場が印加される前に実行される洗浄段階によって達成できる。未使用DNAは保管容器内に隔離でき、後に使用するために、切り替え可能な磁石によって保持または解放され得る。
4.スキャンプレート(510)およびナノ細孔チップ(501)は、比較的近い距離に近づけられ、離隔距離は、可撓リンカの長さより小さい。λ‐DNA可撓リンカの場合、約10〜15μmが適切である。離隔はこの位置で保持される。
5.磁石が係合され、最大の力までゆっくり上昇される。遅い上昇のある時点において、磁力はナノ細孔の電気力に一致した後に超過し(Fm≧Fel)、磁気ビードは、ssDNAを引き出し始める。ssDNAは、磁気ビードがナノ細孔の真上にあるスキャンプレートに接触する(すなわち、ssDNAが適切にナノ細孔に整列される)まで、引き出され続ける(図15のc)。 6.このとき、ssDNAのいくつかは、わずかに収縮し、余分な塩基をナノ細孔から引き出し得る。これが発生する理由は、ssDNAが最初にナノ細孔を出る時間と、それがスキャンプレートに接触するときとの間に、磁力(Fm)がいくらか上昇したからである。バッファ溶液を通過するためには、磁気ビードの力は、動きを妨げる、いくらかの流体抗力に匹敵する必要がある。これにより、ssDNAがやや過剰に伸ばされる。収縮の後、ssDNAは、その塩基と塩基との間の延びによる張力がナノ細孔電気力と厳密に一致する平衡に達する(TssDNA=Fel)。
7.このとき、ビードをスキャンプレートにしっかりと保持するために、磁力は最大限まで増加される。シーケンシングは、塩基認識のために必要な速度でスキャンプレートを動かすことによって進行する。ssDNAは、事前に張力を加えられ、シーケンシング処理中も張力を受け続ける。
8.サンプル断片が読まれる前に、ナノ細孔のトランス側にあるλ‐DNA(または代替的なリンカ)の残りの部分がシーケンシングされる必要がある。これは必要な非効率である。λ‐DNAは較正として機能し得るか、または、カスタムssDNA配列がリンカおよびセンサ較正のために使用され得る。最初の離隔距離が、伸ばされた可撓リンカの長さよりごくわずかに短くなるように、ナノ細孔チップおよびスキャンプレートを厳密に平行にする場合、読まれるλ‐DNAの長さを最低限に抑えることができる。
9.シーケンシング完了後、ナノ細孔バイアスが停止または反転され得て、磁石が離れることにより、標識されたDNAがバッファと再び混ざり、サイクルを繰り返すことを可能にする。ここでも、方法1の整列手順のステップ5において説明されたように、磁気ビードの解離を助けるために、副磁石または他の手段が使用され得る。
この方法の手順は、「一本鎖DNAリンカを用いる整列」方法と同一である。DNAアセンブリは図13のcに示される。違いは次の通りである。
・DNAと磁気ビードとの間に長い「可撓リンカ分子」が無い。代わりに、サンプルDNAが磁気ビードに直接付着している。
[磁気ビード]+[ssDNAサンプル]
より具体的な例は次の通りである。
[1μm DynaBead(登録商標) MyOne(登録商標)カルボン酸ビード]+[アミン端修飾ssDNAサンプル]
別の例:
[1μm DynaBead(登録商標) MyOne(登録商標)ストレプトアビジンビード]+[ビオチン化ssDNAサンプル]
本開示の自動整列方法は、マイクロピラー無しのスキャンプレート(図14および図15)に、および、共通または個別のシス側ウェルを有し、平底マイクロピラーを有するスキャンプレート(図16)適用される。ビードが表面上で横方向に動くことなく、磁場が磁気ビード(620)をマイクロピラーに当てながら真上に引くことができるように、平端であることが必要である。
上記のような、磁気ビードに補助されるDNA‐ナノ細孔整列およびシーケンシングの手法については、単一のサンプルDNAが付着した単一リンカ分子が付着した単一の磁気ビードが一実施形態である。しかしながら、磁気ビードおよびリンカノード上に複数の結合部位があることに起因して、現実には実現が困難である。複数の結合部位があるリンカノードが使用される場合、特に、リンカノードがビードである場合、複雑なビード/DNA架橋ネットワークが形成され得るが、このことは絶対に回避する必要がある。以下は、複雑なリンカネットワークの生成を最低限に抑えるために提案される方法である。
ポアソン分布の法則に基づくと、DNA分子/断片がビードと1:1の比で混合される場合、結果として、DNAを有さないビードが約36.8%でき、DNAを有する残りの63.2%のビードの間では、87.3%が1または2つのコピーを有し、97%が1、2または3つのコピーを有する。比を1:2に減少させると、約39.3%のビードのみがDNAを有することになるが、そのうちの96.3%は、1または2つのコピーを有し、99.6%は、1、2または3つのコピーを有する。4つまたはそれより多くのDNAコピーを有するビードは事実上存在しない(<0.5%)。DNAを有さないビード(ヌルビード)は、濃縮(自由溶液電気泳動または他の方法)を通して除去できる。
(2)リンカビードの代わりとしての連結タンパク質の使用:
ニュートラアビジンおよび抗体などの、いくつかの巨大タンパク質は、ナノ細孔でのDNAブレーキとしてリンカノードビードの代わりに使用できるほど十分に大きい。これらのタンパク質は、結合部位が非常に限定されており、例えば、ニュートラアビジンのビオチン結合部位は4つのみであり、抗体は、結合に用いられる3つの枝分かれを有する。ストレプトアビジンおよびアビジンは、ニュートラアビジンと同一である。2つの結合部位のみを有する二価ストレプトアビジンタンパク質が存在し、それらの部位は、両方とも互いに隣り合っているか(シス二価)、または、反対側にあるか(トランス二価)のいずれかである。2つの結合部位だけを有するタンパク質の場合、1つの単連結リンカ分子を最初に付着させ、1つの部位のみを、シーケンシングDNAの結合のために残すことができ、これにより、単一のDNAの付着が保証される(図20を参照)。3つの結合部位を有するタンパク質の場合、1つの二重連結リンカ分子を最初に付着させ、やはり、1つの結合部位だけをシーケンシングDNAのために残すことができる。さらに、ストレプトアビジンなどの、4つの結合部位を有するタンパク質の場合、1つの三重連結リンカ分子を最初に付着させ、1つの空の結合部位を残すか、または、1つの二重連結リンカ分子を付着させ、2つの空の結合部位を残す。2つのシーケンシングDNA分子を獲得する確率は非常に小さく、また、自動整列方式のためには、2つのコピーDNAが1つの磁気ビードに(リンカ分子を介して)連結することは、1つのDNAが2つの磁気ビードに連結することより良い。図21は、1つの結合部位(一本鎖のみがビオチン化されたssDNAまたはdsDNA)または2つの結合部位(末端にプライマがハイブリダイズされたdsDNAまたはssDNA)のいずれかを提供する一本鎖DNA(ssDNA)および二本鎖DNA(dsDNA)が、リンカ分子として使用されることを示している。二価ストレプトアビジンもしくは通常のストレプトアビジン、または抗体と併せることによって、単一のシーケンシングDNA分子のみを磁気ビードに連結することが可能である。
(3)エマルション滴法:マイクロ流体技法、または、バルク振動もしくは他の混合技法のいずれかを使用して、1つの滴が、ランダムに分配されたDNA分子と共に、1つのビードのみ、または、最大でも2つのビードのみを含むことができるように、ビードサイズより大きく、かつ、それと同程度のサイズの油中水滴を生成する。最後に、反応は停止され、DNAを有するビードは、遊離DNAおよび空のビードから分離される。結果は、同一のポアソン分布の法則に起因して、方法(1)と同様であるが(図22を参照)、ビード間の架橋を効果的に回避できる。
(4)ssDNA可撓リンカ分子の一本鎖サンプルDNAへの直接接続:
図13のbおよび図15に示されているように、サンプルssDNAは、ssDNAリンカにライゲーションされ、新しい連続の単一分子を形成する。この方法は、複数の接続の問題を本質的に回避する。なぜなら、ssDNAは、別のssDNAの端に直接接続することのみできるからである。複雑なビード/DNAのネットワークの問題は、この手法に存在しない。
この開示はまた、図23および図24に示されるように、制御可能磁石を用いて、ナノ細孔を通るDNA、RNAおよび他の生体分子を制御するための方法を提供する。制御されたスキャンプレートの移動は必要ないので、計器の設計が大幅に簡略化され、計器の費用が低減される。ここでは、スキャンプレートは、容器壁(521)によって置き換えられている。容器壁は、スキャンプレートと同一の方式で配置されているが、スキャンプレートおよびナノ細孔基板が動くときの、その間の最大動的間隙に等しいか、またはより大きい距離に固定されている。
・磁力(Fm)
・バッファボリュームの置換に起因する浮力(Fb)
・荷電DNAに作用する電気力(Fe)
・ビード表面の電荷に起因してビードに直接作用する電気力(Fbe)
・DNAが付着した磁気ビードの重量(Fw)
・摩擦力(Ff)(動く前にビードと細孔の入口の間に存在する)または抗力(Fd)(動くときに周囲のバッファによってビードに作用する)
Fm+Fb≧Fe+Fbe+Fw+Ff+Fd
1. Akeson MA, Deamer DW and Branton D, Miniature support for thin films containing single channels or nanopores and methods for using same, US Patent #6267872, 2001
2. Akeson M, Branton D, Deamer DW, Sampson JR, Methods and apparatus for characterizing polynucleotides, US Patent #7947454, 2011
3. Bayley H, Astier Y, Braha O, "Methods using pores", US Patent #8105846, 2012
4. Derrington IM, Butler TZ, Collins MD, Manrao E, Pavlenok M, Niederweis M and Gundlach JH, Nanopore DNA sequencing with MspA, PNAS 2010, 107(37):16060-16065.
5. Fixe F, Dufva M, Telleman P and Christensen CBV, Functionalization of poly(methyl methacrylate) (PMMA) as a substrate for DNA microarrays, Nucleic Acids Research, 2004, 32(1):e9 (DOI: 10.1093/nar/gng157)
6. Fologea D, Uplinger J, Thomas B, McNabb DS and Li J, Slowing DNA translocation in a solid state nanopore, Nano Lett., 2005, 5(9): 1734-1737.
7. Goyal P, Krasteva PV, Gerven NV, Gubellini F, Broeck IVD, Troupiotis-Tsailaki A, Jonckheere W, Pehau-Arnaude G, Pinkner JS, Chapman MR, Hultgren SJ, Howorka S, Fronzes R and Remaut H, Structural and mechanistic insights into the bacterial amyloid secretion channel CsgG, Nature 2014, 516(7530):250-253.
8. Hall AR, Scott A, Rotem D, Mehta KK, Bayley Hagan and Dekker C, Hybrid pore formation by directed insertion of a-haemolysin into solid-state nanopores, Nature Nanotechnology 2010, 5:874-877.
9. Han SJ, Royyuru AK, Stolovitzky G and Wang D, Integrated nanowire/nanosheet nanogap and nanopore for DNA and RNA sequencing, Patent# US2014/0326954 A1, 2014.
10. Holmberg A, Blomstergren A, Nord O, Lukacs M, Lundeberg J and Uhlen M, The biotin-streptavidin interaction can be reversibly broken using water at elevated temperatures, Electrophoresis 2005, 26(3):501-510.
11. Kasianowicz JJ, Brandin E, Branton D and Deamer DW, Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 13770-13773.Keyser UF, Controlling molecular transport through nanopores, J. R. Soc. Interface 2011, 8:1369-1378.
12. Keyser UF, van der Does J, Dekker C and Dekker NH, Optical tweezers for force measurements on DNA in nanopores. Nat. Phys, 2006, 2:473-477.
13. King GM and Golovchenko JA, Probing nanotube-nanopore interactions, Phy Rev Let 2005, 95, 216103
14. Kowalczyk SW, Wells DB, Aksimentiev A, and Dekker C, Slowing down DNA translocation through a nanopore in Lithium Chloride, Nano Letters 2012, 12(2), pp1038-1044
15. Lindsay S and Zhang PM, Devices and methods for target molecule characterization, Patent #: WO 2008/124707 A9, 2008.
16. Lindsay S and Zhang PM, Devices and methods for target molecule characterization, Patent #US9395352 B2, 2016
17. Liu Y and Rauch CB, DNA probe attachment on plastic surfaces and microfluidic hybridization array channel devices with sample oscillation, Analytical Biochemistry 2003, 317:76-84.
18. Lu B, Albertorio F, Hoogerheide DP and Golovchenko JA, Origins and consequences of velocity fluctuations during DNA passage through a nanopore, Biophysical J. 2011, 101:70-79.
19. Lu B, Fleming S, Szalay T and Golovchenko JA, Thermal motion of DNA in an MspA pore, BioRxiv 2015 (dx.doi.org/10.1101/021766)
20. Peng H and Ling XS, Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers, Nanotechnology, 2009, vol 20, 185101.
21. Peng H, Stolovitsky GA, Rossnagel SM, Polonsky S, Luan B, Martyna GJ, Piezoelectric-based nanopore device for the active control of the motion of polymers through the same, US Patent 0223652, 2011
22. Polonsky S, Rossnagel S and Stolovitzky G, Nanopore in metal-dielectric sandwich for DNA position control, Applied Physics Letters 2007, vol 91, no153103
23. Polonsky S, Rossnagel SM, Stolovitzky GA, Systems and methods for controlling position of charged polymer inside nanopore, US Patent #8003319, 2011
24. Sassolas A, Leca-Bouvier BD and Blum LJ, DNA Biosensors and Microarrays, Chem. Rev. 2008, 108:109-139.
25. Sauer-Budge AF, Nyamwanda JA, Lubensky DK, and Branton D, Unzipping kinetics of double-stranded DNA in a nanopore. Phys Rev Lett 2003, 90:238101.
26. Singh V, Zharnikov M, Gulino A, Gupta T, DNA immobilization, delivery and cleavage on solid supports, J. Mater. Chem., 2011 21:10602-10618.
27. Stoddart D, Franceshini L, Heron A, Bayley H and Maglia G, DNA stretching and optimization of nucleobase recognition for enzymatic nanopore sequencing, Nanotechnology, 2015, 26(8):084002
28. Tsutsui M, He Y, Furuhashi M, Rahong S, Taniguchi M and Kawai T, Transverse electric field dragging of DNA in a nanochannel, Scientific Reports, 2012, 2:394-
29. Wanunu M, Nanopores: a journey towards DNA sequencing, Physics of Life Reviews, 2012, 9:125-158.
30. Wanunu M and Meller A, Chemically modified solid-state nanopores, Nano Lett., 2007, 7:1580-1585.
31. Yeh LH, Zhang M, Joo SW and Qian S, Slowing down DNA translocation through a nanopore by lowering fluid temperature, Electrophoresis, 2012, 33(23):3458-65.
Claims (50)
- 荷電線状分子の移動を制御するためのシステムであって、
シス空間とトランス空間との間に位置する基板と、
前記荷電線状分子の少なくとも一部が前記シス空間から前記トランス空間へ通過可能な、前記基板におけるナノ細孔と、
前記荷電線状分子の第1端部が直接的または間接的に付着される、前記シス空間に配置されたスキャンプレートと、
前記基板および前記スキャンプレートをナノメートルまたはサブナノメートル精度で移動させることができるように、前記基板と前記スキャンプレートとの間の距離を制御するアクチュエータと、
前記荷電線状分子の第2端部を誘導して前記ナノ細孔の中に入るようにするために、前記シス空間と前記トランス空間との間にバイアス電圧を印加するためのバイアス源と、
直接的または間接的に、その第1端部で前記荷電線状分子の前記第1端部に付着され、その第2端部で前記スキャンプレートに付着される可撓リンカ分子であって、(a)前記可撓リンカ分子は、天然、修飾、または合成である、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ポリペプチド鎖、セルロース繊維、または任意の可撓線状ポリマー、および、それらの組み合わせから成る群から選択され、(b)前記可撓リンカ分子の長さは5μmから1000μmである可撓リンカ分子と、
を備えるシステム。 - 前記荷電線状分子が前記スキャンプレートと共に移動できるように、前記荷電線状分子の前記スキャンプレートへの付着を助ける付着システムをさらに備える、請求項1に記載のシステム。
- 前記基板は、平面構成で配置された複数のナノ細孔を含むナノ細孔チップであり、複数の前記ナノ細孔の各々は、前記スキャンプレートの表面から実質的に等距離である、請求項1に記載のシステム。
- 前記ナノ細孔は、生体細孔もしくは合成細孔、または、それらの組み合わせを含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記生体細孔は、α‐ヘモリシン細孔、MspA細孔、CsgG細孔、それらの修飾バージョン、および、それらの組み合わせから成る群から選択される、請求項4に記載のシステム。
- 前記合成細孔は、窒化ケイ素(Si3N4)、二酸化ケイ素(SiO2)、酸化アルミニウム(Al2O3)、窒化ホウ素(BN)、グラフェン、二硫化モリブデン(MoS2)もしくはポリマー、または、それらの混成物からできている、請求項4に記載のシステム。
- 前記付着システムは、共有結合または非共有結合のいずれかであり、可逆的または非可逆的のいずれかである化学結合を含む、請求項2に記載のシステム。
- 前記化学結合は、ビオチン‐ストレプトアビジン結合、アミド結合、リン酸ジエステル結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミン結合、アルデヒド結合、水素結合、疎水結合、および、それらの組み合わせを含む群から選択される、請求項7に記載のシステム。
- 前記付着システムは、前記荷電線状分子の前記第1端部に付着される磁気ビーズを含み、前記磁気ビーズは、(a)常磁性、(b)超常磁性、(c)強磁性、または(d)反磁性の材料のうちの1つからできている、請求項2に記載のシステム。
- 前記システムは、電磁石、調節可能な永久磁石、一組の磁石、または、それらの組み合わせを含む制御可能磁石をさらに備え、前記制御可能磁石は、前記磁気ビーズを前記スキャンプレートに向かって引き付け、前記磁気ビーズを前記スキャンプレートに接した状態で保持する、請求項9に記載のシステム。
- 前記付着システムは、前記可撓リンカ分子を含み、前記可撓リンカ分子は、一端で前記荷電線状分子の前記第1端部に付着し、他端で前記スキャンプレートに付着する、請求項2に記載のシステム。
- 前記可撓リンカ分子は、前記荷電線状分子と同一種類の分子である、請求項11に記載のシステム。
- 前記付着システムはさらに、前記可撓リンカ分子と前記荷電線状分子との間に配置されるリンカノードを含み、前記リンカノードは、前記可撓リンカ分子が前記ナノ細孔に入ることを阻害する、請求項11に記載のシステム。
- 前記リンカノードは、抗体、酵素、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、およびアビジンから成る群から選択されるタンパク質、または、ポリマー複合体、または、粒子もしくはビーズ、または、それらの組み合わせである、請求項13に記載のシステム。
- 可撓リンカ分子は、前記荷電線状分子と前記磁気ビーズとの間に配置される、請求項9に記載のシステム。
- 前記可撓リンカ分子は、前記荷電線状分子と同一種類の分子である、請求項15に記載のシステム。
- 前記付着システムはさらに、前記可撓リンカ分子と前記荷電線状分子との間に配置されるリンカノードを含み、前記リンカノードは、前記可撓リンカ分子が前記ナノ細孔に入ることを阻害する、請求項15に記載のシステム。
- 前記リンカノードは、抗体、酵素、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、およびアビジンから成る群から選択されるタンパク質、または、ポリマー複合体、または、粒子、または、非磁気ビーズ、または、それらの組み合わせである、請求項17に記載のシステム。
- 前記システムは、前記荷電線状分子が前記ナノ細孔を通るとき、前記荷電線状分子の個々の基本単位の種類または特性を決定するための検出器をさらに備え、前記荷電線状分子の前記基本単位は、イオン電流阻害に与える影響、または、レコグニショントンネリング、または、電界効果トランジスタ、または、他の塩基検知方法、または、それらの組み合わせによって検出できる、請求項1に記載のシステム。
- 前記システムは、前記スキャンプレートの面上に付着または微細加工されたマイクロピラーをさらに備え、前記マイクロピラーは、前記荷電線状分子の前記第1端部の付着を可能にする尖端または平底端のいずれかを有する、請求項1に記載のシステム。
- 前記マイクロピラーは、前記基板の面上のナノ細孔のアレイと一致するように横方向に配置されている、前記スキャンプレートの面上のマイクロピラーのアレイである、請求項20に記載のシステム。
- 前記アクチュエータは、基本単位の正確なシーケンシングを可能にする安定した速度で、前記荷電線状分子を前記ナノ細孔から引き出すか、または、前記ナノ細孔に挿入できるように、前記スキャンプレートと前記基板との間の距離を制御する高精度直線運動ステージを含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記速度は、基本単位あたり約0.5msか、またはより遅い、請求項22に記載のシステム。
- 前記速度は、基本単位あたり約3msから約20msである、請求項23に記載のシステム。
- 前記高精度直線運動ステージは、ナノメートルまたはサブナノメートル精度の圧電効果駆動装置によって駆動される直線運動ステージを含む、請求項22に記載のシステム。
- 前記アクチュエータは、前記スキャンプレートまたは前記基板をナノメートル精度またはサブナノメートル精度で移動させることを可能にする機械的減速によって前記スキャンプレートまたは前記基板に連結された粗精度アクチュエータを含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記粗精度アクチュエータは、マイクロメートルまたはサブマイクロメートルのサーボモータを含む、請求項26に記載のシステム。
- 前記システムは、シーケンシング前の位置調節のために、物体を横方向および/または縦方向に移動させる前記スキャンプレートまたは前記基板に連結されるマイクロメートル精度の調節ステージをさらに備える、請求項1に記載のシステム。
- 複数の荷電線状分子が前記スキャンプレートにランダムに付着している、請求項1に記載のシステム。
- 複数の荷電線状分子が、前記スキャンプレートの面上のパターンのある領域に付着し、前記パターンのある領域における前記複数の荷電線状分子は、前記基板の面上の複数のナノ細孔と横方向に整列される、請求項1に記載のシステム。
- 前記磁気ビーズを前記スキャンプレートから除去する副調節可能磁石をさらに備える、請求項10に記載のシステム。
- 前記荷電線状分子は、核酸配列またはポリペプチド配列であり、前記核酸配列は、一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNA、オリゴヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドを含む配列、および、それらの組み合わせから成る群から選択される、請求項1に記載のシステム。
- 荷電線状分子の移動を制御するための方法であって、
実質的に平行となるように、および、互いに横方向に整列するように配置されたスキャンプレートおよび基板プレートを設ける段階と、
直接的または間接的に、前記荷電線状分子の第1端部を前記スキャンプレートに付着させる段階と、
調節可能な機械的装置によって、前記荷電線状分子を前記基板プレートにおけるナノ細孔と整列させる段階と、
電気力によって、前記荷電線状分子の第2端部を前記基板プレートにおける前記ナノ細孔へ誘導する段階と、
前記基板プレートおよび前記スキャンプレートをナノメートルまたはサブナノメートル精度で移動させることができるように、前記スキャンプレートと前記基板プレートとの間の距離を調節することによって、前記荷電線状分子に前記ナノ細孔を通過させる段階と、
シーケンシング処理中に前記電気力を調節することによって、前記荷電線状分子における分子内張力を維持する段階と、
可撓リンカ分子を、直接的または間接的に、その第1端部で前記荷電線状分子の前記第1端部に付着させ、その第2端部で前記スキャンプレートに付着させる段階と
を備え、
(a)前記可撓リンカ分子は、天然、修飾、または合成である、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ポリペプチド鎖、セルロース繊維、または任意の可撓線状ポリマー、および、それらの組み合わせから成る群から選択され、(b)前記可撓リンカ分子の長さは5μmから1000μmである、方法。 - 前記調節可能な機械的装置は、マイクロメートルまたはサブマイクロメートルの精度を有する、単一軸または複数軸の直線運動ステージを有する、請求項33に記載の方法。
- 前記スキャンプレートと前記基板プレートとの間の距離を調節する段階は、アクチュエータを用いて前記スキャンプレートおよび/または前記基板プレートを移動させる段階を含む、請求項33に記載の方法。
- 前記アクチュエータは、ナノメートルまたはサブナノメートル精度の圧電効果駆動装置によって駆動される直線運動ステージを含む、請求項35に記載の方法。
- 前記アクチュエータは、前記スキャンプレートまたは前記基板プレートのナノメートルまたはサブナノメートル精度の移動を提供する機械的減速によって前記スキャンプレートまたは前記基板プレートに連結された粗精度アクチュエータを含む、請求項35に記載の方法。
- 前記粗精度アクチュエータは、マイクロメートルまたはサブマイクロメートル精度のサーボモータを含む、請求項37に記載の方法。
- 前記電気力は、前記基板プレートにバイアス電圧を印加して電流が前記ナノ細孔を通ることを可能にし、さらに、前記荷電線状分子を引いて前記ナノ細孔を通過させる電気バイアス装置によって実現される、請求項33に記載の方法。
- 前記可撓リンカ分子が前記荷電線状分子と前記スキャンプレートとの間に配置される、請求項33に記載の方法。
- リンカノードが、前記可撓リンカ分子と前記荷電線状分子との間に配置され、前記リンカノードは、前記可撓リンカ分子が前記ナノ細孔に入ることを阻害し、前記リンカノードは、抗体、酵素、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、およびアビジンから成る群から選択されるタンパク質、または、ポリマー複合体、または、粒子もしくはビーズ、または、それらの一部、または、それらの組み合わせである、請求項40に記載の方法。
- 前記荷電線状分子の前記第1端部を磁気ビーズに付着させる段階であって、前記磁気ビーズは、超常磁性ビーズ、常磁性ビーズ、強磁性ビーズおよび反磁性ビーズから成る群から選択される、段階と、
前記電気力が前記荷電線状分子の前記ナノ細孔への係合を維持している間、前記磁気ビーズを前記スキャンプレートに向かって引き付けるための磁場を印加することによって、前記荷電線状分子を前記ナノ細孔と整列させる段階であって、前記磁場は、電磁石、または、調節可能な永久磁石、または、一組の磁石、または、それらの組み合わせに由来し、前記磁気ビーズは、前記ナノ細孔の上で実質的に直交方向に整列した状態で、前記スキャンプレートの表面に接触し、および、前記磁場によって前記スキャンプレートにしっかりと保持される結果、前記磁気ビーズおよび前記荷電線状分子が実質的に前記スキャンプレートと共に移動する、段階と
をさらに備える、請求項33に記載の方法。 - 前記可撓リンカ分子が、前記荷電線状分子と前記磁気ビーズとの間に配置される、請求項42に記載の方法。
- リンカノードが、前記可撓リンカ分子と前記荷電線状分子との間に配置され、前記リンカノードは、前記可撓リンカ分子が前記ナノ細孔に入ることを阻害し、前記リンカノードは、抗体、酵素、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、およびアビジンから成る群から選択されるタンパク質、または、ポリマー複合体、または、非磁気粒子/ビード、または、それらの組み合わせであり、
前記荷電線状分子を前記基板プレートにおけるナノ細孔と整列させる段階は、さらに、
前記スキャンプレートと前記基板プレートとの間の距離を、前記可撓リンカ分子の長さより大きくなるように設定する段階と、
前記磁気ビーズが受ける磁力が、前記磁気ビーズを持ち上げるのに十分であるが、前記リンカノードを実質的に持ち上げるのに十分でないように、磁場を印加する段階であって、前記リンカノードは、前記電気力によって、前記ナノ細孔に係合される、段階と、
前記スキャンプレートと前記基板プレートとの間の距離を、前記可撓リンカ分子の長さより小さくなるように低減する段階であって、前記磁気ビーズは、前記スキャンプレートに接触し、前記ナノ細孔の上で実質的に直交方向に整列するように前記スキャンプレートによって保持され、結果として、前記磁気ビーズ、前記可撓リンカ分子および前記荷電線状分子の間で実質的に直交する整列が生じる、段階と
を有する、請求項43に記載の方法。 - 前記荷電線状分子は、前記スキャンプレートの面上にランダムに分布し、直接的または間接的に付着する、請求項33に記載の方法。
- 複数の前記荷電線状分子は、前記スキャンプレートの面上のパターンのある領域に分布し、直接的に付着するか、または間接的に付着し、前記スキャンプレートの面上の前記パターンのある領域の複数の前記荷電線状分子は、前記基板プレートの面上の複数の前記ナノ細孔と実質的に横方向に整列される、請求項33に記載の方法。
- 前記基板プレートは、平面構成で配置された複数のナノ細孔を含むナノ細孔チップであり、各ナノ細孔は、前記スキャンプレートの表面から実質的に等距離にある、請求項33に記載の方法。
- 前記スキャンプレートは、尖端または平端のいずれかを有する、前記ナノ細孔に面するマイクロピラーを有し、前記荷電線状分子の前記第1端部は、直接的または間接的に前記マイクロピラーに付着する、請求項33に記載の方法。
- 前記スキャンプレートは、前記基板プレートの面上のナノ細孔のアレイと一致するマイクロピラーのアレイを有する、請求項48に記載の方法。
- 前記荷電線状分子は、核酸配列またはポリペプチド配列であり、前記核酸配列は、一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNA、オリゴヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドを含む配列、および、それらの組み合わせから成る群から選択される、請求項33に記載の方法。
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