JP2018021806A - 生体試料分析方法及び生体試料分析装置 - Google Patents

Abstract

【課題】
本発明は、複数のナノポアを封鎖した塩基を迅速、かつ、超高精度に制御することができる。したがって、スループットを向上でき、ランニングコストを削減でき、待ち時間も短縮することを目的とする。
【解決手段】
上記目標を解決するために、本発明の生体試料分析方法は、生体試料が固定された固定部材と、当該生体試料が通過する貫通孔を有する基板と、前記固定部材を駆動する駆動機構を備えた、生体試料分析装置を用い、生体試料が貫通孔を通過する時に生体試料を検出する生体試料分析方法であって、生体試料が貫通孔を封鎖したことを確認した後に固定部材を保持し、駆動機構によって固定部材を引き上げる。
【選択図】 図５

Description

本発明は、ナノサイズのポアが開いた薄膜によるＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸の配列解析等を行う生体試料分析装置及び生体試料分析方法に関する。特に、アレイ化されたナノポア、即ちマルチナノポアを用いる場合における技術に関する。

本技術分野の背景技術として、ナノポアＤＮＡシーケンスに関する特許文献１がある。この公報には、「ナノポアの内径は約１０ｎｍであった。」と記載されており、ナノポアＤＮＡシーケンサは、伸長反応や蛍光ラベルは行わずに、ＤＮＡの塩基配列を電気的に直接計測する手法が注目を浴びている。直接計測法にはいくつかの手法が提案されているが、その一つに封鎖電流方式がある。薄膜に透過電子顕微鏡などによって数ｎｍのポア（ナノポア）を作製し、その薄膜の両側に電解質溶液を満たした液槽を設ける。それぞれの液槽に電極を設け、これらの電極間に電圧をかけると、ナノポアを通してイオン電流が流れる。イオン電流は一次近似としてナノポアの断面積に比例する。ＤＮＡがナノポアを通過する際に、ＤＮＡがナノポアを封鎖し、イオンが通過できる有効断面積が減少するため、イオン電流が減少する。この減少量を封鎖電流と呼ぶ。封鎖電流の大きさを元に、ＤＮＡの１本鎖と２本鎖との差異や、塩基の種類を判別する。

ナノポア内を通過するＤＮＡのブラウン運動が大きいことや、ナノポア内を通過するスピードが速すぎて検出器の測定スピードが追い付かないなどの課題があるため、各塩基を判別する測定精度を確保しにくい。ＤＮＡのブラウン運動や通過スピードをコントロールするために、ＤＮＡの一端を固定して運動を制御した上で測定する手法がいくつか提案されている。ＡＦＭなどで用いられるカンチレバーにＤＮＡを固定する方式（特許文献２）、ビーズに生体試料を固定する方式（特許文献３）などが開示されている。

ＤＮＡの１本鎖や２本鎖の一端を、ナノポアが作成された平面と平行な面に固定し、その面に垂直な軸に駆動するステージによって、ＤＮＡのナノポア通過速度を制御する方式も考えられる。

ＤＮＡの１本鎖や２本鎖の位置を、ナノポア上の所望の場所に位置付けることが可能な試料移動ステージが設けられている場合もある。

また、従来は１つの薄膜に１つのナノポアを設けた、いわゆるシングルナノポアを用いるのが通例である。一方、１つの薄膜に複数のナノポアを設けた、いわゆるマルチナノポアを用いれば、薄膜あたりの測定効率を向上できると考えられる。

国際公開ＷＯ２０１２−０４３０２８号公報 米国特許公開公報第２００４−０１４４６５８号公報 特開２０１１−２１１９０５号公報

上述のように、ナノポアＤＮＡシーケンサのシステムには、ＤＮＡの一端を固定し、もう一端はナノポアを封鎖しない限り、塩基を判別することができない。

マルチポア化には、複数のナノポアを封鎖することが求められるが、特許文献２に開示された技術によれば、カンチレバーに、ＤＮＡの一端を固定し、上下動作を行う。カンチレバーの先端は非常に細く、複数のナノポアを封鎖することはできない問題があった。

また、特許文献３に開示された技術によれば、磁場や光ピンセットの原理により、また高分子イオンなどの荷電粒子からなる標識物質は電場により、その動きを任意に制御可能であるが、塩基間距離がサブナノメールであり、複数のナノポアを封鎖した塩基を超高精度に制御するような構成にはなっていない。

ＤＮＡの１本鎖や２本鎖の一端を、ナノポアが作成された平面と平行な面に固定し、その面に垂直な軸に駆動するステージによって、ＤＮＡのナノポア通過速度を制御する方式も考えられる。

しかしながら、このような構成の場合、ＤＮＡを固定した面を高精度に制御した場合、ＤＮＡを固定した面とナノポアデバイスが片当たりする可能性がある。この場合、ナノポアにＤＮＡが十分な長さ入らない可能性がある。

上記課題を解決するために、生体試料が固定された固定部材（基板またはビーズ）と、当該生体試料が通過する貫通孔を有する基板と、生体試料が貫通孔を通過時に当該生体試料を検出する検出部材と、前記固定部材を保持するプローブと、前記プローブを駆動する駆動機構を備えた、生体試料分析装置を用いた生体試料分析方法であって、プローブに固定部材を保持し、固定部材を基板に接近させ、プローブから固定部材をリリースし、検出部材にて、生体試料が貫通孔を封鎖したことを確認し、固定部材をプローブに保持し、駆動機構によってプローブを引き上げることを特徴とする生体試料分析方法，及び，生体試料分析装置

上記構成によれば、複数のナノポアを封鎖した塩基を迅速、かつ、高精度に制御することができる。したがって、スループットを向上でき、ランニングコストを削減でき、待ち時間も短縮できる。

生体試料分析装置の構成と生体試料分析チップの拡大図の一例を示す図である。 生体試料分析チップによって取得される配列読取例である。 ＤＮＡの一端をナノポアに導入前の拡大図の一例を示す図である。 ＤＮＡ固定基板とナノポア基板の平行度の違いを示す図である。 第１実施例における生体試料分析方法，及び，生体試料分析装置を示す図である。 第２実施例における生体試料分析方法，及び，生体試料分析装置を示す図である。 第３実施例における生体試料分析方法，及び，生体試料分析装置を示す図である。 第４実施例における生体試料分析方法，及び，生体試料分析装置を示す図である。 第５実施例における生体試料分析方法，及び，生体試料分析装置を示す図である。 第６実施例における生体試料分析方法，及び，生体試料分析装置を示す図である。 第７実施例における生体試料分析方法，及び，生体試料分析装置を示す図である。

以下、添付図面を参照して本発明の実施例について説明する。なお、添付図面は本発明の原理に則った具体的な実施例を示しているが、これらは本発明の理解のためのものであり、決して本発明を限定的に解釈するために用いられるものではない。

以下で述べる「ナノポア」とは、薄膜に設けたナノサイズの孔であり、薄膜の表裏を貫通する。薄膜は主に無機材料から形成される。薄膜材料は、他に、有機物質、高分子材料などを含むこともできる。また、ＤＮＡ断片の一端が固定される基板またはビーズは、主に無機材料から形成される。薄膜材料は、他に、有機物質、高分子材料などを含むこともできる。

まず、ナノポアデバイスを用いた生体試料分析装置を説明する。図１は、生体試料分析装置の構成の一例を示す図であり、生体試料分析チップによる塩基配列読取機構を示す。

図１に示すように、生体試料分析装置（例えば、ＤＮＡ解析装置）１００は、仕切り体１０１により分けられた二つの槽１０２Ａ、１０２Ｂを備える。仕切り体１０１は、ナノポアを有するナノポアデバイスを備える。二つの槽１０２Ａ、１０２Ｂには、電解質溶液１０３が満たされている。二つの槽１０２Ａ、１０２Ｂは、電極１０４及び電源１０５で電気的に接続されている。このナノポアデバイスで仕切られた流路全体をフローセル１０６と呼ぶ。

プローブ１０７に取り付けられたＤＮＡ固定基板１０８に化学的にＤＮＡの一端を固定し、駆動機構１０９によって、フローセル開口部１１０から進入すると、液中のＤＮＡ１１１は、ナノポアデバイス１０１のナノポアを通して、一方の槽１０７Ａから反対側の槽１０７Ｂに泳動するが、通り過ぎることはない。ナノポアに導入されたＤＮＡ１１１の一端を駆動ステージ１０９によって引き抜いたり、押し込んだりすることで、ＤＮＡ１１１がナノポアデバイス１０１のナノポアを通過する際に変化する電流値から塩基配列を読み取る。電流値は、アンプ（図示せず）で増幅されて、ＡＤＣ（図示せず）を介してＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ 図示せず）に記録される。

図１の円形１００Ａ内に、ナノポアデバイス１０１の拡大図を示す。ナノポアデバイス１０１は、ナノポア１１２が形成された数ｎｍのナノポア薄膜１１３を備える。非常に薄いナノポア薄膜１１３の面積は小さく，ナノポアデバイスの厚みは補強のため、数百ｎｍの厚みを有している。ナノポアデバイス１０１の上下の槽１０２Ａ、１０２Ｂに電解質溶液１０３を満たし、ナノポアデバイス１０１を介して上下に電圧を印加すると、電解質溶液１０３中のイオン由来の、ナノポア１１２のポア径の断面積に応じた電流が検出される。ＤＮＡ１１１が駆動ステージによって、ナノポア１１２を通過すると、イオンの流れが妨げられるため、電流値は、ナノポア１１２中のＤＮＡ１１１の断面積分だけ減少する。図１の拡大図では、ＤＮＡ１１１は、球体（ビーズ）を用いて説明したが，以下，ＤＮＡ１１１が数珠状につなぎなった，糸状の1本鎖を用いて説明する。

ＤＮＡ解析装置１００では、塩基種毎の電流値の変化量の違いから塩基識別を行う。図２は、電極１０４で電圧を印加することにより読み取られる塩基種ごとの電流変化の例である。配列読取例２００に示されるように、４種類の塩基ごとに異なる電流値が検出される。

ここで、ＤＮＡ１１１の一端がナノポアに導入する方法，及び，生体試料分析装置の詳細を述べる。図３は、生体試料分析装置３００を示しており一部、拡大し、ＤＮＡ１１１の一端がナノポアに導入される前の状態を示す。ＤＮＡの１本鎖は、２本鎖と比べ、化学的に安定している状態ではないため、溶液中で絡まっていることが知られている。電源１０５により、溶液中のナノポアを中心として、半径数百ナノメールの範囲に、ＤＮＡ１１１がナノポアに引き込まれる力が発生する。ＤＮＡ１１１を引き込む力が発生する範囲を、ＤＮＡ引込範囲３０１とする。

ＤＮＡ１１１の一端がナノポアに導入するためには、ＤＮＡ引込範囲３０１に、ＤＮＡ１１１の一端を近づけ、ブラウン運動によって、ＤＮＡ１１１の一端がＤＮＡ引込範囲３０１に入ったとき、ナノポア１１２に引き込まれる。つまり、いかにしてＤＮＡ１１１の一端をＤＮＡ引込範囲３０１に近づけるかが重要である。

本発明が解決する課題を説明するために、実際のメカ精度を考慮した場合を図４に示す。ナノポアデバイス１０１とプローブ１０７に取り付けられたＤＮＡ固定基板１０８の平行度は、０度にすることはできない。そのため、ＤＮＡ１１１の一端をＤＮＡ引込範囲３０１に近づける際、平行度の違いから、ナノポアデバイス１０１とＤＮＡ固定基板１０８が接触してしまい、ＤＮＡ１１１が数百ナノメートルのＤＮＡ引込範囲３０１に近づくことが難しい。

１本鎖のＤＮＡ１１１は、絡まり方の違いやブラウン運動によって、形状が様々のため、ナノポアデバイス１０１とＤＮＡ固定基板１０８の距離が、数百ナノメートルのＤＮＡ引込範囲３０１まで近づかなくても、偶然的に、ＤＮＡ１１１がナノポア導入される可能性はあるが、待ち時間を制御することは難しく、スループットに多く影響する。

図５は、本発明の生体試料分析装置５００の第１の実施方法を示している。円形１００Ａ内の拡大図を図５の右側に示す。

ナノポアデバイス１０１の拡大図を示す。分析方法は、（１）〜（５）の手順で行っていく。（１）ＤＮＡ固定溶液５０１内にあるＤＮＡ固定基板１０８を、シリンジポンプ５０２などのポンプで、陰圧を作り出し、吸引する。（２）吸引したＤＮＡ固定基板１０８を、ナノポア１１２に駆動機構を用いて、近づける。（３）ＤＮＡ固定基板１０８がナノポアデバイス１０１と接触しない程度に近づけた後、陰圧を開放し、プローブ１０７から、ＤＮＡ固定基板１０８を離反する。（４）離反されたＤＮＡ固定基板１０８は、ナノポアデバイス１０１上に落下し、ＤＮＡ固定基板１０８とナノポアデバイス１０１の距離は、ほぼ０になる。ここで、距離０と言うのは、完全な０ナノメートルではなく、ＤＮＡ固定基板１０８と、ナノポアデバイス１０１には、表面粗さなどがあり、完全にナノポアを封鎖することはできない。ＤＮＡ固定基板１０８とナノポアデバイス１０１との隙間は、ナノポア径１０ｎｍの面積以上あり、封鎖電流には影響はない。仮に完全に０になってしまい、封鎖電流に影響がある場合は、ＤＮＡ固定基板１０８の両端に、設計上、隙間を作るように、部材を製作してもよい。

また、ＤＮＡ固定基板１０８の材質の比重は、電解質溶液１０３の比重よりも大きいとする。

プローブ１０７から、ＤＮＡ固定基板１０８を離反したことで、図４に示すようにＤＮＡ固定基板１０８とナノポアデバイス１０１との接触を防止することができ、ＤＮＡ１１１の一端は、ＤＮＡ引込範囲３０１（図３）に、限りなく近づくことができ、絡まっていたＤＮＡ１１１の一端がナノポア１１２に引き込まれ、ナノポア１１２中のＤＮＡ１１１の断面積分だけ減少した封鎖信号（電流値）が、アンプ（図示せず）で増幅されて、ＡＤＣ（図示せず）を介してＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ 図示せず）で確認される。またこの効果は、シングルポアだけでなく、マルチポアシステムでも同様の効果が得られる。さらに、よりＤＮＡ固定基板１０８を、ナノポアデバイス１０１に近づけるため、一旦離反したＤＮＡ固定基板１０８をプローブ１０７で押し付けることをしてもよい。（５）その後、封鎖信号を確認した後、再び、シリンジポンプ５０２などのポンプで、陰圧を作り出し、ＤＮＡ固定基板１０８を吸引する。（６）吸引したＤＮＡ固定基板１０８を駆動ステージ１０９によって、精密制御を行い、引き抜いたり、押し込んだりすることで、ＤＮＡ１１１がナノポアデバイス１０１のナノポアを通過する際に変化する電流値から塩基配列を読み取る。

（５）において、陰圧による吸引の際、平行度の違いから、駆動ステージ１０９よる精密制御できない領域が存在するが、それは、ＤＮＡ配列を読まない領域（バッファ）を設けることする。１枚の基板にＤＮＡが固定されているため、基板のみを制御できることも利点の一つである。

図６は、本発明の生体試料分析方法６００の第２の実施方法を示している。円形１００Ａ内に、ナノポアデバイス１０１の拡大図を示す。分析方法は、（１）〜（５）の手順で行っていく。予め、ＤＮＡ固定基板１０８のＤＮＡ１１１が固定される面とは反対の面に、磁性体（金属）６０１を、付着、接合、接着、または塗布などを行っておく。（１）ＤＮＡ固定溶液５０１内にあるＤＮＡ固定基板１０８を、電磁石６０２などで、磁力を作り出し、吸引する。（２）吸引したＤＮＡ固定基板１０８を、ナノポア１１２に駆動機構を用いて、近づける。（３）ＤＮＡ固定基板１０８がナノポアデバイス１０１と接触しない程度に近づけた後、磁力を開放し、プローブ１０７から、ＤＮＡ固定基板１０８を離反する。（４）離反されたＤＮＡ固定基板１０８は、ナノポアデバイス１０１上に落下し、ＤＮＡ固定基板１０８とナノポアデバイス１０１の距離は、ほぼ０になる。ここで、距離０と言うのは、完全な０ナノメートルではなく、ＤＮＡ固定基板１０８と、ナノポアデバイス１０１には、表面粗さなどがあり、完全にナノポアを封鎖することはできない。ＤＮＡ固定基板１０８とナノポアデバイス１０１との隙間は、ナノポア径１０ｎｍの面積以上あり、封鎖電流には影響はない。また仮に完全に０になってしまい、封鎖電流に影響がある場合は、ＤＮＡ固定基板１０８の両端に、設計上、隙間を作るように、部材を製作してもよい。

また、ＤＮＡ固定基板１０８の材質の比重は、電解質溶液１０３の比重よりも大きいとする。

プローブ１０７から、ＤＮＡ固定基板１０８を離反したことで、ＤＮＡ１１１の一端は、ＤＮＡ引込範囲３０１に、限りなく近づくことができ、絡まっていたＤＮＡ１１１の一端がナノポア１１２に引き込まれ、ナノポア１１２中のＤＮＡ１１１の断面積分だけ減少した封鎖信号（電流値）が、アンプ（図示せず）で増幅されて、ＡＤＣ（図示せず）を介してＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ 図示せず）で確認される。またこの効果は、シングルポアだけでなく、マルチポアシステムでも同様の効果が得られる。さらに、よりＤＮＡ固定基板１０８を、ナノポアデバイス１０１に近づけるため、一旦離反したＤＮＡ固定基板１０８をプローブ１０７で、押し付けることをしてもよい。（５）その後、封鎖信号を確認した後、再び、電磁石６０２で、磁力を作り出し、ＤＮＡ固定基板１０８を吸引する。（６）吸引したＤＮＡ固定基板１０８を駆動ステージ１０９によって、精密制御を行い、引き抜いたり、押し込んだりすることで、ＤＮＡ１１１がナノポアデバイス１０１のナノポアを通過する際に変化する電流値から塩基配列を読み取る。

（５）において、磁力による吸引の際、平行度の違いから、駆動ステージ１０９よる精密制御できない領域が存在するが、それは、ＤＮＡ配列を読まない領域（バッファ）を設けることする。１枚の基板にＤＮＡが固定されているため、基板のみを制御できることも利点の一つである。

図７は、本発明の生体試料分析方法７００の第３の実施方法を示している。円形１００Ａ内に、ナノポアデバイス１０１の拡大図を示す。分析方法は、（１）〜（５）の手順で行っていく。（１）プローブ先端に、モータ７０１などを駆動力とした、自動把持機構７０２になっており、ＤＮＡ固定溶液５０１内にあるＤＮＡ固定基板１０８を、把持する。（２）把持したＤＮＡ固定基板１０８を、ナノポア１１２に駆動機構を用いて、近づける。（３）ＤＮＡ固定基板１０８がナノポアデバイス１０１と接触しない程度に近づけた後、自動把持機構７０２を開放し、プローブ１０７から、ＤＮＡ固定基板１０８を離反する。（４）離反されたＤＮＡ固定基板１０８は、ナノポアデバイス１０１上に落下し、ＤＮＡ固定基板１０８とナノポアデバイス１０１の距離は、ほぼ０になる。ここで、距離０と言うのは、完全な０ナノメートルではなく、ＤＮＡ固定基板１０８と、ナノポアデバイス１０１には、表面粗さなどがあり、完全にナノポアを封鎖することはできない。ＤＮＡ固定基板１０８とナノポアデバイス１０１との隙間は、ナノポア径１０ｎｍの面積以上あり、封鎖電流には影響はない。また仮に完全に０になってしまい、封鎖電流に影響がある場合は、ＤＮＡ固定基板１０８の両端に、設計上、隙間を作るように、部材を製作してもよい。

また、ＤＮＡ固定基板１０８の材質の比重は、電解質溶液１０３の比重よりも大きいとする。

プローブ１０７から、ＤＮＡ固定基板１０８を離反したことで、ＤＮＡ１１１の一端は、ＤＮＡ引込範囲３０１に、限りなく近づくことができ、絡まっていたＤＮＡ１１１の一端がナノポア１１２に引き込まれ、ナノポア１１２中のＤＮＡ１１１の断面積分だけ減少した封鎖信号（電流値）が、アンプ（図示せず）で増幅されて、ＡＤＣ（図示せず）を介してＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ 図示せず）で確認される。またこの効果は、シングルポアだけでなく、マルチポアシステムでも同様の効果が得られる。さらに、よりＤＮＡ固定基板１０８を、ナノポアデバイス１０１に近づけるため、プローブ１０７で、ＤＮＡ固定基板１０８を押し付けることをしてもよい。（５）封鎖信号を確認した後、再び、自動把持機構７０２で、ＤＮＡ固定基板１０８を把持する。（６）把持したＤＮＡ固定基板１０８を駆動ステージ１０９によって、精密制御を行い、引き抜いたり、押し込んだりすることで、ＤＮＡ１１１がナノポアデバイス１０１のナノポアを通過する際に変化する電流値から塩基配列を読み取る。

（５）において、自動把持機構による把持の際、平行度の違いから、駆動ステージ１０９よる精密制御できない領域が存在するが、それは、ＤＮＡ配列を読まない領域（バッファ）を設けることする。１枚の基板にＤＮＡが固定されているため、基板のみを制御できることも利点の一つである。

図８は、本発明の第４の生体試料分析方法を示している。

本実施例は、実施例１と類似しているため、相違点を中心に説明し、重複する部分は割愛する。本実施例では、実施例１に示す平板上のＤＮＡ固定基板１０８の代わりに、球状のＤＮＡ固定ビーズ８０１を用いている。このＤＮＡ固定ビーズ８０１にＤＮＡを固定する。シリンジポンプ５０２を用いてＤＮＡ固定ビーズ８０１をプローブ１０７に吸引したり、離反したりする点は、実施例１と同じである。なお、図８に示すように球状のＤＮＡ固定ビーズ８０１プローブ先端８０２には多数の開口部が設けられている。

図９は、本発明の第５の生体試料分析方法を示している。

本実施例は、実施例２と類似しているため、相違点を中心に説明し、重複する部分は割愛する。本実施例では、実施例２に示す平板上のＤＮＡ固定基板１０８の代わりに球状のＤＮＡ固定磁気ビーズ９０１を用いている。この球状のＤＮＡ固定磁気ビーズ９０１にＤＮＡを固定する。電磁石６０２を用いる点は実施例２と同じである。その他、プローブ１０７の動作なども実施例２と同じである。

図１０は、本発明の生体試料分析方法１０００の第６の生体試料分析方法を示している。

実施例１の手順（２）〜（３）は、吸引したＤＮＡ固定基板１０８を、ナノポア１１２に駆動機構を用いて、近づけ、ＤＮＡ固定基板１０８がナノポアデバイス１０１と接触しない程度に近づけた後、陰圧を開放し、プローブ１０７から、ＤＮＡ固定基板１０８を離反しているが、離反する距離は、本発明において、問題ではない。たとえば、ＤＮＡ固定液５０１からピンセットで把持し、手動で、フローセル開口部１１０に挿入してもよい。その後の手順は、実施例１〜実施例３の（４）の手順に従い、ＤＮＡ固定基板１０８は、ナノポアデバイス１０１上に落下し、ＤＮＡ固定基板１０８とナノポアデバイス１０１の距離は、ほぼ０になり、ＤＮＡ１１１の一端は、ＤＮＡ引込範囲３０１に、限りなく近づくことができ、絡まっていたＤＮＡ１１１の一端がナノポア１１２に引き込まれ、ナノポア１１２中のＤＮＡ１１１の断面積分だけ減少した封鎖信号（電流値）が、アンプ（図示せず）で増幅されて、ＡＤＣ（図示せず）を介してＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ 図示せず）で確認される。またこの効果は、シングルポアだけでなく、マルチポアシステムでも同様の効果が得られる。ここで、距離０と言うのは、完全な０ナノメートルではなく、ＤＮＡ固定基板１０８と、ナノポアデバイス１０１には、表面粗さなどがあり、完全にナノポアを封鎖することはできない。ＤＮＡ固定基板１０８とナノポアデバイス１０１との隙間は、ナノポア径１０ｎｍの面積以上あり、封鎖電流には影響はない。仮に完全に０になってしまい、封鎖電流に影響がある場合は、ＤＮＡ固定基板１０８の両端に、設計上、隙間を作るように、部材を製作してもよい。

また、ＤＮＡ固定基板１０８の材質の比重は、電解質溶液１０３の比重よりも大きいとする。（５）封鎖信号を確認した後、陰圧や磁力、把持機構によって、ＤＮＡ固定基板１０８を吸引する。（６）吸引したＤＮＡ固定基板１０８を駆動ステージ１０９によって、精密制御を行い、引き抜いたり、押し込んだりすることで、ＤＮＡ１１１がナノポアデバイス１０１のナノポアを通過する際に変化する電流値から塩基配列を読み取る。

（５）において、陰圧による吸引の際、平行度の違いから、駆動ステージ１０９よる精密制御できない領域が存在するが、それは、ＤＮＡ配列を読まない領域（バッファ）を設けることする。１枚の基板にＤＮＡが固定されているため、基板のみを制御できることも利点の一つである。

図１１は、本発明の生体試料分析方法１１００の第７の生体試料分析方法を示している。

実施例５の手順（２）〜（３）は、吸引したＤＮＡ固定磁気ビーズ９０１を、ナノポア１１２に駆動機構を用いて、近づけ、ＤＮＡ固定磁気ビーズ９０１がナノポアデバイス１０１と接触しない程度に近づけた後、磁力を開放し、プローブ１０７から、ＤＮＡ固定磁気ビーズ９０１を離反しているが、離反する距離は、本発明において、問題ではない。たとえば、ＤＮＡ固定液５０１からＤＮＡ固定磁気ビーズ９０１を、手動で、フローセル開口部１１０に挿入してもよい。その後の手順は、実施例４、または、実施例５の（４）の手順に従い、ＤＮＡ固定磁気ビーズ９０１は、ナノポアデバイス１０１上に落下し、ＤＮＡ固定磁気ビーズ９０１とナノポアデバイス１０１の距離は、ほぼ０になり、ＤＮＡ１１１の一端は、ＤＮＡ引込範囲３０１に、限りなく近づくことができ、絡まっていたＤＮＡ１１１の一端がナノポア１１２に引き込まれ、ナノポア１１２中のＤＮＡ１１１の断面積分だけ減少した封鎖信号（電流値）が、アンプ（図示せず）で増幅されて、ＡＤＣ（図示せず）を介してＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ 図示せず）で確認される。またこの効果は、シングルポアだけでなく、マルチポアシステムでも同様の効果が得られる。さらに、よりＤＮＡ固定磁気ビーズ９０１を、ナノポアデバイス１０１に近づけるため、プローブ１０７で、ＤＮＡ固定磁気ビーズ９０１を押し付けることをしてもよい。磁気ビーズの特性を利用し、下の槽１０２Ａ側の下部に、電磁石９０２を配置し、磁気ビーズを−Ｚ方向に引っ張り、よりナノポアデバイス１０１に近づけることをしてもよい。またこの方法は，ビーズに限らず，磁性体６０１付きＤＮＡ固定基板１０８を電磁石９０２で−Ｚ方向に引っ張り、よりナノポアデバイス１０１に近づけることをしてもよい。（５）封鎖信号を確認した後、再び、電磁石６０２などで、磁力を作り出し、ＤＮＡ固定磁気ビーズ９０１を吸引する。この磁力を発生するのは、電磁石である必要はない。永久磁石でも可能である。（６）吸引したＤＮＡ固定磁気ビーズ９０１を駆動ステージ１０９によって、精密制御を行い、引き抜いたり、押し込んだりすることで、ＤＮＡ１１１がナノポアデバイス１０１のナノポアを通過する際に変化する電流値から塩基配列を読み取る。

（５）において、磁力による吸引の際、平行度の違いから、駆動ステージ１０９よる精密制御できない領域が存在するが、それは、ＤＮＡ配列を読まない領域（バッファ）を設けることする。

１００：生体試料分析装置
１００Ａ：生体試料分析装置一部拡大図
１０１：ナノポアを有するが設置された仕切り体（ナノポアデバイス）
１０２Ａ、１０２Ｂ：槽
１０３：電解質溶液
１０４：電極
１０５：電源
１０６：フローセル
１０７：プローブ
１０８：ＤＮＡ固定基板
１０９：駆動機構
１１０：フローセル開口部
１１１：ＤＮＡ
１１２：ナノポア
１１３：ナノポア薄膜
２００：配列読取例
３００：生体試料分析方法
３０１：ＤＮＡ引込範囲
５００：実施例１の生体試料分析方法
５０１：ＤＮＡ固定溶液
５０２：シリンジポンプ
５０３：シリンジポンプ流路
６００：実施例２の生体試料分析方法
６０１：磁性体（金属）
６０２：電磁石
７００：実施例３の生体試料分析方法
７０１：モータ
７０２：自動把持機構
８００：実施例４の生体試料分析方法
８０１：ＤＮＡ固定ビーズ
８０２：プローブ先端流路
９００：実施例５の生体試料分析方法
９０１：ＤＮＡ固定磁気ビーズ
９０２：電磁石
１０００：実施例６の生体試料分析方法
１１００：実施例７の生体試料分析方法

Claims (10)

1. 生体試料が固定された固定部材と、当該生体試料が通過する貫通孔を有する基板と、前記固定部材を駆動する駆動機構を備えた、生体試料分析装置を用い、生体試料が貫通孔を通過する時に生体試料を検出する生体試料分析方法であって、
   (a) 生体試料が貫通孔を封鎖したことを確認した後に固定部材を保持し、
   (b) 駆動機構によって固定部材を引き上げること
   を特徴とする生体試料分析方法。
2. 請求項１において、
   前記(a)の工程の前に、
   (c) プローブに固定部材を保持し、
   (d) 固定部材を基板に接近させ、
   (e) プローブから固定部材をリリースすること
   を特徴とする生体試料分析方法。
3. 請求項１において、
   前記(a)の工程の前に、
   固定部材を生体試料が通過する貫通孔を有する基板が挿入されている槽に落下させることを特徴とする生体試料分析方法。
4. 請求項１から３において、
   生体試料は核酸であり、
   基板は、電解質溶液を収容した槽内に、挿入されており、
   生体試料が貫通孔を通過する時に封鎖される面積に応じて核酸の塩基配列を読み取ることを特徴とする生体試料分析方法。
5. 請求項１から３のいずれかにおいて、
   プローブへの固定部材の保持は、陰圧で行うことを特徴とする生体試料分析方法。
6. 請求項１から３のいずれかにおいて、
   プローブへの固定部材の保持は、磁力で行うことを特徴とする生体試料分析方法。
7. 請求項１から３のいずれかにおいて、
   プローブへの固定部材の保持は、機械的な把持により行うことを特徴とする生体試料分析方法。
8. 請求項１から３のいずれかにおいて、
   固定部材は、平板状の基板であることを特徴とする生体試料分析方法。
9. 請求項１から３のいずれかにおいて、
   固定部材は、球状ビーズであることを特徴とする生体試料分析方法。
10. 生体試料が固定された固定部材と、当該生体試料が通過する貫通孔を有する基板と、前記固定部材を駆動する駆動機構と、生体試料が貫通孔を通過する時に生体試料を検出する検出機構とを備えた、生体試料分析装置において、
    生体試料が貫通孔を封鎖したことを確認した後に固定部材を保持し、駆動機構によって固定部材を引き上げることを特徴とする生体試料分析装置。

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