JP5764296B2 - 生体ポリマーの特性解析法 - Google Patents
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Description
本願によるマルチナノポア解析装置の動作の1実施例を図1に示す。図示の通り、観察機構付きマルチトラップされた生体ポリマー特性解析手法プロセス100は、試料調製工程101、生体ポリマーの投入工程102、生体ポリマーの動きを抑制する処理工程103、トラップ位置の確認工程104、トラップ率に基づく判断工程105、解析工程106の6工程で構成される。以下、各工程の概要を説明する(詳細は後述する)。
トラップ位置の確認工程104において、生体ポリマーと標識物質とは複合体を形成しており、両者ならびにその複合体の位置は一致する。確認手段は標識物質の標識の種類に応じて適宜選択可能である。例えば生体ポリマーに結合された標識物質が蛍光分子群や蛍光ビーズ、FRET方式の標識である場合、確認手段として、光学方式(以下光学確認方式)、特に好適には蛍光顕微鏡が採用できる。蛍光顕微鏡画像はCCDカメラなどによって画像データに変換し、計算機によって処理することにより、生体ポリマーの存在の有無と位置を確認する。
トラップ位置の確認工程105において、確認手段として電流方式(以下電流確認方式)を採用することもできる。電流確認方式の場合、薄膜には各ポア近傍にそれぞれ電極対を設け、開口面に対して水平に電圧を印加する。電極間に流れる電流を、電流検出機構により計測する。電流検出機構は具体的には電流アンプ、ADコンバータ、計算機などから構成される。電極対間の電流は生体ポリマーが存在している時と、いないときで差があるため、個々の電極対間の電流をそれぞれ計測し、閾値を設けて計算機で判別することにより、各ポアにおける生体ポリマーの存在の有無を確認できる。この電流計測においては生体ポリマーの存在の有無を識別できれば良いため、電流アンプとして簡易なものを用いることができる。
なお電流確認方式の変形例として、電流としてトンネル電流、静電容量を検出してもよい。この場合、トラップ位置の確認工程104においてチャンバー内に電解質は添加されていなくても構わない。
本願による位置特定機構を持つ生体ポリマー特性解析を行うマルチナノポア解析装置構成の1実施例について図11を用いて説明する。図11は本実施例の生体ポリマー特性解析装置の一部であり、図示のように、501は生体ポリマートラップ用ポアつき薄膜、503は生体ポリマー封入チャンバー、1101は観察用電流計測系、1102は測定用ポア、1104〜1106は測定用ポア駆動系、1103は測定用トンネル電流及び静電容量計測系及び駆動装置制御機構、1107は計算機である。
測定に用いる際の動作工程は基本的に実施例1のフローに従う。生体ポリマーのトラップ情報取得、生体ポリマー特性解析を実施するためには数々の手法が存在する。その中で本実施例では生体ポリマーの確認には水平型封鎖電流、測定にはトンネル電流方式を採用した形で例示する。
生体ポリマートラップ用ポアつき薄膜には複数のナノポアを備え、そのナノポアの直径は生体ポリマーに結合した標識物質の直径よりも小さい。形状は円筒形以外でもよく、例えば直方体でもよい。ポアが開いている部分の厚みは、生体ポリマーと標識物質間のサイズとほぼ同じか、それ以下が望ましい。材料は問わない。例えば、封鎖電流によるシーケンシングの場合、シリコン酸化膜もしくはシリコンナイトライドが用いられるが、それに限らなければ導電性材料膜例えば、p-Si,a-Siによる成膜でも構わない。
薄膜は層構成になっており、内部に電極がパターニングされている。ポアの内部に電解質溶液を充填して電極に直流電圧を印加すると、ポアの内部でイオン電流が発生する。この電圧源は観察用電流計測系1101に内蔵されている。電極はすべてのポアに向かって図13のように配線されており、それぞれの配線は、簡易電流増幅機構に接続されている。
生体ポリマートラップ用ポアつき薄膜の備えるナノポアの並びを示す模式図を、図7に示した。実施態様によっては、一つのポアを持つ薄膜を、複数並べる(図8)。他の実施態様では、複数のポアを持つ薄膜を、複数並べることも可能である(図9)。
一つのポアを持つ薄膜を複数並べる(図8)の場合、ここのポアが独立していると、測定装置に向かって測定対象を動かすことが可能となり、トラップされていないポアの測定を行うことがなくなるばかりでなく、測定装置を長時間移動させる必要もなくなるため、測定のスループットが上がる。
複数のポアを持つ薄膜を複数並べる(図9)の場合、上記二つの性質が共存する。
また、実施態様によっては、生体ポリマーをトラップしているポアつき薄膜の上部には、一つのナノポアに二つ以上の生体ポリマーがトラップされることを防ぐ為に、薄膜の面に対して水平方向の振動をかけるとよい。トラップ用ポアつき薄膜は駆動装置に結合され、半径マイクロメーターオーダーで振動する。100〜3000rpmの範囲での回転スピードがよい。実施態様によっては、トラップ用ポアつき薄膜の備えるナノポア上部に液体の横向きの流れを作る(拡大図:図16)。これによりポアの無い薄膜表面に、静電気的に吸着してしまった標識物質を洗い流すことが可能となる。
標識物質と結合した生体ポリマーおよび電解質溶液が含まれている。電解質溶液中には一般にKClなどが含まれる。実施態様によってはNaCl,MgCl2などまたは、それらの混合物を用いてもよい。チャンバー材料としては、中に封入された溶液が外部に漏れ出ない素材が用いられる。また、溶液を保持できるだけの堅牢性を持ち合わせる。内部にはチャンバー外壁からの振動を吸収する素材からなる緩衝部材1109が薄膜と外壁の間にはめ込まれている。緩衝部材1109としてはポリジメチルシロキサン(PDMS)などを用いることができるが、振動を吸収する素材であればPDMS以外でも利用できる。
観察用電流計測系1101はトラップ位置の確認手段であり、トラップ用ポアつき薄膜に流す電流を発生させる電圧源および、簡易電流増幅機構1302を内蔵している。電圧源の電圧は電圧コントローラにより設定できる。これによりトラップ率をコントロールする。簡易電流増幅機構1302はさらに外部のADコンバータ1303と接続している。ADコンバータ1303はさらに計算機1107と接続している。ADコンバータ1303の出力するデータは計算機1107のモニタに映し出される。予めナノポアの位置と、出力データの対応づけがなされており、ナノポア内に生体ポリマーがトラップされることによる電流値変化の閾値を超えるポアをトラップが完了したナノポアと判断する。
実施態様によっては、トラップ位置の確認手段として光学測定方式を採用することもできる。光学測定方式の装置構成の例を図12に示した。チャンバーの上部には観察窓1202を設け、その外側に対物レンズ1201を設けた。レーザー光源1204から出力されたレーザー光1207と、試料からの蛍光1206はダイクロックミラー1203で分光される。蛍光は増幅機構、検出器1205を通り、計算機1107で記録される。
測定用ポア1102において、トンネル電流を計測する。測定用ポアつき薄膜の上面図は図14のようになっており、図13のように駆動装置(1104〜1106)と電流計測装置1304および駆動装置制御機構1305に結合している。
測定用ポアつき薄膜に形成されているポアはポリマーの塩基配列測定用のポアであるため、ナノポア周辺部の膜内にはパターニングされた電極が埋め込まれている(図13)。薄膜は主にSi、SiN、SiO2などからできている。溶液中に含まれるK+,Na+が薄膜に浸透するのを防ぐために、SiNが好適に用いられるが、親水性を保つためにSiO2コーティングするのがよい。測定用ナノポアのポア直径は10nm以下である必要がある。ナノポアの直径を10nm以下とすることにより、ポリマーのブラウン運動の抑制にも有利に働く。測定用ポアのポア径は数nm程度が好ましい。dsDNAの開口の断面積が2.5nm程度であるから、ポア径もそれに等しいかそれよりも大きくてdsDNAが2本入らない程度、すなわち5nm未満であることが特に好ましい。
測定用ポアつき薄膜には図13のような配線がなされ、トラップ用ポアつき薄膜同様に、1304に示す測定用電流計測系と電気的に結合している。
図17(B)は、第1の薄膜及び、それにトラップされた生体ポリマー、第2の薄膜及び駆動機構を横から見たものである。点線は、第2の薄膜の移動軌跡であり、トラップされた生体ポリマーの下に駆動装置が来ると、薄膜はz方向駆動装置および微動装置により移動し、生体ポリマーの解析に取り掛かる
実施様態によっては、生体ポリマーのトラップ情報は、計算機1107に随時送られ、前記第2の薄膜及び前記駆動装置1104〜1106は、図17の軌跡に限らず、トラップが完了したナノポアの下に随時アクセスしトラップされた生体ポリマーの特性解析を行う。
本願による位置特定機構を持つ生体ポリマー特性解析を行うマルチナノポア解析装置構成の1実施例を図15を用いて説明する。図は本実施例の生体ポリマー特性解析装置の一部であり、図示のように、生体ポリマートラップ用および測定用ポアつき薄膜501、生体ポリマー引き上げ力発生装置1501、生体ポリマー封入チャンバー503、観察用電流計測系1502、測定用封鎖電流計測系1503で構成されている。以下、装置動作方法および装置構成の概要を説明する。測定用ポアつき薄膜501、生体ポリマー引き上げ力発生装置1501、生体ポリマー封入チャンバー503、観察用電流計測系1502は一体化しておりひとつのチップの形を取る。
基本的な生体ポリマー解析手法は実施例1に従うが、本実施例では生体ポリマーのトラップ情報取得、生体ポリマー特性解析は、ともに封鎖電流方式で行う。
生体ポリマートラップ用および測定用ポアつき薄膜501には複数のナノポアを備え、そのポアのサイズは封鎖電流方式による解析を実現するために10nm以下である。材料は前述(実施例2)の測定用ポアつき薄膜と同じである。
一つは、生体ポリマーのトラップを確認するために、個々の簡易増幅機構1502とつながっている。簡易増幅機構は薄膜外部の駆動装置及びADコンバータ1506とつながっている。ADコンバータ1506はさらに計算機1107と接続している。計算機上では予めポアの位置とコンバータから取得される情報が対応づけられており、ある閾値以上の数値を示すポアではトラップが完了していると判断される。その時のPC画面は、図10(B)中のようになる(1010)。この情報からポアのトラップ率も取得できる。
もう一方の電極は測定用封鎖電流測定系1507に内蔵された高精度増幅機構につながっており、前記トラップ情報を参照し、任意のポアに導通させることができる切り替えスイッチで個々の任意のポアに対して一つずつ測定できるようになっている。
101 試料調製工程
102 生体ポリマー投入工程
103 生体ポリマーの動きを抑制する処理工程
104 トラップ位置確認工程
105 トラップ率による判断工程
106 解析工程
200 観察機構付きマルチトラップされた生体ポリマー特性解析手法プロセス
201 再試行場所判断工程
300 観察機構付きマルチトラップされた生体ポリマー特性解析手法プロセス
301 生体ポリマーの動きを抑制するために印加していた力が測定に対して妨げになるか否かの判断
302 解除の実行工程
400 標識物質と結合した生体ポリマー
401 標識物質
402 生体ポリマー
403 第2の化学物質
500 標識物質が結合した生体ポリマーのポアつき薄膜へのトラップされた様子
501 薄膜
502 ナノポア
503 第1のチャンバー
504 第2のチャンバー
600 ポアつき薄膜へのトラップの様子
700 複数のナノポアを備える一つの薄膜
800 ひとつのナノポアを備える複数の薄膜
900 複数のナノポアを備える複数の薄膜
1000 トラップ情報取得の際の測定データの計算機への出力例及び特性解析結果の計算機への出力例
1100 トラップ情報を電流により取得するトラップ情報取得装置の例
1101 観察用電流計測系
1102 測定用ポア
1103 測定用電流計測系及び駆動装置制御機構
1104 微動機構
1105 z軸方向粗動機構
1106 xy軸方向粗動機構
1107 計算機
1108 水流発生装置
1109 衝撃緩衝材
1200 トラップ情報を光学系により取得するトラップ情報取得装置の例
1201 対物レンズ
1202 観察窓
1203 ダイクロックミラー
1204 レーザー光源
1205 検出器
1206 蛍光
1207 レーザー光
1300 トラップ情報を電流により取得するトラップ情報取得装置の一部拡大図
1301 切り替えスイッチ
1302 簡易電流増幅機構
1303 ADコンバータ
1304 測定用電流計測機構
1305 駆動装置制御機構
1400 測定用ポアつき薄膜上面図
1500 封鎖電流方式特性解析チップ
1501 生体ポリマー引き上げ力発生装置
1502 観察用電流計測系
1503 測定用電流計測系
1504 隔壁
1505 試料封入路
1506 ADコンバータ
1507 測定用電流計測系
1600 水流発生の様子
1601 水流
1602 水流発生装置
1700 第1の薄膜、第1のポアにトラップされた生体ポリマー及び第2の薄膜の装置上面から見た位置関係および第2の薄膜の軌跡
1701 第2のポア及び連結した駆動装置の移動位置例
1710 第1のポアにトラップされた生体ポリマー及び第2の薄膜の装置位置関係を横から見た様子
Claims (25)
- 複数のナノポアを備えた第1の薄膜を用いた生体ポリマーの特性解析法であって、
前記生体ポリマーを複数、前記複数のナノポアそれぞれにトラップするトラップ工程と、
前記複数の生体ポリマーのトラップ情報を取得するトラップ情報取得工程と、
前記トラップ情報に基づいて生体ポリマーの特性を解析する解析工程と、を有し、
前記トラップ情報取得工程は、前記複数のナノポアのそれぞれについて、前記生体ポリマーがトラップされているか否かを検出し、前記検出の結果を前記トラップ情報の真偽として記録することを含み、
前記解析工程は、前記トラップ情報が真であるナノポアについて、トラップされた生体ポリマーの特性を解析することを含み、
前記複数のナノポアの総数に対する、前記複数の生体ポリマーがトラップされているナノポアの割合であるトラップ率をあらかじめ設定した閾値と比較し、前記トラップ率が前記閾値を超えていない場合、再び前記トラップ工程を行うことを特徴とする生体ポリマーの特性解析法。 - 請求項1に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記トラップ率を前記閾値と比較し、前記トラップ率が前記閾値を超えていない場合、前記複数の生体ポリマーをさらに添加することを特徴とする生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項1に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記トラップ率が前記閾値を超えていない場合、前記生体ポリマーの第1の標識物質または標識方法を変えることを特徴とする生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項1に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記トラップ工程は、前記複数の生体ポリマーをトラップする電磁場を印可することを含み、さらに前記解析工程の前に、前記電磁場を解除する工程を含むことを特徴とする生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項1に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記複数の生体ポリマーは核酸を含み、前記解析工程は、前記核酸を構成する塩基配列を解析すること含む生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項1に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記複数の生体ポリマーのうち少なくとも1つの生体ポリマーの一端に前記複数のナノポアの少なくとも一つの径より粒径の大きい第2の標識物質を結合し、前記トラップ工程において前記第2の標識物質を前記ナノポアに引っかけることにより前記生体ポリマーを前記ナノポアにトラップすることを特徴とする生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項6に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記標識物質は蛍光ビーズまたは光吸収体または金属微粒子または大型ポリマーまたは磁気ビーズであることを特徴とする生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項6に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記複数の生体ポリマーの少なくとも一つ以上の生体ポリマーの一端に、マイナス荷電を有する第3の標識物質を結合することを特徴とする生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項8に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記第3の標識物質は前記複数の生体ポリマーの少なくとも1つよりも同じか又は大きい単位分子量当たりの荷電数を有していることを特徴とする生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項1に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記複数のナノポアのうち、少なくとも一つ以上のナノポアの直径は1nm以上50nm以下であることを特徴とする生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項1に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記トラップ情報は、トラップされた生体ポリマーの位置を含むことを特徴とする生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項11に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記トラップ情報は、前記複数の生体ポリマーの少なくとも1つ以上が前記複数のナノポアの少なくとも1つ以上を通過するとき、前記第1の薄膜で隔たれた空間の一方から他方へ流れる電流の変化量を含むことを特徴とする生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項11に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記トラップ情報は、前記生体ポリマーが前記ナノポアを通過するとき、前記ナノポアの内側面に対向し露出する電極間に生じる電流の変化を含むことを特徴とする生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項13に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記電流はトンネル電流であることを特徴とする生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項11に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記トラップ情報は、前記複数の生体ポリマーの少なくとも1つ以上が前記複数のナノポアの少なくとも1つ以上を通過するとき、前記複数のナノポアの内側面に対向し露出する電極間の静電容量の変化を含むことを特徴とする生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項11に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記トラップ情報取得工程は、蛍光顕微鏡または光学顕微鏡を用いて観察可能な標識物質を検出することにより、前記トラップ情報を取得することを含むことを特徴とする生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項11に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記トラップ情報取得工程は、前記複数のナノポアに設けた電極からの複数の信号を前記電極に接続されたアンプで増幅し、前記増幅された複数の信号を前記アンプに接続されたAD変換装置でデジタル信号に変換し、前記デジタル信号を前記AD変換装置に接続された計算機に取り込み、前記計算機は前記デジタル信号を前記ナノポアの配列情報と対応づけることで前記ナノポアに関するトラップ情報を取得することを含むことを特徴とする生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項11に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記トラップ情報取得工程は、予め前記第1の薄膜の座標の指標となる画像を取得し、さらにトラップされた標識物質の画像と前記複数のナノポアに関する光強度情報とを取得し、前記閾値と比較することにより前記トラップされた標識物質の位置を前記第1の薄膜と観察電流系を介して接続された計算機で読み取れる状態に変換し、前記トラップ情報を前記計算機で確認することを含むことを特徴とする生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項1に記載の生体ポリマーの特性解析法において、さらに複数のナノポアを備えた第2の薄膜を有し、前記解析工程は前記第2の薄膜を用いて解析を行うことを含むことを特徴とする生体ポリマー特性解析法。
- 請求項19に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記トラップ情報は、トラップされた生体ポリマーのトラップ位置を含み、前記解析工程は、前記トラップ情報に基づいて、前記第1の薄膜の前記トラップ位置に前記第2の薄膜が移動し解析を行うことを含む生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項1に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記解析工程は、前記第1の薄膜で隔たれた2つの空間の間の封鎖電流を解析することを特徴とする生体ポリマー特性解析法。
- 請求項1に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記解析工程は、前記複数のナノポアの内側面に対向し露出する電極間の封鎖電流を解析することを特徴とする生体ポリマー特性解析法。
- 請求項1に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記解析工程は、
前記複数のナノポアの内側面に対向し露出する電極間のトンネル電流を解析することを特徴とする生体ポリマーの特性解析法。 - 請求項11に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記解析工程は、前記トラップ情報に基づいて、前記複数の生体ポリマーがトラップされた前記複数のナノポアの中から選択された一つの生体ポリマーのみ解析することを含む生体ポリマーの特性解析法。
- 請求項11に記載の生体ポリマーの特性解析法において、前記解析工程は、前記トラップ情報に基づいて、前記複数の生体ポリマーがトラップされた前記複数のポアを順次選択して解析することを含む生体ポリマーの特性解析法。
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