CN101680873B - 使用纳米孔的组合物、设备、系统和方法 - Google Patents

Abstract

本文公开的发明提供了能够检测并控制纳米孔中被另一个化合物如酶起作用的混合物中的个体聚合物的设备和方法。该设备和方法也能被用来在反馈控制下或使用由多聚核苷酸和纳米孔之间的相互作用所产生的信号来快速(约大于50Hz)测定多聚核苷酸的核苷酸碱基序列。本发明在分子生物学、结构生物学、细胞生物学、分子开关、分子电路和分子计算设备及其制造领域具有特殊的用途。

Description

使用纳米孔的组合物、设备、系统和方法

本申请要求以下优先权和利益：2007年4月4日提交、标题为“使用纳米孔将酶活性限制于一个分子或复合体的方法”的美国临时专利申请序列第60/921,787号，2007年5月21日提交、标题为“通过使用纳米孔进行合成来对多聚核苷酸进行测序的方法”的美国临时专利申请序列第60/931,115号，2007年7月30日提交、标题为“在规定的部位安置单分子的方法”的美国临时专利申请序列第60/962,530号，2007年9月4日提交、标题为“独立寻址纳米孔的超大规模阵列的制造方法及其使用方法”的美国临时专利申请序列第60/967,539号，及2008年1月25日提交、标题为“悬浮在纳米孔里的单拴系多聚核苷酸的反馈控制以重复探测多聚核苷酸结合蛋白”的美国临时专利申请序列第61/062,391号，所有的这些申请在这里为了所有目的整体引用被包括进来。

本发明部分地使用来自国家人类基因组研究所(NationalHumanGenomeResearchInstitute，拨款号HG003703-01和HG004035-01)及来自国家综合医学科学院(NationalInstituteofGeneralMedicalSciences，拨款号GM073617-01A1)的基金来进行。美国联邦政府享有本发明的某些权利。

发明领域

在此公开的本发明提供能够调节混合物中的个体聚合物被另一化合物如酶起作用的时间的设备和方法。本发明在分子生物学、结构生物学、细胞生物学、分子开关、分子电路和分子计算设备，及其制造领域中有特殊的用途。本发明还涉及使用所述组合物来诊断一个受试者是否容易患癌症、自身免疫性疾病、细胞周期病症或其他病症的方法。

背景技术

本发明涉及用于表征多聚核苷酸和其他聚合物的组合物、方法和装置的领域。

以很快的方式确定DNA和RNA的核苷酸序列是生物技术研究人员的主要目标，特别是对寻求获得生物体的整个基因组序列的项目。此外，快速测定多聚核苷酸的序列对鉴定个体和群体中的基因突变和多态性是重要的。

纳米孔测序(Nanoporesequencing)是快速测定多聚核苷酸分子序列的一种方法。纳米孔测序基于单个多聚核苷酸(例如DNA和RNA)穿过纳米孔口(nanoporeaperture)的时候其中的个体核苷酸的物理感测性质(或在核苷酸环境中的物理变化(就是说，例如电流))。原则上，多聚核苷酸的序列能够通过单个分子确定。然而，实际上，优选的是一个多聚核苷酸序列由统计平均数据来确定，该统计平均数据由相同分子的多次经过或具有相同多聚核苷酸序列的多个分子的经过来获得。当分子通过小的离子通道时使用膜通道来表征多聚核苷酸已经被Kasianowicz等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(美国国家科学院院刊)，93：13770-13773，1996，在此通过引用并入)研究过了，通过使用一个电场来推动单链RNA和DNA分子穿过一个脂质双层膜中的1.5纳米直径的纳米孔口(例如，一个离子通道)。纳米孔口的直径在任何既定时候仅允许单链多聚核苷酸穿过该纳米孔口。当多聚核苷酸穿过纳米孔口时，该多聚核苷酸部分阻断该纳米孔口，导致离子电流的暂时下降。由于电流下降的时间长度与多聚核苷酸的长度成正比，Kasianowicz等人(1996)得以实验性地通过测量离子电流的变化确定多聚核苷酸的长度。

Baldarelli等(美国专利第6,015,714号)和Church等(美国专利第5,795,782号)描述了使用纳米孔以单体接单体基准(monomerbymonomerbasis)表征包括DNA和RNA分子的多聚核苷酸。特别地，Baldarelli等通过将多聚核苷酸从纳米孔口穿过而对该多聚核苷酸进行表征和测序。纳米孔口嵌入在一个结构或界面上，对两种媒介进行分离。当多聚核苷酸穿过纳米孔口时，该多聚核苷酸通过阻断纳米孔口来改变离子电流。当个体核苷酸穿过纳米孔口时，每个碱基/核苷酸以允许对暂时阻断纳米孔口的核苷酸进行鉴定的方式改变离子电流，从而允许人们表征多聚核苷酸的核苷酸组成并有可能确定多聚核苷酸的核苷酸序列。

先前的纳米孔分析技术的一个缺点是控制目标多聚核苷酸被分析的速度。如Kasianowicz等(1996)描述的，纳米孔分析是完成多聚核苷酸长度测定的一种有用方法。然而，易位速度依赖于核苷酸组成，并且，在Kasianowicz等(1996)所述的测量条件下，易位速度可以在每秒10⁵至10⁷个核苷酸之间变化。因此，任何给定的多聚核苷酸的长度和它的易位时间之间的关联并不直接。还被预期，如果易位速度被大幅降低，能够得到关于多聚核苷酸内的组成和核苷酸单元之间空间关系的更高程度的分辨率。

目前需要提供能够用于包括多聚核苷酸和多肽的聚合物表征的组合物和方法，以及疾病和病症的诊断和预后。

发明简述

本发明提供薄膜设备和使用该薄膜设备的方法。所述设备包括通过电气通信装置连接的顺室(cischamber)和反室(transchamber)。该顺室和反室被包括至少一个孔或通道的薄膜分离。在一个优选的实施方式中，薄膜包括具有疏水域和亲水域的化合物。在一个更优选的实施方式中，薄膜包括磷脂。该设备还包括在顺室和反室之间应用电场的装置。使孔或通道的形状和大小具有让聚合物通过的适当维度。在一个优选的实施方式中，孔或通道容纳一部分但不是全部的聚合物。在另一个优选的实施方式中，所述聚合物为多聚核苷酸。在一个可选择的优选实施方式中，所述聚合物为多肽。本发明提供的其他聚合物包括多肽、磷脂、多糖和聚酮化合物。

在一个实施方式中，薄膜还包括对聚合物具有结合亲和力的化合物。在一个优选的实施方式中，结合亲和力(K_a)为至少10⁶升/摩尔(l/mole)。在一个更优选的实施方式中，K_a为至少10⁸升/摩尔。在另一个仍优选的实施方式中，所述化合物与至少一个孔相邻。在一个更优选的实施方式中，化合物为一通道。在一个仍更优选的实施方式中，通道具有生物活性。在一个最优选的实施方式中，所述化合物包括孔。

在一个实施方式中，所述化合物包括酶活性。酶活性可以是，例如，但不限于，蛋白酶、激酶、磷酸酶、水解酶、氧化还原酶、异构酶、转移酶、甲基化酶、乙酰基转移酶、连接酶、裂解酶、及类似物的酶活性。在一个更优选的实施方式中，酶活性可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸内切酶、核酸外切酶、DNA连接酶、DNA酶、尿嘧啶-DNA糖苷酶、核糖体、激酶、磷酸酶、甲基化酶、乙酰基转移酶、或类似物的酶活性。

在另一个实施方式中，孔的大小和形状允许活化剂(activator)通过，其中，所述活化剂选自由ATP、NAD⁺、NADP⁺、二酰甘油、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine)、类二十烷酸(eicosinoids)、视黄酸、钙化醇、抗坏血酸、神经肽、脑啡肽、内啡肽、4-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺(5-HT)、儿茶酚胺、乙酰辅酶A、S-腺苷甲硫氨酸和任何其他生物活化剂构成的组。

在又一个实施方式中，孔的大小和形状允许辅因子通过，其中，辅因子选自由Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、ATP、NAD⁺、NADP⁺和任何其他生物辅因子构成的组。

在一个优选的实施方式中，孔或通道为孔分子或通道分子，包括生物分子，或合成修饰分子，或改变的生物分子，或其组合。这种生物分子是，例如，但不限于，离子通道、核苷通道、肽通道、糖转运蛋白、突触通道、跨膜受体，如GPCR及类似物、核孔、合成变异体、嵌合变异体、或类似物。在一个优选的实施方式中，生物分子为α-溶血素。

在一个可选择的实施方式中，化合物包括非-酶生物活性。具有非-酶生物活性的化合物可以是，例如，但不限于，蛋白质、肽、抗体、抗原、核酸、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、吗啉寡聚核苷酸(morpholinos)、糖、脂质、糖磷酸肌醇(glycophosphoinositols)、脂多糖或类似物。该化合物可以具有抗原活性。该化合物可以具有选择性结合性质，借此聚合物在一个特定控制的环境条件下结合到该化合物，但是当环境条件改变时不结合。这种条件可以是，例如，但不限于，[H⁺]的变化、环境温度的变化、严格性的变化、疏水性的变化、亲水性的变化、或类似变化。

在另一个实施方式中，本发明提供一种化合物，其中该化合物还包括一个连接体分子，该连接体分子选自由硫醇基、硫醚基、磷酸基、硫酸基、氰基、哌啶基、9-芴甲氧羰基(Fmoc基)和叔丁氧羰基(Boc基)构成的组。

在一个实施方式中，薄膜包括多个孔。在一个实施方式中，设备包括多个电极。

聚合物

在另一个实施方式中，本发明提供一种控制酶与聚合物的结合的方法，该方法包括：提供两个独立的、相邻的介质池和位于两个池之间的界面，该界面具有通道，通道的维度使得每次仅允许一个聚合物按一个单体接一个单体的方式从一个池到另一个池顺序地通过；提供一种对聚合物具有结合活性的酶；将所述聚合物引入两个池中的一个；将所述酶引入到两个池中的一个；在两个池之间应用一个电位差，从而产生第一极性；第一次逆转电位差，从而产生第二极性；第二次逆转电位差来产生第一极性，从而控制酶与聚合物的结合。在一个优选的实施方式中，所述介质是导电的。在一个更优选的实施方式中，所述介质是一种水溶液。在另一个优选的实施方式中，该方法还包括步骤：测量两个池之间的电流；比较第一次诱发第一极性时所获得的电流值(I₁)与第二次诱发第一极性时所获得的电流值(I₂)；以及确定I₁和I₂之间的差从而获得一个差值dI。在另一个优选的实施方式中，该方法还包括步骤：测量两个池之间的电流；比较第一次诱发第一极性时所获得的电流值(I₁)与在后来的时间所获得的电流值(I₂)，并确定I₁和I₂之间的差从而获得一个差值dI。在一个更优选的实施方式中，所述酶选自由蛋白酶、激酶、磷酸酶、水解酶、氧化还原酶、异构酶、转移酶、甲基化酶、乙酰基转移酶、连接酶和裂解酶所构成的组。在另一个可选择的实施方式中，该方法还包括步骤：提供引发酶活性的试剂；将试剂引入到包含多聚核苷酸复合体的池中；以及在适当的温度下对池进行孵育。在一个更优选的实施方式中，试剂选自由活化剂和辅因子构成的组。在一个仍更优选的实施方式中，所述活化剂在引入辅因子之前被引入到池中。在一个还更进一步优选的实施方式中，所述活化剂选自由ATP、NAD⁺、NADP⁺、二酰甘油、磷脂酰丝氨酸、类二十烷酸、视黄酸、钙化醇、抗坏血酸、神经肽、脑啡肽、内啡肽、4-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺(5-HT)、儿茶酚胺、乙酰辅酶A和S-腺苷甲硫氨酸构成的组。在另一个仍更加优选的实施方式中，辅因子选自由Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、ATP、NAD⁺和NADP⁺构成的组。在另一个更优选的实施方式中，所述聚合物选自由多聚核苷酸、多肽、磷脂、多糖和聚酮化合物构成的组。在一个实施方式中，所述酶和聚合物被引入到相同的池里。在一个可选择的实施方式中，所述酶被引入到不同的池中。

多聚核苷酸

在另一个实施方式中，本发明提供控制酶与部分双链的多聚核苷酸复合体的结合的方法，该方法包括：提供两个独立的、相邻的介质池和两个池之间的界面，该界面具有通道，通道的维度使得每次仅允许一个多聚核苷酸按一个单体接一个单体的方式从一个池到另一个池顺序地通过；提供一种对部分双链的多聚核苷酸复合体具有结合活性的酶；提供一种包括第一多聚核苷酸和第二多聚核苷酸的多聚核苷酸复合体，其中该多聚核苷酸复合体的一部分是双链的，并且其中第一多聚核苷酸还包括与第二多聚核苷酸不相容的结构部分(moiety)；将多聚核苷酸复合体引入到两个池中的一个；将所述酶引入到两个池中的一个；在两个池之间应用一个电位差，从而产生第一极性；第一次逆转电位差，从而产生第二极性；第二次逆转电位差来产生第一极性，从而控制所述酶与所述部分双链的多聚核苷酸复合体的结合。在一个优选的实施方式中，所述介质是导电的。在一个更优选的实施方式中，所述介质是一种水溶液。在一个优选的实施方式中，所述结构部分选自由肽核酸、2'-O-甲基、荧光化合物、衍生化核苷酸和核苷酸异构体构成的组。在另一个优选的实施方式中，该方法还包括步骤：测量两个池之间的电流；比较第一次诱发第一极性时所获得的电流值与第二次诱发第一极性时所获得的电流值。在另一个优选的实施方式中，该方法还包括步骤：测量两个池之间的电流；比较第一次诱发第一极性时所获得的电流值与在后来的时间所获得的电流值。在一个更优选的实施方式中，所述酶选自由DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸内切酶、核酸外切酶、DNA连接酶、DNA酶、尿嘧啶-DNA糖苷酶、激酶、磷酸酶、甲基化酶和乙酰基转移酶构成的组。在另一个可选择的实施方式中，该方法还包括步骤：提供至少一种引发酶活性的试剂；将所述试剂引入包括多聚核苷酸复合体的池中；以及在适当的温度下对该池进行孵育。在一个更优选的实施方式中，所述试剂选自由脱氧核糖核苷酸和辅因子构成的组。在一个仍更优选的实施方式中，脱氧核糖核苷酸在引入辅因子之前被引入池中。在另一个还更优选的实施方式中，辅因子选自由Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、ATP、NAD⁺和NADP⁺构成的组。在一个实施方式中，所述酶和多聚核苷酸被引入到同一池中。在一个可选择的实施方式中，所述酶被引入到不同的池中。

多肽

在另一个实施方式中，本发明提供控制酶与多肽的结合的方法，该方法包括：提供两个独立的、相邻的介质池和两个池之间的界面，该界面具有通道，通道的维度使得每次仅允许一个多肽按一个单体接一个单体的方式从一个池到另一个池顺序地通过；提供一种对多肽具有结合活性的酶；提供一种包括可修饰的氨基酸残基的多肽；将所述多肽引入到两个池中的一个；将所述酶引入到两个池中的一个；在两个池之间应用一个电位差，从而产生第一极性；第一次逆转电位差，从而产生第二极性；第二次逆转电位差来产生所述第一极性，从而控制所述酶与所述多肽的结合。在一个优选的实施方式中，所述介质是导电的。在一个更优选的实施方式中，所述介质是一种水溶液。在一个优选的实施方式中，所述结构部分选自由肽核酸、2'-O-甲基、荧光化合物、衍生化核苷酸和核苷酸异构体构成的组。在另一个优选的实施方式中，该方法还包括步骤：测量两个池之间的电流；比较第一次诱发第一极性时所获得的电流值与第二次诱发第一极性时所获得的电流值。在另一个优选的实施方式中，该方法还包括步骤：测量两个池之间的电流；比较第一次诱发第一极性时所获得的电流值与在后来的时间所获得的电流值。在一个更优选的实施方式中，所述酶选自由DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸内切酶、核酸外切酶、DNA连接酶、DNA酶、尿嘧啶-DNA糖苷酶、激酶、磷酸酶、甲基化酶和乙酰基转移酶构成的组。在另一可选择的实施方式中，该方法还包括步骤：提供至少一种引发酶活性的试剂；将所述试剂引入包括多聚核苷酸复合体的池中；在适当的温度下对该池进行孵育。在一个更优选的实施方式中，所述试剂选自由活化剂和辅因子构成的组。在一个最优选的实施方式中，所述活化剂选自由ATP、NAD⁺、NADP⁺、二酰甘油、磷脂酰丝氨酸、乙酰辅酶A和S-腺苷甲硫氨酸构成的组。在一个仍更优选的实施方式中，所述活化剂在引入辅因子之前被引入到池中。在另一个还更优选的实施方式中，所述辅因子选自由Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、ATP、NAD⁺和NADP⁺构成的组。在一个实施方式中，所述酶和多肽被引入到同一池中。在一个替换的实施方式中，所述酶被引入到不同的池中。

在此公布的本发明提供能够调节混合物中的个体聚合物被另一种化合物如酶起作用的速度的设备和方法。该设备和方法还被用来确定多聚核苷酸的核苷酸碱基序列。本发明在分子生物学、结构生物学、细胞生物学、分子开关、分子电路和分子计算设备及其制造领域有特殊的用途。

在一个可选择的实施方式中，本发明提供控制酶与部分双链的多聚核苷酸复合体的结合的方法，该方法导致鉴定多聚核苷酸的序列，该方法包括步骤：提供两个独立的相邻的包含介质的池，位于两个池之间的界面，该界面具有通道，通道的维度使得每次仅允许一个多聚核苷酸链按照一个单体接一个单体的方式从通道的顺面(cis-side)到通道的反面(trans-side)顺序地通过；提供一种对部分双链的多聚核苷酸复合体具有结合活性的酶；提供至少一种受保护的脱氧核糖核苷酸，该保护包括使用一种保护结构部分；提供一种退火剂；提供一种包括第一多聚核苷酸和第二多聚核苷酸的多聚核苷酸复合体，其中该多聚核苷酸复合体的一部分为双链的，一部分为单链的；将所述多聚核苷酸复合体引入所述两个池中的一个；在两个池之间应用一个电位差，从而产生第一极性，该第一极性促使多聚核苷酸的单链部分经过所述通道移位至所述反面；将所述酶和受保护的脱氧核糖核苷酸引入到同一池内；将退火剂引入到另一个池内；允许退火剂结合到单链的多聚核苷酸；允许所述酶和受保护的脱氧核糖核苷酸结合到所述多聚核苷酸；允许受保护的脱氧核糖核苷酸并入到所述多聚核苷酸中；第一次逆转电位差，从而产生第二极性；允许受保护的脱氧核糖核苷酸释放保护结构部分并变成脱保护的；测量保护结构部分的丰度(abundance)；第二次逆转电位差来产生所述第一极性；重复所述步骤中的任何一个，从而控制所述酶与所述双链的多聚核苷酸复合体的结合并确定多聚核苷酸的序列。在一个优选的实施方式中，所述介质是导电的。在一个更优选的实施方式中，所述介质是一种水介质。在一个优选的实施方式中，所述结构部分选自由肽核酸、2'-O-甲基、荧光化合物、花青苷、绿色荧光蛋白(GFP)、β-葡糖苷酸酶、萤光素酶、Cy3、Cy5、衍生化核苷酸和核苷酸异构体构成的组。在另一个优选的实施方式中，所述酶选自由DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸内切酶、核酸外切酶、DNA连接酶、DNA酶、尿嘧啶-DNA糖苷酶、激酶、磷酸酶、甲基化酶和乙酰基转移酶构成的组。在一个可选择的实施方式中，该方法还包括步骤：测量两个池之间的电流；比较第一次诱发第一极性时所获得的电流值与第二次诱发第一极性时所获得的电流值。在另一个可选择的实施方式中，该方法还包括步骤：测量两个池之间的电流；比较第一次诱发第一极性时所获得的电流值与在后来的时间所获得的电流值。在又一个可选择的实施方式中，该方法还包括步骤：提供至少一种引发酶活性的试剂；将所述试剂引入包括多聚核苷酸复合体的池；以及在一个适合保持酶活性的温度下对该池进行孵育；在一个优选的实施方式中，该试剂为一种辅因子。在一个更优选的实施方式中，所述辅因子选自由Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、ATP、NAD⁺、NADP⁺和S-腺苷甲硫氨酸构成的组。在另一个优选的实施方式中，受保护的脱氧核糖核苷酸包括选自由dATP、dGTP、dTTP、dCTP和dUTP构成的组的脱氧核糖核苷酸。在另一个更优选的实施方式中，所述试剂选自由ddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTP和ddUTP构成的组。在又一个优选实施方式中，至少一个池的水介质包括退火剂。在一个更优选的实施方式中，退火剂选自由互补的寡核苷酸和链酶亲和素构成的组。

本发明还提供感测分子相对于孔的位置的方法，该方法包括：提供两个独立的、相邻的介质池和位于两个池之间的结构，该结构具有一个离子可渗透的孔；提供一种聚离子；提供一种对聚离子具有结合活性的分子；将聚离子引入到两个池中的一个；将所述分子引入到同一池中；在两个池之间应用一个电位差，从而产生第一极性；测量两个池之间的第一电流，从而感测分子相对于所述孔的位置。在一个优选的实施方式中，该分子是一个大分子，其中所述大分子选自由蛋白酶、激酶、磷酸酶、水解酶、氧化还原酶、异构酶、转移酶、甲基化酶、乙酰基转移酶、连接酶、裂解酶、跨膜受体、受体酪氨酸激酶、T-细胞受体、MHC受体和核受体构成的组。在另一个优选的实施方式中，所述介质是导电的。在一个更优选的实施方式中，所述介质是一种水溶液。在另一个优选的实施方式中，该结构还包括一种化合物，其中该化合物选自由硫醇基、硫醚基、磷酸基、硫酸基、氰基、哌啶基、9-芴甲氧羰基、叔丁氧羰基、氮化硅、双官能烷基硫化物和金构成的组。在另一个优选的实施方式中，聚离子选自由多聚核苷酸、多肽、磷脂、多糖和聚酮化合物构成的组。在一个可选择的实施方式中，该方法还包括步骤：第一次逆转电位差，从而产生第二极性；第二次逆转电位差来产生第一极性，测量两个池之间的第二电流，从而进一步感测分子相对于所述孔的位置。在另一个可选择的实施方式中，该方法还包括步骤：测量两个池之间的电流；比较第一次诱发第一极性时所获得的电流值与在后来的时间所获得的电流值。在又一个可选择的实施方式中，该方法还包括步骤：提供引发酶活性的试剂；将所述试剂引入包括多聚核苷酸复合体的池中；并在适当的温度下对该池进行孵育。在一个更优选的实施方式中，所述试剂选自由活化剂和辅因子构成的组。在另一个更优选的实施方式中，所述活化剂在引入辅因子之前被引入到池中。在一个还更优选的实施方式中，所述活化剂选自由ATP、NAD⁺、NADP⁺、二酰甘油、磷脂酰丝氨酸、类二十烷酸、糖基化磷脂酰肌醇、糖磷酸肌醇、脂多糖、视黄酸、钙化醇、抗坏血酸、神经肽、脑啡肽、内啡肽、4-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺(5-HT)、儿茶酚胺、乙酰辅酶A和S-腺苷甲硫氨酸构成的组。在另一个还更优选的实施方式中，所述辅因子选自由Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、ATP、NAD⁺和NADP⁺构成的组。

在一个优选的实施方式中，所述孔或通道包括生物分子，或合成修饰或改变的生物分子。这样的生物分子为，例如，但不限于，离子通道，如a-溶血素、核苷通道、肽通道、糖转运蛋白、突触通道、跨膜受体，如GPCR、受体酪氨酸激酶和类似物、T-细胞受体、MHC受体、核受体，如类固醇激素受体、核孔、或类似物。

在一个可选择的实施方式中，所述化合物包括非-酶生物活性。具有非-酶生物活性的化合物可以是，例如，但不限于，蛋白质、肽、抗体、抗原、核酸、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、吗啉寡聚核苷酸、糖、脂质、糖基化磷脂酰肌醇、糖磷酸肌醇、脂多糖、或类似物。该化合物可以具有抗原活性。该化合物可以具有核酶活性。该化合物可以具有选择性结合性质，借此聚合物在一个特定控制的环境条件下结合到该化合物，但是当环境条件改变时不结合。这种条件可以是，例如，但不限于，[H⁺]的变化、环境温度的变化、严格性的变化、疏水性的变化、亲水性的变化、或类似变化。

在一个实施方式中，大分子包括酶活性。该酶活性可以是，例如，但不限于，蛋白酶、激酶、磷酸酶、水解酶、氧化还原酶、异构酶、转移酶、甲基化酶、乙酰基转移酶、连接酶、裂解酶、及类似物的酶活性。在一个更优选的实施方式中，酶活性可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸内切酶、核酸外切酶、DNA连接酶、DNA酶、尿嘧啶-DNA糖苷酶、激酶、磷酸酶、甲基化酶、乙酰基转移酶、葡萄糖氧化酶、或类似物的酶活性。在一个可选择的实施方式中，大分子可以包括一种以上的酶活性，例如，细胞色素P450酶的酶活性。在另一个可选择的实施方式中，大分子可以包括一种以上类型的酶活性，例如，哺乳动物脂肪酸合酶。在另一个实施方式中，大分子包括核酶活性。

在一个可选择的实施方式中，大分子包括非-酶生物活性。具有非-酶生物活性的大分子可以是，例如，但不限于，蛋白质、肽、抗体、抗原、核酸、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、吗啉寡聚核苷酸、糖、磷脂、脂质、糖基化磷脂酰肌醇、糖磷酸肌醇、脂多糖、或类似物。大分子可以具有多聚核苷酸结合活性和/或多肽生物合成活性，如，但不限于，核糖体或核小体。大分子可以具有抗原活性。大分子可以具有选择性结合性质，借此聚合物在一个特定控制的环境条件下结合到大分子，但是当环境条件改变时不结合。这种条件可以是，例如，但不限于，[H⁺]的变化、环境温度的变化、严格性的变化、疏水性的变化、亲水性的变化、或类似变化。

在另一个实施方式中，本发明提供一种化合物，其中该化合物还包括一个连接体分子，所述连接体分子选自由硫醇基、硫醚基、磷酸基、硫酸基、氰基、哌啶基、9-芴甲氧羰基和叔丁氧羰基构成的组。在另一个实施方式中，所述化合物选自由双官能烷基硫化物和金构成的组。

在一个实施方式中，所述薄膜包括多个孔。在一个实施方式中，所述设备包括多个电极。

提供了单通道薄膜设备、系统，和使用它们的方法。所述设备或系统包括通过电子通信装置连接的顺室和反室。在电子通信装置的顺端是一个用薄膜密封的水平锥形口，所述薄膜包含单一纳米孔或通道。该设备还包括在顺室和反室之间应用电场的装置。该设备在监测通过纳米孔或通道的离子电流的应用中得到使用，其中这些应用包括自然产生的离子通道的表征、聚合化合物的表征，及类似应用。

本发明还提供将单个大分子输送到用户指定的规定纳米级部位的方法。

本发明还提供将单个大分子连接到用户指定的规定纳米级的部位的方法。

本发明还提供使用通过纳米级孔的离子电流来监测单个大分子(或单分子的组合)的功能的方法。

本发明还提供检测至少两种化合物的结合的设备或系统，该设备包括混合信号半导体晶片，至少一个电化学层，该电化学层包括半导体材料，其中半导体材料还包括表面改性剂(surfacemodifier)，其中电化学层界定多个开口(orifices)，所述开口包括室和颈，其中所述开口的室与混合信号半导体晶片的金属镀敷组合物共存(colocalize)，其中所述开口的一部分被金属堵塞，其中该金属与金属镀敷组合物进行电子通信，以及其中所述开口还包含薄膜，所述薄膜在开口的颈部形成溶剂不渗透的密封，所述薄膜还包括孔，所述孔还包括孔口。在一个优选的实施方式中，所述化合物是生物化合物。在一个更优选的实施方式中，所述生物化合物选自由多聚核苷酸、多肽、磷脂、多糖、聚酮化合物、蛋白酶、激酶、磷酸酶、水解酶、氧化还原酶、异构酶、转移酶、甲基化酶、乙酰基转移酶、连接酶和裂解酶构成的组。在另一个优选的实施方式中，所述半导体材料选自由二氧化硅(SiO₂)、氮氧化硅(SiON)、氮化硅(SiN)、金属氧化物和金属硅酸盐组成的组。在一个更优选的实施方式中，所述半导体材料是二氧化硅。在另一个优选的实施方式中，所述表面改性剂是烃。在一个更优选的实施方式中，所述金属镀敷组合物选自由镍、金、铜和铝构成的组。在一个最优选的实施方式中，所述金属是银。在一个优选的实施方式中，薄膜是分子双层。在一个更优选的实施方式中，所述薄膜是磷脂双层。在一个可选择的实施方式中，所述开口的尺寸介于0.5μm和3μm之间。在一个优选的实施方式中，所述开口的尺寸介于1μm和2μm之间。在一个最优选的实施方式中，所述开口的尺寸介于1.25μm和1.5μm之间。在另一个优选的实施方式中，所述孔是生物分子。在一个更优选的实施方式中，所述生物分子选自由离子通道、核苷通道、肽通道、糖转运蛋白、突触通道、跨膜受体和核孔构成的组。在一个最优选的实施方式中，所述生物分子是α-溶血素。在一个优选的实施方式中，所述孔口的尺寸介于大约1nm和10nm之间。在一个更优选的实施方式中，所述孔口的尺寸介于大约1nm和4nm之间。在一个最优选的实施方式中，所述孔口的尺寸介于大约1nm和2nm之间。在一个可选择的最优实施方式中，所述孔口的尺寸介于2nm和4nm之间。

本发明还提供一种能够用来检测并控制分子与聚合物的结合的有限状态机(finitestatemachine)。在一个实施方式中，所述分子是一种蛋白。在一个优选的实施方式中，所述蛋白是一种酶。在一个实施方式中，该有限状态机能够检测具有结构单元的聚合物化合物(polymercompound)，该结构单元抑制聚合物化合物通过纳米孔进行移位。在一个优选的实施方式中，有限状态机能够在纳米孔中检测包含DNA发夹结构的聚合物化合物，并在检测到它之后，但是在对发夹结构或DNA双链体结构进行解链之前，从纳米孔中排出包含DNA发夹结构或DNA双链体结构的化合物。在一个可选择的实施方式中，聚合物化合物包含衍生化核酸。在又一个可选择的实施方式中，聚合物化合物包含肽核酸。

在一个实施方式中，有限状态机能够在大约5Hz和2000Hz之间的速率下控制分子与聚合物的结合。该有限状态机能够在例如大约5Hz、大约10Hz、大约15Hz、大约20Hz、大约25Hz、大约30Hz、大约35Hz、大约40Hz、大约45Hz、大约50Hz、大约55Hz、大约60Hz、大约65Hz、大约70Hz、大约75Hz、大约80Hz、大约85Hz、大约90Hz、大约95Hz、大约100Hz、大约110Hz、大约120Hz、大约125Hz、大约130Hz、大约140Hz、大约150Hz、大约160Hz、大约170Hz、大约175Hz、大约180Hz、大约190Hz、大约200Hz、大约250Hz、大约300Hz、大约350Hz、大约400Hz、大约450Hz、大约500Hz、大约550Hz、大约600Hz、大约700Hz、大约750Hz、大约800Hz、大约850Hz、大约900Hz、大约950Hz、大约1000Hz、大约1125Hz、大约1150Hz、大约1175Hz、大约1200Hz、大约1250Hz、大约1300Hz、大约1350Hz、大约1400Hz、大约1450Hz、大约1500Hz、大约1550Hz、大约1600Hz、大约1700Hz、大约1750Hz、大约1800Hz、大约1850Hz、大约1900Hz、大约950Hz和大约2000Hz下控制分子与聚合物的结合。在一个优选的实施方式中，有限状态机能够在大约25Hz和大约250Hz之间的速率下控制分子与聚合物的结合。在一个更优选的实施方式中，有限状态机能够在大约45Hz和大约120Hz之间的速率下控制分子和聚合物的结合。在一个最优选的实施方式中，有限状态机能够在大约50Hz的速率下控制分子与聚合物的结合。

本发明能够用来测定多聚核苷酸的核苷酸序列。本发明也能够被用来测定酶结合多聚核苷酸的相对亲和力，从而使用本发明来鉴定新的与多聚核苷酸结合的酶化合物。

在一个实施方式中，所述设备或系统包括通过电子通信装置连接的顺室和反室。该顺室和反室被包括至少一个孔或通道的薄膜分离。在一个优选的实施方式中，所述薄膜包括具有疏水域和亲水域的化合物。在一个更优选的实施方式中，所述薄膜包括磷脂。该设备还包括在顺室和反室之间应用电场的装置。该设备还包括检测顺室和反室之间电流的装置。所述孔或通道的形状和大小具有适合聚合物通过的维度。在一个优选的实施方式中，所述孔或通道容纳相当一部分聚合物。在一个仍更优选的实施方式中，所述孔或通道具有生物活性。在另一个优选实施方式中，所述聚合物是多聚核苷酸。

在一个实施方式中，所述薄膜还包括对聚合物具有结合亲和力的化合物。在一个优选的实施方式中，结合亲和力(K_a)为至少10⁶升/摩尔。在一个更优选的实施方式中，K_a为至少10⁸升/摩尔。在仍另一个优选的实施方式中，所述化合物与至少一个孔相邻。在一个更优选的实施方式中，所述化合物包括多肽。

在一个实施方式中，所述化合物包括酶活性。所述酶活性可以是，例如，但不限于，蛋白酶、激酶、磷酸酶、水解酶、氧化还原酶、异构酶、转移酶、甲基化酶、乙酰基转移酶、连接酶、裂解酶，及类似物的酶活性。在一个更优选的实施方式中，所述酶活性可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸内切酶、核酸外切酶、DNA连接酶、DNA酶、尿嘧啶-DNA糖苷酶、激酶、磷酸酶、甲基化酶、乙酰基转移酶，或类似物的酶活性。

在另一个实施方式中，所述孔或通道的大小和形状允许活化剂通过，其中所述活化剂选自由ATP、NAD⁺、NADP⁺和任何其他生物活化剂构成的组。

在又一个优选的实施方式中，所述孔或通道的大小和形状允许辅因子通过，其中所述辅因子选自由Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、ATP、NAD⁺、NADP⁺和任何其他生物辅因子构成的组。

在一个优选的实施方式中，所述孔或通道包括生物分子，或合成修饰或改变的生物分子。这种生物分子为，例如，但不限于，离子通道、核苷通道、肽通道、糖转运蛋白、突触通道、跨膜受体，如GPCR及类似物、核孔或类似物。在一个优选的实施方式中，所述生物分子为α-溶血素。

在一个可选择的实施方式中，所述化合物包括非-酶生物活性。具有非-酶生物活性的所述化合物可以是，例如，但不限于，蛋白质、肽、抗体、抗原、核酸、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、吗啉寡聚核苷酸、糖、脂质、糖磷酸肌醇、脂多糖，或类似物。该化合物可以具有抗原活性。该化合物可以具有选择性结合性质，借此聚合物在一个特定控制的环境条件下结合到该化合物，但是当环境条件改变时不结合。这种条件可以是，例如，但不限于，[H⁺]的变化、环境温度的变化、严格性的变化、疏水性的变化、亲水性的变化，或类似变化。

在又一个实施方式中，本发明提供使用电压反馈控制来控制酶与多聚核苷酸的结合的方法，该方法导致酶重复地被所述多聚核苷酸捕捉并离解，该方法包括步骤：提供两个独立的相邻的包含介质的隔室，位于两个隔室之间的界面，该界面具有通道，通道的维度使得每次仅允许一个多聚核苷酸链按一个单体接一个单体的方式从通道的顺面到通道的反面顺序地通过；提供一种对多聚核苷酸具有结合活性的酶；提供一种受保护的脱氧核糖核苷酸；提供一种多聚核苷酸结合化合物；提供一种多聚核苷酸复合体，其中该多聚核苷酸复合体的一部分是双链的，一部分是单链的；将多聚核苷酸复合体引入到两个室中的一个；在两个室之间应用一个电位差，从而产生第一极性，该第一极性引起多聚核苷酸的单链部分经过通道移位至所述反面；将受保护的脱氧核糖核苷酸引入到同一室中；将所述酶引入到同一室中；允许所述酶结合到所述多聚核苷酸；允许受保护的脱氧核糖核苷酸结合到所述多聚核苷酸；测量经过通道的电流，从而检测酶和受保护的脱氧核糖核苷酸与所述多聚核苷酸的结合；将所述多聚核苷酸结合化合物引入两个室中的另一个；第一次降低电位差，从而产生第二极性；允许所述多聚核苷酸结合化合物结合到单链的多聚核苷酸；逆转电位差，从而产生第三极性；第二次逆转电位差；测量经过通道的电流，从而检测所述多聚核苷酸本身或与所述酶和受保护的脱氧核糖核苷酸结合的所述多聚核苷酸；重复所述步骤中的任何一个，从而控制所述酶与所述多聚核苷酸的结合。在一个优选的实施方式中，该方法还包括步骤：测量两个室之间的电流，比较在第一次诱发第一极性时所获得的电流值与第二次诱发第一极性时所获得的电流值。在另一个优选的实施方式中，该方法还包括步骤：测量两个室之间的电流；比较第一次诱发第一极性时所获得的电流值与在后来的时间所获得的电流值。在一个优选的实施方式中，所述多聚核苷酸结合化合物选自由与多聚核苷酸互补的寡核苷酸、肽核酸、锁核酸、衍生化核苷酸和核苷酸异构体构成的组。在另一个优选的实施方式中，所述酶选自由DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸内切酶、核酸外切酶、DNA连接酶、DNA酶、尿嘧啶-DNA糖苷酶、激酶、磷酸酶、甲基化酶和乙酰基转移酶构成的组。在另一个优选的实施方式中，所述介质是导电的。在另一个优选的实施方式中，所述介质是一种水介质。在另一个优选的实施方式中，受保护的脱氧核糖核苷酸包括选自由dATP、dGTP、TTP、dCTP、UTP和dUTP构成的组的脱氧核糖核苷酸。

该方法还可以包括步骤：提供至少一种引发酶活性的试剂；将所述试剂引入包含多聚核苷酸复合体的室；和在足以维持酶活性的温度下对该室进行孵育。在一个优选的实施方式中，所述试剂是一种辅因子。在一个更优选的实施方式中，所述辅因子选自由Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、ATP、NAD⁺、NADP⁺和S-腺苷甲硫氨酸构成的组。在另一个优选的实施方式中，所述试剂选自由ddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTP和ddUTP构成的组。

在本发明另一个实施方式中，本发明提供使用电压反馈控制来控制酶与多聚核苷酸的结合的方法，该方法导致鉴定多聚核苷酸的序列，该方法包括步骤：提供两个独立的相邻的包含介质的室，位于两个室之间的界面，该界面具有通道，通道的维度使得每次仅允许一个多聚核苷酸链按一个单体接一个单体的方式从通道的顺面到通道的反面顺序地通过；提供一种对多聚核苷酸具有结合活性的酶；提供一种受保护的脱氧核糖核苷酸；提供一种多聚核苷酸结合化合物；提供一种多聚核苷酸复合体，其中该多聚核苷酸复合体的一部分是双链的，一部分是单链的；将多聚核苷酸复合体引入到两个室中的一个；在两个室之间应用一个电位差，从而产生第一极性，该第一极性引起多聚核苷酸的单链部分经过通道移位至所述反面；将受保护的脱氧核糖核苷酸引入到同一室中；将所述酶引入到同一室中；允许所述酶结合到多聚核苷酸；允许受保护的脱氧核糖核苷酸结合到所述多聚核苷酸；测量经过通道的电流，从而检测所述酶和受保护的脱氧核糖核苷酸与多聚核苷酸的结合；将所述多聚核苷酸结合化合物引入到两个室中的另一个；第一次降低电位差，从而产生第二极性；允许多聚核苷酸结合化合物结合到单链的多聚核苷酸；逆转电位差，从而产生第三极性；第二次逆转电位差；测量经过通道的电流，从而检测多聚核苷酸本身或与所述酶和受保护的脱氧核糖核苷酸结合的所述多聚核苷酸；重复所述步骤中的任何一个，从而控制所述酶与所述多聚核苷酸的结合。在一个优选的实施方式中，该方法还包括步骤：测量两个室之间的电流，比较第一次诱发第一极性时所获得的电流值与第二次诱发第一极性时所获得的电流值。在另一个优选的实施方式中，该方法还包括步骤：测量两个室之间的电流；比较第一次诱发第一极性时所获得的电流值与在后来的时间所获得的电流值。在一个优选的实施方式中，所述多聚核苷酸结合化合物选自由与所述多聚核苷酸互补的寡核苷酸、肽核酸、锁核酸、衍生化核苷酸和核苷酸异构体构成的组。在另一个优选的实施方式中，所述酶选自由DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸内切酶、核酸外切酶、DNA连接酶、DNA酶、尿嘧啶-DNA糖苷酶、激酶、磷酸酶、甲基化酶和乙酰基转移酶构成的组。在另一个优选的实施方式中，所述介质是导电的。在另一个优选的实施方式中，所述介质是一种水介质。在另一个优选的实施方式中，受保护的脱氧核糖核苷酸包括选自由dATP、dGTP、TTP、dCTP、UTP和dUTP构成的组的脱氧核糖核苷酸。

该方法可能还包括步骤：提供至少一种引发酶活性的试剂；将所述试剂引入包含多聚核苷酸复合体的室；以及在足以维持酶活性的温度下对该室进行孵育。在一个优选的实施方式中，所述试剂是一种辅因子。在一个更优选的实施方式中，辅因子选自由Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、ATP、NAD⁺、NADP⁺和S-腺苷甲硫氨酸构成的组。在另一个优选的实施方式中，所述试剂选自由ddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTP和ddUTP构成的组。

在一个实施方式中，所述薄膜包括多个孔。在一个实施方式中，所述设备包括多个电极。

附图简述

图1阐释了本发明的一个实施方式，其中，酶与多聚核苷酸的结合被阻断引物(blockingprimer)所阻止。

图2阐释了本发明的一个实施方式，其中，对多聚核苷酸的酶催化活性被阻断引物所阻止。

图3阐释了本发明的一个实施方式，其中，对多聚核苷酸的酶催化活性由通过纳米孔注入Mg²⁺来激活。

图4阐释了本发明的一个实施方式，该实施方式显示了对单一多聚核苷酸分子进行测序的方法。

图5阐释了本发明的一个实施方式，该实施方式显示了对单一多聚核苷酸分子进行测序的可选择方法。

图6阐释了本发明的一个实施方式，该实施方式显示了在规定部位安置单一分子的方法。

图7阐释了本发明的一个实施方式，该实施方式显示了在规定部位安置单一分子的替换方法。

图8阐释了本发明的一个实施方式，该实施方式显示了在规定部位安置单一分子的另一个可选择的方法。

图9阐释了本发明能怎样被制造的一个示例性的实施方式，显示了两阵列单元(twoarrayelements)的侧剖视图。

图10阐释了本发明的顶面透视图(overheadperspective)，显示了本发明四个相邻单元的部分。

图11阐释了公开本发明一个实施方式的系统的流程图。

图12阐释了一个插入到脂质双层的单一α-溶血素蛋白质通道(蘑菇形状)。在应用电位下(反面为正)，K⁺离子流向顺面，Cl-离子流向反面。孔通道的前厅(vestibule)和干道(stem)被显示出来。

图13阐释了纳米孔和DNA(顶部)的视图，以及在180mV应用电位下，在20碱基对发夹结构DNA移位事件过程中代表性的离子电流信号(底部)的曲线图。(I)在180mV下，KCl离子通过开放通道，导致约64pA的电流。(II)一旦将DNA分子的单链端捕获进所述孔的顺开口(cisopening)，离子流降至约20pA。(III)约5毫秒之后，电压对发夹结构进行解链，引起ssDNA通过所述孔进入反室，完成测量封锁事件(measuredblockadedevent)。事件的持续时间被称为驻留时间。

图14阐释了在纳米孔设备中区分DNA、DNA/KF复合体，或DNA/KF/dNTP复合体。(a)行描述了DNA本身经过纳米孔的移位(带有36个核苷酸5'-突出端(overhang)和2'-3'双脱氧胞苷末端的14碱基对发夹结构，模板碱基在n＝0时为C)，同时(b)行和(c)行分别显示了来自具有KF的复合体，或来自具有KF和dGTP的复合体的14碱基对发夹(14bphp)结构的移位。对于每一行，提供了具有相关复合体的纳米孔(I列)、电流跟踪(II列)、和驻留时间事件图(eventplot)(III列)的图解。驻留时间数据的以10为底的对数的概率直方图以实心的方式在列(IV)中显示。仔细检查c、III列中的事件图，揭示了最长驻留时间事件处于22pA到24pA之内。处于22pA到24pA之内的事件的开放条形子集直方图被覆盖在概率直方图(c)之上，揭示了所选择的范围以长驻留时间事件支配。

图15阐释了通过对反面引物进行退火来拴系所捕获的DNA低聚物。a)有限状态机(FSM)监测移位事件的开放通道电流。b)捕获的分子引起电流衰减，FSM基于阈值[15.75,26.75]pA对事件(DNA或DNA/KF/dGTP)进行诊断。c)事件一经诊断，FSM降低应用电压至50mV，并保持20秒，在此期间20mer的引物退火至5'端。该图显示了纳米孔的下半部分被关闭，5'端和20mer的引物位于反室中。

图16阐释了拴系DNA实验中离子电流信号的时间过程。最初的两秒显示了使5'-端引物在反室中退火的20秒拴系等待期(应用50mV)的末尾。使用t_fish＝5秒的钓鱼时间(fishingtime)，同时显示9个探测事件。第5号探测事件被放大来显示酶结合事件的细节，以及结束步骤和后续的1.13毫秒之后的结束步骤诊断。由于酶结合事件持续约100毫秒，在这个实验中控制逻辑主要处于钓鱼模式(fishingmode)。

图17阐释了对纳米孔内的拴系DNA分子进行钓鱼和探测。a)钓鱼模式，其中t_fish＝0.521秒。b)探测模式，其中FSM应用150mV直到使用阈值[7.5,15.5]pA来诊断DNA本身的事件。在所显示的事件中，DNA本身在瞬态一平息时就被诊断，没有酶结合到DNA，钓鱼模式重新启动。c)钓鱼模式。

图18阐释了对纳米孔内拴系DNA分子进行钓鱼和探测的另一方法。a)钓鱼模式，其中t_fish＝0.521秒。b)探测模式，其中FSM应用150mV直到DNA本身的事件被诊断。在所显示的事件中，酶结合DNA被诊断，FSM继续监测滤波后的振幅。c)使用阈值[7.5,15.5]pA来诊断结束步骤，钓鱼阶段重新启动。d)钓鱼模式。

图19阐释了DNA/KF二元复合体和DNA/KF/dGTP三元复合体经过纳米孔进行移位的建议机制。a)显示了当三元复合体存在时典型的电流跟踪。部分a(i)、a(ii)和a(iii)阐释了针对信号每一部分的系统配置。b)和c)分别显示了14bphp本身的驻留时间事件图和三元复合体事件中存在的结束步骤。两个图中驻留时间的相似性支持结束步骤是KF离解的结果这一看法。d)和e)如b)和c)显示的一样但是是针对20bphp。f)并排显示了仅DNA的事件f(i)和DNA/KF二元事件f(ii)。当和酶-结合事件相比时，注意到在仅有DNA的事件中缺少结束步骤。

图20阐释了FPGA控制下的有代表性的三元复合体事件。a(i)FPGA在检测范围[17.2pA,22.8pA]内诊断酶事件。a(ii)FPGA继续监测电流以确保它保持在检测范围内至少20毫秒。持续超过20毫秒的事件被诊断为DNA/KF/dGTP三元复合体事件。a(iii)在诊断三元复合体时，FPGA逆转电压至-50mV，并保持5毫秒，从所述孔中排出复合体。然后恢复180mV的捕获电压。b)带有FPGA控制(标红色的总共527个事件)和不带FPGA控制(标蓝色的总共155个事件)的24±2.8pA事件的驻留时间概率直方图。

图21阐释了使用FSM控制来调整20碱基对发夹(bphp)结构驻留时间。(I)红色电流信号为5kHz的低通滤波信号，蓝色信号是中值滤波电流，红色电压信号为受控电压。在a)180mV恒定电压、b)驻留时间延长控制和c)驻留时间聚集控制下的典型的事件和相应的电压信号。(II)DNA事件的事件图，显示每一个事件的平均振幅对驻留时间。(III)所有事件(填充条)和处于13pA到18pA范围内的事件子集(开放条)的驻留时间的以10为底的对数概率直方图。

图22阐释了使用单一多聚核苷酸低聚物的重复的KF结合事件。a)在180mV下的捕获发夹结构或与KF结合的发夹结构。b)在50mV，发夹结构被保留在前厅以使反面引物退火(20秒)。c)在-20mV钓鱼(fishfor)KF5秒。d)应用180mV来检查KF的存在。如果酶结合不发生，孔内的裸DNA被立即检测到。否则，FSM等待KF离解，留下发夹结构在前厅内(20pA结束步骤)。在两种情况下，一旦裸DNA存在于孔中，FSM在发夹结构解链之前逆转电压来钓鱼另一个KF(-20mV)。重复步骤c)到d)，直到发夹结构移位。

发明详述

本文件中所公布的实施方式是说明性和示例性的，并不用来限制本发明。在不背离本发明权利要求范围的情况下能够使用其他实施方式和做结构性的改变。

如在此和在所附权利要求所使用的一样，单数形式“一”、“一个”和“该”(”a”,“an”和“the”)包括复数形式的参考物，除非上下文明确规定为其他情况。这样，例如，参考物“一个纳米孔”包括多个这样的纳米孔，参考物“一个信号”是一个或更多信号的参考物及其等同物，以及等等。

所谓“多聚核苷酸”是指DNA或RNA，包括任何自然存在、合成或修饰的核苷酸。核苷酸包括，但是不限于，ATP、dATP、CTP、dCTP、GTP、dGTP、UTP、TTP、dUTP、5-甲基-CTP、5-甲基-dCTP、ITP、dITP、2-氨基-腺苷-TP、2-氨基-脱氧腺苷-TP、2-硫代胸苷(thiothymidine)三磷酸、吡咯并嘧啶三磷酸、2-硫代胞苷(2-thiocytidine)，及以上所有物质的α-硫代三磷酸盐(alphathiotriphosphates)和所有以上碱的2'-O-甲基-核糖核苷酸三磷酸盐(2'-O-methyl-ribonucleotidetriphosphates)。修饰的碱基包括，但是不限于，5-Br-UTP、5-Br-dUTP、5-F-UTP、5-F-dUTP、5-丙炔基dCTP、和5-丙炔基-dUTP。

所谓“转运性质”是指聚合物相对纳米孔移动过程中一种可测量的性质。该转运性质可以是，例如，溶剂、聚合物、聚合物上的标签、其他溶质(例如，离子)的功能，或所述纳米孔和所述溶剂或聚合物之间的相互作用。

“发夹结构”被定义为具有长度为大约6个至大约100个核苷酸的核苷酸序列的寡核苷酸，该核苷酸序列的前半部分至少部分地与它的后半部分互补，从而引起多聚核苷酸折叠到自身上，形成一个二级发夹结构。

“发夹结构前体”被定义为由微处理器复合体处理然后由Dicer酶复合体处理的发夹结构，产生长度大约16至大约24个核苷酸的寡核苷酸。

“同一性”或“相似性”指两个多聚核苷酸序列或两个多肽序列之间的序列相似性，其中同一性为更严格的比较。“百分比同一性”和“％同一性”指在两个或更多个多聚核苷酸序列或两个或更多个多肽序列的比较中发现的序列相似性的百分比。“序列相似性”指两个或更多个多聚核苷酸序列之间的碱基对序列(如任何适当的方法所确定的)的百分比相似性。两个或更多个序列可以具有在从0-100％相似范围内的任何值，或其间的任何整数值。同一性或相似性可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述序列被对齐以达到比较的目的。当被比较序列中的某一个位置被相同的核苷酸碱基或氨基酸所占据，所述分子在那个位置就是相同的。多聚核苷酸序列之间相似性或同一性的程度是多聚核苷酸序列共享的位置上相同或匹配的核苷酸数量的函数。多肽序列同一性的程度是多肽序列共享的位置上相同氨基酸数量的函数。多肽序列的同源性或相似性是多肽序列共享位置上氨基酸的数量的函数。

术语“不相容”指分子的化学性质，其中两个分子或其一部分不能在物理上、化学上或物理和化学上相互作用。例如，包含核苷酸的聚合物的一部分能够与包含核苷酸和另一化学结构部分的聚合物的一部分不相容。所述另一化学结构部分是例如肽核酸、2'-O-甲基、荧光化合物、衍生化核苷酸、核苷酸异构体或类似物。在另一个实施例中，包含氨基酸残基的聚合物的一部分能够与包含氨基酸残基和另一化学结构部分的聚合物的一部分不相容，所述另一化学结构部分是例如硫酸基、磷酸基、乙酰基、氰基、哌啶组、荧光基团、唾液酸基团、甘露糖基团或类似物。

“比对”指多个DNA或氨基酸序列通过纵长比较来对齐，使得共同组分(如核苷酸碱基或氨基酸残基)可以容易地从视觉上确认。共同组分的分数或百分比与序列之间的同源性或同一性有关。比对可以用来鉴定保守域和这些域内部的关联性。比对可以通过本领域熟知的计算机程序如MACVECTOR软件(1999)(Accelrys公司，圣迭戈，加利福尼亚州)的方式来适当地鉴定。

术语“高度严格”或“高度严格的条件”指允许序列高度互补的DNA链进行杂交的条件，其中这些相同的条件排除显著错配的DNA的杂交。能够在严格的条件下与本发明的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸序列可能是，例如，所公开的多聚核苷酸序列的变异体，包括等位基因或剪接变异体，或编码目前公开的多肽的直系同源物或旁系同源物的序列。多聚核苷酸杂交方法被下列参考文献详细公开：Kashima等(1985)Nature(自然)313：402-404，和Sambrook等(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)，第二版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，纽约(“Sambrook”)；及Haymes等，“NucleicAcidHybridization:APracticalApproach(核酸杂交：一种实用的方法)”，IRL出版社，华盛顿特区(1985)，这些参考文献在这里通过引用被并入。

通常，严格性由孵育温度、溶液的离子强度以及杂交和洗涤工序中所使用的变性剂(例如，甲酰胺)的浓度来确定(关于建立和确定严格性的更详细的描述，参见下文)。在不同的严格性条件下两种核酸的杂交程度与它们的相似性的程度相关。因此，例如在一个生物体的基因组内(如旁系同源物的情况)的或来自可执行相似功能的另一生物体(如直系同源物的情况)的不同来源的相似多聚核苷酸序列，可以根据它们与已知的编码肽的序列杂交的能力被分离。为了分离具有与本领域已知的序列的相似性的序列而能够进行多聚核苷酸杂交的条件和方式可以有许多改变，不限于在此明确公开的那些。这样的方法可以被用来分离与已公开的序列具有不同相似性程度的多聚核苷酸序列，例如，与已公开的序列具有60％的同一性、或更优选的大于约70％的同一性、最优选的72％或更大的同一性的序列。

本发明提供了单通道薄膜设备及其使用方法。所述设备包括通过电子通信装置连接的顺室和反室。在电子通信装置的顺端是用包括单一纳米孔或通道的薄膜密封的一个水平的锥形口。该设备还包括在顺室和反室之间应用电场的装置。该设备在其中监测通过纳米孔或通道的离子电流的应用中得到使用，其中这些应用包括自然存在的离子通道的表征、聚合化合物的表征及类似应用。当前的测序方法限制在大约一千碱基的读取长度(read-length)(1000个碱基对鉴定)，但是在此公开的本发明与传统的批量(bulk)测序方法相比时可能具有长得多的读取长度(Metzker(2005)Genomeres.(基因组研究)15:1767-1776；Rhee和Burns(2006)TIBS24:580-586)。

能够被用来执行本发明方法的设备例如在美国专利第5,795,782号、美国专利第6,015,714号、美国专利第6,267,872号、美国专利第6,746,594号、美国专利第6,428,959号和美国专利第6,617,113号中被描述，上述所有专利在此整体通过引用来并入。根据其中公开的实施例和方法可以最佳地理解本发明。

现在可以理解的是，控制混合物中个体聚合物的酶活性开始时间的手段将是一种优势。就是说，缺少这种控制，酶活性的引发(例如通过添加Mg²⁺辅因子到含有酶和DNA的浴中)将立即开始，当在一个时间序列中被纳米孔所捕获时，酶-多聚核苷酸复合体将必要地处于沿着目标链的多个点上。至少五种方法可以被用来克服这些潜在的多重相互作用：

a)微流控(Microfluidics)：诱导酶活性的因子可以仅在酶-多聚核苷酸复合体被所述孔捕获之后被加入。在该多聚核苷酸被处理以后，浴能够被冲洗，一群新的多聚核苷酸目标在缺少诱导因子的情况下被加入。然后重复该周期。

b)蛋白质工程。通过将酶共价连接到孔，有可能使得仅一种酶在系统中并且它将立即靠近所述孔(用来完成这个的一些方法在美国申请序列第10/739,585号中有清楚的描述)。

c)使用仅通过捕获纳米孔中的复合体来释放的试剂在本体相(bulkphase)中阻断酶的活性。这通过图(图1和图2)的实施例进行说明并在此进行描述。

假设溶液中的一个DNA引物-模板对(以大约1μM)，该溶液包含所有需要的dNTP(每个以大约200μM)、Mg²⁺(以大约5mM)，和一种演进性(processive)DNA聚合酶(以大约1μM)。该溶液与应用电压的单一纳米孔(例如，α-溶血素)接触，这样带负电荷的DNA被吸引到所述孔中。每个引物-模板对在(或接近)将被添加到引物链(位置n＝0)的第一个碱基处也被退火至一个序列特异性分子。这个分子可能具有许多结构中的任何结构，但是在早期的试验中将可能是PNA或2'-O-甲基取代的DNA。这个阻断分子要么在引发部位(图1)抑制聚合酶的结合，要么它允许结合但是阻止链合成(图2)。该阻断分子包含一个足够大的环，以致它不能进入纳米孔。这样，当所述链在应用电压下被牵引到所述孔中时，该环被悬在孔开口处。这引发了来自引物模板的阻断物的解链以及阻断的引物离解。聚合酶结合和聚合酶催化链合成可以接下来进行。该方法的要点是仅有被纳米孔捕获的链可以在它将被检查的一瞬间从阻断引物解锁。当优化时，包含1μMDNA引物/模板的100微升容积代表总共6×10¹³个分子中的一个纳米孔-激活分子。

d)通过孔将辅因子从反面输送到顺面(包含酶)。这能够有效限制需要的因子在紧邻所述孔的容积处。一个例子是Mg²⁺。这由图(图3)和本文中描述的实施例来阐释。

该方法的一个例子在图3中进行阐释。对许多DNA和/或RNA修饰酶，包括多聚核苷酸聚合酶来说，Mg²⁺是催化活性的必要辅因子。在这一方面，大于毫摩尔浓度的Mg²⁺被加入反隔室(transcompartment)。顺隔室(ciscompartment)包括催化作用所必需的所有其他试剂、酶和底物(substrate)。顺隔室还包括微量浓度的EDTA(以大约0.1mM)以确保在反面的游离[Mg²⁺]在本体相中有效地为0。由于Mg²⁺在生理条件下是二价阳离子，将多聚核苷酸吸引进纳米孔(反面+)的应用电压将以相反方向驱使Mg²⁺朝向顺隔室。这样，在紧邻孔口的容积(介质区域)中，游离[Mg²⁺]是从反面到顺面经过纳米孔的电压驱动通量减去由0.1mMEDTA络合的Mg²⁺分数和减去从与纳米孔口相邻的容积(介质区域)中扩散出去的Mg²⁺的比率的函数。在总容积中的[Mg²⁺]有效地保持为0并由二价金属的EDTA络合来支配。

e)经过所述孔从反面到包含酶的顺面输送ssDNA模板。这能有效将模板的酶处理限制至在所述孔中被捕获的分子。所有其它模板链通过支撑通道的不渗透层(例如，双层)从酶分离。

与多聚核苷酸相互作用的酶为本领域技术人员所熟知，能够包括但是不限于，DNA聚合酶如选自大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)、噬菌体T7DNA聚合酶、Phi-29DNA聚合酶、水生栖热菌(Thermusaquaticus，Taq)DNA聚合酶、栖热菌(Thermusflavus，Tfl)DNA聚合酶、嗜热栖热菌(ThermusThermophilus，Tth)DNA聚合酶、栖热球菌(Thermococcuslitoralis，TIi)DNA聚合酶、嗜热古细菌(Pyrococcusfuriosus，Pfu)DNA聚合酶、VENTDNA聚合酶、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus，Bst)DNA聚合酶、AMV反转录酶、MMLV反转录酶和HIV-1反转录酶的DNA聚合酶，RNA聚合酶如选自T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶的RNA聚合酶，以及核酸外切酶如核酸外切酶λ、T7核酸外切酶、ExoIII、RecJ₁核酸外切酶、ExoI和ExoT。

根据合成的纳米孔-耦合测序

这是一种对单一DNA分子进行测序的技术。它结合了传统的合成测序(SBS)与电子和生物化学反馈控制下的单一DNA分子的新型纳米孔分析的特征。其依赖于3’终止物技术，具体而言是可逆的终止物技术。

用于单一纳米孔的基本策略在图4中列出。我们的实验室已经开发出在超过400,000个孔的芯片上执行这项分析的策略。这样一个芯片的设计和制造在下面公开。

如图4所阐释的，同时带有双链和单链区段的DNA分子在应用电压(反面为正)下被捕获进纳米级孔(步骤a：图4)。这种性质的DNA可以由来自基因组DNA或来自BAC克隆等的限制性片段的定时核酸外切酶消化而产生。纳米孔足够大，以允许ssDNA区段的移位，但是该双链区段不能进行移位，因为它的直径太大了，以致不适合穿过所述孔的最窄部分。α-溶血素孔对这个是理想的，因此用来阐释该技术。链捕获和双链体区段进入孔前厅可以根据电流振幅来证实。一旦这个被实现，在反馈控制下降低电压(步骤b：图4)。在这一点，双链体末端可以由几种技术中的任何一种来检查和鉴定。例如，这个实验室较早的专利证明双链体末端可以仅根据直流电流阻抗被鉴定。同时，通道的反面中ssDNA的5'-端被退火至一种将链无限期地保持在孔中的试剂(例如，一种互补的寡核苷酸或链酶亲和素)。

一旦DNA链被捕获以及末端被鉴定，顺隔室被灌注含有Mg²⁺的缓冲液、DNA聚合酶(例如，DNA聚合酶的Klenow片段(KF))，和四种由不同的可逆的终止物或相同的可逆的终止物保护的dNTP中的每一种(步骤c：图4)。膜电位然后被逆转，由此驱动目标链的双链体末端进入包含聚合酶和底物的顺隔室(步骤c：图4)。然后允许足够的时间以让正确的受保护的dNTP被加入目标物(步骤e：图4)。当该时间过去时，电压再次被逆转(反面为正；步骤f：图4)。双链体末端被拉到接近所述孔的限制口，在那里所加核苷酸的身份被确立。如果没有受保护核苷酸被加入，信号将如步骤b中的一样。如果这是事实，重复步骤d到f直到正确的核苷酸被加入并被鉴定。在确认受保护的核苷酸的加入之后，顺隔室被灌注，并加入一种去保护的缓冲液(步骤g：图4)。可选地，我们预想一种情况，在该情况下，仅仅位于靠近纳米孔的去保护试剂在我们的控制下被激活或钝化，这样将消除灌注的需要。去保护试剂可能是酶(例如，碱性磷酸酶)、光线或溶质(例如，催化脱烯丙基的钯)。在灌注之后，反面的负电位被建立，驱动双链体末端进入顺隔室，在那里可逆的终止物可以被除去(步骤h：图4)。在该反应之后，反面正电位被重新确立，吸引双链体末端回到限制口，在那里它可以被检查以确定去保护是否已经成功实现，并确认最后一个碱基的身份(步骤i：图4)。在去保护不成功的事件中，步骤h和i被重复。如果去保护成功，循环在步骤b处重复。

图5中所阐释的情况与图4所阐释的情况相似，除了核酸外切酶消化在通道的反面发生及与图4相比，DNA在相反的方向被捕获。在该策略中，模板链通过引物固定在顺面上的位置中，其中链合成起源于该引物。该情况的优势是送入纳米孔的ssDNA可以由反隔室中一系列的定时核酸外切酶消化在阻断物(blocks)中产生。这样，大多数的模板将作为双链DNA(dsDNA)。例如，如果核酸外切酶以10毫秒每碱基(平均)切割，1000个碱基的突出端可以在20kbdsDNA目标物的末尾产生。当大约1000个碱基被纳米孔-耦合的合成测序(SBS)成功装入时，核酸外切酶(或需要的辅因子)可以被重新添加到反隔室中，并被允许重新反应额外的10秒钟。新产生的ssDNA将和以前一样以一个碱基接一个碱基的方式被装入顺隔室。这将以大约两轮1000个碱基进行重复以完成20kb片段。

孔口可以在大小上变化，例如，它可以具有尺寸介于大约0.5nm和10nm之间的直径。例如，该直径可以是大约0.5nm、1nm、1.25nm、1.5nm、1.75nm、2nm、2.25nm、2.5nm、2.75nm、3nm、3.5nm、4nm、4.5nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm或它们之间的任何尺寸。

合成纳米孔-耦合测序具有与常规SBS相比的几个优势，但是主要的优势是以下这些：

1)核苷酸的添加和可逆终止物的去除可以在个体目标链上直接测量。

2)该系统同时进行电子和生物化学控制，因此核苷酸的添加和去保护步骤可以快速重复，直到它们是成功的。

3)非常长的DNA分子能够被捕获、操控，并无限期地被定量保留在所述孔中。

4)所使用的试剂量可以非常小(大约100微升)，有可能给定的量可以再循环数百次。随着进一步发展，有可能控制纳米孔开口处去保护步骤的激活和钝化。这将完全消除灌注的需要。

如在常规SBS中一样，这种分析可以并行执行。我们预想在可以使用常规的平版印刷术来制造的1厘米x1厘米的芯片上多达400,000个可独立寻址的孔(参见以下单独的公开)。

这里我们提出了可以用来在纳米孔口处放置和连接大分子和其他聚阴离子/聚阳离子的多聚核苷酸。这样的大分子和聚合物可以是，例如，多聚核苷酸结合蛋白，如，但是不限于纳米孔开口处的多聚核苷酸聚合酶。纳米孔具有将几乎任何想要的大分子结构带到由用户指定的规定部位的有用性质。在被放置在纳米孔部位之后，大分子的功能可以被用户以多种方式监测。这个方法可以应用于大分子，如，但是不限于，酶、受体蛋白、核酶和核糖体。该方法可以应用于生物孔，或在薄的无机膜上产生的固态孔。

本发明的基础是，电离聚合物的足够长的链可以被连接到想要的大分子，不管是通过共价或非共价的键。然后，聚合物通过跨膜应用的电压而被吸引穿过纳米孔。在一些应用中，通过改变贯穿孔起作用的电压来调整作用在大分子上的力是必需的。结果，所述大分子被放置在亚纳米精度的孔部位。然后大分子要么被跨膜电压所产生的电动力，或者被设计在大分子和孔或临近孔的表面之间的共价键维持在孔部位。如果需要，多于一个的大分子可以被连接成串。

单一大分子的功能然后可以通过孔上产生的电效应来监测。比如，经过孔的离子电流可以被测量，分子功能可以被检测为电流的调制。可选地，电极如碳纳米管被跨孔放置，分子功能由经过纳米管的电流的调制来检测。

本发明的示例性用途

(1)一种可以用来监测酶如核酸外切酶和聚合酶的周转量的纳米孔设备，其在DNA测序中具有重要应用。

(2)一种纳米孔设备，其可以发挥生物传感器的功能来监测可溶物质如酶底物或信号分子之间的相互作用。实施例包括血液组分如葡萄糖、尿酸和尿素，激素如类固醇和细胞因子，和通过结合到受体分子来发挥它们的功能的药剂。

(3)一种纳米孔设备，其可以实时监测重要生物结构如核糖体功能，并使用单个功能单元来执行这项操作。

图6到8阐释本发明的示例性实施方式。

图6

图6A阐释了基质或结构(2)中包括孔口(1)的纳米孔设备，该基质或结构(2)具有结合到孔口附近的化合物(3)；基质或结构界定顺面和反面。图6A还显示了结合到聚合物(5)以产生大分子/聚合物复合体的分子或大分子(4)，该聚合物还包括不完全合成的部分(6)。

如图6B所阐释的，电压梯度被应用到设备上来将大分子/聚合物复合体吸引到所述基质或结构的顺面。不完全合成部分(6)具有足以通过孔口的尺寸。还阐释了存在于顺面的单体(7)。大分子/聚合物复合体位置的变化可以由穿过孔口的电流的变化(箭头；δI)来测量。然后大分子将单体引入到聚合物中来产生如图6C所显示的完全合成的聚合物(8)。

然后电压梯度被逆转，如图6C所阐释的，完全合成的聚合物被从大分子释放，从而进一步引起电流的变化(δI)。这可通过使用DNA聚合酶作为大分子来例示。

在可选择的实施方式中，如图6D中所阐释的，大分子从聚合物中切除不完全合成的部分，从而从大分子/聚合物复合体中释放不完全合成的部分(6)。然后电压梯度被逆转，聚合物(5)被从大分子释放。这些事件也可以通过电流的变化(箭头；δI)来测量。这个可能通过使用核酸内切酶作为大分子来例示。

图7

图7A阐释了基质或结构(2)中包括孔口(1)的纳米孔设备，该基质或结构(2)具有结合到孔口附近的化合物(3)；所述基质或结构界定了顺面和反面。图7A还显示了结合到聚合物(5)以产生大分子/聚合物复合体的分子或大分子(4)，所述大分子还包括针对配体(10)的高亲和力结合部位(9)，图7B。

如图7B所阐释的，电压梯度被应用到设备上来将大分子/聚合物复合体吸引到所述基质或结构的顺面。然后聚合物(5)共价结合到化合物(3)，从而引起靠近孔口(1)。大分子/聚合物复合体位置的变化可以由穿过孔口的电流的变化(箭头；δI)来测量。

然后配体(10)被允许结合到高亲和力结合部位(9)，如图7C中所阐释的，从而进一步引起电流的变化(箭头；δI)。这可以通过使用类固醇激素受体作为大分子及聚天冬氨酸作为聚合物来例示。

在可选择的实施方式中，如图7D中所阐释的，大分子将配体代谢成两种产物(11)，借此从大分子/聚合物复合体中释放该产物。然后电压梯度被逆转，产物被从大分子释放。这些事件也能通过电流的变化(δI)来测量。这可以通过使用葡萄糖氧化酶或蛋白磷酸酶作为大分子来例示。

图8

图8A阐释了基质或结构(2)中包括孔口(1)的纳米孔设备，该基质或结构(2)具有结合到孔口附近的化合物(3)；所述基质或结构界定顺面和反面。图8A还显示了结合到第一聚合物(5)以产生大分子/聚合物复合体的分子或大分子(4)。

如图8B所阐释的，电压梯度被应用到设备上来将大分子/聚合物复合体吸引到基质或结构的顺面。还阐释了存在于顺面的第二聚合物(12)和存在于反面的单体(7)。在可选择的实施方式中，单体(7)可以在顺面(未显示)。然后聚合物(5)共价结合到化合物(3)，从而引起靠近孔口(1)。大分子/聚合物复合体位置的变化可以由穿过孔口的电流的变化(箭头；δI)来测量。

如图8C所阐释的，第二聚合物(12)结合到大分子(4)并通过所述口被电位差吸引到反面。由于第二聚合物被吸引走，大分子使用单体(7)来协同合成第三聚合物(13)，从而进一步引起穿过孔口的电流的变化(见图8D)。在可选择的实施方式中，第三聚合物(13)能够在顺面合成(未显示)。这些事件也能通过电流的变化(δI)来测量。这可以通过使用核糖体作为大分子及信使RNA作为第一聚合物来例示。在可选择的实施方式中，核糖体可能被用作大分子及聚天冬氨酸用作第三聚合物。

单一通道薄膜设备的制造

提供了单一通道薄膜设备和使用该设备的方法。所述设备包括混合信号半导体晶片，至少一个电化学层，该电化学层包括半导体材料，如二氧化硅或类似物，其中半导体材料还包括表面改性剂，如烃，其中电化学层界定多个开口，这些开口包括室和颈，其中这些开口的室与混合信号半导体晶片的第一金属组合物共存，其中开口的一部分被第二金属如银堵塞，其中第二金属与第一金属成份进行电子通信，其中开口还包含薄膜，如磷脂双层，薄膜在开口的颈部形成溶剂不渗透的密封，薄膜还包含孔，其中开口包封水相和气相。在一个优选的实施方式中，金属镀敷层包括金属，或金属合金，如，但不限于，镍、金、铜和铝。

图9阐释了本发明的侧剖视图。

图10阐释了本发明的顶面透视图，显示了本发明四个相邻单元的部分。

图11阐释了一个流程图，该流程图公开了在制造中使用本发明的方法。

生物纳米孔在多聚核苷酸的测序中有用，但是，由于所使用的低电流(大约在数十皮安(picoamp))，使用单一纳米孔测序设备的高通量进行的检测可能被限制到大约1000个碱基对每秒。制造可互相独立操作的生物纳米孔的阵列，如在超大集成电路的阵列的制造中所使用的，超大规模的纳米孔阵列在单一的一秒内可执行数百万次的生物化学反应和分析。

阵列单元可以通过步进并列的方式来制造，类似于集成电路上晶体管的制造。每个阵列单元所有或大部分的相似层在一系列单一工艺步骤中产生，这些步骤同时在所有或大部分阵列单元中发生。

似乎没有使生物试剂的独立分子的活性同步化的简单方法，因此阵列中的每一个单元应当能够互相独立运行。这可以通过在每个单一生物纳米孔里包含一个数字逻辑电路来实现，其实现一个控制并感测与该生物纳米孔关联的单(或多)分子复合体的生物化学状态的有限状态机。有限状态机允许对与生物纳米孔关联的分子复合体的低延时控制，同时能够存储为在其他时间进行检索(retrieval)而收集的信息。

为了使数十万的生物纳米孔单元的每一个可以使用最少量的电线连接来互相通信，串行接口和可寻址逻辑能够被用来对进入和离开阵列的大量数据进行多重发讯(见图11中的流程图)。

图9阐释了所制造阵列的图解。在此公开了示例性的制造方法。包括将被使用的模拟和数字电路的一个市售混合信号半导体晶片(15)用来当作基层(baselayer)。电化学层(16)然后可以被覆盖。金属(19)，例如银，被沉积在暴露的金属镀敷层(18)上来为纳米孔系统同时产生所有或大部分的电极。如本领域技术人员所熟知的那样，氧化物(2)生长至足以包封一定容量的厚度，该容量等于将占据电极上方区域的液体容量。氧化物的表面经过化学改性(16，3)以允许对开口进行湿润并提高脂质双层(薄膜，20)的密封阻力(sealresistance)。少量气体(21)，例如，氮气，被捕集在与未经过化学改性电极相邻的区域。气体被捕集是因为未经过化学改性的氧化物排斥水(或水溶液)。被捕集的气体(21)能够被用来应用吸力到双层(20)中的任何一个上，通过从底层电子电路除去受控加热。金属镀敷层和金属的高导热性将控制热量从电子电路传递到被捕集的气体。

脂质层，包括经过化学改性的氧化物上面的单层(22)和跨越开口(17)的双层，通过将经过化学改性的晶片压在聚四氟乙烯(TEFLON)膜上来进行应用，该聚四氟乙烯膜的一个表面已被涂上脂质。这能够在存在于室或孔(24)的液体或水溶液(23)的内部发生。如图9A、9B和9C所显示的，移除重叠的TEFLON膜留下覆盖第一溶液(23)的脂质层(20，22)。

值得注意的是，按照以上所列举的方法和程序，不是所有阵列单元都可以具有薄膜或跨越它们各自开口的双层。出现在开口中的脂质的电容，如由有限状态机所测量的，能够被用来检测非功能阵列单元的出现。如果接下来确定，与优选的比例相比时，缺少薄膜或双层的阵列单元的比例较大，那么覆盖TEFLON膜和脂质涂层的步骤能够被重复。

如图9A所显示的，第二溶液(25)，可以包括稳定任何所使用的生物化学试剂的pH值的缓冲液和包括介于大约0.1M和大约5M之间的KCl和其他适当的盐的支持电解质。第二溶液(25)作为一滴未被打破的液体覆盖阵列单元。一个电极，例如一个接地宏观AgCl电极，被放置成与第二溶液(25)接触。当双层被安置在跨越所有功能性开口的地方时，将没有离子电流从第二溶液(25)流向第一溶液(23)。预定量的孔分子或通道分子(14)，例如，α-溶血素毒素，被加入第二溶液(25)。孔分子或通道分子(14)的浓度足够在大约例如15分钟内在任何薄膜或双层中形成单一通道。形成这样的通道的时间可以例如介于半分钟和一小时之间，例如，大约半分钟、一分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、7分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟，或它们之间的任何时间。形成时间可以被操作人员通过几个因子或参数改变，例如，提高或降低环境或孵育温度，提高或降低第二溶液(25)或第一溶液(23)中盐的浓度，在第一溶液和第二溶液之间设置电位差，该电位差将孔或通道分子吸引着朝向薄膜或双层，或其他本领域技术人员所熟知的方法。有限状态机能够检测和/或感测单一通道在其相应的双层中的形成，通过对经过电路的电流(离子)的流动做出反应，电路包括宏观电极、第二溶液、单纳米孔或通道分子、第一溶液和用于任何给定阵列单元的金属(19)电极。

生物通道的形成是一个随机过程。一旦单一通道在给定的阵列单元双层中形成，降低或优选消除在所述阵列单元双层中这样形成第二通道的机会是首选的。第二通道插入的概率能够通过应用电位调制，即，穿越双层的电位差。在感测单一通道时，有限状态机调节金属电极上的电位来降低第二通道插入同一双层的概率。

尽管在先前步骤中采取了预防措施，第二通道还是可能在给定的双层里形成。有限状态机能够检测第二通道的形成。来自开口下面氮气的吸力脉冲可迫使一个或更多通道从双层里出来。一个加热单元能够被包括在靠近气体处，该加热单元用来加热气体从而使气体在受控制的条件下膨胀。一个精确控制的低压脉冲能够迫使两个通道中的一个出来，从而允许单一通道保持嵌入在双层中。有限状态机能够通过钝化加热单元从双层除去一个或更多通道，这将导致气体的收缩并将吸力应用到双层。

在使用生物纳米孔进行生物化学激活和检测的过程中，所述孔可能变得永久性地被堵塞。有限状态机能够检测并感测这种堵塞状态，并通过钝化加热单元从而在双层上应用吸力(减小的压力)来从双层移除被阻断的通道。

在一个可选择的实施方式中，每个阵列单元可能包括环绕所述开口的金电极(26)。该金电极可以使用还原或氧化反应激活化学试剂，并且能够在特定开口的位置特定地起作用。图10例如阐释了四阵列单元的部分的俯视图，图显示了本发明的一些组分和单元的大致间距和安排、开口(17)、可选的金电极(26)以及基质或结构(2)。

有限状态机可以使用现有技术的可市购的65nm工艺技术建造，例如从台湾的台湾半导体制造公司获得)。一个600×600的纳米孔阵列能够以1000Hz的速度执行360,000个生物化学反应和检测/感测步骤。这可以让多聚核苷酸的测序变得可行，例如，以每秒每1cm×1cm的从半导体晶片上切下来的印模3.6亿个碱基的速率行进。

在顺室和反室之间应用电场的示例性装置是，例如，包括连接到电压源的沉浸阳极和沉浸阴极的电极。这样的电极能够由例如氯化银或任何其他具有相似物理和/或化学性质的化合物制造。

检测

纳米孔口的依赖于时间的转运性质可以通过任何适当的技术来测量。该转运性质可以是用来转运多聚核苷酸的介质、液体中的溶质(例如，离子)、多聚核苷酸(例如，单体的化学结构)或多聚核苷酸上的标记的函数。示例性转运性质包括电流、电导、电阻、电容、电荷、浓度、光学性质(例如，荧光和拉曼散射)和化学结构。合乎需要地，转运性质为电流。

用来检测顺室和反室之间电流的示例性装置已经在WO00/79257、美国专利第6,46,594号、第6,6736,673,615号、第6,627,067号、第6,464,842号、6,362,002号、第6,267,872号、第6,015,714号和第5,795,782号和美国公布第2004/0121525号、第2003/0104428号和第2003/0104428号中描述，并且能够包括但不限于，在孔口或靠近孔口处与通道或孔直接关联的电极、放置在顺室和反室内部的电极和绝缘玻璃微电极。这些电极能够，但不限于，检测通过两个室的离子电流差或通过孔口或通道口的电子隧道电流。在另一个实施方式中，转运性质是穿过所述口的直径的电子流，该电子流可以由设置在接近或毗邻纳米孔圆周的电极来监测。这样的电极可以连接到Axopatch200B放大器来放大信号。

在此公开的本发明的应用和/或使用可以包括，但不限于以下：

1.如mRNA、rRNA和tRNA所指示的相对或绝对基因表达水平的测定。这包括自然的、突变的和致病的核酸和多聚核苷酸。

2.等位基因表达的测定。

3.染色体内部多种SNP的Haplotype测定和定相。

4.DNA甲基化状态的测定。

5.mRNA交替剪接的测定及剪接变异体水平的测定。

6.RNA转运测定。

7.mRNA、rRNA和DNA中的蛋白质-核酸复合体的测定。

8.通过DNA、rRNA和mRNA测定食物和环境样本中微生物或病毒内容物的存在。

9.通过DNA、rRNA和mRNA鉴定食物和环境样本中微生物或病毒内容物。

10.通过植物、人、微生物和动物中的DNA、rRNA或mRNA鉴定病理。

11.医疗诊断中核酸的测定。

12.定量核流失测定。

13.DNA和RNA水平上的基因重组测定，包括，但不限于，在免疫反应中所发现的那些。

14.微生物、病毒和线粒体中基因转移的测定。

15.基因演化的测定。

16.法医测定。

针对使用有限状态机的自适应结束步骤检测的滤波导数(filteredderivative)

使用DNA本身和使用DNA、DNA聚合酶的Klenow片段及互补dNTP的恒定电压实验可以被用来确定用来检测结束步骤的阈值，就是说，KF/dNTP从DNA的离解。除滤波振幅之外，离子电流振幅的滤波导数，可以被用来检测结束步骤。实际上，如在此所公布的，滤波振幅被阈值化，监测滤波导数高于设定阈值的偏离。使用指数加权平均滤波器的初步分析显示，应用到滤波振幅的滤波导数，在结束步骤存在下偏离一个数量级。使用滤波振幅和滤波导数的实验被执行，调节导数滤波器和偏离阈值来确保KF离解的鲁棒检测。

导数的偏离可以使用公共(最小)偏离阈值来监测，以监测结束步骤水平的偏离，原则上，监测任何实时的应用电压。在该方法中，试验了仅使用滤波导数而不对滤波振幅进行阈值判断的结束步骤检测。仅使用滤波导数的鲁棒检测可以提高电压范围，该电压能用来探测用来结合KF的DNA，不需要为每一个探测电压鉴定滤波电流振幅范围。除了监测滤波导数的偏离，不使用预设阈值来监测滤波振幅的相对振幅变化的逻辑被开发出来。目标是更自适应的离子电流滤波逻辑，能够为宽范围的电压(可能变化)鲁棒地检测KF离解，使用滤波振幅和/或滤波导数，不需要依赖当前的振幅阈值。

与其他多聚核苷酸同源的多聚核苷酸可能通过在严格或在高度严格的条件下的互相杂交被鉴定。单链多聚核苷酸在它们关联的时候杂交，其关联基于多种良好表征的物理-化学力，如氢键、溶剂排斥、碱基堆积及类似力。杂交的严格性反映了所涉及核酸的序列同一性的程度，以致于严格性越高，两个多聚核苷酸链就越相似。严格性被多种因素所影响，包括存在于杂交和清洗溶液和孵育中的温度、盐浓度和组成、有机和非有机添加剂，溶剂等(及其数量)，如上面所引用的参考文献中有更详细的描述。

DNA双链体的稳定性被这样的因素所影响，如碱基组成、长度和碱基对不匹配程度。杂交条件可以被调整到允许不同序列关联性的DNA杂交。解链温度(T_m)被定义为当双链体分子的50％离解为它们的组成单链时的温度。杂交缓冲液含有甲酰胺作为变性剂时完全匹配的双链体的解链温度可以通过下述方程来估计：

(I)DNA-DNA:T_m,(℃)＝81.5+16.6(log[Na⁺])+0.41(％G+C)-0.62(％甲酰胺)-500/L

(II)DNA-RNA:T_m,(℃)＝79.8+18.5(log[Na⁺])+0.58(％G+C)+-0.12(％G+C)²-0.5(％甲酰胺)-820/L

(III)RNA-RNA:T_m(℃)＝79.8+18.5(log[Na⁺])+0.58(％G+C)+0.12(％G+C)²-0.35(％甲酰胺)-820/L

其中L为所形成的双链体的长度，[Na⁺]为杂交或清洗溶液中钠离子的摩尔浓度，％G+C是杂交体中(鸟嘌呤+胞嘧啶)碱基的百分比。对不完全匹配的杂交体，每1％不匹配需要降低解链温度大约1℃。

杂交实验通常在pH值介于6.8到7.4的缓冲液中进行，尽管在可能在杂交缓冲液里使用的离子强度下杂交率几乎独立于pH(Anderson和Young(1985)“QuantitativeFilterHybridisation(定量滤膜杂交)”Hames和Higgins等编辑，NucleicAcidHybridisation:APracticalApproach(核酸杂交：一种实用的方法)，牛津，IRL出版社，73-111)。此外，以下的一个或更多可被用来降低非特异性杂交：超声处理的鲑鱼精子DNA或另一非互补的DNA、牛血清白蛋白、焦磷酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖和登哈特溶液(Denhardt’ssolution)。硫酸葡聚糖和聚二乙醇6000作用以从溶液中排除DNA，由此在给定的时间单位内提升有效探针DNA浓度和杂交信号。在一些情况中，为降低非特异和/或背景杂交，甚至更加严格的条件是可取的或必要的。这些条件可通过使用更高的温度，更低的离子浓度和更高的变性剂如甲酰胺浓度来创建。

严格性条件能够被调整来筛选适度相似的片段如来自远亲生物体的同源序列，或筛选高度相似的片段如来自近亲生物体的复制功能酶的基因。严格性能在杂交步骤期间或在杂交后清洗中被调整。盐(例如，NaCl)浓度、甲酰胺浓度、杂交温度和探针长度是能够用来改变严格性的变量(如上面的公式所描述的)。作为一般的准则，对多于150个碱基对的双链体，高度严格性典型地是在T_m-5℃至T_m-20℃下执行，中度严格性在T_m-20℃至T_m-35℃以及低度严格性在T_m-35℃至T_m-50℃。杂交可以在低到中度严格性(T_m以下25-50℃)下执行，随后是增加的严格性下的杂交后清洗。溶液中最高的杂交率由经验确定，对DNA-DNA双链体在T_m-25℃下发生，对RNA-DNA双链体，在T_m-15℃下发生。可选地，离解的程度可在每个清洗步骤之后被评估以确定后续的、更高严格性的清洗步骤的需要。

高度严格性条件可以用来选择与已公开的序列具有高度同一性的多聚核苷酸序列。在具有超过100个互补残基的互补核酸杂交的基于滤膜的方法如Southern或northern印迹中得到的严格的杂交条件的例子是低于在规定离子强度和pH下特定序列热解链温度(T_m)大约5℃到20℃。在杂交温度介于大约50℃和大约70℃之间时，用于杂交的条件可包括大约0.02M至大约0.15M的氯化钠，大约0.5％至大约5％的酪蛋白,大约0.02％的SDS或大约0.1％的N-十二烷基肌氨酸,大约0.001M至大约0.03M的柠檬酸钠。更优选地，在温度大约50℃时，高度严格性条件为大约0.02M的氯化钠，大约0.5％的酪蛋白，大约0.02％的SDS，大约0.001M的柠檬酸钠。在严格的条件下杂交的多聚核苷酸分子通常会杂交于探针的整个DNA分子或该DNA的选择部分，例如独特的序列。

严格的盐浓度将通常小于大约750mM的NaCl和75mM的柠檬酸三钠。进一步严格的条件可以通过小于大约500mM的氯化钠和50mM的柠檬酸三钠得到，甚至更高的严格性通过小于大约250mM的NaCl和25mM的柠檬酸三钠得到。低度严格性杂交可以在缺少有机溶剂如甲酰胺的情况下得到，然而高度严格性杂交可以在至少大约35％甲酰胺，更优选地，至少大约50％的甲酰胺的存在下得到。在甲酰胺存在的情况下，严格的温度条件将通常包含至少大约30℃的温度，更优选，至少大约37℃的温度，最优选至少大约42℃的温度。不同的附加参数，如杂交时间，洗涤剂浓度，例如，十二烷基硫酸钠(SDS)和离子强度，为本领域技术人员所熟知。不同水平的严格性通过根据需要结合这些不同的条件实现。

紧随杂交的清洗步骤也能在严格性上变化；杂交后清洗步骤主要决定杂交特异性，最关键的因素为温度和最终清洗溶液的离子强度。清洗严格性能够通过降低盐浓度或通过增加清洗温度来增加。优选地，清洗步骤严格的盐浓度将小于大约30mM的NaCl和3mM的柠檬酸三钠，最优选地，小于大约15mM的NaCl和1.5mM的柠檬酸三钠。

这样，可以用来结合和除去与编码该转录因子的多聚核苷酸序列或它们的互补物的同源性低于所需同源性的多聚核苷酸的杂交和清洗条件包括，例如，

65℃下的6×SSC

42℃下50％甲酰胺，4×SSC；或

65℃下0.5×SSC，0.1％的SDS；

具有例如两个清洗步骤每个10-30分钟。这些条件的有用变动对本领域技术人员将是显而易见的。

本领域技术人员将不会预计本发明范围内所包含的多聚核苷酸种类的大的变动，因为在上式中所阐述的高度严格的条件产生结构相似的多聚核苷酸。

如果需要，可以利用甚至更高严格性的清洗步骤，包括65℃下大约0.2×SSC，0.1％的SDS和清洗两次，每个清洗步骤为大约30分钟，或65℃下大约0.1×SSC，0.1％的SDS和清洗两次30分钟。清洗溶液的温度通常为至少大约25℃，对更强的严格性为至少大约42℃。杂交严格性可以通过使用如杂交步骤中同样的条件来进一步增加，其中清洗温度提升大约3℃至大约5℃，严格性可以通过使用同样的条件来更进一步增加，除了清洗温度被提升至大约6℃至大约9℃。对亲缘关系较远的同系物的鉴定，清洗步骤可以在更低的温度下执行，例如，50℃。

一个低度严格性清洗步骤的例子利用至少25℃、30mM的NaCl、3mM的柠檬酸三钠和0.1％的SDS的溶液和条件，超过30分钟。更高的严格性可以在42℃下，在带有1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS的15mMNaCl中，超过30分钟来得到。甚至更高的严格性清洗条件在65℃至68℃下，在15mMNaCl、1.5mM柠檬酸三钠、和0.1％SDS的溶液中得到。清洗程序将通常利用至少两个最终清洗步骤。关于这些条件的额外变动对本领域技术人员是明显的(例如，美国专利申请第20010010913号)。

严格性条件能够被选择使得与编码寡核苷酸完全互补的寡核苷酸杂交至该编码寡核苷酸，具有比完全互补寡核苷酸与本申请的申请日时已知的编码转录因子的多聚核苷酸的杂交比要高至少大约5-10倍的信噪比。为特定的分析选择条件是可取的，以获得更高的信噪比，就是说，大约15倍或更高。相应地，所述核苷酸将杂交至独特的编码寡核苷酸，与编码寡核苷酸与编码已知多肽的多聚核苷酸的杂交相比，其信噪比至少为2倍或更高。特定的信号将依赖有关分析中所使用的标记，例如，荧光标记、比色标记、放射性标记或类似标记。用来检测相关多聚核苷酸序列的被标记的杂交或PCR探针可以通过寡核苷酸标记(oligolabeling)、切口平移、末端标记或使用被标记的核苷酸的PCR扩增来产生。

本发明包括多聚核苷酸序列，该序列能够在各种严格性条件下(例如，Wahl和Berger(1987)，MethodsEnzymol.(方法酶学)，152:399-407，及Kimmel(1987)，MethodsEnzymol.(方法酶学)，152:507-511)杂交到多聚核苷酸及其片段上。同源性的估计通过在如本领域技术人员所熟知的严格性条件下的DNA-DNA杂交或DNA-RNA杂交来提供(Hames和Higgins,编辑(1985)NucleicAcidHybridisation:APracticalApproach(核酸杂交:一种实用的方法),IRL出版社,牛津,英国)。严格性条件能够被调整来筛选适度相似的片段，如来自远亲生物体的同源序列，高度类似的片段、如来自近亲生物体复制功能酶的基因。杂交后清洗决定严格性条件。

本发明的表征和用途

测序

在一个实施方式中，本发明可用来执行多聚核苷酸的序列分析。该分析较现有技术和当前技术有一个优势在于单个分析可以在单个部位执行，从而导致可观的试剂、底物、报道分子和类似物的成本节约。另外的意义为测序反应和信号产生的快速性，从而导致对现有技术的改进。

对核酸进行测序的其他方法为本领域所熟知，并可以用来实施本发明的任何实施方式。这些方法利用酶，如DNA聚合酶I的Klenow片段、测序酶(SEQUENASE)、TaqDNA聚合酶、热稳定T7DNA聚合酶(AmershamPharmaciaBiotech,皮斯卡塔韦，新泽西)，或聚合酶和校对核酸外切酶的组合，如在ELONGASE扩增系统(LifeTechnologies，GaithersburgMD)中所发现的那些。优选地，序列制备由机器如HYDRA微分配器(RobbinsScientific，桑尼维尔，加利福尼亚)、MICROLAB2200系统(哈密尔顿，里诺，内华达州)和DNAENGINE热循环仪(PTC200；MJResearch,沃特顿，马萨诸塞州)来自动化。用于测序的机器包括ABIPRISM3700、377或373DNA测序系统(PEBiosystems)、MEGABACE1000DNA测序系统(AmershamPharmaciaBiotech)，及类似系统。序列可以使用本领域所熟知的和下面所描述的各种算法来分析：Ausubel等(1997；ShortProtocolsinMolecularBiology(精编分子生物学)，JohnWiley和Sons，纽约N.Y.，单元7.7)和Meyers(1995；MolecularBiologyandBiotechnology(分子生物学和生物技术)，纽约N.Y.，第856-853页)。

鸟枪测序被用来从由多个来源产生的克隆插入物产生更多序列。鸟枪测序方法为本领域所熟知，其使用热稳定DNA聚合酶、热不稳定DNA聚合酶和从位于感兴趣的多聚核苷酸分子侧翼的代表区域选择的引物。不完全组装的序列的同一性使用本领域所熟知的各种算法或程序如CONSED(Gordon(1998)GenomeRes.(基因组研究)，8:195-202)来进行检查。包括载体或嵌合序列或删除序列的污染序列能够被分别除去或恢复，把不完全组装的序列组织成完成序列。

多聚核苷酸序列的延长

本发明的序列可以使用本领域所熟知的各种基于PCRPCR的方法来延长。例如，XL-PCR试剂盒(PEBiosystems)、巢式引物，及市购的cDNA或基因组DNA文库可以用来延长多聚核苷酸序列。对所有基于PCR的方法，引物可以使用市购软件设计，如OLIGO4.06引物分析软件(NationalBiosciences，普利茅斯，明尼苏达州)，被设计成大约22到30个核苷酸的长度，具有大约50％或更多的GC含量，并在大约55℃至大约68℃的温度下退火至目标分子。当延长序列来恢复调节元件时，优选的是使用基因组文库而不是cDNA文库。

本发明的多聚核苷酸的用途

杂交

多聚核苷酸和它的片段能够用于不同目的的杂交技术。探针可以被设计或从独特的区域如5'调节区域获得，或从保守基序如受体标签(receptorsignature)中获得，并被用于操作规程(protocol)中以鉴定编码多聚核苷酸蛋白质的自然存在的分子、等位基因变异体或相关分子。该探针可以是DNA或RNA，通常为单链并应与任何所述多聚核苷酸序列具有至少50％的序列同一性。在标记核苷酸存在下，杂交探针可以使用寡核苷酸标记(oligolabeling)、切口平移、末端标记、或PCR扩增来产生。包含多聚核苷酸或其片段的载体可以通过添加RNA聚合酶和标记核苷酸被用来在体外产生mRNA探针。这些程序可以使用市购试剂盒如由AmershamPharmaciaBiotech公司提供的那些进行。

杂交的严格性由探针的G+C含量、盐浓度和温度确定。尤其，严格性能过通过降低盐浓度或升高杂交温度来增加。在用于一些基于膜的杂交的溶液中，有机溶剂如甲酰胺的添加允许在更低温度下发生反应。杂交能够在低严格性下用缓冲液如60℃下含有1％十二烷基硫酸钠(SDS)的5×SSC进行，其允许在包含一些不匹配的多聚核苷酸序列之间形成杂交复合体。随后的清洗在更高的严格性下用缓冲液如45℃(中等严格性)或68℃(高度严格性)下含有1％SDS的0.2×SSC进行。在高度严格性下，杂交复合体将仅在多聚核苷酸完全互补时保持稳定。在一些基于膜的杂交中，优选地35％，或最优选地50％甲酰胺能够被加入杂交溶液来降低杂交进行的温度，背景信号能够通过使用其他洗涤剂如Sarkosyl或TritonX-100和阻断剂如变性的鲑鱼精子DNA来减少。为杂交选择组分和条件为本领域技术人员所熟知并在Ausubel(上文)和Sambrook等((1989)MolecularCloning.AlaboratoryManual(分子克隆.实验室手册)，ColdSpringHarbor出版社，普莱恩维，纽约)的文章里进行了综述。

微阵列可以使用本领域所熟知的方法来制备和分析。寡核苷酸可以被用作微阵列中的探针或目标物。微阵列能够用来同时监测大量基因的表达水平和鉴定基因变异体、突变和单一核苷酸多态性。这样的信息可以用来确定基因的功能；用来理解病况、疾病或病症的遗传基础；用来诊断病况、疾病或病症；以及来发展和监测治疗剂的活性。(参见，例如，Brennan等(1995)美国专利第5,474,796号；Schena等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.(国家科学院院刊)，93：10614-10619；Baldeschweiler等(1995)PCT申请WO95/251116；Shalon等(1995)PCT申请WO95/35505；Heller等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.(国家科学院院刊)，94:2150-2155；及Heller等(1997)美国专利第5,605,662号。)

杂交探针在自然存在的基因组序列的作图中也是有用的。探针可以被杂交到：(a)特定的染色体，(b)染色体的特定区域，或(c)人工染色体构造如人的人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、细菌P1构造，或单染色体cDNA文库。用于分析的分子标记

各种标记和结合技术为本领域技术人员所熟知，并能用于各种核酸、氨基酸和抗体分析中。标记分子的合成可以使用Promega(麦迪逊，威斯康星州)或AmershamPharmaciaBiotech试剂盒来实现，以包含被标记的核苷酸如³²P-dCTP、Cy3-dCTP或Cy5-dCTP或氨基酸如³⁵S-蛋氨酸。核苷酸和氨基酸可以使用各种物质来直接标记，包括荧光、化学发光物或显色剂及类似物，通过使用如BIODIPY或FITC的试剂(MolecularProbes，尤金，俄勒冈州)与胺、硫醇和其他存在于分子里的基团的化学结合。

单拴系聚合物的反馈控制以重复探测聚合物-结合大分子

这一节解释Klenow片段(KF)聚合酶的基本机制，以及KF从它的DNA模板离解如何能通过监测孔电流振幅和事件驻留时间被检测到。进一步地，由KF加入的下一个碱基的身份能够通过长驻留时间事件(例如，但是不限于>20毫秒)的存在而被发现。长驻留时间事件然后能够被检测到并应用使用有限状态机(FSM)的动态电压控制来做出反应。

已经显示，结合到在纳米孔中被捕获的DNA发夹结构的KF能够基于电流振幅与DNA发夹结构本身区分开来。同时，将被加入到DNA发夹结构的下一个碱基的身份能够基于事件驻留时间被确认。检测并对不同的DNA/酶构型做出反应以及确认被KF催化的碱基的能力是酶功能控制和基于纳米孔的测序方法发展的强大激发因素，尽管进一步的检测和控制的精度是必要的。

现在描述使用纳米孔系统的单一DNA发夹结构分子的自动检测和控制。单一DNA分子的精确控制对进行多序列碱基鉴定是必要的，如将在基于纳米孔的测序中所采用的一样。DNA发夹结构事件被检测到，且显示它们的驻留时间能够被调节。所提供的结构说明了重复酶结合事件调整所必要的控制水平，用在纳米孔里被捕获的单片DNA。

已经显示，个体DNA发夹结构能够基于纳米孔电流信号的振幅被检测和控制。DNA发夹结构的驻留时间能够通过在孔中检测到发夹结构的时候降低应用电压来延长。更长的驻留时间提供更多信号，这些信号能够被用于使用机器学习方法(machinelearningmethods)(参见，例如Vercoutere等(2001)，Nat.Biotechnol.(自然生物技术)，19(3):248-252；及Akeson(2003)，Nucleicacidsresearch(核酸研究)，31:1311-1318)来鉴定发夹结构的热碱基对。这里所说明的控制的扩展允许使用单一DNA发夹结构来捕获多个酶，如下一章所示的。

在实施例XX至XXX中，说明了使用单一DNA发夹结构分子的酶的重复捕获。多个酶实验能够被迅速执行，比原子力谱(atomicforcespectroscopy，AFM))和光镊方法提供更高的通量，这些方法要求手动连接到将被测量的分子(见Elio等(2005)，Nature(自然)，438(7067)：460-465；及Greenleaf和Block(2006)，Science(科学)，313(5788)：801)。快速探测DNA/酶相互作用的能力为基于纳米孔的测序提供进一步的动力。

单一DNA发夹结构的基本检测和控制以重复捕获KF已经被说明。酶离解的实时检测能够通过识别二元和三元复合体移位事件的纳米孔电流信号中存在的结束步骤来进行。使用单片DNA对酶的重复探测实现了使用纳米孔快速读取长序列DNA所必需的机械作用。需要做更多的工作来调整KF的单碱基的添加，这对使用纳米孔进行测序也是必要的。这里所提供的结束步骤检测方法提供令人满意的结果，但是如果想要实用，更少的虚假检测(falsedetect)对使用酶钓鱼(enzymefishing)的测序是必要的。

对酶钓鱼机制的改进已经被提出来。指数加权移动平均滤波器代替之前所使用的移动平均滤波器以降低计算复杂度并提高信号平滑性。能够证实钓鱼的酶离解检查通过裸DNA发夹结构来执行以确保每个被检测到的酶事件都是新的酶结合事件。这对于在测序中使用统计模型是非常重要的，因为模型假定新的酶结合事件。通过使用更长的DNA发夹结构能够实现更高的信噪比，更长的DNA发夹结构将允许使用更高的控制电压。对DNA/酶解开(unbinding)的可靠检测和反应将允许根据重复的酶事件数据准确地鉴定碱基。

诊断

多聚核苷酸、片段、寡核苷酸、互补RNA和DNA分子和PNA可以被用来检测和量化改变的基因表达、不存在/存在与过量mRNA表达，或用来在治疗干预期间监测mRNA水平。与改变的表达相关的病况、疾病或病症包括特发性肺动脉高压、继发性肺动脉高压、细胞增殖紊乱(cellproliferativedisorder)、特别是变性寡树突神经胶质瘤(anaplasticoligodendroglioma)、星形细胞瘤、少突星形细胞瘤(oligoastrocytoma)、胶质母细胞瘤、脑脊膜瘤、神经节细胞瘤、神经肿瘤、多发性硬化、杭廷顿氏舞蹈病、乳腺癌、前列腺癌、胃腺癌、转移性神经内分泌癌、非增殖性纤维囊性和增生性纤维囊性乳腺病、胆囊炎胆石症、骨关节炎、和风湿性关节炎；获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、爱迪生氏病、成人呼吸窘迫综合症、过敏反应、强直性脊柱炎、淀粉样变性、贫血症、哮喘、动脉硬化、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性甲状腺炎、良性前列腺增生、支气管炎、切-东二氏综合症(Chediak-Higashisyndrome)、胆囊炎、克罗恩氏病、特应性皮炎、皮肌炎、糖尿病、肺气肿、胎儿成红细胞增多、结节性红斑、萎缩性胃炎、肾小球性肾炎、古德帕斯彻氏综合症(Goodpasture'ssyndrome)、痛风、慢性肉芽肿疾病、Graves病、桥本甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)、嗜曙红细胞过多、过敏性肠综合症、多发性硬化、重症肌无力、心肌炎或心包炎、骨关节炎、骨质疏松症、胰腺炎、多囊性卵巢综合症、多肌炎、银屑病、赖特尔综合症(Reiter'ssyndrome)、风湿性关节炎、硬皮病、重度联合免疫缺陷病(SCID)、斯耶格伦氏综合征(Sjogren'ssyndrome)、全身性过敏反应、全身性红斑狼疮、系统性硬化、血小板减少性紫癜、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、沃纳综合症(Wernersyndrome)、血液透析(hemodialysis)、体外循环(extracorporealcirculation)、病毒、细菌、真菌、寄生虫、原虫、和蠕虫感染、催乳素产生病症(disorderofprolactinproduction)、不孕，包括输卵管疾病、排卵缺陷、和子宫内膜异位、发情周期中断(disruptionoftheestrouscycle)、月经周期中断(disruptionofthemenstrualcycle)、多囊性卵巢综合症、卵巢过渡刺激综合症、子宫内膜或卵巢肿瘤、子宫肌瘤、自身免疫紊乱(autoimmunedisorder)、宫外孕、致畸(teratogenesis)、畸形精子生理(abnormalspermphysiology)、良性前列腺增生、前列腺炎、佩罗尼氏病(Peyronie'sdisease)、性无能、男性乳房增生症(gynecomastia)；光化性角化病(actinickeratosis)、动脉硬化、粘液囊炎(bursitis)、硬化(cirrhosis)、肝炎、混合结缔组织病(MCTD)、骨髓纤维变性(myelofibrosis)、阵发性夜间血红蛋白尿、真性红细胞增多症(polycythemiavera)、原发性小血板增多症、癌症并发症(complicationsofcancer)、癌症，包括腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤、畸胎癌(teratocarcinoma)，以及，特别地，肾上腺癌、膀胱癌、骨癌、骨髓癌、脑癌、乳癌、子宫颈癌、胆囊癌、神经节癌、胃肠道癌、心脏肿瘤、肾癌、肝癌、肺癌、肌肉癌、卵巢癌、胰腺癌、副甲状腺癌、阴茎癌、前列腺癌、唾液腺癌、皮肤癌、脾癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、及子宫癌。在另一个方面，本发明的多聚核苷酸。

多聚核苷酸、片段、寡核苷酸、互补RNA和DNA分子、和PAN，或其片段，可以用来检测并量化改变的基因表达；缺少、存在或过量的mRNA表达；或在治疗干预期间监测mRNA水平。与改变的表达相关的病症包括：静坐不能(akathesia)、阿尔茨海默氏病、健忘症、肌萎缩性脊髓侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis)、共济失调、双相情感障碍、紧张症、脑瘫(cerebralpalsy)、脑血管疾病、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakobdisease)、痴呆、抑郁、唐氏综合症、迟发性运动障碍(tardivedyskinesia)、肌张力障碍(dystonias)、癫痫症(epilepsy)、杭廷顿氏舞蹈病、多发性硬化(multiplesclerosis)、肌肉萎缩症(musculardystrophy)、神经痛(neuralgias)、神经纤维瘤病(neurofibromatosis)、神经病(neuropathies)、帕金森氏病、皮克氏病(Pick'sdisease)、色素性视网膜炎、精神分裂症、应季性情绪紊乱症(seasonalaffectivedisorder)、老年性痴呆、中风、图雷特氏病(Tourette'ssyndrome)及癌症，包括：腺癌、黑色素瘤、和畸胎癌，特别是脑癌。这些cDNA也能被用作在从几天到几个月不等的时间段里对抗上面所记录的疾病和其他脑部病症、病况和疾病的治疗功效的标志。诊断性分析可以使用杂交或扩增技术来比较来自病人的生物样本里的基因表达和标准样本，以检测改变的基因表达。这个比较的定性或定量的方法是本领域所熟知的。

诊断性分析可以使用杂交或扩增技术来比较来自病人的生物样本与标准样本里的基因表达，以检测改变的基因表达。用于该比较的定性或定量方法为本领域所熟知。

例如，多聚核苷酸或探针可以通过标准方法来标记，并在杂交复合体的形成条件下被加入来自病人的生物样本。经过一个孵育期以后，样本被清洗，与杂交复合体相连的标记(或信号)的数量被量化并与一个标准值进行比较。如果病人样本里的标记数量相比于标准值有显著改变，那么相关病况、疾病或病症的存在被指示出来。

为了给与基因相关的病况、疾病或病症的诊断提供基础，建立正常或标准的表达分布。这可以通过在杂交或扩增条件下将取自正常受试者(动物或人)的生物样本和探针结合来完成。标准杂交可以通过比较使用正常受试者所获得的值和来自实验的值来进行量化，该实验中使用了已知数量的基本纯化的目标序列。以这种方式所获得的标准值可以与从来自病人的样本所获得的值比较，所述病人具有特定病况、疾病或病症的症状。从标准值向着与特定病况相关联的那些值的偏离被用来诊断该病况。

这样的化验也能被用来在动物研究和临床实验中评估特定治疗方案的功效，或用来监测个体病人的治疗。一旦病况的存在性被确立及治疗方案被启动，诊断性分析可以被定期重复以确定病人里的表达水平是否开始接近在正常受试者上所观察到的水平。连续分析所得的结果可以用来显示从几天到几个月的一段时间里的治疗功效。

配体的纯化

多聚核苷酸或其片段可以被用来从样本中纯化配体。使用多聚核苷酸或其片段来纯化配体的方法将包括在允许特异性结合的条件下将多聚核苷酸或其片段与样本结合，检测特异性结合，回收结合的蛋白质，及使用恰当的试剂从纯化的配体中分离多聚核苷酸。

在额外的实施方式中，多聚核苷酸可以用于任何还有待开发的分子生物学技术，条件是新的技术依赖目前已知的多聚核苷酸的性质，包括，但不限于，诸如三联体遗传密码和特定碱基对相互作用的性质。

标号

1.孔或孔口

2.基质或结构

3.化合物

4.大分子

5.第一聚合物

6.聚合物的不完全合成部分

7.单体

8.基本上完全合成的聚合物

9.高亲和力结合部位

10.配体

11.产物

12.第二聚合物

13.第三单体

14.孔分子或通道分子

15.混合信号晶片

16.电化学层

17.开口

18.金属镀敷组合物

19.金属

20.薄膜或脂质双层

21.捕集的气体(例如,氮)

22.脂质单层

23.液体或水溶液(第一)

24.室或孔

25.液体或水溶液(第二)

26.金电极(可选的)

据我们所知，我们是最先使用FPGA来控制和测量纳米孔里的复合体的研究者(见Hornblower等(2007)NatureMeth.(自然方法学)，4：315-317)。我们相信相似的功能能够通过恰当的微处理器实现。FSM逻辑已经被用作机器学习方法的一部分，该方法用来鉴定DNA发夹结构的钝端的末端碱基对(见Vercoutere等(2001)Nat.Biotechnol.(自然生物技术)，19(3):248-252；Winters-Hilt等(2003)Biophys.J.(生物物理学杂志),84(2):967-976)。这是FSM非常不同的一种应用，其中它的主要作用是为了训练离线机器学习模型；我们的FSM功能是用于在线电压控制。

纳米孔(无酶)中的ssDNA的直接控制已被证明(Bates等(2003)BiophysicalJournal(生物物理杂志),84:2366-2372)，其中DNA的检测是基于监测相对于阈值水平的原始振幅。电压水平变化，相比于在Wilson等((2008)同上)中所采用的那些，被控制用来探索零和低电压对ssDNA-孔相互作用的影响。与原始离子电流振幅阈值化相反，我们的方法对电流进行实时地滤波(细节在实施例中给出)

单分子感测和操控可选择的方法包括光镊子和原子力显微镜(见Bustamante等(2003)Nature(自然)，421：423-427)。例如，光学捕获已经被用来对DNA进行测序，通过将进行性酶(processiveenzyme)连接到聚苯乙烯珠上(见Abbondanzieri等(2005)Nature(自然)，438(24)：460-465；及Greenleaf和Block(2006)Science(科学)，313：801)。当前，与使用纳米孔相比，已经实现单一DNA分子聚合的更高的空间和时间分辨率。然而，这些方法通常要求更多的预备性步骤，少得多的分子能够在常用的时间段内被分析。

我们的方法使用悬浮在纳米孔中的单拴系DNA分子的反馈控制来进行反复捕获和后续的个体DNA-结合酶的离解。我们的实施分两个阶段。

首先，带有单链和双链片段的单DNA分子通过单链端被捕获，然后通过将单链片段在反面进行双链化而被拴系。在这个构型中，双链片段同时存在于通道的顺面和反面，DNA将留在通道中直到一个足够的电压力从顺面或反面释放双链片段。通道中单链片段的长度选择使得在负电压下，顺室中单-到-双链(ss-ds)接点的暴露对KF结合来说是足够可用的。

在第二阶段，拴系DNA被用于纳米孔顺室中的KF酶的反复捕获和离解。通过与钓鱼类比，DNA为线和饵(ss-ds接点为钩)，酶是鱼(能够一次仅捕获一个)。现在给出关于我们的方案、控制逻辑、文献中的相关方法、及我们对KF重复结合到纳米孔中拴系DNA分子的初始说明的细节。拴系DNA能力的影响和提炼

为了探索结合或修饰DNA或RNA(核酸外切酶、激酶和其他聚合酶)的酶与被捕获在纳米孔中的DNA或RNA的相互作用，我们认为在这里公开的发明将具有下列技术性的影响：

□数据通量的大幅增加。在拴系构型中，负的电压用于钓鱼模式，及正电压用于探测模式。在探测模式中，离子电流中所包含的所有信息能够用于在任何想要的探测电压下表征聚合物本身或聚合物-酶相互作用。在非拴系构型中，独立事件(包括捕获、纳米孔的封锁和聚合物的最终移位)含有聚合物本身或聚合物-酶相互作用分析相关的信息。足够大的电压被要求用来捕获每个分子，事件之间的时间是不可控制的，更低的捕获电压增加了事件之间的时间。这样，拴系构型增加可分析的数据的通量，通过在常用的时间段里增加可分析事件的数量及通过增加探测电压的范围。

□不可分析数据的减少。在探测模式中，离子电流包含关于拴系聚合物本身或结合到拴系聚合物的酶的相互作用的信息。在非拴系构型中，高达50％的实验记录事件可能与所研究的动力学无关。例如，由接触孔的顺面的DNA发夹结构的ds-端所引起的短暂封锁将被包含在非拴系构型的数据中，但是不在拴系构型中。

□用于实时检测顺室中生物组分的添加的纳米孔传感器灵敏度的大幅提高。实验后分析说明了纳米孔传感器检测Mg²⁺辅因子和KF的互补dNTP的存在的灵敏度。在两种情况下，检测是基于由二元/三元事件的KF-结合部分的驻留时间的增加。通过实时监测事件的KF-结合部分的驻留时间，拴系构型提供一种新的在线检测Mg²⁺和互补dNTP组分在顺室中的添加的能力。同样的能力能够在其他酶和它们的事件敏感性组分中利用。在我们未来的使用KF的拴系DNA实验中，实时检测能力将被作为钓鱼时间、dNTP浓度、Mg²⁺浓度、和探测电压的函数进行探索。

通过参考下列实施例本发明将更易懂，这些实施例被包括进来仅仅是为了说明本发明的某些方面和实施方式，不作为限制。

实施例

在此描述几个实施例来说明测量大分子和聚阴离子或聚阳离子的能力。

实施例I：酶结合被阻断引物所阻止。

为了说明该方法，参见图1(a)到1(g)。(a)在该方案中，阻断引物在本体相中被结合到引物/模板。三元复合体的结构阻止酶结合到目标DNA的双链DNA和单链DNA片段之间的接点，在该接点第一核苷酸将被引入，(b)在应用电压(反面为正)下对被阻断的引物/模板的捕获将ssDNA穿入所述孔并将dsDNA留在前厅上方。发生这种情况，是因为阻断引物末端的环太大而无法进入前厅。电流报告这个状态下复合体的捕获，(c)在应用电压下，ssDNA片段在孔中向着反面前进并对阻断引物和模板之间的碱基对进行性解链。独立释放每个碱基对的能量消耗很小(大约2.5千卡/摩尔)，因此它在受力的情况下快速进行。在该解链过程期间，因为dsDNA片段不能进入前厅，电流和在(b)中一样，(d)解链之后释放阻断引物。不存在阻断引物时，目标DNA的dsDNA片段能够进入孔前厅。这导致标志着阻断引物的释放的信号的电流和标志着目标DNA的激活的信号的电流之间存在可测量的减弱。(e)电压逆转使被激活的dsDNA/ssDNA的接点暴露，供酶结合。通过逆转电压，带负电荷的DNA被驱赶回到顺隔室，(f)阻断引物不存在时，酶能够在目标位置(在本实施例中为dsDNA/ssDNA的接点)结合到DNA，(g)探测已结合的酶或DNA的修饰。在规定时间量(典型地为数百微秒到数秒)之后，电压能够再次逆转到其最初的极性，这样将DNA拉回到纳米孔。读取的电流能够被用来确定酶是否已经被结合(已显示)或DNA双链体末端是否已经被修饰(未显示)。如果结果为否，步骤(e)-(g)能够被重复。

实施例II：酶催化作用被阻断引物阻止

为了说明本方法，参见图2(a)到2(g)。(a)在本方案中，阻断引物在本体相中被结合到引物/模板。三元复合体的结构允许酶结合到目标DNA，但是催化作用和沿着模板的处理被阻止，(b)在应用电压(反面为正)下对被阻断的引物/模板的捕获将ssDNA穿入所述孔并将dsDNA留在前厅上方。发生这种情况，是因为阻断引物末端的环太大不能进入前厅。电流报告在该状态下的复合体的捕获。(c)在应用电压下，ssDNA片段在孔中朝着反面前进并对阻断引物和模板之间的碱基对进行性解链。独立释放每个碱基对的能量消耗很小(大约2.5千卡/摩尔)，因此它在受力的情况下快速进行。在该解链过程期间，因为dsDNA片段不能进入前厅，电流和在(b)中一样。(d)解链之后阻断引物的释放导致复合体的激活。不同于图1中所公布的方案，当阻断物离解时，目标DNA的dsDNA片段不能进入孔前厅，因为被结合的酶太大而无法进入。因此，平均电流不变，(e)降低的应用电压允许酶继续进行。仍保留有足够的离子电流以进行分析。(f)模板链被复制至完整，(g)复合体离解，纳米孔现在准备捕获并激活另一个DNA目标(见步骤a)。

实施例III：酶催化通过由纳米孔注入Mg²⁺来激活。

为了说明本方法，参见图3(a)到3(c)。(a)在这个实施例方案中，顺隔室包含DNA聚合酶活性所必需的所有组分，除了Mg²⁺。这样，没有催化作用可以发生，(b)当电压被应用(反面+)，Mg²⁺被驱赶穿过孔进入顺隔室，(c)当DNA-聚合酶复合体被孔捕获时，紧邻孔的容积中的Mg²⁺浓度足够高以允许Mg²⁺占据酶的催化部位中的两个关键地点。然后能够发生复制链的聚合。本体相中的三元复合体不能催化DNA的合成，因为远离孔处的Mg²⁺浓度基本为零。该方案能够应用于DNA合成所需要的且足够小从而能够在受控制的条件下渗入纳米孔的其他物质。

实施例IV：使用生物纳米孔、α-溶血素测量聚合酶活性

DNA聚合酶I的聚合酶活性大部分地包含在一种被称为Klenow片段的较小的结构中。在本应用中，Klenow片段被允许结合到DNA的链(模板)，该DNA的链已经经历过使用规定的碱基序列进行互补碱基配对。该蛋白被吸引到孔中，从而穿过孔的离子电流下降。两种不同的酶功能能够被监测。1)当蛋白质被从它的位于引物-模板复合体的结合部位释放时，产生一个特征性的离子电流的瞬时下降。2)当酶由适当的dNTP底物供应时，产生了酶在孔中的停留时间的特征性延长。错误的dNTP底物不改变停留时间。

实施例V：检测结合到受体蛋白的配体。

通过形成适当的共价键，如由交联剂所产生的共价键，胞质雌二醇受体被以共价键的形式连接到聚天冬氨酸的100mer。受体被作用于阴离子形式的聚天冬氨酸的电场定位在3纳米直径的氮化硅孔中。所述孔具有连接到孔上的金层的双官能烷基硫单层。定位以后，通过在孔上的烷基和受体上的半胱氨酸基团之间形成二硫键，受体被以共价键的形式连接到所述孔。当雌二醇存在时，它结合到受体上的高亲和力部位并改变穿过所述孔的离子电流，从而提供使用单分子灵敏度来检测这种类固醇激素的手段。

实施例VI：检测葡萄糖氧化酶活性。

按照实施例2中所述的程序，葡萄糖氧化酶分子被连接到氮化硅孔。当葡萄糖存在时，酶促作用产生了在葡萄糖结合到活性部位时穿过所述孔的离子电流的可检测的瞬时变化、氧化及释放产物。

实施例VII：监测核糖体功能。

核糖体的制备在常用的翻译系统如大肠杆菌的细胞质提取物存在下被暴露给特定的mRNA。该系统被维持在接近0℃以抑制核糖体功能。可替换地，核糖体可通过排除必需的辅因子如延伸因子或tRNA来钝化。当单一核糖体连接到mRNA时，它能够被放置在孔中，通过由100mV或更高的跨膜电压的作用以吸引mRNA穿过孔来实现。然后混合物被快速加温至25℃以引发蛋白质合成或必需的辅因子的添加。蛋白质合成的单个步骤然后通过离子电流上的综合效应来监测，该离子电流由核糖体作用而被吸引穿过孔的mRNA，以及当它沿着翻译步骤行进时核糖体的环构象改变来产生。

实施例VIII：在固态孔中放置α-溶血素通道

七聚物形式的α-溶血素通道在脂质体膜内组装。组装完成后，加入一端带有链酶亲和素分子的DNA100mers，瞬时膜电位在整个脂质体膜上产生，内部为正。做到这一点的一个方法是加入带有阳离子和阴离子的盐，其中阳离子能够渗入溶血素通道，阴离子由于它的尺寸无法渗入。膜电位吸引发夹结构的游离端进入孔。由于链酶亲和素结构，DNA不能穿过孔，但是反而与溶血素形成复合体。然后七聚物和它已连接的DNA链通过已公开的程序被分离，并被加入带有5纳米孔的氮化硅膜的顺面。100mV或更高的电压被应用，电泳作用将从溶血素七聚物的干道突出的DNA链吸引入所述孔。然后如实施例中所描述的，溶血素七聚物被以共价键的方式连接到孔。然后引导性DNA链通过逆转应用电位的极性被移除，由此溶血素-氮化硅膜能够被用作生物传感器的高分辨率纳米孔。

实施例IX：悬浮在纳米孔中的单拴系DNA分子的反馈控制以重复探测DNA-结合酶

在生物纳米孔的建立中，在KCl溶液中，平面脂质双层贯穿整个50-100微米的teflon口而产生，单一α-溶血素蛋白质通道自行插入平面脂质中。通道(孔)的长度为15纳米且直径有变化。孔的顺开口为2.6纳米宽，通向一个3.6纳米的前厅，然后在干道的起点处变窄至有限的1.5纳米宽。干道至反开口的的剩余部分为2纳米宽。前厅足够大以使双链DNA(dsDNA)能进入，但是干道的受限宽度仅刚好够单链DNA(ssDNA)通过。AgCl电极被用来在双层的两端应用一电位，该电位产生经过孔(图12)的离子电流。由这个电压创建的电场推动ssDNA或RNA的带负电荷的磷酸盐骨架穿过孔，从顺面穿过直到孔的反面，其中反面电压为正。随着分子的移位，孔由于移位的分子变得被部分阻断，引起电流的下降。这些移位事件能够由衰减的(封锁)电流的振幅和分子在孔中的时间(被定义为驻留时间)来特征化。纳米孔系统的图解和DNA移位事件的实施例在图13中显示。显示在图13中的DNA具有单链片段和双链片段，双链片段作为20碱基对发夹结构(20bphp)。DNA被以单链端捕获进入纳米孔，一旦电压场力引起发夹结构在前厅里解链，该DNA就移位。该配置对本发明的一部分有用。双链片段的用途是它延长DNA的驻留时间(通过停止移位)，简单地，直到电压将片段剪成单链DNA以及DNA移位。此外，更长的双链片段在给定电压下产生更长的驻留时间。相反，对ssDNA或RNA，在捕获级电压下，移位率达到2核苷酸/微秒，无移位暂停。

我们注意到双链片段可选择地通过使用互补碱基退火引物DNA片段至单链DNA的末端来形成。关键在于，在我们的配置中，被捕获的DNA分子必须具有单和双链片段。该结构帮助捕获和保留：单链端被捕获，双链端增加驻留时间，提供检测捕获和通过降低电压至保持水平(以下更详细地解释)来作出反应的时间。使用这种DNA结构的另一个关键原因为，在我们建议的方法中所开发出的酶在DNA的单链-至-双链接点处精确地结合到DNA。

实施例X:纳米孔和酶

近来，我们已经使用生物纳米孔来探测酶与被捕获的DNA分子的相互作用。在应用电压下，酶结合DNA的ssDNA端被捕获进纳米孔，酶由于太大无法穿过纳米孔移位而停留在纳米孔的顶部。结合到ssDNA的大肠杆菌核酸外切酶I(ExoI)的动力学已经使用基于纳米孔的力谱的电压斜坡被量化。特别地，在检测到ssDNA的捕获时，电压被自动化以暂时地保留ssDNA-ExoI复合体，然后完成一个电压斜坡直到ExoI离解及ssDNA通过孔移位。应用电压斜坡下的离解时间(time-to-dissociation)被进而用来估计结合率常数。

之前(见Benner等(2007)NatureNanotechnology(自然纳米技术)，2:718-724)我们已经研究过DNA和大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片断(KF)的相互作用。在不存在KF的情况下，捕获和随后的在180mV恒定电压下14bphp的解链揭示了具有20pA平均振幅和1毫秒中值驻留时间的封锁(图14a)。2μMKF的添加产生可归结于更高平均振幅(23pA)的二元复合体(DNA/KF)引起的新的事件群，并导致更长驻留时间(所有事件的中值3毫秒)的事件图(图14bII)。200μM脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、在KF催化部位与DNA模板碱基互补dGTP的加入延长新事件群的驻留时间至133毫秒中值，这归功于三元复合体(DNA/KF/dGTP)内部更高稳定性的键。

在下一节中描述的我们的拴系DNA配置影响了(leverage)现在所描述的KF-结合DNA事件所展示的重要结构特征(有或没有互补的dNTP，就是说，二元或三元复合体)。更紧密的二元和三元复合体封锁的调查揭示分别大于90％和97％的封锁的两步模式。第一步具有23pA的平均振幅，接下来是简短(1毫秒中值驻留时间)的第二步，被称为20pA平均振幅下的结束步骤。证明了从步骤1到步骤2的过渡导致KF(对二元和三元复合体)从DNA的离解，接下来是发夹结构下落到孔前厅直到移位发生。这样，结束步骤动力学正是DNA双链体解链动力学。

酶结合DNA事件中的结束步骤的持续存在对我们的发明具有机械上的重要性。特别地，对恒定电压下在纳米孔内被捕获的酶-结合DNA复合体来说，结束步骤使基于振幅变化(在我们最近的工作中使用KF在180mV电压下从23pA至20pA)来实时检测酶已经从DNA离解变得可能。

实施例XI：对纳米孔中的DNA和KF结合的DNA的检测和控制

在该方法中，电压控制逻辑使用LabVIEW8软件里的有限状态机(FSM)来进行编程，FSM逻辑在现场可编程门阵列(FPGA)硬件系统上实施。我们第一个FSM/FPGA电压控制的实现基于特征性的23pA振幅和至少20毫秒驻留时间证明了对个体二元复合体的高效自动检测。对保持在21.2-26.8pA阈值范围内20毫秒的所有事件，电压被逆转来将复合体驱回顺室，而不是等待(大于100毫秒中值驻留时间)酶的离解和DNA移位到反面。控制逻辑具有集中被检测到的三元复合体事件的驻留时间的作用，从没有FSM/FPGA控制的123毫秒(235毫秒四分位差(IQR))中值驻留时间，到有FSM/FPGA控制的23毫秒(0.3毫秒IQR)中值驻留时间。由于少于2％的DNA和二元事件长于20毫秒，20毫秒的等待时间段确保几乎所有受控制的事件均为三元复合体。

在我们的第二个FSM/FPGA电压控制的实施方式中，我们说明了基于特征性的20pA振幅的个体DNA复合体的高效自动检测(没有KF酶存在于顺室)(Wilson等，(2008))RapidfinitestatemachinecontrolofindividualDNAmoleculesinananopore(个体DNA分子在纳米孔中的快速有限状态机控制)，生物医学电子器件和设备国际会议(BIODEVICES)，召开于葡萄牙马德拉)。对所有落入20±2.8pA阈值范围的事件，电压被迅速降低来延长DNA驻留时间。在第二实验中，对所有落入大约20pA水平的阈值的DNA事件，电压被迅速逆转以在移位之前将DNA驱回顺室。两种实施方式(检测并对酶结合事件做出反应和检测并对酶释放DNA事件做出反应)都是基本成就，推动我们尝试在两种类型的事件之间个别地、实时地检测和识别。

实施例XII：设备

膜片钳放大器、MolecularDevicesAxoPatch200B，调整应用电压并测量经过通道的离子电流。使用MolecularDevicesDigidata1440A数字化仪来记录数据，以50kHz进行采样并以四极Bessel滤波器在5kHz进行低通滤波。我们的工作站中的一个使用不同的膜片钳，A-MSystems2400型。

实施例XIII：控制逻辑：硬件和软件

控制逻辑使用LabVIEW8软件里的有限状态机(FSM)来进行编程。该FSM逻辑在现场可编程门阵列(FPGA)硬件系统“NationalInstrumentsPCI-7831R”上实施。FPGA是可重构的硬件平台，其允许快速测量和电压反应时间(1微秒输出采样时间)。FSM是一种逻辑构造，其中程序的执行被分解为一系列个体状态。每个状态有与之关联的命令，状态之间的过渡是根据系统测量结果而进行的。对孔电流的测量结果被处理后作为输入被传递到FSM。根据需要对FSM控制逻辑作出改变，不需要对设计进行重新编译和重新路由来在FPGA运行。这通过使系统以微秒级对事件作出反应，同时也允许控制逻辑在实验之间根据需要被重新配置，而在速度和灵活性之间得到平衡。

实施例XIV：对离子电流的滤波和取阈值

我们的控制逻辑要求对源于DNA本身或KF结合DNA的离子电流封锁(事件)的高效检测。进一步，该逻辑必须能够高效地在这两种类型的事件之间进行区分。在180mV，DNA本身和KF结合DNA的平均振幅分别是20pA和23pA；3pA的差值。为了实时地将DNA本身和KF结合DNA事件区分开来，FPGA上的输入电流信号被滤波并被取阈值。

阈值水平通过恒定电压实验被事先确定，在该实验中，生物组件将在顺室中被检测到。在我们的使用KF的实验中，与KF结合或KF释放事件振幅一致的振幅阈值在180mV和150mV被确认。在180mV，例如，被确认的用来检测DNA本身事件的阈值为20±2.8pA；被确认的用来检测KF-结合DNA事件的阈值为24±2.8pA。在我们迄今为止的实验中，一或两个阈值已经被在一次实施。在未来的工作中，多于两个的阈值可能被同时使用，以区分不相同的多种大分子状态，这些状态已知基于衰减的振幅而不同。

滤波被用来减轻噪声。由于离子电流的峰值-峰值(peak-to-peak)噪声在180mV下通常超过3pA，通过监测原始电流振幅，将不能将DNA本身和KF结合DNA事件可靠地区分开来。通过对电流振幅进行滤波，我们已经证实了DNA本身事件和KF结合DNA事件的实时检测。迄今为止，一个窗口均值滤波器已经被用在我们的实验中，包括在2.3节所显示的我们的发明的初始说明中。近来，一个更高级的指数加权均值滤波器被确认，并将被用在新的实验中。关于这两个滤波器的细节在下面给出。

实施例XV：移动平均滤波器

每5.3微秒，FPGA对离子电流进行采样，并使用0.75毫秒的窗口尺寸计算一个窗口平均振幅。如果该均值进入了选定的阈值范围，FPGA检测入口并继续监测均值，每过0.2毫秒重新检查阈值。如果四次连续的检查的均值都保持在阈值范围以内，FSM逻辑将封锁诊断为已知与所选择的阈值一致的事件类型。

电压中不存在变化时，事件开始和事件诊断之间的预期时延为1.35毫秒；对于第一次进入阈值的窗口均值，为0.75毫秒，三次更加确定的测试为0.6毫秒。实际上，诊断时间从1.1到2.5毫秒变动。均值滤波器在我们的发明的初始说明中实施(以下为细节)。

实施例XVI：指数加权移动平均滤波器

通过实验后分析，我们的均值滤波器被显示为虚假地检测三元事件内的结束步骤。具体地，FSM/FPGA被编程以检测三元水平振幅，等到结束步骤，并在检测到结束步骤时，逆转电压来将未结合的DNA驱赶回到顺室。数据的检验显示了许多事件的电压逆转，在这些事件中没有结束步骤清晰地存在，尽管没有电压反转时三元事件中结束步骤的存在率很高(97％)。

为提高FSM对结束步骤虚假检测的鲁棒性(robustness)，一个指数加权移动平均(EWMA)滤波器现在被开发出来代替均值滤波器。EWMA滤波器代表在电子工程应用中通常用来进行信号平滑的模拟阻容(RC)滤波器的数字化实施方式。该滤波器计算对过去的样本具有指数级更少重要性的移动平均，允许被滤波的信号更好地追踪真实信号。与使用均值滤波器一样，四个连续的阈值测试将被用于事件诊断，在阈值测试之间等待0.2毫秒。

EWMA检测时间更精确的估计将是我们正在进行的工作的一部分。

实施例XVII：改变电压场力的时间标度

当膜两端的电压数值变化时，电容瞬态被叠加于所测量的离子电流上。瞬态存在于涉及电压变化的所有的α-溶血素纳米孔研究中(见上文，例如，Bates等(2003))，并必要地为每个事件的规定且可管理的片段掩盖所测量电流中的一些信息。在我们的发明中，瞬态意味着，当控制逻辑被编程为在电压变化后诊断事件类型时，经滤波的电流振幅将不进入为事件诊断而选定的阈值内，直到瞬态足够稳定。

瞬态的稳定时间与电压的净变化成比例。在电压控制实验中，应用电压中的变化从180mV到-50mV，及-50mV到180mV。对230mV的净变化(绝对值)，我们观察到瞬态的98％在2.5毫秒之后已经充分衰减来正确地取阈值。在我们最初的拴系DNA实验中，电压变化为200mV和170mV(绝对值)。源自电压变化的瞬态在图17-18中是可观察的。

在电压中存在变化时，预计诊断事件(如DNA事件或酶结合DNA事件)所需的时间与电压瞬态稳定时间相匹配。这是因为瞬态稳定时间典型地要长于滤波振幅收敛到所测量的离子电流信号所需要的时间。因此，对230mV的电压变化(绝对值)，预计诊断时间为最多2.5毫秒，对更小的电压变化，预计诊断时间少于2.5毫秒。

实施例XVIII：拴系DNA配置

在我们最初的拴系DNA实验中，单一DNA20bphp在孔中被捕获，被拴系，并在电压控制下经过孔来回穿梭，以使KF反复地结合到顺室中的ss-ds接点和从该接点解开。在实验中，1μM100merDNA,、5mMMgCl、2μMKF和200μM的dGTP存在于孔的顺孔(ciswell)中。这样，每个事件由在纳米孔中捕获的DNA本身或三元复合体产生。

DNA低聚物是为拴系而设计。具体地，3'端在20碱基对发夹结构中形成，与5'端互补的2μM20mer引物存在于反室中。在捕获到5'端时，电压被降低以将DNA保留在孔中，但是不解链前厅里的3'-端发夹结构(如果未结合的DNA分子被捕获)或从ss-ds接点离解KF/dGTP(如果三元复合体被捕获)。在足够长的时间段之后，20mer引物退火至5'端，在孔的反面产生一个20mer双链体。现在提供我们最初实验的细节。

在实验中，180mV应用电压被用来捕获孔中的每个DNA分子，其中5'端移位进入反室中。当使用均值滤波器诊断DNA事件(阈值[15.75,21.25]pA)或KF结合DNA事件(阈值[21.25,26.75]pA)，FSM降低电位至50mV，以保持分子在孔中但是不解链发夹结构或离解KF/dGTP。50mV的保持电压被应用20秒，这是足以使20mer引物退火至反室中的DNA5'端的时间段。被捕获的DNA分子的最初拴系阶段在图15中显示。

20秒之后，FSM逆转电压至-20mV，迫使DNA朝向孔的顺面，其中足够的力使5'双链体靠着通道的反面端毗邻，并摇晃3'端发夹结构的ss-ds接点进入顺室。-20mV电压被发现足够小从而不解链5'–端引物双链体。处于-20mV电压的时间量被称为钓鱼时间t_fish，按秒测量。将-20mV应用t_fish秒，被称为控制逻辑的钓鱼模式。

-20mV电压t_fish＝5秒之后，FSM改变电压至180mV，然后监测(取阈值)均值滤波振幅以诊断孔内分子的身份为DNA本身或酶结合DNA。如果未结合的DNA被诊断出来([15.75,21.25]pA阈值)，电压被逆转至-20mV以重启钓鱼模式。否则，FSM继续监测滤波振幅。在一个KF/dGTP-结合事件中，基于结束步骤([15.75,21.25]pA阈值)的诊断，电压被逆转至-20mV来重启钓鱼模式。

应用180mV直到未结合的DNA被诊断出来(通过DNA本身或通过到达酶结合事件的结束步骤)被称为控制逻辑的探测模式。拴系DNA实验内的前九个钓鱼-然后-探测(fish-then-probe)行动在图16中展示。一旦DNA被拴系，且FSM逻辑开始钓鱼-然后-探测循环，仅有未结合的DNA阈值被用于诊断未结合的DNA或酶结合DNA事件内的结束步骤。FSM逻辑重复钓鱼模式，然后探测模式循环，直到被拴系的DNA分子通过孔移位，且开放通道电流被检测到。如果3'-端发夹结构被解链或5'-端双链体被解链，则DNA移位。我们预计DNA移位最有可能通过解链3'-端发夹结构发生，因为180mV下的解链能够比DNA事件诊断发生的更快。另一方面，-20mV电压不太可能解链5'-端双链体，即使对于分钟级别的钓鱼时间也是如此。实验后分析能够被用来确定探测模式对钓鱼模式中的DNA移位频率。当拴系DNA移位且电流回到开放通道值，FSM重新设置并监测另一个事件电流，以便拴系新的DNA分子。

在第二实验中，使用了更低的捕获和探测电压150mV，并使用了更快的钓鱼时间t_fish＝0.521秒。基于在恒定的150mV下使用DNA本身和含有KF和dGTP的DNA的实验，未结合的DNA阈值被设置为[7.5,15.5]pA，以及KF/dGTP结合DNA阈值被设置为[19,27]pA。钓鱼和探测模式在图17中显示，其中探测揭示一个DNA本身事件。钓鱼和探测事件在图18中再次显示，其中探测揭示了一个酶结合DNA事件。FSM捕获并拴系八个独立的DNA分子。总的来说，337个酶结合DNA事件在380秒的时间段里在探测模式下发生。数据的分析显示在72％的时间里，FSM/FPGA正确的诊断这些事件里的结束步骤。在剩下的28％里，钓鱼在实际上发生于酶结合DNA事件中的结束步骤之前被重启(被称为误报)。离线分析显示EWMA滤波器在该数据中产生了零误报。未来拴系DNA实验中EWMA滤波器的在线实施将被用来估计并提高滤波器误报的鲁棒性。一种“未结合DNA检查”机制能够被开发出来以排除/最小化误报。该机制以如下方式进行工作：在每个探测模式的末尾，进行一个时间段的钓鱼，该时间段太短而无法暴露顺室中的ss-ds接点，然后重新探测以确保DNA是未结合的；如果未结合，进行钓鱼达时间段t_fish；如果已结合，等待直到结束步骤被检测到。用来证实DNA是未结合的短暂的钓鱼时间段的确认是我们正在进行的工作的一部分。

实施例XIX：快速的检测和控制以探测纳米孔中的个体DNA和酶结合DNA分子

在生物纳米孔的建立中，在KCl溶液里，平面脂质双层在整个20微米的TELON口上产生。单一α-溶血素蛋白通道被插入平面脂质。通道(孔)的长度为15纳米且直径有变化。孔的顺开口为2.6纳米宽，通向一个3.6纳米的前厅，然后在干道的起点处变窄至有限的1.5纳米宽。至反开口的干道的剩余部分为2纳米宽。前厅足够大以使双链DNA(dsDNA)能进入，但是受限的干道的宽度仅够ssDNA通过。AgCl电极被用来在双层的两端应用一电位，该电位产生经过孔的离子电流(图12)。由该电压产生的电场拉动ssDNA或RNA的带负电荷的磷酸盐骨架穿过孔，从顺面穿过直到孔的反面，其中反面电压为正。随着分子的移位，孔由于移位的分子变得被部分阻断，引起电流的短暂下降。这些移位事件能够由封锁电流的振幅和分子在孔中的的时间(定义为驻留时间)来表征。这里所出现的实验中所使用的DNA由ssDNA和dsDNA片段组成。具体地，对这里公开的非FPGA实验，使用总长度14个碱基对发夹结构(14bphp)67个核苷酸。对于剩余部分的实验，使用总长度79个核苷酸的DNA低聚物，具有20个bphp。发夹结构通过在它自身上折叠3'端形成，产生14或20个碱基对。发夹结构由此为双链片段，其中对于14和20bphp，单链片段均为35个核苷酸长(在双链末端的环中4个未配对的碱基)。在捕获到ssDNA末端时，发夹结构进入孔前厅并停留，直到发夹结构被解链。纳米孔系统和20bphp移位事件实例的图解在图13中阐释。

离子电流振幅和个体DNA或RNA分子经过孔移位的特征之间的相关性已经通过使用α-溶血素通道的各种分析来显示。通过孔的分子数量和电流下降的数量之间几乎直接的相关性已经被说明。ssDNA的均聚物和RNA的嵌段共聚物也基于封锁电流振幅或动力学中可测量的差值来区分。然而，对于使用现有的生物纳米孔来对多相单链聚合物中的个体核苷酸进行测序，移位速度太快(高达2个核苷酸/微妙)。这里和在其它研究中，带有单和双链片段的DNA被用来增加核苷酸在孔(0.5-5毫秒，取决于应用电压和dsDNA片段长度)的驻留时间。例如，Vercoutere等(2001；Nat.Biotechnol(自然生物技术)，19(3)：248-252及Vercoutere等(2003)Nucleicacidsresearch(核酸研究)，31:1311-1318)使用了没有单链突出端的钝尾发夹结构，长度在3到9个碱基之间变化的那些钝尾发夹结构，其中机器学习方法被应用于延长的驻留时间事件以鉴定(测序)由ssDNA的3'和5'端组成的末端碱基对。

实施例XX：使用FSM/FPGA的电压控制

纳米孔系统在0.3mMKCl溶液中建立。膜片钳放大器、MolecularDevicesAxoPatch200B，调节应用电压并测量经过通道的离子电流。使用MolecularDevicesDigidata1440A数字化仪来记录数据，以50kHz进行采样并以四极Bessel滤波器在5kHz进行低通滤波。

电压控制逻辑使用LabVIEW8软件里的FSM来进行编程。该FSM逻辑在现场可编程门阵列(FPGA)硬件系统“NationalInstrumentsPCI-7831R”上实现。FPGA是可重构的硬件平台，其允许快速测量和电压反应时间(1微秒输出采样时间)。FSM是一种逻辑构造，其中程序的执行被分解为一系列个体状态。每个状态有与之关联的命令，状态之间的过渡是根据系统测量结果而进行的。对孔电流的测量结果被处理后作为输入被传递到FSM。根据需要对FSM控制逻辑作出改变，不需要对设计进行重新编译和重新路由来在FPGA运行。这通过使系统以微秒级对事件作出反应，同时也允许控制逻辑在实验之间根据需要被重新配置，而在速度和灵活性之间得到平衡。

实施例XXI：用于DNA和酶结合DNA事件诊断的均值滤波电流的FSM监测

可通过使用FSM/FPGA对以封锁电流和驻留时间量化的封锁事件进行实时检测和监测。应用到FPGA上的输入电流信号的均值滤波器除去一大部分峰值-峰值噪声。具体地，每5.3微秒，FPGA对离子电流进行采样并计算一个窗口均值振幅。FPGA测试均值是否在一个预先指定的范围内，然后在初始检测之后，继续每0.2毫秒对均值进行一次测试。如果均值在四次连续的测试中都进入并保持在这个范围之内，FSM逻辑诊断封锁为DNA发夹结构事件。DNA移位事件和DNA移位事件诊断之间的时延通常为1.35毫秒；对首次进入17.2到22.8pA范围的窗口均值为0.75毫秒，对三次附加的证实测试为0.6毫秒，以及0.65毫秒的计算延迟。均值滤波电流被用于DNA事件诊断并触发FSM控制逻辑中状态之间的过渡。

FSM控制逻辑已经用于在使用纳米孔系统的DNA本身或DNA/酶复合体之间进行识别。此外，能够使用FSM检测到酶从DNA的离解，并实时地做出反应，以用来检测存在于电流信号中的结束步骤。在孔中检测DNA和DNA/酶复合体的能力能够允许在KF结合到DNA发夹结构及正确的核苷酸存在于系统中时，对位于单链和双链DNA之间的接点上碱基的实时鉴定，如本报告中所详述的。

进一步，单一DNA发夹结构分子的检测和控制能够使用DNA的单个拷贝被扩展以包括重复捕获的KF。当使用纳米孔拉引KF从DNA发夹结构离开时，一个碱基能够被鉴定。KF从相同DNA拷贝的重复捕获和离解能够允许许多碱基被测序，只要找到一种用于单碱基棘轮聚合酶(ratchetingpolymerase)反应的方法。电流测序方法仅限于读取大约1千个碱基(1000个已鉴定的碱基对)，但是基于纳米孔的测序方法与传统的本体相测序方法相比具有更长的读取长度的潜力。

大量的未来工作致力于通过改进的滤波和使用更长的DNA发夹结构来提高电流信号的信噪比，从而提高检测的鲁棒性。同时，确保酶已经离解的双重检查方案将被实施。改变KF和dNTP浓度的实验也将被执行以发现不同复合体的检测极限。

实施例XXII：分子复合体的检测

DNA与大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片断(KF)的相互作用能够使用纳米孔系统探测。KF不存在时，捕获及随后的180mV恒定电压下20bphp的解链揭示了20pA平均振幅和4毫秒中值驻留时间的电流封锁。KF和与KF催化部位的DNA模板碱基互补的dNTP的添加导致封锁驻留时间(对dGTP，110毫秒中值寿命)的大幅增加，这由三元(DNA/KF/dGTP)复合体引起。对这种封锁的更紧密的调查揭示大于97％封锁中的两步模式，第一步为24pA平均振幅，及第二(结束)步为20pA平均振幅，持续4毫秒，与发夹结构动力学本身一致。这表明从步骤一到二的过渡导致KF首先从DNA离解，接下来发夹结构下落到孔前厅直到解链发生。作为酶结合DNA电压控制下的初始努力，个体三元复合体的高效自动检测(小于3毫秒)被证明，这基于特征性的24pA振幅和20毫秒后通过电压逆转的封锁时间截断。使用20毫秒截止，因为60％的事件在正确的dNTP存在时长于20毫秒，而在没有正确的dNTP的检测范围中，仅有2％的事件长于20毫秒，显示长于20毫秒的事件通常对应三元复合体事件(图14)。检测基于1.2.2节所描述的机制以使用前述的1.5毫秒信号和17.2至22.8pA的检测范围计算窗口均值。选择该范围的基础是：大约20pA是180mV时以及结束步骤(图19)中14和20bphp事件的中值振幅。

实时诊断个体事件的能力显示了扩展该系统以进行测序的潜力。单个的长驻留时间事件(大于20毫秒)给出了三元复合体事件的高概率。基于存在于系统的dNTP，将被加入的下一个基的身份能够被鉴定，实现单个碱基测序。对多个碱基读取，碱基聚合的调整对沿着核苷酸添加的步骤来说是必要的。对每个添加的碱基，能够探测存在于孔中的酶结合DNA的三元复合体的存在，证实聚合所需的正确的dNTP的存在。这里所提供的实验中，dNTP是双脱氧终端的(di-deoxyterminated)，因此聚合被拖延，阻止多于一个单碱基加入到发夹结构。双脱氧终止子(di-deoxyterminators)的这种使用是今天所使用的大多数测序方法的基础。

实施例XXIII：个体DNA分子的控制

快速检测(<2毫秒)基于根据最后0.75毫秒的离子电流实时计算滤波均值，并监测关于与DNA发夹结构封锁(20±2.8pA)一致的振幅范围的均值。在检测时，说明两种电压控制的方法。

在第一个方法中，通过迅速的电压下降实现对驻留时间的延长，应用下降电压直到发夹结构解链。用于捕获的更高电压增加被检查到的分子的数量，且捕获后降低电压增加了驻留时间，从而原则上有利于测序。特别地，延长孔内DNA发夹结构的寿命，从而增加了能够使用机器学习方法实现末端碱基鉴定的时间。

第二种方法在预设的时间内(10毫秒)降低电压，然后逆转电压以在发夹结构解链之前驱逐分子。这说明了聚集数百个封锁事件的驻留时间的控制权限。此外，它补充了前述的工作，证实了同时检测酶结合封锁和DNA发夹结构封锁的能力。在每个封锁类型之间实时识别的能力的确认对未来工作具有关键性。最终，酶动力学的基于纳米孔的表征将要求直接检测和控制与酶相关的多个DNA构象，对无酶DNA的直接控制是开发这种能力的前提。

对纳米孔中ssDNA的直接控制已经被说明，其中DNA的检测是基于监测相对于一个阈值水平的原始振幅。相比于这里所采用的电压，电压水平变化被控制用来探索ssDNA-孔相互作用的零和低电压效应。与对原始离子电流振幅取阈值相反，这里所使用的窗口振幅均值计算对电流噪声进行滤波。此外，检测依赖于在多个连续的比较中保持在预设振幅范围内的均值(幅度<6pA)，导致比单阈值比较更少的虚假检测。

实施例XXIV：实验和结果

现在描述的是纳米孔中单一DNA分子的直接FSM/FPGA控制的演示。在第一个实验中，目标为高效地检测DNA发夹结构事件，一次一个分子，并通过在检测时将应用电压从180mV降低至150mV来增加封锁驻留时间。这被称为“驻留时间延长控制”。在完成这个目标后，通过使用在150mV下10毫秒之后的-50mV的电压逆转来驱逐DNA，从而寻求延长的封锁驻留时间的聚集。这被称为“驻留时间聚集控制”。目的是增加标准发夹结构驻留时间，但是在解链发夹结构之前驱逐分子。与延长的驻留时间事件的分布相反，聚集的驻留时间事件更紧凑的分布将指示目标已经实现。

180mV恒定电压下典型的20bphp事件在图13和2Ia(I)中显示。驻留时间的以10为底的对数的概率直方图(图21aIII，实心条)为单峰曲线，其中中值驻留时间为2.8毫秒。图21aII中事件图的中值振幅为20.9pA，其中四分位差(IQR)为1.7pA。仅有6％的事件处于13至18pA的子范围(图21aIII，开放条)。对在150mV恒定电压下的同一实验(数据未显示)，围绕14.7pA中值振幅的时间集群和87％的150mV事件位于13至18pA范围内。这样，在延长和聚集控制下，其中对所有检测到的事件电压降至150mV，占更大百分比的封锁应该具有处于13至18pA范围内的均值振幅。

实施例XXV：驻留时间延长控制(图21b)

在使用均值滤波电流对DNA发夹结构事件的诊断中，受控电压被降低至150mV直到发夹结构解链以及DNA通过孔移位。使用180mV的捕获电压比150mV导致更多的事件，而降低至150mV延长发夹结构的寿命。再次，驻留时间延长对通过机器学习方法的测序是有用的。通过增加其中均值必须处在对应每个状态的振幅阈值内的时间，延长的时间也能被用来增加正确检测DNA或DNA-酶配置(状态)的可能性。每次移位后，FPGA重设电压至180mV。代表性的事件在图21bI中显示。事件图(图21bII)模式显示快于约1.4毫秒的标准诊断时间的事件不受延长控制的影响，更长驻留时间的事件如预期的那样收敛至约15pA均值振幅。凹陷趋势也与每个事件的均值振幅计算一致。处于13至18pA子范围内的事件的百分数增加至41％，并在开放条直方图上显示，该开放条直方图覆盖在概率(实心条)直方图(图21bIII)上。

实施例XXVI：驻留时间聚集控制(图21c)

目标是通过在发夹结构事件诊断中应用10毫秒的150mV电压来聚集延长事件的驻留时间，随后是5毫秒-50mV的电压逆转。众所周知5毫秒的逆转时间足够从通道里清理DNA，为下一个事件准备好孔。除了对个体分子事件的控制之外，聚集控制将意味者对事件分布的一定程度的控制。一个有代表性的事件在图21cI中显示。如前所述，事件图(图21cII)模式显示快于约1.4毫秒的标准诊断时间的事件不受聚集控制的影响。在13至18pA的子范围内，中值为16pA，具有0.7pA的IQR，正是近似均值计算。13至18pA子范围内的事件百分数增加至55％，在开放条直方图上显示，该开放条直方图覆盖在实心条概率直方图(图21cIII)上。对事件子集，12.4毫秒的中值驻留时间与诊断发夹结构状态所要求的短暂的延迟相称，加上10毫秒延长时间。开放条子集直方图0.1的IQR指示聚集目标已经实现。考虑到事件分布控制的影响，图21cII中所有事件的43％落入12-13毫秒的驻留时间范围及13-18pA的振幅范围。

实施例XXVII：拴系DNA

初步实验使用结合到20碱基对发夹结构(20bphp)的KF来运行。单一20bphp经过孔来回穿梭以使KF与DNA多次结合。在这个实验中，1μM100merssDNA、5mMMgCl₂、2μMKF和200μM的dGTP存在于孔的顺孔中。ssDNA低聚物被设计成使得20mer发夹结构在3'端上形成。在反面，有2μM的20碱基对(20mer)引物与顺面的DNA发夹结构的5'端上的序列互补。

随着电压的应用，DNA被吸引通过孔，其中5'首先移位。当ssDNA移位事件的20pA事件特征被检测到时，FSM降低电位至50mV，处于一个足够将分子保留在孔中但没有强到剪切发夹结构的电平。如果酶结合DNA的24pA事件特征被检测到，电压的应用继续直到酶离解，在孔中留下裸DNA，在此时，电压被降低至50mV以将分子保留在孔中。分子被保留在孔中20秒，该时间被发现足够使20mer引物在2μM引物浓度下退火至DNA的5'端。由于DNA的两端都包含20mer双链片段，分子的立即移位被制止。引物退火等待时间之后，FSM逆转电压至-20mV，拉引DNA朝向孔的顺面，力量足以使DNA在溶液里摇摆但是不会剪切反面引物。电压保持在-20mV5秒钟，在这之后FSM改变电压至180mV以诊断孔中分子的身份：DNA本身、DNA/KF二元复合体或DNA/KF/dGTP三元复合体。如果是酶结合的，假定如果大约24pA被观察到，FSM监测20pA结束步骤的电流信号，当KF已经离解但是在DNA移位之前的时刻上，以逆转电压回到-20mV以企图捕获另一个KF。如果在DNA分子移位之前FSM检测DNA分子失败，电流回到大约60pA的开放通道电流，FSM将监测另一个DNA移位事件的电流并重复钓鱼过程(图22)。如果在一个特定的钓鱼尝试期间，没有酶被捕获，FSM再次尝试钓鱼直到酶捕获真的发生。对来自该实验的数据分析，五个DNA拷贝被捕获并被用于对KF的钓鱼。长驻留时间事件(就是说，事件长于20毫秒)对于95.1％的钓鱼尝试被记录，尽管没有进行分析来确定被FSM正确作出反应的KF离解事件的数量。

在执行完最初的概念验证实验后，进行钓鱼实验的第二次，产生了更好的结果。使用0.521秒的钓鱼时间，FSM捕获同一DNA发夹结构的八个拷贝，并在380秒的时间段内对337个可能的KF离解事件做出反应。数据的事后分析显示FPGA为71.68％的KF捕获正确地检测并对酶离解事件做出反应，例如，337个可能的离解事件中的74个为误报。

实施例XXVIII减少虚假的酶离解检测

在上面所提供的数据中，酶的离解通过对纳米孔电流信号进行均值滤波和检查以看它是否处于所选择的振幅范围内来检测。这种平滑方法产生大量虚假检测。作为对这个滤波方案的改进，一个指数加权移动平均(EWMA)滤波器能够取代FPGA所使用的均值滤波器。EWMA滤波器是常用于电子工程应用中信号平滑的模拟RC滤波器的数字实施方式。该滤波器计算一个对过去的样本产生指数级更少重要性的移动平均。EWMA滤波由于它的递归实现还比简单移动平均进行更有效的信号平滑。然而，仍然需要进行实验性测试以为纳米孔电流信号分析来调节该滤波器。

为了更鲁棒地检测酶离解事件，需要实施KF离解检查以确保钓鱼使用裸DNA来进行。当FPGA检测KF离解时，它将钓鱼足够快的一段时间，因此KF不结合，然后它将针对酶的存在检查DNA。如果仅有裸DNA被诊断出来(电流是大约20pA)，那么酶已经离解且系统能够尝试去捕获另一个酶。这个检查对进行实验以收集关于重复事件的信息是重要的。对有效和统计准确的数据，每个被检测到的事件必须为新的酶结合事件。

当存在KF的饱和水平和正确的dNTP时，大部分的长驻留时间事件对应于强的KF结合事件，例如，下一个将被加入模板链的dNTP存在于纳米孔系统中。一连串的多个长驻留时间事件提高碱基鉴定的置信度，因为重复连续的长驻留时间事件在将被加入的正确的dNTP不存在时比在它存在时经常更少发生。这是KF钓鱼将显示它的有用性的地方。独立的工作被用来将以泊松过程对驻留时间事件进行建模，所以Phred质量评分能够被应用于基于重复连续的长驻留时间事件数量的碱基身份诊断。Phred系统是常用于DNA测序的精确度量。例如，90％准确的调用(accuratecall)在Phred的尺度上将为Q₁₀及99％准确的调用将为Q₂₀。Q₂₀被认为是DNA测序在编写时的标准质量水平。

提高酶事件末尾电流步骤的可检测性的另一个方法是使用更长的发夹结构并在较高的电压下运行实验。由于更高的离子流经过通道，使得结束步骤更突出，通道电流的信噪比将提高。

实施例XXIX：电压滴定实验

可以产生结束步骤和应用电压的振幅和持续时间之间的更量化的联系。这里的目标是揭示结束步骤的可重复性并显示它的结构是怎样在不同电压下与DNA本身一致。对结束步骤的深入表征允许对该结束步骤的更好的控制。使用DNA本身及DNA/KF/dNTP三元复合体的恒定电压实验在四种不同的电压下运行，利用每个底物的饱和水平(分别为1μM,2μM和200μM)。电压为220、200、180和160mV。使用24bphp而不是在其它拴系实验中所使用的20bphp以在较高的电压下延长驻留时间。更高的电压被首先运行。以便为产生可检测的结束步骤事件持续时间的应用电压确定一个实际的上限。

如上所描述的，显示准确的检测和对结束步骤的反应是必要的。如更早所陈述的，97％的酶结合事件显示了结束步骤，从而，这是理论上的最大检测率。检测和对结束步骤的反应将通过检测时电压的逆转来显示，聚集结束步骤持续时间。高的探测电压，如上面所使用的，给出了结合和非结合电流水平之间的更高分辨率。实验用DNA本身及DNA/KF/dNTP三元复合体进行，并采用每个底物的饱和水平。对误报的鲁棒性可以通过离线验证准确的检测来显示。

实施例XXXI：结束步骤控制实验：具有钓鱼时间滴定的拴系DNA配置

重复执行上面已实现内容，但是使用拴系DNA。钓鱼时间滴定被执行来重现DNA本身事件与三元复合体事件的比率，这些三元复合体事件比得上非拴系DNA实验中的那些。该信息帮助在钓鱼时间上设置限度以保持对顺孔中的内容物的代表性的采样。实验使用DNA本身及DNA/KF/dNTP三元复合体来运行，并利用每个底物的饱和水平。

实施例XXXII：钓鱼滴定实验

进行KF和dGTP的滴定。长事件的百分比作为KF和dGTP浓度的函数被记录下来。实验在如上面一样的高捕获电压下执行。使用如Benner等的增刊(2007，SequencespecificdetectionofDNApolymerasebindingusingananopore-basedstatemachine(使用基于纳米孔的状态机器的DNA聚合酶结合的序列特定检测)，投稿至NatureMethods(自然方法学))中一样的KF和dGTP浓度间隔：(KF＝[0,0.25,0.5,1.0,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0]μM；dGTP＝[0,0,0,0,0,2.5,7.5,15,30,60,120,200]μM)。

实施例XXXIII：其他酶研究

FPGA/FSM纳米孔系统也能用于其他酶研究。在捕获DNA/酶复合体时应用斜坡电压能够使用电压力谱来产生数据以计算键能地形图。同时，DNA与孔的相互作用能够使用应用电压的反馈控制来表征。酶催化作用的调整能够通过对占据孔的DNA应用张力来实现，该张力抵消酶的前进力。

实施例XXXIV：基因组DNA的分离

血样(2-3毫升)通过肺部导管从病人采集并在-80⁰C下存储于含乙二胺四乙酸的试管内直到使用。使用DNA分离试剂盒根据制造商的指示(PUREGENE，GentraSystems，明尼阿波利斯，明尼苏达州)从血样中提取基因组DNA。DNA的纯度被作为使用Beckman分光光度计测量的260和280纳米下的吸收率的比率(1厘米光路；A₂₆₀/A₂₈₀)来测量。

实施例XXXV：SNPs的鉴定

来自病人DNA样本的基因区通过使用为该区域特别设计的引物的PCR来扩增。PCR产物使用上面公布的方法进行测序。在序列跟踪中所确认的SNPs使用Phred/Phrap/Consed软件来进行验证，并与存储在NCBISNP数据库中的已知SNPs进行比较。

实施例XXXVI：cDNA文库的构建

互补DNA(cDNA)文库使用从哺乳动物组织分离的RNA来构建。冰冻的组织使用POLYTRON均质器(BrinkmannInstruments公司，韦斯特伯里，新泽西州)在异硫氰酸胍溶液里进行均质化和溶解。溶解产物在5.7M的CsCl衬垫(cushion)上使用带有SW28转子的L8-70M超高速离心机(BeckmanCoulter公司，富尔顿，加利福尼亚州)来进行离心分离，该离心在环境温度下以25000rpm进行18个小时。RNA使用酸酚(acidphenol，pH4.7)来提取，使用0.3M乙酸钠和2.5容量的乙醇沉淀，再悬浮于无核糖核酸酶的水中，并在37℃下使用脱氧核糖核酸酶来处理。RNA的提取和沉淀如之前一样重复。mRNA使用OLIGOTEX试剂盒(Qiagen公司,Chatsworth加利福尼亚)来分离并用来构建cDNA文库。

mRNA根据SUPERSCRIPT质粒系统(Invitrogen公司)中的推荐协议来处理。cDNA在SEPHAROSECL4B柱(APB公司)上进行分馏，超过400bp的那些cDNA被连接到表达质粒。质粒随后被转化为DH5aa感受态细胞(Invitrogen公司)。

实施例XXXVII：cDNA的制备和测序

cDNA使用MICROLAB2200(哈密尔顿，里诺，内华达州)结合DNAENGINE热循环仪(MJResearch)制备并通过Sanger和Coulson的方法(1975；J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，94:441-448)的方法使用PRISM377或373DNA测序系统(ABI公司)进行测序。读取框使用标准技术来确定。

序列表的核苷酸序列和/或氨基酸序列被用来在GenBank、SwissProt、BLOCKS和PimaII数据库中查询序列。BLAST产生核苷酸和氨基酸序列的比对以确定序列相似性。由于比对的局部性质，BLAST被用来确定完全匹配或鉴定同源物(homologs)，这些同源物可能是原核生物(细菌)或真核生物(动物、真菌或植物)的来源。其他算法如Smith等的那些(1992；ProteinEngineering(蛋白质工程)5:35-51)在处理一基序列模式和二级结构空位罚分(gappenalty)时也能被使用。本申请中所公开的序列具有至少49个核苷酸的长度以及具有不多于12％的多余碱基(其中N被记载，不是A、C、G或T)。

BLAST方法在查询序列和数据库序列之间搜索匹配。BLAST估计任何所发现的匹配的统计学意义，并只报告满足用户选择的意义阈值的那些匹配。在本申请中，对核苷酸，阈值被设为10^-25，对肽为10^-10。

实施例XXXVIII：cDNA的延长

cDNA使用cDNA克隆和寡核苷酸引物来延长。一个引物被合成来引发已知片段的5'延长，另一引物被合成来引发已知片段的3'延长。初始引物使用引物分析软件被设计为大约22至30个核苷酸的长度，具有大约50％或更多的GC含量，及用来在大约68℃至大约72℃的温度下退火至目标序列。会导致发夹结构和引物-引物二聚的核苷酸的任何拉伸都被避免。

所选择的cDNA文库被用作模板来延长序列。如果延长被执行一次以上，设计额外或巢式引物组。优选的文库的大小被选择来包括更大的cDNA和随机引物，以包含带有5'或上游基因区域的更多序列。基因文库能够被用来获得延长至5'启动子结合区域的调节元件。

高保真放大使用如美国专利号5,932,451里所教授的方法通过PCR来获得。PCR使用DNAENGINE热循环仪(MJResearch)在96-孔板上执行。反应混合物包含DNA模板，每种引物200nmol，包含Mg²⁺、(NH₄)₂SO₄和β-巯基乙醇的反应缓冲液、TaqDNA聚合酶(APB公司)、ELONGASE酶(Invitrogen公司)、和PfuDNA聚合酶(Stratagene公司),采用以下参数。循环的参数为1:94℃,3分钟；2:94℃,15秒；3:60℃,1分钟；4:68℃,2分钟；5:2、3和4重复20次；6:68℃,5分钟；和7:储存于4℃下。在可选择的实施方式中，引物对T7和SK+(Stratagene公司)的参数如下：1:94℃,3分钟；2:94℃,15秒；3:57℃,1分钟；4:68℃，2分钟；5:2、3和4重复20次；6:68℃,5分钟；以及7:储存于4℃下。

每个孔中DNA的浓度通过在不透明的荧光计平板(CorningLifeSciences，阿克顿，马萨诸塞州)上的每个孔中分配100毫升PICOGREEN定量试剂(1×TE中0.25％的试剂，v/v；MolecularProbes公司)和0.5毫升未稀释的PCR产物并允许DNA结合到试剂来确定。该平板在FluoroskanII(LabsystemsOy公司,赫尔辛基,芬兰)上进行扫描以测量样品的荧光并量化DNA的浓度。反应混合物的5毫升至10毫升等份部分通过1％的琼脂糖微胶囊上的电泳效应来进行分析，以确定哪些反应对延长序列是成功的。

延长的克隆被脱盐、浓缩并转移至384-孔板，被CviJIcholera病毒核酸内切酶(MolecularBiologyResearch(分子生物学研究)，MadisonWis.)进行消化，并在重新连接进pUC18载体(APB公司)之前被超声波粉碎或剪切。对鸟枪序列，被消化的核苷酸序列在低浓度(0.6至0.8％)琼脂糖凝胶上被分离，片段被切除，琼脂用AGARACE酶(Promega公司)消化。延长的克隆使用T4DNA连接酶(NewEnglandBiolabs公司)被重新连接到pUC18载体(APB公司)，使用PfuDNA聚合酶(Stratagene公司)来处理以填充限制部位突出，并被转染至大肠杆菌感受态细胞。转化的细胞在包含抗生素的培养基上被选择，个体集落被挑选出来并在37℃下在384孔板上在LB/2X羧苄青霉素液体培养基中整夜培养。

细胞被溶解，DNA使用引物、TaqDNA聚合酶(APB公司)和PfuDNA聚合酶(Stratagene公司)来扩增，其中参数如下：1:94℃,3分钟；2:94℃,15秒；3:60℃,1分钟；4:72℃,2分钟；5:2、3和4重复29次；6:72℃,5分钟；以及7:存储于4℃下。DNA使用如上面所描述的PICOGREEN量化试剂(MolecularProbes公司)来量化。低DNA回收率的样本使用如上面所描述的条件来重扩增。样本用20％的二甲亚砜(DMSO；1：2，v/v)所稀释，并使用DYENAMIC能量转移测序引物和DYENAMICDIRECT循环测序试剂盒(APB公司)或PRISMBIGDYE终止子循环测序试剂盒(ABI公司)来进行测序。

实施例XXXIX：多聚核苷酸的延长

至少一个用来组装多聚核苷酸的多聚核苷酸由使用寡核苷酸引物的cDNA克隆的延长产生。一个引物被合成以引发已知片段的5'延长，另一个引物被合成以引发3'延长。初始引物使用OLIGO4.06软件(NationalBiosciences)被设计成大约22至30个核苷酸长度，具有大约50％的GC含量，并用来在大约55℃至大约68℃的温度下退火至目标序列。将导致发夹结构和引物-引物二聚体的任何片段都被避免。选择的人cDNA文库被用来延长分子。如果需要一个以上的延长，计外额设或巢式引物组。

高保真扩增通过使用DNAENGINE热循环仪(MJResearch公司)在96孔板上进行PCR来获得。反应混合物包含DNA模板、每种引物200nmol，包含Mg²⁺、(NH₄)₂SO₄、和β-巯基乙醇的反应缓冲液、TaqDNA聚合酶(AmershamPharmaciaBiotech公司)、ELONGASE酶(LifeTechnologies公司)、和PfuDNA聚合酶(Stratagene公司)),对选自质粒的引物对，参数如下：步骤1:94℃,3分钟；步骤2:94℃,15秒；步骤3:60℃,1分钟；步骤4:68℃,2分钟；步骤5:步骤2、3和4重复20次；步骤6:68℃,5分钟；步骤7:存储于4℃下。在可选择的实施方式中，当使用插入质粒载体的序列时，引物对T7和SK+(Stratagene公司)的参数如下:步骤1:94℃,3分钟；步骤2:94℃,15秒；步骤3:57℃,1分钟；步骤4:68℃,2分钟；步骤5:步骤2、3和4重复20次；步骤6:68℃,5分钟；步骤7存储于4℃下。

每个孔中DNA的浓度通过在不透明的荧光计平板(CorningCostar公司，阿克顿，马萨诸塞州)上的每个孔中分配溶解在1×TE中的100毫升PICOGREEN定量试剂(0.25％(v/v)；MolecularProbes公司)和0.5ml未稀释的PCR产物并允许DNA结合到试剂来确定。该板在FluoroskanII(LabsystemsOy公司,赫尔辛基,芬兰)上进行扫描以测量样品的荧光并量化DNA的浓度。反应混合物的5毫升至10毫升等份部分通过1％的琼脂糖微胶囊上的电泳效应来进行分析，以确定哪些反应对产生更长的序列是成功的。

延长的克隆被脱盐、浓缩并转移至384孔板，使用CviJIcholera病毒核酸内切酶(MolecularBiologyResearch公司，麦迪逊，威斯康星州)进行消化，并在重新连接进pUC18载体(AmershamPharmaciaBiotech公司)之前被超声波破碎或剪切。对鸟枪测序，被消化的片段在大约0.6-0.8％的琼脂糖凝胶上被分离，如在紫外光下所见的，片段被切除，琼脂用AGARACE(Promega公司)除去/消化。延长的片段使用T4DNA连接酶(NewEnglandBiolabs公司)被重新连接到pUC18载体(AmershamPharmaciaBiotech公司)，使用PfuDNA聚合酶(Stratagene公司)来处理以填充限制部位突出，并被转染至大肠杆菌感受态细胞。转化的细胞在包含抗生素的培养基上被选择，个体的集落被挑选出来并在37℃下整夜培养，该培养在LB/2X羧苄青霉素液体培养基中的384孔板中进行。

细胞被溶解，DNA使用TaqDNA聚合酶(AmershamPharmaciaBiotech公司)和PfuDNA聚合酶(Stratagene公司)来扩增，其中参数如下：步骤1:94℃,3分钟；步骤2:94℃,15秒；步骤3:60℃,1分钟；步骤4:72℃,2分钟；步骤5:步骤2、3,和4重复29次；步骤6:72℃,5分钟；以及步骤7:存储于4℃下。DNA使用如上面所描述的PICOGREEN试剂(MolecularProbes公司)来量化。低DNA回收率的样本使用如上面所描述的条件来重扩增。样本用20％的二甲亚砜(1：2，v/v)所稀释，并使用DYENAMIC能量转移测序引物和DYENAMICDIRECT循环测序试剂盒(AmershamPharmaciaBiotech公司)或ABIPRISMBIGDYE终止子循环测序准备反应试剂盒(PEBiosystems)来进行测序。

以相似的方式，SEQIDNo：1-163的多聚核苷酸被用于使用上面的程序获得调节序列，为外延而设计的寡核苷酸、和基因组DNA文库。

实施例XL：探测和杂交分析的标记

核酸被从生物源分离并通过下列方法之一应用于标准杂交程序的基质。目标核酸的混合物，基因组DNA的限制性消化，通过在1×TAE[Tris-醋酸盐-乙二胺四乙酸(EDTA)]电泳缓冲液(runningbuffer)中穿过0.7％琼脂糖凝胶的电泳来分离，并使用20×盐水柠檬酸钠(SSC)的毛细管转移来转移至尼龙膜。可选择地，目标核酸被个别地连接到载体并被插入细菌宿主细胞以形成文库。目标核酸通过下列方法之一被安置在基质上。在第一个方法中，包含个体克隆的细菌细胞被机械地(robotically)挑选出来并被安置在尼龙膜上。膜被放置在细菌成长介质上，包含羧苄青霉素的LB琼脂，并在37℃下孵育16小时。细菌集落被变性、中和，使用蛋白酶K消化。尼龙膜的在STRATALINKER紫外线-交联器(Stratagene公司)中被暴露在紫外线照射之下，以使DNA交联至膜。

在第二种方法中，目标核酸通过30个PCR循环由细菌载体扩增，这些循环使用与位于插入物两侧的载体序列互补的引物。被扩增的目标核酸使用SEPHACRYL-400珠(AmershamPharmaciaBiotech公司)来进行提纯。提纯后的目标核酸被机械地排列在玻璃显微镜载片上(CorningScienceProducts，康宁，纽约)。载片事先使用0.05％的氨基丙基硅烷(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州)进行涂层并在110℃下进行固化。排列好的玻璃载片(微阵列)在STRATALINKER紫外线-交联器(Stratagene公司)中被暴露于紫外线照射之下。

cDNA探针从mRNA模板制备。5微克的mRNA与1毫克的随机引物(LifeTechnologies公司)混合，在70℃下孵育10分钟，并冻干。冻干后的样本被再悬浮在50毫升的1×第一链缓冲液(cDNA合成系统；LifeTechnologies公司)，该缓冲液包含dNTP混合物、[a-³²P]dCTP、二硫苏糖醇、和MMLV(莫罗尼氏鼠白血病病毒)逆转录酶(Stratagene公司)，并在42℃下孵育1-2小时。孵育之后，探针用42毫升的dH₂O稀释，加热至95℃3分钟，并在冰中冷却。探针中的mRNA通过碱降解被移除。探针被中和，降解的mRNA和未结合的核苷酸使用PROBEQUANTG-50MicroColumn(AmershamPharmaciaBiotech公司)来移除。探针能够使用荧光标志、Cy3-dCTP或Cy5-dCTP(AmershamPharmaciaBiotech公司)来标记，代替放射性核苷酸，[³²P]dCTP。

杂交在65℃下在包含0.5M磷酸钠(pH7.2)、7％SDS、和1mMEDTA的杂交缓冲液里进行。基质在65℃的杂交缓冲液中被孵育至少2小时后，缓冲液被10毫升的包含探针的新鲜缓冲液取代。在65℃下孵育18小时后，杂交缓冲液被移除，基质在增加的严格性条件下被顺序地清洗，该严格性条件高至65℃下40mM磷酸钠、1％SDS、1mMEDTA。为了检测在膜上进行杂交的放射性标记探针所产生的信号，基质被暴露于PHOSPHORIMAGERcassette(盒)(AmershamPharmaciaBiotech公司)，图像使用IMAGEQUANT数据分析软件来分析(AmershamPharmaciaBiotech公司)。为了检测在微阵列上进行杂交的荧光探针所产生的信号，基质通过共聚焦激光显微镜来进行检查，图像使用基因表达分析软件来收集和分析。

实施例XLI：互补多聚核苷酸

与多聚核苷酸互补的分子，或它们的片段，被用来检测、减少或阻止基因表达。尽管包含大约15至大约30碱基对的寡核苷酸的使用已经被描述过，但同样的程序被用于更大或更小的片段或它们的衍生物(例如，肽核酸，PNA)。寡核苷酸使用OLIGO4.06引物分析软件(NationalBiosciences公司)和SEQIDNO：1-163来设计。为了通过防止转录因子结合到启动子来阻止转录，互补寡核苷酸被设计来结合最独特的5'序列，最优选地，在开放读取框的起始密码子之前，介于大约500至10个核苷酸之间。为阻止翻译，互补的寡核苷酸被设计来防止核糖体结合到编码哺乳动物蛋白的mRNA。

实施例XLII：特定抗体的生产

包含多聚核苷酸复合体和它的结合蛋白的结合物(conjugate)使用聚丙烯酰胺凝胶电泳来提纯并用来使小鼠或兔子免疫。抗体使用下面的方案产生。兔子使用完全弗氏佐剂中的复合体来免疫。在那之后免疫在不完全弗氏佐剂中按间隔重复进行。在最低的对老鼠来说7周或对兔子来说12周以后，抗血清被抽取并被测试抗肽活性。测试包括将肽结合到塑料、使用1％牛血清清蛋白阻断、与兔抗血清反应、清洗、及与放射性碘标记的山羊抗兔IgG反应。本领域所熟知的方法被用来确定抗体滴度和复合体形成的数量。

实施例XLIII：筛选与多聚核苷酸或蛋白质结合物特异性结合的分子

多聚核苷酸，或它们的片断，使用³²P-dCTP、Cy3-dCTP或Cy5-dCTP(AmershamPharmaciaBiotech)来分别标记，或使用BIODIPY或FITC(MolecularProbes公司，尤金，俄勒冈州)。相似地，包含多聚核苷酸复合体和它的结合蛋白的结合物能够使用放射性核苷酸或荧光探针来标记。事先安排在基质上的候选分子或化合物的文库在标记多聚核苷酸或蛋白存在的情况下被孵育。在针对多聚核苷酸或氨基酸分子的条件下孵育之后，基质被清洗，基质上保留标记的任何位置被分析，这些标记指示特异性的结合或复合体形成，配体被鉴定。使用不同浓度多聚核苷酸或蛋白质所得的数据被用来计算标记的多聚核苷酸或蛋白和结合分子之间的亲和力。

本领域技术人员将领会，能够在不背离本发明范围和精神的情况下对刚描述的实施方式作出各种调整和修改。根据这里所描述的本发明的说明，其他本领域所已知的适当的技术和方法能够被本领域技术人员以许多具体方式应用。从而，可以理解的是本发明可以以不同于这里所具体描述的方式来实施。上面的说明意为阐述性的，而不是限制性的。在回顾完上面的说明以后，许多其他的实施方式对本领域技术人员来说是明显的。从而，本发明的范围应当参考所附权利要求，并结合这样的权利要求所授权的同等内容的全部范围来确定。

Claims (12)

1.一种控制对部分双链的多聚核苷酸复合体的酶催化活性的方法，所述方法包括：

(a)提供两个独立的、相邻的介质池和位于两个池之间的界面，所述界面具有通道，该通道的维度使得每次仅允许一个单链多聚核苷酸从一个池到另一个池通过；

(b)提供对具有单链部分的部分双链的多聚核苷酸复合体具有催化活性的所述酶；

(c)提供包括第一多聚核苷酸和第二多聚核苷酸的多聚核苷酸复合体，其中该多聚核苷酸复合体的一部分为双链的，并且其中所述第一多聚核苷酸还包括与所述第二多聚核苷酸不相容的阻断引物，并且其中对多聚核苷酸的酶催化活性被所述阻断引物阻止；

(d)将所述多聚核苷酸复合体引入所述两个池中的一个；

(e)将所述酶引入包含步骤(c)的多聚核苷酸复合体的所述池；和

(f)在所述两个池之间应用一个电位差，从而产生第一极性，引起所述多聚核苷酸复合体的所述单链部分经过所述通道移位，并将所述阻断引物从所述复合体离解；

第一次逆转所述电位差，从而产生第二极性；第二次逆转所述电位差来产生所述第一极性，从而控制所述酶对所述部分双链的多聚核苷酸复合体的催化活性。

2.如权利要求1所述的方法，其还包括以下步骤：

测量所述两个池之间的电流；

比较第一次诱发所述第一极性时所获得的电流值与第二次诱发所述第一极性时所获得的电流值。

3.如权利要求1所述的方法，其还包括以下步骤：

测量所述两个池之间的电流；

比较第一次诱发所述第一极性时获得的电流值与在后来的时间所获得的电流值。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述酶选自由DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸内切酶、核酸外切酶、DNA连接酶、DNA酶、尿嘧啶-DNA糖苷酶、激酶、磷酸酶、甲基化酶和乙酰基转移酶构成的组。

5.如权利要求1所述的方法，其还包括以下步骤：

提供至少一种引发酶活性的试剂；

将所述试剂引入包含所述多聚核苷酸复合体的所述池；和

在适当的温度下孵育所述池。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述试剂选自由脱氧核糖核苷酸和辅因子构成的组。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述脱氧核糖核苷酸在引入所述辅因子之前被引入所述池中。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述辅因子选自由Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、ATP、NAD⁺、NADP⁺和S-腺苷甲硫氨酸构成的组。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述介质是导电的。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述介质是水溶液。

11.如权利要求1所述的方法，还包括向除了其中被引入所述多核苷酸复合体的池的另一个池中引入多聚核苷酸结合化合物；以及允许所述多聚核苷酸结合化合物结合至穿过所述通道的所述多核苷酸复合体的单链部分，使得被结合的所述多核苷酸结合化合物不能穿过所述通道。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述多聚核苷酸结合化合物选自由下列组成的组：与所述第二多核苷酸互补的寡核苷酸、肽核酸、锁核酸、衍生化核苷酸和核苷酸异构体。